JP2010517552A - 細菌検出および/または同定培地 - Google Patents
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Abstract
a)細菌コロニーを得るために
・β−グルクロニダーゼ基質、β−ガラクトシダーゼ基質及びα−ガラクトシダーゼ基質、及びラクトース酸性化酵素、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、L−アラニンアミノペプチダーゼ及びL−ロイシンアミノペプチダーゼのための基質から選択される第1の基質、及び
・β−グルクロニダーゼ基質、β‐ガラクトシダーゼ基質及びα−ガラクトシダーゼ基質、及びラクトース酸性化酵素、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、L−アラニンアミノペプチダーゼ及びL−ロイシンアミノペプチダーゼのための基質から選択される上記第1の基質とは異なる、第2の基質を含む検出培地に、大腸菌を含む傾向がある尿試料を接種すること、
b)第1の基質および/または第2の基質と反応するコロニーを大腸菌のコロニーとして同定すること、
を含む方法に関する。
Description
大腸菌の早期の特異的な検出は、治療に関して、汚染除去、その他の適切な解決法を提案することを可能にする。この検出は、検出することが求められる細菌の酵素活性等の標的代謝活性とされる代謝に特異的な基質を含む検出培地の使用に特に基づくことができ、すなわち基質の選択によって、反応があるか否かに応じて、微生物の性質を特徴づけることが可能である。
この培養培地は、チューブまたはフラスコまたはシャーレ上に播種の準備ができている、液体形態または使用準備済みのゲル形態であってもよい。
本発明の目的において、検出は、液体培地、一片(a strip)または他の固体支持体で行われ得る。
基質は特に代謝基質、例えば炭素または窒素源であってもよく、代謝の生成物のうちの1つの存在下で呈色反応を生じる指示薬に結合されてもよい。
また、基質は酵素基質であってもよく、基質は微生物の直接的または間接的な検出を可能にする生成物を与えるために酵素によって加水分解され得る基質であってもよい。この基質は、明らかにされる酵素活性に特異的な第1の部分及び標識として作用する第2の部分(以下では標識部分とする)を含んでもよい。この標識部分は色素生産性、蛍光発生性、発光性等でもよい。固体支持体(フィルター、寒天、電気泳動ゲル)に適している色素生産性基質として、オキシダーゼ(osidase)とエステラーゼ活性の検出を可能にする、インドキシルとその誘導体を主成分とした基質、及びヒドロキシキノリン又はエスクレチンとそれらの誘導体を主成分とした基質を挙げることが出来る。また、ニトロフェノール及びニトロアニリン及びその誘導体を主成分とする基質を挙げることができ、ニトロフェノールに基づく基質の場合はオキシダーゼとエステラーゼ活性を検出するためであり、ニトロアニリンに基づく基質の場合はペプチダーゼ活性を検出するためである。最後に、ナフトールとナフチルアミンとそれらの誘導体を主成分とする基質を挙げることができ、ナフトールによってオキシダーゼとエステラーゼ活性を検出することが可能であり、ナフチルアミンによってペプチダーゼ活性を検出することが可能である。この基質は、オキシダーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ等の活性のような酵素活性の検出を特に可能にすることができるが、これに制限されるものではない。
また、酵素基質は、その加水分解の生成物が直接的または間接的に検出される天然の基質であってもよい。天然の基質としては、特に、トリプトファナーゼまたはデアミナーゼ活性を検出するためのトリプトファン、デアミナーゼ活性を検出するための環状アミノ酸(トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン)、ホスホリパーゼ活性を検出するためのホスファチジルイノシトール等を挙げることができる。
・β‐グルクロニダーゼの場合は、好ましくはグルクロネート及びメチル−β−グルクロニドから選択されるグルクロニドを挙げることができる;
・β‐ガラクトシダーゼの場合は、好ましくはラクトースとイソプロピル−β−チオガラクトシドから選択されるガラクトシドを挙げることができる;
・β−グルコシダーゼの場合は、グルコースにβ位において結合する炭水化物で構成される炭水化物、またはβグルコシドサブユニットを有する炭水化物、特にセロビオース、セルロース、デンプン、セロトリオースまたはトレハロースを挙げることができる。また、メチル−β−グルコシド、イソプロピル−β−チオグルコシド、インドキシル−β−グルコシドまたはメチル−β−チオグルコシドを挙げてもよい。
100ng/lと30g/lとの間、好ましくは1mg/lと3g/lとの間の濃度は、特に本発明に適しているが、これに限定されるものではない。
・β‐グルクロニダーゼの場合は、D−グルコース、D−グルカル酸1,4−ラクトンを特に挙げることができる。
・β‐ガラクトシダーゼの場合は、2−デオキシガラクトース、セロビオース、D−ガラクトース、D−グルコースを特に挙げることができる。
a)細菌コロニーを得るために
・β‐グルクロニダーゼ基質、β‐ガラクトシダーゼ基質及びα−ガラクトシダーゼ基質、及びラクトース酸性化酵素、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、L−アラニンアミノペプチダーゼ及びL−ロイシンアミノペプチダーゼのための基質から選択される第1の基質、及び
・β‐グルクロニダーゼ基質、β‐ガラクトシダーゼ基質及びα−ガラクトシダーゼ基質、及びラクトース酸性化酵素、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、L−アラニンアミノペプチダーゼ及びL−ロイシンアミノペプチダーゼのための基質から選択される上記第1の基質とは異なる第2の基質
を含む、検出培地上に、大腸菌を含む傾向がある試料、好ましくは尿試料を接種すること、
b)第1の基質および/または第2の基質と反応するコロニーを大腸菌のコロニーとして同定すること、
を含む方法に関する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、上記第1の基質は20と1000mg/lとの間の濃度であり、上記第2の基質は20mg/と30g/lとの間の濃度である。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記第1の基質はβ−グルクロニダーゼ基質であり、第2の基質はβ−ガラクトシダーゼ基質である。
好ましくは、β‐グルクロニダーゼ活性のための基質は、好ましくは20と1000mg/lとの間の濃度の、4−メチルウンベリフェリル−β−グルクロニド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、6−クロロ−3インドリル−β−グルクロニド、アリザリン−β−グルクロニドまたはシクロヘキセノエスクレチン−β−グルクロニド、またはそれらの塩類から選択される。
好ましくは、上記第3の基質はβ−グルコシダーゼのための基質である。好ましくは、β−グルコシダーゼ活性のための基質は、好ましくは10と1000mg/lとの間、好ましくは20と500mg/lとの間の濃度の、4−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、6−クロロ−3−インドリル−β−グルコシド、シクロヘキセノエスクレチン−β−グルコシド、ニトロフェニル−β−グルコシドまたはジクロロアミノフェニルグルコシド、またはそれらの塩類から選択される。本発明の好ましい一実施形態によれば、検出培地も、誘導物質を含む。
本発明の好ましい一実施形態によれば、誘導物質は:
・β−グルクロニダーゼの場合は、好ましくはグルクロネート及びメチル−β−グルコシドから選択されるグルクロニド;
・β−ガラクトシダーゼの場合は、好ましくはラクトース及びイソプロピル−β−チオガラクトシドから選択されるガラクトシド;
・β−グルコシダーゼの場合は、グルコースにβ位において結合する炭水化物で構成される炭水化物、またはβ−グルコシドサブユニットを有する炭水化物、特にセロビオース、セルロース、デンプン、セロトリオースまたはトレハロースである。また、メチル−β−グルコシド、イソプロピル−β−チオグルコシド、インドキシル−β−グルコシドまたはメチル−β−チオグルコシドを挙げてもよい。
好ましくは、誘導物質は、好ましくは100ng/lと10g/lとの間の濃度のセロビオースである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、阻害物質は、好ましくは、
・β−グルクロニダーゼの場合は、Dグルコース、Dグルカル酸−1,4−ラクトン、
・β−ガラクトシダーゼの場合は、2−デオキシガラクトース、セロビオース、D−ガラクトース、Dグルコースである。
さまざまな濃度の6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド(0、0.1、0.15と0.20g/l)及び、さまざまな濃度の5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド(0、0.025、0.05と0.1g/l)は、β‐グルクロニダーゼのための合成酵素基質が取り除かれたCPS ID 3培地(ビオメリュー)に加えられて、組合せられる。また、これらの培地は、50mg/lの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシドを含む。それらは、1シャーレにつき20mlの割合で分配される。食品試料中の大腸菌と大腸菌群の検出とカウントを目的とする、β‐グルクロニダーゼ基質(6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド)とβ−ガラクトシダーゼ基質(5−ブロモ−3−インドリル−β−ガラクトシド)を組合わせたColi ID培地(ビオメリュー)は、平行して試験される。尿試料から一般に単離された微生物及び出願人のコレクションに由来する微生物は、0.5のマクファーランドを1/20に希釈した10μlの懸濁液の半定量的単離によってこれらの培地上に接種される。シャーレは37°Cで20時間インキュベートされ、次に形成されたコロニーは視覚的に調べられる。これらのコロニーの色は記録される。結果を、下記の表1に示す:
表1
NA=適用なし、−=無色、Inh=阻害された、P=ピンク色、Pp=薄ピンク色、GP=灰色がかったピンク、GG=灰色がかった緑色、GB=灰色がかった青色、BG=青っぽい緑色、Vi=紫色、O=オレンジ色がかった茶色、T=青緑色
したがって、また特異性に過度に損害を与えず大腸菌の菌株の検出感度を向上させるために最も有利な培地を決定することが可能でする。
それぞれ0.15g/l、0.08g/l及び0.08g/lの6−クロロ−3−インドリル−β−グルクロニド、5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシドと5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−グルコシドを、トリプチケースソイ寒天培地(ビオメリュー)に、加えた。この培地に、0.5g/lのセロビオースが補充されるか、または補充されない。これらの2つの培地は、1つのシャーレにつき20mlの割合で分配される。尿サンプルから一般に単離された微生物及び出願人のコレクションに由来する微生物は、0.5のマクファーランドを1/20に希釈した10μlの懸濁液の半定量的単離によってこれらの培地上に接種される。シャーレは37℃で24時間インキュベートされ、次に形成されたコロニーは視覚的に調べられる。これらのコロニーの色は記録される。結果を、下記の表2に示す:
下記の試験は本発明による上記第1および第2の基質の濃度を定めるために実施されることができ、それは使用する基質及び、さらに一般的にいえば、反応培地の調製に応じて可変的である。この試験の理解を助けるために、特に大腸菌の菌株を含み、陽性活性を表さない菌株、あるいは弱くまたは遅く陽性活性を表す菌株及び任意に他の微生物を含む、微生物の菌株のキットを用いて、β−グルクロニダーゼとβ−ガラクトシダーゼの組合せの場合について、以下で実施する。この試験は、他の種類の基質のために実施され得る。適切な濃度のβ−グルクロニダーゼ基質を含むか、あるいはβ−グルクロニダーゼ基質を含まない2つの反応培地は、ゼロ濃度、β−ガラクトシダーゼを発現する大腸菌の菌株に陽性反応を得るための少なくとも一つの濃度、更には中間濃度からなるβ−ガラクトシダーゼ基質の範囲を調製するために用いる。各々の微生物の菌株が、各々の培地上の純粋な培地に接種をされ得るような方法で、各々の培地は等分される。他の微生物の菌株から大腸菌の菌株を識別すると同時に、大腸菌の菌株の最大数を明らかにすることを可能にするようなβ−ガラクトシダーゼ及びβ−グルクロニダーゼのための基質の組合せを含む培地を選択するために、培地は好ましくは20と50℃との間の適切な温度、通常は30分間と72時間との間の適切なインキュベーションの後、検討される。調製される各基質の濃度及び菌株キットについて実験を繰り返す必要がある可能性がある。また、反応培地は、β−ガラクトシダーゼおよび/またはβ−グルクロニダーゼの誘導物質および/または阻害物質を含むことは有利である可能性がある。
Claims (7)
- 尿試料中の大腸菌を検出および/または同定する方法であって、
a)細菌コロニーを得るために
・β−グルクロニダーゼ基質、β−ガラクトシダーゼ基質及びα−ガラクトシダーゼ基質、及びラクトース酸性化酵素、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、L−アラニンアミノペプチダーゼ及びL−ロイシンアミノペプチダーゼのための基質から選択される第1の基質、及び
・β−グルクロニダーゼ基質、β‐ガラクトシダーゼ基質及びα−ガラクトシダーゼ基質、及びラクトース酸性化酵素、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、L−アラニンアミノペプチダーゼ及びL−ロイシンアミノペプチダーゼのための基質から選択される前記第1の基質とは異なる、第2の基質を含む検出培地に、大腸菌を含む傾向がある尿試料を接種すること、
b)第1の基質および/または第2の基質と反応するコロニーを大腸菌のコロニーとして同定すること、
を含む方法。 - 第1の基質がβ−グルクロニダーゼ基質であり、第2の基質がβ−ガラクトシダーゼ基質である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の基質が20と1000mg/lとの間の濃度であり、前記第2の基質が10mg/と30g/lとの間の濃度である、請求項2に記載の方法。
- 検出培地が、β−グルコシダーゼ、β−ラクトシダーゼ、N−アセチルヘキソサミニダーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、β−キシロシダーゼ、フォスフォリパーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−セロビオシダーゼ、α−グルコシダーゼ、トリプトファナーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、色素合成、ペプチダーゼ(βアラニン・アミノペプチダーゼ、エラスターゼ等)のための基質から選択される第3の基質を含む、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 第3の基質がβ−グルコシダーゼ基質である、請求項4に記載の方法。
- 検出培地が誘導物質、好ましくはセロビオースを含む、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 検出培地が阻害物質を含む、請求項1から6の何れか一項に記載の方法。
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