JP2010510805A - Ｃ型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するｒｎａ分解酵素抵抗性ｒｎａアプタマー - Google Patents

Ｃ型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するｒｎａ分解酵素抵抗性ｒｎａアプタマー Download PDF

Info

Publication number
JP2010510805A
JP2010510805A JP2009539170A JP2009539170A JP2010510805A JP 2010510805 A JP2010510805 A JP 2010510805A JP 2009539170 A JP2009539170 A JP 2009539170A JP 2009539170 A JP2009539170 A JP 2009539170A JP 2010510805 A JP2010510805 A JP 2010510805A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rna
hcv
aptamer
seq
rna aptamer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2009539170A
Other languages
English (en)
Inventor
ソン‐ウク リー
ギョング‐スック シン
ジョン‐フン イム
ヨン‐ジュ リー
チャン‐ホー リー
Original Assignee
ベックスコア カンパニー リミテッド
テウォン ファーム カンパニー リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ベックスコア カンパニー リミテッド, テウォン ファーム カンパニー リミテッド filed Critical ベックスコア カンパニー リミテッド
Publication of JP2010510805A publication Critical patent/JP2010510805A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本発明はC型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマーが提供される。本発明によるRNAアプタマーは、U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にはidTが付着された配列番号4の塩基配列に構成される群から選択される少なくとも一つの塩基配列でなされ、C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合しHCVレプリコン増殖を抑制する。本発明のRNAアプタマーはHCV診断と治療などに有用に使うことができる。
【選択図】図５

Description

本発明はC型肝炎ウイルスレプリコンの増殖を抑制するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマー、これを利用したHCV感染診断キット及びC型肝炎ウイルスの増殖抑制剤に関する。
C型肝炎ウイルス(Hepatitis C Virus: HCV）は、慢性肝炎と肝硬化、そしてある場合には肝癌を起こす主要病源体である(貼付の参考文献14参照、以下同一)。HCVが全世界人類の約3%以上に影響を与えていることにもかかわらずいまだこうした特異的で効率的な治療剤が開発されていない。
HCVはおよそ3、010個のアミノ酸で構成された重合蛋白質を解読する9、600個の塩基配列長さの単一陽性ストランドRNAゲノムを持っている(参考文献6)。前記重合蛋白質の前駆体は細胞とウイルスのプロテアーゼによって少なくとも10個の円熟した構造的、非構造的蛋白質(C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、and NS5B）に進行される(参考文献6及び23参照)。
HCVのNS5BはHCVが自身のゲノムを複製する間に陰性ストランド鋳型とゲノムのウイルスRNAの合成に重要なものと思われるRNA依存性RNA合成に活性を有している(参考文献2参照)。したがって、NS5Bはウイルスの増殖に非常に本質的なものと思われており抗ウイルス新薬開発に主要標的になっている(参考文献18参照)。
RNAはその性格のため標的蛋白質に特異的に結合する安定した構造で結合体化することができ、そのうえ化学的にも容易に合成できるので潜在的に診断、治療に有用な先駆化合物である(参考文献4及び8参照)。
特にSELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)と呼ばれる試験管での反復的な選択技術を利用して、いろいろな蛋白質に高い親和力と特異性を有する短いRNAリガンド(ligand)であるRNAアプタマーを無作為RNAライブラリーから発掘することができる(参考文献7及び28参照)。
多様なアプタマーが動物の疾病モデルから成功的に評価されており(参考文献9、24及び26参照)、それらの一部は現在治療的な臨床開発段階まで至っている(参考文献27参照)。最近、米国の食品医薬庁から全種類の湿性老人性黄斑変性に対して、 ペガプタニブ・ナトリウム (pegaptanib sodium : Macugen)と呼ばれる新生血管抑制剤に関するRNAアプタマーが承認され(参考文献19参照)、これはRNAアプタマーの治療的な潜在性を見せる良い事例である。
HCV NS5Bに特異的で高親和力を有するRNAアプタマーが最近分離され、その特性が記述されていて(参考文献3及び29参照)、たとえかかるアプタマーが試験管でRNA依存性RNA合成酵素の活性を阻害するとしても細胞内でHCV複製を抑制するいかなる研究も未だ発表されていない。
本発明者たちはRNA分解酵素に抵抗性がありHCV NS5Bに対抗するRNAアプタマーを発見し、同時にこれらRNAアプタマーが人間の肝細胞株でHCVの複製過程を抑制することができるのを発見して本発明を完成した。
本発明の目的は、C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合するRNAアプタマーの提供にある。
本発明の他の目的は、HCVのNS5Bに特異的に結合しHCVの増殖を抑制してHCV感染を抑制しえるHCV治療及びその診断に利用できるRNAアプタマーの提供にある。
本発明のまた他の目的は、HCVのNS5Bに特異的に結合しHCVの増殖を抑制してHCV感染を抑制しえるRNAアプタマーを用いた、HCV感染診断キット及びC型肝炎ウイルスの増殖抑制剤の提供にある。
本発明によりC型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマーが提供される。
本発明によるRNAアプタマーは、U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にはidTが付着された配列番号4の塩基配列で構成される群から選択される少なくとも一つの塩基配列になっている。本発明によるRNAアプタマーは、C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合しHCVレプリコン増殖を抑制する。
本発明のRNAアプタマーが起源した配列番号1と配列番号2のRNAアプタマーと、本発明による配列番号3及び配列番号4のRNAアプタマーの塩基配列は下のようである。
5′-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCUUGAACGAUUGGUAGUAGAAUAUCGUCAGUGAACGGCAGUCAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCU-3′(配列番号1)
5′-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCGACAGGGUAGCUUACAGCUGCAUGAUCGCUAGAGGGCGAACAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCCCCC-3′(配列番号2)
5′-GCUGGGCCUUGAACGAUUGGUAGUAGAAUAUCGUCAGUGAACGGC-3′(配列番号3)
5′-GUUGAACGAUUGGUAGUAGAAUAUCGUCAG-3′(配列番号4)
本発明により、U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にはidTが付着された配列番号4のRNAアプタマーから構成される群から選択される少なくとも一つのRNAアプタマーを含み、前記RNAアプタマーとHCVが発現する蛋白質NS5Bの特異的結合を検出してHCV感染の診断に使われるHCV感染診断キットが提供される。
本発明により、U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にidTが付着された配列番号4のRNAアプタマーから構成される群から選択される少なくとも一つのRNAアプタマーを有効性分とし、C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合しHCVレプリコン増殖を抑制するC型肝炎ウイルスの増殖抑制剤が提供される。
前述したように、C型肝炎ウイルス(HCV)が発現するNS5B蛋白質はRNA依存性RNA合成機能を有する酵素としてHCV増殖のために重要な機能を有する蛋白質であり、したがってHCV NS5Bは抗HCV製剤発掘のために有用な標的分子と思われる。
本発明者たちは、SELEX技術を利用して、40個の無作為ヌクレオチド塩基配列を有し2′にヒドロキシル基の代わりにRNA分解酵素に抵抗性を有するフルオロ基に置換されている組合ライブラリーRNAから、HCV NS5Bを標的にRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマーを一次的に発掘(選別)し、発掘されたRNAアプタマーは配列番号1(RNAアプタマー#9）と配列番号2(RNAアプタマー#24）の塩基配列を持つRNAアプタマーである。
ライブラリーRNAは標的蛋白質とほとんど結合できない反面、発掘された前記RNAアプタマー(配列番号1及び配列番号2）はHCV NS5Bと特異的で高い親和力を有して結合し、その結合力(Kd）はそれぞれ18nMと5nMである。
このような前記RNAアプタマーを肝癌細胞であるHuh-7に導入するとHCVのサブゲノミックレプリコン(subgenomic replicon）のRNA合成を阻害してHCVの複製を阻害しえることを発見した。
本発明者たちは、配列番号1及び配列番号2のRNAアプタマーを切断したアプタマーを製作してNS5Bに対する結合力を測定することによってNS5Bに強力に結合できる最適化された本発明のRNAアプタマーである配列番号3(RNAアプタマー#9-t1）と配列番号4(RNAアプタマー#9-t2）のRNAアプタマーを発掘した。
最適化された本発明の配列番号4のRNAアプタマー(RNAアプタマー#9-t2）は、ただ30ntのサイズから構成されながらも2.6nMの高い結合力でNS5Bと結合し、全長のRNAアプタマー(配列番号1)より更に效果的にHCVのサブゲノミックレプリコンのRNA合成を阻害する。
また本発明者たちは、最適化された本発明のRNAアプタマー(Chol-RM9 t2)を化学的に合成した。この際5′末端には細胞透過性分子であるコレステロールを、3′末端にはidT(inverted deoxy thymidylate)を付着した変形されたRNAアプタマーを合成した後、HCVサブレプリコンの複製抑制機能を検査し、その結果NS5Bに結合できない突然変異アプタマに比して、本発明による最適RNAアプタマーの場合Huh-7細胞とインキュベーションする時、その導入量と比例して效果的にHCVサブゲノミックレプリコンのRNA合成を阻害しえることを確認した。
本発明のRNAアプタマーは、HCVの感染の診断と治療に用いることができ、同時にHCVのRNA依存性RNA合成酵素の機能を研究することのできる有用な道具として利用されようと期待する。
本発明によるRNAアプタマーは、HCV NS5B蛋白質によるRNA依存性RNA合成に対抗してRNA分解酵素に抵抗性のあるRNAアプタマーとして、本発明のRNAアプタマーはナノモールのとても低い結合常数(すなわち高結合力）で標的蛋白質に特異的に結合し、さらに本発明のRNAアプタマーは人間肝細胞に導入した場合HCVレプリコンの細胞内のRNA合成を妨害する作用効果がある。
最近NS5Bを含んでNS3ヘリカーゼ(参考文献10及び11参照)とプロテアーゼドメイン(参考文献13参照）のような、また他のHCV調節蛋白質に対抗するRNAアプタマーが発掘されているが、これらのアプタマーは2番位置に正常なヒドロキシルを持っていてHCV複製を妨害するための抗ウイルス製剤開発に適用するには非常に難しい点がありえるが(参考文献20参照)、本発明によるRNA分解酵素に抵抗するRNAアプタマーは小さな化学物質のように標的細胞に效果的に直接移動させることができる。
最適化過程を介した本発明による配列番号4のアプタマー(RNAアプタマー#9-t2）は化学的合成が容易なやや30ヌクレオチドの小さなサイズで構成されてその実效性がきわめて優秀であるものと予測される。。
また最適化された本発明のRNAアプタマー(配列番号4）の3′末端にidTを、そして5′末端にコレステロール基を付着したアプタマー変形体(Chol-RM9 t2)を成功的に合成するによって、アプタマーのヌクレアーゼ(nuclease)に対する安全性を付加してアプタマーの細胞透過性を附与したので、このような本発明の合成されたRNAアプタマーを細胞に直接に処理する場合にHCV複製が效果的に抑制される。
本発明のアプタマーはヌクレオチド連結部位をフォスフォチオエイト(phosphothioate）に変形したりその末端をPEG(polyethyleneglycol）のような他物質を付着した変形を通してその治療的な潜在性を増加させることができる(参考文献5参照)。
また治療的な製剤としての本発明によるRNAアプタマーはHCV感染に対する診断的なプローブ(probe）として利用できるし、HCVが増殖するあいだHCV NS5Bの細胞内の役割を糾明する遺伝的な道具としても用いられる。
選別された2′-F RNAアプタマーの予想構造図である。 選別された2′-F RNAアプタマーとHCV NS5Bとの結合を示す図である。 選別された2′-F RNAアプタマーのHCV NS5Bレブリカゼに対する結合親和力を示す図である。 選別された2′-F RNAアプタマーによるHCVレプリコンの増殖抑制を示す図である。 RNAアプタマー#9とその切断したアプタマーの予想構造図である。 本発明による最適化した(切断した)2′-F RNAアプタマーによるHCVレプリコン増殖抑制を示す図である。 本発明による2′-F RNAアプタマーの化学合成形であるChol-RM9 t2の予想構造図である。 合成した本発明によるChol-RM9 t2 RNAアプタマー、及びChol-Mu-RM9 t2 RNAアプタマー部位の塩基配列及び構造図である。 合成した本発明のChol-RM9 t2 RNAアプタマー、及びChol-Mu-RM9 t2 RNAアプタマーによるHCVレプリコンの増殖抑制を示す図である。
以下、実施例と貼付の図面を参照して本発明によるRNAアプタマーを詳細に説明する。以下、先ず本発明によるRNAアプタマーの配列を決定しその特徴を分析する一連の過程を説明して、続いてその具体的な実施例を説明する。
1.RNAアプタマーの発掘
SELEX過程を行うために必要なRNAライブラリーを製造するため、40個の塩基が無作為に入っていった76merの単一オリゴヌクレオチドを鋳型として利用して下の5′-プライマー(配列番号5)と3′-プライマー(配列番号6）でPCRを通しDNAライブラリーを製造した。5′-はRNAを合成するためのT7 RNAプロモーター部分を含んでいる。
5′-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3′(配列番号5)
5′-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3′(配列番号6)
0.25μM 5′-プライマー、0.25μM 3′-プライマー、10×PCR バッファー、及び100μM dNTPの混合物を混合して、先ず95℃で5分間Taqポリメラーゼ(Promega)を2.5ユニット添加した。そしてPCRサイクルで95℃の30秒、55℃の30秒及び72℃の1分の条件で20サイクル反復した後、最後に72℃の8分30秒で多様なDNAライブラリーを製造した。
PCRを通して作られた多様な塩基配列を有するDNAライブラリーを鋳型としてT7 RNAポリメラーゼ(Takara)を利用して試験管内で転写を通してRNAライブラリーを製造した。このときRNA分解酵素に抵抗性のあるRNAを製造するために2′-デオキシ-2′フルオロCTPとUTP(Epicentre Technologies)及び正常なGTPとATPとT7 RNA重合酵素を利用して、試験管から合成した鋳型の転写により、すべてのピリミディンヌクレオチドの2番位置がフルオロ基に変形されたRNAを生産した(参考文献25参照)。
具体的に、DNAライブラリー、5×転写 バッファー、50mM DTT、0.5mM ATP、GTP、2′-F CTP、2′-F UTP、T7 RNA ポリメラーゼ(Takara)、DEPC-H2Oで50μlにして37℃で3時間反応させた。5U RQ1 DNaseI(promega)を処理して37℃で30分間処理して鋳型として使われたDNAを除去した後Sephadex(sigma)を利用してRNAライブラリーを抽出した。SELEX過程を通し得られたRNAは7Mウレア-6%ポリアクリルアミドゲルから抽出した。
得られた下のRNAライブラリーの塩基配列はA、G、C、Uがそれぞれの位置に同等な量で混入された40個のヌクレオチドを意味するN40を含む。
5′-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCC N40 CAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCCCCC-3′
C型肝炎ウイルスRNA重合酵素はカルボキシル末端にヒスティディンでタグして発現するpET21発現ベクター(Novagen)にクローニングし、蛋白質をE.coli BL21(DE3)菌株で過剰発現させニッケルレジン(Ni-NTAアガロス）を利用して精製した(参考文献22)。
SELEX技術を活用してC型肝炎ウイルスNS5Bに特異的なRNA分解酵素に抵抗性のあるRNAアプタマーを分離した(参考文献1、10及び25)。先ず、10μgのRNAライブラリーを振り上げる状態で室温で30分間20μlのニッケルNTAビード(bead)と100μl結合緩衝額(30mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、2mM ジチオトレイトール (dithiothreitol)、及び1% BSA)で反応してビードと反応する非特異的なRNAを除去した。
以後、上層液を新しいチューブに移し常温からヒスティディンでタグされたC型肝炎ウイルスNS5Bと30分間培養してNS5B-RNA結合体を沈殿させてペレットを0.5mlの結合緩衝額で5回洗ってあげた。
このように得られたRNAを逆転写-遺伝子増幅技術と試験管転写を反復して7回以上のセレクションに利用した。8回のセレクション後に増幅されたDNAをクローニングした後14個のクローンの塩基配列を分析した。
2.RNAアプタマーの結合特異性
[alpha-32P]ATPを利用して先に選別したRNAアプタマーの内部を放射線同位元素で表示した。すなわち、発掘されたRNAアプタマーに対するcDNAクローンからT7 RNA重合酵素を利用してRNAを生成するとき[alpha-32P]ATPを添加してRNAアプタマーの内部を放射線同位元素で表示した。
製造したRNAを変性させるため95℃で2分間放置した。変性されたRNAを7Mウレア-6%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後X線フィルムに3分間露出して現像した後、望むRNAバンドを切って400μlの溶離バッファーに入れて37℃で3時間溶離した。溶離されたRNAはフェノール抽出及びエタノール沈殿で精製及び濃縮して液体閃光計数器(Liquid Scintillation Counter）で定量した。
定量したRNAアプタマーとHCV NS5Bとの結合性をわかるために1nMのRNAと100nM NS5Bを100μlの結合緩衝額(30mM Tris-HCl(PH7.5)、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、2mM DTT)で常温で30分結合させた。
結合されたRNAはニッケルNTAビードで沈殿した後0.5ml結合緩衝額で5回洗い落とした後、0.1M EDTA及び15μlフェノールを利用して抽出した後エタノールで濃縮させて6%ポリアクリルアミドウレアゲルで分析した。
結果、配列番号1(RNAアプタマー#9）と配列番号2(RNAアプタマー#24）のRNAアプタマーを発掘した。
3.切断RNAアプタマー製作
発掘された配列番号1(RNAアプタマー#9）と配列番号2(RNAアプタマー#24）のRNAアプタマーの切断された(truncated)形をT7重合酵素を利用した試験管転写方法を介して製作した。
このとき、後述する本発明によるRNAアプタマー#9-t1(配列番号3)には各々配列番号7及び配列番号8の5′及び3′プライマーを使用し、本発明のRNAアプタマー#9-t2(配列番号4)には各々配列番号9及び配列番号10の5′及び3′プライマーを使用し、RNAアプタマー#9-t3には配列番号11及び配列番号12の5′及び3′プライマーを使用して、各々PCRで増幅させた。これらプライマーの配列は下のようである。
5′-GGTAATACGACTCACTATAGGGCTGGGCCTTGAACGAATGGTAG-3′(配列番号7)
5′-GCCGTTCACTGACGATATTCTACTACCAATCGTTCAAGG-3′(配列番号8)
5′-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGAACGATTGGTA-3′(配列番号9)
5′-CTGACGATATTCTACTACCAATCGTTCAACCCTATA-3′(配列番号10)
5′-GGTAATACGACTCACTATAGGGAACGATTGGTA-3′(配列番号11)
5′-ACGATATTCTACTACCAATCGTTCCCTATAGTG-3′(配列番号12)
増幅させた二重螺旋DNAをT7 RNA重合酵素を利用して試験管転写を行い、このときピリミディーンヌクレオチドは2′フルオロ基に置換されたものを使用した。製作された各々のRNAアプタマーを10%変性ウレアゲルで電気泳動した後精製した。
結果、本発明によるRNAアプタマーである配列番号3(RNAアプタマー#9-t1)及び配列番号4(RNAアプタマー#9-t2）のRNAアプタマーを発掘した。
4.RNAアプタマーの合成
最適化された本発明のRNAアプタマー#9-t2(2′-フルオロピリミディーン含有)を標準固相フォスフォラミダイト化学(standard solid-phase phosphoramidite chemistry）を利用して合成しHPLC(high speed liquid chromatography)を利用して精製した。このときNS5Bに結合できない突然変異(mutant)アプタマーも共に合成した。
最適及び突然変異アプタマーのすべての3′末端にはヌクレアーゼに対して防御するためにidT(inverted dT)を添加し5′末端にはアプタマーの細胞膜透過のためにコレステロールを付着した。
このような変形されたアプタマーを合成するために、idT CPG(solid support)を利用して1mmolスケールで合成を行い、このとき5′末端にはコレステロールTEGアミダイト(Cholesteryl TEG amidite)(1-dimethoxytrityloxy-3-O-(N-cholesteryl-3-aminopropyl)-triethyleneglycol-glyceryl-2-O-(2-cyanoethyl)-(N、Ndiisopropyl)-phosphoramidite)を使用してコレステロール基を付着した。
コレステロール基が付着されたアプタマーコンジュゲート(conjugate）の合成はポリアクリルアミドゲルエレクトロホレシス(polyacrylamide gel electrophoresis)、HPLC及びMALDI-TOFを利用して検証し、CentriSep(Pronceton Separations Inc.）を利用した沈殿及び精製(desalting）を行って用意し、水に溶かした後実験に使用した。化学的に最終合成されたアプタマーをChol-RM9 t2、突然変異アプタマーをChol-Mu-RM9 t2とした。
5.RNAアプタマー結合親和度測定
(1) Gel retardation
放射線同位元素で内部が表示されたRNAアプタマー(50pM)をNS5B蛋白質量(0-320nM）を増加しながら反応させた。このときアプタマーと蛋白質及び結合緩衝額(30mMTris-HCl(PH7.5)、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、2mM DTT)、tRNA 3μgなどを総40μlに合せたあと常温で30分間結合させた。6X BPBを添加して4℃で120Vで6%ネイティブゲル(6%ポリアクリルアミド、1X TBE、10mM MgCl2、2%グリセロール)で電気泳動しX線フィルムに露出して現像した。総RNAアプタマーE対するNS5Bに結合するRNAアプタマーの量を計算して分離常数(Kd)を測定した。
(2) SPR分析
Biacore2000機械を使用してNHSとDECを同量(50μl)混合物を作った後5s/minで40s間流してCM5センサーチップを活性化した。150-200RUになると固定化しようとする蛋白質をソディウムアセテート(pH4.0)に入れ混ぜて50ng/μlになるように流した。リガンド(ligand)の固定化が正しくなされたのか確認するために50mM NaOHから5s間流した。80℃でRNAアプタマーを5分間変性させたあと常温で15分間脱変性して分析対象物RNAを準備した。その動力学(kinetics)を求めるために流速を30s/minに変更させた。用意した分析対象物を1X HBSに希釈して6.25nMで500nM間の濃度間で流した。各段階ごとに50mM NaOHで脱変性した。平衡解離常数(equilibrium dissociation constant : Kd）はligandと分析対象の1:1結合に設定した後センサーグラム(sensogram)から得られたReq値のプロット曲線からKa/Kd動力学同時モデルプログラム(kinetic simultaneous Ka/Kd modelprogram）を利用してKD値を求めた。
6.RNAアプタマーによるHCV増殖抑制
最近開発されたC型肝炎ウイルスサブゲノミックレプリコンシステムを利用して人間肝細胞でC型肝炎ウイルス複製を妨害するRNAアプタマー活性を測定した(参考文献12及び17参照)。
サブゲノミックレプリコン構成体であるpFK-I389neo/NS3-3′/5.1(参考文献12参照）はNS3とNS4Aで適応性の変形をへたものとしてドイツのハイデルベルグのラルフバテンシュレンジャ博士(Dr.R.Bartenschlager)から獲得した。C型肝炎ウイルスレプリコンRNAプラスミドを制限酵素Ase-1とSca-1で切断した後試験管で転写して使用した(参考文献10参照)。
選別されたRNAが細胞内部でC型肝炎ウイルス複製を妨害するの察するためにC型肝炎ウイルスレプリコンRNAと多様のRNA競争者とを一緒にトランスフェクション (transfection) したあと72時間後に逆転写遺伝子増幅技術を利用して肝癌細胞Huh-7細胞でHCV陰性ストランドRNAが合成された量の水準を測定した。
500ngのHCVレプリコンRNAと5μgのサンプルRNAを電気穿孔法実験を利用して4x106個Huh-7細胞に950μF 250V状態でGene Pulser System(BioRad）を持って導入した。導入効率を測定するために各サンプルにレニラルシフェラーゼ(Renilla luciferase)を暗号化するプラスミド、pCDNAlucを添加した。
各サンプルで等しいトランスフェクション効率がルシフェラーゼ遺伝子を逆転写遺伝子増幅分析により再確認された。
トランスフェクション72時間後全体RNAを分離してHCV cDNA陰性ストランドに特異的な3′プライマー(5′-GGGGAATTCCGTAACACCAACGGGCGC:配列番号13)またはβ-actin cDNAに対する無作為プライマーで逆転写した。
このように得られたcDNAはHCV cDNA陰性ストランドに特異的な5′プライマー(5′-GGGAAGCTTCTCGTCCTGCAGTTCAT:配列番号14)と3′プライマーを有して30サイクルで増幅して結果を得て、その値は5′プライマー(5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG:配列番号15)、3′-プライマー(5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC:配列番号16）で増幅したβ-actin cDNA量を利用して標準化した。
化学合成された本発明によるRNAアプタマー(Chol-RM9 t2)によるHCVサブレプリコンRNA複製機能抑制現状を観察するためにHCVサブゲノミックレプリコンRNAであるFK-I389neo/NS3-3′/5.1RNAが安定的に複製されているHuh-7細胞を利用した。
多様の濃度のChol-RM9 t2及びChol-Mu-RM9 t2アプタマーをHCVサブレプリコンが複製されているHuh-7細胞と37℃で反応した。反応後48時間後に細胞から総RNAを分離した後リアルタイムPCRを利用してHCVサブレプリコンRNAの複製抑制度も観察した。リアルタイムPCRのためでSYBR-Green core reagentカート及びTaqポリメラーゼ(Takara)を利用した。
前記で提示したHCV cDNAの陰性ストランドに特異的なプライマーセットを使用してアプタマーを処理するときの変化するHCVのnegative-strand RNA合成量をmock処理した細胞と相互比較した。
HCV cDNA陰性ストランドを増幅するために総RNA 2mgを利用しPCR-キットマニュアルを参照して行った[12.5ml SYBR Green Mix(2×)、0.2ml cDNA、1ml primer pair mix(5pmol/ml each primer)、及び11.3ml H2O]。
PCR増幅は95℃で30秒、55℃で40秒、及び72℃で1分の条件で40サイクルを適用した。
反応産物のためのコントローラでハウスキーピング(house keeping)遺伝子であるGAPDH遺伝子を利用することによって、cDNAローディング量の最小限の変移を補正するためにHCV cDNAから得られた限界水準をGAPDHでの限界水準に調整した。増幅のためにRoter-Gene及びリアルタイムPCR装置(Corbett）を利用した。
実施例1 : HCV NS5Bに対するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマーの選別
前述した方法で1014個の互いに異なる分子の無作為プールから構成されたRNAライブラリーを生成してHCV NS5Bに結合するRNAアプタマーを選別した。このときRNAヌクレオチドの2′基が変形されたピリミディンを利用してRNA分解酵素に抵抗性あるRNAライブラリーを製造した。RNAの2番位置変形は変形されないものと比較するとき人間血清で10、000倍以上の安全性を増加させる(参考文献15、16及び25参照)。2番位置フルオロ基を持つRNAは堅くて強い分子内螺旋を形成して熱力学的に安定に固定された3次構造を主導して高親和力を有する(参考文献21参照)。
SELEX結果2番位置でフルオロが変形され選択されたRNAアプタマーは、#9(配列番号1)と#24(配列番号2）に命名された2個の主要グループに区分された。2個になされたアプタマーグループは全体的に異なる塩基配列を持ち、MULFOLDプログラムを利用して分析した結果、図1に示したように、これらは安定した２次構造を持つものと予測された(参考文献30参照)。
予測された構造は2個のアプタマーグループが異なる形態を表す。選別されたRNAアプタマー#9の場合、一個のステム-ループ構造になっているものとは対照的に#24は終わり部分に2個のステム-ループ構造を持っている。
RNAライブラリーの無作為部分から選択された前記２グループのアプタマー塩基配列は終わり部位にステム-ループ部分が存在するが、この部分がNS5Bに直接的に結合に関与することと予測される。
図1は8回の試験管選択後に14個の選別されたRNAアプタマーから決定された塩基配列である。クローンのなかで二つの異なるRNA塩基配列が現れ、#9と#24は各々8回と6回の頻度で現れた。図面でCとUは各々2′-フルオロCと2′-フルオロUを表す。RNAの２次構造はMULFOLDプログラムを利用して決定された。図1の配列番号1及び配列番号2のRNAで塩基配列25から64はRNAライブラリーの無作為部分から選別された塩基配列を表す。
実施例2 : RNAアプタマーの結合特異性
2番位置フルオロの選別されたRNAアプタマーの結合特異性を察するために実施例1で選別されたRNAアプタマーを放射線同位元素で表示して沈殿実験を行った(図2参照)。表示精製されたRNAを前述したように蛋白質と反応したあと結合されたRNAを抽出して分析した。
図2は放射線同位元素で表示された1nMオリジナルライブラリーRNA、RNAアプタマー#9及びRNAアプタマー#24を標的蛋白質(100nM）がある場合(+E)とない場合(-E)に反応させて、RNA-標的蛋白質結合体をNi-NTAビードで沈殿して結合されたRNAを抽出し、6%ポリアクリルアミドウレアゲルで分析した結果として、I番レーンは各投入された表示RNAの10%を表す。
図2の結果から2番位置にフルオロ基ピリミディンを有するオリジナルライブラリーRNAはニッケルビードと標的蛋白質に結合しなかったが(図2のレーン1-3)、選別されたRNAアプタマー#9と#24はビードとは結合しないが標的蛋白質に結合するのを見ることができた(図2のレーン4-9)。特に選別されたRNAアプタマー#24は#9よりもっと強く標的蛋白質に結合する。これはより高い親和力で#24がC型肝炎ウイルスNS5Bに結合するためである。
また選別されたRNAアプタマーはNS3ヘリカーゼ(helicase)のような、また他のC型肝炎ウイルスヒスティディンタグされた蛋白質には結合しない。したがってNS5B蛋白質のヒスティディン部分に非特異的な結合の可能性を排除することができ、またこれは標的蛋白質であるC型肝炎ウイルスNS5Bとアプタマーの特異的な相互関係を表す。
実施例3 : RNAアプタマーの結合親和力
選別されたRNAアプタマーとC型肝炎ウイルスNS5Bの相互関係の親和力を測定するためにNS5B蛋白質の量を増加しながら放射線同位元素で表示されたRNAと反応後RNAの位置が変化した量を前述したようにgel retardation実験を通して測定した(図3参照)。
図3はHCV NS5Bレプリカーゼ(replicase)に選別されたRNAアプタマーの高い結合親和力を見せる。図3のA及びBは放射線同位元素が表示されたRNAアプタマー#9(A、50pM)とRNAアプタマー#24(B、50pM)を持ってHCV NS5Bレプリカーゼ(0-320nM）の量を増加させて反応したものであり、結果で得られたNS5B-RNA結合体を4%非変性アクリルアミドゲルを利用して結合しない自由のRNA(F)と分離した。
図3のCはHCV NS5Bに結合するRNAの量の百分率に求めるために放射線同位元素を利用して計算したものとして、本結果は3回独立的に行って各々測定した後測定値の平均値である。
図3から分かるように、40個の無作為塩基配列を持つオリジナルライブラリーRNAの場合、蛋白質のもっとも高い濃度でさえもC型肝炎ウイルスNS5Bに極めて低い親和力を表すこととは対照的に、2番位置フルオロ選別されたRNAアプタマー#9と#24両方共に量に依存する傾向でC型肝炎ウイルスNS5Bと結合して效率的に位置変化を形成し、およそ18nM、5nMの高い親和力を有する分離常数(Kd)を示した。特に選別されたRNA#24は#9より標的蛋白質に4倍程度で強く結合できてより効率的な結合力を見せる。
実施例4 : RNAアプタマーによるHCV複製抑制
C型肝炎ウイルスNS5Bに特異的、そして高結合力を有して結合する選別された前記RNAアプタマーが人間肝細胞でC型肝炎ウイルス複製を阻害する活性を、最近開発されたC型肝炎ウイルスのサブゲノミックレプリコンシステムを利用して測定した(参考文献12及び17参照)(図4参照)。
選別されたRNAアプタマーが細胞内部でC型肝炎ウイルス複製を妨害するのか察するためにC型肝炎ウイルスレプリコンRNAと多様のRNA競争者を共にトランスフェクションした後72時間後に逆転写遺伝子増幅技術を利用して肝癌細胞Huh-7細胞からHCV陰性ストランドRNAが合成された量の水準を測定した。HCVレプリコン一つだけトランスフェクションした細胞とRNA競争者が導入されたそれぞれの細胞においてのC型肝炎ウイルスRNAの量を相互比較した。HCVレプリコンRNAとtRNAまたは重症筋無力症(myasthenia gravis）の原因となる自己抗体のような関連されない標的蛋白質に対抗するアプタマー(参考文献25参照)、及びNS5Bに対して選別されたRNAアプタマー#9、#24などを人体肝癌細胞株であるHuh-7細胞に導入した。RNA導入後72時間後に全体RNAを分離しHCV cDNA陰性ストランドとβ-actin cDNAを増幅して増幅されたHCV cDNA陰性ストランド量を増幅したβ-actin cDNA量を利用して標準化した。
図4はHuh-7セルにモックトランスフェクション(mock transfection)したものとHCVサブゲノミックレプリコンRNAをいかなる競争者無しに、MG RNAアプタマー、HCV NS5Bに対するRNAアプタマー#9、またはRNAアプタマー#24と一緒にトランスフェクションしたものである。HCV(-)サブゲノミックRNAを逆転写-遺伝子増幅技術を通して増幅した。RNAアプタマー#24を持ってトランスフェクションした細胞から逆転写を行わず(w/o RT)遺伝子増幅をcDNAなしに行った。対照群は増幅したβ-actin cDNAをロードした。HCV(-)RNA値は、先ずβ-actin RNA量を基準として標準化し、かかるHCV RNA値をHCVレプリコンRNAひとつだけトランスフェクションした細胞で発現した場合のHCV RNA値に対する相対的であるHCV RNAレベルに標準化した。本結果は3回独立的に行い各々測定した測定値の平均値である。
図4を参照すると、tRNAのような非特異的なRNAはHCVサブゲノミックRNA合成にほとんど影響を与えないが、これと反対にRNAアプタマー#9と#24はHCVレプリコンのRNA合成を27%と47%まで阻害(妨害)するのが分かる。
関連のない2番位置フルオロを含有したMG RNAアプタマーがHCVレプリコンRNAの複製から肝細胞を保護できないことをみたとき、選別されたRNAによるHCV複製の妨害は選別されたRNAアプタマーの特異的な相互関係によることが分かる(図2及び図3)。
選別されたRNAの結合効率と親和力に対する分析によると選別されたRNAアプタマー#24が#9より更に效率的にHCVレプリコンRNAの増殖を妨害するのが分かる(図4)。これはHCV増殖を妨害するRNAアプタマーの生物学的活性が標的HCV蛋白質の結合親和力を増加することによって向上させることができることを見せる。
実施例5 : RNAアプタマーの最適化
選別されたアプタマー#9と#24のサイズは各々89nt及び92ntとして化学的合成が容易でないサイズである。化学的合成が容易なRNAアプタマーサイズは概略40nt以下と知られている(参考文献26参照)。また長いサイズのRNAアプタマーは構造上多様の構造形態があり得るので最も適合したアプタマーにみるには限界がある。
発掘されたRNAアプタマーのサイズを縮めた後最適化された本発明のRNAアプタマーを発掘する実験を行った。このために発掘されたRNAアプタマー(#9と#24）の切断された形をT7重合酵素を利用した試験管転写方法を介して製作した。
RNAアプタマー#24の場合、サイズを縮めるほどその結合力が落ちることを観察した。これは#24の場合92nt全長の形が最も適合なRNAアプタマーであることを見せる。したがって、化学的合成側面を考慮するときRNAアプタマー#24の場合、たとえ標的蛋白質に対する結合力は優れているとしても有用なRNAアプタマーとして望ましくないこともある。
RNAアプタマー#9に対して三つの異なる切断されたRNAを製作した(図5のA)。
RNAアプタマー#9-t1は上部ループと上部ステム、そして中間膨部(bulge)及び中間ステムを含み、RNAアプタマー#9の塩基配列のうち17-61に該当する塩基配列として45ntサイズを有している。
RNAアプタマー#9-t2はRNAアプタマー#9の塩基配列の中25-53に該当する塩基配列として上部ループと上部ステムだけを含む30ntサイズを持っている。
RNAアプタマー#9-t3はRNAアプタマー#9の塩基配列の中28-50に該当する塩基配列として、ただ上部ループと上部ステム配列の一部だけを含んだ23ntサイズを有している。
このようなRNAアプタマーのHCV NS5Bに対する結合力をSPR方法を介して測定した(図5のB)。その結果、これらRNAライブラリーは933nMの高いKDを表し、#9-t3の場合40.4nMのKDを示した。これは上部ループと上部ステムの一部配列だけでは高い結合力を有しないことを表す。反面、本発明によるRNAアプタマー#9-t1及び#9-t2は各々8.4nM及び2.6nM KDの高結合力を持ってNS5Bと結合することが分かった。
特に上部ループと上部ステムだけを含む本発明のRNAアプタマー#9-t2はHCV NS5B蛋白質に対して全長のRNAアプタマー#9よりもっと高い結合力を持つばかりでなく30ntの小さなサイズを有するアプタマーであるので最適化されたRNAアプタマーであることが分かる。
図5のA構造は大部分安定したRNA２次構造としてMULFOLDプログラムを利用して決定されたのである(参考文献30)。ここでCとUは2′-フルオロCと2′-フルオロUを示す。塩基配列25から64はRNAライブラリーの無作為部分から選別された塩基配列を示す。図5のBはSPR分析を通して観察した各RNAアプタマーのHCV NS5Bに対するKD常数である。
実施例6 : 最適化されたRNAアプタマーによるHCV複製抑制
実施例5で最適化された本発明のRNAアプタマー#9-t2がHCV複製を效果的に抑制するのか察するために図4と同一実験を行った。即ち、HCVサブゲノミックレプリコンシステムを利用して人間肝細胞でC型肝炎ウイルス複製を妨害するRNAアプタマー活性を測定した(参考文献12及び17参照)(図6)。
HCVレプリコンRNAと多様の種類のRNAアプタマーを肝癌細胞であるHuh-7細胞にトランスフェクションした後72時間後に逆転写遺伝子増幅技術を用いて、それぞれの場合HCV陰性ストランドRNAが合成された量の水準をβ-actin cDNA量を基準とし標準化して測定及び相互比較した。
図6はHuh-7セルにモックトランスフェクションしたものとHCVサブゲノミックレプリコンRNAをいかなる競争者なしに、HCV NS5Bに対するRNAアプタマー#9、または切断されたRNAアプタマー#9-t1、#9-t2、#9-t3と共にトランスフェクションしたものである。HCV(-)サブゲノミックRNAを逆転写-遺伝子増幅技術を介して増幅した。HCV(-)RNA値は、まずβ-actin RNA量を基準として標準化し、そういうHCV RNA値をHCVレプリコンRNAでだけトランスフェクションした細胞から発現した場合のHCV RNA値に対する相対的であるHCV RNAレベルに標準化した。本結果は3回独立的に行い各々測定した測定値の平均値である。
図6を参照すると、RNAアプタマー#9は図4のようにHCVレプリコンのRNA合成を30%まで妨害した。NS5Bに対する結合力をなくした#9-t3の場合、HCVレプリコンのRNA合成が約15%しか妨害できなかった。このような結果は結合力の喪失によってHCV複製抑制力も喪失されたことを示唆する。
反面、本発明によるRNAアプタマー#9-t1は38%まで、そして、やや30ntサイズである本発明によるRNAアプタマー#9-t2の場合は53%まで效果的にHCVレプリコンのRNA合成を妨害し、これは全長のRNAアプタマー#9よりも切断されたRNAアプタマーがHCV複製をもっとよく抑制することを示した。このような結果は全長RNAアプタマーより標的蛋白質に対する結合力がより一層大である切断されたRNAアプタマーがHCV複製を抑制できる機能もなお向上したことが分かる。
特に最適化された本発明のRNAアプタマー#9-t2は化学的合成が有用な30ntの小さなサイズのRNAであり、HCV NS5Bに対する結合力が増大されただけでなくHCV複製を抑制することができる能力もまた増大されたのでHCV複製を抑制しえる非常に有用なRNAアプタマーといえる。
実施例 7: 化学的に合成されたRNAアプタマーによるHCV複製抑制
前記の最適化された本発明のRNAアプタマー#9-t2を化学的に合成した後、そういうアプタマーによるHCV複製抑制度を観察した。アプタマーの3′末端にはidTを導入してエキソヌクレアーゼ(exonuclease)によるRNA分解度を最小化し、5′末端にはコレステロール基を導入することによって何らのトランスフェクション作用剤なしにアプタマーが細胞透過できるようにアプタマーを変形した。最適化した本発明のRNAアプタマー#9-t2の化学合成形であるChol-RM9 t2の予想構造図も図7に示した。
最適化された本発明のRNAアプタマー#9-t2を合成し、この時5′末端にはコレステロール基を3′末端にはidTを各々貼付した。2′-Fは2′-OH基の代わりに2′-fluoro基を有したピリミディンヌクレオチドを表す。
化学的に合成された本発明のRNAアプタマー(Chol-RM9 t2)及びNS5Bに結合できない突然変異RNAアプタマー(Chol-Mu-RM9 t2、Chol-RM9 t2とループ部位塩基部位だけ違う）の塩基配列及び構造を図8に示した。
本発明のRNAアプタマーChol-RM9 t2がHCV複製を效果的に抑制するのか察してみるために図9に図示の実験を行った。即ち、HCVサブゲノミックレプリコンが安定的に複製されているHuh-7細胞システムを利用して化学合成された本発明のRNAアプタマーChol-RM9 t2をトランスフェクション作用剤なしに細胞と反応させる場合、效果的にC型肝炎ウイルス複製を妨害するのかRNAアプタマー活性を測定した。
いろいろな濃度のChol-RM9 t2またはChol-Mu-RM9 t2をHCVサブレプリコンが複製されているHuh-7細胞に48時間処理した後、リアルタイムPCR技術を利用してそれぞれの場合HCV陰性ストランドRNAが合成された量の水準をGAPDH cDNA量を基準とし標準化して測定及び相互比較した。
図9を参照すると、HCVサブレプリコンが複製されているHuh-7細胞にmock処理または合成したアプタマーを反応させた。その後HCV(-)サブゲノミックRNAをリアルタイムPCR技術を介して増幅した。HCV(-)RNA値は、まずGAPDH RNA量を基準として標準化し、アプタマーを処理した時のHCV RNA値をmock処理した細胞におけるHCV RNA値に対する相対的であるHCV RNAレベルに標準化した。本実験は5回独立的に行って各々測定し、測定値の平均値と標準偏差を表明したのである。
図9から分かるように、突然変異RNAアプタマーを処理する場合は高農度を処理してもHCV複製にいかなる影響も及ぼさなかった。反面、本発明のRNAアプタマーであるChol-RM9 t2を処理する時には反応させたアプタマー濃度に比例してHCVサブレプリコンのRNA複製が最大80%まで效果的に抑制されることを観察した。そして本発明のRNAアプタマーChol-RM9 t2によるHCV複製抑制のためのIC50は約2mMであることがわかった。
前記結果から細胞透過性を附与した化学的に合成された本発明のRNAアプタマーがHCV複製を效果的に抑制しえることがわかり、このようなHCV抑制力は本発明のRNAアプタマーに付着されたコレステロール基による非特異的反応でなく、NS5B蛋白質に特異的な特定塩基配列を持ったRNAアプタマーによる特異的反応であることを意味する。従って、化学的に合成された本発明のRNAアプタマーChol-RM9 t2は直接癌細胞内で透過することのできる非常に有用なHCV抑制用薬剤の候補になることが分かる。
本発明はC型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマー、これを利用したHCV感染診断キット及びC型肝炎ウイルスの増殖抑制剤に関するもので、本発明によるRNAアプタマーは、HCV NS5B蛋白質によるRNA依存性RNA合成に対抗してRNA分解酵素に抵抗性のあるRNAアプタマーとして、本発明のRNAアプタマーはナノモールのきわめて低い結合常数(即ち、高い結合力)で標的蛋白質に特異的に結合し、さらに本発明のRNAアプタマーは人間肝細胞に導入したときHCVレプリコンの細胞内のRNA合成を妨害する作用効果がある。
［参考文献］
1. Bae、 S.-J.、 J.-H. Oum、 S. Sharma、 J. Park、 and S.-W. Lee. 2002. In vitro selection of specific RNA inhibitors of NFATc. Biochem. Biophys. Res. Commun. 298: 486-492.
2. Behrens、 S.-E.、 L. Tomei、 and R. De Francesco. 1996. Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of the hepatitis C virus. EMBO J. 15: 12-22.
3. Biroccio、 A.、 J. Hamm、 I. Incitti、 R. De Francesco、 and L. Tomei. 2002. Selection of RNA aptamers that are specific and high-affinity ligands of the hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase. J. Virol. 76: 3688-3696.
4. Burgstaller、 P.、 A. Girod、 and M. Blind. 2002. Aptamers as tools for target prioritization and lead identification. Drug Discov. Today 7: 1221-1228.
5. Cload、 S.T.、 T.G. McCauley、 A.D. Keefe、 J.M. Healy、 and C. Wilson. 2006. Properties of therapeutic aptamers、 pp.363-416. In S. Klussmann (ed.). The Aptamer Handbook、 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA、 Weinheim.
6. De Francesco、 R. 1999. Molecular Virology of the hepatitis C virus. J. Hepatol. 312: 47-53.
7. Ellington、 A.D. and J.W. Szostak. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346: 818-822.
8. Gold、 L.、 P. Allen、 J. Binkley、 D. Brown、 D. Schneider、 S.R. Eddy、 C. Tuerk、 L. Green、 S. Macdougal、 and D. Tasset. 1993. RNA: the shape of things to come、 pp. 497-510. In: R.F. Gestelend and J.F. Atkins (eds.). The RNA World、 Cold Spring Harbor Press、 Cold Spring Harbor、 N.Y.
9. Hwang、 B.、 Han、 K.、 and S.W. Lee. 2003. Prevention of passively transferred experimental autoimmune myasthenia gravis by an in vitro selected RNA aptamer. FEBS Lett. 548: 85-89.
10. Hwang、 B.、 J.S. Cho、 H.J. Yeo、 J.-H. Kim、 K.M. Chung、 K. Han、 S.K. Jang、 and S.-W. Lee. 2004. Isolation of specific and high-affinity RNA aptamers against NS3 helicase domain of hepatitis C virus. RNA 10: 1277-1290.
11. Hwang、 B. and S.-W. Lee. 2005. Analysis of in vivo interaction of HCV NS3 protein and specific RNA aptamer with yeast three-hybrid system. Journal of Microbiology and Biotechnology 15: 660-664.
12. Krieger、 N.、 V. Lohmann、 and R. Bartenschlager. 2001. Enhancement of hepatitis C virus RNA replication by cell culture-adaptive mutations. J. Virol. 75: 4614-4624.
13. Kumar、 P.K.、 K. Machida、 P.T. Urvil、 N. Kakiuchi、 D. Vishnuvardhan、 K. Shimotohno、 K. Taira、 and S. Nishikawa. 1997. Isolation of RNA aptamers specific to the NS3 protein of hepatitis C virus from a pool of completely random RNA. Virology 237: 270-282.
14. Lauer、 G.M. and B.D. Walker. 2001. Hepatitis C virus infection. New Engl. J. Med. 345: 41-52.
15. Lee、 S.W. and B. Sullenger. 1996. Isolation of a nuclease resistant decoy RNA that selectively blocks autoantibody binding to insulin receptors on human lymphocytes. J. Exp. Med. 194: 315-324.
16. Lee、 S.W. and B. Sullenger. 1997. Isolation of a nuclease-resistant decoy RNA that can protect human acetylcholine receptors from myasthenic antibodies. Nature Biotechnol. 15: 41-45.
17. Lohmann、 V.、 F. Korner、 J. Koch、 U. Herian、 L. Theilmann、 and R. Bartenschlager. 1999. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science 285: 110-113.
18. Moradpour、 D.、 V. Brass、 R. Gosert、 B.Wolk、 and H. Blum. 2002. Hepatitis C: molecular virology and antiviral targets. Trends Mol. Med. 8: 476-482.
19. Ng、 E.W.M.、 D.T. Shima、 P. Calias、 E.T. Cunningham、 Jr.、 D.R. Guyer、 and A.P. Adamis. 2006. Pegaptanib、 a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease. Nature Rev. Drug Discov. 5: 123-132.
20. Nishikawa、 F.、 N. Kakiuchi、 K. Funaji、 K. Fukuda、 S. Sekiya、 and S. Nishikawa. 2003. Inhibition of HCV NS3 protease by RNA aptamers in cells. Nucleic Acids Res. 31: 1935-1943.
21. Pagratis、 N.C.、 C. Bell、 Y.F. Chang、 S. Jennings、 T. Fitzwater、 D. Jellinek、 and C. Dang. 1997. Potent 2'-amino、 and 2'-fluoro-2'deoxyribonucleotide RNA inhibitors of keratinocyte growth factor. Nature Biotechnol. 15: 68-73.
22. Park、 C.-H.、 Y.-H. Kee、 J、-H. Lee、 J.-H. Oh、 J.-C. Park、 and H.-J. Myung. 1999. Purification and characterization of recombinant hepatitis C virus replicase. J. Microbiol. Biotechnol. 9: 881-884.
23. Purcell、 R. 1997. The hepatitis C virus: overview. Hepatology 26(Supple. 1): S11-S14.
24. Rusconi、 C.P.、 J.D. Roberts、 G.A. Pitoc、 S.M. Nimjee、 R.R. White、 G. Jr. Quick、 E. Scardino、 W.P. Fay、 and B.A. Sullenger. 2004. Antidote-mediated control of an anticoagulant aptamer in vivo. Nature Biotechnol. 22:1423-1428.
25. Seo、 H.S. and S.W. Lee. 2000. In vitro selection of the 2'-fluoro-2'-deoxyribonucleotide decoy RNA inhibitor of myasthenic autoantibodies. J. Microbiol. Biotechnol. 10: 707-713.
26. Sullenger、 B.A. and E. Gilboa. 2002. Emerging clinical applications of RNA. Nature 418: 252-258.
27. Thiel、 K. 2004. Oligo oligarch-the surprisingly small world of aptamers. Nat. Biotechnol. 22:649-651.
28. Tuerk、 C. and L. Gold. 1990. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249: 505-510.
29. Vo、 N.V.、 J.W. Oh、 and M.M. Lai. 2003. Identification of RNA ligands that bind hepatitis C virus polymerase selectively and inhibit its RNA synthesis from the natural viral RNA templates. Virology 307: 301-316.
30. Zuker、 M. 2003. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31: 3406-3415.

Claims (3)

  1. U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており、5′末端にコレステロールが付着されており、3′末端にはidTが付着された配列番号4の塩基配列に構成される群から選択される少なくとも一つの塩基配列でなされ、
    C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合し、HCVレプリコン増殖を抑制することを特徴とする、C型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するRNA分解酵素抵抗性RNAアプタマー。
  2. U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にはidTが付着された配列番号4のRNAアプタマーに構成される群から選択される少なくとも一つのRNAアプタマーを含み、
    前記RNAアプタマーとHCVが発現する蛋白質NS5Bの特異的結合を検出してHCV感染の診断に使われるのを特徴とする、HCV感染診断キット。
  3. U(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されている配列番号3と配列番号4、及びU(ウラシル)とC(シトシン）の2′ヒドロキシルがフルオロ基に置換されており5′末端にコレステロールが付着されており3′末端にidTが付着された配列番号4のRNAアプタマーに構成される群から選択される少なくとも一つのRNAアプタマーを有効性分とし、
    C型肝炎ウイルス(HCV）のNS5Bに特異的に結合しHCVレプリコン増殖を抑制するのを特徴とする、C型肝炎ウイルスの増殖抑制剤。
JP2009539170A 2006-11-28 2007-06-08 Ｃ型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するｒｎａ分解酵素抵抗性ｒｎａアプタマー Pending JP2010510805A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20060118062 2006-11-28
KR1020070054744A KR100861108B1 (ko) 2006-11-28 2007-06-05 씨형 간염 바이러스 레플리콘 증식을 억제하는 알엔에이분해효소 저항성 알엔에이 압타머
PCT/KR2007/002769 WO2008066231A1 (en) 2006-11-28 2007-06-08 Nuclease-resistant rna aptamer inhibiting replication of hepatitis c virus replicon

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2010510805A true JP2010510805A (ja) 2010-04-08

Family

ID=39804607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009539170A Pending JP2010510805A (ja) 2006-11-28 2007-06-08 Ｃ型肝炎ウイルスレプリコン増殖を抑制するｒｎａ分解酵素抵抗性ｒｎａアプタマー

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8008272B2 (ja)
EP (1) EP2092078B1 (ja)
JP (1) JP2010510805A (ja)
KR (1) KR100861108B1 (ja)
CN (1) CN101605908A (ja)
AT (1) ATE495253T1 (ja)
AU (1) AU2007326284B2 (ja)
CA (1) CA2670447C (ja)
DE (1) DE602007011972D1 (ja)
WO (2) WO2008066230A1 (ja)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010115177A (ja) * 2008-11-14 2010-05-27 Nec Soft Ltd 分解耐性を有するｒｎａアプタマー分子の修飾ヌクレオチド配列の選択方法
JP5825673B2 (ja) * 2009-05-15 2015-12-02 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ペプチドを認識するアプタマー
JP5967687B2 (ja) * 2009-07-17 2016-08-10 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 スフィンゴシルホスホリルコリンに結合するアプタマー分子
KR20120068231A (ko) * 2010-12-17 2012-06-27 한국식품연구원 살모넬라 티피뮤리움 균주의 ｏｍｐＣ단백질에 대해 결합하는 ＲＮＡ 앱타머
RU2501862C1 (ru) * 2012-04-16 2013-12-20 ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук Способ получения терапевтического агента для лечения клещевого энцефалита
KR20220139425A (ko) 2012-07-13 2022-10-14 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
KR101480495B1 (ko) * 2013-04-30 2015-01-12 주식회사 포스코 C형 간염바이러스의 표면 단백질 e2에 대한 압타머 및 이의 용도
WO2016057920A1 (en) * 2014-10-09 2016-04-14 The Research Foundation For The State University Of New York Rna hydrogel
CN107873056A (zh) * 2015-04-01 2018-04-03 维也纳大学 新型表达调节性rna分子及其用途
US10731165B2 (en) 2016-10-06 2020-08-04 The Research Foundation For The State University Of New York RNA hydrogels
CN108330131A (zh) * 2018-01-30 2018-07-27 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抑制丝状病毒感染的抗病毒包膜糖蛋白的rna适配体及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2666142B2 (ja) * 1987-02-04 1997-10-22 旭光学工業株式会社 カメラの自動焦点検出装置
US20050209180A1 (en) 2001-05-18 2005-09-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hepatitis C virus (HCV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7465537B2 (en) 2005-05-01 2008-12-16 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compounds and methods for inhibiting hepatitis C virus replication

Also Published As

Publication number Publication date
DE602007011972D1 (de) 2011-02-24
ATE495253T1 (de) 2011-01-15
KR20080048382A (ko) 2008-06-02
EP2092078A4 (en) 2010-04-07
CN101605908A (zh) 2009-12-16
AU2007326284A1 (en) 2008-06-05
WO2008066231A1 (en) 2008-06-05
EP2092078A1 (en) 2009-08-26
CA2670447A1 (en) 2008-06-05
US20100160617A1 (en) 2010-06-24
WO2008066230A1 (en) 2008-06-05
US8008272B2 (en) 2011-08-30
AU2007326284B2 (en) 2012-01-19
EP2092078B1 (en) 2011-01-12
CA2670447C (en) 2013-02-12
KR100861108B1 (ko) 2008-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100861108B1 (ko) 씨형 간염 바이러스 레플리콘 증식을 억제하는 알엔에이분해효소 저항성 알엔에이 압타머
Alves Ferreira-Bravo et al. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity
Thiviyanathan et al. Aptamers and the next generation of diagnostic reagents
DK2348125T3 (en) Process for the synthesis of a bifunctional complex
Jangra et al. DDX6 (Rck/p54) is required for efficient hepatitis C virus replication but not for internal ribosome entry site-directed translation
Lauridsen et al. Enzymatic recognition of 2′‐modified ribonucleoside 5′‐triphosphates: Towards the evolution of versatile aptamers
Hwang et al. hnRNP L is required for the translation mediated by HCV IRES
Urvil et al. Selection of RNA aptamers that bind specifically to the NS3 protease of hepatitis C virus
JPWO2013073602A1 (ja) 標的タンパク質に結合する核酸断片
Hwang et al. Isolation of specific and high-affinity RNA aptamers against NS3 helicase domain of hepatitis C virus
James Nucleic acid and polypeptide aptamers: a powerful approach to ligand discovery
Stovall et al. In vitro selection using modified or unnatural nucleotides
Vo et al. Identification of RNA ligands that bind hepatitis C virus polymerase selectively and inhibit its RNA synthesis from the natural viral RNA templates
Torres-Vázquez et al. In vitro selection of high affinity DNA and RNA aptamers that detect hepatitis C virus core protein of genotypes 1 to 4 and inhibit virus production in cell culture
JP2008253176A (ja) 高親和性分子取得のためのリンカー
KR101218470B1 (ko) Ｈｃｖ 감염 세포에서 특이적으로 마이크로 ｒｎａ에 대한 안티센스를 방출하는 엡타자임 및 이를 이용한 ｈｃｖ 관련 질환 치료용 조성물
El Awady et al. Antisense oligonucleotide inhibition of hepatitis C virus genotype 4 replication in HepG2 cells
JP2007029061A (ja) ランダムペプチドライブラリーもしくは抗体超可変領域を模倣したペプチドライブラリーと、ｒｎａ結合タンパク質を用いる試験管内ペプチド選択法を組み合わせた、新規の機能性ペプチド創製システム
Shubham Selection of functional RNA aptamers against Ebola glycoproteins
JP2009124946A (ja) Ｐｑｑｇｄｈ制御アプタマー及びその用途
Shin et al. Inhibition of the replication of hepatitis C virus replicon with nuclease-resistant RNA aptamers
Orito et al. High-affinity RNA aptamers to C-reactive protein (CRP): Newly developed pre-elution methods for aptamer selection
Wei et al. Functional XNA and Biomedical Application
KR101384860B1 (ko) 표적 물질 특이적으로 ｓｉＲＮＡ를 방출하는 ＲＮＡ 간섭용 조성물 및 이를 이용한 ＨＣＶ 관련 질환 치료용 조성물
JP2006141305A (ja) 翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇに結合するリボ核酸

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110927

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20111216

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20111226

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120217

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120224

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20120612