KR20090089308A

KR20090089308A - 선택적인 글루카곤 유사 펩티드-2(ｇｌｐ-2) 유사체

Info

Publication number: KR20090089308A
Application number: KR1020097009589A
Authority: KR
Inventors: 비야르네 듀 라르센; 이베테 미아타 피터슨
Original assignee: 질랜드 파마 에이/에스
Priority date: 2006-11-08
Filing date: 2007-11-08
Publication date: 2009-08-21
Also published as: AU2007319066B2; UA102506C2; EA023886B1; NZ576260A; EP2051995B1; US10092648B2; IL198127A; NZ597554A; BRPI0718566A2; CN101573376B; JP2010509197A; US8642727B2; MX2009004701A; EP2051995A1; KR101527233B1; WO2008056155A1; IL198127A0; EA200900667A1; US20120004392A1; HK1136310A1

Abstract

h[Gly2]GLP-2에 비하여 하나 이상의 치환을 포함하며 증가된 소장/결장 및 위/결장 민감도의 특성을 가질 수 있는 GLP-2 유사체가 개시된다. 보다 구체적으로, 본 명세서에 개시된 바람직한 GLP-2 유사체는 경우에 따라 위치 2, 및 위치 3, 5, 7 및 10에서의 하나 이상의 추가 치환, 및/또는 아미노산 31 내지 33 중 하나 이상의 아미노산의 결실, 및/또는 N-말단 또는 C-말단 안정화 펩티드 서열의 부가와 함께 야생형 GLP-2 서열의 위치 11, 16, 20, 24 및/또는 28에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 상기 유사체는 위 및 장 관련 장애의 예방 또는 치료 및 화학요법의 부작용의 개선에 특히 유용하다.

Description

선택적인 글루카곤 유사 펩티드-2(ＧＬＰ-2) 유사체{SELECTIVE GLUCAGON-LIKE-PEPTIDE-2(GLP-2) ANALOGUES}

본 발명은 글루카곤 유사 펩티드-2(GLP-2) 유사체; 및 예를 들어, 위 및 장 관련 장애의 예방 또는 치료, 및 화학요법 및 방사선 요법의 부작용의 개선을 위한 상기 유사체의 의학 용도에 관한 것이다.

GLP-2는 장의 장내분비 L 세포 및 뇌간의 특정 영역에서 프로글루카곤의 번역 후 과정으로부터 방출된 33개 아미노산 펩티드이다. 이는 영양분 소화에 반응하여 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1), 옥신토모듈린(oxyntomodulin) 및 글리센틴(glicentin)과 함께 동시 분비된다.

GLP-2는 장샘에서의 줄기세포 증식의 자극 및 융모에 대한 아폽토시스(apoptosis)의 억제를 통해 소장 점막 상피의 유의한 성장을 유도한다(Drucker et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1996, 93: 7911-6). 또한, GLP-2는 위 비우기(emptying) 및 위산 분비를 억제하고(Wojdemann et al. J Clin Endocrinol Metab. 1999, 84: 2513-7), 장 장벽 기능을 증강시키며(Benjamin et al., Gut. 2000, 47: 112-9), 글루코스 수송자의 상향조절을 통해 장 헥소스 수송을 자극하고(Cheeseman, Am J Physiol. 1997, R1965-71), 장 혈류를 증가시킨다(Guan et al., Gastroenterology. 2003, 125, 136-47).

GLP-2는 II형 글루카곤 세크레틴 족(class II glucagon secretin family)에 속하는 단일 G 단백질 결합 수용체에 결합한다(1). GLP-2 수용체는 GLP-2에 대해 반응하는 것으로 공지된 부위인 소장, 결장 및 위에만 국한되어 있다(Yusta et al., Gastroenterology. 2000, 119: 744-55). 그러나, 위장관에서의 GLP-2 수용체 자극에 대한 표적 세포는 불분명한 상태로 남아있고 GLP-2 수용체에 결합된 다운스트림 세포 내 매개자는 잘 알려져 있지 않다.

소장에서의 GLP-2의 입증된 특이적이고도 유익한 효과는 장 질환 또는 손상의 치료에 있어서의 GLP-2의 용도에 대한 많은 관심을 불러 일으켰다(Sinclair and Drucker, Physiology 2005: 357-65). 나아가, GLP-2는 화학요법에 의해 유도된 점막염, 허혈-재관류 손상, 덱스트란 설페이트에 의해 유도된 결장염, 및 염증성 장 질환의 유전적 모델을 비롯한 창자 손상의 많은 임상 전 모델에서 점막 상피 손상을 예방하거나 경감시키는 것으로 밝혀졌다(Sinclair and Drucker Physiology 2005: 357-65).

또한, GLP-2가 위 운동성 및 위산 분비를 감소시킨다는 관찰(Meier et al., 2006)과 함께 위에서 GLP-2R mRNA의 발현(Yusta et al., 2000)은, 위가 GLP-2에 직접 또는 간접적으로 반응적이라는 충분한 증거를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 위장막에 대한 손상을 특징으로 하는 병태에 있어서 GLP-2 또는 GLP-2의 유사체의 사용은 아직 연구되지 않았다.

GLP-2는 하기 서열을 갖는 33개 아미노산 펩티드로서 분비된다: H-His-Ala- Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH. GLP-2는 효소 DPP IV에 의해 NH₂ 말단의 위치 2에 있는 알라닌(A)에서 신속히 절단되어 불활성 인간 GLP-2(3-33)를 생성한다. GLP-2(1-33)의 이 신속한 효소적 분해는 신장을 깨끗이 하는 것(신장 청정) 이외에 상기 펩티드가 약 7분의 반감기를 가지게 한다(Tavares et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 278: E134-E139, 2000).

미국 특허 제5,994,500호(Drucker et al.)에는 GLP-2의 길항제 및 위장 조직의 성장에 대한 이의 효과가 기재되어 있다. 상기 길항제는 증식증(hyperplasia)의 치료 또는 증식증의 유도에 있어서 사용되는 약물로서 제형화된다는 것이 시사되어 있다. 미국 특허 제5,994,500호에서, 포유동물 GLP-2의 구조는 돌연변이 예컨대, 치환 및 결실에 의해 변경되었다.

미국 특허 제6,184,208호, 미국 특허 제5,789,379호 및 미국 특허 제6,184,201호는 GLP-2 유사체들 및 이들의 의학 용도를 개시한다. 상기 유사체들은 인간 GLP-2의 치환 및/또는 결실에 의해 모두 수득된다.

문헌(DaCambra et al., Biochemistry 2000, 39, 8888-8894)에는 GLP-2의 활성에 대한 구조적 결정인자가 기재되어 있다. 이 결정인자의 예로는 Phe6 및 Thr5를 들 수 있고, 이들은 GLP-2 수용체 결합 및 활성화에 있어서 결정적으로 중요한 것으로서 언급되어 있다.

국제특허출원 공개 제WO 97/39031호에서, GLP-2 유사체인 [Gly2]GLP-2가 개 시되어 있다. 여기서, 상기 펩티드가 DPP IV 절단에 대해 내성을 나타내도록 위치 2의 알라닌이 글리신으로 치환되어 있다. 알라닌의 치환은 상기 펩티드의 안정성 및 효능을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 본원은 GLP-2 유사체가 장 상피 점막의 염증 및 파괴와 관련된 질환에 대해 어떻게 사용될 수 있는지를 기술한다. 이들에는 대규모 소장 절제, 염증성 장 질환, 화학요법에 의해 유도된 점막염 및 허혈성 손상이 포함된다.

국제특허출원 공개 제WO 02/066511호에는 생체 내에서의 연장된 반감기를 갖는 GLP-2 유사체, 및 위장 장애 예컨대, 염증성 장 질환의 치료에 있어서 약제로서의 상기 유사체의 용도가 기재되어 있다.

국제특허출원 공개 제WO 01/41779호에는 화학요법에 의해 유도된 아폽토시스를 억제하고 세포 생존을 촉진하는 예비치료제로서의 h[Gly2]GLP-2의 용도가 기재되어 있다.

본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고로 본원에 명백히 도입된다.

다양한 질환의 치료에 있어서 GLP-2 또는 GLP-2의 유사체의 용도는 많은 과학자들에 의해 제안되었다. 그러나, 개선되고 안정한 GLP-2 유사체가 여전히 필요하다.

[발명의 개요]

넓게는, 본 발명은 야생형 GLP-2에 비하여 하나 이상의 치환을 포함하며 생체 내에서의 개선된 증가된 소장 대 결장 민감도, 생체 내에서의 개선된 생물학적 활성 및/또는, 예를 들어, 시험관 내 안정성 분석에서 평가된 바와 같은 개선된 화학적 안정성이라는 성질을 가질 수 있는 GLP-2 유사체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 바람직한 GLP-2 유사체는 경우에 따라 (도입부에 언급된 바와 같이) 위치 2 및 위치 3, 5, 7 및 10의 하나 이상의 추가 보존적 또는 비보존적 치환, 및/또는 야생형 GLP-2 서열의 위치 31 내지 33에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 결실, 및 경우에 따라 N-말단 또는 C-말단 안정화 펩티드 서열의 부가와 함께, 야생형 GLP-2 서열의 위치 8, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 20, 21, 24 및/또는 28에서의 하나 이상의 비보전성 치환을 포함한다. 또한, 본 발명의 GLP-2 유사체는 위치 9, 14 및 15에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 본 발명은 개선된 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 가질 수 있는 GLP-2 유사체를 제공할 뿐만 아니라, 특히 야생형 GLP-2의 위치 Asn11 및/또는 Asn16 및/또는 Arg20 및/또는 Asn24 및/또는 Gln28에서의 하나 이상의 변형을 포함함으로써 결장에 비하여 소장에서 우선적인 장 성장 촉진 활성을 가지거나 반대로 소장에 비하여 결장에서 우선적인 장 성장 촉진 활성을 갖는 화합물을 제공하는 것에 관한 것이다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 하기 일반식 I로 표시되는 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 제공한다:

일반식 I

R¹-Z¹-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z²-R²

(상기 식에서,

R¹은 수소, C_1-4 알킬(예컨대, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;

X2는 Gly, Ala 또는 Sar이며;

X3은 Glu 또는 Asp이고;

X5는 Ser 또는 Thr이며;

X6은 Phe 또는 Pro 또는 보존적 치환이고;

X7은 Ser 또는 Thr이며;

X8은 Asp 또는 Ser 또는 보존적 치환이고;

X9는 Glu 또는 Asp 또는 보존적 치환이며;

X10은 Met, Leu, Nle 또는 산화적으로 안정한 Met 대체 아미노산이고;

X11은 Y1이며;

X12는 Thr 또는 Lys 또는 보존적 치환이고;

X13은 Ile 또는 Glu 또는 Gln 또는 보존적 치환이며;

X14는 Leu 또는 Met 또는 Nle 또는 보존적 치환이고;

X15는 Asp 또는 Glu 또는 보존적 치환이며;

X16은 Y2이고;

X17은 Leu 또는 Glu 또는 보존적 치환이며;

X18은 Ala 또는 Aib 또는 비보존적 치환이고;

X19는 Ala 또는 Thr 또는 보존적 치환이며;

X20은 Y3이고;

X21은 Asp 또는 Ile 또는 보존적 치환이며;

X24는 Y4이고;

X28은 Y5이며;

X31은 Pro 또는 Ile이거나 결실되어 있고;

X32는 Thr이거나 결실되어 있으며;

X33은 Asp 또는 Asn이거나 결실되어 있고;

R²는 NH₂ 또는 OH이며;

Z¹ 및 Z²는, 독립적으로, 존재하지 않거나, Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met 및 Orn으로 이루어진 군에서 선택된 1 내지 10개의 아미노산 단위로 이루어진 펩티드 서열이고;

HPP = ∑ hpi_X11 + hpi_X16 + hpi_X20 + hpi_X24 + hpi_X28로서 계산한 일반식 I의 잔기 X11, X16, X20, X24, X28의 친수도 프로파일(hydrophaticity profile; HPP)이 -10 이상이며;

이때, Y1, Y2, Y4 및 Y5는, 개별적으로, Asn, Asp, Glu, Gln, Lys, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Val, Met 또는 Phe로 이루어진 군에서 선택될 수 있고;

Y3은 Asn, Asp, Glu, Gln, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Val, Met 또는 Phe로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며;

단, X20이 Arg인 경우, X11은 Ser, X16은 Ala, X24는 Ala, X28은 Ala이고 Z²는 Lys이다).

일 실시양태에서, 본 발명은 HPP가 -4 이상인 전술한 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 유사체를 포함한다.

다른 일 실시양태에서, 본 발명은 HPP가 0 이상인 전술한 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 유사체를 포함한다.

다른 일 양태에서, 본 발명은 하기 일반식 II로 표시되는 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 제공한다:

일반식 II

R¹-Z¹-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z²-R²

(상기 식에서,

X2는 Gly, Ala 또는 Sar이며;

X3은 Glu 또는 Asp이고;

X5는 Ser 또는 Thr이며;

X6은 Phe 또는 Pro이고;

X7은 Ser 또는 Thr이며;

X8은 Asp 또는 Ser이고;

X9는 Glu 또는 Asp이며;

X11은 Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr 또는 Val이며;

X12는 Thr 또는 Lys이고;

X13은 Ile 또는 Glu 또는 Gln이며;

X14는 Leu 또는 Met 또는 Nle이고;

X15는 Asp 또는 Glu이며;

X16은 Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr 또는 Val이고;

X17은 Leu 또는 Glu이며;

X18은 Ala 또는 Aib이고;

X19는 Ala 또는 Thr이며;

X20은 Asn, Arg, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr 또는 Val이고;

X21은 Asp 또는 Ile이며;

X24는 Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr 또는 Val이고;

X28은 Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr 또는 Val이며;

X31은 Pro 또는 Ile이거나 결실되어 있고;

X32는 Thr이거나 결실되어 있으며;

X33은 Asp 또는 Asn이거나 결실되어 있고;

R²는 NH₂ 또는 OH이며;

일 실시양태에서, 본 발명은

X11이 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr 또는 Val;

X16이 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr 또는 Val;

X20이 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr 또는 Val;

X24가 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr 또는 Val;

X28이 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr 또는 Val

인 전술한 GLP-2 유사체를 포함한다.

다른 일 실시양태에서, 본 발명은

X11이 Ala, He, Leu, Phe 또는 Val;

X16이 Ala, He, Leu, Phe 또는 Val;

X20이 Ala, He, Leu, Phe 또는 Val;

X24가 Ala, Ile, Leu, Phe 또는 Val;

X28이 Ala, He, Leu, Phe 또는 Val

인 전술한 GLP-2 유사체를 포함한다.

또 다른 일 실시양태에서, 본 발명은 야생형 GLP-2(1-33)와 60% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며 장 질량 생체 내에서 장 질량을 증가시키는 생물학적 활성을 갖는 전술한 GLP-2 유사체를 포함한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 위치 X11, X16, X20, X24 및/또는 X28에서의 하나 이상의 치환(전술한 야생형 서열에 비해 하나 이상의 치환)을 포함하고/포함하거나, 하나 이상의 상기 치환을 위치 X3, X5, X7 및/또는 X10에서의 하나 이상의 치환과 함께 포함하는 GLP-2 유사체를 포함한다.

또 다른 일 실시양태에서, 본 발명은 위치 X10에서의 치환이 Leu, Nle 또는 산화적으로 안정한 Met 대체 아미노산, 예컨대 Met(O) 또는 Met(O)₂인 GLP-2 유사체를 포함한다. 따라서, 전술한 치환에 대해 부가적으로 또는 별법으로, GLP-2 유사체는 위치 X10에서의 Leu, Nle 또는 산화적으로 안정한 Met 대체 아미노산, 예컨대 Met(O) 또는 Met(O)₂를 가질 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, GLP-2 유사체는 본원의 도입부에 기재된 서열을 갖는 야생형 GLP-2(1-33)와 60% 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 63% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 66% 이상의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 69% 이상의 서열 동일성을 갖는다.

GLP-2 폴리펩티드 서열에 대하여 "% 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요하다면, 최대 %의 서열 동일성을 달성하기 위해 갭(gap)을 도입하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후, 야생형 GLP-2 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 서열 정렬은 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 예컨대, BLAST, BLAST2 또는 얼라인(Align) 소프트웨어를 이용하여 당분야에 잘 공지된 기법을 이용하여 당업자에 의해 수행될 수 있고, 상기 소프트웨어에 대해서는 문헌[Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html] 또는 문헌[Pearson et al., Genomics, 46, 24, 36 (1997)] 및 얼라인 프로그램에 대해 웹사이트(http://molbiol.soton.ac.uk/compute/align.html)를 참조한다.

본 발명에 따라 본원 사용되는 % 서열 동일성은 디폴트 셋팅(default setting)을 갖는 이들 프로그램을 이용하여 결정한다. 보다 일반적으로, 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 결정하기에 적절한 매개변수를 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시양태에서, 전술한 GLP-2 유사체는 위치 X3, X5, X7, X11, X16, X20, X24, X28, X31, X32 및/또는 X33에서의 하나 이상의 치환(즉, 전술한 야생형 서열에 비해 하나 이상의 치환)을 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 실시양태에서, X11, X16, X20, X24, X28이 Ile, Ala, Leu, Phe 또는 Val인 치환으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하며; 위치 X31, X32 및 X33의 아미노산 잔기가 경우에 따라 결실되어 있는 전술한 GLP-2 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 실시양태에서, 전술한 GLP-2 유사체는 위치 X11, X16, X20, X24 및/또는 X28 중 하나 이상에서 치환(즉, 전술한 야생형 서열에 비해 치환)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 명세서의 표 1 또는 표 2에 개시된 전술한 GLP-2 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 글루카곤 유사 펩티드(GLP-2) 유사체, 또는 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체는 하기 일반식 III으로 정의된다:

일반식 III

R1-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-X8-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-X15-X16-Leu-Ala-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH₂

(상기 식에서,

X8은 Asp 또는 Ser, 바람직하게는 Asp이며;

X11은 Ser, Ala, Glu, Lys 또는 Asn이고;

X15는 Glu 또는 Asp, 바람직하게는 Glu이고;

X16은 Ser, Ala 또는 Glu이며;

X20은 Ser, Ala 또는 Glu이고;

X24는 Ser, Ala 또는 Glu이며;

X28은 Ser, Ala, Gln 또는 Glu이다).

본 발명의 흥미로운 화합물(일반식 I)은 하기의 표에 기재되어 있고, 상기 화합물은 일반식 III에서 R1에 대해 기술한 바와 같이 N-말단에서 변혈될 수 있으며 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 포함한다:

본 발명의 추가 화합물은 하기 표 1에 나타낸다.

본 발명은 결장에 비해서 소장에서 우선적인 성장 촉진 활성을 갖는 화합물을 제공한다. 특히, 본원에 기재된 실험들은 야생형 GLP-2의 위치 X11 및/또는 X16 및/또는 Asn20 및/또는 X24 및/또는 X28에서 소정의 치환이 결장 질량의 증가에 비해서 시험 동물에 투여할 때 소장 중량의 우선적인 증가를 제공함을 나타낸다. 이러한 발견은 예로 든 화합물이 소장에서 증가된 성장 촉진 효과를 갖는 것이 이로운 병태를 치료하는 데 유용할 수 있는 한편, 결장 또는 소장이 손상되고 결장이 그대로인 병태에 대해 효과가 낮은 것을 의미한다.

따라서, 소장의 성장을 유발하기에 바람직한 화합물은 일반적으로 야생형 GLP-2의 위치 11, 16, 20, 24 및/또는 X28에서(즉, 앞서 주어진 야생형 서열에 대한) 하나 이상의 치환을 포함한다. 이러한 화합물은 결장보다는 소장의 성장을 선택적으로 유발할 수 있다. 그러므로, 그것들은 소장에 영향을 미치거나 또는 소장과 관련된 병태에 사용될 수 있다.

바람직하게는, 그러한 소장 선택적 화합물은 위치 X11, X16, X20, X24 및/또는 X28의 하나 이상에서(즉, 앞서 주어진 야생형 서열에 대한) 치환을 포함한다. 따라서, 소장 선택적 화합물은 X11이 Ser, X16이 Ala, X20, X24가 Ala, X28이 Ala, X31이 Ile, X32가 Thr이고 X33이 Asp인 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 위치 X31, X32 및 X33에서 아미노산 잔기는 경우에 따라 결실될 수 있다.

소장 선택적 화합물에 있어서, X11, X16, X20, X24 및 X28 각각은 독립적으로 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다.

예를 들어, X11 및 X16 각각은 독립적으로 Ala 또는 Ser일 수 있고, X20, X24 및 X28은 독립적으로 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다.

예를 들어, X11 및 X16은 둘 다 Ala일 수 있고, X20, X24 및 X28은 독립적으로 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다.

예를 들어 X11 및 X16은 둘 다 Ala일 수 있고, X20, X24 및 X28은 모두 독립적으로 Ala 또는 Ser일 수 있다.

이러한 일반적인 기준을 벗어나는 다른 잔기 조합은 또한 소장 민감도를 제공할 수 있는 것으로 보인다.

위치 X11, X16, X20, X24 및 X28에서 잔기의 바람직한 조합은, Ser/Ser/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/Ala/Ala/Ala/Ser, Ser/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/Ser/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ala/Ser/Ala; Ala/Ala/Ser/Ala/Ala; Ser/Ala/Ala/Ala/Ala; Ser/Ala/Arg/Ala/Ala; Ala/Ser/Ala/Ser/Ala; Ala/Ala/Ala/Ala/Ala를 포함한다.

소장에서 상피 성장을 자극하는 예로든 화합물로는 ZP2264, ZP2268, ZP2242, ZP2272, ZP2411, ZP2380, ZP2384, ZP2398, ZP2417, ZP2423, ZP2385, ZP2399, ZP2418, ZP2381, ZP2420 및 ZP2397이 있다.

본 발명은 또한 결장에 비하여 위에서 우선적인 성장 촉진 활성을 갖는 화합물에 관한 것이다. 그러므로, 그것들은 위에 영향을 미치거나 위와 관련된 병태에 사용될 수 있다.

바람직하게는, 그러한 위 선택적 화합물은 위치 X11, X16, X20, X24 및/또는 X28의 하나 이상에서 치환(즉, 앞서 주어진 야생형 서열에 대해)을 포함한다. 위치 X31, X32 및 X33의 아미노산 잔기는 경우에 따라 결실될 수 있다.

예를 들어, 위 선택적 화합물에서

X11은 Leu, Phe 또는 Lys일 수 있고,

X16은 Leu, Phe 또는 Lys이며,

X20은 Ala 또는 Ser일 수 있고,

X24는 Ala, Ser 또는 Lys일 수 있으며,

X28은 Ala, Ser 또는 Lys일 수 있다.

예를 들어, X11과 X16이 독립적으로 Leu 또는 Phe일 수 있고, X24 및 X28은 독립적으로 Lys 또는 Ser일 수 있으며, X20이 Ser일 수 있다.

예를 들어, X11 및 X16이 독립적으로 Leu 또는 Phe일 수 있고, X20, X24 및 X28이 Ser일 수 있다.

이러한 일반적인 기준에 벗어나는 다른 잔기 조합은 또한 위 민감도를 제공할 수 있음을 이해할 것이다.

위치 X11, X16, X20, X24 및 X28에서 잔기의 바람직한 조합은 Lys/Lys/Lys/Lys/Lys; Phe/Phe/Ser/Ser/Ser; Leu/Leu/Ala/Ala/Ala; 및 Leu/Leu/Ser/Ser/Ser이 있다.

위에서 상피 성장을 우세하게 자극하는 예로든 화합물은 ZP2400, ZP2412, ZP2396, ZP2395, ZP2394 및 ZP2401이다.

바람직하게는, GLP-2 유사체는 하기 실시예 7에서 기재한 하나 이상의 분해 시험에서 초기 순도에 비해 70% 이상의 관찰 순도를 유지한다. 부가적으로 또는 대안으로, 그것은 12 일 후 HCl 0.1 M의 용액 중의 초기 순도에 비해 60% 이상의 관찰 순도를 유지할 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로, 그것은 6 일 후 NH₄HCO₃ 0.1 M의 용액 중의 초기 순도에 비해 70% 이상의 관찰 순도를 유지할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는 EC50이 1 nM 이상이어서 GLP-2 효현제로서 정의되는 전술한 GLP-2 유사체에 관한 것이다. 본 화합물은 실시예 9에서 기재한 바와 같이 평가하였다. 도 5에서, ZP2264의 EC50은 GLP-2 효현제의 예로서 나타낸다.

추가 양태에서, 본 발명은 담체와 혼합된 상태로, 본원에 정의된 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 조성물이고 상기 담체는 약학적으로 허용되는 담체이다. GLP-2 펩티드 유사체는 GLP-2 유사체의 약학적으로 허용되는 산 부가염일 수 있다.

일 실시양태에서, 본 발명은 주사 또는 주입에 의한 투여에 적합한 액체로서 제형화되거나, 상기 GLP-2 유사체를 서방출하도록 제형화된 약학 조성물로서 본원에서 정의되는 GLP-2 유사체의 용도에 관한 것이다.

추가 양태에서, 본 발명은 치료요법에서의 사용을 위한 본원에서 정의한 GLP-2 유사체, 또는 이의 염을 제공한다.

본 발명은 위 및 장 관련 장애의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 본원에서 정의한 GLP-2 유사체의 용도를 추가 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 위 및 장 관련 장애의 치료 및/또는 예방, 예컨대 장 기능이 손상된 신생아, 골다공증, 및 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 병태의 치료용 약제의 제조를 위한 GLP-2 유사체, 이의 염 또는 유도체의 용도에 관한 것이다. 예로써, 상기 위 및 장 관련 장애로는 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군, 위염, 소화 장애, 흡수장애 증후군, 짧은 창자 증후군, 맹관 증후군, 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 결장염), (예를 들어, 글루텐 유발성 장병증 또는 만성소화장애증으로부터 발병된) 비열대성 스프루우, 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증성 스프루우, 장염, 설사 소장 손상 및 단장 증후군과 관련된 과민성 대장 증후군이 있다.

다른 바람직한 일 실시양태에서, 본 발명은 상기 위 및 장 관련 장애가 방사선 장염, 감염성 또는 감염 후 장염, 또는 독성 물질 또는 다른 화학요법제로 인한 소장 손상인 전술한 GLP-2 유사체의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 화학요법 또는 방사선 요법의 부작용의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 본원에서 정의한 GLP-2 유사체의 용도를 제공한다.

화학요법 및/또는 방사선의 상기 부작용은 설사, 복부 경련, 구토 또는 화학요법 치료로부터 발생된 장 상피의 구조적 및 기능적 손상이다.

본 발명은 신생아, 골다공증 또는 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 병태의 치료용 약제의 제조를 위한 본원에서 정의한 GLP-2 유사체의 용도를 추가 제공한다.

그러므로, 본 발명은 경우에 따라 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 암 화학요법 약물 및 본 발명의 GLP-2 유사체를 포함하는 치료용 키트 또한 제공한다. 상기 두 가지 치료제는 분리 투여를 위해 (예컨대, 별개의 바이알 내에) 별도로 포장될 수 있거나, 동일한 조성물 중에 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 암 화학요법 약물 및 본 발명의 GLP-2 유사체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.

위장 점막 신생물을 가지거나 위장 점막 신생물의 증가된 위험을 가진 환자의 경우, 감소된 부작용 예컨대, 위장 점막 신생물의 자극 또는 악화의 위험을 감소시키거나 없애도록 화합물을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, (양성이든 악성이든 간에) 결장 신생물을 가지거나 결장 신생물을 발생시킬 위험에 있는 환자를 치료하기 위해 화합물을 선택하는 경우, 비선택적 화합물 또는 소장에 비하여 결장에 대해 선택성을 갖는 화합물보다 결장에 비하여 소장에 대해 선택성을 갖는 화합물을 선택하는 것이 더 적절할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 영양실조 예를 들어, 소모성 증후군인 악액질 및 식욕부진과 같은 병태의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 GLP-2 유사체의 용도를 제공한다.

추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 GLP-2 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

추가 양태에서, 본 발명은 경우에 따라 상기 핵산 서열의 발현을 지시하는 서열과 조합된 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 이 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 GLP-2 유사체를 발현하고 분비할 수 있다. 추가 양태에서, 본 발명은 GLP-2 유사체를 발현하기에 적합한 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 이로써 생성된 GLP-2 유사체를 정제하는 단계를 포함하는 GLP-2 유사체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 치료요법에서 사용하기 위한 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 GLP-2 유사체를 발현하고 분비할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 상기 핵산, 발현 벡터 및 숙주 세포가 GLP-2 유사체 자체로 치료될 수 있는 본원에 기재된 장애들 중 임의의 장애의 치료를 위해 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 본 발명의 GLP-2 유사체를 포함하는 치료 조성물 또는 본 발명의 GLP-2 유사체의 투여에 대한 언급은 해당 문맥에 달리 명시되어 있는 경우를 제외하고 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 투여를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

일 실시양태에서, 본 발명은 위 및 장 관련 장애의 치료 및/또는 예방, 또는 화학요법 또는 방사선 요법의 부작용의 치료 및/또는 예방, 또는 신생아, 골다공증 또는 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 병태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 전술한 핵산 분자, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.

추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 GLP-2 유사체 또는 이의 염 또는 유도체, 또는 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 유효량을 투여함으로써 위 및 장 관련 장애의 치료가 필요한 환자에 대해 위 및 장 관련 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 위 및 장 관련 장애의 예는 전술되어 있다.

추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 GLP-2 유사체 또는 이의 염 또는 유도체, 또는 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 화학요법 또는 방사선 요법의 부작용의 치료가 필요한 환자에 대해 상기 부작용을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 GLP-2 유사체 또는 이의 염 또는 유도체, 또는 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 영양실조 예를 들어, 소모성 증후군인 악액질 및 식욕부진과 같은 병태를을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

지금부터, 본 발명의 실시양태는 첨부된 도면과 관련하여 실시예에 의해 더욱 상세히 기재될 것이지만 이로 한정되지 않는다.

[도면의 설명]

도 1은 참조 화합물인 [Gly2]GLP-2와 화합물 ZP2264, ZP2266-ZP2268(800 nmol/kg, 3일간 하루에 한번)의 투여에 따른 비이클 대조군에 대한 상대적인 소장 질량 변화를 도시한다. 상대적인 소장 질량은 비이클 동물에서 100%로서 보여진다. *:비이클에 대하여 P<0.05, $:[Gly2]GLP-2 처리에 대하여 P<0.05

도 2는 참조 화합물인 [Gly2]GLP-2와 화합물 ZP2242, ZP2269 및 ZP2272(800 nmol/kg, 3일간 하루에 한번)의 투여에 따른 비이클 대조군에 대한 상대적인 소장 질량 변화를 도시한다. 상대적인 소장 질량은 비이클 동물에서 100%로서 보여진다. *:비이클에 대하여 P<0.05, $:[Gly2]GLP-2 처리에 대하여 P<0.05

도 3은 화합물 ZP2264, ZP2266-ZP2268(800 nmol/kg, 3일간 하루에 한번)의 투여에 따른 [Gly2]GLP-2 처리 동물에 대한 소장 질량/결장 질량의 비율 변화를 도시한다. 상대적인 소장(SI) 질량은 비이클 동물에서 100%로서 보여진다. $:[Gly2]GLP-2 처리에 대하여 P<0.05

도 4는 화합물 ZP2242, ZP2269, ZP2272 및 ZP2271(800 nmol/kg, 3일간 하루에 한번)의 투여에 따른 [Gly2]GLP-2 처리한 동물에 대한 소장 질량/결장 질량의 비율 변화를 도시한다. 상대적인 소장(SI) 질량은 [Gly2]GLP-2 처리 동물에서 100%로 보여진다.

도 5는 BHK-21 세포에서 재조합 발현된 GLP-2 수용체 상에서 효현에 대한 ZP2264의 시험관 내 스크리닝을 도시한다. ZP2264의 IC50은 효현제에 대해 정의된 범위 내의 웰인 3.55E-12이다.

도 6은 소장에 선택적인 ZP 화합물의 소장/결장 민감도 지수를 도시한다.

도 7은 위에 선택적인 ZP 화합물의 위/결장 민감도 지수를 도시한다.

도 8은 비선택적인 ZP 화합물의 소장/결장 민감도 지수를 도시한다.

[발명의 상세한 설명]

정의

달리 명시하지 않는 한, 상기 설명에서 사용된 특정 용어들에 대한 정의는 하기에 제공된다.

명세서 및 청구의 범위 전체에서, 천연 아미노산에 대한 약정된 1개 문자 및 3개 문자 코드 뿐만 아니라 다른 α-아미노산 예컨대, 사르코신(Sar), 노르류신(Nle) 및 α-아미노이소부티르산(Aib)에 대한 일반적으로 허용되는 3개 문자 코드가 사용된다. 본 발명의 펩티드 내의 모든 아미노산 잔기는 바람직하게는 L-구조를 갖는다. 그러나, D-구조의 아미노산 또한 존재할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "보존적 치환"은 고유의 인간 GLP-2 펩티드 서열의 소정의 위치에 속하는 아미노산 잔기가 하기 표에 정의된 동일 군(I, II, III, IV, V, 1, 2, 3)에 속하는 아미노산 잔기와 교체되는 것을 의미한다:

본원에서 사용되는 바와 같이, "비보존적" 치환은 고유의 인간 GLP-2 서열의 아미노산 잔기의 임의의 다른 치환, 예컨대 비단백질 아미노산(Sar, Nle, Aib)으로 치환 또는 동일한 군에 속하지 않는 아미노산으로 치환을 의미한다.

알파 나선의 한쪽 면의 얻어진 친수도 프로파일을 기술하기 위해, 문헌[Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. (1982) 157, 105-132]에 기재된 개개의 아미노산에 대한 친수도 지수(hpix)를 선택했다. 본 발명에 있어서, 대상인 나선은 아미노산 위치 X11-X16-X20-X24-X28에 의해 윤곽이 잡힌다.

개개의 아미노산의 친수도 지수(HPI)는 문헌[Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. (1982) 157, 105-132]에서 도입되고 정의된 친수도 지수를 이용하여 기재된다.

상기 개개의 아미노산에 대한 HPI 값은:

아미노산 hpi지수

I 4.5

V 4.2

L 3.8

F 2.8

C 2.5

M 1.9

A 1.8

G -0.4

T -0.7

W -0.9

S -0.8

Y -1.3

P -1.6

H -3.2

E -3.5

Q -3.5

D -3.5

N -3.5

K -3.9

R -4.5

일반식 I의 잔기 X11, X16, X20, X24, X28의 얻어지는 친수도 프로파일(HPP)은 HPP = ∑ hpi_X11 + hpi_X16 + hpi_X20 + hpi_X24 + hpi_X28로서 계산된다.

HPP≥-10

HPP≥-4

HPP≥0

Y1, Y2, Y4 및 Y5는 개별적으로 Asn, Asp, Glu, Gln, Lys, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Val, Met 또는 Phe로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

Y3은 Asn, Asp, Glu, Gln, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, He, Val, Met 또는 Phe로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

소장 선택적 화합물에 있어서, HPP≥-10, -4 또는 0인 전반적인 기준 내에서, 위치 11 및 16에 대한 HPI는 독립적으로 -0.8≤HPI≤3.8, 예를 들어 -0.8≤HPI≤2.8, 예컨대 HPI=1.8이어야 하는 것이 바람직할 수 있다.

위치 20, 24 및 28에 대하여, HPI가 독립적으로 -0.8≤HPI_20,24,28≤1.8, 예를 들어 -0.8≤HPI_20,24,28≤1.8, 예컨대 HPI_20,24,28=-0.8이어야 하는 것이 바람직할 수 있다.

따라서, 위치 X11, X16, X20, X24 및 X28 각각에서 잔기는 독립적으로 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다.

예를 들어, X11 및 X16 각각은 독립적으로 Ala 또는 Ser일 수 있고, X20, X24 및 X28은 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다. 예를 들어 X11 및 X16은 Ala일 수 있고, X20, X24 및 X28은 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다.

위치 X11, X16, X20, X24 및 X28에서 바람직한 조합은 Ala/Ala/Ala/Ser/Ser, Ala/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/Ala/Thr/Ser/Ser 및 Ala/Ala/Gly/Ser/Ser을 포함할 수 있다.

위 선택적 화합물에 있어서, HPP≥-10, -4 또는 0인 전반적인 기준 내에서, 위치 11 및 16에 대한 HPI는 독립적으로 -3.9≤HPI_11,16≤3.8이어야 하는 것이 바람직할 수 있다, 예를 들어 HPI_11,16은 2.8≤HPI_11,16≤3.8이거나, 또는 HPI_11,16은 -3.9일 수 있다.

위치 20, 24 및 28에 있어서, HPI가 독립적으로 -3.9≤HPI_20,24,28≤1.8이어야 하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, HPI_20,24,28은-0.8≤HPI_20,24,28≤1.8이거나, 또는 HPI_20,24,28은 -3.9일 수 있다.

따라서, 위치 X11에서 잔기는 Leu, Phe 또는 Lys일 수 있다.

위치 X16에서 잔기는 Leu, Ser, Phe, Lys 또는 Thr일 수 있다.

위치 X20에서 잔기는 Ala, Ser, Leu, Gly 또는 Thr일 수 있다.

위치 X24에서 잔기는 Ala, Ser, Lys, Glu, Gly 또는 Thr일 수 있다.

위치 X28에서 잔기는 Ala, Ser, Lys, Gln, Gly 또는 Thr일 수 있다.

예를 들어, X11 및 X16은 독립적으로 Leu 또는 Phe일 수 있고, X24 및 X28은 독립적으로 Ala 또는 Ser일 수 있다.

본 발명의 바람직한 화합물은 하나 이상의 GLP-2 생물학적 활성, 특히 장 또는 위의 성장을 일으키는 활성을 갖는다. 이는 생체 내 분석으로 평가될 수 있는데, 예를 들어 실시예에서 기술한 바와 같이, 시험 동물을 GLP-2 유사체로 처리하거나 이에 노출시킨 후 장의 질량 또는 이의 부분을 측정한다.

본 발명의 GLP-2 유사체는 고유의 GLP-2 및 전술한 바와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 역위 또는 부가를 갖는다. 본 정의는 또한 동의어 GLP-2 모사체 및/또는 GLP-2 효현제를 포함한다. 또한, 본 발명의 유사체는 그것의 아미노산 측 기, α-탄소 원자, 말단 아미노 기 또는 말단 카르복시산 기의 하나 이상의 화학적 변형을 추가로 가질 수 있다. 화학적 변형으로는 화학적 잔기의 부가, 새로운 결합의 생성 및 화학적 잔기의 제거가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 아미노산 측 기의 변형으로는 리신 ε-아미노 기의 아실화, 아르기닌, 히스티딘 또는 리신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산 카르복시산 기의 알킬화, 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아미드화가 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 말단 아미노의 변형으로는 데스-아미노, N-저급 알킬, N-디-저급 알킬 및 N-아실 변형이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 말단 카르복시 기의 변형은 아미드, 저급 알킬 아미드, 디알킬 아미드 및 저급 알킬 에스테르 변형을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직하게는 본원에서 저급 알킬은 C₁-C₄ 알킬이다. 더욱이, 하나 이상의 측 기 또는 말단 기는 당업계에 숙련된 펩티드 화학자에게 공지된 보호기에 의해 보호될 수 있다. 아미노산의 α-탄소는 모노메틸화 또는 디메틸화될 수 있다.

그것들이 존재하는 경우에, 산화적으로 안정한 Met 대체 아미노산은 Met(O)(메티오닌 설폭시드), Met(O)₂(메티오닌 설폰), Val, He, Asn, Glx(Glu 또는 Gln), Tyr, Phe, Trp 및 바람직하게는 Leu, Nle, Ala, Ser 및 Gly로 이루어진 군에서 선택되는 하나를 의미한다.

본 발명의 펩티드가 염 또는 다른 유도체의 형태로 제공될 수도 있음을 이해해야 한다. 염은 산 부가염 및 염기성 염과 같은 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 산 부가염의 예로는 히드로클로라이드 염, 시트레이트 염 및 아세테이트 염이 있다. 염기성 염의 예로는 양이온이 알칼리 금속, 예컨대 나트륨 및 칼륨, 알칼리 토금속, 예컨대 칼슘, 및 암모늄 이온 ⁺N(R³)₃(R⁴)(이때, R³ 및 R⁴는 독립적으로 경우에 따라 치환된 C_1,6-알킬, 경우에 따라 치환된 C_2-6 알케닐, 경우에 따라 치환된 아릴 또는 경우에 따라 치환된 헤테로아릴을 나타냄)인 염을 들 수 있다. 약학적으로 허용되는 염의 다른 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985] 및 이의 최근 개정판, 및 문헌[Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology]에 기재되어 있다.

본 발명의 GLP-2 유사체의 다른 유도체는 Mn²⁺ 및 Zn²⁺과 같은 금속 이온과의 배위 착물, 생체 내에서 가수분해 가능한 에스테르와 같은 에스테르, 유리산 또는 유리 염기, 수화물, 프로드러그 또는 지질이 포함된다. 에스테르는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 본 화합물에 존재하는 히드록실 또는 카르복실산 기와 적당한 카르복실산 또는 알코올 반응 파트너 사이에 형성될 수 있다. 화합물의 프로드로그로서의 유도체는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 모 화합물들 중 하나로 전환될 수 있다. 전형적으로, 화합물의 생물학적 활성 중 하나 이상의 활성이 본 화합물의 프로드러그 형태에서 감소될 것이고, 본 화합물 또는 이의 대사물질을 방출시키는 프로드러그의 전환에 의해 활성화될 수 있다. 프로드러그의 예에는 원위치에서 제거되어 활성 화합물을 방출시킬 수 있거나 생체 내에서 약물의 제거를 억제하는 데 기여할 수 있는 보호기의 사용이 포함된다.

Z¹ 및 Z²는, 존재하는 경우, 3∼20개 또는 4∼20개 아미노산 잔기의 펩티드 서열, 예를 들어 4-15개 범위, 더 바람직하게는 4∼10개 범위, 특히 4∼7개 범위의 아미노산 잔기, 예를 들어 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 잔기, 예컨대 6개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 서열을 각각 독립적으로 나타낸다. 펩티드 서열 Z 내의 아미노산 잔기들은 Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met 및 Orn로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 잔기는 Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Orn 및 Met 뿐만 아니라, WO01/04156에서 정의된 바와 같은 일반식 I에 포함되는 아미노산, 예를 들어 Dbu(2,4-디아미노부티르산) 또는 Dpr(2,3-디아미노프로판산)으로부터 선택되며, 더 바람직하게는 Glu, Lys 및 Met로부터 선택되고, 특히 Lys이다. 전술한 아미노산은 D-구조 또는 L-구조를 가질 수 있지만, 바람직하게는 전술한 아미노산은 L-구조를 갖는다. 특히 바람직한 서열 Z는 4개, 5개 또는 6개의 연속적 리신 잔기, 특히 6개의 연속적인 리신 잔기로 이루어진 서열이다. 실예가 되는 서열 Z는 WO 01/04156호에 개시되어 있다.

소정의 실시양태에 있어서, Z¹은 존재하지 않는다. 그러한 경우에, Z²는 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다.

EC50이 적어도 1 nM인 GLP-2 유사체를 GLP-2 효현제로서 정의한다.

본 발명은 이하의 실험 부분에서 추가로 기재될 하기의 펩티드를 포함한다.

본 발명의 특히 바람직한 화합물은 화합물 ZP2264, ZP2267, ZP2268 및 ZP2270을 포함한다.

안정성 연구

당업자는 예를 들어 하기 기재된 것에 기초하여 GLP-2 유사체의 분해 생성물의 검출에 적합한 방법(예를 들어, 정량적 방법)을 디자인할 수 있을 것이다. 분해는 임의의 소정의 GLP-2 유사체 내의 아미노산의 정체(동일성) 및 위치, 및 pH, 용액 및 온도와 같은 조건에 따라 산화, 가수분해 및 탈아미드화로서 일어날 수 있다. 화합물은 그가 스트레스를 받는 조건(즉, 분해를 초래할 수 있는 조건) 하에 항온처리된 후 잔존하는 완전한 펩티드의 함량에 대해 분석될 때 화학적 안정성에 따라 등급이 매겨질 수 있다. 또한, 스트레스를 받는 조건 하에 수득된 주 분해 생성물에 대해 얻은 지식은 향후 임의의 분석 방법 개발에 중요할 것이다.

GLP-2 유사체를 검출하기 위한 정량 분석

당업자는, GLP-2 유사체를 포유동물에게 투여한 후 GLP-2 유사체의 흡수, 분배, 물질대사 및 분비를 조사하기 위해 또는 시험관 내 세포 시스템의 기능적 연구의 일부로서, 복잡한 환경 또는 용액(예를 들어, 혈장, 소변, 조직 균질화물, 세포 균질화물, 타액 또는 이들과 유사한 것) 중의 GLP-2 유사체의 검출을 위한 방법(예를 들어, 정량적 방법)을 디자인할 수도 있다.

한 실시양태에서, 정량 분석은 GLP-2 유사체 또는 이의 단편에 대해 생성된 항체를 기초로 할 수 있다. 면역화된 동물로부터 수득된 항체를 정량 분석에 사용할 수 있다. 한 예에서, 멀티-웰 플레이트(multi-well plate) 내에 고정된 분자의 한 일부에 대한 친화성을 갖는 제1 항체를 사용하여 직접적 샌드위치 ELISA를 준비할 수 있다. 그 다음, 샘플을 상기 웰에 첨가하고 GLP-2 유사체를 상기 제1 항체에 의해 포획한다. 이어서, 포획된 GLP-2 유사체는 GLP-2 유사체의 또 다른 일부에 대한 친화성을 갖는 제2 항체에 의해 인식된다. 상기 제2 항체는 효소[호스라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제 또는 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase)] 또는 방사성 동위원소로 표지할 수 있다. 그 후, 포획된 GLP-2 유사체의 양은 비색성 기질의 첨가, 방사성 방출의 직접적 카운팅 또는 섬광에 의해 검출될 수 있다. 별법으로, 포획된 GLP-2 유사체의 양은 제2 항체에 대한 치환성을 갖는 표지된 항체의 첨가에 의해 간접적으로 검출될 수 있다. 샘플 중의 농도는 공지된 양의 GLP-2 유사체를 함유하는 외부 표준 곡선으로부터 수득된 반응으로부터 추정될 수 있다. 별법으로, 항체는 직접적인 경쟁적 면역분석을 준비하는 데 사용될 수 있고, 이때 GLP-2 유사체에 특이적인 항체는 멀티-웰 플레이트 상에 고정되고, 샘플은 소정의 고정된 농도의 표지된 GLP-2 유사체와 함께 상기 웰 중에서 항온처리된다. 표지는 효소, 형광발색단, 방사성 동위원소 또는 바이오틴일 수 있고, 예를 들어, 상기 효소에 특이적인 기질(예컨대, 비색성, 형광성 또는 화학발광성 기질), 섬광 또는 효소에 결합된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있고, 그 후 이들은 전술한 바와 같이 검출될 수 있다. 결합된 표지된 GLP-2 유사체의 양은 적절한 방법에 의해 검출될 수 있고, 샘플 중에 존재하는 GLP-2 유사체의 농도는 상기 외부 표준 곡선으로부터 수득된 반응으로부터 유도될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 정량 분석은 액체 크로마토그래피 초정밀 질량 분광법을 기초로 할 수 있다. 이러한 구성 하에서, 연구될 GLP-2 유사체에 특이적인 단편으로부터의 반응은 불활성 기체(He 또는 Ar)와의 충돌에 의해 유도된 모 화합물의 단편화에 대해 모니터링된다. 단편화 전, 샘플 성분들을 역상 크로마토그래피로 분리할 수 있거나 샘플을 질량 분광계에 직접 주입할 수 있다. 적절한 경우, 샘플을 전처리(즉, 프로테아제 억제제의 첨가, 단백질 침전, 고체 상 추출, 면역-친화 추출 등)할 수 있다. 가능하게는, 연구될 GLP-2 유사체와 유사한 내부 표준을 사용한 반응의 보정 후에, 샘플 중에 존재하는 GLP-2 유사체의 농도를 상기 외부 표준 곡선으로부터 수득된 반응으로부터 유도한다.

특이적 항체의 생성

GLP 유사체 또는 이의 단편에 대한 특이적 항체를 포유동물에서 유도하여 혈청으로부터 정제할 수 있다. GLP 유사체 또는 단편은 토끼, 마우스 또는 다른 포유동물을 면역화시키기 위해 보강제와 함께 직접 사용될 수 있거나, GLP 유사체 또는 이의 단편은 담체 분자(즉, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 오브알부민, 알부민 등)에 화학적으로 결합시켜 보강제와 함께 주사될 수 있다. 주사는 항체의 친화성 및 선택성을 개선하기 위해 연장된 기간 동안 2 내지 4주 간격으로 반복될 수 있다. 폴리클로날 항체는 혈청으로부터 직접 수거될 수 있다. 모노클로날 항체를 수득하기 위해, 면역화된 동물, 바람직하게는 마우스로부터 단리된 B 세포를 종양 세포와 융합시켜 항체 생성 하이브리도마를 형성해야 한다. 적절한 클론 및 항체의 스크리닝 및 선별은 고정된 GLP-2 유사체 또는 이의 펩티드를 사용한 후 표지된 항-항체로 검출함으로써 수행될 수 있다. 별법으로, 상기 스크리닝 및 선별은 항체의 고정 후 표지된 GLP-2 유사체 또는 이의 단편을 사용한 검출을 기초로 할 수 있다. 모든 경우, 표지는 방사성 동위원소, 효소, 형광발색단 또는 바이오틴일 수 있고, 예를 들어, 상기 효소에 특이적인 기질(예컨대, 비색성, 형광성 또는 화학발광성 기질), 섬광 또는 효소에 결합된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있고, 그 후 이들은 전술한 바와 같이 검출될 수 있다.

GLP-2 유사체의 합성

고체 상 또는 액체 상 펩티드 합성을 이용하여 본 발명의 유사체를 합성하는 것이 바람직하다. 이와 관련하여, 국제특허출원 공개 제WO 98/11125호, 및 많은 다른 문헌들 중 문헌[Fields, GB et al., 2002, "Principles and practice of solid-phase peptide synthesis". In: Synthetic 펩티드 (2nd Edition)] 및 본원의 실시예를 참조한다.

따라서, GLP-2 유사체는 예를 들어,

(a) 고체 상 또는 액체 상 펩티드 합성을 이용하여 펩티드를 합성하고, 이로써 수득된 합성 펩티드를 회수하는 단계; 또는

(b) 펩티드가 천연 발생 아미노산으로 구성되는 경우, 숙주 세포에서 펩티드를 코딩하는 핵산 작제물(construct)을 발현시키고 숙주 세포 배양물로부터 발현 생성물을 회수하는 단계; 또는

(c) 펩티드가 천연 발생 아미노산으로 구성되는 경우, 펩티드를 코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관 내 발현을 수행하고 발현 생성물을 회수하는 단계; 또는

상기 (a), (b) 및 (c)의 단계를 조합하여 펩티드의 단편을 수득한 후 상기 단편을 결찰시켜 펩티드를 수득하고 상기 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 비롯한 다수의 방법으로 합성될 수 있다.

따라서, 본 발명의 일부 유사체의 경우, 유전공학적 기법을 활용하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 경우는 펩티드가 충분히 크고 (융합 작제물로서 생성된 경우) 펩티드가 살아있는 유기체 내에서 RNA로부터 번역될 수 있는 천연 발생 아미노산만을 포함하는 경우일 수 있다.

재조합 유전자 기술을 위해, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 단편이 중요한 화학적 생성물이다. 그러므로, 본 발명의 추가 양태는 본 발명의 GLP-2 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는데, 이때 펩티드는 바람직하게는 천연 발생 아미노산으로 구성된다. 본 발명의 핵산 단편은 DNA 또는 RNA 단편이다.

본 발명의 핵산 단편은 통상적으로 클로닝에 적합한 벡터 또는 본 발명의 핵산 단편을 보유하는 발현 벡터 내에 삽입될 것이고, 이러한 신규 벡터 또한 본 발명의 일부이다. 본 발명의 상기 벡터의 작제에 대한 상세한 설명은 하기 형질전환된 세포 또는 미생물에 관한 내용에서 논의될 것이다. 상기 벡터는 적용 목적 및 유형에 따라 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니(mini)-염색체 또는 바이러스의 형태일 수 있으나, 일부 세포에서 일시적으로만 발현되는 노출된 DNA 역시 중요한 벡터이다. 본 발명의 바람직한 클로닝 및 발현 벡터(플라스미드 벡터)는 자가 복제할 수 있어서 고도 발현 또는 후속 클로닝을 위한 고도 복제를 위한 높은 카피 수(copy-number)를 부여할 수 있다.

본 발명의 벡터의 일반적인 윤곽은 5'→3' 방향 및 작동 가능한 결합으로 하기 특징들을 포함한다: 본 발명의 핵산 단편의 발현을 유도하기 위한 프로모터, 경우에 따라 (세포외 상, 또는 적용 가능한 경우, 원형질막 주위 공간 내로의) 분비를 가능하게 하는 리더 펩티드, 또는 다중 용도 예컨대, 조합 분비, 정제 태그, 및 펩티드를 교정하거나 폴리펩티드 단편을 막 내로 통합시키기 위한 효소적 트리밍을 위한 리더 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 단편, 및 경우에 따라 종결신호를 코딩하는 핵산 서열. 생산자 균주 또는 세포주 내에서 발현 벡터를 사용하는 경우, 상기 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 것이 형질전환된 세포의 유전적 안정성을 위해 바람직하다.

본 발명의 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시켜 본 발명의 변형된 펩티드를 생성한다. 본 발명의 일부이기도 한 이러한 형질전환된 세포는 본 발명의 핵산 단편 및 벡터의 증식을 위해 사용되거나 본 발명의 펩티드의 재조합 제조에 사용되는 항온처리된 세포 또는 세포주일 수 있다.

본 발명의 바람직한 형질전환된 세포는 미생물 예컨대, 박테리아[예컨대, 에스케리치아(Escherichia)(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 바실러스(Bacillus)(예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 살모넬라(Salmonella) 또는 마이코박테리움(Mycobacterium)(바람직하게는, 비-병원성 마이코박테리움, 예를 들어, 엠. 보비스(M. bovis) BCG) 종], 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 및 원충류(protozoans)이다. 별법으로, 형질전환된 세포는 다세포 유기체로부터 유래될 수 있고, 즉 형질전환된 세포는 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다. 또한, 인간으로부터 유래된 세포가 흥미로운데, 이에 대해서는 하기 세포주 및 벡터에 관한 논의 부분을 참조한다. 클로닝 및/또는 최적화된 발현을 위해, 형질전환된 세포가 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있는 것이 바람직하다. 핵산 단편을 발현하는 세포는 본 발명의 바람직한 유용한 실시양태이고, 상기 세포는 본 발명의 펩티드의 소규모 또는 대규모 제조를 위해 사용될 수 있다.

형질전환된 세포를 이용하여 본 발명의 펩티드를 생성하는 경우, 결코 필수적인 것은 아니지만 발현 생성물이 항온처리 배지 내로 배출되거나 형질전환된 세포의 표면 상에 보유되는 것이 편리하다.

효과적인 생성자 세포가 확인된 경우, 이를 기초로 하여, 본 발명의 벡터를 보유하며 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 단편을 발현하는 안정한 세포주를 확립하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이 안정한 세포주는 본 발명의 펩티드를 분비하거나 보유하여, 이의 정제를 용이하게 한다.

일반적으로, 숙주 세포에 적합한 종으로부터 유래된 복제단위(replicon) 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 숙주와 관련하여 사용된다. 통상적으로, 상기 벡터는 형질전환된 세포에서 표현형적 선별을 제공할 수 있는 표지 서열 뿐만 아니라 복제 부위 또한 보유한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322(그러나, 다수의 다른 유용한 플라스미드가 존재함)를 사용하여 형질전환시킨다[예를 들어, 문헌(Bolivar et al., 1977)을 참조한다]. pBR322 플라스미드는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 보유하여 형질전환된 세포를 확인하기에 용이한 수단을 제공한다. 또한, pBR 플라스미드, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 파지는 원핵 미생물에 의해 사용될 수 있는 발현용 프로모터를 포함해야 하거나 포함하도록 변형되어야 한다.

원핵생물의 재조합 DNA 작제에 가장 흔하게 사용되는 이들 프로모터들은 β-락타메이즈(lactamase)(페니실리나제), 락토스 프로모터 시스템(Chang et al., 1978; ltakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) 및 트립토판 프로모터 시스템(Goeddel et al., 1979; 유럽특허 제0 036 776호 A)을 포함한다. 이들이 가장 흔하게 사용되지만, 다른 미생물 유래의 프로모터가 발견되어 사용되고 있고, 이들의 뉴클레오티드 서열에 대한 상세한 설명은 공개되어 있어 당업자가 이들을 플라스미드 벡터에 기능적으로 결찰시킬 수 있다(Siebwenlist et al., 1980).

원핵생물 이외에, 진핵 미생물 예컨대, 효모 배양물도 사용될 수 있고, 이 경우에도 프로모터가 발현을 유도할 수 있어야 한다. 사카로마이세스 세레비지애, 또는 다른 흔한 제빵 효모는 다수의 다른 균주가 통상적으로 사용될 수 있다 하더라도 진핵 미생물들 중에서 가장 흔하게 사용된다. 사카로마이세스에서 발현시키는 경우, 예를 들어, 플라스미드 YRp7이 통상적으로 사용된다(Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). 이 플라스미드는 트립토판의 존재 하에 증식하는 능력이 없는 돌연변이 효모 균주 예를 들어, ATCC 제44076호 또는 PEP4-1(Jones, 1977)에 대한 선별 마커를 제공하는 trp1 유전자를 이미 함유한다. 따라서, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서의 trp1 부위의 존재는 트립토판의 부재 하의 증식에 의한 형질전환을 검출하기에 효과적인 환경을 제공한다.

효모 벡터 내의 적절한 프로모터 서열에는 3-포스포글리세레이트 키나제(phosphoglycerate kinase)(Hitzman et al., 1980) 또는 다른 해당효소(Hess et al., 1968; Holland et al., 1978) 예컨대, 에놀라제(enolase), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터들이 포함된다. 또한, 적절한 발현 플라스미드의 작제에 있어서, 이들 유전자들과 관련된 말단 서열들을 발현될 소정의 서열의 발현 벡터 3'에 결찰시켜 mRNA의 폴리아데닐화 및 종결을 제공한다.

증식 조건에 의해 조절되는 전사의 부가적 이점을 갖는 다른 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 상기 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 적합성 프로모터, 복제 기점 및 말단 서열을 함유하는 임의의 플라스미드 벡터가 적합하다.

미생물 이외에, 다세포 유기체로부터 유래된 세포의 배양물을 숙주로서 사용할 수도 있다. 원리적으로, 이러한 세포 배양물들 중 임의의 배양물은 척추동물 배양물로부터 유래된 것이든 아니면 무척추동물 배양물로부터 유래된 것이든 사용 가능하다. 그러나, 척추동물 세포가 가장 흥미롭고, 배양물(조직 배양물) 중에서의 척추동물 세포의 증식은 최근 통상적으로 이용되는 기법이 되었다(Tissue Culture, 1973). 이러한 유용한 숙주 세포주의 예는 VERO 및 HeLa 세포, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포주, 및 W138, BHK, COS-7 293, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(SF) 세포[프로테인 사이언스(단백질 Sciences; 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A.) 및 인비트로겐(Invitrogen; PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The Netherlands)으로부터 완전한 발현 시스템으로서 시판됨], 인비트로겐으로부터 시판되는 디. 멜라노가스터(D. melanogaster) 세포주 S₂, 및 MDCK 세포주이다.

이러한 세포를 위한 발현 벡터는 통상적으로 (필요한 경우) 복제 기점; 임의의 필요한 리보좀 결합 부위와 함께, 발현될 유전자의 앞 부분에 위치된 프로모터; RNA 스플라이스 부위; 폴리아데닐화 부위; 및 전사 종결신호 서열을 포함한다.

포유동물 세포에서 사용하기 위해, 발현 벡터에 대한 조절 기능도 종종 바이러스 물질에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스 2, 및 가장 흔하게는 원숭이 바이러스 40(SV40)으로부터 유래된 것이다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터가 특히 유용한데, 이는 이들 둘다가 복제의 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 단편으로서 바이러스로부터 용이하게 수득되기 때문이다(Fiers et al., 1978). 보다 작거나 보다 큰 SV40 단편 역시 사용될 수 있되, HindiII 부위부터 바이러스 복제 기점에 위치된 BgII 부위를 향해 연장되어 있는 대략 250 bp 서열을 포함해야 한다. 추가로, 원하는 유전자 서열과 일반적으로 관련되어 있는 프로모터 또는 조절 서열을 사용할 수도 있고 상기 조절 서열의 사용이 종종 바람직할 수 있되, 상기 조절 서열은 숙주 세포 시스템에 적합해야 한다.

복제 기점은 외인성 기점, 예를 들어, SV40 또는 다른 바이러스(예컨대, 폴리오마, 아데노, VSV, BPV)로부터 유래될 수 있는 외인성 기점을 포함하도록 벡터를 작제함으로써 제공될 수 있거나 숙주 세포 염색체 복제 기작에 의해 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 통합되는 경우, 종종 숙주 세포 염색체 복제 기작에 의한 복제 기점의 제공만으로도 충분하다.

재조합 제조 방법에서 만족스러운 수율을 얻기 위해, (정제의 용이성을 위한) 친화성 태그로서 작용할 수 있는 융합 파트너에 펩티드를 융합시키고/시키거나 펩티드의 많은 반복부를 가짐으로써 본 발명의 유사체를 융합 단백질로서 제조하는 것이 유리할 수 있다. 이 방법은 펩티다제에 적합한 절단 부위의 존재를 필요로 하지만, 당업자는 기초가 되는 유전적 작제물을 알맞게 제작하는 방법을 알 것이다.

재조합 제조 후, 본 발명의 펩티드는 다단계 크로마토그래피(이온 교환, 크기 배제, 및 친화성 크로마토그래피 기법)를 비롯하여 당분야에 일반적으로 공지된 방법에 의해 정제될 수 있다.

별법으로, 천연 발생 아미노산으로 구성된 펩티드를 시험관 내 무세포 시스템에서 제조할 수 있다. 이는 펩티드가 잠정적 숙주 세포에 대해 독성을 나타낼 수 있는 경우 특히 적합하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 제조하기 위해 시험관 내 무세포 번역/발현의 사용 또한 예상한다. 이와 관련하여, 예를 들어, 암비온 인코포레이티드(Ambion Inc.; 2130 Woodward, Austin, TX 78744-1832, USA)로부터 시판되는 시험관 내 번역 키트, 재료 및 기술적 자료를 참조한다.

마지막으로, 물론 이용 가능한 방법들은 예를 들어, 반합성 유사체들을 제조할 수 있도록 조합될 수도 있다. 이러한 구성에 있어서, 2개 이상의 분리된 단계들 또는 방법들을 이용하여 펩티드 단편을 제조한 후, 단편들을 결찰시켜 최종 펩티드 생성물을 수득한다.

약학적 조성물 및 투여

본 발명의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체는 치료 유효량의 본 발명의 GLP-2 펩티드, 또는 이의 염 또는 유도체를 약학적으로 허용되는 담체 중에 포함하는, 저장용 또는 투여용으로 제조된 약학 조성물로서 제형화될 수 있다.

치료 유효량의 본 발명의 화합물은 투여 경로, 치료될 포유동물의 유형, 및 고려되는 특정 포유동물의 신체적 특징에 달려 있을 것이다. 이들 인자들, 및 이들과 상기 양의 결정 사이의 관계는 의학 분야의 숙련된 기술자에게 잘 공지되어 있다. 이 양 및 투여 방법은 펩티드를 대장까지 전달하기 위해 최적의 효능을 달성하도록 조정될 수 있지만, 체중, 식사, 병행 약물 치료, 및 의학 분야의 숙련된 자에게 잘 공지된 다른 인자들에 달려 있을 것이다.

GLP-2 유사체 또는 이의 염이 위 및 장 관련 장애의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 존재하는 약학 조성물을 제공하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.

산성 잔기를 갖는 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 유기 염기 및 무기 염기를 사용하여 형성할 수 있다. 염기를 사용하여 형성한 적절한 염에는 금속 염, 예컨대, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어, 나트륨, 칼륨 또는 마그네슘 염; 암모니아 염 및 유기 아민 염, 예컨대, 모르폴린, 티오모르폴린, 피페리딘, 피롤리딘, 모노-저급 알킬아민, 디-저급 알킬아민 또는 트리-저급 알킬아민(예를 들어, 에틸-tert-부틸아민, 디에틸아민, 디이소프로필아민, 트리에틸아민, 트리부틸아민 또는 디메틸프로필아민), 또는 모노히드록시, 디히드록시, 트리히드록시 저급 알킬아민(예를 들어, 모노에탄올아민, 디에탄올아민 또는 트리에탄올아민)을 사용하여 형성한 염이 포함된다. 속염 또한 형성될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 화합물이 염기성 잔기를 함유하는 경우, 염은 유기 산 및 무기 산을 사용하여 형성할 수 있다. 예를 들어, 염은 하기 산으로부터 형성될 수 있다: 아세트산, 프로피온산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 말론산, 맨델산, 말산, 프탈산, 염산, 브롬화수소산, 인산, 질산, 황산, 메탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산 및 캄포르설폰산 뿐만 아니라 다른 공지된 약학적으로 허용되는 산. 아미노산 부가염 또한 아미노산 예컨대, 리신, 글리신 또는 페닐알라닌을 사용하여 형성할 수 있다.

의학 분야에서 숙련된 자에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 펩티드 또는 약학 조성물의 "치료 유효량"은 연령, 체중 및 치료되는 포유동물 종, 사용되는 구체적인 화합물, 구체적인 투여 방식, 및 원하는 효과 및 치료 징후에 따라 다를 것이다. 이들 인자들, 및 이들과 상기 양의 결정 사이의 관계가 의학 분야에서 잘 공지되어 있기 때문에, 치료적으로 유효한 투여 수준 즉, 본원에 기재된 장 및 위 관련 질환 뿐만 아니라 본원에 개시된 다른 의학적 징후의 예방 및/또는 치료라는 원하는 결과를 달성하기에 필요한 양의 결정은 당업자의 능력 내에 있을 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "치료 유효량"은 소정의 증상 또는 병태의 징후를 경감시키는 양, 바람직하게는 상기 증상 또는 병태를 갖는 개체에서 생리학적 반응을 정상화하는 양이다. 징후의 경감 또는 생리학적 반응의 정상화는 당분야에서 통상적으로 이용되는 방법을 이용하여 측정될 수 있고 소정의 증상 또는 병태에 따라 다를 수 있다. 한 양태에서, 치료 유효량의 하나 이상의 GLP-2 유사체, 또는 이 하나 이상의 GLP-2 유사체를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량은 측정 가능한 생리학적 매개변수를 증상 또는 병태가 없는 개체에서의 매개변수와 실질적으로 동일한 값(바람직하게는, 상기 값의 + 30% 이내, 보다 바람직하게는 상기 값의 + 20% 이내, 더욱 더 바람직하게는 상기 값의 10% 이내)으로 회복시키는 양이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물의 투여는 관련 의학적 징후 예컨대, 소장 및 위 관련 질환의 원하는 예방/치료 효과가 달성될 때까지 투약 수준을 증가시키면서 보다 낮은 투약 수준에서 시작한다. 이는 치료 유효량을 정의할 것이다. 단독으로 또는 약학 조성물의 일부로서의 본 발명의 펩티드의 경우, 상기 투여량은 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 100 mg, 예컨대, 약 0.01 내지 10 mg, 예를 들어, 10 내지 100 ㎍일 수 있다.

치료 용도의 경우, 선택된 GLP-2 유사체는 약학적으로 허용 가능하며 선택된 투여 경로에 의해 펩티드를 전달하기에 적합한 담체를 사용하여 제형화한다. 본 발명을 위해, 말초 비경구 경로는 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여 경로를 포함한다. 본 발명에 사용되는 일부 화합물은 경구, 직장, 비강 또는 하부 호흡 경로에 의해 투여될 수도 있다. 이들이 소위 비경구 경로이다. 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 적절한 약학적으로 허용되는 담체는 펩티드계 약물과 함께 통상적으로 사용되는 담체, 예컨대, 희석제, 부형제 등이다. 치료 용도를 위한 약학적으로 허용되는 담체는 약학 분야에서 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 약산성 또는 생리학적 pH를 갖는 멸균 식염수 및 인산염 완충 식염수를 사용할 수 있다. pH 완충제는 인산염, 시트르산염, 아세트산염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(TRIS), N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판설폰산(TAPS), 중탄산암모늄, 디에탄올아민, 바람직한 완충제인 히스티딘, 아르기닌, 리신 또는 아세트산염, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직한 완충제 범위는 pH 4 내지 8, pH 6.5 내지 8, 보다 바람직하게는 pH 7 내지 7.5이다. 보존제 예컨대, 파라-크레졸, 메타-크레졸, 오르토-크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 페놀, 벤질 알콜, 벤조산나트륨, 벤조산, 벤질-벤조에이트, 소르브산, 프로파노산 또는 p-히드록시벤조산의 에스테르를 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 산화, 탈아미드화, 이성질체화, 라세미체화, 고리화 또는 펩티드 가수분해를 방지하는 안정화제 예컨대, 아스코르브산, 메티오닌, 트립토판, EDTA, 아스파라긴, 리신, 아르기닌, 글루타민 및 글리신을 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 응집, 섬유화 또는 침전을 방지하는 안정화제 예컨대, 소듐 도데실 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸 셀룰로스 또는 시클로덱스트린을 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 가용화 또는 응집의 방지를 위한 유기 개질제 예컨대, 에탄올, 아세트산 또는 아세테이트 및 이의 염을 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 염과 같은 등장성 마커 예컨대, 염화나트륨 또는 가장 바람직한 탄수화물, 예를 들어, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 슈크로스 또는 이들의 혼합물을 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다.

세제 예컨대, 트윈(Tween) 20, 트윈 80, SDS, 폴록사머(Poloxamer) 예를 들어, 플루로닉(Pluronic) F-68, 플루로닉 F-127을 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 안료 및 심지어 방향제를 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, GLP-2 펩티드 유사체의 약학적으로 허용되는 산 부가염이 제공된다. 현탁화제를 사용할 수 있다.

유기 개질제 예컨대, 에탄올, 3급-부탄올, 2-프로판올, 에탄올, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜을 동결건조된 생성물의 동결건조를 위해 약학 제형 중에 함유시킬 수 있다. 팽화제 및 염과 같은 등장성 마커 예컨대, 염화나트륨, 탄수화물 예를 들어, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 수크로즈 또는 이들의 혼합물, 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루타메이트 또는 부형제 예컨대, 시스테인, 레시틴 또는 인간 혈청 알부민, 또는 이들의 혼합물을 동결건조용 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 투여를 위한 정제, 캡슐제 또는 엘릭시르; 직장 투여를 위한 좌약제; 주사 투여를 위한 바람직하게는 멸균된 용액 또는 멸균된 산제 또는 현탁액 등으로서 제형화되어 사용될 수 있다. 투여량 및 투여 방법은 최적 효능을 달성하도록 조정될 수 있으나, 체중, 식사, 병행 약물 치료, 및 의학 분야의 숙련된 자에게 인식될 다른 인자들과 같은 인자들에 달려 있을 것이다.

예를 들어, 1일 기준으로 정맥내 또는 피하 투여와 같은 비경구 투여의 경우, 주사 가능한 약학 조성물은 수용액 또는 수성 현탁액으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있거나, 사용 직전에 재구성하기에 적합하거나 주사 전에 액체 중에 현탁시키기에 적합한 동결건조된 고체 형태로 제조될 수 있거나, 에멀젼으로서 제조될 수 있다.

동결건조된 생성물의 재구성을 위한 희석제는 상기 리스트로부터의 적절한 완충제, 물, 식염수, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 수크로즈, 레시틴, 알부민, 소듐 글루타메이트 또는 시스테인 히드로클로라이드일 수 있거나; 세제 예컨대, 트윈 20, 트윈 80, 폴록사머 예를 들어, 플루로닉 F-68 또는 플루로닉 F-127, 폴리에틸렌 글리콜이 첨가된 주사용수, 및/또는 보존제 예컨대, 파라-크레졸, 메타-크레졸, 오르토-크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 페놀, 벤질 알콜, 벤조산나트륨, 벤조산, 벤질-벤조에이트, 소르브산, 프로파노산, p-히드록시벤조산의 에스테르가 첨가된 주사용수, 및/또는 유기 개질제 예컨대, 에탄올, 아시트산, 시트르산, 락트산 또는 이들의 염이 첨가된 주사용수일 수 있다.

또한, 원하는 경우, 주사 가능한 약학 조성물은 소량의 무독성 보조제 예컨대, 습윤제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 흡수 증강 제제(예를 들어, 리포좀, 세제 및 유기산)가 사용될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 화합물은 예를 들어, 전체 비경구 영양 요법을 받는 환자(예를 들어, 신생아, 또는 악액질 또는 식욕부진을 앓는 환자)를 위한 액상 영양 보충제로서 사용되는 경우 주입에 의한 투여, 또는 예를 들어, 피하, 복강내 또는 정맥내 주사에 의한 투여를 위해 제형화되므로, 경우에 따라 생리학적으로 허용 가능한 pH 예컨대, 약산성 또는 생리학적 pH까지 완충된, 멸균된 발열물질 무함유 형태의 수용액으로서 사용된다. 근육내 투여를 위한 제형은 식물유, 예를 들어, 캐놀라유, 옥수수유 또는 대두유 중의 용액 또는 현탁액을 기초로 한 것일 수 있다. 이들 오일계 제형은 항산화제 예컨대, BHA(부틸화 히드록시아니솔) 및 BHT(부틸화 히드록시톨루엔)에 의해 안정화될 수 있다.

따라서, 본 발명의 펩티드 화합물은 증류수와 같은 비이클 또는 식염수, 인산염 완충 식염수, 5% 덱스트로스 용액 또는 오일 중의 화합물로서 투여될 수 있다. GLP-2 유사체의 가용성은 원하는 경우 가용성 증강제 예컨대, 세제 및 유화제를 혼입시킴으로써 증강시킬 수 있다.

주사 가능한 물질로서 사용하기 위해, 수성 담체 또는 비이클은 원하는 작용 부위로 GLP-2 유사체를 서방출하기 위해 주사 부위 또는 주사 부위 근처에서 GLP-2 유사체를 침착시키는 데 기여하는 소정량의 젤라틴으로 보충될 수 있다. 대안으로 사용 가능한 겔화제, 예컨대 히알루론산 또한 침착제로서 유용할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 제형은

a. 최종 농도가 0.5 내지 300 mM, 바람직하게는 3 내지 200 mM, 가장 바람직하게는 20 내지 100 mM이 되도록 물에 용해된 L-히스티딘;

b. 350 mM 이하, 바람직하게는 30 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 100 내지 230 mM의 만니톨; 및

c. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.05 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 0.5 내지 50 mM의 아세트산을 용액 중에 포함한다.

적정량의 치료 화합물을 최종 농도가 1 내지 100 mg/㎖, 바람직하게는 5 내지 50 mg/㎖, 가장 바람직하게는 10 내지 30 mg/㎖가 되도록 첨가한다.

pH는 최종 pH가 4 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 6.7 내지 7.3이 되도록 조정한다. 생성된 용액은 목적 중량으로 조정하고, 멸균 여과하고, 적절하게 분취하여 약학적 용도를 위한 바이알 내에 분배한다. 제형은 액상 제품 또는 동결건조된 제품에 따라 더 가공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제형은

b. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.5 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 5 내지 50 mM의 L-아르기닌;

c. 350 mM 이하, 바람직하게는 30 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 100 내지 230 mM의 만니톨; 및

d. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.05 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 0.5 내지 50 mM의 아세트산을 용액 중에 포함한다.

pH는 최종 pH가 4 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 6.7 내지 7.3이 되도록 조정한다. 생성된 용액은 목표 중량으로 조정하고, 멸균 여과하고, 적절하게 분취하여 약학적 용도를 위한 바이알 내에 분배한다. 제형은 액상 제품 또는 동결건조된 제품에 따라 더 가공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제형은

a. 최종 농도가 200 mM 이하, 바람직하게는 3 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 5 내지 50 mM이 되도록 물에 용해된 L-히스티딘;

적정량의 치료 화합물을 농도가 1 내지 100 mg/㎖, 바람직하게는 5 내지 50 mg/㎖, 가장 바람직하게는 10 내지 30 mg/㎖가 되도록 첨가한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제형은

a. 최종 농도가 200 mM 이하, 바람직하게는 0.5 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 5 내지 50 mM이 되도록 물에 용해된 N-아세테이트; 및

b. 350 mM 이하, 바람직하게는 30 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 100 내지 230 mM의 만니톨을 포함한다.

본 발명의 GLP-2 유사체는 GLP-2 펩티드 유사체의 연장 방출 및 지속 방출을 위한 서방출 이식 장치로서 제형화될 수도 있다. 이러한 지속 방출 제형은 신체의 외부에 배치되는 패치 형태일 수 있다. 지속 방출 제형의 예에는 생체적합성 중합체의 복합물 예컨대, 폴리(락트산), 폴리(락트산-공-글리콜산), 메틸셀룰로스, 히알루론산, 시알산, 실리케이트, 콜라겐, 리포좀 등이 포함된다. 지속 방출 제형은 높은 국소 농도의 본 발명의 GLP-2 유사체를 제공하는 것이 바람직할 때 특히 관심의 대상이 될 수 있다.

GLP-2 유사체는 단위 투여량 또는 다회 투여량으로 장친화적(intestinotrophic) 양의 펩티드를 함유하는 멸균 충전 바이알 또는 앰플의 형태로 사용될 수 있다. 투여 준비 제형으로서의 상기 바이알 또는 앰플은 GLP-2 유사체 및 소정의 담체를 함유할 수 있다. 별법으로, 상기 바이알 또는 앰플은 멸균수 또는 인산염 완충 식염수와 같은 적절한 담체 중에 재구성하기에 적합한 동결건조된 형태와 같은 형태로 GLP-2 펩티드를 함유할 수 있다.

주사 가능한 제형에 대한 대안으로서, GLP-2 유사체는 다른 경로에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 경구 투약 제형 예컨대, 정제, 캡슐제 등을 표준 약학적 관행에 따라 제형화할 수 있다. 본 발명에 따라, GLP-2 유사체는 소장 조직의 성장으로부터 유리한 효과를 얻을 개체를 치료하기 위해 투여된다.

비강 투약 제형은 키토산 또는 세제, 예를 들어, 트윈 20, 트윈 80, 폴록사머 예를 들어, 플루로닉 F-68, 플루로닉 F-127, Brij 35, Brij 72, 크레모포어 EL과 같은 증강제를 첨가하여 제형화할 수 있다.

본 발명의 펩티드 화합물은 단독으로 사용될 수 있거나, 소염 효과를 갖는 화합물과 조합 사용될 수 있다. 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, 이러한 조합 치료는 본 발명의 펩티드 유사체의 유리한 치료 효과를 강화시킬 수 있는 것으로 기대된다.

물론, 환자 치료에 가장 적합한 치료적 투약 및 섭생법은 치료될 질환 또는 병태, 환자의 체중 및 다른 매개변수에 따라 다를 것이다. 임의의 특정한 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, ㎍/kg 범위 내의 투여량, 및 보다 짧거나 보다 긴 치료 기간 또는 치료 빈도는 치료적으로 유용한 결과 예컨대, 특히 소장 질량에서의 통계적으로 유의한 증가를 나타낼 수 있다고 기대된다. 일부 경우, 치료적 섭생법은 초기 치료의 중단 후 일어나는 조직 복귀(regression)를 예방하기에 적합한 유지 투여량의 투여를 포함할 수 있다. 인간에게 사용하기에 가장 적당한 투여량 및 투약 섭생법은 본 발명에 의해 수득된 결과에 의해 좌우되며, 적절하게 디자인된 임상 시험에서 확인될 수 있다.

효과적인 투여량 및 치료 프로토콜은 실험실 동물에서 낮은 투여량으로 시작된 후 효과를 모니터링하면서 투여량을 증가시키고 투약 섭생법 역시 체계적으로 변화시키는 통상의 수단에 의해 결정될 수 있다. 소정의 대상 객체에 대한 최적 투여량을 결정할 때 임상의는 많은 인자들을 고려할 수 있다. 이러한 고려는 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명에 따른 GLP-2 펩티드의 인간 투여량은 한 실시양태에서 체중 1 kg 당 하루에 약 10 ㎍ 내지 약 10 mg, 바람직하게는 약 50 ㎍ 내지 약 5 mg, 가장 바람직하게는 약 100 ㎍ 내지 1 mg일 수 있다.

의학적 병태

본 발명의 펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 유효량의 GLP-2 유사체 또는 이의 염을 투여함으로써 식도의 상부 위장관을 비롯한 위-장 장애를 앓는 개체를 예방하거나 치료하기 위한 약제로서 유용하다. 위 및 장 관련 장애에는 임의의 병인에 의한 궤양(예를 들어, 소화성 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군, 약물 유도 궤양, 감염 또는 다른 병원체와 관련된 궤양), 소화 장애, 흡수장애 증후군, 단장 증후군, 맹관 증후군, 염증성 장 질환(크론병 및 궤양성 대장염), (예를 들어, 글루텐 유발성 장병증 또는 만성소화장애증으로부터 발병된) 비열대성 스프루우, 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증성 스프루우, 및 화학요법 및/또는 방사선 요법에 의해 유도된 점막염 및 설사가 포함된다.

위장의 점막 종양 형성을 가지거나 또는 위장의 점막 종양 형성의 위험이 증가된 환자를 위해, 위장의 점막 종양 형성의 자극 또는 악화와 같은 감소된 부작용의 위험을 감소시키거나 폐지하기 위해 화합물을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 결장 종양 형성(양성 또는 악성) 또는 결장 종양 형성의 성장 위험이 있는 환자를 치료하기 위한 화합물을 선택하는 경우, 비선택적 화합물보다는 결장에 비해 소장에 선택적인 화합물 또는 소장에 비해 결장에 선택적인 화합물을 선택하는 것이 더 적당할 수 있다.

일반적으로 전술된 바와 같이, 증가된 소장 질량 및 이의 필연적 결과, 및/또는 정상적인 소장 점막 구조 및 기능의 유지로부터 유리한 효과를 얻는 개체가 본 발명의 GLP-2 유사체를 사용한 치료에 대한 후보이다. GLP-2 유사체로 치료될 수 있는 구체적인 병태에는 열에 의한 알파-글리아딘에 대한 독성 반응으로부터 야기되며 글루텐 유도 장병증 또는 만성소화장애증의 결과일 수 있고 소장의 융모의 상당한 손실에 의해 표시되는 비열대성 스프루우; 감염으로부터 초래되며 융모의 부분적 평평화에 의해 표시되는 열대성 스프루우; 흔한 가변성 면역결핍증 또는 저감마글로불린혈증을 앓는 환자에 대해 공통적으로 관찰되며 융모 높이에서의 상당한 감소에 의해 표시되는 저감마글로불린혈증성 스프루우를 비롯한 다양한 형태의 스프루우가 포함된다. GLP-2 유사체 치료의 치료적 효능은 융모 형태를 조사하기 위한 장 생검, 영양분 흡수의 생화학적 평가, 환자 체중 증가, 또는 이들 병태들과 관련된 징후의 개선에 의해 모니터링될 수 있다.

본 발명의 GLP-2 유사체로 치료될 수 있거나 GLP-2 유사체가 예방적으로 유용할 수 있는 다른 병태에는 상기 병태 이외에 방사선 장염, 감염성 또는 감염 후 장염, 및 암 화학요법제 또는 독성 물질로 인한 소장 손상이 포함된다.

GLP-2 유사체는 영양실조 예를 들어, 악액질 및 식욕부진의 치료를 위해 사용될 수도 있다.

본 발명의 특정한 실시양태에는 장 손상 및 기능장애의 예방 및/또는 치료를 위한 본 발명의 펩티드의 사용에 관한 것이다. 소장 점막의 줄기세포는 이의 빠른 증식 속도로 인해 화학요법의 세포독성 효과에 특히 민감하다(Keefe et al., Gut 2000; 47: 632-7). 본 발명의 GLP-2 펩티드 작용제의 투여는 장의 장샘에서 영향(trophic) 효과를 상승시킬 수 있고 화학요법 및/또는 방사선 요법 후 손상된 장 상피를 대체하는 신생 세포를 신속히 제공할 수 있다. 본 발명의 펩티드의 투여에 의해 달성되는 궁극적 목표는 암 치료를 위한 가장 최적의 화학요법적 섭생법을 제공하면서 화학요법 치료를 받는 환자의 위장 손상과 관련된 사망률을 감소시키는 것이다. 부수적인 예방적 또는 치료적 치료가 방사선 요법을 받거나 방사선 요법을 막 시작하려는 환자에게 본 발명에 따라 제공될 수 있다.

암 화학요법 후의 위장 점막염은 이것이 점차 감퇴하더라도 일단 확립되면 본질적으로 치료 불가능한 증가하는 문제이다. 통상적으로 사용되는 세포증식억제성 항암 약물인 5-FU 및 이리노테칸을 사용하여 수행한 연구는 이들 약물을 사용하는 효과적인 화학요법이 소장의 구조적 완전성 및 기능에 우선적으로 영향을 주지만 결장은 상기 요법에 덜 민감하고 증가된 점액 형성으로 주로 반응한다(Gibson et al., J Gastroenterol Hepatol. Sep; 18(9): 1095-1100, 2003; Tamaki et al., J lnt Med Res. 31(1): 6-16, 2003).

본 발명의 신규 GLP-2 유사체는 위장 손상 및 화학요법제의 부작용의 예방 및/또는 치료에 있어서 유용할 수 있다. 이 잠재적으로 중요한 치료적 용도는 현재 사용되고 있는 하기 화학요법제들과 같은 화학요법제에 적용될 수 있으나, 이로 한정되지 않는다: 5-FU, 알트레타민(Altretamine), 블레오마이신(Bleomycin), 부설판(Busulfan), 카페시타빈(Capecitabine), 카르보플라틴(Carboplatin), 카르무스틴(Carmustine), 클로람부실(Chlorambucil), 시스플라틴(Cisplatin), 클라드리빈(Cladribine), 크리산타스파제(Crisantaspase), 시클로포스파미드(Cyclophosph아미드), 시타라빈(Cytarabine), 다카르바진(Dacarbazine), 닥티노마이신(Dactinomycin), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 에토포사이드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 히드록시카르바미드(Hydroxycarbamide), 이다루비신(Idarubicin), 이포스파미드(Ifosfamide), 이리노테칸(Irinotecan), 리포조말 독소루비신(Liposomal doxorubicin), 류코보린(Leucovorin), 로무스틴(Lomustine), 멜팔란(Melphalan), 머캡토퓨린(Mercaptopurine), 메스나(Mesna), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미토마이신(Mitomycin), 미톡산트론(Mitoxantrone), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 페메트렉세드(Pemetrexed), 펜토스타틴(Pentostatin), 프로카르바진(Procarbazine), 랄티트렉세드(Raltitrexed), 스트렙토조신(Streptozocin), 테가푸르-우라실(Tegafur-uracil), 테모졸로마이드(Temozolomide), 티오테파(Thiotepa), 티오구아닌/싸이오구아닌(Tioguanine/Thioguanine), 토포테칸(Topotecan), 트레오설판(Treosulfan), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 비노렐빈(Vinorelbine).

본 발명의 펩티드는 유효량의 GLP-2 유사체 또는 이의 염을 투여함으로써 신생아를 치료하는 방법에서 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 장 발달의 부족으로 인한 젖먹이 신생아에서의 합병증은 본 발명의 펩티드 작용제에 의해 극복될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 GLP-2 유사체 또는 이의 염을 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 병태의 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 상기 병태를 치료하는 방법을 기술한다. 이러한 질환에는 DPP-IV 효소가 과발현되는 병태가 포함된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 전술된 바와 같은 상기 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체의 서방출을 일으키도록 제형화될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 설명하기 위해 제공되는 것이지 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.

일반적인 펩티드 합성

장치 및 합성 방법

펩티드는 N-α-아미노 보호기로서의 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 및 측쇄 작용기로서 적합한 통상의 보호기를 사용한 여과를 위한 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에서 회분식으로 합성되었다.

용매

용매 DMF(N,N-디메틸포름아미드, Riedel de-Haen, Germany)는 강한 양이온 교환 수지(Lewatit S 100 MB/H 강산, Bayer AG Leverkusen, Germany)로 팩킹된 컬럼에 통과시켜 정제하고, 유리 아민이 존재하는 경우 황색 색상(Dhbt-O-음이온)을 발색시키는 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt-OH)을 첨가하여 사용 전에 유리 아민에 대해 분석하였다. 용매 DCM(디클로로메탄, 분석 등급, Riedel de-Haen, Germany)을 정제하지 않고 직접 사용하였다. 아세토니트릴(HPLC-등급, Lab-Scan, Dublin Ireland)을 정제하지 않고 직접 사용하였다.

아미노산

Fmoc-보호 아미노산을 어드밴스드 캠테크(Advanced ChemTech(ACT))로부터 적절한 측쇄 보호 형태로 구입하였다.

커플링 시약

커플링 시약인 디이소프로필카르보디이미드(DIC)를 리에델 드-핸(Riedel de-Haen, Germany)으로부터 구입하였다.

고체 지지체

펩티드를 텐타겔(탄타겔) S 수지 0.22 내지 0.31 mmol/g 상에서 합성하였다. 텐타겔 S-램(Ram), 텐타겔 S RAM-Lys(Boc)Fmoc(Rapp polymere, Germany)는 C-말단 아미드화 펩티드가 바람직한 경우에 사용하였지만, 텐타겔 S PHB, 텐타겔 S PHB Lys(Boc)Fmoc는 C-말단 유리 카르복실산이 바람직한 경우에 사용하였다.

촉매 및 다른 시약

디이소프로필에틸아민(DIEA)을 알드리치(Aldrich, Germany)로부터 구입하였고, 피페리딘 및 피리딘을 리에델 드-핸(Frankfurt, Germany)으로부터 구입하였다. 에탄디티올을 리에델 드-핸(Frankfurt, Germany)으로부터 구입하였다. 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt-OH), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)(HOAt)을 플루카(Fluka, Switzerland)로부터 구입하였다. 아세트산 무수물을 플루카로부터 구입하였다.

커플링 절차

아미노산은 DMF 중의 DIC를 사용하여 적절한 N-α-보호 아미노산 및 HObt 또는 HOAt로부터 제조된 원위치에서 생성된 HObt 또는 HOAt 에스테르로서 커플링되었다. 아실화는 시험하는 동안에 Fmoc 탈보호를 방지하기 위해 80℃에서 수행된 닌히드린 시험에 의해 확인되었다(Larsen, B. D. and Holm, A., Int. J. 펩티드 단백질 Res. 43, 1994, 1-9).

N-α-아미노 보호기(Fmoc)의 탈보호

Fmoc 기의 탈보호는 DMF(1×5 및 1×10 분) 중의 20% 피페리딘으로 처리한 후, Dhbt-OH를 배수된 DMF에 첨가한 후 황색 색상이 검출될 수 없을 때까지 DMF(각각 5×15 ㎖, 5분)로 세척하였다.

HOBt-에스테르의 커플링

3 당량의 N-α-아미노 보호 아미노산을 3 당량의 HObt 및 3 당량의 DIC와 함 께 DMF에 용해시킨 후 수지에 첨가하였다.

산을 사용하여 수지로부터 펩티드 절단

95% 트리플루오로아세트산(TEA, Riedel-de Haen, Frankfurt, Germany)-물(부피/부피) 또는 95% TFA 및 5% 에탄디티올(부피/부피)로 2 시간 동안 실온에서 처리하여 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 여과된 수지를 95% TFA-물로 세척하고 여액 및 세척액을 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 에테르로 세척하고 아세트산-물로부터 동결건조하였다. 미정제 동결건조 생성물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하고 질량 분광계(MS)로 확인하였다.

텐타겔 수지(PEG-PS) 상의 회분식 펩티드 합성

텐타겔 수지(1 g, 0.23-0.24 mmol/g)를 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣었다. 수지를 DMF(15 ㎖) 중에서 팽윤시키고, 링커 텐타겔 S RAM 상의 초기 Fmoc 기를 제거하거나 수지 텐타겔 S RAM-Lys(Boc)Fmoc 상의 제1 아미노산 상의 초기 Fmoc 기를 제거하기 위해 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하였다. 수지를 배수시키고, Dhbt-OH를 배수된 DMF에 첨가한 후 황색 색상이 검출될 수 없을 때까지 DMF로 세척하였다. 본 서열에 따른 아미노산은 전술한 바와 같이 미리 형성된 Fmoc-보호 HObt 에스테르(3 당량)로서 커플링되었다. 달리 명시하지 않는 한, 커플링은 2 시간 동안 계속하였다. 수지를 배수시키고, 과량의 시약을 제거하기 위해 DMF(각각 5×15 ㎖, 5분)로 세척하였다. 모든 아실화를 전술한 바와 같이 닌히드린 시험으로 확인하였다. 완전한 합성 후, 펩티드 수지를 DMF(각각 3×15 ㎖, 5분), DCM(각각 3×15 ㎖, 1분) 및 마지막으로 디에틸 에테르(각각 3×15 ㎖, 1분)로 세척하고 진공 하에 건조하였다. 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하고, 후술하는 바와 같이 미정제 펩티드 생성물을 분석하고 정제하였다.

HPLC 조건

HP 1100 4변수 펌프(Quaternary Pump), HP 1100 오토샘플러(Autosampler), HP 1100 컬럼 써모스타트(컬럼 Thermostat) 및 HP 1100 멀티플 파장 검출기(Multiple Wavelength Detector)로 구성된 휴렛 팩커드(Hewlett Packard) HP 1100 HPLC를 이용하여 구배 HPLC 분석을 수행하였다. LC 소프트웨어(리비젼 A.06.01)용 휴렛 팩커드 켐스테이션(Chemstation)을 장치 조절 및 데이타 획득을 위해 사용하였다. 하기 컬럼 및 HPLC 완충제 시스템을 사용하였다:

컬럼: VYDAC 238TP5415, C-18, 5 mm, 300 Å 150×4.6 mm.

완충제: A: MQV 중의 0.1% TFA; B: 0.085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN.

구배: 0 내지 1.5 분, 0% B

1.5 내지 25 분, 50% B

25 내지 30 분, 100% B

30 내지 35 분, 100% B

35 내지 40 분, 0% B

유속 1 ㎖/분, 오븐 온도 40℃, UV 검출: I = 215 nm.

미정제 펩티드의 HPLC 정제

미정제 펩티드 생성물은 퍼셉티브 바이오시스템스 비젼 워크스테이션(PerSeptive Biosystems VISION Workstation)으로 정제하였다. 비젼 3.0 소프트 웨어(VISION 3.0 software)를 장치 조절 및 데이타 획득을 위해 사용하였다. 하기 컬럼 및 HPLC 완충제 시스템을 사용하였다:

컬럼: 크로마실(Kromasil) KR 100 Å, 10 mm C-8, 250×50.8 mm.

완충제 시스템: 완충제: A: MQV 중의 0.1% TFA; B: 0.085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN.

구배: 0 내지 37분. 0 내지 40% B

유속 35 ㎖/분, UV 검출: I = 215 nm 및 280 nm.

질량 분광법

농도가 1 내지 10 mg/㎖가 되도록 펩티드를 초구배 메탄올(Labscan, Dublin, Ireland), 밀리-Q 물(Millipore, Bedford, MA) 및 포름산(Merck, Damstadt, Germany)(50:50:0.1 부피/부피/부피)에 용해시켰다. 펩티드 용액(20 ㎖)은 정확도가 +/- 0.1 m/z인 LCT 질량 분광계(Micromass, Manchester, UK)를 이용하는 ESI-TOF-MS에 의해 양성 극성 모드에서 분석되었다.

일반적인 합성 절차

모든 합성에서, 무수 텐타겔-S-램 수지(1 g, 0.22-0.31 mmol/g)를 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣었다. 수지를 DMF(15 ㎖) 중에서 팽윤시키고, DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 수지 상의 비양성자화 아미노 기의 존재를 확보하였다. 수지를 배수시키고, Dhbt-OH를 배수된 DMF에 첨가한 후 황색 색상이 검출될 수 없을 때까지 DMF로 세척하였다. 본 서열에 따른 아미노산은 전술한 바와 같이 미리 형성된 Fmoc-보호 HOBt 에스테르(3 당량)로서 커플링되었 다. 달리 명시하지 않는 한, 커플링은 2 시간 동안 계속하였다. 수지를 배수시키고, 과량의 시약을 제거하기 위해 DMF(각각 5×15 ㎖, 5분)로 세척하였다. 모든 아실화를 80℃에서 수행된 닌히드린 시험으로 확인하였다. 완전한 합성 후, 펩티드 수지를 DMF(각각 3×15 ㎖, 5분), DCM(각각 3×15 ㎖, 1분) 및 마지막으로 디에틸 에테르(각각 3×15 ㎖, 1분)로 세척하고 진공 하에 건조하였다. 그 다음, 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하고, 동결건조하였다.

전술한 바와 같이 분취형 HPLC를 이용하여 정제한 후, 펩티드 생성물을 모아 펩티드의 정체를 ES-MS로 확인하였다. 이 절차를 하기에서 추가로 예시된 모든 펩티드의 합성에 이용하였다.

합성된 화합물

상기 기법을 이용하여, 화합물 1809 내지 1861 및 기준 화합물 1559(H-[Gly2]hGLP-2-OH)를 합성하였다(표 1).

[표 1]

합성된 화합물

실시예 1. 화합물 2264의 합성

탄타겔 S RAM 상의 H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH₂

무수 탄타겔 S RAM(0.2 mmol/g, 1g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣고 N-말단 히스티딘의 커플링을 마무리할 때까지 "텐타겔 수지 상의 회분식 펩티드 합성" 하에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. 아실화를 전술한 바와 같이 확인하였다. 합성 완료 및 N-말단 Fmoc 기의 탈보호 후, 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하였다. 전술한 바와 같이 분취형 HPLC를 이용하여 정제한 후, 413 mg의 펩티드 생성물을 93%보다 더 높은 순도로 모으고 펩티드의 정체를 MS로 확인하였다(실측된 M 3488.13, 계산된 M 3487.79).

실시예 2. 화합물 2268의 합성

탄타겔 S RAM 상의 H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH₂

무수 탄타겔 S RAM(0.2 mmol/g, 1 g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣고 N-말단 히스티딘의 커플링을 마무리할 때까지 "텐타겔 수지 상의 회분식 펩티드 합성" 하에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. 아실화를 전술한 바와 같이 확인하였다. 합성 완료 및 N-말단 Fmoc 기의 탈보호 후, 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하였다. 전술한 바와 같이 분취형 HPLC를 이용하여 정제한 후, 132 mg의 펩티드 생성물을 91%보다 더 높은 순도로 모으고 펩티드의 정체를 MS로 확인하였다(실측된 M 3535.88, 계산된 M 3535.77).

실시예 3. 화합물 2264(Lys6)의 합성

탄타겔 S RAM-Lys(Boc)-Fmoc 상의 H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys NH₂

무수 탄타겔 S RAM-Lys(Boc)-Fmoc(0.24 mmol/g, 1 g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣고 N-말단 히스티딘의 커플링을 마무리할 때까지 "텐타겔 수지 상의 회분식 펩티드 합성" 하에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. 아실화를 전술한 바와 같이 확인하였다. 합성 완료 및 N-말단 Fmoc 기의 탈보호 후, 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하였다. 전술한 바와 같이 분취형 HPLC를 이용하여 정제한 후, 펩티드 생성물을 90%보다 더 높은 순도로 모으고 펩티드의 정체를 MS로 확인하였다(실측된 M 4256.40 계산된 M 4256.36).

실시예 4. 화합물 2268(Lys6)의 합성

탄타겔 S RAM-Lys(Boc)-Fmoc 상의 H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys NH₂

무수 탄타겔 S RAM-Lys(Boc)-Fmoc(0.24 mmol/g, 1 g)을 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣고 N-말단 히스티딘의 커플링을 마무리할 때까지 "텐타겔 수지 상의 회분식 펩티드 합성" 하에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. 아실화를 전술한 바와 같이 확인하였다. 합성 완료 및 N-말단 Fmoc 기의 탈보호 후, 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하였다. 전술한 바와 같이 분취형 HPLC를 이용하여 정제한 후, 펩티드 생성물을 90%보다 더 높은 순도로 모으고 펩티드의 정체를 MS로 확인하였다(실측된 M 4304.10 계산된 M 4304.34).

실시예 5. 화합물 2264 A(아세테이트 염)의 합성

화합물 2264의 트리플루오로아세테이트로부터 아세테이트로의 반대 이온 교환.

화합물 2264의 정제된 합성 펩티드 생성물은 미정제 합성 펩티드 생성물의 정제를 위해 사용된 HPLC 완충제 중의 트리플루오로아세트산(0.1% 부피/부피)의 존재로 인해 트리플루오로아세테이트 염으로서 단리되었다.

반대 이온 트리플루오로아세테이트를 아세테이트로 교환하기 위해, 펩티드 용액을 아세테이트 상의 강염기 이온 교환 수지(Dowex 1×8)로 팩킹된 컬럼에 통과시켰다. 화합물 2264T를 물에 용해시켰다. 용액을 아세테이트 상의 강염기 이온 교환 수지(Dowex 1×8; 용량 1.33 meq/㎖ 수지)를 함유하는 컬럼에 통과시켰다. 그 다음으로, 상기 수지를 물로 세척하고, 용출액을 모아 동결건조함으로써, HPLC 분석에 따른 순도가 90%보다 높은 아세테이트 염을 수득하였다.

실시예 6. 화합물 2264 C(클로라이드 염)의 합성

화합물 2264의 트리플루오로아세테이트(Tfa)로부터 클로라이드(Cl-)로의 반대 이온 교환.

화합물 2264T를 0.1 M 염산에 용해시키고, 생성된 용액을 동결건조하였다. 잔류물을 물에 용해시키고 다시 동결건조함으로서, HPLC 분석에 따른 순도가 90%보다 높은 클로라이드 염을 수득하였다.

추가의 선택적인 GLP-2 유사체 화합물을 표 2에 열거하였다.

[표 2]

선택적 GLP-2 유사체 화합물의 목록

실시예 7. 상대적인 화학적 안정성 시험

표 3에 열거된 화합물을 0.5 mM의 공칭 농도로 0.1 M HCl 중에 용해시켰다. 샘플을 암실에서 7 일간 40℃에서 항온처리한 후, 0.2 mg/mL의 공칭 농도로 희석하고, 주요 피크의 회복에 대하여 RP-HPLC로 분석하고, 주요 피크의 질량에 의한 동일성 확인에 대하여 LC-MS로 분석하였다.

상기 화합물을 25%∼48% MeCN로부터 39 분간 단계적으로 작동하는 MQW 및 MeCN 중 0.1% TFA의 이동상을 사용하여 Phenomenex Gemini C18 컬럼 상 RP-HPLC 및 LC-MS, 3 μm, 110 Å, 3×150 mm에 의해 0.2 mg/mL의 공칭 농도로 분석하였다. 유속은 0.400 mL/min였다. 컬럼 오븐 온도는 5O℃였고, 자동 샘플러 온도는 4℃였고, UV 검출은 220 nm에서 측정되었다.

순도의 회복에 대한 결과는 표 3에 열거하였다.

[표 3]

ZP 화합물에 대한 순도 회복

ZP 번호	회복(%)
2242	87
2263	95
2264	*
2266	73
2267	*
2268	*
2269	39
2270	52
2272	*
* 분석용 RP-HPLC에서 세정층에 용리. 반복되는 변형된 분석용 RP-HPLC법으로 실시예 7에서 나타냄.

4가지 화합물(ZP2264, ZP2267, ZP2268 및 ZP2272)을 이 분석법으로 세정층에 천천히 용리시키고, 이들 4개의 화합물을 가지고 후술한 변형법으로 실험을 반복하였다.

실시예 8. 상대적인 화학적 안정성 시험

표 4에 나열된 화합물을 0.1 M HCl 중에 0.25 mM의 공칭 농도로 용해시켰다. 이 샘플을 암실에서 3 일간 4O℃에서 항온처리한 후 0.2 mg/mL의 공칭 농도로 희석하고, 주요 피크의 회복에 대하여 RP-HPLC로 분석하였다.

상기 화합물을 25%∼80% MeCN로부터 39 분간 단계적으로 작동하는 MQW 및 MeCN 중 0.1% TFA의 이동상을 사용하여 Phenomenex Gemini C18 컬럼 상 RP-HPLC 및 LC-MS, 3 μm, 110 Å, 3×150 mm에 의해 0.2 mg/mL의 공칭 농도로 분석하였다. 유속은 0.400 mL/min였다. 컬럼 오븐 온도는 5O℃였고, 자동 샘플러 온도는 4℃였고, UV 검출은 220 nm에서 측정되었다.

순도 회복에 대한 결과를 표 4에 나타낸다.

[표 4]

ZP 화합물의 순도 회복

ZP 번호	회복(%)
1846	95
2264	61
2267	61
2268	62
2272	61

실시예 9. BHK-21 세포에서 재조합 발현된 GLP-2 수용체 상의 효현에 대한 GLP-2 유사체의 시험관내 스크리닝 *)

GLP-2 수용체를 사용하여 일시적으로 형질감염시킨 BHK21 세포 및 CRE-루시퍼라제 리포터 유전자 구조체를 이용하여 스크리닝 하였다. 투여-반응 곡선 및 EC50 값을 10 fM∼10 nM의 7개 농축액 및 각각의 농도에 대한 3배 지점을 이용하여 측정하였다. 대조군 펩티드를 모든 시험 플레이트 상에서 사용하였다.

*) 시험은 헝가리 부다페스트에서 AMRI에 의해 수행됨

재료 및 방법

사용한 재료 및 세포:

Nunc or Greiner 조직 배양물 플라스크

Nunc or Greiner 10 cm TC 페트리 접시(Nunc 172931)

daughter 플레이트용 Nunc or Greiner 96 웰 플레이트(Nunc 167008)

BHK-21(C13) 세포

화이트 96 웰 플레이트(PerkinElmer 6005680)

희석용 딥 웰 플레이트(Nunc 278752)

글래스고 MEM(Sigma G5154)

페놀 레드 무함유 DMEM(Invitrogen/Gibco 31053-028)

우태아혈청(FCS, Invitrogen/Gibco Zealand batch)

비필수 아미노산(100×)(Invitrogen/Gibco 11140-035)

20O mM 글루타민(100×)(Invitrogen/Gibco 25030-024)

페니실린/스트렙토마이신(100×)(Invitrogen/Gibco 15140-122)

피루브산나트륨(10O×)(Invitrogen/Gibco 11360-039)

D-PBS(Invitrogen/Gibco 14190-094)

1×트립신-EDTA 용액(Invitrogen/Gibco 25300-054)

옵티-MEM(Invitrogen/Gibco 31985-047)

리포펙타민 2000(Invitrogen 11668-027)

CRE-luc 벡터(Zealand batch)

hGLP2R 벡터(Zealand batch)

DMEM 중 10%(w/v) 멸균 BSA(Sigma 05488)

DMEM 중 1O mM(20O×) IBMX(Sigma 15879)

룩라이트 키트(Perkin Elmer 6016911)

탑실-A(Perkin Elmer 6005185)

배지 및 완충제

BHK-21(C13) 세포용 성장 배지:

글래스고 MEM+ 2 mM 글루타민(1:100) + 10% FCS + 1% NEAA + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1 mM 피루브산나트륨(1:100).

BHK-21(C13) 세포용 항생물질 무함유 형질감염 배지:

글래스고 MEM + 2 mM 글루타민(1:100) + 1% NEAA + 1 mM 피루브산나트륨(1:100)

BHK-21(C13) 세포용 형질감염 후 배지:

글래스고 MEM + 2 mM 글루타민(1:100) + 0.2% FCS + 1% NEAA + 1% Pen/Strep + 1 mM 피루브산나트륨(1:100)

코팅액:

D-PBS + 1% BSA

펩티드 용해 완충제:

D-PBS + 0.1% BSA

자극 완충제:

페놀 레드 무함유 DMEM + 2 mM 글루타민(1:100) + 50 μM IBMX + 0.3% BSA

형질감염된 BHK21(C13) 세포에서 펩티드의 스크리닝을 위한 프로토콜

BHK-21 세포를 10 cm TC-페트리 접시에 시딩하고 70-80% 집합으로 재배했다. 이어서, 배지를 혈청 무함유 형질감염 배지로 바꾸었다. DNA(7.5 μg hGLP-2 수용체 벡터 및 7.5 μg CRE-루시퍼라제 벡터) 및 리포펙타민 2000을 옵티MEM 중에 희석하고, 혼합하고, 20∼30 분간 세포에 부가하였다. 세포를 항온처리기에서 37℃, 5% CO₂에서 4 시간 동안 항온처리하고, 트립신 처리하고, 96 웰 플레이트에서 웰당 35,000개 세포를 재시딩하였다. 이식유전자의 발현을 허용하기 위해 세포를 완전 성장 배지에서 밤새 항온처리하였다. 희석한 GLP-2 유사체 용액의 제조에 사용되는 모든 플레이트를 인산염 완충 염수 중 1% BSA로 2 시간 동안 예비 코팅하고, 밤새 건조하였다. GLP-2 유사체를 PBS/0.1% BSA에 용해시켜 250 μM로 하고, 포스포디에스테라제 억제제와 0.3% BSA(자극 완충제)를 함유하는 페놀 레드 무함유 배지 및 혈청 무함유 배지에서 각각 10 μM 및 10O nM로 두 단계로 희석하였다. 이후에, GLP-2 유사체를 연속적으로 동일한 자극 완충제 중에 희석하여 1O nM에서 1O fM로 낮아진 농도를 얻었다. 자극 완충제만을 사용하여 기준선 활성을 조절하였다. 이러한 용액을 37℃에서 30 분간 예비 가온하였다. 예비 가온한(37℃) 자극 완충제로 세포를 세정하고, 100 μl의 예비 가온한 펩티드 희석액 및 대조군으로 5 시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 항온처리하였다. LucLite 효소 기질/세포용해 완충제는 항온처리가 끝나기 직전에 제조하였다. 100 μl LucLite 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 빛 방출을 적합한 계수기(예컨대, Wallac VictorII)로 계수하였다. 데이타를 4가지 변수 지수 방정식(Microcal OriGln 5.0 또는 GraphPad 4)에 도입하여 EC50 값을 유도하였다.

결과는 표 5에 열거하였다.

[표 5]

GLP-2 수용체 발현 BHK21 세포에서 GLP-2 유사체의 스크리닝

ZP ID	2263	2264	2266	2267	2268	2269	2270	2272	2242
pEC50	10.84	11.5	9.253	10.87	11.21	10.04	10.23	11.27	12.41
SEM	0.1929	0.2419	0.2272	0.3139	0.2239	0.09546	0.1449	0.1668	0.1971

결론: 결과는 모든 시험한 화합물이 GLP-2 효현제임을 명백하게 나타낸다.

실시예 10. 생체 내 시험에서, 수컷 C57BL 마우스에서 측정한 장 성장의 자극

결장 질량에 상대적인 소장 질량을 선택적으로 자극하기 위한 본 화합물(ZP2264, ZP2266, ZP2267, ZP2268, ZP2242, ZP2269, ZP2270, ZP2272 및 ZP2242)의 능력을 수컷 C57BL 마우스에서 측정하였다. 마우스의 개별 군(n=6∼10)에게 각각의 화합물 800 nmol/kg을 연속적으로 3일 동안 1일 1회씩 주었다. 비교를 위해, 다른 군의 동물들에게 등몰 투여량의 [Gly2]GLP-2(ZP1559) 또는 비이클(인산염 완 충 염수, pH 7.4)을 동일한 투약 섭생법으로 투여하였다. 마지막 투여량의 화합물을 투여한 지 24 시간 후, 마우스를 희생시키고, 소장(유문부터 맹장까지) 및 결장(맹장으로부터 멀리 떨어져 있는 장)을 비우고 그 중량을 측정하였다.

체중(BW)에서의 근소한 차이를 보정하기 위해, 소장(SI) 및 결장의 기관 질량을 BW에 비하여 상대적으로 표시하였다. 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2는 식도, 위, 소장 및 결장에서 위장 성장을 자극하는 것으로 보고되었고, 화합물에 의해 유도된 성장 패턴의 차이를 평가하기 위해, 화합물 X의 소장-결장 민감도 지수를 다음과 같이 산출하였다:

(SI/결장)_x/(SI/결장)_[Gly2]GLP-2 %.

소장-결장 감수성이 1.05 이상인 화합물은 소장에 대해 상대적으로 선택적인 것으로 간주되었다.

[표 6]

참조 화합물 [Gly2]GLP-2에 대한 시험 화합물의 소장-결장 민감도 지수의 목록. NT는 "시험 안함"을 가리킨다. *: [Gly2]GLP-2에 대하여 P<0.05

[표 7]

참조 화합물 [Gly2]GLP-2에 대한 시험 화합물의 소장 및 결장 질량에 대한 시험 화합물의 효과. NT는 "시험 안함"을 가리킨다. *: [Gly2]GLP-2에 대하여 P<0.05

결과

본 발명에 따른 시험 화합물의 효과는 결장 질량에 비해 소장 질량을 선택적으로 증가시키는 펩티드의 능력을 기초로 하여 측정하였다. 도 1 및 2에서는, 참조 화합물인 [Gly2]GLP-2와 ZP2264, ZP2266, ZP2267, ZP2268, ZP2242, ZP2269 및 ZP2272의 투여에 따른 비이클 대조군에 대해 상대적인 소장 질량을 나타낸다. 도 3 및 4에서는, 참조 화합물인 [Gly2]GLP-2의 것과 비교하여 소장 질량 대 결장 질량의 비에 대한 시험 화합물의 효과를 나타낸다. [Gly2]GLP-2가 주어진 동물에서 소장 질량 대 결장 질량의 비는 100%로 표준화하였다. 참조 화합물인 [Gly2]GLP-2의 것에 비해 계산한 소장-결장 민감도 지수를 기초로 하여 소장에 선택적인 시험 화합물은 표 6에 나타낸다. [Gly2]GLP-2가 주어진 동물에서, 소장-결장 민감도 지수를 1로 표준화하였다. 참조 화합물 [Gly2]GLP-2에 비해 소장 및 결장 질량에 대한 시험 화합물의 효과는 표 7에 나타낸다. [Gly2]GLP-2가 주어진 동물에서 소장 및 결장 질량을 100%로 표준화하였다.

실시예 11. 생체 내 시험에서, 수컷 C57BL 마우스에서 측정한 장 성장의 자극

결장 질량에 비해 소장 질량을 선택적으로 자극하는 추가 화합물의 능력을 수컷 C57BL 마우스에서 측정하였다. 각각의 화합물 200 nmol/kg을 매일 투여하는 것을 제외하고는 실시예 10에서 전술한 것과 동일한 프로토콜을 이용하였다. 따라서, 마우스의 개별 군(n=6∼10)에게 각각의 화합물 200 nmol/kg을 연속적으로 3 일간 1일 1회씩 피하 투여하였다. 다른 군의 동물들에게 등몰 투여량의 [Gly2]GLP-2(참조 화합물) 또는 비이클(인산염 완충 염수, pH 7.4; 음성 대조군)을 동일한 투약 섭생법으로 투여하였다. 마지막 투여량의 화합물을 투여한 지 24 시간 후, 마우스를 희생시키고 위, 소장 및 결장을 비우고 그 중량을 측정하였다.

도 6에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물 ZP2380, ZP2381, ZP2384, ZP2385, ZP2397, ZP2398, ZP2399, ZP2411, ZP2417, ZP2418, ZP2420, ZP2423은 결장 질량에 비해 소장 질량을 선택적으로 증가시키는 능력이 있다.

실시예 12. 생체 내 시험에서, 수컷 C57BL 마우스에서 측정한 위 성장의 자극

비이클 대조군에 비해 위 질량을 선택적으로 증가시키는 펩티드의 능력을 기초로 하여 본 발명에 따른 시험 화합물의 효과를 측정하였다. 결장 질량에 비해 위 질량을 선택적으로 자극하는 본 화합물(ZP2395, ZP2396, ZP2400, ZP2412, ZP2394 및 ZP2401)의 능력은 수컷 C57BL 마우스에서 측정하였다. 마우스의 개별 군(n=6∼10)에게 각각의 화합물 200 nmol/kg을 연속적으로 3 일간 1일 1회씩 피하 투여하였다. 비교를 위해, 다른 군의 동물에게 등몰 투여량의 [Gly2]GLP-2 또는 비이클(인산염 완충 염수, pH 7.4)을 동일한 투약 섭생법으로 투여하였다. 마지막 투여량의 화합물을 투여한 지 24 시간 후, 마우스를 희생시키고, 소장(유문부터 맹장까지) 및 결장(맹장으로부터 멀리 떨어져 있는 장)을 비우고 그 중량을 측정하였다. 체중(BW)에서의 근소한 차이를 보정하기 위해, 위의 기관 질량을 BW에 비하여 상대적으로 나타내었다. 도 7에서, 화합물 2P2395, ZP2396, ZP2400, ZP2412, ZP2414, ZP2416, ZP2394 및 ZP2401이 결장 질량에 비해 위 질량을 선택적으로 증가시키는 능력을 가짐을 나타낸다.

참조 화합물인 [Gly2]GLP-2는 위 질량을 자극하는 것으로 보고되지 않았으나, 반면에 다수의 ZP 화합물은 체중에 비해 위 질량을 증가시켰다(도 7). 위에서 [Gly2]GLP-2에 비해, ZP 화합물에 의해 유도되는 차별적인 성장 패턴을 평가하기 위해, 화합물 X의 위-결장 민감도 지수는 하기와 같이 계산하였다:

(위/결장)_x/위/(결장)_[Gly2]GLP-2 %.

위/결장 민감도가 1.05보다 크거나 동일한 화합물은 위에 대해 상태적으로 선택적인 것으로 간주하였다.

화합물 ZP2267, ZP2386, ZP2404, ZP2413, ZP1415, ZP2402, ZP2403, ZP2382, ZP2266, ZP2378, ZP2414, ZP2416, ZP2424, ZP2379, ZP2269는 소장, 결장 또는 위에 대해 비선택적이다(도 8).

표 8은 실시예 10∼12에서 얻은 데이터의 개요를 나타낸다:

[표 8]

데이터의 개요

GLP-2 수용체 특이성

기질이 주어진 수용체를 향한 생물학적 특이성을 달성하는 것으로 보이는 메카니즘은 수소 결합, 친수도, 정전기적 상호작용 등을 기반으로 하는 기질과 수용체 사이의 다양한 상호작용을 포함한다.

우리가 구조-활성 관계를 연구하는 동안, GLP-2 서열에 있어서 위치 11, 16, 20, 24 및 28의 잔기가 GLP-2 수용체에 대한 인지 및 결합에 깊이 관련이 있는 것 으로 보였다. 따라서, 이러한 특정 위치의 아미노산 패턴 변화는 GLP-2 유사체를 3가지 다른 군: 소장 특이적 펩티드, 위 특이적 펩티드 및 비특이적 펩티드로 구분한다.

GLP-2 유사체의 수용체 특이성은 위치 11, 16, 20, 24 및 28에서 아미노산의 친수도 및 수소 결합 포텐셜에 따라 달라짐이 밝혀졌다.

실시예 13. 소장 특이성에 대한 HPI의 효과

표 9에서, HPI 데이타는 Sl/결장 민감도 지수에 따라 소장 특이적인 GLP-2 펩티드에 대해 나타낸다.

[표 9]

소장 특이적 GLP-2 유사체 - 친수도 프로파일(HPP)

상기 데이타는 소장 특이적 GLP-2 유사체에 있어서 개개의 위치 11, 16, 20, 24 및 28에 대한 HPI 범위가, 위치 11 및 16에 대하여 독립적으로 -0.8≤HPI≤3.8 이상이거나 또는 바람직하게는 -0.8≤HPI≤2.8 또는 더 바람직한 HPI = 1.8이어야 함을 나타낸다.

위치 20, 24 및 28에 있어서, HPI 범위는 개개의 위치에 대하여 독립적으로 -0.8≤HPI_20,24,28≤1.8이거나 또는 바람직하게는 -0.8≤HPI₂₀≤1.8이고, 더 바람직하게는 HPI_24,28 = -0.8이어야 한다.

HPI 범위에 따른 소장 선택적 펩티드에 대한 가능한 아미노 치환 패턴은 표 10에 나타낸다.

[표 10]

소장 특이적 GLP-2 유사체 - 친수도 프로파일(HPP)

따라서, X11, X16, X20, X24 및 X28 각각은 독립적으로 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다. 특히, X11 및 X16 각각은 독립적으로 Ala 또는 Ser일 수 있고, X20, X24 및 X28은 독립적으로 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다. 예를 들어, X11 및 X16은 둘 다 Ala일 수 있고, X20, X24 및 X28은 독립적으로 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다.

실시예 14. 위 특이성에 대한 HPI의 효과

표 11에서, HPI 데이터는 위/SI 민감도 지수에 따라 위 특이적인 GLP-2 펩티 드에 대하여 나타낸다.

[표 11]

위 특이적 GLP-2 유사체 - 친수도 프로파일(HPP)

상기 데이터는 위 특이적 GLP-2 유사체에 있어서 개개의 위치 11, 16, 20, 24 및 28에 대한 HPI 범위는 위치 11 및 16에 대해 독립적으로 -3.9≤HPI_11,16≤3.8이거나 또는 바람직하게는 2.8≤HPI_11,16≤3.8 또는 HPI_11,16 = -3.9이어야 하고, 위치 20, 24 및 28에 있어서, HPI는 독립적으로 -3.9≤HPI_20,24,28≤1.8이거나 또는 바람직하게는 -0.8≤HPI_20,24,28≤1.8 또는 HPI_20,24,28 = -3.9이어야 함을 나타낸다.

HPI 범위에 따른 가능한 아미노 치환 패턴은 표 12에 나타낸다.

[표 12]

가능한 아미노산 치환 패턴

따라서, 위 특이적 화합물에 있어서

X11은 Leu, Phe 또는 Lys일 수 있다.

X16은 Leu, Phe 또는 Lys일 수 있다.

X20은 Ala 또는 Ser일 수 있다.

X24는 Ala, Ser 또는 Lys일 수 있다.

X28은 Ala, Ser 또는 Lys일 수 있다.

예를 들어, X11 및 X16은 독립적으로 Leu 또는 Phe일 수 있고, X20, X24 및 X28은 Ser일 수 있다.

수용체 특이성에 대한 수소 결합 포텐셜(HBP)의 효과

전술한 바와 같이, GLP-2 유사체의 수용체 특이성은 상기 위치 11, 16, 20, 24 및 28의 수소 결합 포텐셜에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다.

수소 결합 포텐셜(hydrogen bonding potential; HBP)은 문헌[W.D. Stein, "The movement of molecules across cell membranes"; Academic Press N.Y. 1967, pp 65-125]에 의해 개개의 아미노산에 대해 도입되고 정의되며, 주어진 아미노산 곁사슬에 수소 결합을 형성하는 능력을 제공한다.

개개의 아미노산에 대한 HBP는 표 13에 주어진다.

[표 13]

개개의 아미노산에 대한 HBP

실시예 15. 위 특이성에 대한 수소 결합 포텐셜(HBP)의 효과

위 특이적 유사체의 예는 표 14에 나타낸다.

[표 14]

위 특이적 GLP-2 펩티드 유사체

표에 따르면, 위 특이적 GLP-2 유사체에 있어서 개개의 위치 11, 16, 20, 24 및 28에 대한 HBP 범위는 모든 위치에 대하여 독립적으로 0≤HBP_{11,16,20,24,28}≤2 이상이다. HBP 범위에 따라, 가능한 아미노산 치환 페턴은 표 15에 나타낸다.

[표 15]

가능한 아미노산 치환 패턴

바람직한 위 특이적 유사체는 위치 11 및 16에 대한 HBP 범위가 HBP_11,16 = 0이고 위치 20, 24 및 28에 대한 HBP 범위가 독립적으로 0≤HBP_20,24,28≤2인 GLP-2 유사체이다.

소정의 위 특이적 GLP-2 유사체는 하기와 같다:

X11은 Leu, Phe 또는 Lys일 수 있다.

X16은 Leu, Phe 또는 Lys일 수 있다.

X20은 Ala 또는 Ser일 수 있다.

X24는 Ala, Ser 또는 Lys일 수 있다.

X28은 Ala, Ser 또는 Lys일 수 있다.

예를 들어, X11 및 X16은 독립적으로 Leu 또는 Phe일 수 있고, X24 및 X28은 독립적으로 Lys 또는 Ser일 수 있으며, X20은 Ser일 수 있다.

실시예 16. 소장 특이성에 대한 수소 결합 포텐셜(HBP)의 효과

소장 특이적 GLP-2 유사체는 또한 전술한 특정 위치 11, 16, 20, 24 및 28의 수소 결합 포텐셜과 같은 변수들에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다. 개개의 아미노산에 대한 HBP는 표 16에 주어진다.

[표 16]

소장 특이성에 대한 수소 결합 포텐셜(HBP)의 효과

표에 따르면, 소장 특이적 GLP-2 유사체에 있어서 개개의 위치 11, 16, 20, 24 및 28에 대한 HBP 범위는 모든 위치에 대하여 독립적으로 적어도 0≤HBP_{11,16,20,24,28}≤2이어야 한다.

바람직한 유사체는 위치 11과 16에 대한 HBP 범위가 HBP_11,16 = 0이고, 위치 20, 24 및 28은 독립적으로 HBP 범위가 0≤HBP_20,24,28≤2이다.

소장 특이성을 나타내는 더 바람직한 GLP-2 유사체는 위치 11과 16에 대한 HBP 범위가 HBP_11,16 = 0, HBP₂₀ = 0∼2, and HBP_24,28 = 2인 펩티드이다.

소정의 치환 패턴을 표 17에 나타낸다.

[표 17]

소장 특이성 펩티드

따라서, 소장 선택적 화합물에 있어서, X11, X16, X20, X24 및 X28 각각은 독립적으로 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다. 예를 들어, X11 및 X16 각각은 독립적으로 Ala 또는 Ser일 수 있고, X20, X24 및 X28은 독립적으로 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다. 예를 들어, X11 및 X16은 둘 다 Ala일 수 있고, X20, X24 및 X28은 독립적으로 Ala, Ser, Gly 또는 Thr일 수 있다.

본 발명은 전술된 예시적 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 본 개시내용이 제공될 때 많은 등가의 변형 및 변경이 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 전술된 본 발명의 예시적 실시양태는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 발명의 기술적 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 전술된 실시양태를 다양하게 변화시킬 수 있다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌들은 명백히 참고로 도입된다.

Claims

하기 일반식 I로 표시되는 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체:

일반식 I

R¹-Z¹-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z²-R²

(상기 식에서,

R¹은 수소, C_1-4 알킬(예컨대, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;

X2는 Gly, Ala 또는 Sar이며;

X3은 Glu 또는 Asp이고;

X5는 Ser 또는 Thr이며;

X6은 Phe 또는 Pro 또는 보존적 치환이고;

X7은 Ser 또는 Thr이며;

X8은 Asp 또는 Ser 또는 보존적 치환이고;

X9는 Glu 또는 Asp 또는 보존적 치환이며;

X10은 Met, Leu, Nle 또는 산화적으로 안정한 Met 대체 아미노산이고;

X11은 Y1이며;

X12는 Thr 또는 Lys 또는 보존적 치환이고;

X13은 Ile 또는 Glu 또는 Gln 또는 보존적 치환이며;

X14는 Leu 또는 Met 또는 Nle 또는 보존적 치환이고;

X15는 Asp 또는 Glu 또는 보존적 치환이며;

X16은 Y2이고;

X17은 Leu 또는 Glu 또는 보존적 치환이며;

X18은 Ala 또는 Aib 또는 비보존적 치환이고;

X19는 Ala 또는 Thr 또는 보존적 치환이며;

X20은 Y3이고;

X21은 Asp 또는 Ile 또는 보존적 치환이며;

X24는 Y4이고;

X28은 Y5이며;

X31은 Pro 또는 Ile이거나 결실되어 있고;

X32는 Thr이거나 결실되어 있으며;

X33은 Asp 또는 Asn이거나 결실되어 있고;

R²는 NH₂ 또는 OH이며;

Z¹ 및 Z²는, 독립적으로, 존재하지 않거나, Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met 및 Orn으로 이루어진 군에서 선택된 1 내지 10 개의 아미노산 단위로 이루어진 펩티드 서열이고;

HPP = ∑ hpi_X11 + hpi_X16 + hpi_X20 + hpi_X24 + hpi_X28로서 계산한 일반식 I의 잔기 X11, X16, X20, X24, X28의 친수도 프로파일(hydrophaticity profile; HPP)은 -10 이상이며;

이때, Y1, Y2, Y4 및 Y5는, 개별적으로, Asn, Asp, Glu, Gln, Lys, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Val, Met 또는 Phe로 이루어진 군에서 선택될 수 있고;

Y3은 Asn, Asp, Glu, Gln, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Val, Met 또는 Phe로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며;

단, X20이 Arg인 경우, X11은 Ser, X16은 Ala, X24는 Ala, X28은 Ala이고 Z²는 Lys이다).
제1항에 있어서, HPP가 -4 이상인 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 유사체.
제1항에 있어서, HPPI가 0 이상인 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 유사체.
하기 일반식 II로 표시되는 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체:

일반식 II

R¹-Z¹-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z²-R²

(상기 식에서,

R¹은 수소, C_1-4 알킬(예컨대, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;

X2는 Gly, Ala 또는 Sar이며;

X3은 Glu 또는 Asp이고;

X5는 Ser 또는 Thr이며;

X6은 Phe 또는 Pro이고;

X7은 Ser 또는 Thr이며;

X8은 Asp 또는 Ser이고;

X9는 Glu 또는 Asp이며;

X10은 Met, Leu, Nle 또는 산화적으로 안정한 Met 대체 아미노산이고;

X11은 Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr 또는 Val이며;

X12는 Thr 또는 Lys이고;

X13은 Ile 또는 Glu 또는 Gln이며;

X14는 Leu 또는 Met 또는 Nle이고;

X15는 Asp 또는 Glu이며;

X16은 Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr 또는 Val이고;

X17은 Leu 또는 Glu이며;

X18은 Ala 또는 Aib이고;

X19는 Ala 또는 Thr이며;

X20은 Asn, Arg, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr 또는 Val이고;

X21은 Asp 또는 Ile이며;

X24는 Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr 또는 Val이고;

X28은 Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr 또는 Val이며;

X31은 Pro 또는 Ile이거나 결실되어 있고;

X32는 Thr이거나 결실되어 있으며;

X33은 Asp 또는 Asn이거나 결실되어 있고;

R²는 NH₂ 또는 OH이며;

Z¹ 및 Z²는, 독립적으로, 존재하지 않거나, Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met 및 Orn으로 이루어진 군에서 선택된 1 내지 10 개의 아미노산 단위로 이루어진 펩티드 서열이고;

단, X20이 Arg인 경우, X11은 Ser, X16은 Ala, X24는 Ala, X28은 Ala이고 Z²는 Lys이다).
제4항에 있어서,

X11이 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr 또는 Val이고;

X16이 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr 또는 Val이며;

X20이 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr 또는 Val이고;

X24가 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr 또는 Val이며;

X28이 Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr 또는 Val인 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 유사체.
제4항에 있어서,

X11이 Ala, Ile, Leu, Phe 또는 Val이고;

X16이 Ala, Ile, Leu, Phe 또는 Val이며;

X20이 Ala, Ile, Leu, Phe 또는 Val이고;

X24가 Ala, Ile, Leu, Phe 또는 Val이며;

X28이 Ala, Ile, Leu, Phe 또는 Val인 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 유사체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 GLP-2(1-33)와 60% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며 생체 내에서 장 질량을 증가시키는 생물학적 활성을 갖는 GLP-2 유사체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 X11, X16, X20, X24 및/또는 X28에서의 하나 이상의 치환을 포함하고/하거나, 하나 이상의 상기 치환을 위치 X3, X5, X7 및/또는 X10에서의 하나 이상의 치환과 함께 포함하는 GLP-2 유사체.
제1항 또는 제4항에 있어서, 위치 X10에서의 상기 치환이 Leu, Nle, 또는 Met(O) 또는 Met(O)₂와 같은 산화적으로 안정한 Met 대체 아미노산인 GLP-2 유사체.
하기 일반식 III으로 정의되는 글루카곤 유사 펩티드 2(GLP-2) 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체:

일반식 III

R¹-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-X8-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-X15-X16-Leu-Ala-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH₂

(상기 식에서,

R¹은 수소, C_1-4 알킬(예컨대, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;

X8은 Asp 또는 Ser, 바람직하게는 Asp이며;

X11은 Ser, Ala, Glu, Lys 또는 Asn이고;

X15는 Glu 또는 Asp, 바람직하게는 Glu이고;

X16은 Ser, Ala 또는 Glu이며;

X20은 Ser, Ala 또는 Glu이고;

X24는 Ser, Ala 또는 Glu이며;

X28은 Ser, Ala, Gln 또는 Glu이다).
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 본 명세서의 표 1 및 표 2에 개시된 GLP-2 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체.
제11항에 있어서,

2263 HGEGSFSDELSTILESLAASDFISWLISTKITD-NH₂;

2264 HGEGSFSDELATILEALAAADFIAWLIATKITD-NH₂;

2266 HGEGSFSDELETILEELAAEDFIEWLIETKITD-NH₂;

2267 HGEGSFSDELSTILESLAAADFIAWLIATKITD-NH₂;

2268 HGEGSFSDELATILEALAASDFISWLISTKITD-NH₂;

2269 HGEGSFSDELKTILESLAAADFIEWLIQTKITD-NH₂;

2270 HGEGSFSDELNTILESLAASDFISWLISTKITD-NH₂;

2272 HGEGSFSDELATILESLAAADFISWLIATKITD-NH₂;

2242 HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH인 GLP-2 유사체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 X3, X5, X7, X11, X16, X20, X24, X28, X31. X32 및/또는 X33에서의 하나 이상의 치환을 포함하는 GLP-2 유사체.
제13항에 있어서, X11, X16, X20, X24, X28이 Ile, Ala, Leu, Phe 또는 Val인 치환으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하며, 위치 X31, X32 및 X33의 아미노산 잔기가 경우에 따라 결실되어 있는 것인 GLP-2 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 X11, X16, X20, X24 및/또는 X28 중 하나 이상에서 치환을 갖는 GLP-2 유사체.
제1항, 제4항 또는 제10항에 있어서, 각각의 X11, X16, X20, X24 및 X28은 독립적으로 Ala, Ser, Gly 및 Thr으로부터 선택되고, 결장보다 소장에 대해 우선적인 성장 촉진 활성을 갖는 GLP-2 유사체.
제16항에 있어서, 각각의 X11 및 X16은 독립적으로 Ala 및 Ser으로부터 선택되고, X20, X24 및 X28은 독립적으로 Ala, Ser, Gly 및 Thr으로부터 선택되는 것인 GLP-2 유사체.
제17항에 있어서, X11 및 X16이 둘 다 Ala이고, X20, X24 및 X28이 독립적으로 Ala, Ser, Gly 및 Thr으로부터 선택되는 것인 GLP-2 유사체.
제17항에 있어서, X11 및 X16이 둘 다 Ala이고, X20, X24 및 X28이 독립적으로 Ala 및 Ser으로부터 선택되는 것인 GLP-2 유사체.
제16항에 있어서, 위치 X11, X16, X20, X24 및 X28에서 하기의 잔기 조합 중 하나를 포함하는 GLP-2 유사체:

Ser/Ser/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ala/Ala/Ser; Ser/Ala/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ala/Ser/Ala; Ala/Ala/Ser/Ala/Ala; Ser/Ala/Ala/Ala/Ala; Ser/Ala/Arg/Ala/Ala; Ala/Ser/Ala/Ser/Ala; Ala/Ala/Ala/Ala/Ala.
제16항에 있어서, ZP2264, ZP2268, ZP2242, ZP2272, ZP2411, ZP2380, ZP2384, ZP2398, ZP2417, ZP2423, ZP2385, ZP2399, ZP2418, ZP2381, ZP2420 또는 ZP2397인 GLP-2 유사체.
제1항, 제4항 또는 제10항에 있어서,

X11은 Leu, Phe 및 Lys으로부터 선택되고;

X16은 Leu, Phe 및 Lys으로부터 선택되며;

X20은 Ala, Ser, Leu, Gly 및 Thr으로부터 선택되고;

X24는 Ala 및 Ser으로부터 선택되며;

X28은 Ala, Ser 또는 Lys으로부터 선택되고;

결장에 비해 위에서 우선적인 성장 촉진 활성을 갖는 GLP-2 유사체.
제22항에 있어서, X11 및 X16은 독립적으로 Leu 및 Phe으로부터 선택되고, X24 및 X28은 독립적으로 Lys 및 Ser으로부터 선택되며, X20은 Ser인 GLP-2 유사체.
제23항에 있어서, X11 및 X16은 독립적으로 Leu 및 Phe으로부터 선택되고, X20, X24 및 X28은 Ser인 GLP-2 유사체.
제22항에 있어서, 위치 X11, X16, X20, X24 및 X28에서 하기의 잔기 조합 중 하나를 포함하는 GLP-2 유사체:

Lys/Lys/Lys/Lys/Lys; Phe/Phe/Ser/Ser/Ser; Leu/Leu/Ser/Ser/Ser; Leu/Leu/Ala/Ala/Ala.
제22항에 있어서, ZP2400, ZP2412, ZP2396, ZP2394, ZP2401 또는 ZP2395인 GLP-2 유사체.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 소장 특이적 GLP-2 유사체에 있어서 개개의 위치 11, 16, 20, 24 및 28에 대한 HBP 범위(hydrogen bonding potential interval)가 모든 위치에 대하여 독립적으로 적어도 0≤HBP_{11,16,20,24,28}≤2이어야 하는 것인 GLP-2 유사체.
제27항에 있어서, 위치 11 및 16에 대한 HBP 범위가 HBP_11,16=0이고 위치 20, 24 및 28에 대한 HBP 범위가 독립적으로 0≤HBP_20,24,28≤2인 GLP-2 유사체.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 위 특이적 GLP-2 유사체에 있어서 개개의 위치 11, 16, 20, 24 및 28에 대한 HBP 범위가 모든 위치에 대하여 독립적으로 적어도 0≤HBP_{11,16,20,24,28}≤2이어야 하는 것인 GLP-2 유사체.
제29항에 있어서, 위치 11 및 16에 대한 HBP 범위가 HBP_11,16=0이고 위치 20, 24 및 28에 대한 HBP 범위가 독립적으로 0≤HBP_20,24,28≤2인 GLP-2 유사체.
치료요법에 사용하기 위한 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 GLP-2 유사체.
담체와 혼합된 상태로, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체를 포함하는 약학 조성물.
제32항에 있어서, 상기 GLP-2 유사체가 약학적으로 허용되는 산 부가염인 약학 조성물.
제32항 또는 제33항에 있어서, 주사 또는 주입에 의한 투여에 적합한 액체로서 제형화되거나, 상기 GLP-2 유사체를 서방출하도록 제형화된 것인 약학 조성물.
위 및 장 관련 장애의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체의 용도.
제35항에 있어서, 상기 위 및 장 관련 장애가 궤양, 졸링거-엘리슨 증후 군(Zollinger-Ellison syndrome), 소화 장애, 흡수장애 증후군, 짧은 창자 증후군, 맹관 증후군, 염증성 장 질환, (예를 들어, 글루텐 유발성 장병증 또는 만성소화장애증으로부터 발병된) 비열대성 스프루우, 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증성 스프루우, 장염, 국소성 장염(크론병), 궤양성 결장염, 소장 손상 또는 단장 증후군인 용도.
제35항에 있어서, 상기 위 및 장 관련 장애가 방사선 장염, 감염성 또는 감염 후 장염, 또는 독성 물질 또는 다른 화학요법제로 인한 소장 손상인 용도.
화학요법 또는 방사선 요법의 부작용의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체의 용도.
제39항에 있어서, 상기 화학요법의 부작용이 설사, 복부 경련, 구토 또는 화학요법 치료로부터 발생된 장 상피의 구조적 및 기능적 손상인 용도.
신생아, 골다공증 또는 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 병태의 치료용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체의 용도.
영양실조가 관여하는 병태의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 제1 항 내지 제26항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체의 용도.
제41항에 있어서, 상기 영양실조가 관여하는 병태가 악액질 또는 식욕부진인 용도.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
제40항의 핵산 서열을, 이의 발현을 지시하는 조절 서열과 함께 포함하는 발현 벡터.
제34항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제41항의 숙주 세포를 GLP-2 유사체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 이로써 생성된 GLP-2 유사체를 정제하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 GLP-2 유사체의 제조 방법.
치료요법에서 사용하기 위한 제43항에 따른 핵산 분자, 제44항에 따른 발현 벡터 또는 제41항에 따른 숙주 세포.
위 및 장 관련 장애의 치료 및/또는 예방, 화학요법 또는 방사선 요법의 부 작용의 치료 및/또는 예방, 또는 신생아, 골다공증 또는 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 병태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제43항에 따른 핵산 분자, 제40항에 따른 발현 벡터 또는 제45항에 따른 숙주 세포의 용도.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 GLP-2 유사체, 제43항에 따른 핵산 분자, 제44항에 따른 발현 벡터 또는 제45항에 따른 숙주 세포의 유효량을 투여함으로써 위 및 장 관련 장애의 치료가 필요한 환자에 대해 위 및 장 관련 장애를 치료하는 방법.
제49항에 있어서, 상기 위 및 장 관련 장애가 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군, 소화 장애, 흡수장애 증후군, 짧은 창자 증후군, 맹관 증후군, 염증성 장 질환, (예를 들어, 글루텐 유발성 장병증 또는 만성소화장애증으로부터 발병된) 비열대성 스프루우, 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증성 스프루우, 장염, 국소성 장염(크론병), 궤양성 결장염, 소장 손상 또는 단장 증후군인 방법.
제49항에 있어서, 상기 위 및 장 관련 장애가 방사선 장염, 감염성 또는 감염 후 장염, 또는 독성 물질 또는 다른 화학요법제로 인한 소장 손상인 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 GLP-2 유사체, 제43항에 따른 핵산 분자, 제44항에 따른 발현 벡터 또는 제45항에 따른 숙주 세포의 유효량을 투여하 는 단계를 포함하는, 화학요법 또는 방사선 요법의 부작용의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에 대해 화학요법 또는 방사선 요법의 부작용을 치료 또는 예방하는 방법.
제52항에 있어서, 상기 화학요법의 부작용이 설사, 복부 경련, 구토 또는 화학요법 치료로부터 발생된 장 상피의 구조적 또는 기능적 손상인 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 GLP-2 유사체, 제43항에 따른 핵산 분자, 제44항에 따른 발현 벡터 또는 제45항에 따른 숙주 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 신생아 장애, 비만, 골다공증 또는 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 병태의 치료를 필요로 하는 환자에 대해 신생아 장애, 비만, 골다공증 또는 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 병태를 치료하는 방법.
각각 경우에 따라 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 암 화학요법 약물 및 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 GLP-2 유사체, 제43항에 따른 핵산 분자, 제44항에 따른 발현 벡터 또는 제45항에 따른 숙주 세포를 포함하는 치료용 키트.
약학적으로 허용되는 담체와 함께, 암 화학요법 약물 및 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 GLP-2 유사체, 제43항에 따른 핵산 분자, 제44항에 따른 발 현 벡터 또는 제45항에 따른 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물.