BRPI1101765A2 - procedimento para a obtenÇço de um produto de engenharia tissular orientado À regeneraÇço de tecido àsseo - Google Patents

Abstract

PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇçO DE UM PRODUTO DE ENGENHARIA TISSULAR ORIENTADO À REGENERAÇçO DE TECIDO àSSEO. A presente invenção refere-se a um procedimento para a preparação de um produto de engenharia tissular orientado à regeneração de tecidos ásseos. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um produto que compreende principalmente células mesenquimais de origem óssea expandidas, imobilizadas sobre suportes ósseos e amalgamadas por meio de géis de fibrina. O dito procedimento compreende fundamentalmente as etapas de colonização dos suportes ásseos e o amalgamado das partículas colonizadas à base de géis de fibrina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCEDI- MENTO PARA A OBTENÇÃO DE UM PRODUTO DE ENGENHARIA TIS- SULAR ORIENTADO À REGENERAÇÃO DE TECIDO ÓSSEO"

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a um procedimento para a prepa- ração de um produto de engenharia tissular orientado à regeneração de te- cidos ósseos. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um pro- duto que compreende principalmente células mesenquimais de origem ós- sea expandidas, imobilizadas sobre suportes ósseos e amalgamadas por meio de géis de fibrina. O dito procedimento compreende fundamentalmente as etapas de colonização dos suportes ósseos e o amalgamado das partícu- las colonizadas à base de géis de fibrina.

A reconstrução de segmentos ósseos devido a traumatismos, enfermidades degenerativas, inflamação e o tratamento cirúrgico de tumores é um problema clínico não resolvido. Os tratamentos disponíveis atualmente incluem o transplante de tecido ósseo autólogo, heterólogo e a utilização de implante à base de diversos tipos de biomateriais. Entre as abordagens an- teriores, o autoenxerto de osso obtido de diversas localizações, tais como, por exemplo, a crista ilíaca, é o tratamento preferido para uma ampla varie- dade de condições ortopédicas. Entre estas se encontram a substituição de defeitos ósseos, a consolidação de fraturas complicadas ou os defeitos de união. A utilização de tecido autólogo como veículo da regeneração óssea satisfaz uma série de requisitos-chaves básica, resulta em uma matriz estru- tural osteoindutiva, fatores de crescimento que promovem a vascularização e a osteoindução do implante e introduz células com potencial osteogênico.

Apesar dos benefícios derivados, de um ponto de vista exclusi- vamente mecanístico, a utilização de autoenxertos na prática clínica apre- senta uma série de importantes inconvenientes. Freqüentemente, não se consegue uma substituição completa do tecido ósseo prejudicada com o au- toenxerto. Esta circunstância pode desencadear a longo prazo uma ruptura do enxerto. Estimou-se, depois de transcorridos dez anos, a percentagem de ruptura é de 60% e se encontra associada a uma multiplicidade de fatores tais como a diminuição na mineralização do osso neoformado, a produção de microfraturas ou a atividade dos osteoclastos (Wheeler DL e outros, Allo- graft bone decreases in strength in vivo over time. Clin Orthop Relat Res. 2005;435:36-42.). Por outro lado, a obtenção cirúrgica do osso autólogo fre- quentemente tem associada uma elevada morbidez variável (Laureie SW e outros, Donor-site morbidity after harvesting rib and iliac bone. Plast Recons- tr Surg. 1984;6:93-98). Em função da localização anatômica e da técnica de extração (Chou LB e outros, Stress frature as a complication of autogenous bone graft harvest from the distai tibia. Foot Ankle Int. 2007;2:199-201; Braw- ley SC e outros, Results of an alternative autogenous iliac crest bone graft harvest method. Orthopedics. 2006;4:342-346.).

A utilização de osso humano procedente de bancos de tecidos soluciona o problema da morbidez associada aos autoenxertos, mas carece dos benefícios associados à atividade regeneradora acarretada pelo compo- nente celular, a qual foi determinada como um fator-chave. Este tipo de en- xerto apresenta uma incorporação lenta no osso nativo que pode acabar produzindo instabilidade mecânica durante esforços ou pouca afinidade celu- lar, circunstâncias que se traduzem na não-união com o osso nativo (Enne- king WF e outros, Observations on massive retrieved human allografts. J Bone Joint Surgery. 1991;73:1123-1142; Turk JB e outros, Bone source from craneomaxillofacial reconstruction. Facial Plast Surg. 2000;16:7-14). Esta problemática situa a taxa de fracasso desta técnica entre 10 e 40% (Ottoleu- ghi C. Massive osteo and osteo-articular bone grafts: technique and results of 62 cases. Clin Orthop Relat Res. 1972;87:156-64). Poresta razão, embo- ra se disponha de tecido ósseo de um banco, o tratamento mais freqüente de lesões ósseas importantes é o autoenxerto.

Como resposta à problemática mencionada, a presente invenção apresenta um procedimento para preparar um produto baseado na engenha- ria tissular, cuja utilização resulta em uma alternativa terapêutica eficaz. O uso do produto obtido por meio de o procedimento que a presente invenção apresenta é fundamentado na utilização de matrizes à base de biomateriais, combinadas com células-mãe para induzir a regeneração dos tecidos ósseos danificados.

As matrizes utilizadas na presente invenção exibem várias ca- racterísticas, que resultam em chaves para executar a função de suporte à reconstrução do tecido-alvo. Entre estas características é dado destaque ao fato que elas são biocompatíveis, reabsorbíveis, possuem integridade estru- tural e características mecânicas que se adequam à zona de implantação. Além disso, devem ser capazes de gerar um entorno biológico que garanta o suprimento de nutrientes às células para assegurar que estas possam exe- cutar a sua função regeneradora. Às características anteriores, deve ser a- crescentado que uma matriz orientada à regeneração de tecidos ósseos de- veria possuir capacidade de induzir a osteoindução.

O segundo componente fundamental do produto de engenharia tissular da presente invenção inclui as células. As ditas células também exi- bem várias características relevantes tais como a facilidade e segurança de sua preparação, são uma fonte segura do ponto de vista citogenético e têm propriedades de multipotencialidade, que permite que elas sejam diferencia- das das células responsáveis pela produção de tecido ósseo, os osteoblas- tos.

Portanto, a presente invenção apresenta um procedimento para a preparação de um produto de engenharia tissular orientado à regeneração óssea. O dito procedimento se fundamenta na utilização de células mesen- quimais expandidas, de origem autóloga ou alogênica, procedentes da me- dula óssea, e as ditas células se imobilizam sobre suportes à base de partí- culas de osso desantigenizado ou desantigenizado/desmineralizado. O pro- duto obtido pelo dito procedimento é amalgamado e estabilizado na zona de implantação por meio de a utilização de géis de fibrina. O tratamento com o produto obtido pelo procedimento da presente invenção tem como principal vantagem em relação aos tratamentos baseados no autoenxerto o fato que não é necessário submeter o receptor da terapia a uma ou várias interven- ções de cirurgia maior para a extração do material biológico.

O material celular necessário para a preparação do produto de Engenharia Tissular segundo a presente invenção é obtido por meio de a extração da medula óssea que é realizada de forma ambulatória. Esta abor- dagem, portanto, evita as complicações potencialmente graves derivadas da obtenção de material ósseo autólogo tais como dor crônica, afetação do te- cido nervoso e arterial, instabilidade da pélvis, infecção e cicatrizes (Banwart JC e outros, Iliac crest bone graft harvest donor site morbidity. A statistical evaluation. Spine. 1995;20:1055-1060).

Por outro lado, o procedimento de acordo com a presente inven- ção, que utiliza de forma combinada de células mesenquimais e uma matriz de capacidade osteindutora reconhecida, de preferência osso desantigeni- zado ou desantigenizado/desmineralizado, permite superar as limitações impostas pela utilização de osso procedente de banco de tecidos sem com- ponente celular, que mostra um índice de fracasso na integração óssea en- tre 10% e 40%.

Foi demonstrado que a combinação de matrizes ósseas desmi- neralizadas/desantigenizadas ou desantigenizadas com medula óssea não processada acelera e incrementa a formação de osso em comparação à uti- lização da matriz óssea por si só (Rougraft BT., Treatment of ative unicame- ral bone cysts with percutaneous injection of demineralizaed bone matrix and autogenous bone marrow. J. Bone Joint Surg. Am. 2002;84:921). Embora este resultado tenha manifestado que a medula óssea, ou seja, as células com possível potencial osteogênico contidas na medula podem ser um ele- mento-chave na atividade terapêutica do produto, ao atuar como catalisado- res da formação de tecido sadio.

Entretanto, a medula óssea é constituída por um conjunto celular heterogêneo que inclui todas as células de linhagem hematopoiética, células endoteliais, células de tecido adiposo, assim como uma percentagem menor do que 0,01% de células mesenquimais multipotentes. Esta população de células mesenquimais é aquela que, através de um processo de diferencia- ção, dará lugar aos osteoblastos, que são os principais responsáveis pela formação do osso. Logicamente, esta baixa percentagem das células me- senquimais na medula óssea supõe uma limitação na capacidade regenera- dora desta fonte celular. Portanto, existe um elevado grau de incerteza quan- to ao resultado do tratamento, uma vez que não é possível determinar a quantidade de células com capacidade osteoindutora aplicadas e fixadas à zona da lesão.

Os inventores da presente invenção descobriram que, por meio de o procedimento da presente invenção, no qual matrizes ósseas são con- jugadas por meio de um processo de imobilização de um produto celular en- riquecido em células mesenquimais, são obtidos resultados surpreendentes na regeneração óssea. O dito produto apresenta uma excelente capacidade osteoindutora e é obtido por meio de uma seleção e posterior expansão in vitro destas células mesenquimais.

O procedimento da presente invenção, por meio da manipulação do processo de expansão das células mesenquimais, permite gerar uma ampla faixa de quantidades de enxerto ósseo, que facilita o tratamento de lesões de diversos tamanhos e origens. Esta característica faz com que o produto obtido por meio de o procedimento segundo a presente invenção seja aplicável em um leque de abordagens terapêuticas tais como a recons- trução óssea maxilofacial, em osteoartrose, em osteonecrose, na substitui- ção de defeitos ósseos, na fusão intervertebral, na consolidação de fraturas complicadas ou nos defeitos de união.

Por outro lado, a conjugação das células mesenquimais às ma- trizes ósseas por meio de um processo de colonização, permite a localiza- ção das células com potencial osteogênico na zona a ser regenerada. Esta característica assegura a atividade celular reparadora na zona a ser tratada e a diferença de outras abordagens de engenharia tissular, que introduzem as células sem imobilização na matriz. Além disso, isto garante a permanên- cia das células mesenquimais na zona da lesão onde deve ser realizado o trabalho reparador.

Finalmente, o amalgamado destas partículas de osso coloniza- dos com células mesenquimais por meio de géis de fibrina permite conferir ao conjunto plasticidade e capacidade de manipulação, facilitando por sua vez a imobilização da mistura na zona a ser tratada e conferindo a arquitetu- ra requerida. Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção apresenta um procedimento para a prepa- ração de um produto de engenharia tissular orientado à regeneração de te- cidos ósseos. O dito produto é constituído por um componente celular que consiste em células mesenquimais expandidas a partir da medula óssea e um componente não celular à base de matrizes ósseas. O procedimento compreende as etapas de:

a) expansão de células mesenquimais;

b) conjugação/imobilização das células mesenquimais obtidas em (a) em matrizes ósseas;

c) lavagem da suspensão óssea; e

d) acondicionamento final (amalgamado).

O tamanho da lesão a ser tratada determinará a quantidade de células mesenquimais requeridas para uma regeneração óssea adequada. Uma vez que a dose de células mesenquimais requeridas é obtida na etapa (a), inicia-se a etapa de conjugação destas a uma matriz óssea. Esta conju- gação/imobilização pode ser realizada por meio de sistemas dinâmicos ou estáticos.

No caso em que se utilize um sistema dinâmico, as células me- senquimais obtidas na etapa de expansão (a) são ressuspensas em meio de cultura, de preferência o meio DMEM complementado com soro a uma con- centração não superior 1x107 células por mililitro e não inferior a 1x10³ célu- las por mililitro. Continuando, a suspensão celular de forma estéril é despe- jada em uma bolsa ou frasco de cultura, que pode estar equipado ou não com um agitador pendular previamente carregado com a matriz óssea. A relação do número de células por centímetro cúbico de matriz óssea será mantida dentro do intervalo de 1x10² a 1x10^8 células por centímetro cúbico. Uma vez que a suspensão celular é adicionada ao frasco, biorreator ou bol- sa de cultura, é incubada com agitação durante 4 a 24 horas a uma tempera- tura de 37°C, uma saturação de CO2 de 5%, e umidade relativa de 95%. As condições de agitação empregadas para garantir a ancoragem das células são de 1 a 120 rotações por minuto. Em caso do emprego de um sistema de imobilização estático, as células mesenquimais obtidas na etapa de expansão (a) são resuspensas em meio de cultura, de preferência o meio DMEM complementado com soro a uma concentração não superior a 1x107 células por mililitro e não inferior a 1x103 células por mililitro. Continuando, a suspensão celular de forma estéril é despejada em uma bolsa ou frasco de cultura, que pode estar equipado ou não com um agitador pendular previamente carregado com a matriz óssea. A relação do número de células por centímetro cúbico de matriz óssea será mantida dentro do intervalo de 1x102 a 1x108 células por centímetro cúbico. Uma vez que a suspensão celular é adicionada ao frasco, biorreator ou bol- sa de cultura, é incubada durante 4 a 24 horas a condições de temperatura de 37°C, uma saturação de CO2 de 5% e umidade relativa de 95%.

O produto obtido da etapa de conjugação/imobilização (b), com- posto por células mesenquimais imobilizadas sobre matrizes ósseas, de pre- ferência de osso desantigenizadas, mais de preferência desantigeniza- das/desmineralizadas, é submetido a um ciclo de lavagens, de preferência por meio de uma solução salina fisiológica, e é colocado de forma estéril em uma bolsa de conservação.

O produto obtido é extraído da bolsa de conservação de forma estéril misturado com um gel de fibrina com uma relação de uma unidade volumétrica de solução de fibrinogênio por uma unidade volumétrica de solu- ção de trombina e uma unidade volumétrica de matriz óssea colonizada.

Continuando, a presente invenção é ilustrada por meio de E- xemplos, que não constituem uma limitação da mesma.

Exemplo 1. Procedimento utilizando uma imobilização dinâmica

O seguinte procedimento foi executado para a obtenção de um centímetro cúbico do produto de engenharia tissular orientado à regeneração óssea, segundo a presente invenção.

Foram obtidas 6x106 células mesenquimais de medula óssea por meio de expansão empregando meios livres de soro animal e inoculadas em um frasco de cultura. Por meio do emprego de um meio à base de DMEM suplementado com soro humano a 10% (v/v), a concentração celular foi fixada a uma densidade de 6x105 células por mililitro. Esta suspensão celular foi adicionada de forma estéril a um segundo frasco de material plás- tico dotado de agitador pendular, onde foi previamente adicionado 1 centí- metro cúbico de matriz óssea desantigenizada.

O frasco foi colocado na incubadora a condições de temperatura de 37°C, saturação de CO2 de 5%, e umidade relativa de 95% e foi iniciado um ciclo de agitação de 24 horas de duração a uma velocidade de 1 rpm. Com o passar do tempo de duração desta etapa de imobilização das células mesenquimais sobre a matriz óssea, foram tiradas amostras do sobrenadan- te para determinar o ritmo e rendimento da imobilização das células. Os ren- dimentos de imobilização quando foi finalizada esta etapa eram superiores a 80% e a viabilidade das células, determinada por meio de tingimento de nú- cleos ou ensaios metabólicos indiretos, era superior a 90%.

Transcorridas as 24 horas, depois da imobilização das células mesenquimais sobre a matriz óssea, foi executada uma lavagem do produto obtido com o objetivo de eliminar resíduos celulares e o meio de cultura. Es- ta operação foi levada a cabo por meio de filtração empregando como agen- te de lavagem uma solução salina fisiológica. Continuando, o produto obtido foi colocado em uma bolsa estéril.

No momento anterior à aplicação do produto ao paciente, foi fei- to um amalgamado das partículas ósseas com um gel de fibrina. Para exe- cutar esta operação, foi empregada uma relação volumétrica que consiste em uma unidade de solução de fibrinogênio por uma unidade volumétrica de solução de trombina e uma unidade volumétrica de matriz óssea colonizada. Continuando, o dito conjunto adotou a forma que permitiu que ele se adap- tasse à distribuição espacial da lesão e foi colocado na mesma.

Exemplo 2. Procedimento utilizando uma imobilização estática Foram obtidas 6x10® células mesenquimais de medula óssea por meio de expansão empregando meios livres de soro animal e inoculadas em um frasco de cultura. Por meio do emprego de meio à base de DMEM suplementado com soro humano a 10% (v/v), a concentração celular foi fixa- da a uma densidade de 6x105 células por mililitro. Esta suspensão celular foi adicionada de forma estéril a uma bolsa de cultura permeável a gás de ma- terial plástico, onde foi previamente adicionado 1 centímetro cúbico de matriz óssea desantigenizada.

O frasco foi colocado na incubadora a condições de temperatura de 37°C, saturação de CO2 de 5%, e umidade relativa de 95% e mantido sem movimento durante 24 horas. Com o passar do tempo de duração desta etapa de imobilização das células mesenquimais sobre a matriz óssea, fo- ram tiradas amostras do sobrenadante para determinar o ritmo e rendimento da imobilização das células. Os rendimentos de imobilização quando foi fina- lizada esta etapa eram superiores a 80% e a viabilidade das células, deter- minada por meio de tingimento de núcleos ou ensaios metabólicos indiretos, era superior a 90%.

Transcorridas as 24 horas, depois da imobilização das células mesenquimais sobre a matriz óssea, foi feita uma lavagem do produto obtido com o objetivo de eliminar resíduos celulares e o meio de cultura. Esta ope- ração foi levada a cabo por meio de filtração empregando como agente de lavagem uma solução salina fisiológica. Continuando, o produto obtido foi colocado em uma bolsa estéril.

No momento anterior à aplicação do produto ao paciente, foi fei- to um amalgamado das partículas ósseas com um gel de fibrina. Para exe- cutar esta operação, foi empregada uma relação volumétrica que consiste em uma unidade de solução de fibrinogênio por uma unidade volumétrica de solução de trombina e uma unidade volumétrica de matriz óssea colonizada. Continuando, o dito conjunto adotou a forma que permitiu que ele se adap- tasse à distribuição espacial da lesão e foi colocado na mesma.

Claims (14)

1. Procedimento para a preparação de um produto de engenha- ria tissular orientado à regeneração de tecidos ósseos, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) expansão de células mesenquimais; b) conjugação/imobilização das células mesenquimais obtidas em (a) em matrizes ósseas; c) lavagem da suspensão óssea; e d) acondicionamento final (amalgamado).

2. Procedimento, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de conjugação/imobilização é executada por meio de um sistema dinâmico ou um sistema estático.

3. Procedimento, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte- rizado pelo fato de que a matriz óssea é osso desantigenizado.

4. Procedimento, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a matriz óssea é osso desantigeniza- do/desmineralizado.

5. Procedimento, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a lavagem é executada com solução salina fisiológica.

6. Procedimento, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a lavagem é executada em ciclos e o agente de lavagem é eliminado por meio de filtração.

7. Procedimento, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a relação de número de células por centíme- tro cúbico de matriz óssea na etapa de conjugação (b) fica compreendida no intervalo de 1x102 a 1x108 células por centímetro.

8. Procedimento, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o tempo de conjugação/imobilização (b) fica compreendido no intervalo de 4 a 24 horas.

9. Procedimento, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa de conjugação/imobilização (b) é executada em condições de temperatura de 37°C, uma saturação de CO2 de 5% e umidade relativa de 95%.

10. Procedimento, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a agitação quando é utilizado o sistema di- nâmico na etapa de conjugação/imobilização (b) é executada em um interva- lo de 1 a 120 rpm.

11. Procedimento, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o rendimento de imobilização da etapa de conjugação/imobilização (b) é superior a 80% e a viabilidade das células, determinada por meio de tingimento de núcleos ou ensaios metabólicos indi- retos, é superior a 90%.

12. Procedimento, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o acondicionamento final é realizado por meio de amalgamado com um gel de fibrina.

13. Procedimento, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o acondicionado final é realizado no momento anterior à aplicação do produto ao paciente.

14. Uso de um produto que compreende células mesenquimais imobilizadas em uma matriz óssea, obtido por meio do procedimento como definido em qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de se prestar à fabricação de um medicamento utilizado na regeneração óssea.