KR101242951B1 - 글루카곤 유사 펩티드-2(ｇｌｐ-2) 유사체 - Google Patents

글루카곤 유사 펩티드-2(ｇｌｐ-2) 유사체 Download PDF

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Abstract

[hGly2]GLP-2에 비하여 하나 이상의 치환을 포함하며 생체 내에서 생물학적 활성을 개선시키고/시키거나, 예를 들어, 시험관 내 안정성 분석에서 평가된 바와 같이 화학적 안정성을 개선시키는 GLP-2 유사체가 개시된다. 보다 구체적으로, 본 명세서에 개시된 바람직한 GLP-2 유사체는 경우에 따라 (도입부에 언급된 바와 같이) 위치 2, 및 위치 3, 5, 7, 10 및 11에서의 하나 이상의 추가 치환, 및/또는 아미노산 31 내지 33 중 하나 이상의 아미노산의 결실, 및/또는 N-말단 또는 C-말단 안정화 펩티드 서열의 부가와 함께 야생형 GLP-2 서열의 위치 8, 16, 24 및/또는 28에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 상기 유사체는 위 및 장 관련 장애의 예방 또는 치료 및 화학요법의 부작용의 개선에 특히 유용하다.

Description

글루카곤 유사 펩티드-2(ＧＬＰ-2) 유사체{GLUCAGON-LIKE-PEPTIDE-2(GLP-2)}
본 발명은 글루카곤 유사 펩티드-2(GLP-2) 유사체; 및 예를 들어, 위 및 장 관련 장애의 예방 또는 치료, 및 화학요법 및 방사선요법의 부작용의 개선을 위한 상기 유사체의 의학 용도에 관한 것이다.
GLP-2는 장의 장내분비(enteroendocrine) L 세포 및 뇌간의 특정 영역에서 프로글루카곤의 번역 후 과정으로부터 방출된 33개 아미노산 펩티드이다. 이는 영양분 소화에 반응하여 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1), 옥신토모듈린(oxyntomodulin) 및 글리센틴(glicentin)과 함께 동시 분비된다.
GLP-2는 장샘(crypt)에서의 줄기세포 증식의 자극 및 융모(villi)에 대한 아폽토시스(apoptosis)의 억제를 통해 소장 점막 상피의 유의한 성장을 유도한다(Drucker et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1996, 93: 7911-6). 또한, GLP-2는 위 비우기(emptying) 및 위산 분비를 억제하고(Wojdemann et al. J Clin Endocrinol Metab. 1999, 84: 2513-7), 장 장벽 기능을 증강시키며(Benjamin et al., Gut. 2000, 47: 112-9), 글루코스 수송자의 상향조절을 통해 장 헥소스 수송을 자극하고(Cheeseman, Am J Physiol. 1997, R1965-71), 장 혈류를 증가시킨다(Guan et al., Gastroenterology. 2003, 125, 136-47).
GLP-2는 II형 글루카곤 세크레틴 족(class II glucagon secretin family)에 속하는 단일 G 단백질 결합 수용체에 결합한다(1). GLP-2 수용체는 GLP-2에 대해 반응하는 것으로 공지된 부위인 소장, 결장 및 위에만 국한되어 있다(Yusta et al., Gastroenterology. 2000, 119: 744-55). 그러나, 위장관에서의 GLP-2 수용체 자극에 대한 표적 세포는 불분명한 상태로 남아있고 GLP-2 수용체에 결합된 다운스트림(downstream) 세포 내 매개자는 잘 알려져 있지 않다.
소장에서의 GLP-2의 입증된 특이적이고도 유익한 효과는 장 질환 또는 손상의 치료에 있어서의 GLP-2의 용도에 대한 많은 관심을 불러 일으켰다(Sinclair and Drucker, Physiology 2005: 357-65). 나아가, GLP-2는 화학요법에 의해 유도된 점막염, 허혈-재관류 손상, 덱스트란 설페이트에 의해 유도된 결장염, 및 염증성 장 질환의 유전적 모델을 비롯한 창자(gut) 손상의 많은 임상 전 모델에서 점막 상피 손상을 예방하거나 경감시키는 것으로 밝혀졌다(Sinclair and Drucker Physiology 2005: 357-65). GLP-2는 하기 서열을 가진 33개 아미노산 펩티드로서 분비된다: H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH. GLP-2는 효소 DPP IV에 의해 NH2 말단의 위치 2에 있는 알라닌(A)에서 신속히 절단되어 불활성 인간 GLP-2(3-33)를 생성한다. GLP-2(1-33)의 이 신속한 효소적 분해는 신장을 깨끗이 하는 것(renal clearance) 이외에 상기 펩티드가 약 7분의 반감기를 가지게 한다(Tavares et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 278: E134-E139, 2000).
미국 특허 제5,994,500호(Drucker et al.)에는 GLP-2의 길항제 및 위장 조직의 성장에 대한 이의 효과가 기재되어 있다. 상기 길항제는 증식증(hyperplasia)의 치료 또는 증식증의 유도에 있어서 사용되는 약물로서 제형화된다는 것이 시사되어 있다. 미국 특허 제5,994,500호에서, 포유동물 GLP-2의 구조는 돌연변이 예컨대, 치환 및 결실에 의해 변경되었다.
미국 특허 제6,184,208호, 미국 특허 제5,789,379호 및 미국 특허 제6,184,201호는 GLP-2 유사체들 및 이들의 의학 용도를 개시한다. 상기 유사체들은 인간 GLP-2의 치환 및/또는 결실에 의해 모두 수득된다.
문헌(DaCambra et al., Biochemistry 2000, 39, 8888-8894)에는 GLP-2의 활성에 대한 구조적 결정인자(determinant)가 기재되어 있다. 이 결정인자의 예로는 Phe6 및 Thr5를 들 수 있고, 이들은 GLP-2 수용체 결합 및 활성화에 있어서 결정적으로 중요한 것으로서 언급되어 있다.
국제특허출원 공개 제WO 97/39031호에서, GLP-2 유사체인 [Gly2]GLP-2가 개시되어 있다. 여기서, 상기 펩티드가 DPP IV 절단에 대해 내성을 나타내도록 위치 2의 알라닌이 글리신으로 치환되어 있다. 알라닌의 치환은 상기 펩티드의 안정성 및 효능을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 본원은 GLP-2 유사체가 장 상피 점막의 염증 및 파괴와 관련된 질환에 대해 어떻게 사용될 수 있는지를 기술한다. 이들에는 대규모 소장 절제, 염증성 장 질환, 화학요법에 의해 유도된 점막염 및 허혈성 손상이 포함된다.
국제특허출원 공개 제WO 02/066511호에는 생체 내에서의 연장된 반감기를 가진 GLP-2 유사체, 및 위장 장애 예컨대, 염증성 장 질환의 치료에 있어서 약제로서의 상기 유사체의 용도가 기재되어 있다.
국제특허출원 공개 제WO 01/41779호에는 화학요법에 의해 유도된 아폽토시스를 억제하고 세포 생존을 촉진하는 예비치료제로서의 h[Gly2]GLP-2의 용도가 기재되어 있다.
본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고로 본원에 명백히 도입된다.
다양한 질환의 치료에 있어서 GLP-2 또는 GLP-2의 유사체의 용도는 많은 과학자들에 의해 제안되었다. 그러나, 개선되고 안정한 GLP-2 유사체가 여전히 필요하다.
넓게는, 본 발명은 야생형 GLP-2에 비하여 하나 이상의 치환을 포함하며 생체 내에서의 개선된 생물학적 활성 및/또는, 예를 들어, 시험관 내 안정성 분석에서 평가된 바와 같은 개선된 화학적 안정성이라는 성질을 가질 수 있는 GLP-2 유사체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 바람직한 GLP-2 유사체는 경우에 따라 (도입부에서 언급된 바와 같이) 위치 2 및 위치 3, 5, 7, 10 및 11에서의 하나 이상의 추가 치환, 및/또는 야생형 GLP-2 서열의 위치 31 내지 33에 상응하는 하나 이상의 아미노산의 결실, 및/또는 N-말단 또는 C-말단 안정화 펩티드 서열의 부가와 함께, 위치 8, 16, 24 및/또는 28에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 본 발명은 개선된 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 가질 수 있는 GLP-2 유사체를 제공할 뿐만 아니라, 특히 야생형 GLP-2의 위치 Asp3 및/또는 Ser8 및/또는 Asn16 및/또는 Asn24 및/또는 Gln28에서의 하나 이상의 변형을 포함함으로써 결장에 비하여 소장에서 우세한 장 성장 촉진 활성을 가지거나 반대로 소장에 비하여 결장에서 우세한 장 성장 촉진 활성을 가지는 화합물을 제공하는 것에 관한 것이다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 하기 일반식 I로 표시되는 GLP-2 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 제공한다:
[일반식 I]
R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
상기 식에서,
R1은 수소, C1 -4 알킬(예컨대, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;
X2는 Gly, Ala 또는 Sar이며;
X3은 Glu 또는 Asp이고;
X5는 Ser 또는 Thr이며;
X6은 Phe 또는 Pro이고;
X7은 Ser 또는 Thr이며;
X8은 Asp 또는 Ser이고;
X9는 Glu 또는 Asp이며;
X10은 Met, Leu, Nle, 또는 산화적으로 안정한 Met 대체 아미노산이고;
X11은 Asn, Ala, Lys 또는 Ser이며;
X12는 Thr 또는 Lys이고;
X13은 Ile, Glu 또는 Gln이며;
X14는 Leu, Met 또는 Nle이고;
X15는 Asp 또는 Glu이며;
X16은 Asn 또는 Ala이고;
X17은 Leu 또는 Glu이며;
X18은 Ala 또는 Aib이고;
X19는 Ala 또는 Thr이며;
X20은 Arg 또는 Lys이고;
X21은 Asp 또는 Ile이며;
X24는 Asn, Ala 또는 Glu이고;
X28은 Gln, Ala 또는 Asn이며;
X31은 Pro 또는 Ile이거나 결실되어 있고;
X32는 Thr이거나 결실되어 있으며;
X33은 Asp 또는 Asn이거나 결실되어 있고;
R2는 NH2 또는 OH이며;
Z1 및 Z2는, 독립적으로, 존재하지 않거나, Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met 및 Orn으로 구성된 군으로부터 선택된 3 내지 20개의 아미노산 단위로 이루어진 펩티드 서열이고;
이때, GLP-2 유사체는 X8이 Ser인 치환 및/또는 X16이 Ala인 치환 및/또는 X24가 Ala인 치환 및/또는 X28이 Ala인 치환으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 하기 일반식 II로 표시되는 GLP-2 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 제공한다:
[일반식 II]
R1-Z1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
상기 식에서,
R1은 수소, C1 -4 알킬(예컨대, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;
X3은 Glu 또는 Asp이고;
X5는 Ser 또는 Thr이며;
X7은 Ser 또는 Thr이며;
X8은 Asp 또는 Ser이고;
X9는 Glu 또는 Asp이며;
X10은 Met, Leu, Nle, 또는 산화적으로 안정한 Met 대체 아미노산이고;
X11은 Asn, Ala, Lys 또는 Ser이며;
X12는 Thr 또는 Lys이고;
X13은 Ile, Glu 또는 Gln이며;
X14는 Leu, Met 또는 Nle이고;
X15는 Asp 또는 Glu이며;
X16은 Asn 또는 Ala이고;
X17은 Leu 또는 Glu이며;
X19는 Ala 또는 Thr이며;
X24는 Asn 또는 Ala이고;
X28은 Gln, Ala 또는 Asn이며;
X31은 Pro 또는 Ile이거나 결실되어 있고;
X32는 Thr이거나 결실되어 있으며;
X33은 Asp이거나 결실되어 있고;
R2는 NH2 또는 OH이며;
Z1 및 Z2는, 독립적으로, 존재하지 않거나, Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met 및 Orn으로 구성된 군으로부터 선택된 3 내지 20개의 아미노산 단위로 이루어진 펩티드 서열이고;
이때, GLP-2 유사체는 X8이 Ser인 치환 및/또는 X16이 Ala인 치환 및/또는 X24가 Ala인 치환 및/또는 X28이 Ala인 치환으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 하기 일반식 III으로 표시되는 GLP-2 유사체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 제공한다:
[일반식 III]
R1-Z1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-Glu-X10-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-X16-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
상기 식에서,
R1은 수소, C1 -4 알킬(예컨대, 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;
X3은 Glu 또는 Asp이고;
X5는 Ser 또는 Thr이며;
X7은 Ser 또는 Thr이며;
X8은 Asp 또는 Ser이고;
X10은 Met, Leu, Nle, 또는 산화적으로 안정한 Met 대체 아미노산이고;
X11은 Asn, Ala, Lys 또는 Ser이며;
X24는 Asn 또는 Ala이고;
X28은 Gln 또는 Ala이며;
X31은 Pro이거나 결실되어 있고;
X32는 Thr이거나 결실되어 있으며;
X33은 Asp이거나 결실되어 있고;
R2는 NH2 또는 OH이며;
Z1 및 Z2는, 독립적으로, 존재하지 않거나, Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met 및 Orn으로 구성된 군으로부터 선택된 3 내지 20개의 아미노산 단위로 이루어진 펩티드 서열이고;
이때, GLP-2 유사체는 X8이 Ser인 치환 및/또는 X16이 Ala인 치환 및/또는 X24가 Ala인 치환 및/또는 X28이 Ala인 치환으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다. X16이 Ala인이 아닌 경우, X16은 Asn일 것이다.
소정의 실시양태에서, Z1이 존재하는 경우 R1은 H일 수 있고, Z2가 존재하는 경우 R2는 OH일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, GLP-2 유사체는 본원의 도입부에 기재된 서열을 가진 야생형 GLP-2(1-33)와 60% 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 63% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 66% 이상의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 69% 이상의 서열 동일성을 가진다.
GLP-2 폴리펩티드 서열에 대하여 "% 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요하다면, 최대 %의 서열 동일성을 달성하기 위해 갭(gap)을 도입하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후, 야생형 GLP-2 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 서열 정렬은 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어 예컨대, BLAST, BLAST2 또는 얼라인(Align) 소프트웨어를 이용하여 당분야에 잘 공지된 기법을 이용하여 당업자에 의해 수행될 수 있고, 상기 소프트웨어에 대해서는 문헌[Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html] 또는 문헌[Pearson et al., Genomics, 46, 24, 36 (1997)] 및 얼라인 프로그램에 대해 웹사이트(http://molbiol.soton.ac.uk/compute/align.html)를 참조한다.
본 발명에 따라 본원 사용되는 % 서열 동일성은 디폴트 셋팅(default setting)을 가진 이들 프로그램을 이용하여 결정한다. 보다 일반적으로, 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 결정하기에 적절한 매개변수를 용이하게 결정할 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 일반식 I, II 또는 III으로 표시되는 GLP-2 펩티드 유사체는 위치 X8, X16, X24 및/또는 X28에서의 하나 이상의 치환, 및/또는 이들 치환과 다른 치환, 바람직하게는 위치 X3, X5, X7, X10 및/또는 X11에서의 치환의 조합을 포함한다.
일반식 I 내지 III에 포함되는 X8, X16, X24 및/또는 X28 치환들의 조합의 예에는 하기에 기재된 것들이 포함된다:
Ser8, Ala16;
Ser8, Ala24;
Ser8, Ala28;
Ala16, Ala24;
Ala16, Ala28;
Ala24, Ala28;
Ser8, Ala16, Ala24;
Ser8, Ala16, Ala28;
Ser8, Ala24, Ala28;
Ala16, Ala24, Ala28; 및
Ser8, Ala16, Ala24, Ala28.
일반식 I 내지 III에 포함되며 위치 X8, X16, X24 및/또는 X28에서의 하나 이상의 치환, 또는 위치 8, 16, 24 및/또는 28에서의 상기 언급된 변화와 조합된 위치 X31 내지 X33에서의 하나 이상의 결실과 조합될 수 있는 위치 X3, X5, X7, X10 및/또는 X11에서의 치환의 예에는 하기에 기재된 것들이 포함된다:
Glu3, Leu10, Ala11,24;
Glu3, Thr5, Leu10, Ser11, Ala16,24,28;
Glu3, Thr5, Leu10, Lys11, Ala16,24,28;
Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Lys11, Ala16,24,28;
Glu3, Thr5, Ser8,11, Leu10, Ala16,24,28;
Glu3, Thr5, Ser8,11, Leu10, Ala16,24,28;
Glu3, Ser8,11, Leu10, Ala16,24,28;
Glu3, Leu10, Ser11, Ala16,24,28;
Glu3, Leu10, Lys11, Ala16,24,28;
Glu3, Thr5, Leu10, Ala11,16,24,28;
Glu3, Thr5, Leu10, Ala11,16,24,28, Ile21;
Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Ala11,16,24,28;
Glu3, Ser8, Leu10, Ala11,16,24,28;
Glu3, Leu10, Ala11,16,24,28;
Thr7, Leu10, Ala11,24;
Thr7, Leu10, Lys11, Ala24;
Thr7, Leu10, Ser11, Ala24;
Thr7, Leu10, Ser8,11, Ala24;
Thr7, Ser8, Leu10, Ala11,24;
Thr7, Ser8, Leu10, Lys11, Ala24;
Ser8, Leu10, Ala11,24;
Leu10, Ala24;
Leu10, Ala11, Ala24;
Leu10, Ala11,24,28;
Leu10, Ala11,16,24,28;
Leu10, Lys11, Ala24;
Leu10, Ser11, Ala24; 및
Leu10, Ser8,11, Ala24.
본 발명의 GLP-2 화합물의 구체적인 예는 하기 상세한 설명에 기재되어 있다.
본 발명은 개선된 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 가질 수 있는 GLP-2 유사체를 제공할 뿐만 아니라, 결장에 비하여 소장에서 우세한 성장 촉진 활성을 가지거나 반대로 소장에 비하여 결장에서 우세한 성장 촉진 활성을 가지는 화합물을 제공하는 것에 관한 것이다. 특히, 본원에 기재된 실험은 야생형 GLP-2의 위치 Asp3 및/또는 Ser8 및/또는 Asn16 및/또는 Gln28에서의 치환이 시험 화합물에 투여된 경우 결장 질량에서의 증가에 비하여 소장 체중의 우세한 증가를 제공한다는 것을 보여준다. 이 발견은 예시된 화합물이 결장에 대해 더 낮은 효과를 가지면서 소장에서 증가된 성장 촉진 효과를 가지는 것이 유리한 증상 또는 상기 효과의 반대의 효과를 가지는 것이 유리한 증상을 치료하는 데 유용할 수 있다는 것을 의미한다.
따라서, 소장의 성장을 촉진하는 데 바람직한 화합물은 전형적으로 야생형 GLP-2의 위치 3, 8, 16 및/또는 28에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 이러한 화합물은 결장보다 오히려 소장의 성장을 선택적으로 촉진할 수 있다. 따라서, 이들은 소장에 영향을 주거나 소장과 관련된 증상을 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 이러한 소장 선택적 화합물은 위치 X3, X7, X16, X24, X28, X31, X32 및/또는 X33에서의 하나 이상의 치환을 포함한다. 따라서, 소장 선택적 화합물은 X3이 Glu인 치환, X7이 Ser인 치환, X16이 Ala인 치환, X24가 Ala인 치환, X28이 Ala인 치환, X31이 Ile인 치환, X32가 Thr인 치환 및 X33이 Asp인 치환 중 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 위치 X31, X32 및 X33의 아미노산 잔기는 경우에 따라 결실될 수 있다.
소장에서 상피 성장을 우세하게 자극하는 예시적 화합물에는 1809, 1818, 1819, 1820, 1826, 1827, 1844, 1845, 1846, 1848, 1849, 1850, 1851, 1852, 1853, 1855, 1857, 1858 및 1859가 포함된다.
다른 한편으로, 이러한 변형을 가지지 않는, 예를 들어, 위치 10, 11 및/또는 24에서의 하나 이상의 치환을 포함하는 본 발명의 화합물은 소장보다 오히려 결장의 우세한 성장을 유도하는 데 바람직할 수 있다. 그러므로, 이들 화합물은 결장에 영향을 주거나 결장과 관련된 증상의 치료를 위해 사용될 수 있다.
이러한 결장 선택적 화합물은 위치 X3, X8 및/또는 X24에서의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들은 X3이 Asp인 치환, X8이 Asp인 치환 및 X24가 Ala인 치환으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 위치 X31, X32 및 X33의 아미노산 잔기는 경우에 따라 결실될 수 있다.
결장에서 상피 성장을 우세하게 자극하는 예시적 화합물에는 1830, 1831, 1835, 1836, 1839, 1840, 1841 및 1843이 포함된다.
소장 또는 결장에서 우세한 성장을 자극하지 않는 예시적 화합물에는 [Gly2]GLP-2(즉, 참조 분자), 1559, 1821, 1822, 1823, 1825, 1828, 1829, 1832, 1833, 1834, 1842 및 1854가 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 예컨대, 산 가수분해, 산화 및 탈아미드화에 대해 증가된 화학적 안정성을 가진다. 위치 X3 및/또는 X33에서의 치환은 산 가수분해에 대한 안정성을 개선시킬 수 있는 것으로 생각된다. 위치 X10에서의 치환은 산화적 안정성을 개선시킬 수 있다. 위치 X11, X16 및/또는 X24에서의 하나 이상의 치환은 탈아미드화에 대한 안정성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 GLP-2 유사체는 Gly2-GLP-2에 비하여 상대적으로 산성 용액 중에서의 분해, 탈아미드화 및/또는 산화적 분해에 대해 증강된 안정성을 나타낼 수 있다.
바람직하게는, GLP-2 유사체는 하기 실시예 7에 기재된 분해 시험들 중 하나 이상의 시험에서 초기 순도에 비하여 상대적으로 70% 이상의 실측 순도를 유지한다. 추가로 또는 별법으로, 상기 유사체는 12일 후 0.1 M의 HCl 용액 중에서의 초기 순도에 비하여 상대적으로 60% 이상의 실측 순도를 유지할 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 상기 유사체는 6일 후 0.1 M의 NH4HCO3 용액 중에서의 초기 순도에 비하여 상대적으로 70% 이상의 실측 순도를 유지할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 담체와 혼합된 상태로, 본원에 정의된 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 조성물이고, 상기 담체는 약학적으로 허용되는 담체이다. GLP-2 펩티드 유사체는 GLP-2 유사체의 약학적으로 허용되는 산 부가염일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 치료요법에서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 GLP-2 유사체 또는 이의 염을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 위 및 장 관련 장애의 치료 및/또는 예방 예컨대, 골다공증 및 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 증상, 손상된 장 기능을 가진 신생아의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체의 용도를 제공한다. 예를 들면, 위 및 장 관련 장애에는 궤양, 위염, 소화 장애, 흡수장애 증후군, 짧은 창자 증후군, 맹관(cul-de-sac) 증후군, 염증성 장 질환, (예를 들어, 글루텐에 의해 유도된 장병증 또는 만성소화장애증으로부터 발병된) 비열대성 스프루우(celiac sprue), 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증성 스프루우, 장염, 국소성 장염(크론병), 궤양성 결장염, 설사와 관련된 자극성 장 증후군, 소장 손상 및 단장 증후군이 포함된다.
본 발명의 GLP-2 유사체로 치료될 수 있거나 GLP-2 유사체가 예방적 또는 치료적으로 유용할 수 있는 다른 증상에는 방사선 장염, 감염성 또는 감염 후 장염, 및 독성 물질 또는 다른 화합요법제로 인한 소장 손상이 포함된다. 이는 화학요법의 부작용 예컨대, 설사, 복부 경련 및 구토를 감소시키고 화학요법 또는 방사선요법으로부터 발생된 필연적 결과인 장 상피의 구조적 및 기능적 손상을 감소시키기 위해 화학요법 또는 방사선요법의 과정 전에, 상기 과정과 동시에 또는 상기 과정 후에 GLP-2 유사체의 투여를 필요로 할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 경우에 따라 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 암 화학요법 약물 및 본 발명의 GLP-2 유사체를 포함하는 치료용 키트 또한 제공한다. 상기 두 가지 치료제는 분리 투여를 위해 (예컨대, 별개의 바이알 내에) 별도로 포장될 수 있거나, 동일한 조성물 중에 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 암 화학요법 약물 및 본 발명의 GLP-2 유사체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
위장 점막 신생물을 가지거나 위장 점막 신생물의 증가된 위험을 가진 환자의 경우, 감소된 부작용 예컨대, 위장 점막 신생물의 자극 또는 악화의 위험을 감소시키거나 없애도록 화합물을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, (양성이든 악성이든 간에) 결장 신생물을 가지거나 결장 신생물을 발생시킬 위험에 있는 환자를 치료하기 위해 화합물을 선택하는 경우, 비선택적 화합물 또는 소장에 비하여 결장에 대해 선택성을 가진 화합물보다 결장에 비하여 소장에 대해 선택성을 가진 화합물을 선택하는 것이 더 적절할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 영양실조 예를 들어, 소모성 증후군인 악액질 및 식욕부진과 같은 증상의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조를 위한 GLP-2 유사체의 용도를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 GLP-2 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 경우에 따라 상기 핵산 서열의 발현을 지시하는 서열과 조합된 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 이 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 GLP-2 유사체를 발현하고 분비할 수 있다. 추가 양태에서, 본 발명은 GLP-2 유사체를 발현하기에 적합한 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 이로써 생성된 GLP-2 유사체를 정제하는 단계를 포함하는 GLP-2 유사체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 치료요법에서 사용하기 위한 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 GLP-2 유사체를 발현하고 분비할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 상기 핵산, 발현 벡터 및 숙주 세포가 GLP-2 유사체 자체로 치료될 수 있는 본원에 기재된 장애들 중 임의의 장애의 치료를 위해 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 본 발명의 GLP-2 유사체를 포함하는 치료 조성물 또는 본 발명의 GLP-2 유사체의 투여에 대한 언급은 해당 문맥에 달리 명시되어 있는 경우를 제외하고 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 투여를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 GLP-2 유사체 또는 이의 염 또는 유도체, 또는 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 유효량을 투여함으로써 위 및 장 관련 장애의 치료가 필요한 환자에서 위 및 장 관련 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 위 및 장 관련 장애의 예는 전술되어 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 GLP-2 유사체 또는 이의 염 또는 유도체, 또는 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 화학요법 또는 방사선요법의 부작용의 치료가 필요한 환자에서 상기 부작용을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 GLP-2 유사체 또는 이의 염 또는 유도체, 또는 본 발명의 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 영양실조 예를 들어, 소모성 증후군인 악액질 및 식욕부진과 같은 증상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
지금부터, 본 발명의 실시양태는 첨부된 도면과 관련하여 실시예에 의해 더욱 상세히 기재될 것이지만 이로 한정되지 않는다.
정의
달리 명시하지 않는 한, 상기 설명에서 사용된 특정 용어들에 대한 정의는 하기에 제공된다.
명세서 및 청구의 범위 전체에서, 천연 아미노산에 대한 약정된 1개 문자 및 3개 문자 코드 뿐만 아니라 다른 α-아미노산 예컨대, 사르코신(Sar), 노르류신(Nle) 및 α-아미노이소부티르산(Aib)에 대한 일반적으로 허용되는 3개 문자 코드가 사용된다. 본 발명의 펩티드 내의 모든 아미노산 잔기는 바람직하게는 L-구조를 가진다. 그러나, D-구조의 아미노산 또한 존재할 수 있다.
본 발명의 바람직한 화합물은 특히, 장을 성장시키는 데 있어서 하나 이상의 GLP-2 생물학적 활성을 가진다. 이는 예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 생체 내 분석에서 평가될 수 있고, 이때 장 또는 이의 일부의 질량은 시험 동물이 GLP-2 유사체로 처리되거나 GLP-2 유사체에 노출된 후에 측정된다.
본 발명의 GLP-2 유사체는 상기 정의된 바와 같이 천연 GLP-2와 비교될 때 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 역위(inversion) 또는 부가를 가진다. 본 정의는 동의어 GLP-2 모사체(mimetics) 및/또는 GLP-2 작용제(agonist) 또한 포함한다. 추가로, 본 발명의 유사체는 하나 이상의 그의 아미노산 측 기(side group), α-탄소 원자, 말단 아미노 기 또는 말단 카르복실산 기의 화학적 변형을 추가로 가질 수 있다. 화학적 변형은 화학적 잔기(moiety)의 부가, 새로운 결합의 생성, 및 화학적 잔기의 제거를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 아미노산 측 기에서의 변형은 라이신 ε-아미노 기의 아실화, 아르기닌, 히스티딘 또는 라이신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산의 카르복실산 기의 알킬화, 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아미드화를 포함하나 이로 한정되지 않는다. 말단 아미노의 변형은 데스-아미노, N-저급 알킬, N-디-저급 알킬 및 N-아실 변형을 포함하나 이로 한정되지 않는다. 말단 카르복시 기의 변형은 아미드, 저급 알킬 아미드, 디알킬 아미드 및 저급 알킬 에스테르 변형을 포함하나 이로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본원에서 저급 알킬은 C1-C4 알킬이다. 더욱이, 하나 이상의 측 기 또는 말단 기는 통상의 기술을 가진 펩티드 화학자에게 공지된 보호 기에 의해 보호될 수 있다. 아미노산의 α-탄소는 모노메틸화될 수 있거나 디메틸화될 수 있다.
산화적으로 안정한 Met 대체 아미노산이 존재하는 경우, 이는 Met(O)(메티오닌 설폭시드), Met(O)2(메티오닌 설폰), Val, Ile, Asn, Glx(Glu 또는 Gln), Tyr, Phe, Trp 및 바람직하게는 Leu, Nle, Ala, Ser 및 Gly으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 의미한다.
본 발명의 펩티드가 염 또는 다른 유도체의 형태로 제공될 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 염에는 약학적으로 허용되는 염 예컨대, 산 부가염 및 염기성 염이 포함된다. 산 부가염의 예에는 염산 염, 시트르산 염, 아세트산 염이 포함된다. 염기성 염의 예에는 양이온이 알칼리 금속 예컨대, 나트륨 및 칼륨, 알칼리 토금속 예컨대, 칼슘, 및 암모늄 이온 +N(R3)3(R4)(이때, R3 및 R4는 경우에 따라 치환된 C1-C6-알킬, 경우에 따라 치환된 C2-C6-알케닐, 경우에 따라 치환된 아릴, 또는 경우에 따라 치환된 헤테로아릴을 독립적으로 나타냄)로부터 선택된 염이 포함된다. 약학적으로 허용되는 염의 다른 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985] 및 이의 최근 개정판, 및 문헌[Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology]에 기재되어 있다.
본 발명의 GLP-2 유사체의 다른 유도체에는 Mn2 + 및 Zn2 +과 같은 금속 이온과의 배위 착물, 생체 내에서 가수분해 가능한 에스테르와 같은 에스테르, 유리 산 또는 염기, 수화물, 프로드러그 또는 지질이 포함된다. 에스테르는 당분야에 잘 공지된 기법을 이용하여 본 화합물에 존재하는 히드록실 또는 카르복실 산 기와 적절한 카르복실산 또는 알콜 반응 파트너 사이에 형성될 수 있다. 본 화합물의 프로드러그로서의 유도체는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 모 화합물들 중 하나로 전환될 수 있다. 전형적으로, 화합물의 생물학적 활성 중 하나 이상의 활성이 본 화합물의 프로드러그 형태에서 감소될 것이고, 본 화합물 또는 이의 대사물질을 방출시키는 프로드러그의 전환에 의해 활성화될 수 있다. 프로드러그의 예에는 원위치에서 제거되어 활성 화합물을 방출시킬 수 있거나 생체 내에서 약물의 제거를 억제하는 데 기여할 수 있는 보호 기의 사용이 포함된다.
Z1 및 Z2는, 존재하는 경우, 3 내지 20개 또는 4 내지 20개의 아미노산 잔기 예컨대, 4 내지 15개, 보다 바람직하게는 4 내지 10개, 특히 4 내지 7개의 아미노산 잔기, 예를 들어, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 잔기 예컨대, 6개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 서열을 각각 독립적으로 나타낸다. 펩티드 서열 Z 내의 아미노산 잔기들은 Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met 및 Orn으로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 잔기는 Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Om 및 Met 뿐만 아니라 국제특허출원 공개 제WO 01/04156호에 정의된 바와 같은 일반식 I에 포함되는 아미노산, 예를 들어, Dbu(2,4-디아미노부티르산) 또는 Dpr(2,3-디아미노프로파노산)으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 Glu, Lys 및 Met로부터 선택되고, 특히 Lys이다. 전술된 아미노산은 D-구조 또는 L-구조를 가질 수 있지만, 바람직하게는 전술된 아미노산은 L-구조를 가진다. 특히 바람직한 서열 Z는 4, 5 또는 6개의 연속적 라이신 잔기들, 특히 6개의 연속적 라이신 잔기들로 이루어진 서열이다. 예시적 서열 Z는 국제특허출원 공개 제WO 01/04156호에 개시되어 있다.
소정의 실시양태에서, Z1은 존재하지 않는다. 이 경우, Z2는 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
본 발명은 하기 실험 부분에 더 기재되어 있는 하기 펩티드를 포함한다:
참조 GLP-2 유사체
1559 H-[Gly2]hGLP-2-OH
H-HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD-OH
본 발명의 GLP-2 유사체의 예
1809 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, Ala11,16,24,28]hGLP-2-(Lys)6-NH2
HGEGTFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1810 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, Ala11,16,24,28, Ile21]hGLP-2(1-30)-(Lys)6-NH2
HGEGTFSDELATILDALAARIFIAWLIATK6-NH2
1811 [Gly2, Pro6, Leu10, Ala11,16,24,28]hGLP-2-NH2
HGDGSPSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1812 [Gly2, Glu3, Leu10, Ala11,24]hGLP-2-NH2
HGEGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD-NH2
1813 [Gly2, Leu10, Ala11,16,24,28]hGLP-2-NH2
H-HGDGSFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1814 [Gly2, Leu10, Ala11,24,28]hGLP-2-NH2
H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIATKITD-NH2
1815 [Gly2, Glu3, Leu10, Ala11,16,24,28]hGLP-2-NH2
H-HGEGSFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1818 [Gly2, Ser8, Leu10, Ala11,24]hGLP-2(1-3O)-K6-NH2
H-HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2
1819 [Gly2, Leu10, Ser11, Ala24]hGLP-2(1-3O)-K6-NH2
H-HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2
1820 [Gly2, Thr7, Ser8, Leu10, Ala11,24]hGLP-2(1-3O)-K6-NH2
H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2
1821 [Gly2, Leu10, Lys11, Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2
H-HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2
1822 [Gly2, Thr7, Leu10, Lys11, Ala24]hGLP-2(1-3O)-K6-NH2
H-HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2
1823 [Gly2, Thr7, Ser8, Leu10, Lys11, Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2
H-HGDGSFTSELKTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2
1824 [Gly2, Thr7, Leu10, Ala11,24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2
H-HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2
1825 [Gly2, Ser8, Leu10, Ala11,24]hGLP-2(1-30)-NH2
H-HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1826 [Gly2, Leu10, Ala24]hGLP-2-K6-NH2
H-HGDGSFSDELNTILDNLAARDFIAWLIQTKITDK6-NH2
1827 [Gly2, Thr7, Leu10, Ser11, Ala24]hGLP-2(1-3O)-K6-NH2
H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2
1828 [Gly2, Thr7, Leu10, Ser8,11, Ala24]hGLP-2(1-3O)-K6-NH2
H-HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2
1829 [Gly2, Leu10, Ser8,11, Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2
H-HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2
1830 [Gly2, Leu10, Ser11, Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2
H-HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1831 [Gly2, Thr7, Leu10, Ser11, Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2
H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1832 [Gly2, Thr7, Leu10, Ser8,11, Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2
H-HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1833 [Gly2, Leu10, Ser8,11, Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2
H-HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1834 [Gly2, Thr7, Ser8, Leu10, Ala11,24]hGLP-2(1-30)-NH2
H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1835 [Gly2, Leu10, Lys11, Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2
H-HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1836 [Gly2, Thr7, Leu10, Lys11, Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2
H-HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1839 [Leu10, Ala11, Ala24]hGLP-2(1-33)-K6-NH2
H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITDK6-NH2
1840 [Leu10, Ala11, Ala24]hGLP-2(1-33)-NH2
H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD-NH2
1841 [Leu10, Ala11, Ala24]hGLP-2(1-3O)-NH2
H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1842 [Thr7, Ser8, Leu10, Lys11, Ala24]hGLP-2(1-3O)-NH2
H-HGDGSFTSELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1843 [Thr7, Leu10, Ala11, Ala24]hGLP-2(1-3O)-NH2
H-HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1844 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8,11, Leu10, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2
H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1845 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, Ser11, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2
H-HGEGTFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1846 [Gly2, Glu3, Ser8,11, Leu10, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2
H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6NH2
1847 [Gly2, Glu3, Leu10, Ser11, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2
H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1848 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Ala11,16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2
H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1849 [Gly2, Glu3, Ser8, Leu10, Ala11,16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2
H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1850 [Gly2, Glu3, Leu10, Lys11, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2
H-HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1851 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, Lys11, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2
H-HGEGTFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1852 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Lys11, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2
H-HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1853 [GIy2, Glu3, Thr5, Ser8,11, Leu10, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2
H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1854 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, Ser11, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2
H-HGEGTFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1855 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Ala11,16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2
H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1856 [Gly2, Glu3, Ser8,11, Leu10, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2
H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1857 [Gly2, Glu3, Leu10, Ser11, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2
H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1858 [Gly2, Glu3, Ser8, Leu10, Ala11,16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2
H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1859 [Gly2, Glu3, Leu10, Lys11, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2
H-HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1860 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, Lys11, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2
H-HGEGTFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1861 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Lys11, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2
HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITD
본 발명의 특히 바람직한 화합물에는 화합물 1834, 1846, 1847, 1848, 1849, 1855, 1857 및 1858이 포함된다.
1834 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1846 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6NH2
1847 H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1848 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1849 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1855 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1857 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1858 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
안정성 연구
당업자는 예를 들어 하기 기재된 것에 기초하여 GLP-2 유사체의 분해 생성물의 검출에 적합한 방법(예를 들어, 정량적 방법)을 디자인할 수 있을 것이다. 분해는 임의의 소정의 GLP-2 유사체 내의 아미노산의 정체(identity) 및 위치, 및 pH, 용액 및 온도와 같은 조건에 따라 산화, 가수분해 및 탈아미드화로서 일어날 수 있다. 화합물은 그가 스트레스를 받는 조건(즉, 분해를 초래할 수 있는 조건) 하에 항온처리된 후 잔존하는 완전한 펩티드의 함량에 대해 분석될 때 화학적 안정성에 따라 등급이 매겨질 수 있다. 또한, 스트레스를 받는 조건 하에 수득된 주 분해 생성물에 대해 얻은 지식은 향후 임의의 분석 방법 개발에 중요할 것이다.
GLP -2 유사체를 검출하기 위한 정량 분석
당업자는, GLP-2 유사체를 포유동물에게 투여한 후 GLP-2 유사체의 흡수, 분배, 물질대사 및 분비를 조사하기 위해 또는 시험관 내 세포 시스템의 기능적 연구의 일부로서, 복잡한 환경 또는 용액(예를 들어, 혈장, 소변, 조직 균질화물, 세포 균질화물, 타액 또는 이들과 유사한 것) 중의 GLP-2 유사체의 검출을 위한 방법(예를 들어, 정량적 방법)을 디자인할 수도 있다.
한 실시양태에서, 정량 분석은 GLP-2 유사체 또는 이의 단편에 대해 생성된 항체를 기초로 할 수 있다. 면역화된 동물로부터 수득된 항체를 정량 분석에 사용할 수 있다. 한 예에서, 멀티-웰 플레이트(multi-well plate) 내에 고정된 분자의 한 일부에 대한 친화성을 가진 제1 항체를 사용하여 직접적 샌드위치 ELISA를 준비할 수 있다. 그 다음, 샘플을 상기 웰에 첨가하고 GLP-2 유사체를 상기 제1 항체에 의해 포획한다. 이어서, 포획된 GLP-2 유사체는 GLP-2 유사체의 또 다른 일부에 대한 친화성을 가진 제2 항체에 의해 인식된다. 상기 제2 항체는 효소(호스라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제(phosphatase) 또는 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase)) 또는 방사성 동위원소로 표지할 수 있다. 그 후, 포획된 GLP-2 유사체의 양은 비색성(colorimetric) 기질의 첨가, 방사성 방출의 직접적 카운팅 또는 섬광(scintillation)에 의해 검출될 수 있다. 별법으로, 포획된 GLP-2 유사체의 양은 제2 항체에 대한 치환성을 가진 표지된 항체의 첨가에 의해 간접적으로 검출될 수 있다. 샘플 중의 농도는 공지된 양의 GLP-2 유사체를 함유하는 외부 표준 곡선으로부터 수득된 반응으로부터 추정될 수 있다. 별법으로, 항체는 직접적인 경쟁적 면역분석을 준비하는 데 사용될 수 있고, 이때 GLP-2 유사체에 특이적인 항체는 멀티-웰 플레이트 상에 고정되고, 샘플은 소정의 고정된 농도의 표지된 GLP-2 유사체와 함께 상기 웰 중에서 항온처리된다. 표지는 효소, 형광발색단(fluorophore), 방사성 동위원소 또는 바이오틴일 수 있고, 예를 들어, 상기 효소에 특이적인 기질(예컨대, 비색성, 형광성 또는 화학발광성 기질), 섬광 또는 효소에 결합된 아비딘(avidin)을 사용하여 검출할 수 있고, 그 후 이들은 전술한 바와 같이 검출될 수 있다. 결합된 표지된 GLP-2 유사체의 양은 적절한 방법에 의해 검출될 수 있고, 샘플 중에 존재하는 GLP-2 유사체의 농도는 상기 외부 표준 곡선으로부터 수득된 반응으로부터 유도될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 정량 분석은 액체 크로마토그래피 직렬(tandem) 질량 분광법을 기초로 할 수 있다. 이러한 구성 하에서, 연구될 GLP-2 유사체에 특이적인 단편으로부터의 반응은 불활성 기체(He 또는 Ar)와의 충돌에 의해 유도된 모 화합물의 단편화에 대해 모니터링된다. 단편화 전, 샘플 성분들을 역상 크로마토그래피로 분리할 수 있거나 샘플을 질량 분광계에 직접 주입할 수 있다. 적절한 경우, 샘플을 전처리(즉, 프로테아제 억제제의 첨가, 단백질 침전, 고체 상(phase) 추출, 면역-친화 추출 등)할 수 있다. 가능하게는, 연구될 GLP-2 유사체와 유사한 내부 표준을 사용한 반응의 보정 후에, 샘플 중에 존재하는 GLP-2 유사체의 농도를 상기 외부 표준 곡선으로부터 수득된 반응으로부터 유도한다.
특이적 항체의 생성
GLP 유사체 또는 이의 단편에 대한 특이적 항체를 포유동물에서 유도하여 혈청으로부터 정제할 수 있다. GLP 유사체 또는 단편은 토끼, 마우스 또는 다른 포유동물을 면역화시키기 위해 보강제(adjuvant)와 함께 직접 사용될 수 있거나, GLP 유사체 또는 이의 단편은 담체 분자(즉, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 오브알부민, 알부민 등)에 화학적으로 결합시켜 보강제와 함께 주사될 수 있다. 주사는 항체의 친화성 및 선택성을 개선하기 위해 연장된 기간 동안 2 내지 4주 간격으로 반복될 수 있다. 폴리클로날(polyclonal) 항체는 혈청으로부터 직접 수거될 수 있다. 모노클로날(monoclonal) 항체를 수득하기 위해, 면역화된 동물, 바람직하게는 마우스로부터 단리된 B 세포를 종양 세포와 융합시켜 항체 생성 하이브리도마(hybridoma)를 형성해야 한다. 적절한 클론 및 항체의 스크리닝 및 선별은 고정된 GLP-2 유사체 또는 이의 펩티드를 사용한 후 표지된 항-항체로 검출함으로써 수행될 수 있다. 별법으로, 상기 스크리닝 및 선별은 항체의 고정 후 표지된 GLP-2 유사체 또는 이의 단편을 사용한 검출을 기초로 할 수 있다. 모든 경우, 표지는 방사성 동위원소, 효소, 형광발색단 또는 바이오틴일 수 있고, 예를 들어, 상기 효소에 특이적인 기질(예컨대, 비색성, 형광성 또는 화학발광성 기질), 섬광 또는 효소에 결합된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있고, 그 후 이들은 전술한 바와 같이 검출될 수 있다.
GLP -2 유사체의 합성
고체 상 또는 액체 상 펩티드 합성을 이용하여 본 발명의 유사체를 합성하는 것이 바람직하다. 이와 관련하여, 국제특허출원 공개 제WO 98/11125호, 및 많은 다른 문헌들 중 문헌[Fields, GB et al., 2002, "Principles and practice of solid-phase peptide synthesis". In: Synthetic Peptides (2nd Edition)] 및 본원의 실시예를 참조한다.
따라서, GLP-2 유사체는 예를 들어,
(a) 고체 상 또는 액체 상 펩티드 합성을 이용하여 펩티드를 합성하고, 이로써 수득된 합성 펩티드를 회수하는 단계; 또는
(b) 펩티드가 천연 발생 아미노산으로 구성되는 경우, 숙주 세포에서 펩티드를 코딩하는 핵산 작제물(construct)을 발현시키고 숙주 세포 배양물로부터 발현 생성물을 회수하는 단계; 또는
(c) 펩티드가 천연 발생 아미노산으로 구성되는 경우, 펩티드를 코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관 내 발현을 수행하고 발현 생성물을 회수하는 단계; 또는
상기 (a), (b) 및 (c)의 단계를 조합하여 펩티드의 단편을 수득한 후 상기 단편을 결찰(ligation)시켜 펩티드를 수득하고 상기 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 비롯한 다수의 방법으로 합성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 유사체의 경우, 유전공학적 기법을 활용하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 경우는 펩티드가 충분히 크거나 (융합 작제물로서 생성된 경우) 및 펩티드가 살아있는 유기체 내에서 RNA로부터 번역될 수 있는 천연 발생 아미노산만을 포함하는 경우일 수 있다.
재조합 유전자 기술을 위해, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 단편이 중요한 화학적 생성물이다. 그러므로, 본 발명의 추가 양태는 본 발명의 GLP-2 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는데, 이때 펩티드는 바람직하게는 천연 발생 아미노산으로 구성된다. 본 발명의 핵산 단편은 DNA 또는 RNA 단편이다.
본 발명의 핵산 단편은 통상적으로 클로닝에 적합한 벡터 또는 본 발명의 핵산 단편을 보유하는 발현 벡터 내에 삽입될 것이고, 이러한 신규 벡터 또한 본 발명의 일부이다. 본 발명의 상기 벡터의 작제에 대한 상세한 설명은 하기 형질전환된 세포 또는 미생물에 관한 내용에서 논의될 것이다. 상기 벡터는 적용 목적 및 유형에 따라 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니(mini)-염색체 또는 바이러스의 형태일 수 있으나, 일부 세포에서 일시적으로만 발현되는 노출된(naked) DNA 역시 중요한 벡터이다. 본 발명의 바람직한 클로닝 및 발현 벡터(플라스미드 벡터)는 자가 복제할 수 있어서 고도 발현 또는 후속 클로닝을 위한 고도 복제를 위한 높은 카피 수(copy-number)를 부여할 수 있다.
본 발명의 벡터의 일반적인 윤곽은 5'→3' 방향 및 작동 가능한 결합으로 하기 특징들을 포함한다: 본 발명의 핵산 단편의 발현을 유도하기 위한 프로모터, 경우에 따라 (세포외 상, 또는 적용 가능한 경우, 원형질막 주위 공간 내로의) 분비를 가능하게 하는 선도 펩티드, 또는 다중 용도 예컨대, 조합 분비, 정제 태그, 및 펩티드를 교정하거나 폴리펩티드 단편을 막 내로 통합시키기 위한 효소적 트리밍( trimming)을 위한 선도 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 단편, 및 경우에 따라 종결신호를 코딩하는 핵산 서열. 생산자 균주 또는 세포주 내에서 발현 벡터를 사용하는 경우, 상기 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 것이 형질전환된 세포의 유전적 안정성을 위해 바람직하다.
본 발명의 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시켜 본 발명의 변형된 펩티드를 생성한다. 본 발명의 일부이기도 한 이러한 형질전환된 세포는 본 발명의 핵산 단편 및 벡터의 증식을 위해 사용되거나 본 발명의 펩티드의 재조합 제조에 사용되는 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다.
본 발명의 바람직한 형질전환된 세포는 미생물 예컨대, 박테리아[예컨대, 에스케리치아(Escherichia)(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 바실러스(Bacillus)(예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 살모넬라(Salmonella) 또는 마이코박테리움(Mycobacterium)(바람직하게는, 비-병원성 마이코박테리움, 예를 들어, 엠. 보비스(M. bovis) BCG) 종], 효모(예컨대, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 및 원충류(protozoans)이다. 별법으로, 형질전환된 세포는 다세포 유기체로부터 유래될 수 있고, 즉 형질전환된 세포는 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다. 또한, 인간으로부터 유래된 세포가 흥미로운데, 이에 대해서는 하기 세포주 및 벡터에 관한 논의 부분을 참조한다. 클로닝 및/또는 최적화된 발현을 위해, 형질전환된 세포가 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있는 것이 바람직하다. 핵산 단편을 발현하는 세포는 본 발명의 바람직한 유용한 실시양태이고, 상기 세포는 본 발명의 펩티드의 소규모 또는 대규모 제조를 위해 사용될 수 있다.
형질전환된 세포를 이용하여 본 발명의 펩티드를 생성하는 경우, 결코 필수적인 것은 아니지만 발현 생성물이 배양 배지 내로 배출되거나 형질전환된 세포의 표면 상에 보유되는 것이 편리하다. 효과적인 생성자 세포가 확인된 경우, 이를 기초로 하여, 본 발명의 벡터를 보유하며 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 단편을 발현하는 안정한 세포주를 확립하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이 안정한 세포주는 본 발명의 펩티드를 분비하거나 보유하여, 이의 정제를 용이하게 한다.
일반적으로, 숙주 세포에 적합한 종으로부터 유래된 복제단위(replicon) 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터가 숙주와 관련하여 사용된다. 통상적으로, 상기 벡터는 형질전환된 세포에서 표현형적 선별을 제공할 수 있는 표지(marking) 서열 뿐만 아니라 복제 부위 또한 보유한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322(그러나, 다수의 다른 유용한 플라스미드가 존재함)를 사용하여 형질전환시킨다[예를 들어, 문헌(Bolivar et al., 1977)을 참조한다]. pBR322 플라스미드는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 보유하여 형질전환된 세포를 확인하기에 용이한 수단을 제공한다. 또한, pBR 플라스미드, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 파지는 원핵 미생물에 의해 사용될 수 있는 발현용 프로모터를 포함해야 하거나 포함하도록 변형되어야 한다.
원핵생물의 재조합 DNA 작제에 가장 흔하게 사용되는 이들 프로모터들은 β-락타메이즈(lactamase)(페니실리나제(penicillinase)), 락토스 프로모터 시스템(Chang et al., 1978; ltakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel et al., 1979; 유럽특허 제0 036 776호 A)을 포함한다. 이들이 가장 흔하게 사용되지만, 다른 미생물 유래의 프로모터가 발견되어 사용되고 있고, 이들의 뉴클레오티드 서열에 대한 상세한 설명은 공개되어 있어 당업자가 이들을 플라스미드 벡터에 기능적으로 결찰시킬 수 있다(Siebwenlist et al., 1980). 원핵생물 이외에, 진핵 미생물 예컨대, 효모 배양물도 사용될 수 있고, 이 경우에도 프로모터가 발현을 유도할 수 있어야 한다. 사카로마이세스 세레비지애, 또는 다른 흔한 제빵 효모는 다수의 다른 균주가 통상적으로 사용될 수 있다 하더라도 진핵 미생물들 중에서 가장 흔하게 사용된다. 사카로마이세스에서 발현시키는 경우, 예를 들어, 플라스미드 YRp7이 통상적으로 사용된다(Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). 이 플라스미드는 트립토판의 존재 하에 증식하는 능력이 없는 돌연변이 효모 균주 예를 들어, ATCC 제44076호 또는 PEP4-1(Jones, 1977)에 대한 선별 마커를 제공하는 trp1 유전자를 이미 함유한다. 따라서, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서의 trp1 부위의 존재는 트립토판의 부재 하의 증식에 의한 형질전환을 검출하기에 효과적인 환경을 제공한다.
효모 벡터 내의 적절한 프로모터 서열에는 3-포스포글리세레이트 키나제(phosphoglycerate kinase)(Hitzman et al., 1980) 또는 다른 해당효소(Hess et al., 1968; Holland et al., 1978) 예컨대, 에놀라제(enolase), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터들이 포함된다. 또한, 적절한 발현 플라스미드의 작제에 있어서, 이들 유전자들과 관련된 말단 서열들을 발현될 소정의 서열의 발현 벡터 3'에 결찰시켜 mRNA의 폴리아데닐화 및 종결을 제공한다.
증식 조건에 의해 조절되는 전사의 부가적 이점을 가진 다른 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 상기 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 적합성 프로모터, 복제 기점 및 말단 서열을 함유하는 임의의 플라스미드 벡터가 적합하다.
미생물 이외에, 다세포 유기체로부터 유래된 세포의 배양물을 숙주로서 사용할 수도 있다. 원리적으로, 이러한 세포 배양물들 중 임의의 배양물은 척추동물 배양물로부터 유래된 것이든 아니면 무척추동물 배양물로부터 유래된 것이든 사용 가능하다. 그러나, 척추동물 세포가 가장 흥미롭고, 배양물(조직 배양물) 중에서의 척추동물 세포의 증식은 최근 통상적으로 이용되는 기법이 되었다(Tissue Culture, 1973). 이러한 유용한 숙주 세포주의 예는 VERO 및 HeLa 세포, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포주, 및 W138, BHK, COS-7 293, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(SF) 세포[프로테인 사이언스(Protein Sciences; 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A.) 및 인비트로겐(Invitrogen; PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The Netherlands)으로부터 완전한 발현 시스템으로서 시판됨], 인비트로겐으로부터 시판되는 디. 멜라노가스터(D. melanogaster) 세포주 S2, 및 MDCK 세포주이다.
이러한 세포를 위한 발현 벡터는 통상적으로 (필요한 경우) 복제 기점; 임의의 필요한 리보좀 결합 부위와 함께, 발현될 유전자의 앞 부분에 위치된 프로모터; RNA 스플라이스 부위; 폴리아데닐화 부위; 및 전사 종결신호 서열을 포함한다.
포유동물 세포에서 사용하기 위해, 발현 벡터에 대한 조절 기능도 종종 바이러스 물질에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스 2, 및 가장 흔하게는 원숭이 바이러스 40(SV40)으로부터 유래된 것이다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터가 특히 유용한데, 이는 이들 둘 다가 복제의 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 단편으로서 바이러스로부터 용이하게 수득되기 때문이다(Fiers et al., 1978). 보다 작거나 보다 큰 SV40 단편 역시 사용될 수 있되, HindIII 부위부터 바이러스 복제 기점에 위치된 BgII 부위를 향해 연장되어 있는 대략 250 bp 서열을 포함해야 한다. 추가로, 원하는 유전자 서열과 일반적으로 관련되어 있는 프로모터 또는 조절 서열을 사용할 수도 있고 상기 조절 서열의 사용이 종종 바람직할 수 있되, 상기 조절 서열은 숙주 세포 시스템에 적합해야 한다.
복제 기점은 외인성 기점, 예를 들어, SV40 또는 다른 바이러스(예컨대, 폴리오마, 아데노, VSV, BPV)로부터 유래될 수 있는 외인성 기점을 포함하도록 벡터를 작제함으로써 제공될 수 있거나 숙주 세포 염색체 복제 기작에 의해 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 통합되는 경우, 종종 숙주 세포 염색체 복제 기작에 의한 복제 기점의 제공만으로도 충분하다.
재조합 제조 방법에서 만족스러운 수율을 얻기 위해, (정제의 용이성을 위한) 친화성 태그로서 작용할 수 있는 융합 파트너에 펩티드를 융합시키고/시키거나 펩티드의 많은 반복부(repeat)를 가짐으로써 본 발명의 유사체를 융합 단백질로서 제조하는 것이 유리할 수 있다. 이 방법은 펩티다제에 적합한 절단 부위의 존재를 필요로 하지만, 당업자는 기초가 되는 유전적 작제물을 알맞게 제작하는 방법을 알 것이다.
재조합 제조 후, 본 발명의 펩티드는 다단계 크로마토그래피(이온 교환, 크기 배제, 및 친화성 크로마토그래피 기법)를 비롯하여 당분야에 일반적으로 공지된 방법에 의해 정제될 수 있다.
별법으로, 천연 발생 아미노산으로 구성된 펩티드를 시험관 내 무세포 시스템에서 제조할 수 있다. 이는 펩티드가 잠정적 숙주 세포에 대해 독성을 나타낼 수 있는 경우 특히 적합하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 제조하기 위해 시험관 내 무세포 번역/발현의 사용 또한 예상한다. 이와 관련하여, 예를 들어, 암비온 인코포레이티드(Ambion Inc.; 2130 Woodward, Austin, TX 78744-1832, USA)로부터 시판되는 시험관 내 번역 키트, 재료 및 기술적 자료를 참조한다.
마지막으로, 물론 이용 가능한 방법들은 예를 들어, 반합성 유사체들을 제조할 수 있도록 조합될 수도 있다. 이러한 구성에 있어서, 2개 이상의 분리된 단계들 또는 방법들을 이용하여 펩티드 단편을 제조한 후, 단편들을 결찰시켜 최종 펩티드 생성물을 수득한다.
약학적 조성물 및 투여
본 발명의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체는 치료 유효량의 본 발명의 GLP-2 펩티드, 또는 이의 염 또는 유도체를 약학적으로 허용되는 담체 중에 포함하는, 저장용 또는 투여용으로 제조된 약학 조성물로서 제형화될 수 있다.
치료 유효량의 본 발명의 화합물은 투여 경로, 치료될 포유동물의 유형, 및 고려되는 특정 포유동물의 신체적 특징에 달려 있을 것이다. 이들 인자들, 및 이들과 상기 양의 결정 사이의 관계는 의학 분야의 숙련된 기술자에게 잘 공지되어 있다. 이 양 및 투여 방법은 펩티드를 대장까지 전달하기 위해 최적의 효능을 달성하도록 조정될 수 있지만, 체중, 식사, 병행 약물 치료, 및 의학 분야의 숙련된 자에게 잘 공지된 다른 인자들에 달려 있을 것이다.
GLP-2 유사체 또는 이의 염이 위 및 장 관련 장애의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 존재하는 약학 조성물을 제공하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.
산성 잔기를 가진 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 유기 염기 및 무기 염기를 사용하여 형성할 수 있다. 염기를 사용하여 형성한 적절한 염에는 금속 염, 예컨대, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어, 나트륨, 칼륨 또는 마그네슘 염; 암모니아 염 및 유기 아민 염, 예컨대, 모르폴린, 티오모르폴린, 피페리딘, 피롤리딘, 모노-저급 알킬아민, 디-저급 알킬아민 또는 트리-저급 알킬아민(예를 들어, 에틸-tert-부틸아민, 디에틸아민, 디이소프로필아민, 트리에틸아민, 트리부틸아민 또는 디메틸프로필아민), 또는 모노히드록시, 디히드록시, 트리히드록시 저급 알킬아민(예를 들어, 모노에탄올아민, 디에탄올아민 또는 트리에탄올아민)을 사용하여 형성한 염이 포함된다. 속염(internal salt) 또한 형성될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 화합물이 염기성 잔기를 함유하는 경우, 염은 유기 산 및 무기 산을 사용하여 형성할 수 있다. 예를 들어, 염은 하기 산으로부터 형성될 수 있다: 아세트산, 프로피온산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 석신산, 푸마르산, 말레산, 말론산, 맨델산, 말산, 프탈산, 염산, 브롬화수소산, 인산, 질산, 황산, 메탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산 및 캄포르설폰산 뿐만 아니라 다른 공지된 약학적으로 허용되는 산. 아미노산 부가염 또한 아미노산 예컨대, 라이신, 글리신 또는 페닐알라닌을 사용하여 형성할 수 있다.
의학 분야에서 숙련된 자에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 펩티드 또는 약학 조성물의 "치료 유효량"은 연령, 체중 및 치료되는 포유동물 종, 사용되는 구체적인 화합물, 구체적인 투여 방식, 및 원하는 효과 및 치료 징후에 따라 다를 것이다. 이들 인자들, 및 이들과 상기 양의 결정 사이의 관계가 의학 분야에서 잘 공지되어 있기 때문에, 치료적으로 유효한 투여 수준 즉, 본원에 기재된 장 및 위 관련 질환 뿐만 아니라 본원에 개시된 다른 의학적 징후의 예방 및/또는 치료라는 원하는 결과를 달성하기에 필요한 양의 결정은 당업자의 능력 내에 있을 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 유효량"은 소정의 증상 또는 병태의 징후를 경감시키는 양, 바람직하게는 상기 증상 또는 병태를 가진 개체에서 생리학적 반응을 정상화하는 양이다. 징후의 경감 또는 생리학적 반응의 정상화는 당분야에서 통상적으로 이용되는 방법을 이용하여 측정될 수 있고 소정의 증상 또는 병태에 따라 다를 수 있다. 한 양태에서, 치료 유효량의 하나 이상의 GLP-2 유사체, 또는 이 하나 이상의 GLP-2 유사체를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량은 측정 가능한 생리학적 매개변수를 증상 또는 병태가 없는 개체에서의 매개변수와 실질적으로 동일한 값(바람직하게는, 상기 값의 + 30% 이내, 보다 바람직하게는 상기 값의 + 20% 이내, 더욱 더 바람직하게는 상기 값의 10% 이내)으로 회복시키는 양이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물의 투여는 관련 의학적 징후 예컨대, 소장 및 위 관련 질환의 원하는 예방/치료 효과가 달성될 때까지 투약 수준을 증가시키면서 보다 낮은 투약 수준에서 시작한다. 이는 치료 유효량을 정의할 것이다. 단독으로 또는 약학 조성물의 일부로서의 본 발명의 펩티드의 경우, 상기 투여량은 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 100 mg, 예컨대, 약 0.01 내지 10 mg, 예를 들어, 10 내지 100 ㎍일 수 있다.
치료 용도의 경우, 선택된 GLP-2 유사체는 약학적으로 허용 가능하며 선택된 투여 경로에 의해 펩티드를 전달하기에 적합한 담체를 사용하여 제형화한다. 본 발명을 위해, 말초 비경구 경로는 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여 경로를 포함한다. 본 발명에 사용되는 일부 화합물은 경구, 직장, 비강 또는 하부 호흡 경로에 의해 투여될 수도 있다. 이들이 소위 비경구 경로이다. 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 적절한 약학적으로 허용되는 담체는 펩티드계 약물과 함께 통상적으로 사용되는 담체, 예컨대, 희석제, 부형제 등이다. 치료 용도를 위한 약학적으로 허용되는 담체는 약학 분야에서 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 약산성 또는 생리학적 pH를 가진 멸균 식염수 및 인산염 완충 식염수를 사용할 수 있다. pH 완충제는 인산염, 시트르산염, 아세트산염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(TRIS), N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판설폰산(TAPS), 중탄산암모늄, 디에탄올아민, 바람직한 완충제인 히스티딘, 아르기닌, 라이신 또는 아세트산염, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직한 완충제 범위는 pH 4 내지 8, pH 6.5 내지 8, 보다 바람직하게는 pH 7 내지 7.5이다. 보존제 예컨대, 파라-크레졸, 메타-크레졸, 오르토-크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 페놀, 벤질 알콜, 벤조산나트륨, 벤조산, 벤질-벤조에이트, 소르브산, 프로파노산 또는 p-히드록시벤조산의 에스테르를 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 산화, 탈아미드화, 이성질체화, 라세미체화, 고리화 또는 펩티드 가수분해를 방지하는 안정화제 예컨대, 아스코르브산, 메티오닌, 트립토판, EDTA, 아스파라긴, 라이신, 아르기닌, 글루타민 및 글리신을 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 응집, 섬유화(fibrillation) 또는 침전을 방지하는 안정화제 예컨대, 소듐 도데실 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸 셀룰로스 또는 시클로덱스트린을 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 가용화 또는 응집의 방지를 위한 유기 개질제 예컨대, 에탄올, 아세트산 또는 아세테이트 및 이의 염을 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 염과 같은 등장성 마커 예컨대, 염화나트륨 또는 가장 바람직한 탄수화물, 예를 들어, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 슈크로스 또는 이들의 혼합물을 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다.
세제 예컨대, 트윈(Tween) 20, 트윈 80, SDS, 폴록사머(Poloxamer) 예를 들어, 플루로닉(Pluronic) F-68, 플루로닉 F-127을 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 안료 및 심지어 방향제를 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, GLP-2 펩티드 유사체의 약학적으로 허용되는 산 부가염이 제공된다. 현탁화제를 사용할 수 있다.
유기 개질제 예컨대, 에탄올, 3급-부탄올, 2-프로판올, 에탄올, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜을 동결건조된 생성물의 동결건조를 위해 약학 제형 중에 함유시킬 수 있다. 팽화제(bulking agent) 및 염과 같은 등장성 마커 예컨대, 염화나트륨, 탄수화물 예를 들어, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 수크로즈 또는 이들의 혼합물, 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루타메이트 또는 부형제 예컨대, 시스테인, 레시틴 또는 인간 혈청 알부민, 또는 이들의 혼합물을 동결건조용 약학 조성물 중에 함유시킬 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 투여를 위한 정제, 캡슐제 또는 엘릭시르; 직장 투여를 위한 좌약제; 주사 투여를 위한 바람직하게는 멸균된 용액 또는 멸균된 산제 또는 현탁액 등으로서 제형화되어 사용될 수 있다. 투여량 및 투여 방법은 최적 효능을 달성하도록 조정될 수 있으나, 체중, 식사, 병행 약물 치료, 및 의학 분야의 숙련된 자에게 인식될 다른 인자들과 같은 인자들에 달려 있을 것이다.
예를 들어, 1일 기준으로 정맥내 또는 피하 투여와 같은 비경구 투여의 경우, 주사 가능한 약학 조성물은 수용액 또는 수성 현탁액으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있거나, 사용 직전에 재구성하기에 적합하거나 주사 전에 액체 중에 현탁시키기에 적합한 동결건조된 고체 형태로 제조될 수 있거나, 에멀젼으로서 제조될 수 있다.
동결건조된 생성물의 재구성을 위한 희석제는 상기 리스트로부터의 적절한 완충제, 물, 식염수, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 수크로즈, 레시틴, 알부민, 소듐 글루타메이트 또는 시스테인 히드로클로라이드일 수 있거나; 세제 예컨대, 트윈 20, 트윈 80, 폴록사머 예를 들어, 플루로닉 F-68 또는 플루로닉 F-127, 폴리에틸렌 글리콜이 첨가된 주사용수, 및/또는 보존제 예컨대, 파라-크레졸, 메타-크레졸, 오르토-크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 페놀, 벤질 알콜, 벤조산나트륨, 벤조산, 벤질-벤조에이트, 소르브산, 프로파노산, p-히드록시벤조산의 에스테르가 첨가된 주사용수, 및/또는 유기 개질제 예컨대, 에탄올, 아시트산(acitic acid), 시트르산, 락트산 또는 이들의 염이 첨가된 주사용수일 수 있다.
또한, 원하는 경우, 주사 가능한 약학 조성물은 소량의 무독성 보조제 예컨대, 습윤제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 흡수 증강 제제(예를 들어, 리포좀, 세제 및 유기산)가 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 화합물은 예를 들어, 전체 비경구 영양 요법을 받는 환자(예를 들어, 신생아, 또는 악액질 또는 식욕부진을 앓는 환자)를 위한 액상 영양 보충제로서 사용되는 경우 주입에 의한 투여, 또는 예를 들어, 피하, 복강내 또는 정맥내 주사에 의한 투여를 위해 제형화되므로, 경우에 따라 생리학적으로 허용 가능한 pH 예컨대, 약산성 또는 생리학적 pH까지 완충된, 멸균된 발열물질 무함유 형태의 수용액으로서 사용된다. 근육내 투여를 위한 제형은 식물유, 예를 들어, 캐놀라유, 옥수수유 또는 대두유 중의 용액 또는 현탁액을 기초로 한 것일 수 있다. 이들 오일계 제형은 항산화제 예컨대, BHA(부틸화된 히드록시아니솔(hydroxianisole) 및 BHT(부틸화된 히드록시톨루엔)에 의해 안정화될 수 있다.
따라서, 본 발명의 펩티드 화합물은 증류수와 같은 비히클 또는 식염수, 인산염 완충 식염수, 5% 덱스트로스 용액 또는 오일 중의 화합물로서 투여될 수 있다. GLP-2 유사체의 가용성은 원하는 경우 가용성 증강제 예컨대, 세제 및 유화제를 혼입시킴으로써 증강시킬 수 있다.
주사 가능한 물질로서 사용하기 위해, 수성 담체 또는 비히클은 원하는 작용 부위로 GLP-2 유도체를 서방출하기 위해 주사 부위 또는 주사 부위 근처에서 GLP-2 유사체를 침착(depot)시키는 데 기여하는 소정량의 젤라틴으로 보충될 수 있다. 대안으로 사용 가능한 겔화제(gelling agent) 예컨대, 히알루론산(hyaluronic acid) 또한 침착제(depot agent)로서 유용할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제형은 a. 최종 농도가 0.5 내지 300 mM, 바람직하게는 3 내지 200 mM, 가장 바람직하게는 20 내지 100 mM이 되도록 물에 용해된 L-히스티딘; b. 350 mM 이하, 바람직하게는 30 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 100 내지 230 mM의 만니톨; 및 c. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.05 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 0.5 내지 50 mM의 아세트산을 용액 중에 포함한다. 적정량의 치료 화합물을 최종 농도가 1 내지 100 mg/㎖, 바람직하게는 5 내지 50 mg/㎖, 가장 바람직하게는 10 내지 30 mg/㎖가 되도록 첨가한다. pH는 최종 pH가 4 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 6.7 내지 7.3이 되도록 조정한다. 생성된 용액은 목적 중량으로 조정하고, 멸균 여과하고, 적절하게 분취하여 약학적 용도를 위한 바이알 내에 분배한다. 제형은 액상 제품 또는 동결건조된 제품에 따라 더 가공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제형은 a. 최종 농도가 0.5 내지 300 mM, 바람직하게는 3 내지 200 mM, 가장 바람직하게는 20 내지 100 mM이 되도록 물에 용해된 L-히스티딘; b. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.5 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 5 내지 50 mM의 L-아르기닌; c. 350 mM 이하, 바람직하게는 30 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 100 내지 230 mM의 만니톨; 및 d. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.05 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 0.5 내지 50 mM의 아세트산을 용액 중에 포함한다. 적정량의 치료 화합물을 최종 농도가 1 내지 100 mg/㎖, 바람직하게는 5 내지 50 mg/㎖, 가장 바람직하게는 10 내지 30 mg/㎖가 되도록 첨가한다. pH는 최종 pH가 4 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 6.7 내지 7.3이 되도록 조정한다. 생성된 용액은 목표 중량으로 조정하고, 멸균 여과하고, 적절하게 분취하여 약학적 용도를 위한 바이알 내에 분배한다. 제형은 액상 제품 또는 동결건조된 제품에 따라 더 가공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제형은 a. 최종 농도가 200 mM 이하, 바람직하게는 3 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 5 내지 50 mM이 되도록 물에 용해된 L-히스티딘; b. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.5 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 5 내지 50 mM의 L-아르기닌; c. 350 mM 이하, 바람직하게는 30 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 100 내지 230 mM의 만니톨; 및 d. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.05 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 0.5 내지 50 mM의 아세트산을 용액 중에 포함한다. 적정량의 치료 화합물을 농도가 1 내지 100 mg/㎖, 바람직하게는 5 내지 50 mg/㎖, 가장 바람직하게는 10 내지 30 mg/㎖가 되도록 첨가한다. pH는 최종 pH가 4 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 6.7 내지 7.3이 되도록 조정한다. 생성된 용액은 목표 중량으로 조정하고, 멸균 여과하고, 적절하게 분취하여 약학적 용도를 위한 바이알 내에 분배한다. 제형은 액상 제품 또는 동결건조된 제품에 따라 더 가공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제형은 a. 최종 농도가 0.5 내지 300 mM, 바람직하게는 3 내지 200 mM, 가장 바람직하게는 20 내지 100 mM이 되도록 물에 용해된 L-히스티딘; b. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.5 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 5 내지 50 mM의 L-아르기닌; c. 350 mM 이하, 바람직하게는 30 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 100 내지 230 mM의 만니톨; 및 d. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.05 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 0.5 내지 50 mM의 아세트산을 용액 중에 포함한다. 적정량의 치료 화합물을 농도가 1 내지 100 mg/㎖, 바람직하게는 5 내지 50 mg/㎖, 가장 바람직하게는 10 내지 30 mg/㎖가 되도록 첨가한다. pH는 최종 pH가 4 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 6.7 내지 7.3이 되도록 조정한다. 생성된 용액은 목표 중량으로 조정하고, 멸균 여과하고, 적절하게 분취하여 약학적 용도를 위한 바이알 내에 분배한다. 제형은 액상 제품 또는 동결건조된 제품에 따라 더 가공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제형은 a. 최종 농도가 200 mM 이하, 바람직하게는 3 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 5 내지 50 mM이 되도록 물에 용해된 L-히스티딘; b. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.5 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 5 내지 50 mM의 L-아르기닌; c. 350 mM 이하, 바람직하게는 30 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 100 내지 230 mM의 만니톨; 및 d. 200 mM 이하, 바람직하게는 0.05 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 0.5 내지 50 mM의 아세트산을 용액 중에 포함한다. 적정량의 치료 화합물을 농도가 1 내지 100 mg/㎖, 바람직하게는 5 내지 50 mg/㎖, 가장 바람직하게는 10 내지 30 mg/㎖가 되도록 첨가한다. pH는 최종 pH가 4 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 6.7 내지 7.3이 되도록 조정한다. 생성된 용액은 목표 중량으로 조정하고, 멸균 여과하고, 적절하게 분취하여 약학적 용도를 위한 바이알 내에 분배한다. 제형은 액상 제품 또는 동결건조된 제품에 따라 더 가공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제형은 a. 최종 농도가 200 mM 이하, 바람직하게는 0.5 내지 100 mM, 가장 바람직하게는 5 내지 50 mM이 되도록 물에 용해된 N-아세테이트; 및 b. 350 mM 이하, 바람직하게는 30 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 100 내지 230 mM의 만니톨을 포함한다. 적정량의 치료 화합물을 농도가 1 내지 100 mg/㎖, 바람직하게는 5 내지 50 mg/㎖, 가장 바람직하게는 10 내지 30 mg/㎖가 되도록 첨가한다. pH는 최종 pH가 4 내지 8, 바람직하게는 6.5 내지 7.5, 가장 바람직하게는 6.7 내지 7.3이 되도록 조정한다. 생성된 용액은 목표 중량으로 조정하고, 멸균 여과하고, 적절하게 분취하여 약학적 용도를 위한 바이알 내에 분배한다. 제형은 액상 제품 또는 동결건조된 제품에 따라 더 가공한다.
본 발명의 GLP-2 유사체는 GLP-2 펩티드 유사체의 연장 방출 및 지속 방출을 위한 서방출 이식 장치(device)로서 제형화될 수도 있다. 이러한 지속 방출 제형은 신체의 외부에 배치되는 패치 형태일 수 있다. 지속 방출 제형의 예에는 생체적합성 중합체의 복합물 예컨대, 폴리(락트산), 폴리(락트산-공-글리콜산), 메틸셀룰로스, 히알루론산, 시알산, 실리케이트, 콜라겐, 리포좀 등이 포함된다. 지속 방출 제형은 높은 국소 농도의 본 발명의 GLP-2 유사체를 제공하는 것이 바람직할 때 특히 관심의 대상이 될 수 있다.
GLP-2 유사체는 단위 투여량 또는 다회 투여량으로 장친화적(intestinotrophic) 양의 펩티드를 함유하는 멸균 충전 바이알 또는 앰플의 형태로 사용될 수 있다. 투여 준비 제형으로서의 상기 바이알 또는 앰플은 GLP-2 유사체 및 소정의 담체를 함유할 수 있다. 별법으로, 상기 바이알 또는 앰플은 멸균수 또는 인산염 완충 식염수와 같은 적절한 담체 중에 재구성하기에 적합한 동결건조된 형태와 같은 형태로 GLP-2 펩티드를 함유할 수 있다.
주사 가능한 제형에 대한 대안으로서, GLP-2 유사체는 다른 경로에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다. 경구 투약 제형 예컨대, 정제, 캡슐제 등을 표준 약학적 관행에 따라 제형화할 수 있다. 본 발명에 따라, GLP-2 유사체는 소장 조직의 성장으로부터 유리한 효과를 얻을 개체를 치료하기 위해 투여된다.
비강 투약 제형은 키토산 또는 세제, 예를 들어, 트윈 20, 트윈 80, 폴록사머 예를 들어, 플루로닉 F-68, 플루로닉 F-127, Brij 35, Brij 72, 크레모포어(cremophor) EL과 같은 증강제를 첨가하여 제형화할 수 있다.
본 발명의 펩티드 화합물은 단독으로 사용될 수 있거나, 소염 효과를 가진 화합물과 조합 사용될 수 있다. 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, 이러한 조합 치료는 본 발명의 펩티드 유사체의 유리한 치료 효과를 강화시킬 수 있는 것으로 기대된다.
물론, 환자 치료에 가장 적합한 치료적 투약 및 섭생법은 치료될 질환 또는 증상, 환자의 체중 및 다른 매개변수에 따라 다를 것이다. 임의의 특정한 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, ㎍/kg 범위 내의 투여량, 및 보다 짧거나 보다 긴 치료 기간 또는 치료 빈도는 치료적으로 유용한 결과 예컨대, 특히 소장 질량에서의 통계적으로 유의한 증가를 나타낼 수 있다고 기대된다. 일부 경우, 치료적 섭생법은 초기 치료의 중단 후 일어나는 조직 복귀(regression)를 예방하기에 적합한 유지 투여량의 투여를 포함할 수 있다. 인간에게 사용하기에 가장 적당한 투여량 및 투약 섭생법은 본 발명에 의해 수득된 결과에 의해 좌우되며, 적절하게 디자인된 임상 시험에서 확인될 수 있다.
효과적인 투여량 및 치료 프로토콜은 실험실 동물에서 낮은 투여량으로 시작된 후 효과를 모니터링하면서 투여량을 증기시키고 투약 섭생법 역시 체계적으로 변화시키는 통상의 수단에 의해 결정될 수 있다. 소정의 대상 객체에 대한 최적 투여량을 결정할 때 임상의는 많은 인자들을 고려할 수 있다. 이러한 고려는 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따른 GLP-2 펩티드의 인간 투여량은 한 실시양태에서 체중 1 kg 당 하루에 약 10 ㎍ 내지 약 10 mg, 바람직하게는 약 50 ㎍ 내지 약 5 mg, 가장 바람직하게는 약 100 ㎍ 내지 1 mg일 수 있다.
의학적 증상
본 발명의 펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 유효량의 GLP-2 유사체 또는 이의 염을 투여함으로써 식도의 상부 위장관을 비롯한 위-장 장애를 앓는 개체를 예방하거나 치료하기 위한 약제로서 유용하다. 위 및 장 관련 장애에는 임의의 병인에 의한 궤양(예를 들어, 소화성 궤양, 약물 유도 궤양, 감염 또는 다른 병원체와 관련된 궤양), 소화 장애, 흡수장애 증후군, 단장 증후군, 맹관 증후군, 염증성 장 질환, (예를 들어, 글루텐에 의해 유도된 장병증 또는 만성소화장애증으로부터 발병된) 비열대성 스프루우, 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증성 스프루우, 장염, 궤양성 결장염, 소장 손상 및 화학요법에 의해 유도된 설사/점막염(CID)이 포함된다.
일반적으로 전술된 바와 같이, 증가된 소장 질량 및 이의 필연적 결과, 및/또는 정상적인 소장 점막 구조 및 기능의 유지로부터 유리한 효과를 얻는 개체가 본 발명의 GLP-2 유사체를 사용한 치료에 대한 후보이다. GLP-2 유사체로 치료될 수 있는 구체적인 증상에는 열에 의한 알파-글리아딘(gliadin)에 대한 독성 반응으로부터 야기되며 글루텐 유도 장병증 또는 만성소화장애증의 결과일 수 있고 소장의 융모의 상당한 손실에 의해 표시되는 비열대성 스프루우; 감염으로부터 초래되며 융모의 부분적 평평화에 의해 표시되는 열대성 스프루우; 흔한 가변성 면역결핍증 또는 저감마글로불린혈증을 앓는 환자에서 공통적으로 관찰되며 융모 높이에서의 상당한 감소에 의해 표시되는 저감마글로불린혈증성 스프루우를 비롯한 다양한 형태의 스프루우가 포함된다. GLP-2 유사체 치료의 치료적 효능은 융모 형태를 조사하기 위한 장 생검, 영양분 흡수의 생화학적 평가, 환자 체중 증가, 또는 이들 증상들과 관련된 징후의 개선에 의해 모니터링될 수 있다.
본 발명의 GLP-2 유사체로 치료될 수 있거나 GLP-2 유사체가 예방적으로 유용할 수 있는 다른 증상에는 상기 증상 이외에 방사선 장염, 감염성 또는 감염 후 장염, 및 암 화학요법제 또는 독성 물질로 인한 소장 손상이 포함된다.
GLP-2 유사체는 영양실조 예를 들어, 악액질 및 식욕부진의 치료를 위해 사용될 수도 있다.
본 발명의 특정한 실시양태에는 장 손상 및 기능장애의 예방 및/또는 치료를 위한 본 발명의 펩티드의 사용에 관한 것이다. 이러한 손상 및 기능장애는 암 화학요법 치료의 잘 공지된 부작용이다. 화학요법 투여는 위장 시스템과 관련된 원치않는 부작용 예를 들어, 점막염, 설사, 박테리아 전위, 흡수장애, 복부 경련, 위장 출혈 및 구토와 종종 관련된다. 이러한 부작용은 장 상피의 구조적 및 기능적 손상의 임상적 결과이고 종종 화학요법의 투여량 및 빈도를 감소시킬 필요가 있게 한다. 본 발명의 GLP-2 펩티드 작용제의 투여는 장의 장샘에서 영향(trophic) 효과를 상승시킬 수 있고 화학요법 후 손상된 장 상피를 대체하는 신생 세포를 신속히 제공할 수 있다. 본 발명의 펩티드의 투여에 의해 달성되는 궁극적 목표는 암 치료를 위한 가장 최적의 화학요법적 섭생법을 제공하면서 화학요법 치료를 받는 환자의 위장 손상과 관련된 사망률을 감소시키는 것이다. 부수적인 예방적 또는 치료적 치료가 방사선 요법을 받거나 방사선 요법을 막 시작하려는 환자에게 본 발명에 따라 제공될 수 있다.
소장 점막의 줄기세포는 이의 빠른 증식 속도로 인해 화학요법의 세포독성 효과에 특히 민감하다(Keefe et al., Gut 2000; 47: 632-7). 화학요법에 의해 유도된 소장 점막에의 손상은 종종 임상적으로 위장 점막염으로 지칭되며 소장의 흡수 및 차단 손상을 특징으로 한다. 예를 들면, 광범위하게 사용되는 화학요법제인 5-FU, 이리노테칸(irinotecan) 및 메토트렉세이트(methothrexate)는 설치류의 소장에서 융모 위축증 및 장샘 증식증을 초래하는 아폽토시스를 증가시키는 것으로 밝혀져 있다(Keefe et al., Gut 47: 632-7, 2000; Gibson et al., J Gastroenterol Hepatol. Sep;18(9): 1095-1100, 2003; Tamaki et al., J lnt Med Res. 31(1): 6-16, 2003). 화학요법제는 인간에서 투여 후 24시간이 되는 시점에서 장의 장샘에서 아폽토시스를 증가시킨 후, 화학요법 후 3일이 되는 시점에서 융모 면적, 장샘 길이, 장샘 당 유사분열의 수 및 장샘 높이를 감소시키는 것으로 밝혀져 있다(Keefe et al., Gut 2000; 47: 632-7). 따라서, 소장 내에서의 구조적 변화가 장의 기능장애 및 일부 경우 설사를 직접 야기한다.
암 화학요법 후의 위장 점막염은 이것이 점차 감퇴하더라도 일단 확립되면 본질적으로 치료 불가능한 증가하는 문제이다. 통상적으로 사용되는 세포증식억제성 항암 약물인 5-FU 및 이리노테칸을 사용하여 수행한 연구는 이들 약물을 사용하는 효과적인 화학요법이 소장의 구조적 완전성 및 기능에 우선적으로 영향을 주지만 결장은 상기 요법에 덜 민감하고 증가된 점액 형성으로 주로 반응한다(Gibson et al., J Gastroenterol Hepatol. Sep; 18(9): 1095-1100, 2003; Tamaki et al., J lnt Med Res. 31(1): 6-16, 2003).
본 발명의 신규 GLP-2 유사체는 위장 손상 및 화학요법제의 부작용의 예방 및/또는 치료에 있어서 유용할 수 있다. 이 잠재적으로 중요한 치료적 용도는 현재 사용되고 있는 하기 화학요법제들과 같은 화학요법제에 적용될 수 있으나, 이로 한정되지 않는다: 5-FU, 알트레타민(Altretamine), 블레오마이신(Bleomycin), 부설판(Busulfan), 카페시타빈(Capecitabine), 카르보플라틴(Carboplatin), 카르무스틴(Carmustine), 클로람부실(Chlorambucil), 시스플라틴(Cisplatin), 클라드리빈(Cladribine), 크리산타스파제(Crisantaspase), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 시타라빈(Cytarabine), 다카르바진(Dacarbazine), 닥티노마이신(Dactinomycin), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 에토포사이드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 히드록시카르바미드(Hydroxycarbamide), 이다루비신(Idarubicin), 이포스파미드(Ifosfamide), 이리노테칸(Irinotecan), 리포조말 독소루비신(Liposomal doxorubicin), 류코보린(Leucovorin), 로무스틴(Lomustine), 멜팔란(Melphalan), 머캡토퓨린(Mercaptopurine), 메스나(Mesna), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미토마이신(Mitomycin), 미톡산트론(Mitoxantrone), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 페메트렉세드(Pemetrexed), 펜토스타틴(Pentostatin), 프로카르바진(Procarbazine), 랄티트렉세드(Raltitrexed), 스트렙토조신(Streptozocin), 테가푸르-우라실(Tegafur-uracil), 테모졸로마이드(Temozolomide), 티오테파(Thiotepa), 티오구아닌/싸이오구아닌(Tioguanine/Thioguanine), 토포테칸(Topotecan), 트레오설판(Treosulfan), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 비노렐빈(Vinorelbine), 블레오마이신(Bleomycin), 부설판(Busulfan), 카페시타빈(Capecitabine), 카르보플라틴(Carboplatin), 카르무스틴(Carmustine), 클로람부실(Chlorambucil), 시스플라틴(Cisplatin), 클라드리빈(Cladribine), 크리산타스파제(Crisantaspase), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 시타라빈(Cytarabine), 다카르바진(Dacarbazine), 닥티노마이신(Dactinomycin), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 에토포사이드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 플루오로우라실(Fluorouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 히드록시카르바미드(Hydroxycarbamide), 이다루비신(Idarubicin), 이포스파미드(Ifosfamide), 이리노테칸(Irinotecan), 리포조말 독소루비신(Liposomal doxorubicin), 류코보린(Leucovorin), 로무스틴(Lomustine), 멜팔란(Melphalan), 머캡토퓨린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미토마이신(Mitomycin), 미톡산트론(Mitoxantrone), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 페메트렉세드(Pemetrexed), 펜토스타틴(Pentostatin), 프로카르바진(Procarbazine), 랄티트렉세드(Raltitrexed), 스트렙토조신(Streptozocin), 테가푸르-우라실(Tegafur-uracil), 테모졸로마이드(Temozolomide), 티오테파(Thiotepa), 티오구아닌/싸이오구아닌(Tioguanine/Thioguanine), 토포테칸(Topotecan), 트레오설판(Treosulfan), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine) 및 비노렐빈(Vinorelbine).
본 발명의 펩티드는 유효량의 GLP-2 유사체 또는 이의 염을 투여함으로써 신생아를 치료하는 방법에서 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 장 발달의 부족으로 인한 젖먹이 신생아에서의 합병증은 본 발명의 펩티드 작용제에 의해 극복될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 GLP-2 유사체 또는 이의 염을 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 증상의 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 상기 증상을 치료하는 방법을 기술한다. 이러한 질환에는 DPP-IV 효소가 과발현되는 증상이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 전술된 바와 같은 상기 GLP-2 유사체, 또는 이의 염 또는 유도체의 서방출을 일으키도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 유효량의 GLP-2 유사체 또는 이의 염을 투여함으로써 신생아를 치료하는 방법에서 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 장 발달의 부족으로 인한 젖먹이 신생아에서의 합병증은 본 발명의 펩티드 작용제에 의해 극복될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 GLP-2 유사체 또는 이의 염을 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 증상의 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 상기 증상을 치료하는 방법을 기술한다. 이러한 질환에는 DPP-IV 효소가 과발현되는 증상이 포함된다.
도 1: C57BL 마우스에서 소장(SI) 질량에 대한 4가지 소장 선택적 화합물(화합물 번호 1846, 1855, 1848 및 1858)의 전체 투여-반응 데이타의 예. 화합물은 하기 투여량으로 3일 동안 1일 2회 피하 투여함으로써 투여하였다: 0(비히클), 5, 15, 45, 135, 405 nmol/kg(n = 6/투여군). 각각의 투여량 수준에서의 반응은 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2로 처리된 쌍-처리 마우스에서 동일한 투여량 수준에서 얻은 반응과 비교하였다. 체중(BW)의 변화를 보정하기 위해, SI 질량을 BW에 비하여 상대적으로 표현하고(SI-BW 비), 각각의 투여량 수준에서의 성장 반응을 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2에서 관찰된 반응으로 표준화하였다. 결과는 소장 선택적 화합물 1846, 1855, 1848 및 1858의 투여-반응 관계가 투여량 범위 5 내지 405 nmol/kg 내에서 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2와 유의하게 상이하며(2원 ANOVA에서 p<0.05), 상기 4가지 화합물 모두가 [Gly2]GLP-2보다 유의하게 더 높은 최대 반응을 보이면서 소장 성장을 자극한다는 것을 입증하였다. 값은 평균 ± SEM이다. *: [Gly2]GLP-2의 등몰 투여량에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 2: 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2에 비하여 상대적으로 마우스에서의 소장(SI) 대 결장 감수성 지수에 대한 4가지 소장 선택적 화합물(화합물 번호 1846, 1855, 1848 및 1858)의 전체 투여-반응 데이타의 예. 화합물은 하기 투여량으로 3일 동안 C57BL 마우스에게 1일 2회 피하 투여함으로써 투여하였다: 0(비히클), 5, 15, 45, 135, 405 nmol/kg(n = 6/투여군). 각각의 투여량 수준에서의 반응은 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2로 처리된 쌍-처리 마우스에서 동일한 투여량 수준에서 얻은 반응과 비교하였다. SI 결장 감수성 지수는 결장 질량에 비하여 상대적인 SI 질량으로서 계산하였고, 각각의 투여량 수준에서의 상기 감수성 지수는 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2에서 관찰된 반응으로 표준화하였다. 결과는 소장 선택적 화합물 1857 및 1820의 투여-반응 관계가 투여량 범위 5 내지 405 nmol/kg 내에서 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2와 유의하게 상이하며(2원 ANOVA에서 p<0.05), 화합물 1846, 1855 및 1848이 [Gly2]GLP-2에 비하여 상대적으로 증가된 최대 소장 감수성을 나타낸다는 것을 입증하였다. 값은 평균 ± SEM이다. *: [Gly2]GLP-2의 등몰 투여량에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 3: C57BL 마우스에서 소장(SI) 질량에 대한 2가지 소장 선택적 화합물(화합물 번호 1857, 1849 및 1820)의 전체 투여-반응 데이타의 예. 화합물은 하기 투여량으로 3일 동안 1일 2회 피하 투여함으로써 투여하였다: 0(비히클), 5, 15, 45, 135, 405 nmol/kg(n = 6/투여군). 각각의 투여량 수준에서의 반응은 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2로 처리된 쌍-처리 마우스에서 동일한 투여량 수준에서 얻은 반응과 비교하였다. 체중(BW)의 변화를 보정하기 위해, SI 질량을 BW에 비하여 상대적으로 표현하고(SI-BW 비), 각각의 투여량 수준에서의 성장 반응을 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2에서 관찰된 반응으로 표준화하였다. 결과는 소장 선택적 화합물 1857, 1849 및 1820의 투여-반응 관계가 투여량 범위 5 내지 405 nmol/kg 내에서 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2와 유의하게 상이하며(2원 ANOVA에서 p<0.05), 상기 양 화합물 모두가 [Gly2]GLP-2보다 유의하게 더 높은 최대 반응을 보이면서 소장 성장을 자극한다는 것을 입증하였다. 값은 평균 ± SEM이다. *: [Gly2]GLP-2의 등몰 투여량에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 4: 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2에 비하여 상대적으로 마우스에서의 소장(SI) 대 결장 감수성 지수에 대한 3가지 소장 선택적 화합물(화합물 번호 1857, 1820 및 1849)의 전체 투여-반응 데이타의 예. 화합물은 하기 투여량으로 3일 동안 C57BL 마우스에게 1일 2회 피하 투여함으로써 투여하였다: 0(비히클), 5, 15, 45, 135, 405 nmol/kg(n = 6/투여군). 각각의 투여량 수준에서의 반응은 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2로 처리된 쌍-처리 마우스에서 동일한 투여량 수준에서 얻은 반응과 비교하였다. SI 결장 감수성 지수는 결장 질량에 비하여 상대적인 SI 질량으로서 계산하였고, 각각의 투여량 수준에서의 상기 감수성 지수는 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2에서 관찰된 반응으로 표준화하였다. 결과는 소장 선택적 화합물 1857, 1820 및 1849의 투여-반응 관계가 투여량 범위 5 내지 405 nmol/kg 내에서 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2와 유의하게 상이하며(2원 ANOVA에서 p<0.05), 상기 3가지 화합물 모두가 [Gly2]GLP-2에 비하여 상대적으로 증가된 최대 소장 감수성을 나타낸다는 것을 입증하였다. 값은 평균 ± SEM이다. *: [Gly2]GLP-2의 등몰 투여량에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 5: 소장, 결장 및 위 질량에 대한 비선택적 화합물 ([Gly2]GLP-2) 및 소장 선택적 화합물(화합물 1848)의 전체 투여-반응 데이타의 예. 화합물은 하기 투여량으로 3일 동안 C57BL 마우스에게 1일 2회 피하 투여함으로써 투여하였다: 0(비히클), 5, 15, 45, 135, 405 nmol/kg(n = 6/투여군). 결과는 [Gly2]GLP-2가 투여량 범위 5 내지 405 nmol/kg 내에서 소장, 결장 및 위 내에서의 투여량 의존적 성장 자극을 나타내지만, 화합물 1848만이 소장 내에서의 투여량 의존적 성장 자극을 나타낸다는 것을 입증하였다. 값은 평균 ± SEM이다. *: 비히클에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 6: 예는 세포증식억제성 약물인 5-플루오로우라실(5-FU)로 처리된 마우스에서 A) 소장 대 체중 비(SI-BW) 및 B) 소장 길이(SI 길이)에 대한 화합물 1846(5, 15, 45, 135, 405 및 810 nmol/kg, 1일 2회 피하 투여; n = 6/투여군)의 효과를 보여준다. 화합물 1846을 5-FU 투여 전 3일 동안 또는 5-FU와 함께 4일 동안 50 mg/kg씩 매일 복강 내로 투여하였다. 참조용으로, [Gly2]GLP-2(405 nmol/kg)를 일군의 동물들에게 제공하였다. 비히클(PBS) 또는 5-FU 단독으로 처리된 대조군 동물들로부터의 결과 또한 도시되어 있다. 화합물 1846은 C57BL 마우스에서 5-FU 유도 소장 위축증(감소된 기관 질량 및 단축화)을 예방하였다. 값은 평균 ± SEM이었다. *: 5-FU에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 7: 예는 세포증식억제성 약물인 5-플루오로우라실(5-FU)로 처리된 마우스에서 A) 소장 대 체중 비(SI-BW) 및 B) 소장 길이(SI 길이)에 대한 화합물 1848(5, 15, 45, 135, 405 및 810 nmol/kg, 1일 2회 피하 투여; n = 6/투여군)의 효과를 보여준다. 화합물 1848을 5-FU 투여 전 3일 동안 또는 5-FU와 함께 4일 동안 50 mg/kg씩 매일 복강 내로 투여하였다. 참조용으로, [Gly2]GLP-2(405 nmol/kg)를 일군의 동물들에게 제공하였다. 비히클(PBS) 또는 5-FU 단독으로 처리된 대조군 동물들로부터의 결과 또한 도시되어 있다. 화합물 1848은 C57BL 마우스에서 5-FU 유도 소장 위축증(감소된 기관 질량 및 단축화)을 예방하였고, 높은 투여량의 화합물 1848은 [Gly2]GLP-2보다 더 효과적이었다. 값은 평균 ± SEM이었다. *: 5-FU에 비하여 상대적인 P<0.05. #: [Gly2]GLP-2에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 8: 예는 세포증식억제성 약물인 5-플루오로우라실(5-FU)로 처리된 마우스에서 A) 소장 대 체중 비(SI-BW) 및 B) 소장 길이(SI 길이)에 대한 화합물 1855(5, 15, 45, 135 및 405 nmol/kg, 1일 2회 피하 투여; n = 6/투여군)의 효과를 보여준다. 화합물 1855를 5-FU 투여 전 3일 동안 또는 5-FU와 함께 4일 동안 50 mg/kg씩 매일 복강 내로 투여하였다. 참조용으로, [Gly2]GLP-2(405 nmol/kg)를 일군의 동물들에게 제공하였다. 비히클(PBS) 또는 5-FU 단독으로 처리된 대조군 동물들로부터의 결과 또한 도시되어 있다. 화합물 1855는 C57BL 마우스에서 5-FU 유도 소장 위축증(감소된 기관 질량 및 단축화)을 예방하였고, 가장 높은 투여량의 화합물 1855는 등몰 투여량의 [Gly2]GLP-2보다 더 효과적이었다. 값은 평균 ± SEM이었다. *: 5-FU에 비하여 상대적인 P<0.05. #: [Gly2]GLP-2에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 9: 예는 세포증식억제성 약물인 5-플루오로우라실(5-FU)로 처리된 마우스에서 A) 소장 대 체중 비(SI-BW) 및 B) 소장 길이(SI 길이)에 대한 화합물 1857(5, 15, 45, 135 및 405 nmol/kg, 1일 2회 피하 투여; n = 6/투여군)의 효과를 보여준다. 화합물 1857을 5-FU 투여 전 3일 동안 또는 5-FU와 함께 4일 동안 50 mg/kg씩 매일 복강 내로 투여하였다. 참조용으로, [Gly2]GLP-2(405 nmol/kg)를 일군의 동물들에게 제공하였다. 비히클(PBS) 또는 5-FU 단독으로 처리된 대조군 동물들로부터의 결과 또한 도시되어 있다. 화합물 1857은 C57BL 마우스에서 5-FU 유도 소장 위축증(감소된 기관 질량 및 단축화)을 예방하였고, 가장 높은 투여량의 화합물 1855는 높은 투여량의 [Gly2]GLP-2보다 더 효과적이었다. 값은 평균 ± SEM이었다. *: 5-FU에 비하여 상대적인 P<0.05. #: [Gly2]GLP-2에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 10: 예는 세포증식억제성 약물인 5-플루오로우라실(5-FU)로 처리된 수컷 스프라그-다울리(Spague-Dawley) 래트에서의 화합물 1846(16, 80 및 400 nmol/kg/일, 피하 투여; n = 6/투여군)의 효과를 보여준다. 화합물 1846을 5-FU 투여 전 3일 동안 또는 5-FU와 함께 4일 동안 (75 mg/kg씩 매일 복강 내로) 투여하였다. 결과를 비히클(식염수) 또는 5-FU 단독으로 처리된 대조군 동물에서의 반응과 비교하였다. 식염수 및 5-FU 대조군 또한 도시되어 있다. 화합물 1846은 래트에서 5-FU 유도 소장 위축증(감소된 소장 질량 및 소장 단축화)을 예방하였다. 값은 평균 ± SEM이었다. *: 5-FU 단독에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 11: 본 예는 세포증식억제성 약물인 5-플루오로우라실(5-FU)을 사용한 처리에 의해 유도된 설사에 대한 화합물 1846의 치료 효과를 보여준다. 래트를 1일 1회 75 mg/kg의 5-FU로 4일 동안(1일 내지 4일) 처리하였다(n = 40 마리 래트). 동물의 절반은 5-FU 처리 전 마지막 3일 동안(-3일 내지 -1일) 및 4일간의 5-FU 처리 동안(0일 내지 3일) 화합물 1846(400 nmol/kg, 1일 1회 피하 주사)을 사용한 추가 처리를 받았다. 래트를 매일 2회 관찰하여(아침 및 저녁) 상기 동물이 설사를 하는지를 확인하고, 설사의 심각도를 하기 기준에 따라 스코어를 매겼다: (0) 설사 없음; (1) 약간의 설사 - 항문 주변을 더럽히는 배설물; (2) 중간 정도의 설사 - 뒷다리 및 꼬리를 더럽히는 배설물; 및 (3) 심각한 정도의 설사 - 앞다리 및 복부를 더럽히는 배설물. 5일째 되는 날, 5-FU만을 투여받은 스프라그 다울리 래트의 약 70%가 설사를 일으켰으나(도 11 A), 화합물 1846으로 동시 처리된 래트의 30%만이 설사를 일으켰다(도 11B). 이 결과는 화합물 1846이 소장의 손상, 및 그로 인한 5-FU를 사용한 세포증식억제 처리 동안의 설사의 발병을 효과적으로 예방한다는 것을 보여준다.
도 12: 본 예는 공장(즉, 소장의 중간 부분)의 상피 장샘-융모 높이(도 12A) 및 근육 두께(도 12B)에 대한 화합물 1846의 효과를 보여준다. 스프라그 다울리 래트에게 5일 동안 화합물 1846(매일 1회씩 0.62, 3.41 또는 6.2 mg/kg)을 정맥 내로 투여하였다(n = 6/투여군). 이어서, 상기 동물을 희생시키고 소장 생검(1 cm)을 유문괄약근으로부터 25 cm 떨어진 지점에서 채취하였다. 상기 생검을 고정시키고, 파라핀 내에 포매시키고, 절개하고 해마톡실린(haematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색하였다. 염색된 부분을 현미경 하에서 조사하고, 장샘 깊이, 융모 높이, 장샘-융모 길이 및 근육 두께를 측정하였다. 입증된 바와 같이, 화합물 1846은 공장으로부터의 장 상피에서 장샘-융모 길이를 투여량 의존적으로 증가시켰지만, 공장의 근육 두께에 대해서는 효과를 나타내지 않았다. 이 결과는 화합물 1846이 작은 상피 성장의 자극을 통해 소장에서 그의 증식 작용을 일차적으로 발휘한다는 것을 시사한다. 값은 평균 ± SEM이었다. *: 비히클 대조군(0 mg/kg/일)에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 13: 본 예는 인도메타신(indomethacin)에 의해 유도된 소장 궤양에 대한 화합물 1848의 효과를 보여준다. 수컷 스프라그 다울리 래트를 비히클(식염수; 제1군) 또는 인도메타신(2일 동안 1일 1회씩 7 mg/kg 피하 투여; 제2군 내지 제7군)으로 처리하였다. 인도메타신은 단독으로 투여하거나(제2군), 프레드니졸론과 함께 투여하거나(10 mg/kg 피하 투여; 제3군), 8, 40 또는 200 nmol/kg의 화합물 1848과 함께 1일 1회씩 피하 투여하였다(제4군 내지 제6군). 마지막으로, 일군의 래트를 프레드니졸론(10 mg/kg, 피하 투여)과 화합물 1848(200 nmol/kg, 1일 1회씩 피하 투여)의 조합 치료로 치료하였다. 화합물 1848을 사용한 처리는 인도메타신 처리 4일 전에 개시하여 2일간의 인도메타신 처리 동안 계속하였다. 3일째 되는 날, 래트를 희생시켰고, 부검 시 소장을 10% 포르말린으로 약하게 붉게 하였으며, 5분 동안 포르말린으로 충전시킨 후, 장간막대측 가장자리를 따라 장을 절개하여 개방하고, 폴리프로필렌 플레이트 상에 현탁시켰다. 임의의 잔류 장 내용물을 1쌍의 핀셋으로 조심스럽게 제거하였다. 실온에서 24시간 더 고정시킨 후, 조직을 밀리(Milli)-Q 물 중에서 린싱하고, 1% 아세트산 중의 0.5% 용액으로서 제조된 알시안 그린(Alcian Green) 3BX(Chroma)로 20분 동안 표면 염색하였다(Bie & Berntsen). 밀리-Q 물로 과량의 염색 용액을 제거한 후, 조직 표본을 70% 알콜로 옮기고 저배율(×7)에서 입체현미경을 이용하여 분석하였다. 유문에서 시작하여, 소장을 스캐닝하고 모든 궤양의 형태(원형 대 선형) 및 크기(원형 궤양: 직경, 선형 궤양: 길이×폭)를 표준 자(해상도: 0.5 mm)를 이용하여 측정하였다. 궤양은 상피 표면이 없는 면적으로서 정의되었다. 궤양의 치유에 있어서, 융모 구조가 보다 넓은 면적에서 여전히 상실되어 있다 하더라도 여전히 상피 표면을 갖지 않은 면적만이 궤양으로서 간주되었다. 모든 분석은 맹검(blinded) 방식으로 수행하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 인도메타신은 소장 궤양의 강한 유도를 초래하였다(총 소장 궤양 형성 = 333±21 mm2). 프레드니졸론을 사용한 처리는 대략 29%까지 궤양 형성의 정도를 유의하게 감소시켰다. 화합물 1848을 사용한 처리는 투여량 의존적 방식으로 인도메타신 유도 궤양 형성을 예방하였고, 가장 높은 투여량에서 총 궤양 형성이 거의 50%까지 감소하였다(178±17 mm2). 화합물 1846에 대한 이러한 최대 반응은 프레드니졸론의 효과보다 더 컸으며, 높은 투여량의 화합물 1848과 조합된 프레드니졸론의 첨가는 임의의 추가 효과를 제공하지 못하였다. 이 결과는 화합물 1848이 소장에서 인도메타신 유도 궤양 형성을 효과적으로 예방한다는 것을 의미한다. 값은 평균 ± SEM이었다. *: 인도메타신(제2군)에 비하여 상대적인 P<0.05. #: 프레드니졸론(제3군)에 비하여 상대적인 P<0.05.
도 14: 본 예는 소장에서 인도메타신 유도 염증이 있는 래트에서 TNF-α의 소장 함량에 대한 화합물 1848의 효과를 입증한다. 수컷 스프라그 다울리 래트를 비히클(식염수; 제1군) 또는 인도메타신(2일 동안 매일 1회씩 7 mg/kg 피하 투여; 제2군 내지 제7군)으로 처리하였다. 인도메타신은 단독으로 투여하거나(제2군), 프레드니졸론과 조합하여 투여하거나(10 mg/kg 피하 투여; 제3군), 8, 40 또는 200 nmol/kg의 화합물 1848과 함께 매일 1회씩 피하 투여하였다(제4군 내지 제6군). 마지막을, 1일군의 래트를 프레드니졸론(10 mg/kg 피하 투여)과 화합물 1848(200 nmol/kg, 1일 1회씩 피하 투여)의 조합 치료로 치료하였다(제7군). 화합물 1848을 사용한 처리는 인도메타신 처리 4일 전에 개시하여 2일간의 인도메타신 처리 동안 계속하였다. 3일째 되는 날, 래트를 희생시켰고, 부검 시, 소장을 1) 십이지장 및 근위(proximal) 공장, 2) 중위(mid) 및 원위(distal) 공장 및 3) 회장에 상응하는 동등한 길이의 3개 절편으로 나누었다. 샘플을 액체 N2 중에 즉시 민첩하게 동결시키고 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. 소장 절편으로부터 세포 단백질의 균질화 및 추출을 하기 절차에 따라 수행하였다: 조직 절편의 중량을 측정하고 조직 1 g 당 1.5 ㎖의 빙냉(4℃) 추출 완충제(10 mM Tris-HCl(Sigma) 및 1 mM EDTA(J.T. Baker)(pH 7.6), 0.05% 소듐 아지드(Fluka), 1% Tween-80(Fluka), 2 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF, Fluka) 및 단백질분해효소(protease) 억제제인 아프로티닌(aprotinin), 류펩틴(leupeptin) 및 펩스타틴 A(pepstatin A)(Roche Diagnostics) 각각 1 ㎍/㎖을 함유함)를 첨가하였다. 상기 조직을 1쌍의 가위로 작은 조각으로 절단하고 얼음 상에서 30초 동안 간헐적으로 냉각시키면서 9500 rpm에서 20초 동안(IKA UltraTurrax T25 균질화기, Janke & Kunkel) 3회 균질화시켰다. 균질화물을 40℃에서 30분 동안 20,000 × g에서 원심분리하고, 상청액을 모아 TNF-α에 대해 분석할 때까지 20℃에 저장하였다. 소장 단백질 추출물을 제조자의 사용설명서에 따라 시판되는 ELISA 키트(래트 종양 괴사 인자-α 초감수성 ELISA 키트; Biosource International Inc.)를 이용하여 TNF-α에 대해 분석하였다. 이 분석의 검출 한계는 0.7 pg/㎖이다. 단백질 추출물을 시판되는 분석 키트(DC 단백질 분석 키트; Bio-Rad Laboratories Ltd.)를 이용하여 총 단백질 함량에 대해 분석하였다. TNF-α의 소장 조직 농도를 총 단백질에 비하여 상대적으로 표현하였다. 화합물 1848은 전구염증성 시토킨인 TNF-α의 소장 조직 농도를 유의하게 감소시켰고, 이 효과는 근위 절편(소장의 처음 1/3 부분)에서 가장 현저하였다. 화합물 1848은 근위 절편 및 중위 절편(소장의 근위 절편 다음의 1/3 부분)에서 프레드니졸론보다 더 효과적이었다. 흥미롭게는, 화합물 1848은 프레드니존보다 더 효과적으로 소장 내의 염증을 억제하였고, 프레드니존은 화합물 1848과 조합되어 투여될 때 부가적 효과를 나타내지 않았다. 이 결과는 화합물 1848이 소장에 영향을 주는 질병 기전에 대한 현저한 소염 능력을 가진다는 것을 암시한다. 값은 평균 ± SEM이었다. *: 인도메타신(제2군)에 비하여 P<0.05.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 설명하기 위해 제공되는 것이지 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
일반적인 펩티드 합성
장치 및 합성 방법
펩티드는 N-α-아미노 보호기로서의 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 및 측쇄 작용기로서 적합한 통상의 보호기를 사용한 여과를 위한 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에서 회분식(batchwise)으로 합성되었다.
용매
용매 DMF(N,N-디메틸포름아미드, Riedel de-Haen, Germany)는 강한 양이온 교환 수지(Lewatit S 100 MB/H 강산, Bayer AG Leverkusen, Germany)로 팩킹된 컬럼에 통과시켜 정제하고, 유리 아민이 존재하는 경우 황색 색상(Dhbt-O-음이온)을 발색시키는 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt-OH)을 첨가하여 사용 전에 유리 아민에 대해 분석하였다. 용매 DCM(디클로로메탄, 분석 등급, Riedel de-Haen, Germany)을 정제하지 않고 직접 사용하였다. 아세토니트릴(HPLC-등급, Lab-Scan, Dublin Ireland)을 정제하지 않고 직접 사용하였다.
아미노산
Fmoc-보호 아미노산을 어드밴스드 캠테크(Advanced ChemTech(ACT))로부터 적절한 측쇄 보호 형태로 구입하였다.
커플링 시약
커플링 시약인 디이소프로필카르보디이미드(DIC)를 리에델 드-핸(Riedel de-Haen, Germany)으로부터 구입하였다.
고체 지지체
펩티드를 텐타겔(TentaGel) S 수지 0.22 내지 0.31 mmol/g 상에서 합성하였다. 텐타겔 S-램(Ram), 텐타겔 S RAM-Lys(Boc)Fmoc(Rapp polymere, Germany)는 C-말단 아미드화 펩티드가 바람직한 경우에 사용하였지만, 텐타겔 S PHB, 텐타겔 S PHB Lys(Boc)Fmoc는 C-말단 유리 카르복실산이 바람직한 경우에 사용하였다.
촉매 및 다른 시약
디이소프로필에틸아민(DIEA)을 알드리치(Aldrich, Germany)로부터 구입하였고, 피페리딘 및 피리딘을 리에델 드-핸(Frankfurt, Germany)으로부터 구입하였다. 에탄디티올을 리에델 드-핸(Frankfurt, Germany)으로부터 구입하였다. 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt-OH), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)(HOAt)을 플루카(Fluka, Switzerland)로부터 구입하였다. 아세트산 무수물을 플루카로부터 구입하였다.
커플링 절차
아미노산은 DMF 중의 DIC를 사용하여 적절한 N-α-보호 아미노산 및 HObt 또는 HOAt로부터 제조된 원위치에서 생성된 HObt 또는 HOAt 에스테르로서 커플링되었다. 아실화는 시험하는 동안에 Fmoc 탈보호를 방지하기 위해 80℃에서 수행된 닌히드린 시험에 의해 확인되었다(Larsen, B. D. and Holm, A., Int. J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 1-9).
N-α-아미노 보호기( Fmoc )의 탈보호
Fmoc 기의 탈보호는 DMF(1×5 및 1×10 분) 중의 20% 피페리딘으로 처리한 후, Dhbt-OH를 배수된 DMF에 첨가한 후 황색 색상이 검출될 수 없을 때까지 DMF(각각 5×15 ㎖, 5분)로 세척하였다.
HOBt -에스테르의 커플링
3 당량의 N-α-아미노 보호 아미노산을 3 당량의 HObt 및 3 당량의 DIC와 함께 DMF에 용해시킨 후 수지에 첨가하였다.
산의 사용에 의한 수지로부터의 펩티드의 절단
95% 트리플루오로아세트산(TEA, Riedel-de Haen, Frankfurt, Germany)-물(부피/부피) 또는 95% TFA 및 5% 에탄디티올(부피/부피)로 2시간 동안 실온에서 처리하여 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 여과된 수지를 95% TFA-물로 세척하고 여액 및 세척액을 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 에테르로 세척하고 아세트산-물로부터 동결건조하였다. 미정제 동결건조 생성물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하고 질량 분광계(MS)로 확인하였다.
텐타겔 수지( PEG - PS ) 상의 회분식 펩티드 합성
텐타겔 수지(1 g, 0.23-0.24 mmol/g)를 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣었다. 수지를 DMF(15 ㎖) 중에서 팽윤시키고, 링커 텐타겔 S RAM 상의 초기 Fmoc 기를 제거하거나 수지 텐타겔 S RAM-Lys(Boc)Fmoc 상의 제1 아미노산 상의 초기 Fmoc 기를 제거하기 위해 DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하였다. 수지를 배수시키고, Dhbt-OH를 배수된 DMF에 첨가한 후 황색 색상이 검출될 수 없을 때까지 DMF로 세척하였다. 본 서열에 따른 아미노산은 전술한 바와 같이 미리 형성된 Fmoc-보호 HObt 에스테르(3 당량)로서 커플링되었다. 달리 명시하지 않는 한, 커플링은 2시간 동안 계속하였다. 수지를 배수시키고, 과량의 시약을 제거하기 위해 DMF(각각 5×15 ㎖, 5분)로 세척하였다. 모든 아실화를 전술한 바와 같이 닌히드린 시험으로 확인하였다. 완전한 합성 후, 펩티드 수지를 DMF(각각 3×15 ㎖, 5분), DCM(각각 3×15 ㎖, 1분) 및 마지막으로 디에틸 에테르(각각 3×15 ㎖, 1분)로 세척하고 진공 하에 건조하였다. 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하고, 후술하는 바와 같이 미정제 펩티드 생성물을 분석하고 정제하였다.
HPLC 조건
HP 1100 4변수 펌프(Quaternary Pump), HP 1100 오토샘플러(Autosampler), HP 1100 컬럼 써모스타트(Column Thermostat) 및 HP 1100 멀티플 파장 검출기(Multiple Wavelength Detector)로 구성된 휴렛 팩커드(Hewlett Packard) HP 1100 HPLC를 이용하여 구배(gradient) HPLC 분석을 수행하였다. LC 소프트웨어(리비젼 A.06.01)용 휴렛 팩커드 켐스테이션(Chemstation)을 장치 조절 및 데이타 획득을 위해 사용하였다. 하기 컬럼 및 HPLC 완충제 시스템을 사용하였다:
컬럼: VYDAC 238TP5415, C-18, 5 mm, 300 Å 150×4.6 mm.
완충제: A: MQV 중의 0.1% TFA; B: 0.085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN.
구배: 0 내지 1.5 분, 0% B
1.5 내지 25 분, 50% B
25 내지 30 분, 100% B
30 내지 35 분, 100% B
35 내지 40 분, 0% B
유속 1 ㎖/분, 오븐 온도 40℃, UV 검출: I = 215 nm.
미정제 펩티드의 HPLC 정제
미정제 펩티드 생성물은 퍼셉티브 바이오시스템스 비젼 워크스테이션(PerSeptive Biosystems VISION Workstation)으로 정제하였다. 비젼 3.0 소프트웨어(VISION 3.0 software)를 장치 조절 및 데이타 획득을 위해 사용하였다. 하기 컬럼 및 HPLC 완충제 시스템을 사용하였다:
컬럼: 크로마실(Kromasil) KR 100 Å, 10 mm C-8, 250×50.8 mm.
완충제 시스템: 완충제: A: MQV 중의 0.1% TFA; B: 0.085% TFA, 10% MQV, 90% MeCN.
구배: 0 내지 37분. 0 내지 40% B
유속 35 ㎖/분, UV 검출: I = 215 nm 및 280 nm.
질량 분광법
농도가 1 내지 10 mg/㎖가 되도록 펩티드를 초(super)-구배 메탄올(Labscan, Dublin, Ireland), 밀리-Q 물(Millipore, Bedford, MA) 및 포름산(Merck, Damstadt, Germany)(50:50:0.1 부피/부피/부피)에 용해시켰다. 펩티드 용액(20 ㎖)은 정확도가 +/- 0.1 m/z인 LCT 질량 분광계(Micromass, Manchester, UK)를 이용하는 ESI-TOF-MS에 의해 양성 극성 모드에서 분석되었다.
일반적인 합성 절차
모든 합성에서, 무수 텐타겔-S-램 수지(1 g, 0.22-0.31 mmol/g)를 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣었다. 수지를 DMF(15 ㎖) 중에서 팽윤시키고, DMF 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 수지 상의 비양성자화 아미노 기의 존재를 확보하였다. 수지를 배수시키고, Dhbt-OH를 배수된 DMF에 첨가한 후 황색 색상이 검출될 수 없을 때까지 DMF로 세척하였다. 본 서열에 따른 아미노산은 전술한 바와 같이 미리 형성된 Fmoc-보호 HOBt 에스테르(3 당량)로서 커플링되었다. 달리 명시하지 않는 한, 커플링은 2시간 동안 계속하였다. 수지를 배수시키고, 과량의 시약을 제거하기 위해 DMF(각각 5×15 ㎖, 5분)로 세척하였다. 모든 아실화를 80℃에서 수행된 닌히드린 시험으로 확인하였다. 완전한 합성 후, 펩티드 수지를 DMF(각각 3×15 ㎖, 5분), DCM(각각 3×15 ㎖, 1분) 및 마지막으로 디에틸 에테르(각각 3×15 ㎖, 1분)로 세척하고 진공 하에 건조하였다. 그 다음, 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하고, 동결건조하였다. 전술한 바와 같이 분취형 HPLC를 이용하여 정제한 후, 펩티드 생성물을 모아 펩티드의 정체를 ES-MS로 확인하였다. 이 절차를 하기에서 추가로 예시된 모든 펩티드의 합성에 이용하였다.
합성된 화합물
상기 기법을 이용하여, 화합물 1809 내지 1861 및 참조 화합물 1559(H-[Gly2]hGLP-2-OH)를 합성하였다(하기 표 1).
Figure 112011050297638-pat00001
표 1 (계속)
Figure 112011050297638-pat00002
실시예 1. 화합물 1846의 합성
텐타겔 S RAM-Lys(Boc)Fmoc 상의 H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
무수 텐타겔 S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24 mmol/g, 1 g)를 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣고 N-말단 히스티딘의 커플링을 마무리할 때까지 "텐타겔 수지 상의 회분식 펩티드 합성" 하에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. 아실화를 전술한 바와 같이 확인하였다. 합성 완료 및 N-말단 Fmoc 기의 탈보호 후, 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하였다. 전술한 바와 같이 분취형 HPLC를 이용하여 정제한 후, 28.8 mg의 펩티드 생성물을 90%보다 더 높은 순도로 모으고 펩티드의 정체를 MS로 확인하였다(실측된 M 4315.38, 계산된 M 4315.41).
실시예 2. 화합물 1848의 합성
텐타겔 S RAM-Lys(Boc)Fmoc 상의 H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
무수 텐타겔 S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24 mmol/g, 1 g)를 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣고 N-말단 히스티딘의 커플링을 마무리할 때까지 "텐타겔 수지 상의 회분식 펩티드 합성" 하에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. 아실화를 전술한 바와 같이 확인하였다. 합성 완료 및 N-말단 Fmoc 기의 탈보호 후, 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하였다. 전술한 바와 같이 분취형 HPLC를 이용하여 정제한 후, 230 mg의 펩티드 생성물을 90%보다 더 높은 순도로 모으고 펩티드의 정체를 MS로 확인하였다(실측된 M 4313.63, 계산된 M 4313.43).
실시예 3. 화합물 1855의 합성
텐타겔 S RAM-Asp(OtBu)Fmoc 상의 H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
무수 텐타겔 S RAM-Asp(OtBu)Fmoc(0.2 mmol/g, 1 g)를 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣고 N-말단 히스티딘의 커플링을 마무리할 때까지 "텐타겔 수지 상의 회분식 펩티드 합성" 하에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. 아실화를 전술한 바와 같이 확인하였다. 합성 완료 및 N-말단 Fmoc 기의 탈보호 후, 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하였다. 전술한 바와 같이 분취형 HPLC를 이용하여 정제한 후, 27.3 mg의 펩티드 생성물을 96%보다 더 높은 순도로 모으고 펩티드의 정체를 MS로 확인하였다(실측된 M 3547, 계산된 M 3546.84).
실시예 4. 화합물 1857의 합성
텐타겔 S RAM-Asp(OtBu)Fmoc 상의 H-His-Gly-Glu-GIy-Thr-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
무수 텐타겔 S RAM-Asp(OtBu)Fmoc(0.2 mmol/g, 1 g)를 여과용 폴리프로필렌 필터가 장착된 폴리에틸렌 용기 내에 넣고 N-말단 히스티딘의 커플링을 마무리할 때까지 "텐타겔 수지 상의 회분식 펩티드 합성" 하에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 커플링을 밤새 계속하였다. 아실화를 전술한 바와 같이 확인하였다. 합성 완료 및 N-말단 Fmoc 기의 탈보호 후, 펩티드를 전술한 바와 같이 수지로부터 절단하였다. 전술한 바와 같이 분취형 HPLC를 이용하여 정제한 후, 39.3 mg의 펩티드 생성물을 94%보다 더 높은 순도로 모으고 펩티드의 정체를 MS로 확인하였다(실측된 M 3544.88, 계산된 M 3544.86).
실시예 5. 화합물 1846 A(아세테이트 염)의 합성
화합물 1846의 트리플루오로아세테이트로부터 아세테이트로의 반대 이온 교환.
화합물 1846의 정제된 합성 펩티드 생성물은 미정제 합성 펩티드 생성물의 정제를 위해 사용된 HPLC 완충제 중의 트리플루오로아세트산(0.1% 부피/부피)의 존재로 인해 트리플루오로아세테이트 염으로서 단리되었다.
반대 이온 트리플루오로아세테이트를 아세테이트로 교환하기 위해, 펩티드 용액을 아세테이트 상의 강염기 이온 교환 수지(Dowex 1×8)로 팩킹된 컬럼에 통과시켰다. 365 mg의 화합물 1을 40 ㎖의 물에 용해시켰다. 용액을 아세테이트 상의 강염기 이온 교환 수지(Dowex 1×8; 용량 1.33 meq/㎖ 수지)를 함유하는 컬럼에 통과시켰다. 그 다음으로, 상기 수지를 4×30 ㎖ 물로 세척하고, 용출액을 모아 동결건조함으로써, HPLC 분석에 따른 순도가 97%인 312 mg의 아세테이트 염을 수득하였다.
실시예 6. 화합물 1848 C(클로라이드 염)의 합성
화합물 1848의 트리플루오로아세테이트(Tfa)로부터 클로라이드(Cl-)로의 반대 이온 교환.
100 mg의 화합물 1을 50 ㎖의 0.1 M 염산에 용해시키고, 생성된 용액을 동결건조하였다. 잔류물을 50 ㎖의 물에 용해시키고 다시 동결건조함으로서, HPLC 분석에 따른 순도가 93%인 80 mg의 클로라이드 염을 수득하였다.
실시예 7 - 화학적 안정성 시험
GLP-2 유사체를 정제된 물에 용해시킨 후, HCl, NaOH, H2O2 또는 NH4HCO3을 함유하는 용액 중에서 희석시켰다. 용액을 40℃에서 항온처리하여 가수분해, 탈아미드화 및 산화 생성물을 생성시켰다. 샘플을 RP-HPLC로 분석하고, 잔류하는 완전한 화합물의 백분율을 상대적 안정성에 대한 척도로서 측정하였다. 주 분해 생성물을 LC-MS로 임시로 확인하였다. 사용된 펩티드는 하기 표 3에 나열되어 있다.
Figure 112011050297638-pat00003
화합물 ZP1559 즉, Gly2-GLP-2를 시험된 다른 GLP-2 유사체들에 대한 기준으로서 사용하였다. GLP-2 유사체들에서, 서열이 참조 화합물 ZP1559와 상이한 위치는 굵은 글자체로 표시하였다. 서열은 하기 표 3에 나열되어 있다.
화합물들은 C-말단-K6 연장이 있거나 없는 이들의 서열에 따라 쌍으로서 나열되어 있다.
Figure 112011050297638-pat00004
Figure 112011050297638-pat00005
실험에 사용된 화학물질들은 하기 표 4에 나열되어 있다.
분석 절차에 사용된 화학물질 및 시약
물질 질 공급자 제품
아세토니트릴(MeCN) HPLC 등급 리에델-드-핸 34851
트리플루오로아세트산(TFA) 99.9% 피어스(Pierce) 28904
포름산(FA) 98 내지 100% 머크(Merk) 1.00264.1000
염산 HCl "베이커 분석됨" 제이. 티. 베이커(J. T. Baker) 7088
수산화나트륨 NaOH "베이커 분석됨" 제이. 티. 베이커 7098
과산화수소 H2O2 30% 중량/중량 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) H1009
NH4HCO3 99.0% 아날라R(AnalaR) 103025E
먼저, 물을 18 MΩcm 이상의 저항값까지 탈미네랄화한 후, 밀리-Q 시스템(Millipore, Bedford, USA)에 통과시켰다. 마지막으로, 밀리-Q 정제 물(MQW)을 0.22 ㎛ 멸균 필터(Millipak 40 Gamma Gold, Millipore)를 통해 탭핑하였다.
시험된 GLP-2 유사체 및 참조 화합물 Gly2-GLP-2인 ZP1559를 물에 용해시킨 후, HCl, NaOH, H2O2 또는 NH4HCO3을 함유하는 용액 내로 희석시켰다. 샘플을 40℃에서 항온처리하여 가수분해, 탈아미드화 및 산화 생성물 각각을 생성시켰다. 상기 화합물들을 본래의 주 피크의 순도에 대해 RP-HPLC로 분석하고, 주 피크 및 주 분해 생성물의 질량에 의한 본질의 확인을 위해 LC-MS로 분석하였다.
스트레스 용액의 제조:
0.2 M HCl: 4 ㎖의 MQW 및 1 ㎖의 1 M HCl.
0.02 M NaOH: 4 ㎖의 MQW 및 1 ㎖의 0.1 M NaOH.
0.2 M NH4HCO3, pH 8: 0.79 g의 NH4HCO3을 50 ㎖의 MQW에 용해시켰다.
1% H2O2: 5.8 ㎖의 MQW 및 0.2 ㎖의 30% H2O2.
샘플 용액:
먼저, GLP-2 유사체를 4 mg/㎖의 농도로 MQW에 용해시킨 후, 1:1 비(예를 들어, 125 ㎕ 플러스 125 ㎕)로 스트레스 용액 중에서 더 희석시켰다. 0.1 M의 HCl, 0.01 M의 NaOH, 0.1 M의 NH4HCO3 및 0.5% H2O2 각각이 존재하는 스트레스 조건에 대한 GLP-2 유사체의 최종 농도는 2 mg/㎖이었다.
용액을 40℃의 암실에서 항온처리한 후, 용출액 A 중에서 5 mg/㎖의 농도까지 희석시킨 후(750 ㎕의 첨가), RP-HPLC 및 LC-MS로 분석하였다.
스트레스 시험에 대한 조건
용액 0.1 M HCl 0.01 M NaOH 0.1 M NH 4 HCO 3 0.5% H 2 O 2
온도(℃) 40 40 40 40
저장(일) 12 3 6 3
RP - HPLC
아질렌트 테크놀로지스, 인코포레이티드(Agilent Technologies, Inc.)로부터 구입한 케모스테이션(리비젼 A.08.03 [847]) 소프트웨어의 조절 하에 아질렌트 시리즈 1100 HPLC 시스템 상에서 RP-HPLC 분석을 수행하였다. 아질렌트 테크놀로지스 리비젼 B01.03 소프트웨어를 사용하여 미처리 데이타 및 피크 통합의 결과를 켐스토어(ChemStore) C/S 서버 상에 축적하였다.
RP-HPLC 방법
방법 파일명 P2204071.M
컬럼 Vydac218MS52, 5 ㎛, 300 Å, 2.1 × 250 ㎜
구배(시간; % B) 0;5, 2;5, 7;15, 25;30, 45;40, 65;50, 70;100, 73;100, 75;5, 90;5
용출액 A 0.05% TFA, MQW 중의 0.05% FA
용출액 B 0.05% TFA, MeCN 중의 0.05% FA
유속 0.200 ㎖/분
주입 부피 20 ㎕
컬럼 온도 25℃
자동 샘플러 온도 4℃
UV 검출 220 nm
LC - MS
분석적 LC-MS 분석은 온-라인 탈기기(degasser), 4변수 구배 펌프, 자동 샘플러, 컬럼 오븐 및 UV 검출기로 구성된 아질렌트 테크놀로지스 1100 HPLC 장치 상에서 수행하였다. 상기 HPLC 장치는 마이크로매스((Micromass, UK)로부터 구입한 매스라이닉스(Masslynx) 3.5 소프트웨어의 조절 하에 마이크로매스 LCT(ESI-TOF) 질량 분광계와 인터페이스로 접속되었다.
LC-MS 방법
방법 파일명 P22_04_071_003.M
컬럼 Vydac218MS52, 5 ㎛, 300 Å, 2.1 × 250 ㎜
구배(시간; % B) 0;5, 2;5, 7;15, 25;30, 45;40, 65;50, 70;100, 73;100, 75;5, 90;5
용출액 A 0.05% TFA, MQW 중의 0.05% FA
용출액 B 0.05% TFA, MeCN 중의 0.05% FA
유속 0.200 ㎖/분
주입 부피 30 ㎕
컬럼 온도 25℃
자동 샘플러 온도 4℃
UV 검출 220 nm
SOP 22-3003에 따른 MS 구성
원뿔(cone) 전압 30 V
모세관 전압 3.1 kV
질소 분무기 기체 유동 100 L/hr
탈용매화 기체 유동 500 L/hr
탈용매화 온도 250℃
공급원 블록 온도 100℃
결과는 스트레스 조건 하의 항온처리 후 RP-HPLC에 의해 측정된 화합물 순도로서 표 9에 나타내었다. 이 순도는 T=0에서 측정된 순도에 비하여 상대적인 것으로서 스트레스 용액 중에서 항온처리한 후 잔류하는 완전한 화합물에 대한 측정치이다. 이 결과는 이 분석적 RP-HPLC 방법에 의해 관찰되지 않은 가능한 숨겨진 분해 생성물을 고려하지 않은 것이다.
스트레스 시험 샘플 중의 주 분해 생성물은 LC-MS 방법에 의해 임시로 확인되었다. 모 화합물 및 부(minor) 분해 생성물에 대한 어떠한 이성질체도 이 분석적 LC-MS 방법에 의해 관찰되지 않았다. 임시 확인결과는 하기 표 11 내지 15에 기재되어 있다.
시험된 GLP-2 유사체는 C-말단-K6 연장이 있거나 없는 이들의 서열에 따라 쌍으로서 나열되어 있다.
Figure 112011050297638-pat00006
NaOH 중에서 항온처리된 화합물들에 대한 결과는 안정성의 차이가 관찰될 수 없었기 때문에 기재되지 않았다. 분해 생성물 및 주 피크는 모두 LC-MS 분석에 의해 동일한 질량을 가지며; 이들 화합물들은 시간에 따라 라세미체화될 수 있었다. 상기 표 9에 기재된 결과는 일반적으로 시험된 GLP-2 유사체가 Gly2-GLP-2 참조 화합물인 ZP1559보다 더 화학적으로 안정하다는 것을 보여준다.
산 가수분해 동안, 시험된 GLP-2 유사체들은 ZP1820 및 ZP1834를 제외하고 Gly2-GLP-2 참조 화합물인 ZP1559보다 더 안정하였다. 이는 위치 3에 있는 아미노산 Asp에 주로 기인한다. Asp보다는 오히려 Glu이 아미노산 3과 4 즉, Asp와 Gly 사이의 절단을 최소화할 수 있다. 시험된 다른 ZP GLP-2 유사체는 거의 동일한 안정성을 가지며, C-말단-K6이 없는 화합물인 ZP1855, ZP1857 및 ZP1858에 대해 다소 더 높은 안정성을 가지는 경향을 보였다. 이 차이는 위치 33에 존재하는 아미노산인 Asp에 의해 설명된다. C-말단-K6이 없는 화합물에 있어서, 이 아미노산은 C-말단이고 아미노산 32와 33 즉, Tyr과 Asp 사이의 절단은 아미노산 33과 34 즉, Asp과 Lys 사이의 절단보다 더 느리게 일어났다. 안정성의 차이는 Asp에 기인하는 것이지 C-말단-K6에 기인하는 것이 아니다.
가속화된 산화(H2O2, 하기 표 10 및 13 또한 참조함) 조건 하에, 시험된 GLP-2 유사체는 Gly2-GLP-2 참조 화합물인 ZP1559보다 훨씬 더 안정하였다. 이는 ZP1559의 위치 10에 있는 Met의 산화에 기인할 수 있다. 예외는 설명될 수 없는 낮은 안정성을 보이는 ZP1855이다. 이는 ZP1855의 배치(bath)에 특이적일 수 있고 이를 설명하기 위해서는 추가 연구가 필요할 것이다.
탈아미드화를 촉진하는 조건((NH4HCO3) 하의 안정성에 있어서, 시험된 GLP-2 유사체가 Gly2-GLP-2 참조 화합물인 ZP1559보다 더 안정하였다. 이는 ZP1559에 존재하는 여러 개의 탈아미드화 부위 즉, 시험된 GLP-2 유사체에 대한 서열에는 존재하지 않는 위치 11, 16 및 24에 있는 Asn에 기인할 수 있다.
LC - MS 에 의한 주 분해 생성물의 임시적 확인
Figure 112011050297638-pat00007
Figure 112011050297638-pat00008
40℃, 0.1 M HCl 중에서 12일 동안 항온처리된 GLP-2 유사체
GLP-2
유사체		 측정된
MW(Da)		 이론상
MW(Da)		 * 질량 차이(Da) 주 생성물/부 생성물의 존재도 가능한 ID 제안
ZP1559 3749.88 3749.80 +0.08 주 생성물
3732.75 Na -17.13 부 생성물, 시클릭 탈아미드화
3751.88 Na +2.00 부 생성물, 2 × 탈아미드화
ZP1820 4070.13 4070.28 -0.15 주 생성물 A1-A36
4071.25 Na +1.12 부 생성물, 탈아미드화
3761.25 3761.17 +0.08 부 생성물, 가수분해 A4-A36
2526.75 2526.56 +0.19 부 생성물, 가수분해 A16-A36
3762.25 3762.16 +0.09 부 생성물, 가수분해 A4-A36,
탈아미드화
ZP1834 3302.00 3301.71 +0.29 주 생성물
3303.00 Na +1.00 부 생성물, 탈아미드화
3283.88 Na -18.12 부 생성물, 시클릭 탈아미드화
3302.88 Na +0.88 부 생성물, 탈아미드화
2992.88 2992.60 -309.12 주 생성물, 가수분해 A4-A30,
탈아미드화
2993.88 2993.59 -308.12 부 생성물, 가수분해 A4-A30
2993.75 2993.59 -308.25 부 생성물, 가수분해 A4-A30
ZP1846 4315.00 4315.41 +0.59 주 생성물 A1-A39
3547.50 3547.82 -0.32 부 생성물, 가수분해 A1-A33
3934.88 3935.26 -0.38 부 생성물, 가수분해 A5-A33
2755.38 2755.70 -0.32 부 생성물, 가수분해 A16-A39
2158.25 2158.37 -0.12 부 생성물, 가수분해 A22-A39
3155.16 Na -1160.25 제안 없음
ZP1855 3548.13 3546.84 +1.29 주 생성물/탈아미드화
3548.13 Na +1.29 부 생성물, 탈아미드화
3225.13 3223.71 +1.42 부 생성물, 가수분해 A4-A33,
탈아미드화
3433.13 3432.79 +0.34 부 생성물, 가수분해 A1-A32
3354.50 3352.76 +1.76 부 생성물, 가수분해 A3-A33,
탈아미드화
ZP1857 3544.50 3544.86 -0.36 주 생성물 A1-A33
3430.63 3430.81 -0.18 부 생성물, 가수분해 A1-A32
3351.38 3350.78 +0.06 부 생성물, 가수분해 A3-A33
3165.50 3164.71 +0.79 부 생성물, 가수분해 A5-A33
3222.50 3221.73 +0.77 부 생성물, 가수분해 A4-A33
2830.25 2829.56 +0.69 부 생성물, 가수분해 A8-A33
3545.13 Na +0.63 부 생성물, 라세미체화
ZP1849 4299.63 4299.41 +0.22 주 생성물, A1-A39
2755.88 2755.70 +0.18 부 생성물, 가수분해 A16-A38
3532.00 3531.82 +0.18 부 생성물, 가수분해 A1-A33
2158.38 2159.05
2158.37		 -0.67
+0.01		 부 생성물, 가수분해
A1-A21 또는 A22-A39
3976.88 3976.29 +0.59 부 생성물, 가수분해 A4-A39
4105.13 4105.33 -0.20 부 생성물, 가수분해 A3-A39
3920.50 3919.27 +1.23 부 생성물, 가수분해 A5-A39,
탈아미드화
1561.84 1561.73 +0.11 부 생성물, 가수분해 A1-A15
ZP1858 3532.13 3530.84 +1.29 주 생성물/탈아미드화
Na = 이용 가능하지 않으며, 이론상 MW가 계산되지 않거나 제안되지 않았다.
* 질량 차이는 주 피크 또는 제안된 화합물에 대한 이론상 MW와 측정된 MW의 차이이다.
하기 표 12의 결과는 시험된 GLP-2 유사체 및 Gly2-GLP-2 참조 화합물인 ZP1559에 대한 측정된 분자량이 이론상 분자량에 상응한다는 것을 보여준다.
ZP1559, ZP1820 및 ZP1834에서 가장 풍부한 분해 생성물은 아미노산 3과 사이, 즉 Asp과 Gly 사이의 절단물이었다. C-말단-K6을 가지는 화합물 ZP1846, ZP1848 및 ZP1849의 경우, 위치 33 내지 39에 있는 C-말단-K6(Lys6)의 상실에 상응하는 분해 생성물이 검출되었다. C-말단-K6을 가지지 않는 화합물 ZP1855 및 ZP1857의 경우, 위치 33에 있는 C-말단 Asp의 상실에 상응하는 분해 생성물이 검출되었다.
검출된 부 분해 생성물들은 아미노산 15와 16(Asp와 Asn, 또는 Asp와 Ala) 사이, 아미노산 4와 5(Gly과 Ser) 사이, 아미노산 21과 22(Asp와 Phe) 사이의 절단물이었다.
H2O2에 의해 스트레스 받은 용액
40℃, 0.5% H2O2 중에서 3일 동안 항온처리된 GLP-2 유사체
GLP-2
유사체		 측정된
MW(Da)		 이론상
MW(Da)		 * 질량 차이(Da) 주 생성물/부 생성물의 존재도
가능한 ID 제안
ZP1559 n.d. 3749.80 - 완전한 생성물이 없음
3766.00 Na +16.2 주 생성물, M의 산화
ZP1820 4070.63 4070.28 -0.35 주 생성물
4052.38 Na -18.25 주 생성물, 탈아미드화 전구체
4086.50 Na +15.87 부 생성물, W의 산화
4068.75 Na -1.88 부 생성물, 2 × 탈아미드화
ZP1834 3301.75 3301.71 +0.04 주 생성물
3283.75 Na -18.00 주 생성물, 탈아미드화 전구체
3317.88 Na +16.13 부 생성물, W의 산화
3299.75 Na -2.00 부 생성물, 2 × 탈아미드화
ZP1846 4315.50 4315.41 +0.09 주 생성물
4331.88 Na +16.38 부 생성물, W의 산화
ZP1855 3547.00 3546.84 +0.16 주 생성물
3481.88 Na -65.12 부 생성물, 제안 없음
3410.00 Na -137.00 부 생성물, A2-A33
3563.00 Na +16.00 부 생성물, W의 산화
ZP1848 4313.50 4313.43 +0.07 주 생성물
4329.63 Na +16.13 부 생성물, W의 산화
ZP1857 3545.00 3544.86 +0.14 주 생성물
3408.00 Na -137.00 부 생성물, A2-A33
3561.00 Na +16.00 부 생성물, W의 산화
3479.88 Na -65.12 부 생성물, 제안 없음
ZP1849 4299.50 4299.41 +0.09 주 생성물
4315.75 Na +16.25 부 생성물, W의 산화
ZP1858 3531.00 3530.84 +0.16 주 생성물
3394.13 Na -136.87 부 생성물, A2-A33
3547.00 Na +16.00 부 생성물, W의 산화
3466.00 Na -65.00 부 생성물, 제안 없음
Na = 이용 가능하지 않으며, 이론상 MW가 계산되지 않거나 제안되지 않았다.
* 질량 차이는 주 피크에 대한 이론상 MW와 측정된 MW의 차이이다.
하기 표 13의 결과는 시험된 GLP-2 유사체 및 Gly2-GLP-2 참조 화합물인 ZP1559에 대한 측정된 분자량이 이론상 분자량에 상응한다는 것을 보여준다. ZP1559의 경우, 위치 10에 있는 Met의 산화된 생성물일 수 있는, MW가 +16 Da인 주 분해 생성물이 관찰되었다. ZP1820 및 ZP1834의 경우, MW가 +18 Da인 주 분해 생성물이 관찰되었다. 이들은 탈아미드화에 대한 전구체에 있어서 물의 상실에 의한 것일 수 있다. 또한, MW가 -2 Da인 부 생성물이 관찰되었고 2개의 부위에서의 탈아미드화에 의한 것일 수 있다. MW가 +16 Da인 부 생성물은 모든 화합물에서 관찰되었고 Trp의 산화에 의한 것일 수 있다. C-말단-K6이 없는 화합물 ZP1855, ZP1857 및 ZP1858의 경우, MW가 각각 -137 Da 및 -65 Da인 부 분해 생성물들이 검출되었고, 이들은 각각 위치 1에 있는 His의 상실 및 미확인된 분해 생성물에 상응하였다.
NaOH 에 의해 스트레스 받은 용액
40℃, 0.01 M NaOH 중에서 3일 동안 항온처리된 GLP-2 유사체
GLP-2
유사체		 측정된
MW(Da)		 이론상
MW(Da)		 * 질량 차이(Da) 설명
ZP1559 3750.38 3749.80 +0.58 MW에서의 변화 없음
ZP1820 4070.63 4070.28 +0.35 MW에서의 변화 없음
ZP1834 3302.00 3301.71 +0.29 MW에서의 변화 없음
ZP1846 4315.63 4315.41 +0.22 MW에서의 변화 없음
ZP1855 3547.25 3546.84 +0.41 MW에서의 변화 없음
ZP1848 4313.88 4313.43 +0.45 MW에서의 변화 없음
ZP1857 3545.13 3544.86 +0.27 MW에서의 변화 없음
ZP1849 4299.88 4299.41 +0.47 MW에서의 변화 없음
ZP1858 3531.13 3530.84 +0.29 MW에서의 변화 없음
na = 이용 가능하지 않으며, 이론상 MW가 계산되지 않거나 제안되지 않았다.
* 질량 차이는 주 피크에 대한 이론상 MW와 측정된 MW의 차이이다.
LC-MS 분석은 각각이 화합물에 대한 모든 피크에서 동일한 분자량을 보였다. 이는 가장 풍부한 분해 생성물이 서열 내의 하나 이상의 아미노산의 L-형태로부터 D-형태로의 라세미체화에 의한 것일 수 있음을 의미한다. 그 후, 이 주 피크는 하나 또는 수개의 라세미체화된 생성물을 숨길 수 있으므로, 완전한 펩티드의 잔류 순도가 전혀 결정될 수 없었다. 절단으로부터 생성된 주 분해 생성물은 전혀 검출되지 않았다.
NH 4 HCO 3 에 의해 스트레스 받은 용액
0℃, 0.1 M NH4HCO3 (pH 8) 중에서 6일 동안 항온처리된 GLP-2 유사체
GLP-2
유사체		 측정된
MW(Da)		 이론상
MW(Da)		 * 질량 차이(Da) 주 생성물/부 생성물의 존재도
가능한 ID 제안
ZP1559 3750.00 3749.80 +0.20 주 생성물
3751.13 Na +1.13 부 생성물, 가능한 탈아미드화
3751.13 Na +1.13 부 생성물, 가능한 탈아미드화
ZP1820 4070.13 4070.28 -0.15 주 생성물
4070.13 Na -0.15 부 생성물, 가능한 라세미체화
ZP1834 3302.00 3301.71 +0.29 주 생성물
3302.00 Na +0.29 부 생성물, 가능한 라세미체화
ZP1846 4315.25 4315.41 -0.16 주 생성물
4315.63 Na +0.38 부 생성물, 가능한 라세미체화
ZP1855 3547.13 3546.84 +0.29 주 생성물
ZP1848 4313.75 4313.43 +0.32 주 생성물
ZP1859 3544.75 3544.86 -0.11 주 생성물
ZP1849 4299.50 4299.41 +0.09 주 생성물
ZP1858 3531.00 3530.84 +0.16 주 생성물
Na = 이용 가능하지 않으며, 이론상 MW가 계산되지 않거나 제안되지 않았다.
* 질량 차이는 주 피크에 대한 이론상 MW와 측정된 MW의 차이이다.
표 14의 결과는 시험된 GLP-2 유사체 및 Gly2-GLP-2 참조 화합물인 ZP1559에 대한 측정된 분자량이 이론상 MW에 상응한다는 것을 보여준다. ZP1559의 경우, 탈아미드화된 생성물일 수 있는, MW가 +1 Da인 부 분해 생성물이 관찰되었다. ZP1820, ZP1834 및 ZP1846의 경우, 주 화합물에 대한 MW와 동일한 MW를 가진 부 분해 생성물이 관찰되었다. 이들은 라세미체화된 생성물 또는 탈아미드화된 생성물일 수 있다. 그러나, 본 장치의 MS 해상도는 이를 확인하거나 부인하기에 적당하지 않았다. 또한, 이들 생성물들은 나머지 화합물들의 경우에도 존재할 수 있으나 이들이 주 피크 하에 감춰질 수 있기 때문에 검출되지 않을 수 있다.
시험된 모든 본 발명의 GLP-2 유사체는 가수분해, 산화 및 탈아미드화에 대한 스트레스 조건 하에 참조 화합물인 Gly2-GLP-2; ZP1559에 비하여 더 우수한 화학적 안정성을 가진다. 화합물 1820 및 1834는 산 가수분해로 인해 남은 6개의 후보물질보다 덜 안정하였다. 가장 높은 화학적 안정성은 아미노산 A3이 Asp가 아니라 Glu인 경우 관찰되었다.
Asp 다음의 불안정한 부위, 및 C-말단-K6을 가진 후보물질에서의 -K6의 상실 때문에 -K6이 없는 후보물질의 화학적 안정성이 약간 더 우수하다는 점을 제외하고, 남은 6개의 후보물질들의 화학적 안정성에서의 유의한 차이는 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 8: C57BL 마우스에서 화합물의 장 성장 효과에 대한 스크리닝
장 성장을 자극하는 본 발명의 화합물들의 능력을 수컷 C57BL 마우스에서 측정하였다. 마우스의 개별 군(n=6)에게 각각의 화합물 30 nmol/kg을 연속적으로 10일 동안 1일 2회씩 피하 투여하였다. 비교를 위해, 다른 군의 동물들에게 등몰 투여량의 [Gly2]GLP-2 또는 비히클(인산염 완충 식염수, pH 7.4)을 동일한 투약 섭생법으로 투여하였다. 마지막 투여량의 화합물을 투여한 지 24시간 후, 마우스를 희생시키고, 소장(유문부터 맹장까지) 및 결장(맹장으로부터 멀리 떨어져 있는 장)을 비우고 그 중량을 측정하였다. 체중(BW)에서의 근소한 차이를 보정하기 위해, 소장(SI) 및 결장의 기관 질량을 BW에 비하여 상대적으로 표시하였다. 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2는 식도, 위, 소장 및 결장에서 위장 성장을 자극하는 것으로 보고되었고, 화합물에 의해 유도된 성장 패턴의 차이를 평가하기 위해, 화합물 X의 소장-결장 감수성 지수를 다음과 같이 산출하였다:
(SI/결장)×/(SI/결장)[ Gly2 ] GLP -2 %.
소장-결장 감수성이 1.05 이상인 화합물은 소장에 대해 상대적으로 선택적인 것으로 간주되었다(하기 표 15).
소장-결장 감수성이 0.95 이하인 화합물은 결장에 대해 상대적으로 선택적인 것으로 간주되었다(하기 표 15).
Figure 112011050297638-pat00009
결과
본 발명에 따른 본 화합물의 장 성장 효과는 비선택적 참조 화합물 [Gly2]GLP-2의 등몰 투여량의 효과에 비해 상대적으로 SI 질량을 투여량 의존적으로 증가시키는 펩티드의 능력을 기초로 하여 측정하였다.
본 연구로부터 얻은 발견은 야생형 GLP-2 서열의 위치 8, 16, 24 및/또는 28에서의 아미노산 치환을 가지는 GLP-2 변이체가 C57BL 마우스에서 [Gly2]GLP-2에 비하여 증가된 생물학적 활성을 가진다는 것을 입증한다.
실시예 9: C57BL 마우스에서 장 성장에 대한 선택된 화합물들의 투여-반응 효과
1820, 1855, 1846, 1858, 1849, 1848 및 1857을 선도(lead) 화합물로서 선택하였는데, 이는 이들 화합물들이 [Gly2]GLP-2에 비해 상대적으로 소장 질량을 증가시켰고(실시예 8) 스트레스를 받는 조건 하에 [Gly2]GLP-2에 비해 상대적으로 화학적 안정성을 증가시켰기(실시예 7) 때문이다. 소장에 대한 1820, 1855, ZP1846, 1858, 1849, 1848 및 1857의 투여-반응 효과는 수컷 C57BL 마우스에서 측정하였다. 개별 마우스 군(n=6)에게 각각의 화합물 5, 15, 45, 135 또는 405 nmol/kg을 연속하여 3일 동안 1일 2회 피하 투여하였다. 비교를 위해, 다른 군의 동물들에게 등몰 투여량의 [Gly2]GLP-2 또는 비히클(인산염 완충 식염수, pH 7.4)을 동일한 투약 섭생법으로 투여하였다. 마지막 투여량의 화합물을 투여한 지 24시간 후, 마우스를 희생시키고, 소장(유문부터 맹장까지)을 비우고 그 중량을 측정하여 소장 질량에 대한 효과를 측정하였다.
결과
참조 화합물 [Gly2]GLP-2의 효과에 비해 상대적으로 소장에 대한 1820, 1855, 1846, 1858, 1849, 1848 및 1857의 효과를 도 1 내지 5에 도시하였다. 시험된 투여량 각각에서, 소장 질량에 대한 [Gly2]GLP-2의 효과를 100%로 표준화하였다. 본 발명에 따른 화합물 1820, 1855, 1846, 1858, 1849, 1848 및 1857의 장 성장 효과를 [Gly2]GLP-2의 등몰 투여량의 효과에 비해 상대적으로 SI 질량을 투여량 의존적으로 증가시키는 펩티드의 능력을 기초로 하여 측정하였다. 이 발견을 기초로 하여, 본 발명자들은 8개의 치환(GLP-2 1809의 경우 G2, E3, T5, L10, A11 , A16, A24, A28)을 함유하는 GLP-2 유사체를 [Gly2]GLP-2로 처리된 마우스에 비해 소장의 중량을 유의하게 증가시킨다는 결론을 내릴 수 있었다.
특히, Asp3의 Glu으로의 치환 Asn16의 Ala으로의 치환 및 Gln28의 Ala으로의 치환은 결장에 비해 선택적인 방식으로 소장의 중량을 증가시켰다(1839 또는 1840과 1809의 비교). 따라서, 3개의 아미노산 Asp3, Asn16 및 Gln28의 치환은 결장 질량에 비해 상대적으로 소장 중량을 선택적으로 증가시켰다.
나아가, Asp8의 세린으로의 치환은 상기 선택성을 더 증가시킴으로써 결장의 중량에 유의하게 영향을 주지 않으면서 소장의 중량을 보충적으로 증가시켰다(1818, 1820, 1844, 1846, 1848, 1849, 1852, 1853, 1855, 1858).
도 1 내지 4는 SI-BW 대 결장-BW 비에 대한 예시된 화합물 1846, 1855, 1848, 1857 및 1849의 투여-반응 효과가 참조 화합물 [Gly2]GLP-2에 비해 상대적으로 도시되어 있는 실험의 결과를 도시한다. 시험된 투여량 각각에서, 소장 질량에 대한 [Gly2]GLP-2의 효과를 100%로 표준화하였다. 예시된 화합물 모두가 위치 8, 16 및/또는 28에서의 변형을 공유하고 결장에 비해 상대적으로 소장의 성장 자극에 대해 증가된 선택성을 보인다.
실시예 10: 5- FU 를 투여받은 마우스에서 소장 위축증에 대한 1846, 1848, 1855 및 1857의 투여-반응 효과
소장 줄기세포의 증식의 빠른 속도는 상기 줄기세포를 항암요법에 사용되는 화학요법제의 세포독성 효과에 민감한 표적으로 만든다. 따라서, 화학요법제 5-플루오로우라실(5-FU)의 임상적 사용이 종종 암 환자에서 소장 손상(위축증 및 설사)과 관련된다. 본 발명자들은 4일 동안 1일 1회씩 50 mg/kg의 5-FU를 복강 내로 투여하는 것이 C57BL 마우스에서 유의한 소장 위축증을 유도한다는 것을 이미 밝혔다. 5-FU 유도 소장 위축증에 대한 선도 화합물 1846, 1848, 1855 및 1857의 효과는 마우스에서 조사되었다. 본 발명자들은 4일 동안 1일 1회씩 50 mg/kg의 5-FU를 복강 내로 투여하는 것이 C57BL 마우스에서 유의한 소장 위축증을 유도한다는 것을 이미 밝혔다. 1846, 1848, 1855 또는 1857을 5-FU 전에 3일 동안 및 5-FU 투여와 함께 4일 동안 1일 2회씩 투여하였다. 선도 화합물은 건강한 마우스에서 소장 성장을 효과적으로 자극하는 것으로 이미 밝혀진(실시예 9) 5가지 상이한 투여량(5, 15, 45, 135 및 405 nmol/kg)으로 각각 투여되었다. 비교를 위해, 일군의 동물들을 405 nmol/kg의 [Gly2]GLP-2로 처리하였다. 소장에 대한 5-FU의 효과를 측정하기 위해, 동물 군에게 5-FU를 단독 투여하고 미처리된 상태로 남기고(5-FU 대조군), 또 다른 일군의 동물들에게 비히클만을 투여하였다(PBS 대조군).
결과
5-FU는 C57BL 마우스에서 PBS 대조군에 비해 상대적으로 SI-BW 및 SI 길이의 유의한 감소를 유도하였다. 5-FU를 투여받은 마우스에서 SI-BW 및 SI 길이에 대한 1846, 1848, 1855 또는 1857의 투여-반응 효과는 도 6 내지 9에 도시되어 있다. 405 nmol/kg의 [Gly2]GLP-2의 효과 또한 도시되어 있다. 1846, 1848, 1855 또는 1857은 5-FU 유도 SI 위축증을 투여량 의존적으로 예방하였고 PBS 대조군과 유사한 수준으로 SI-BW를 유지하였다. 등몰 투여량으로 투여된 ZP1848, ZP1855 및 ZP1857은 SI-BW에 대해 405 nmol/kg의 [Gly2]GLP-2보다 훨씬 더 효과적이었다. 1848 및 1857은 SI-길이에 대해 405 nmol/kg의 [Gly2]GLP-2보다 훨씬 더 효과적이었다.
실시예 11: 5- FU 를 투여받은 SD 래트에서 소장 위축증 및 설사에 대한 1846의 투여-반응 효과
5-FU 유도 소장 위축증 및 설사에 대한 임상 후보물질 1846의 효과를 SD 래트에서 조사하였다. 본 발명자들은 4일 동안 1일 1회씩 75 mg/kg의 5-FU를 복강 내로 투여하는 것이 SD 래트에서 유의한 소장 위축증 및 설사를 유도한다는 것을 이미 밝혔다. 1846(16, 80 및 400 nmol/kg/일; n= 20 마리 래트/투여군)을 5-FU 전에 3일 동안 및 5-FU 투여와 함께 4일 동안 1일 2회씩 투여하였다. 5-FU 대조군 및 PBS 대조군을 본 연구에 포함시켰다. 1846의 마지막 투여량을 투여한 지 24시간 후, 하위군의 동물들을 희생시켜 소장 위축증에 대한 1846의 효과를 측정하였다. 설사에 대한 1846의 효과를 측정하기 위해, 모든 동물들을 투여 기간 및 추가 6일 동안 1일 2회씩(아침 및 저녁) 관찰하였다. 각각의 관찰 기간에서, 동물들의 설사 여부 및 설사의 심각도를 나타내는 스코어(0, 설사 없음, 1(약한 설사), 항문 주위를 더럽히는 배설물, 2(중간 정도의 설사), 뒷다리 및 꼬리를 더럽히는 배설물, 및 3(심각한 설사) 앞다리 및 복강을 더럽히는 배설물)를 각각의 동물들에게 부여하였다.
결과
5-FU는 SD 래트에서 PBS 대조군에 비해 상대적으로 SI-BW 및 SI 길이의 유의한 감소를 유도하고 설사를 유도하였다. 5-FU 유도 소장 위축증 및 설사에 대한 1846의 투여-반응 효과는 도 10 및 11에 도시되어 있다. 1846은 5-FU 유도 소장 위축증을 투여량 의존적으로 예방하였고 대조군과 유사한 수준으로 SI-BW 및 SI 길이를 유지하였다. 투여된 최대 투여량(400 nmol/kg)에서, 1846은 5-FU를 투여받은 래트에서 설사의 발병률 및 심각도를 감소시켰다.
실시예 12: SD 래트의 소장에서 장샘 -융모 길이 및 근육 두께에 대한 1846의 투여-반응 효과
SD 래트의 소장에서 장샘-융모 길이 및 근육 두께에 대한 임상 후보물질 1846의 효과를 조사하였다. 1846(0.62, 3.41 또는 6.2 mg/kg/일; n= 6 마리 래트/투여군)을 연속적으로 5일 동안 1일 1회씩 정맥내 볼루스(bolus)로서 투여하였다. 마지막 투여량을 투여한 지 24시간 후, 래트를 희생시키고, 조직학적 처리를 위해 1 cm의 생검을 공장(위 십이지장 접합부로부터 30 cm 떨어져 있음) 및 회장(회장맹장 접합부로부터 30 cm 떨어져 있음)으로부터 절개하였다.
결과
공장 및 회장에서 장샘-융모 길이 및 근육 두께에 대한 1846의 투여-반응 효과는 도 12에 도시되어 있다. 1846은 공장에서 평균 장샘-융모 길이를, 회장에서 회장 근육 두께를 투여량 의존적으로 증가시켰다.
실시예 13: 인도메타신에 의해 유도된 크론병 모델에서 소장 염증의 마커에 대한 1848의 효과
크론병은 소장의 일시적 염증을 초래하는 만성 질환이다. 인도메타신에 의해 유도된 크론병 모델에서 소장 염증에 대한 GLP-2 유사체 1848의 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 인도메타신의 투여(2일 동안 1일 1회씩 피하 투여)가 궤양 형성, 및 전구-염증성 시토킨인 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)에서의 증가를 특징으로 하는 소장 염증을 유도한다는 것을 이미 밝혔다. 궤양 형성에 대한 ZP1848의 효과를 측정하기 위해, 1848(8, 40 및 200 nmol/kg; 1일 2회씩 피하 투여(9:00 및 16:00))을 인도메타신의 첫 번째 투여 전 4일 동안 및 인도메타신과 함께 추가 2일 동안 투여하였다. 코르티코스테로이드가 크론병에서 활성 염증의 치료를 위해 통상적으로 사용되기 때문에, 코르티코스테로이드인 프레드니졸론(10 mg/kg, 비경구 투여)을 양성 대조군으로서 사용하였다. 추가로, 조합 치료의 효과를 측정하기 위해 1848(200 nmol/kg) 및 프레드니졸론 둘 다를 일군의 동물들에게 투여하였다. 1848의 마지막 투여량을 투여한 지 24시간 후, 동물들을 희생시키고, 소장을 약하게 물로 씻어 깨끗하게 하고 고정시켰다. 궤양 형성의 정도를 측정하기 위해, 소장을 장간막대측 가장자리를 따라 절개하여 개방하고, 폴리프로필렌 플레이트 상에 현탁시키고, 알시안 그린 3BX로 표면 염색하였다. 유문에서 시작하여, 소장을 스캐닝하고, 모든 궤양의 형태(원형 대 선형) 및 크기(원형 궤양: 직경, 선형 궤양: 길이 × 폭)를 표준 자를 이용하여 측정하였다(해상도: 0.5 mm). 궤양은 상피 표면이 없는 면적으로서 정의되었다. 마지막으로, 총 손상된 면적을 모든 개별 궤양의 면적을 합하여 각각의 동물에 대해 계산하였다.
소장에서 TNF-α의 농도에 대한 1848의 효과를 측정하기 위해, 1848 및 인도메타신을 전술한 바와 같이 투여하였다. 그러나, 희생시킬 때, 소장을 동등한 길이의 3개의 절편(근위 절편, 중위 절편 및 원위 절편)으로 분리하였다. TNF-α 농도는 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 개별 절편들 각각에서 측정하였다.
결과
인도메타신은 대조군에 비해 소장 궤양의 강한 유도를 초래하였다(평가된 궤양 형성 정도 = 333±21 mm2 대 10 mm2). 평가된 궤양 형성 정도(mm2)에 대한 1846의 효과는 도 13에 도시되어 있다. 1848을 사용한 처리(8, 40 및 200 nmol/kg)는 궤양 형성의 정도를 유의하게 감소시켰다(각각 230+12 mm2, 216±17 mm2, 및 178+17 mm2, 인도메타신에 비해 상대적인 p<0.001). 최대 투여량(200 nmol/kg)에서, 사용된 ZP1848은 양성 대조군인 프레드니졸론보다 더 효과적이었다(p<0.05).
인도메타신은 대조군 동물(34±7 pg/mg 단백질, 인도메타신에 비해 상대적인 p<0.05)에 비해 근위 절편에서 TNF-α의 조직 농도를 대략 2.9배 증가시켰다(97±14 pg/mg 단백질). 소장 TNF-α 농도에 대한 1846의 효과는 도 14에 도시되어 있다. 1848(8, 40 또는 200 nmol/kg)을 사용한 치료는 3가지 투여량 사이에 유의한 차이를 보이지 않으면서 TNF-α의 조직 농도를 유의하게 감소시켰다(각각 45±14 pg/mg 단백질, 44±9 pg/mg 단백질 및 45±7 pg/mg 단백질).
인도메타신은 대조군 동물(34±6 pg/mg 단백질, 인도메타신에 비해 상대적인 p<0.05)에 비해 중위 절편에서 TNF-α의 조직 농도를 대략 3.2배 증가시켰다(108±9 pg/mg 단백질). 1848(40 또는 200 nmol/kg)은 TNF-α의 조직 농도를 각각 유의하게 감소시켰다(인도메타신에 비해 상대적인 p<0.05).
인도메타신은 대조군 동물(45±3 pg/mg 단백질, 인도메타신에 비해 상대적인 p<0.05)에 비해 원위 절편에서 TNF-α의 조직 농도를 대략 1.7배 증가시켰다(75±5 pg/mg 단백질). 1848은 원위 절편에서 TNF-α 수준에 대한 억제 효과를 나타내었지만, 이 효과는 다른 절편들에 비해 덜 뚜렷하였다. 프레드니졸론은 단독으로는 모든 3개의 절편에서 TNF-α의 조직 농도에 유의하게 영향을 주지 못하였지만, 프레드니졸론 투여는 원위 절편에서 TNF-α 농도에 대한 1848(200 nmol/kg)의 억제 효과를 개선시켰다.
실시예 14
히스티딘, 만니톨 및 아세테이트 제형 중의 ZP1846, 10 mg/㎖의 제형화
1. 800 ㎖(WFI) 물을 1 ℓ 비이커에 채웠다.
2. 비이커 중에서 13.964 g의 L-히스티딘을 계량하여 상기 1 ℓ 비이커에 첨가하였다.
3. 비이커 중에서 32.200 g의 만니톨을 계량하여 상기 1 ℓ 비이커에 첨가하였다.
4. 629 ㎕의 100% 아세트산을 상기 1 ℓ 비이커에 직접 첨가하거나 12.58 g의 5%(중량/부피) 아세트산 용액을 계량하여 상기 비이커에 첨가하였다.
6. 대략 950 ㎖까지 채웠다.
7. pH를 측정하고, 필요한 경우 10% 아세트산 또는 0.25 M의 히스티딘으로 pH 6.9 내지 7.0으로 조정하였다.
8. 11.312 g의 약물(펩티드 함량 88.4%)을 계량하여 상기 비이커에 첨가하였다.
9. 1.015 kg(= 대략 1000 ㎖)까지 채우고 pH, 삼투압 및 밀도를 측정하였다.
10. 제형을 직렬로 연결된 2개의 멸균 필터를 통해 멸균 여과하였다.
11. LAF 벤치 내에서 제형을 0.5 ㎖씩 분취하여 2 ㎖의 약학적으로 승인된 바이알 내로 분배하였다.
12. 동결 건조 정지장치(stopper)를 부분적으로 배치한 후, 멸균되고 4℃로 예비냉각된 동결건조기 내로 적재하였다.
13. 동결 주기, 어닐링(annealing) 주기, 1차 건조 주기 및 2차 건조 주기로 구성된 동결건조 사이클을 40.5시간에 걸쳐 진행시켰다. 바이알을 동결건조기 챔버 내에서 유지하면서 질소 하에 마개를 덮었다.
14. 바이알을 분류하고, 철저히 밀봉하고 크림프(crimps)를 인가하였다.
실시예 15
히스티딘, 아르기닌, 만니톨 및 트레할로스 중의 ZP1846, 10 mg/㎖의 제형화
1. 800 ㎖(WFI) 물을 1 ℓ 비이커에 채웠다.
2. 비이커 중에서 6.206 g의 L-히스티딘을 계량하여 상기 1 ℓ 비이커에 첨가하였다.
3. 비이커 중에서 3.484 g의 L-아르기닌을 계량하여 상기 1 ℓ 비이커에 첨가하였다.
4. 비이커 중에서 33.46 g의 만니톨을 계량하여 상기 1 ℓ 비이커에 첨가하였다.
5. 비이커 중에서 11.16 g의 트레할로스를 계량하여 상기 1 ℓ 비이커에 첨가하였다.
6. 대략 950 ㎖까지 채웠다.
7. pH를 측정하고, 필요한 경우 10% 아세트산 또는 0.25 M의 히스티딘으로 pH 6.9 내지 7.0으로 조정하였다.
8. 11.312 g의 약물(펩티드 함량 88.4%)을 계량하여 상기 비이커에 첨가하였다.
9. 1.015 kg(= 대략 1000 ㎖)까지 채우고 pH, 삼투압 및 밀도를 측정하였다.
10. 제형을 직렬로 연결된 2개의 멸균 필터를 통해 멸균 여과하였다.
11. LAF 벤치 내에서 제형을 0.5 ㎖씩 분취하여 2 ㎖의 약학적으로 승인된 바이알 내로 분배하였다.
12. 동결 건조 정지장치를 부분적으로 배치한 후, 멸균되고 4℃로 예비냉각된 동결건조기 내로 적재하였다.
13. 동결 주기, 어닐링 주기, 1차 건조 주기 및 2차 건조 주기로 구성된 동결건조 사이클을 40.5시간에 걸쳐 진행시켰다. 바이알을 동결건조기 챔버 내에서 유지하면서 질소 하에 마개를 덮었다.
14. 바이알을 분류하고, 철저히 밀봉하고 크림프를 인가하였다.
본 발명은 전술된 예시적 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 본 개시내용이 제공될 때 많은 등가의 변형 및 변경이 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 전술된 본 발명의 예시적 실시양태는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 발명의 기술적 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 전술된 실시양태를 다양하게 변화시킬 수 있다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌들은 명백히 참고로 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Zealand Pharma A/S Larsen, Bjarne D Petersen, Yvette M <120> Glucagon-Like-Peptide-2 (GLP-2) Analogues <130> GRFFP6379127 <140> PCT/GB2006/001633 <141> 2006-05-04 <150> US 06/678,066 <151> 2005-05-04 <160> 54 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 2 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> General Formula I of PCT/GB2006/001633 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Attached to R1, where R1 is hydrogen, C1-4 alkyl (e.g. methyl), acetyl, formyl, benzoyl or trifuoroacetyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> May be absent. If present, any 17 Xaas may be absent - indicates a range of 3 - 20 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> Each Xaa may independently be selected from the group consisting of Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met and Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa is Gly, Ala or MeGly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Glu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa is Phe or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Asp or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Glu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is Met, Leu, Nle, or an oxidatively stable Met-replacement amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Asn, Ala, Lys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is Thr or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is Ile, Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is Leu, Met or Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa is Asn or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa is Leu or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Ala or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa is Ala or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa is Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa is Asp or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Asn, Ala or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa is Gln, Ala or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa is Pro, Ile or deleted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is Thr or deleted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa is Asp, Asn or deleted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(73) <223> May be absent. If present, any 17 Xaas may be absent - indicates a range of 3 - 20 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(73) <223> Each Xaa may independently be selected from the group consisting of Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met and Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> Attached to R2, where R2 is NH2 or OH <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Ile Xaa 35 40 45 Thr Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 <210> 3 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> General Formula II of PCT/GB2006/001633 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Attached to R1, where R1 is hydrogen, C1-4 alkyl (e.g. methyl), acetyl, formyl, benzoyl or trifuoroacetyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> May be absent. If present, any 17 Xaas may be absent - indicates a range of 3 - 20 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> Each Xaa may independently be selected from the group consisting of Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met and Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Glu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Asp or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Glu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is Met, Leu, Nle, or an oxidatively stable Met-replacement amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Asn, Ala, Lys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is Thr or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is Ile, Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa is Leu, Met or Nle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa is Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa is Asn or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa is Leu or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa is Ala or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Asn or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa is Gln, Ala or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa is Pro, Ile or deleted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is Thr or deleted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa is Asp or deleted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(73) <223> May be absent. If present, any 17 Xaas may be absent - indicates a range of 3 - 20 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(73) <223> Each Xaa may independently be selected from the group consisting of Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met and Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> Attached to R2, where R2 is NH2 or OH <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa His Gly Xaa Gly Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Arg Asp Phe Ile Xaa Trp Leu Ile Xaa 35 40 45 Thr Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 <210> 4 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> General Formula III of PCT/GB2006/001633 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Attached to R1, where R1 is hydrogen, C1-4 alkyl (e.g. methyl), acetyl, formyl, benzoyl or trifuoroacetyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> May be absent. If present, any 17 Xaas may be absent - indicates a range of 3 - 20 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> Each Xaa may independently be selected from the group consisting of Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met and Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa is Glu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is Asp or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa is Met, Leu, Nle, or an oxidatively stable Met-replacement amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Asn, Ala, Lys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa is Asn or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa is Asn or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa is Gln or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa is Pro or deleted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is Thr or deleted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa is Asp or deleted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(73) <223> May be absent. If present, any 17 Xaas may be absent - indicates a range of 3 - 20 amino acids <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(73) <223> Each Xaa may independently be selected from the group consisting of Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met and Orn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> Attached to R2, where R2 is NH2 or OH <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa His Gly Xaa Gly Xaa Phe Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Thr 20 25 30 Ile Leu Asp Xaa Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Xaa Trp Leu Ile Xaa 35 40 45 Thr Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 <210> 5 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Reference GLP-2 analogue <400> 5 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 6 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 7 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 7 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Ile Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 8 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 8 His Gly Asp Gly Ser Pro Ser Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 9 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 9 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 10 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 10 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 11 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 11 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 12 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 12 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 13 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 13 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 14 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 14 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 15 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 15 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 16 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 16 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 17 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 17 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 18 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 18 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 19 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 19 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 20 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 20 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 21 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 22 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 22 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 23 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 23 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 24 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 24 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 25 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 26 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 27 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 28 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 29 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 30 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 31 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 32 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 32 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 33 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 33 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 34 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 35 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 35 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 36 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 36 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys 20 25 30 <210> 37 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 37 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 38 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 38 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Asp Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 39 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 39 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 40 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 40 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 41 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 41 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 42 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 42 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 43 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 43 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 44 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 44 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Asp Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 45 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 45 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 46 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 46 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 47 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 47 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Asp Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 48 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 48 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 49 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 49 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 50 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 50 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 51 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 51 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 52 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 52 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 53 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 53 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Asp Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 54 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Example of GLP-2 analogue <400> 54 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp

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  8. 다음의 서열로 표현되는 글루카곤 유사 펩티드-2(GLP-2) 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    1830 H-HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2;
    1831 H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2;
    1835 H-HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2;
    1836 H-HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2;
    1841 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2;
    1843 H-HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2.
  9. 담체와 혼합된, 제8항의 GLP-2 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 위 또는 장 관련 장애의 치료를 위한 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 위 또는 장 관련 장애는 궤양, 위염, 소화 장애, 흡수장애(malabsorption) 증후군, 짧은 창자 증후군, 맹관(cul-de-sac) 증후군, 염증성 장 질환, 비열대성 스프루우(celiac sprue), 열대성 스프루우, 저감마글로불린혈증성 스프루우, 장염, 국소성 장염(크론병), 궤양성 결장염, 설사와 연관된 과민성 대장 증후군, 소장 손상, 단장 증후군, 방사선 장염, 감염성 장염 또는 감염 후 장염인 것인 약학 조성물.
  11. 담체와 혼합된, 제8항의 GLP-2 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 화학요법 또는 방사선요법의 부작용의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 화학요법 또는 방사선요법의 부작용이 화학요법으로 의한 설사, 복부 경련 또는 구토, 또는 화학요법 또는 방사선요법으로부터 발생된 장 상피의 구조적 및 기능적 손상인 것인 약학 조성물.
  13. 신생아의 손상된 장 기능, 골다공증 또는 DPP-IV(디펩티딜펩티다제-IV) 매개 증상을 치료하기 위한, 또는 영양실조가 관여하는 증상을 치료 또는 예방하기 위한, 담체와 혼합된, 제8항의 GLP-2 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학 조성물.
  14. 제8항의 GLP-2 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  15. 제14항의 핵산 분자를, 이의 발현을 지시하는 조절 서열과 함께 배합하여 포함하는 발현 벡터.
  16. 제15항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  17. 암 화학요법 약물, 및 제8항의 GLP-2 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 치료용 키트.
  18. 암 화학요법 약물, 및 제8항의 GLP-2 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  19. 삭제
  20. 제13항에 있어서, 상기 영양실조가 관여하는 증상은 악액질(cachexia) 또는 식욕부진(anorexia)인 것인 약학 조성물.
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