JP2010509197A - 選択的グルカゴン様ペプチド−2(glp−2)類似体 - Google Patents
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Abstract
Description
R1−Z1−His−X2−X3−Gly−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−X20−X21−Phe−Ile−X24−Trp−Leu−Ile−X28−Thr−Lys−X31−X32−X33−Z2−R2
により表され、
R1は水素、C1−4アルキル(例えばメチル)、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
X2はGly、AlaまたはSar、
X3はGluまたはAsp、
X5はSerまたはThr、
X6はPheまたはProまたは保存された置換、
X7はSerまたはThr、
X8はAspまたはSerまたは保存された置換、
X9はGluまたはAspまたは保存された置換、
X10はMet、Leu、Nleまたは酸化的に安定なMet−置換アミノ酸、
X11はY1、
X12はThrまたはLysまたは保存された置換、
X13はIle、GluまたはGlnまたは保存された置換、
X14はLeu、MetまたはNleまたは保存された置換、
X15はAspまたはGluまたは保存された置換、
X16はY2、
X17はLeuまたはGluまたは保存された置換、
X18はAlaまたはAibまたは保存されていない置換、
X19はAlaまたはThrまたは保存された置換、
X20はY3、
X21はAspまたはHeまたは保存された置換、
X24はY4、
X28はY5、
X31はPro、Ileまたは欠失、
X32はThrまたは欠失、
X33はAsp、Asnまたは欠失、
R2はNH2またはOHであり、
式中、
Z1およびZ2は独立して存在しないかまたはAla、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、MetおよびOrnからなる群から選択される1から10アミノ酸単位のペプチド配列であり、かつ式IのX11,X16,X20,X24,X28残基のハイドロファティシティ(hydrophaticity)プロファイル(HPP)は、
HPP=Σhpix11+hpix16+hpiX20+hpiX24+hpiX28は≧−10であり、
式中、
X20がArgの場合X11はSerであり、X16がAla、X24がAla、X28がAla、およびZ2がLysまたは医薬的に許容される塩またはその誘導体である条件下で、
Y1、Y2、Y4、およびY5は、Asn、Asp、Glu、Gln、Lys、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、MetおよびPheからなる群から個々に選択でき、かつ
Y3は、Asn,Asp,Glu,Gln,His,Arg,Ala,Ser,Thr,Pro,Gly,Leu,Ile,Val,Met or Pheからなる群から選択できるGLP−2類似体を提供する。1つの態様において、本発明は上に述べたようにHPPが≧−4であるグルカゴン様ペプチド2(GLP−2)類似体を提供する。
R1−Z1−His−X2−X3−Gly−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−Ala−X19−X20−X21−Phe−Ile−X24−Trp−Leu−Ile−X28−Thr−Lys−X31−X32−X33−Z2−R2
により表され、
R1は水素、C1−4アルキル(例えばメチル)、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
X2はGly、AlaまたはSar、
X3はGluまたはAsp、
X5はSerまたはThr、
X6はPheまたはPro、
X7はSerまたはThr、
X8はAspまたはSer、
X9はGluまたはAsp、
X10はMet、Leu、Nleまたは酸化的に安定なMet−置換アミノ酸、
X11はAsn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe Ser、ThrまたはVal、
X12はThrまたはLys、
X13はIle、GluまたはGln、
X14はLeu、MetまたはNle、
X15はAspまたはGlu、
X16はAsn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe Ser、ThrまたはVal、
X17はLeuまたはGlu、
X18はAlaまたはAib、
X19はAlaまたはThr、
X20はAsn、Arg、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe Ser、ThrまたはVal、
X21はAspまたはIle、
X24はAsn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe Ser、ThrまたはVal、
X28はAsn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe Ser、ThrまたはVal、
X31はPro、Ileまたは欠失、
X32はThrまたは欠失、
X33はAsp、Asnまたは欠失、
R2はNH2またはOHであり、
X20がArgの場合X11はSerであり、X16がAla、X24がAla、X28がAla、およびZ2がLysである条件下で、
Z1およびZ2は独立して存在しないかまたはAla、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、MetおよびOrnからなる群から選択される1から10アミノ酸単位のペプチド配列であるか、または医薬的に許容される塩またはその誘導体であるグルカゴン様ペプチド2(GLP−2)類似体を提供する。
X11はAla、Gly、Ile、Leu、Phe Ser、ThrまたはVal、
X16はAla、Gly、Ile、Leu、Phe Ser、ThrまたはVal、
X20はAla、Gly、Ile、Leu、Phe Ser、ThrまたはVal、
X24はAla、Gly、Ile、Leu、Phe Ser、ThrまたはVal、
X28はAla、Gly、Ile、Leu、Phe Ser、ThrまたはVal、
であるグルカゴン様ペプチド2(GLP−2)類似体を含む。
X11はAla、Ile、Leu、Phe、またはVal、
X16はAla、Ile、Leu、Phe、またはVal、
X20はAla、Ile、Leu、Phe、またはVal、
X24はAla、Ile、Leu、Phe、またはVal、
X28はAla、Ile、Leu、Phe、またはVal、
であるグルカゴン様ペプチド2(GLP−2)類似体を含む。
R1−His−Gly−Glu−Gly−Ser−Phe−Ser−X8−Glu−Leu−X11−Thr−Ile−Leu−X15−X16−Leu−Ala−Ala−X20−Asp−Phe−Ile−X24−Trp−Leu−Ile−X28−Thr−Lys−Ile−Thr−Asp−NH2;
により表され、
R1は水素、C1−4アルキル(例えばメチル)、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
X8はAspまたはSer、好ましくはAsp、
X11はSer、Ala、Glu、LysまたはAsn、
X15はGluまたはAsp、好ましくはGlu、
X16はSer、AlaまたはGlu、
X20はSer、AlaまたはGlu、
X24はSer、AlaまたはGlu、および
X28はSer、Ala、GlnまたはGlu、または医薬的に許容される塩またはその誘導体である。
X11はLeu、PheまたはLysであり得る。
X16はLeu、PheまたはLysであり得る。
X20はAlaまたはSerであり得る。
X24はAla、SerまたはLysであり得る。
X28はAla、SerまたはLysであり得る。
定義
他に特定されない限り、以下の定義は上の記述において使用された特定の用語のために提供されるものである。
アミノ酸 HPI値
I 4.5
V 4.2
L 3.8
F 2.8
C 2.5
M 1.9
A 1.8
G −0.4
T −0.7
W −0.9
S −0.8
Y −1.3
P −1.6
H −3.2
E −3.5
Q −3.5
D −3.5
N −3.5
K −3.9
R −4.5
HPP≧−10
HPP≧−4
HPP≧0
として計算される。
熟練者は、例えば以下の記述に基づき、GLP−2類似体の分解産物を検出するための適切な方法(例えば定量法)をデザインすることができる。分解は所定のGLP−2類似体いずれにおいても、同一性およびアミノ酸の位置、およびpH、溶液および温度の状態に依存し、酸化、加水分解および脱アミドとして起こり得る。化合物は、ストレスとなる条件下(即ち、分解の原因となるような状態)でインキュベートし、続いて未変化のペプチドの含量を分析することによる化学的安定性に従い順位付けられる。さらに、ストレスとなる条件下で得られた主要な分解産物について得られた知識は、その後のいずれの分析法開発にも重要となり得る。
熟練者はまた、GLP類似体の哺乳類への投与後の吸収、分布、代謝および排泄を調査するため、またはin vitro細胞システムでの機能試験の一部として、複雑な環境または溶液(例えば血漿、尿、組織破砕物、細胞破砕物、唾液または類似物)中のGLP類似体を検出するための方法(例えば定量法)をデザインできる。
GLP類似体に対する特異的抗体またはその断片は哺乳類において誘導することができ、かつ血清より精製できる。GLP類似体または断片は直接アジュバントと共にウサギ、マウスまたはその他の哺乳類の免疫に使用できるか、またはGLP類似体またはその断片は担体分子(即ち、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン、アルブミンなど)に化学的に結合できアジュバントと共に注射できる。抗体の親和性および選択性を良くするため、注射は2−4週間の間隔で、延長された期間繰り返すことができる。ポリクローナル抗体は血清から直接回収できる。モノクローナル抗体を得るため、免疫動物、好ましくはマウスから分離されたB細胞は抗体産生ハイブリドーマを形成するために腫瘍細胞と融合されなければならない。適切なクローンおよび抗体のスクリーニングと選択は、固定化されたGLP類似体またはそのペプチドの使用とそれに続く標識抗体による検出により行うことができる。あるいは、スクリーニングと選択は、固定化された抗体とそれに続く標識GLP類似体またはその断片による検出に基づき行うことができる。全てのケースにおいて標識は放射性同位元素、酵素、フルオロフォア、またはビオチンであり得て、例えば酵素に特異的な基質(例えば比色定量の、蛍光定量の、または化学発光の)、シンチレーション、または酵素に結合したアビジンの使用およびそれに続く記述された検出法により検出できる。
本発明の類似体は固相または液相のペプチド合成により合成されることが好ましい。この状況において、国際公開第98/11125号および、とりわけSynthetic Peptides(2nd Edition)の中のFields,GB et al.,2002,“Principles and practice of solid−phase peptide synthesis”、およびここでの実施例が参考となる。
本発明の一部でもあるこのような形質転換細胞は、本発明の核酸断片およびベクターの増殖のために使用されるか、または組み換え型の本発明のペプチドの産生のために使用される培養細胞または細胞株であることができる。
本発明のGLP−2類似体またはその塩または誘導体は、保存または投与のために調整された医薬組成物として処方され得て、これは治療上効果的な量の本発明のGLP−2類似体ペプチドまたはその塩または誘導体を医薬的に許容される担体中に含む。
本発明のペプチドは、ここに述べられた効果的な量のGLP−2類似体またはその塩の投与による、食道の上部消化管を含む胃−腸関連疾患を患う個体の予防および治療のための薬剤として有用である。胃および腸関連疾患は、いずれの病因にもよる潰瘍(例えば、消化性潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、薬物誘導性潰瘍、感染またはその他の病原体に関連する潰瘍)、消化疾患、吸収不良症候群、短腸症候群、カルデサック症候群(cul−de−sac syndrome)、炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性結腸炎)、セリアックスプルー(例えばグルテン誘導性腸疾患またはセリアック病)、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、および化学療法および/または放射線血液療法誘導性の粘膜炎および下痢を含む。
装置および合成ストラテジー
ペプチドは、側鎖官能性のためのN−α−アミノ保護基としての9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)および適切な一般保護基を用いた濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中でバッチ式に合成された。
溶媒のDMF(N,N−ジメチルホルムアミド、Riedel de−Haen、ドイツ)は強力な陽イオン交換樹脂を充填したカラム(Lewatit S 100MB/H強酸、バイエルAG Leverkusen、ドイツ)を通して精製し、遊離アミンについては、遊離アミンが存在すると黄色(Dhbt−O−アニオン)を呈する3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン(Dhbt−OH)の添加によって使用前に分析した。溶媒のDCM(ジクロロメタン、分析グレード、Riedel de−Haen、ドイツ)は、精製せず直接使用した。アセトニトリル(HPLC−グレード、Lab−Scan、ダブリン、アイルランド)は、精製せず直接使用した。
Fmoc−保護アミノ酸は側鎖が保護された適切な形でAdvanced ChemTech(ACT)より購入した。
共役試薬のジイソプロピルカルボジイミド(DIG)は、Riedel de−Haen、ドイツ、から購入した。
ペプチドは0.22−0.31mmol/gのTentaGel S樹脂上で合成した。TentaGel S−Ram、TentaGel S RAM−Lys(Boc)Fmoc(Rapp polymere、ドイツ)はC−末端がアミド化されたペプチドが好ましい場合に使用したが、TentaGel S PHB、TentaGel S PHB Lys(Boc)FmocはC−末端が遊離カルボン酸であることが好ましい場合に使用した。
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)はAldrich、ドイツから、ピペリジンおよびピリジンはRiedel−de Haen、フランクフルト、ドイツから、エタンジチオールはRiedel−de Haen、フランクフルト、ドイツから購入した。3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン(Dhbt−OH)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(HOAt)はFluka、スイスから入手した。無水酢酸はFlukaから入手した。
アミノ酸は、in situで産生されたHOBtまたはHOAtエステルとして共役され、DMF中でDICを用い、適切なN−α−保護アミノ酸およびHOBtまたはHOAtから作られた。
Fmoc基の脱保護は、DMF中での20%ピペリジンによる処理(1x5および1x10分)、続くDMFによる洗浄(5x15ml、各5分)により行った。洗浄はDMF廃液中にDhbt−OHを加えた後、黄色が検出されなくなるまで行った。
3当量のN−α−保護アミノ酸を3当量のHOBtおよび3当量のDICと共にDMFに溶解し、次いで樹脂に加えた。
ペプチドは、95%トリフルオロ酢酸(TFA、Riedel−de Haen、フランクフルト、ドイツ)水v/vまたは95%TFAおよび5%エタンジチオールv/vにより室温で2時間処理し、樹脂から切断した。濾過した樹脂は95%TFA水で洗浄し、濾過物および洗浄液は減圧下で蒸発させた。残渣はエーテルで洗浄し、酢酸水から凍結乾燥した。未精製の凍結乾燥物は高速液体クロマトグラフィーにより分析し、マススペクトロメトリー(MS)により同定した。
TentaGel樹脂(1g、0.23−0.24mmol/g)を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置した。樹脂はDMF(15ml)中で膨潤させ、リンカーTentaGel S RAM上、または樹脂TentaGel S RAM−Lys(Boc)Fmoc上の最初のアミノ酸上のいずれかに存在する最初のFmoc基を除去するため、DMF中の20%ピペリジンで処理した。樹脂を排出し、DMF廃液中にDhbt−OHを加えた後黄色が検出されなくなるまで、DMFにより洗浄した。配列に従ったアミノ酸は、上に述べたように予めFmoc保護されたHOBtエステル(3当量)として共役させた。共役は他に記載のない限り2時間継続した。樹脂を排出し、過剰の試薬を除くためにDMFで洗浄した(5x15ml、各5分)。全てのアシル化は、上に述べたようにニンヒドリン試験によって調べた。合成が完了した後、ペプチド−樹脂はDMF(3x15ml、各5分)、DCM(3x15ml、各1分)および最後にジエチルエーテル(3x15ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥した。ペプチドは先に述べたように樹脂から切断し、未精製のペプチド産物は以下に述べるように分析、および精製した。
勾配HPLC分析は、HP 1100 Quaternaryポンプ、HP 1100オートサンプラー、HP 1100カラムサーモスタット、およびHP 1100多波長検出器から成る、Hewlett Packard HP 1100 HPLCシステムを用いて行った。機器の制御およびデータの取得には、LCソフトウェア(rev. A.06.01)のためのHewlett Packard Chemstationを使用した。以下のカラムおよびHPLCバッファーシステムを使用した。
緩衝液:A:MQV中の0.1%TFA;B:0.085%TFA、10%MQV、90%MeCN
勾配:0−1.5分 0%B
1.5−25分 50%B
25−30分 100%B
30−35分 100%B
35−40分 0%B
フロー 1ml/分、乾燥温度40℃、UV検出:I=215nm
未精製のペプチド産物はPerSeptive Biosystems VISION Workstationにて精製した。機器の制御およびデータの取得には、VISION 3.0ソフトウェアを使用した。以下のカラムおよびHPLCバッファーシステムを使用した。
カラム:Kromasil KR 100Å、10mm C−8、250x50.8mm
バッファーシステム:緩衝液:A:MQV中の0.1%TFA;B:0.085%TFA、10%MQV、90%MeCN
勾配:0−37分 0−40%B
フロー 35ml/分、UV検出:I=215nmおよび280nm
ペプチドは、1ないし10mg/mlの濃度になるよう、super gradientメタノール(Labscan、ダブリン、アイルランド)、ミリQ水(Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ)、およびギ酸(Merck、ダルムシュタット、ドイツ)(50:50:0.1v/v/v)に溶解した。ペプチド溶液(20ml)はLCT質量分析計(Micromass,Manchester,UK)を用いたESI−TOF−MSによる陽極性モードで、+/−0.1m/zの精度にて分析した。
全ての合成において、乾燥TentaGel−S−Ram樹脂(1g、0.22−0.31mmol/g)は濾過のためのポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中に配置した。樹脂はDMF(15ml)中で膨潤させ、樹脂上のプロトン化していないアミノ基の存在を確保するためDMF中の20%ピペリジンで処理した。樹脂を排出し、DMF廃液中にDhbt−OHを加えた後黄色が検出されなくなるまで、DMFにより洗浄した。配列に従ったアミノ酸は、上に述べたように予めFmoc保護されたHOBtエステル(3当量)として共役させた。共役は他に記載のない限り2時間継続した。樹脂を排出し、過剰の試薬を除くためにDMFで洗浄した(5x15ml、各5分)。全てのアシル化は、ニンヒドリン試験を80℃で行なうことにより調べた。合成が完了した後、ペプチド−樹脂はDMF(3x15ml、各5分)、DCM(3x15ml、各1分)および最後にジエチルエーテル(3x15ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥した。その後ペプチドは上に述べたように樹脂から切断し、凍結乾燥した。
上記の手法を用いて、1809から1861までの化合物およびリファレンス化合物1559(H−[Gly2]hGLP−2−OH)を上に述べた方法により合成した(表1)。
TentaGel S RAM上の、
H−His−Gly−Glu−Gly−Ser−Phe−Ser−Asp−Glu−Leu−Ala−Thr−Ile−Leu−Glu−Ala−Leu−Ala−Ala−Ala−Asp−Phe−Ile−Ala−Trp−Leu−Ile−Ala−Thr−Lys−Ile−Thr−Asp−NH2
TentaGel S RAM上の、
H−His−Gly−Glu−Gly−Ser−Phe−Ser−Asp−Glu−Leu−Ala−Thr−Ile−Leu−Glu−Ala−Leu−Ala−Ala−Ser−Asp−Phe−Ile−Ser−Trp−Leu−Ile−Ser−Thr−Lys−Ile−Thr−Asp−NH2
TentaGel S RAM−Lys(Boc)−Fmoc上の、
H−His−Gly−Glu−Gly−Ser−Phe−Ser−Asp−Glu−Leu−Ala−Thr−Ile−Leu−Glu−Ala−Leu−Ala−Ala−Ala−Asp−Phe−Ile−Ala−Trp−Leu−Ile−Ala−Thr−Lys−Ile−Thr−Asp−Lys−Lys−Lys−Lys−Lys−Lys NH2
TentaGel S RAM−Lys(Boc)−Fmoc上の、
H−His−Gly−Glu−Gly−Ser−Phe−Ser−Asp−Glu−Leu−Ala−Thr−Ile−Leu−Glu−Ala−Leu−Ala−Ala−Ser−Asp−Phe−Ile−Ser−Trp−Leu−Ile−Ser−Thr−Lys−Ile−Thr−Asp−Lys−Lys−Lys−Lys−Lys−Lys NH2
トリフルオロ酢酸塩から化合物2264の酢酸塩への対イオン交換。未精製の合成ペプチド産物の精製に使用したHPLC緩衝液中に存在するトリフルオロ酢酸(0.1% v/v)により、化合物2264の精製合成ペプチド産物をトリフルオロ酢酸塩として分離した。
トリフルオロ酢酸塩(Tfa)から化合物2264Cの塩化物(Cl−)への対イオン交換。化合物2264Tを0.1Mの塩酸に溶解し、その溶解液を凍結乾燥した。その残留物(remanence)を水に溶解し、純度が90%を超える塩化物になるよう再び凍結乾燥した。
表3に示した化合物を名目上濃度(nominal concentration)が0.5mMになるように0.1M HClに溶解した。サンプルは遮光下、40℃で7日間インキュベートした後、名目上濃度(nominal concentration)が0.2mg/mLになるよう希釈した。主要ピークの回収率をRP−HPLCにより分析し、主要ピークの質量による同一性の確認をLC−MSにより分析した。化合物は0.2mg/mLの名目上濃度(nominal concentration)において、ミリQ水およびMeCN中の0.1%TFAの移動相と共に、3μm、110Å、3x150mmのPhenomenex Gemini C18カラム上で、39分を超える25%から48%MeCNの段階的な実行によるRP−HPLCおよびLC−MSにより分析した。流速は0.400mL/minであった。カラム乾燥温度は50℃、オートサンプラー温度は4℃であり、UV検出は220nmにおいて測定した。
表4に示した化合物を名目上濃度(nominal concentration)が0.25mMになるように0.1M HClに溶解した。サンプルは遮光下、40℃で2日間インキュベートした後、名目上濃度(nominal concentration)が0.2mg/mLになるよう希釈した。主要ピークの回収率をRP−HPLCにより分析した。化合物は0.2mg/mLの名目上濃度(nominal concentration)において、ミリQ水およびMeCN中の0.1% TFAの移動相と共に、3μm、110Å、3x150mmのPhenomenex Gemini C18カラム上で、39分を超える25%から80%MeCNの段階的な実行によるRP−HPLCおよびLC−MSにより分析した。流速は0.400mL/minであった。カラム乾燥温度は50℃、オートサンプラー温度は4℃であり、UV検出は220nmにおいて測定した。
スクリーニングはGLP−2レセプターおよびCRE−ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトを一過性にトランスフェクトしたBHK−21細胞を用いて行なった。用量反応曲線およびEC50値は10fMから10nMまでの7濃度および各濃度につき3点を用いて決定した。全ての試験プレートにコントロールペプチドを使用した。
*)この試験はAMRI(ブダペスト、ハンガリー)により行なわれた。
使用した材料および細胞:
NuncまたはGreiner 組織培養フラスコ
NuncまたはGreiner 10cm TC ペトリ皿(Nunc 172931)
NuncまたはGreiner 娘プレート(daughter plates)用96−ウェルプレート(Nunc 167008)
BHK−21(C13)細胞
白 96−ウェルプレート(PerkinElmer 6005680)希釈用深底ウェルプレート(Nunc 278752)
グラスゴー MEM(Sigma G5154)
フェノールレッド非含有 DMEM(Invitrogen/Gibco 31053−028)
ウシ胎血清(FCS、Invitrogen/Gibco Zealandバッチ)
非必須アミノ酸(100x)(Invitrogen/Gibco 11140−035)
20OmM グルタミン(100x)(Invitrogen/Gibco 25030−024)
ペニシリン/ストレプトマイシン(100x)(Invitrogen/Gibco 15140−122)
ピルビン酸ナトリウム(100x)(Invitrogen/Gibco 11360−039)
D−PBS(Invitrogen/Gibco 14190−094)
1xトリプシン−EDTA溶液(Invitrogen/Gibco 25300−054)
リポフェクタミン 2000(Invitrogen 11668−027)
CRE−luc ベクター(Zealand バッチ)
hGLP2R ベクター(Zealand バッチ)
10%(w/v)無菌BSA添加DMEM(Sigma 05488)
1OmM(20Ox)IBMX添加DMEM(Sigma I5879)
LucLite キット(Perkin Elmer 6016911)
Topseal−A(Perkin Elmer 6005185)
BHK−21(C13)細胞用増殖培地:
グラスゴーMEM+2mMグルタミン(1:100)+10%FCS+1% 非必須アミノ酸+1%ペニシリン/ストレプトマイシン+1mMピルビン酸ナトリウム(1:100).
グラスゴーMEM+2mMグルタミン(1:100)+1%非必須アミノ酸+1mMピルビン酸ナトリウム(1:100)
グラスゴーMEM+2mMグルタミン(1:100)+0.2%FCS+1%非必須アミノ酸+1%ペニシリン/ストレプトマイシン+1mMピルビン酸ナトリウム(1:100)
D−PBS+1%BSA
D−PBS+0.1%BSA
フェノールレッド非含有DMEM+2mMグルタミン(1:100)+50μM IBMX+0.3%BSA
BHK−21細胞は10cm TC−ペトリ皿に撒き、70−80%の培養密度まで増殖させた。次いで、培地を無血清のトランスフェクション用培地に交換した。DNA(7.5μgのhGLP−2レセプターベクターおよび7.5μgのCRE−ルシフェラーゼベクター)およびリポフェクタミン2000をOpti MEMで希釈し組み合わせ、20−30分後に細胞に加えた。細胞は37℃、5%CO2のインキュベーター内で4時間インキュベート、トリプシン処理の後、96−ウェルプレートに1ウェル当たり35,000細胞を再び撒いた。細胞は導入遺伝子を発現させるため、完全増殖倍地中でオーバーナイトでインキュベートした。希釈したGLP−2類似体溶液の調整のために使用した全てのプレートは、予め1%BSAを含むリン酸緩衝食塩水で2時間コートし、オーバーナイトで乾燥させた。GLP−2類似体は250μMになるようPBS/0.1% BSAに溶解し、フェノールレッドおよび血清を含まず、ホスホジエステラーゼ阻害剤および0.3%BSAを含む培地(刺激用緩衝液)中に、10μMおよび100nMの各2段階で希釈した。その後GLP−2類似体は、10nMから10fMへと下る濃度になるよう、同刺激用緩衝液で連続的に希釈した。基線となる活性は刺激用緩衝液のみで制御した。これらの溶液は37℃になるよう予め30分間加温した。細胞は加温(37℃)した刺激用緩衝液で洗浄し、100μlの加温したペプチド希釈液およびコントロールと共に37℃、5%CO2において5時間インキュベートした。LucLite酵素基質/溶解緩衝液はインキュベーションの終了直前に調整した。100μlのLucLite基質を各ウェルに加え、発光を適切なカウンター(例えば、Wallac Victor II)にて測定した。EC50値は、4パラメータロジスティック方程式(Microcal Origin 5.0またはGraphPad 4)を用いてフィッティングした生データに由来する。
本化合物(ZP2264、ZP2266、ZP2267、ZP2268、ZP2242、ZP2269、ZP2270、ZP2272およびZP2242)の結腸質量に比し小腸質量を選択的に刺激する能力を、雄C57BLマウスにおいて決定した。マウスのそれぞれのグループ(n=6−10)に、800nmol/kgの各化合物を1日1回、3日連続で皮下投与した。比較のため、動物の他のグループに等モル量の[Gly2]GLP−2(ZP1559)、または溶媒(リン酸緩衝食塩水、pH7.4)のいずれかを同じ投薬計画にて投与した。化合物の最後の量が投与されてから24時間後にマウスを屠殺し、小腸(幽門から盲腸まで)および結腸(腸末端から盲腸まで)を空にして秤量した。
本発明による試験化合物の効果は、結腸質量に対して選択的に小腸質量を増大させるペプチドの能力に基づき決定した。リファレンス化合物[Gly2]GLP−2およびZP2264、ZP2266、ZP2267、ZP2268、ZP2242、ZP2269およびZP2272の投与後の、溶媒コントロールに対する相対的小腸質量を図1および2に示した。リファレンス化合物[Gly2]GLP−2の小腸質量の結腸質量に対する比への効果に対する試験化合物の同効果を図3および4に示した。[Gly2]GLP−2を投与された動物の結腸質量に対する小腸質量の比を100%に標準化した。リファレンス化合物[Gly2]GLP−2の小腸−結腸感受性指数に対して算出された試験化合物の同指数に基づいた、小腸選択性の試験化合物を表6に示した。[Gly2]GLP−2を投与された動物の小腸−結腸感受性指数は1に標準化した。リファレンス化合物[Gly2]GLP−2に対する試験化合物の小腸および結腸質量に対する効果を表7に示した。[Gly2]GLP−2を投与された動物の結腸質量および小腸質量を100%に標準化した。
雄C57BLマウスにおいて、さらなる化合物の結腸質量に比し小腸質量を選択的に刺激する能力を決定した。1日当たり200nmol/kgの各化合物を投与すること以外は、上記実施例10と同様のプロトコルを用いた。従って、マウスのそれぞれのグループ(n=6−10)に、200nmol/kgの各化合物を1日1回、3日連続で皮下投与した。動物の他のグループに等モル量の[Gly2]GLP−2(リファレンス化合物)、または溶媒(リン酸緩衝食塩水、pH7.4;ネガティブコントロール)のいずれかを同じ投薬計画にて投与した。化合物の最後の量が投与されてから24時間後にマウスを屠殺し、胃、小腸および結腸を空にして秤量した。
本発明による試験化合物の効果は、溶媒コントロールに対して選択的に胃質量を増大させるペプチドの能力に基づき決定した。本化合物(ZP2395、ZP2396、ZP2400、ZP2412、ZP2394、およびZP2401)の結腸質量に比し胃質量を選択的に刺激する能力を、雄C57BLマウスにおいて決定した。マウスのそれぞれのグループ(n=6−10)に、200nmol/kgの各化合物を1日1回、3日連続で皮下投与した。比較のため、動物の他のグループに等モル量の[Gly2]GLP−2、または溶媒(リン酸緩衝食塩水、pH7.4)のいずれかを同じ投薬計画にて投与した。化合物の最後の量が投与されてから24時間後にマウスを屠殺し、胃および小腸(幽門から回盲部まで)を空にして秤量した。体重(BW)のわずかな違いを補正するため、胃の臓器質量はBWに相対的に表した。図7は、化合物ZP2395、ZP2396、ZP2400、ZP2412、ZP2414、ZP2416、ZP2394、およびZP2401が、結腸質量に比し胃質量を選択的に刺激する能力を有することを示している。
所定のレセプターに対して基質が達成するとみられる生物学的特異性の機序は、水素結合、疎水性、静電性結合等に基づいた、基質とレセプターの間の様々な相互作用に関わる。
小腸/結腸感受性指数により小腸選択性であるGLP−2ペプチドのHPIデータを表9に示した。
胃/小腸感受性指数により胃特異的であるGLP−2ペプチドのHPIデータを表11に示した。
先に述べたように、GLP−2類似体のレセプター特異性は上記の位置11、16、20、24および28の水素結合のポテンシャルにより支配されることもまた明らかになった。
胃特異的類似体の例を表14に示す。
X11はLeu、PheまたはLysであり得る。
X16はLeu、PheまたはLysであり得る。
X20はAlaまたはSerであり得る。
X24はAla、SerまたはLysであり得る。
X28はAla、SerまたはLysであり得る。
小腸特異的GLP−2類似体は、上で特に言及した位置11、16、20、24および28の水素結合のポテンシャルのようなパラメーターに支配されることもまた明らかになった。個々のアミノ酸のHBPを表16に示す。
これに従い、幾つかの置換パターンを表17に示す。
Claims (56)
- 一般式I
R1−Z1−His−X2−X3−Gly−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−X20−X21−Phe−Ile−X24−Trp−Leu−Ile−X28−Thr−Lys−X31−X32−X33−Z2−R2
(式中、
R1は水素、C1−4アルキル(例えばメチル)、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
X2はGly、AlaまたはSar、
X3はGluまたはAsp、
X5はSerまたはThr、
X6はPheまたはProまたは保存された置換、
X7はSerまたはThr、
X8はAspまたはSerまたは保存された置換、
X9はGluまたはAspまたは保存された置換、
X10はMet、Leu、Nleまたは酸化的に安定なMet−置換アミノ酸、
X11はY1、
X12はThrまたはLysまたは保存された置換、
X13はIle、GluまたはGlnまたは保存された置換、
X14はLeu、MetまたはNleまたは保存された置換、
X15はAspまたはGluまたは保存された置換、
X16はY2、
X17はLeuまたはGluまたは保存された置換、
X18はAlaまたはAibまたは保存されていない置換、
X19はAlaまたはThrまたは保存された置換、
X20はY3、
X21はAspまたはHeまたは保存された置換、
X24はY4、
X28はY5、
X31はPro、Ileまたは欠失、
X32はThrまたは欠失、
X33はAsp、Asnまたは欠失、
R2はNH2またはOHであり、
式中、
Z1およびZ2は独立して存在しないかまたはAla、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、MetおよびOrnからなる群から選択される1から10アミノ酸単位のペプチド配列であり、かつ式IのX11,X16,X20,X24,X28残基のハイドロファティシティ(hydrophaticity)プロファイル(HPP)は、
HPP=Σhpix11+hpix16+hpiX20+hpiX24+hpiX28 は≧−10であり、
式中、
X20がArgの場合X11はSerであり、X16がAla、X24がAla、X28がAla、およびZ2がLysまたは医薬的に許容される塩またはその誘導体である条件下で、
Y1、Y2、Y4、およびY5は、Asn、Asp、Glu、Gln、Lys、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、MetおよびPheからなる群から個々に選択でき、かつ
Y3 は、Asn,Asp,Glu,Gln,His,Arg,Ala,Ser,Thr,Pro,Gly,Leu,Ile,Val,Met or Pheからなる群から選択できる)で表されるグルカゴン様ペプチド2(GLP−2)類似体。 - HPPが≧−4である、請求項1に記載のグルカゴン様ペプチド2(GLP−2)類似体。
- HPPが≧0である、請求項1に記載のグルカゴン様ペプチド2(GLP−2)類似体。
- 一般式II
R1−Z1−His−X2−X3−Gly−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17−Ala−X19−X20−X21−Phe−Ile−X24−Trp−Leu−Ile−X28−Thr−Lys−X31−X32−X33−Z2−R2
(式中、
R1は水素、C1−4アルキル(例えばメチル)、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
X2はGly、AlaまたはSar、
X3はGluまたはAsp、
X5はSerまたはThr、
X6はPheまたはPro、
X7はSerまたはThr、
X8はAspまたはSer、
X9はGluまたはAsp、
X10はMet、Leu、Nleまたは酸化的に安定なMet−置換アミノ酸、
X11はAsn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe Ser、ThrまたはVal、
X12はThrまたはLys、
X13はIle、GluまたはGln、
X14はLeu、MetまたはNle、
X15はAspまたはGlu、
X16はAsn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe Ser、ThrまたはVal、
X17はLeuまたはGlu、
X18はAlaまたはAib、
X19はAlaまたはThr、
X20はAsn、Arg、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe Ser、ThrまたはVal、
X21はAspまたはIle、
X24はAsn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe Ser、ThrまたはVal、
X28はAsn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe Ser、ThrまたはVal、
X31はPro、Ileまたは欠失、
X32はThrまたは欠失、
X33はAsp、Asnまたは欠失、
R2はNH2またはOHであり、
X20がArgの場合X11はSerであり、X16がAla、X24がAla、X28がAla、およびZ2がLysである条件下で、
Z1およびZ2は独立して存在しないかまたはAla、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、MetおよびOrnからなる群から選択される1から10アミノ酸単位のペプチド配列であるか、または医薬的に許容される塩またはその誘導体)で表されるグルカゴン様ペプチド2(GLP−2)類似体。 - X11はAla、Gly、Ile、Leu、Phe Ser、ThrまたはVal、
X16はAla、Gly、Ile、Leu、Phe Ser、ThrまたはVal、
X20はAla、Gly、Ile、Leu、Phe Ser、ThrまたはVal、
X24はAla、Gly、Ile、Leu、Phe Ser、ThrまたはVal、
X28はAla、Gly、Ile、Leu、Phe Ser、ThrまたはVal、
である、請求項4に記載のGLPグルカゴン様ペプチド2(GLP−2)類似体。 - X11はAla、Ile、Leu、Phe、またはVal、
X16はAla、Ile、Leu、Phe、またはVal、
X20はAla、Ile、Leu、Phe、またはVal、
X24はAla、Ile、Leu、Phe、またはVal、
X28はAla、Ile、Leu、Phe、またはVal、
である、請求項4に記載のGLPグルカゴン様ペプチド2(GLP−2)類似体。 - GLP−2類似体が野生型GLP−2(1−33)に対し少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有し、かつin vivoにおける腸の質量増大の原因となる生物活性を有する請求項1から6のいずれか1項に記載のGLP−2類似体。
- GLP−2類似体が位置X11、X16、X20、X24および/またはX28における1以上の置換および/または前記置換のうちの1以上と位置X3、X5、X7および/またはX10における1以上の置換との組み合わせを有する、請求項1から7のいずれか1項に記載のGLP−2類似体。
- 前記の位置X10における置換がLeu、Nle、またはMet(O)またはMet(O)2のような酸化的に安定なMet−置換アミノ酸である、請求項1または4に記載のGLP−2類似体。
- 一般式III
R1−His−Gly−Glu−Gly−Ser−Phe−Ser−X8−Glu−Leu−X11−Thr−Ile−Leu−X15−X16−Leu−Ala−Ala−X20−Asp−Phe−Ile−X24−Trp−Leu−Ile−X28−Thr−Lys−Ile−Thr−Asp−NH2
(式中、
R1は水素、C1−4アルキル(例えばメチル)、アセチル、ホルミル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルであり、
X8はAspまたはSer、好ましくはAsp、
X11はSer、Ala、Glu、LysまたはAsn、
X15はGluまたはAsp、好ましくはGlu、
X16はSer、AlaまたはGlu、
X20はSer、AlaまたはGlu、
X24はSer、AlaまたはGlu、および
X28はSer、Ala、GlnまたはGlu、または医薬的に許容される塩またはその誘導体)により定義されるGLP−2類似体。 - 表1および表2に開示された、請求項1から10のいずれか1項に記載のGLP−2類似体またはその薬理学的に許容される塩または誘導体。
- 配列
2263 HGEGSFSDELSTILESLAASDFISWLISTKITD−NH2
2264 HGEGSFSDELATILEALAAADFIAWLIATKITD−NH2
2266 HGEGSFSDELETILEELAAEDFIEWLIETKITD−NH2
2267 HGEGSFSDELSTILESLAAADFIAWLIATKITD−NH2
2268 HGEGSFSDELATILEALAASDFISWLISTKITD−NH2
2269 HGEGSFSDELKTILESLAAADFIEWLIQTKITD−NH2
2270 HGEGSFSDELNTILESLAASDFISWLISTKITD−NH2
2272 HGEGSFSDELATILESLAAADFISWLIATKITD−NH2
2242 HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK−OH
で表される、請求項11に記載のGLP−2類似体。 - 位置X3、X5、X7、X11、X16、X20、X24、X28、X31、X32および/またはX33に1を超える置換を有する、請求項1から12のいずれか1項に記載のGLP−2類似体。
- X11、X16、X20、X24、X28がIle、Ala、Leu、PheまたはValから選択される1以上の置換、および位置X31、X32およびX33の任意の欠失、または医薬的に許容される塩またはその誘導体を含む、請求項13記載のGLP−2類似体。
- 位置X11、X16、X20、X24および/またはX28のうち1以上の位置に置換を有する、請求項1から9のいずれか1項に記載のGLP−2類似体。
- X11、X16、X20、X24およびX28がそれぞれ独立してAla、Ser、GlyおよびThrから選択され、かつ該類似体が結腸に比し小腸に対して優先的な増殖促進活性を有する、請求項1、4、または10に記載のGLP−2類似体。
- X11およびX16がそれぞれ独立してAlaおよびSerから選択され、かつX20、X24およびX28が独立してAla、Ser、GlyおよびThrから選択される、請求項16に記載のGLP−2類似体。
- X11およびX16が両者ともAlaであり、かつX20、X24およびX28は独立してAla、Ser、GlyおよびThrから選択される、請求項17に記載のGLP−2類似体。
- X11およびX16が両者ともAlaであり、かつX20、X24およびX28が独立してAlaおよびSerから選択される、請求項17に記載のGLP−2類似体。
- 位置X11、X16、X20、X24およびX28の残基が、以下の組み合わせSer/Ser/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ser/Ser/Ser、Ala/Ala/Ala/Ala/Ser、Ser/Ala/Ser/Ser/Ser、Ala/Ala/Ala/Ser/Ala; Ala/Ala/Ser/Ala/Ala; Ser/Ala/Ala/Ala/Ala; Ser/Ala/Arg/Ala/Ala; Ala/Ser/Ala/Ser/Ala; Ala/Ala/Ala/Ala/Ala のうち1つを含む、請求項16に記載のGLP−2類似体。
- ZP2264、ZP2268、ZP2242、ZP2272、ZP2411、ZP2380、ZP2384、ZP2398、ZP2417、ZP2423、ZP2385、ZP2399、ZP2418、ZP2381、ZP2420またはZP2397である、請求項16に記載のGLP−2類似体。
- X11がLeu、PheおよびLysから選択され、
X16がLeu、PheおよびLysから選択され、
X20がAla、Ser、Leu、GlyおよびThrから選択され、
X24がAlaおよびSerから選択され、
X28がAla、SerまたはLysから選択され、かつ該類似体が結腸に比し胃において優先的な増殖促進活性を有する、請求項1、4、または10に記載のGLP−2類似体。 - X11およびX16が独立してLeuおよびPheから選択され、X24およびX28が独立してLysおよびSerから選択され、かつX20がSerである、請求項22に記載のGLP−2類似体。
- X11およびX16が独立してLeuおよびPheから選択され、かつX20、X24およびX28がSerである、請求項23に記載のGLP−2類似体。
- 位置X11、X16、X20、X24およびX28の残基が、以下の組み合わせ
Lys/Lys/Lys/Lys/Lys; Phe/Phe/Ser/Ser/Ser; Leu/Leu/Ser/Ser/Ser; Leu/Leu/Ala/Ala/Ala のうち1つを含む、請求項22に記載のGLP−2類似体。 - ZP2400、ZP2412、ZP2396、ZP2394、ZP2401またはZP2395である、請求項22に記載のGLP−2類似体。
- 小腸特異的GLP−2類似体の個々の位置11、16、20、24および28のHBP間隔が、全ての位置につき独立して少なくとも0≦HBP11,16,20,24,28≦2でなければならない、請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体。
- 位置11および16がHBP11,16,=0、かつ位置20、24および28が独立して 0≦HBP20,24,28≦2のHBP間隔を有する、請求項27に記載のGLP−2類似体。
- 胃特異的GLP−2類似体の個々の位置11、16、20、24および28のHBP間隔が、全ての位置につき独立して少なくとも0≦HBP11,16,20,24,28≦2でなけらばならない、請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体。
- 位置11および16のHBP間隔がHBP11,16,=0、かつ位置20、24および28のHBP間隔が独立して 0≦HBP20,24,28≦2である、請求項29に記載のGLP−2類似体。
- 治療に用いられる、請求項1から30のいずれか1項に記載のGLP−2類似体。
- 請求項1から31のいずれか1項に記載のGLP−2類似体、またはその塩または誘導体を、担体との混合物として含む医薬組成物。
- 該GLP−2類似体が医薬的に許容される酸付加塩である、請求項32に記載の医薬組成物。
- 前記のGLP−2類似体が注射または点滴による投与に適した液体として処方されるか、または緩慢に放出されるように処方された、請求項32または33に記載の医薬組成物。
- 胃および腸関連疾患を治療および/または予防する薬剤の製剤のための、請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体の使用。
- 該胃および腸関連疾患が、潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群(short−gut syndrome)、カルデサック症候群(cul−de−sac syndrome)、炎症性腸疾患、セリアックスプルー(例えばグルテン誘導性腸疾患またはセリアック病)、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、局所性腸炎(クローン病)、潰瘍性結腸炎、小腸損傷、または短腸症候群である、請求項35に記載の使用。
- 該胃および腸関連疾患が放射線性腸炎、感染性または後感染性腸炎、または有毒剤またはその他の化学療法剤による小腸損傷である、請求項35に記載の使用。
- 化学療法または放射線治療における副作用を治療および/または予防する薬剤の製剤のための、請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体の使用。
- 該化学療法の副作用が下痢、腹部けいれん、嘔吐、および化学療法による治療に起因する腸上皮の構造的および機能的損傷である、請求項39に記載の使用。
- 新生児、骨粗鬆症、またはDPP−IV(ジペプチジルペプチダーゼIV)により媒介される状態を治療する薬剤の製剤のための、請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体の使用。
- 栄養障害に関わる状態を治療および/または予防する薬剤の製剤のための、請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体の使用。
- 該栄養障害に関わる状態が悪液質または食欲不振である、請求項41に記載の使用。
- 請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体をコードする核酸配列を含む核酸分子。
- 請求項40に記載の核酸配列を、その発現を導く制御配列と組み合わせて含む発現ベクター。
- 請求項34に記載の発現ベクターにより形質転換されたホスト細胞。
- 該GLP−2類似体の発現に適した条件下で請求項41に記載のホスト細胞を培養すること、およびそれにより産生されたGLP−2類似体を精製することを含む、請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体の産生方法。
- 請求項43に記載の核酸分子、請求項44に記載の発現ベクター、または請求項41に記載のホスト細胞の治療における使用。
- 胃および腸関連疾患を治療および/または予防するための、または化学療法または放射線治療における副作用を治療および/または予防するための、または新生児、骨粗鬆症、またはDPP−IV(ジペプチジルペプチダーゼIV)により媒介される状態を治療するための薬剤の製剤における、請求項43に記載の核酸分子、請求項40に記載の発現ベクター、または請求項45に記載のホスト細胞の使用。
- 効果的な量の請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体、請求項43に記載の核酸分子、請求項44に記載の発現ベクター、または請求項45に記載のホスト細胞を投与することによる、患者の必要性に応じて胃および腸関連疾患を治療する方法。
- 該胃および腸関連疾患が、潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、消化障害、吸収不良症候群、短消化管症候群(short−gut syndrome)、カルデサック症候群(cul−de−sac syndrome)、炎症性腸疾患、セリアックスプルー(例えばグルテン誘導性腸疾患またはセリアック病)、熱帯性スプルー、低ガンマグロブリン血症スプルー、腸炎、局所性腸炎(クローン病)、潰瘍性結腸炎、小腸損傷、または短腸症候群である、請求項49に記載の方法。
- 該胃および腸関連疾患が放射線性腸炎、感染性または後感染性腸炎、または有毒剤またはその他の化学療法剤による小腸損傷である、請求項49に記載の方法。
- 効果的な量の請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体、請求項43に記載の核酸分子、請求項44に記載の発現ベクター、または請求項45に記載のホスト細胞を投与することを含む、患者の必要性に応じて化学療法または放射線治療における副作用を治療または予防する方法。
- 該化学療法の副作用が下痢、腹部けいれん、嘔吐、または化学療法による治療に起因する腸上皮の構造的および機能的損傷である、請求項52に記載の方法。
- 効果的な量の請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体、請求項43に記載の核酸分子、請求項44に記載の発現ベクター、または請求項45に記載のホスト細胞を投与することを含む、患者の必要性に応じて新生児疾患、肥満、骨粗鬆症、またはDPP−IV(ジペプチジルペプチダーゼIV)により媒介される状態を治療する方法。
- 癌化学療法薬剤および請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体、請求項43に記載の核酸分子、請求項44に記載の発現ベクター、または請求項45に記載のホスト細胞それぞれを任意に医薬的に許容される担体と組み合わせて含む治療キット。
- 癌化学療法薬剤および請求項1から26のいずれか1項に記載のGLP−2類似体、請求項43に記載の核酸分子、請求項44に記載の発現ベクター、または請求項45に記載のホスト細胞を医薬的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物。
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