EA014184B1 - Аналоги глюкагонподобного пептида-2 (glp-2) - Google Patents

Аналоги глюкагонподобного пептида-2 (glp-2) Download PDF

Info

Publication number
EA014184B1
EA014184B1 EA200702408A EA200702408A EA014184B1 EA 014184 B1 EA014184 B1 EA 014184B1 EA 200702408 A EA200702408 A EA 200702408A EA 200702408 A EA200702408 A EA 200702408A EA 014184 B1 EA014184 B1 EA 014184B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
analogue
olp
leyu
acre
small intestine
Prior art date
Application number
EA200702408A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200702408A1 (ru
Inventor
Бьярн Дюе Ларсен
Иветт Миата Петерсен
Кирстен Еббехой
Original Assignee
Зеаланд Фарма А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36649773&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA014184(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Зеаланд Фарма А/С filed Critical Зеаланд Фарма А/С
Publication of EA200702408A1 publication Critical patent/EA200702408A1/ru
Publication of EA014184B1 publication Critical patent/EA014184B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/22043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/20243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

Описаны аналоги GLP-2, включающие один или более заместитель по сравнению c [hGly2]GLP-2, обладающие улучшенной биологичесой активностью in vivo и/или улучшенной химической стабильностью, оцененной in vitro анализом на стабильность. В частности, описанные здесь предпочтительные аналоги GLP-2 включают заместители в одной или более позиции 8, 16, 24 и/или 28 последовательности дикого типа GLP-2, необязательно в комбинации с дополнительными заместителями в позиции 2 (как указано во введении) и в одной или более позиции 3, 5, 7, 10 и 11 и/или удаление одной или более аминокислоты 31-33 и/или присоединение к N-концу или С-концу стабилизирующей пептидной последовательности. Аналоги особенно полезны для профилактики или лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта и для снижения побочных эффектов химиотерапии.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к аналогам глюкагонподобного пептида-2 (ОЬР-2) и их медицинскому применению, например, в профилактике или лечении желудочно-кишечных заболеваний и для снижения побочных эффектов химиотерапии и лучевой терапии.
Уровень техники, предшествующий изобретению
ОЬР-2 представляет собой пептид, состоящий из 33 аминокислот, выделяющийся в посттрансляционном процессинге проглюкагона в кишечных Ь энтероэндокринных клетках и определенных областях ствола головного мозга. Он секретируется совместно с глюкагонподобным пептидом-1 (ОЬР-1), оксинтомодулином и глицентином в ответ на прием нутриента.
ОЬР-2 индуцирует значительный рост эпителиальной ткани слизистой оболочки тонкого кишечника посредством стимуляции пролиферации стволовых клеток в криптах и ингибирования апоптоза на ворсинках (Огисксг е! а1. Ргос №111 АсаБ 8е1 АсаБ 8е1 И8А. 1996, 93:7911-6). ОЬР-2 также ингибирует эвакуацию из желудка и секрецию кислоты желудочного сока (\Уо)Бетапп е! а1. 1 С1ш ЕиБосгшо1 Ме1аЬ. 1999, 84:2513-7), усиливает функцию интестинального барьера (Вещатш е! а1. Ои1. 2000, 47:112-9), стимулирует транспорт гексозы в кишечнике путем повышения регуляции переносчиков глюкозы (Сйеекетаи, Ат 1 Рйу8ю1. 1997, К.1965-71) и увеличивает ток крови в кишечнике (Оиаи е! а1. Оа8!тоеи!его1о§у. 2003, 125, 136-47).
ОЬР-2 связывается с О-белок сопряженным рецептором, принадлежащим к классу II семейства глюкагона-секретина (1). Рецептор ОЬР-2 локализован только в тонком кишечнике, толстой кишке и желудке, участках, известных как ответственные за ОЬР-2 (Уи81а е! а1. Оа81тоеи!его1о§у. 2000,119:744-55). Однако остается неясным механизм стимуляции клетки-мишени рецептора ОЬР-2 в желудочнокишечном тракте и плохо понятны внутриклеточные медиаторы прямого направления, сопряженные с рецептором ОЬР-2.
Демонстрация специфических и благоприятных эффектов ОЬР-2 в тонком кишечнике вызвала сильный интерес к использованию ОЬР-2 для лечения кишечных заболеваний или поражений. Кроме того, было выявлено на целом ряде преклинических моделей повреждений кишечника, включая мукозиты, индуцированные химиотерапией, повреждения, вызванные ишемией-реперфузией, колиты, вызванные сульфатом декстрана, и генетические модели воспалительных заболеваний кишечника, что ОЬР-2 предотвращает или снижает повреждения эпителиальных тканей слизистой (8шс1а1т аиБ Ьгискег. РЬу8ю1оду 2005:357-65). ОЬР-2 секретируется как пептид из 33 аминокислот с следующей последовательностью: Н-НЬ-АкьАкр-СК-Зег-Рйе-Зег-Акр-Ши-МеЬАщ-Тйг-Пе-Ьеи-Акр-Ащ-Ьеи-АЫ-АЬ-Агд-Акр-Рйе-ПеА8η-Τ^ρ-^еи-I1е-01η-Τй^-^у8-I1е-Τй^-А8ρ-0Η. Инактивация человеческого ОЬР-2 (3-33) ферментом ЭРР IV происходит за счет быстрого отщепления у аланина в положении 2 ΝΗ2 группы. Эта быстрая ферментативная деградация ОЬР-2 (1-33) в дополнение к почечному клиренсу ведет к тому, что период полужизни для пептида составляет около 7 мин (Тауатек е! а1., Ат. 1. Рйукуок ЕиБостшо1. Ме!аЬ. 278:Е134Е139, 2000).
В патенте США 5994500 (Эгискег е! а1.) описываются антагонисты ОЬР-2 и их воздействие на рост тканей желудочно-кишечного тракта. Предполагалось, что антагонисты входят в состав фармацевтических препаратов, используемых для лечения гиперплазии или индуцирования гипоплазии. В патенте США 5994500 структура ОЬР-2 млекопитающих была изменена мутациями, такими как замещения и делеции.
В патентах США 6184208, 5789379 и 6184201 описываются аналоги ОЬР-2 и их медицинское применение. Все аналоги получены замещениями и/или делециями в человеческом ОЬР-2.
ИаСатЬта е! а1. (ВюсйетШту 2000, 39, 8888-8894) описывает структурные детерминанты активности ОЬР-2. Примерами таких детерминант являются Рйе6 и Тйт5, которые отвечают за связывание и активацию рецептора ОЬР-2.
В νθ 97/39031 описан аналог ОЬР-2 [О1у2]ОЬР-2, где аланин в позиции 2 был замещен глицином с получением пептида, устойчивого к расщеплению ОРРШ. Замещение аланина приводит к росту стабильности и активности пептида. Патентная заявка описывает использование аналога ОЬР-2 при лечении заболеваний, связанных с воспалением и разрушением эпителия слизистой оболочки кишечника. Последние включают все виды резекции тонкого кишечника, воспалительные заболевания кишечника, мукозиты, вызванные химиотерапией, и повреждения, вызванные ишемией.
В νθ 02/066511 описаны аналоги ОЬР-2, имеющие продленный период полужизни ш у1уо, и их применение в качестве медикаментов при лечении желудочно-кишечных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника.
νθ 01/41779 описывает использование 11|С1у2| ОЬР-2 для профилактики ингибирования апоптоза, индуцированного химиотерапией, и стимуляции способности клеток к выживанию.
Все цитированные здесь ссылки введены в полном объеме.
Многие ученые предлагали применение ОЬР-2 или аналогов ОЬР-2 для лечения различных заболеваний. Однако все еще существует потребность в улучшенных и стабильных аналогах ОЬР-2.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к аналогам ОЬР-2, которые включают один или более заместите
- 1 014184 лей по сравнению с диким типом ОЬР-2 и которые обладают улучшенной биологической активностью ίη νίνο и/или улучшенной химической стабильностью, например, определяемой пробой на стабильность ίη νίΐΓο. В частности, предпочтительные аналоги ОЬР-2 включают заместители в одной или более позициях 8, 16, 24 и/или 28 последовательности ОЬР-2 дикого типа необязательно в комбинации с дополнительными замещениями позиции 2 (как упомянуто во введении) и одной или более позиций 3, 5, 7, 10 и 11, и/или одной или более делецией аминокислот в позициях 31-33 последовательности ОЬР-2 дикого типа, и/или дополнением Ν-конца или С-конца, стабилизирующим пептидную последовательность. Также и к аналогам, имеющим улучшенную химическую стабильность и/или биологическую активность, настоящее изобретение также относится к соединениям, обладающим способностью увеличивать рост тканей в тонком кишечнике по сравнению с толстым кишечником и наоборот, в частности, включая модификацию одной или более позиций Азр3, и/или Зег8, и/или Азп16, и/или Азп24, и/или С1п28 последовательности ОЬР-2 дикого типа.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к аналогу ОЬР-2, представленному общей формулой I
Κ[-Ζι-Ηίκ-Χ2-Χ3-αΐγ-Χ5-Χ6-Χ7-Χ8-Χ9-Χ10-Χ11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17А1а-Х19-Х20-Х21 -РЬе-11е-Х24-Тгр-Ьеи-Пе-Х28-Т11г-Ьу8-ХЗ 1 -Χ32-Χ33-Ζ2-Β2, где В1 представляет собой водород, С1-4 алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил.
Х2 представляет собой О1у, А1а или Заг.
Х3 представляет собой О1и или Азр.
Х5 представляет собой Зег или ТЬг.
Х6 представляет собой РЬе или Рго.
Х7 представляет собой Зег или ТЬг.
Х8 представляет собой Азр или Зег.
Х9 представляет собой О1и или Азр.
Х10 представляет собой Ме1. Ьеи, ΝΕ или стабильно окисленную МеРзамещенную аминокислоту.
Х11 представляет собой Азп, А1а, Ьуз или Зег.
Х12 представляет собой ТЬг или Ьуз.
Х13 представляет собой Не, О1и или От.
Х14 представляет собой Ьеи, Ме1 или Ме.
Х15 представляет собой Азр или С1и.
Х16 представляет собой Азп или А1а.
Х17 представляет собой Ьеи или С1и.
Х18 представляет собой А1а или А1Ь.
Х19 представляет собой А1а или ТЬг.
Х20 представляет собой Агд или Ьуз.
Х21 представляет собой Азр или Не.
Х24 представляет собой Азп, А1а или С1и.
Х28 представляет собой Ош, А1а или Азп.
Х31 представляет собой Рго, 11е или удален.
Х32 представляет собой ТЬг или удален.
Х33 представляет собой Азр, Азп или удален.
В2 представляет собой ΝΗ2 или ОН.
Ζ1 и Ζ2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 3-20 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из А1а, Ьеи, Зег, ТЬг, Туг, Азп, О1п, Азр, О1и, Ьуз, Агд, Н1з, Ме! и Огп;
где аналог ОЬР-2 включает один или более заместитель, выбранный из Х8, представляющий собой Зег, и/или Х16, представляющий собой А1а, и/или Х24, представляющий собой А1а, и/или Х28 представляющий собой А1а;
или его фармацевтически приемлемая соль, или производное.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогу ОЬР-2, представленному общей формулой II
К'-г’-Н1з-О1у-ХЗ-О1у-Х5-Р11е-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17А1а-Х 19-Аг£-А8р-РЬе-11е-Х24-Тгр-Ьеи-Ие-Х28-Ткг-Ьу8-ХЗ 1-Χ32-Χ3 3 -Ζ2-Κ2, где В1 представляет собой водород, С1-4 алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил.
Х3 представляет собой О1и или Азр.
Х5 представляет собой Зег или ТЬг.
Х7 представляет собой Зег или ТЬг.
Х8 представляет собой Азр или Зег.
Х9 представляет собой О1и или Азр.
- 2 014184
Х10 представляет собой Мс1. Ьеи, Ν1ο или стабильно окисленную Ме1-замещенную аминокислоту.
Х11 представляет собой Аки, А1а, Ьук или 8ег.
Х12 представляет собой ТНг или Ьук.
Х13 представляет собой Не, О1и или О1п.
Х14 представляет собой Ьеи, Ме1 или Ν1ο.
Х15 представляет собой Акр или О1и.
Х16 представляет собой Акп или А1а.
Х17 представляет собой Ьеи или О1и.
Х19 представляет собой А1а или ТЬг.
Х24 представляет собой Акп или А1а.
Х28 представляет собой О1п, А1а или Акп.
Х31 представляет собой Рго, 11е или удален.
Х32 представляет собой ТЬг или удален.
Х33 представляет собой Акр или удален.
К2 представляет собой ΝΗ2 или ОН.
Ζ1 и Ζ2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 3-20 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из А1а, Ьеи, 8ег, ТЬг, Туг, Акп, О1п, Акр, О1и, Ьук, Агд, Н1к, Ме1 и Огп;
где аналог ОЬР-2 включает один или более заместитель, выбранный из Х8, представляющий собой 8ег, и/или Х16, представляющий собой А1а, и/или Х24, представляющий собой А1а, и/или Х28, представляющий собой А1а;
или его фармацевтически приемлемая соль, или производное.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогу ОЬР-2, представленному общей формулой III
К1^1-Н1к-О1у-Х3-О1у-Х5-РЬе-Х7-Х8-О1и-Х10-Х11-ТЬг-Пе-Ьеи-Акр-Х16-Ьеи-А1а-А1а-Агд-Акр-РЬе-ПеХ24-Тгр-Ьеи-Пе-Х28-ТЬг-Ьук-Х31-Х32-Х33^2-К2, где К1 представляет собой водород, С!-4 алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил.
Х3 представляет собой О1и или Акр.
Х5 представляет собой 8ег или ТЬг.
Х7 представляет собой 8ег или ТЬг.
Х8 представляет собой Акр или 8ег.
Х10 представляет собой Ме1, Ьеи, Ν1ο или стабильно окисленную Ме1-замещенную аминокислоту.
Х11 представляет собой Акп, А1а, Ьук или 8ег.
Х24 представляет собой Акп или А1а.
Х28 представляет собой О1п или А1а.
Х31 представляет собой Рго или удален.
Х32 представляет собой ТЬг или удален.
Х33 представляет собой Акр или удален.
К2 представляет собой ΝΗ2 или ОН.
Ζ1 и Ζ2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 3-20 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из А1а, Ьеи, 8ег, ТЬг, Туг, Акп, О1п, Акр, О1и, Ьук, Агд, Н1к, Ме1 и Огп;
где аналог ОЬР-2 включает один или более заместитель, выбранный из Х8, представляющий собой 8ег, и/или Х16, представляющий собой А1а, и/или Х24, представляющий собой А1а, и/или Х28, представляющий собой А1а;
или его фармацевтически приемлемая соль, или производное, где Х16 не является А1а, а представляет собой Акп.
В определенных вариантах воплощения настоящего изобретения Ζ1 представляет собой К1 и может быть Н, а Ζ2 представляет собой К2 и может быть ОН.
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения аналог ОЬР-2 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную последовательности ОЬР-2 дикого типа (133), приведенной во введении заявки, более предпочтительно по меньшей мере на 63% идентичную последовательности, более предпочтительно по меньшей мере на 66% идентичную последовательности, и еще более предпочтительно, по меньшей мере на 69% идентичную последовательности. Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности в отношении полипептидных последовательностей ОЬР-2 определяется как процентное соотношение аминокислотных остатков в испытуемой последовательности, идентичных аминокислотным остаткам последовательности ОЬР-2 дикого типа после выравнивания последовательностей и введения пробела, при необходимости, с достижением максимального процента идентичности последовательности, при этом какие-либо консервативные заместители не учитываются как часть идентичности последовательности. Выравнивание последовательности может быть
- 3 014184 осуществлено специалистом в данной области техники с использованием технологий, хорошо известных из предшествующего уровня техники, например с использованием общедоступного программного обеспечениия, такого как ВЬА8Т, ВЬА8Т2 или Λΐίβη. см. ВЬА8Т, ВЬА8Т2 или Айди кой^аге, см. А11ксйи1 с1 а1. (МеЮобк ίη Еихуто1оду. 266:460-480 (1996); 1Шр://Ыак1.\\11к11/еби/Ыак1/ВЕАОМЕ.1ит1) или Реагкои е1 а1. (Сеиоткк, 46, 24, 36, 1997) и Ьйр://то1Ью1.ко1ои.ас.ик/сотри1е/а1фи.Ыт1 для АПди ргодгат.
Процент идентичности последовательности, использованный здесь и в соответствии с настоящим изобретением, определен с использованием этих программ и их стандартных настроек. В более общем смысле, специалист в данной области техники может легко определить подходящие параметры для определения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания полной длины сравниваемых последовательностей.
В некоторых предпочтительных вариантах воплощения настоящего изобретения аналоги пептида СЬР-2, представленные формулой I, II или III, включают заместители в более чем одной позиции Х8, Х16, Х24 и/или Х28 и/или комбинацию этих заместителей с другими заместителями, предпочтительно в позициях Х3, Х5, Х7, Х10 и/или Х11.
Примеры комбинаций Х8, Х16, Х24 и/или Х28, которые приведены в формулах Т-Ш, включают
8ег8, А1а16
8ег8, А1а24
8ег8, А1а28
А1а16, А1а24
А1а16, А1а28
А1а24, А1а28
8ег8, А1а16, А1а24
8ег8, А1а16, А1а28
8ег8, А1а24, А1а28
А1а16, А1а24, А1а28
8ег8, А1а16, А1а24, А1а28.
Примеры заместителей в позициях Х3, Х5, Х7, Х10 и/или Х11, приведенных в формулах НИ, могут быть скомбинированы с заместителями в одной или более позициях Х8, Х16, Х24 и/или Х28 включают СНиЗ, Ьеи 10, А1а11,24
01иЗ, 1Ъг5, ЬеиЮ, 8ег11, А1а16, 24,28
01иЗ, ТЬг5, ЬеиЮ, Ьуз 11, А1а16, 24,28
О1иЗ, ТЬг5, 8ег8, ЬеиЮ, Ьуз11, А1а16,24,28
01иЗ, ТЬг5, 8ег8,11, ЬеиЮ, А1а16, 24,28
01иЗ, ТЬг5,8ег8,11, Ьеи10, А1а16,24,28
- 4 014184
С1иЗ, 8ег8, 11, ЬеиЮ, А1а16, 24,28
СНиЗ, ЬеиЮ, 8ег11, А1а16,24,28
С1иЗ, ЬеиЮ, Ьуя11, А1а16, 24, 28
О1иЗ, ТЬг5, ЬеиЮ, А1а11,16,24,28
О1иЗ, ТЬг5, ЬеиЮ, А1а11,16,24, 28, Пе21
О1иЗ, ТЬг5, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11,16,24, 28
О1иЗ, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11,16,24,28
О1иЗ, ЬеиЮ, А1а11,16,24,28
1Ъг7, ЬеиЮ, А1а11,24
ТЬг7, ЬеиЮ, Ьуз11, А1а24
Ткг7, ЬеиЮ, 8ет11, А1а24
ТЬг7, ЬеиЮ, 8ег8, 11,А1а24
Т1тг7, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11,24
ТЬг7, 8ег8, ЬеиЮ, Ьуз11, А1а24
8ег8, ЬеиЮ, А1а11,24
ЬеиЮ, 24
ЬеиЮ, А1а11, А1а24
ЬеиЮ, А1а11,24, 28
ЬеиЮ, А1а11,16,24,28
ЬеиЮ, Ьук11, А1а24
ЬеиЮ, 8ег11,А1а24
ЬеиЮ, 8ег8,11, А1а24 или удалена одна или более из позиций Х31-Х33 в комбинации с выше приведенными изменениями в позициях 8, 16, 24 и/или 28.
Отдельные примеры соединений ОЬР-2 по настоящему изобретению приведены ниже в детальном описании настоящего изобретения.
Настоящее изобретение относится как к аналогам ОЬР-2, обладающим улучшенной химической стабильностью и биологической активностью, так и к соединениям, которые обладают способностью преимущественно усиливать рост ткани тонкого кишечника по сравнению с тканями толстого кишечника и наоборот. В частности, описанные здесь эксперименты показывают, что замещения в позициях Акр3, и/или 8ет8, и/или Аки16, и/или О1и28 последовательности ОЬР-2 дикого типа обеспечивают при введении тестируемым животным преимущественно увеличение массы тонкого кишечника по сравнению с массой толстого кишечника. Эти полученные результаты свидетельствуют о том, что эти соединения, приведенные в качестве примера, могут быть использованы для лечения состояний, когда преимуществом является эффект усиления роста тканей тонкого кишечника, в то время как рост тканей толстого кишечника меньше и наоборот.
Таким образом, соединения, являющиеся предпочтительными для роста тканей тонкого кишечника, включают один или более заместителей в позициях 3, 8, 16 и/или 28 ОЬР-2 дикого типа. Такие соединения могут являться причиной избирательного роста тканей тонкого кишечника по сравнению с тканями толстого кишечника. Они могут быть использованы в состояниях, вызванных неблагоприятным воздействием, или в состояниях, относящихся к проблемам тонкого кишечника.
Предпочтительно такие соединения, оказывающие избирательное воздействие на рост ткани тонкого кишечника, включают заместители более чем одной позиции Х3, Х7, Х16, Х24, Х28, Х31, Х32 и/или Х33. Таким образом, соединения, оказывающие избирательное воздействие на рост ткани тонкого кишечника, могут включать более чем один заместитель Х3, представляющий собой О1и, Х7, представляющий собой 8ет, Х16, представляющий собой А1а, Х24, представляющий собой А1а, Х28, представляющий собой А1а, Х31, представляющий собой 11е, Х32, представляющий собой Тйг, и Х33, представляющий собой Акр. Аминокислотные остатки в позициях Х31, Х32 и Х33 необязательно могут быть удалены.
Соединения, приведенные в качестве примеров, стимулирующие преимущественно эпителиальный рост в тонком кишечнике, включают 1809, 1818, 1819, 1820, 1826, 1827, 1844, 1845, 1846, 1848, 1849, 1850, 1851, 1852, 1853, 1855, 1857, 1858, 1859.
С другой стороны, соединения по настоящему изобретению, не имеющие этих модификаций, на- 5 014184 пример, которые включают один или более заместитель в позициях 10, 11 и/или 24, могут быть предпочтительными для индуцирования преимущественного роста тканей толстого кишечника по сравнению с тканями тонкого кишечника. Они могут быть использованы в состояниях, вызванных неблагоприятным воздействием или в состояниях, относящихся к проблемам толстого кишечника.
Такие соединения, оказывающие избирательное воздействие на рост ткани толстого кишечника, включают заместители в позициях Х3, Х8 и/или Х24. Например, они могут включать более чем один заместитель, выбранный из Х3, представляющий собой Азр, Х8, представляющий собой Азр, и Х24, представляющий собой А1а. Аминокислотные остатки в позициях Х31, Х32 и Х33 необязательно могут быть удалены.
Соединения, приведенные в качестве примеров, стимулирующие преимущественно эпителиальный рост в толстом кишечнике, включают 1830, 1831, 1835, 1836, 1839, 1840,1841 и 1843.
Соединения, приведенные в качестве примеров, не оказывающие преимущественной стимуляции на рост тканей тонкого кишечника или рост тканей толстого кишечника: [О1у2]ОЬР-2 (то есть молекулы, приведенные в качестве ссылки), 1559, 1821, 1822, 1823, 1825, 1828, 1829, 1832, 1833, 1834, 1842, 1854.
Соединения по настоящему изобретению также обладают повышенной химической стабильностью, например, к кислотному гидролизу, окислению и дезамидированию. Считается, что заместители в позициях Х3 и/или Х33 могут улучшать стабильность к кислотному гидролизу. Заместитель в позиции Х10 может улучшать стабильность к окислению. Заместитель в одной или более позициях Х11, Х16 и/или Х24 может повышать стабильность к дезамидированию. Кроме того, аналог ОЬР-2 по настоящему изобретению демонстрирует усиление стабильности к деградации в кислотном растворе, к дезамидированию и/или к окислительной деградации по сравнению с О1у2-ОЬР-2.
Предпочтительно аналог ОЬР-2 сохраняет уровень чистоты, полученный при эксперименте, по меньшей мере на 70% по сравнению с начальным уровнем чистоты по меньшей мере в одном тесте на деградацию, описанном ниже в примере 7. Кроме того, или в качестве альтернативы, он сохраняет уровень чистоты, полученный при эксперименте, по меньшей мере на 60% по сравнению с начальной чистотой в растворе НС1 0,1М после 12 дней. Кроме того, или в качестве альтернативы, он сохраняет уровень чистоты, полученный при эксперименте, по меньшей мере на 70% по сравнению с начальной чистотой в растворе ХН4НСО3 0,1М после 6 дней.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей аналог ОЬР-2, как описано выше, или его соль, или производное в смеси с носителем. В предпочтительных вариантах воплощения настоящего изобретения композиция является фармацевтически приемлемой композицией, и носитель является фармацевтически приемлемым носителем. Аналог пептида ОЬР-2 может представлять собой фармацевтически приемлемую аддитивную соль кислоты аналога ОЬР-2.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогу ОЬР-2, как описано выше, или его соли для применения в лечении.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению аналога ОЬР-2, или его соли, или производного для получения лекарственного средстваа для лечения и/или профилактики желудочнокишечных заболеваний, таких как лечение у новорожденных нарушений кишечной функции, остеопороза, состояний, связанных с ЭРР-ΐν (дипептидилпептидазой-ΐν). Например, желудочно-кишечные заболевания включают язвенные заболевания, гастриты, расстройства пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченного кишечника, синдром прямокишечно-маточного углубления, воспалительные заболевания кишечника, брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или глютенового заболевания), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, энтериты, региональный энтерит (болезнь Крона), язвенные колиты, синдром раздраженного кишечника, связанный с диареей, повреждения тонкого кишечника и синдром укороченной тонкой кишки.
Другие состояния, которые могут лечить аналогами ОЬР-2 по настоящему изобретению, или для которых могут быть применены аналоги ОЬР- 2 для профилактики или лечения, включают лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты, повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химических агентов. Это может потребовать введение аналога ОЬР-2 перед, одновременно с или после курса химиотерапии или лучевой терапии для снижения побочных эффектов химиотерапии, таких как диарея, абдоминальные спазмы и рвота и уменьшения структурных и функциональных повреждений кишечного эпителия в результате химиотерапии или лучевой терапии.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к терапевтическому набору, включающему химиотерапевтические препараты для лечения рака и аналог ОЬР-2 по настоящему изобретению, каждый необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Два терапевтических агента могут быть упакованы раздельно (например, в отдельных емкостях) для раздельного введения или могут входить в состав одной композиции. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей химиотерапевтические препараты для лечения рака и аналог ОЬР-2 по настоящему изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Для пациентов с неоплазией слизистой желудочно-кишечного тракта или с повышенным риском возникновения неоплазии слизистой желудочно-кишечного тракта желательно выбирать соединение, которое снижает или упраздняет риск возникновения побочных эффектов, таких как стимуляция или
- 6 014184 обострение неоплазии слизистой желудочно-кишечного тракта. Например, при выборе соединения для лечения пациента с неоплазией толстой кишки (как доброкачественной, так и злокачественной) или при риске развития неоплазии толстой кишки, может быть более приемлемым выбор соединения, селективного для тонкого кишечника по сравнению с толстой кишкой, чем неселективного соединения, или соединения, которое является селективным для толстой кишки по сравнению с тонкой.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению аналогов СЬР-2 для получения лекарственных средств для лечения и/или профилактики недостаточности или нарушения питания, например, состояний, таких как сидром атрофии, такой как катехия или анорексия.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аналог СЬР-2, описанный выше.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему вышеуказанную последовательность нуклеиновой кислоты, необязательно в комбинации с последовательностями, направляющими экспрессию, и клеткам-хозяевам, трансформированным векторами экспрессии. Предпочтительно клетки-хозяева способны экспрессировать и секретировать аналог СЬР-2. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения аналога СЬР-2, способ включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессирования аналога СЬР-2, и очистку полученного таким образом аналога СЬР-2.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению, вектору экспрессии по настоящему изобретению или клетке-хозяину, способной экспрессировать и секретировать аналог СЬР-2 по настоящему изобретению для применения в терапии. Следует понимать, что нуклеиновая кислота, вектор экспрессии и клетки-хозяева могут использоваться для лечения любого из описанных здесь заболеваний, которое может лечиться аналогами СЬР-2. Ссылки на терапевтические композиции, содержащие аналог СЬР-2 по настоящему изобретению, или введение аналога СЬР-2 по настоящему изобретению должны включать в свой объем введение нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки-хозяина по настоящему изобретению, за исключением тех случаев, когда в контексте предусмотрено иное.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения желудочно-кишечных заболеваний у пациента, нуждающегося в нем, введением эффективного количества аналога СЬР-2, описанного выше, или его соли, или производного, или нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки хозяина по настоящему изобретению. Примеры желудочно-кишечных заболеваний приведены выше.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии у пациентов, нуждающихся в этом, способ включает введение эффективного количества аналога СЬР-2, описанного выше, или его соли, или производного, или нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки хозяина по настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики недостаточности или нарушения питания, например состояний, таких как сидром атрофии, такой как катехия или анорексия, способ включает введение эффективного количества аналога СЬР-2, описанного выше, или его соли, или производного, или нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии или клетки хозяина по настоящему изобретению.
Варианты воплощения настоящего изобретения будут описаны более детально путем приведения примеров и не ограничиваются ссылкой на прилагаемые фигуры.
Описание чертежей
Фиг. 1. Примеры данных по эффектам полной дозы четырех селективных соединений для тонкого кишечника (соединения № 1846, 1855, 1848 и 1858 в расчете на массу тонкого кишечника (81) С57ВЬ мышей). Соединения вводились путем подкожных инъекций дважды в день в течение трех дней в следующих дозах: 0 (носитель), 5, 15, 45, 135, 405 нмоль/кг (п=6/дозу группы). Результаты каждого уровня доз сравнивали с результатами, полученными при таких же дозах на мышах, парно обработанных неселективным эталонным соединением [С1у2]СЬР-2. Для корректировки в зависимости от изменений массы тела (В\У) масса тонкого кишечника (81) была выражена по отношению к ВXV (81-В XV соотношение), и результат изменений роста при каждом уровне дозы нормализовали по результату, полученному при использовании неселективного эталонного соединения [С1у2]СЬР-2. Результаты показали, что при дозах в пределах 5-405 нмоль/кг отношения эффекта дозы селективных соединений для тонкого кишечника 1846, 1855, 1848 и 1858, значительно отличались от отношений эффекта дозы неселективного эталонного соединения [С1у2]СЬР-2, (р<0,05 двухфакторный ΑΝΟνΑ), при этом все четыре соединения стимулировали рост ткани тонкого кишечника с максимальными ответами, которые были значительно выше, чем у [С1у2]СЬР-2. Приведенные значения указаны ±СКО. *: Р<0,05 по сравнению с эквимолярной дозой [С1у2]СЬР-2.
Фиг. 2. Примеры данных по эффектам полной дозы четырех селективных соединений для тонкого кишечника (соединение 1846, 1855, 1848 и 1858) приведены через индекс чувствительности мышей, представляющий отношение массы тонкого кишечника (81) к массе толстой кишки (81-Со1оп) по отношению к неселективному эталонному соединению [С1у2]СЬР-2. Соединения вводились мышам С57ВЬ подкожно дважды в день в течение трех дней следующими дозами: 0 (носитель), 5, 15, 45, 135, 405
- 7 014184 нмоль/кг (п=6/ дозу группы). Ответы на каждый уровень доз были сравнены с ответами, полученными при тех же самых дозах на мышах, парно обработанных неселективным эталонным соединением [О1у2]ОЬР-2. Индекс чувствительности (81-Со1оп) рассчитывается как отношение массы тонкого кишечника (81) к массе толстой кишки (Со1оп) и индекс чувствительности при каждом уровне дозы нормализовали по результату, полученному при использовании неселективного эталонного соединения [О1у2]ОЬР2. Результаты показали, что при дозах в пределах 5-405 нмоль/кг отношения эффекта дозы селективных соединений для тонкого кишечника 1846, 1855, 1848 и 1858 значительно отличались от отношений эффекта дозы неселективного эталонного соединения [О1у2]ОЬР-2, (р<0,05 двухфакторный ΑΝΟνΑ), и соединения 1846, 1855 и 1848 продемонстрировали максимальное возрастание чувствительности тонкого кишечника по отношению к [О1у2]ОЬР-2. Значения выражены ±СКО. *: Р<0,05 по сравнению с эквимолярной дозой [О1у2]ОЬР-2.
Фиг. 3. Примеры данных по эффектам полной дозы трех соединений, селективных для тонкого кишечника (соединение 1857, 1849 и 1820) приведены на массе тонкого кишечника (81) С57ВЬ мышей. Соединения вводились подкожно дважды в день в течение трех дней следующими дозами: 0 (носитель), 5, 15, 45, 135, 405 нмоль/кг (п=6/дозу группы). Ответы на каждый уровень доз были сравнены с ответами, полученными при тех же самых дозах на мышах, парно обработанных неселективным эталонным соединением [О1у2]ОЬР-2. Для корректировки изменений в массе тела (В\У) масса тонкого кишечника (81) была выражена относительно В\У (81-ВХУ соотношение), и ростовая ответная реакция при каждом уровне дозы была приведена к ответу, полученному при использовании неселективного эталонного соединения [О1у2]ОЬР-2. Результаты показали, что при дозах в пределах 5-405 нмоль/кг отношения эффекта дозы селективных соединений для тонкого кишечника 1857, 1849 и 1820, значительно отличались от отношений эффекта дозы неселективного эталонного соединения [О1у2]ОЬР-2, (р<0,05 двухфакторный ΑΝΟνΑ), и все соединения стимулировали рост ткани тонкого кишечника с максимальными ответами, которые были значительно выше, чем у [О1у2]ОЬР-2. Значения выражены ±СКО. *: Р <0,05 по сравнению с эквимолярной дозой [О1у2]ОЬР-2.
Фиг. 4. Примеры данных по эффектам полной дозы трех соединений, селективных для тонкого кишечника (соединение 1857, 1820 и 1849), приведены через индекс чувствительности мышей, представляющий отношение массы тонкого кишечника (81) к массе толстой кишки (81-Со1оп) по отношению к неселективному эталонному соединению [О1у2]ОЬР-2. Соединения вводились мышам С57ВЬ подкожно дважды в день в течение трех дней следующими дозами: 0 (носитель), 5, 15, 45, 135, 405 нмоль/кг (п=6/ дозу группы). Ответы на каждый уровень доз были сравнены с ответами, полученными при тех же самых дозах на мышах, парно обработанных неселективным эталонным соединением [О1у2]ОЬР-2. Индекс чувствительности (81-Со1оп) рассчитывается как отношение массы тонкого кишечника (81) к массе толстой кишки (Со1оп), и индекс чувствительности при каждом уровне дозы был приведен к ответу, полученному при использовании неселективного эталонного соединения [О1у2]ОЬР-2. Результаты показали, что при дозах в пределах 5-405 нмоль/кг отношения эффекта дозы селективных соединений для тонкого кишечника 1857, 1849 и 1820 значительно отличались от отношений эффекта дозы неселективного эталонного соединения [О1у2]ОЬР-2 (р<0,05 двухфакторный ΑΝΟνΑ), и все три соединения 1857, 1820 и 1849 продемонстрировали максимальное возрастание чувствительности тонкого кишечника по отношению к [О1у2]ОЬР-2. Значения выражены ±СКО. *: Р <0,05 по сравнению с эквимолярной дозой [О1у2]ОЬР-2.
Фиг. 5. Примеры данных по эффектам полной дозы неселективного соединения ([О1у2]ОЬР-2) и соединения, селективного для тонкого кишечника (соединение 1848), приведены на массе тонкого кишечника, массе толстой кишки и массе желудка. Соединения вводились мышам С57ВЬ подкожно дважды в день в течение трех дней следующими дозами: 0 (носитель), 5, 15, 45, 135, 405 нмоль/кг (п=6/ дозу группы.) Результаты показали, что при дозах в пределах 5-405 нмоль/кг [О1у2]ОЬР-2 получена доза зависимая стимуляция роста тонкого кишечника, толстой кишки и желудка. При этом соединение 1848 вызывало дозазависимую стимуляцию только роста тонкого кишечника. Значения выражены ±СКО. *: Р <0,05 по сравнению с носителем.
Фиг. 6. Примеры показали воздействие соединения 1846 (5, 15, 45, 135, 405 и 810 нмоль/кг подкожно дважды в день; п=6/дозу группы) на А) массовое соотношение тонкого кишечника к массе тела (81В\У) и В) длину тонкого кишечника (81 длина) у мышей, обработанных цитостатическим препаратом 5фторурацил (5-ЕИ). Соединение 1846 вводили в течение трех дней перед и 4 дней совместно с 5-ЕИ, 50 мг/кг интраперитонеально ежедневно. Для сравнения одна группа животных получала [О1у2]ОЬР-2 (405 нмоль/кг). Также показаны результаты для контрольной группы животных, обработанных носителем (РВ8) или одним 5-ЕИ. Соединение 1846 предотвращает 5-ЕИ индуцированную атрофию тонкого кишечника (снижение массы органа и укорачивание) у С57ВЬ мышей. Значения выражены ±СКО. *Р<0,05 по сравнению с 5-ЕИ.
Фиг. 7. Пример показал воздействие соединения 1848 (5, 15, 45, 135, 405 и 810 нмоль/кг подкожно дважды в день; п=6/дозу группы) на А) массовое соотношение тонкого кишечника к массе тела (81-ВХУ) и В) длину тонкого кишечника (81 длина) у мышей, обработанных цитостатическим препаратом 5фторурацил (5-ЕИ). Соединение 1848 вводили в течение трех дней перед и 4 дней совместно с 5-ЕИ, 50
- 8 014184 мг/кг интраперитонеально ежедневно. Для сравнения одна группа животных получала [О1у2]ОЬР-2 (405 нмоль/кг). Также показаны результаты для контрольной группы животных, обработанных носителем (РВ8) или одним 5-РИ. Соединение 1848 предотвращает 5-РИ индуцированную атрофию тонкого кишечника (снижение массы органа и укорачивание) у С57ВЬ мышей и высокие дозы соединения 1848 обладали большей эффективностью, чем [О1у2]ОЬР-2. Значения выражены ±СКО. *: Р<0,05 по сравнению с 5-РИ.# Р<0,05 по сравнению с [О1у2]ОЬР-2.
Фиг. 8. Пример показал воздействие соединения 1855 (5, 15, 45, 135 и 405 нмоль/кг подкожно дважды в день; п=6/дозу группы) на А) массовое соотношение тонкого кишечника к массе тела (81-В^) и В) длину тонкого кишечника (81 длина) у мышей, обработанных цитостатическим препаратом 5фторурацил (5-РИ). Соединение 1855 вводили в течение 3 дней перед и 4 дней совместно с 5-РИ, 50 мг/кг интраперитонеально ежедневно. Для сравнения одна группа животных получала [О1у2]ОЬР-2 (405 нмоль/кг). Также показаны результаты для контрольной группы животных, обработанных носителем (РВ8) или одним 5-РИ. Соединение 1855 предотвращает 5-РИ индуцированную атрофию тонкого кишечника (снижение массы органа и укорачивание) у С57ВЬ мышей, и высокие дозы соединения 1855 обладали большей эффективностью, чем эквимолярная доза [О1у2]ОЬР-2. Значения выражены ±СКО. * Р<0,05 по сравнению с 5-РИ. # Р<0,05 по сравнению с [О1у2]ОЬР-2.
Фиг. 9. Пример показал, что воздействие соединения 1857 (5, 15, 45, 135 и 405 нмоль/кг подкожно дважды в день; п=6/групп доз) на А) массовое соотношение тонкого кишечника к телу (81-В^) и В) длину тонкого кишечника (81 длина) у мышей, обработанных цитостатическим препаратом 5-фторурацил (5РИ). Соединение 1857 вводили в течение 3 дней перед и 4 дней совместно с 5-РИ, 50мг/кг интраперитонеально ежедневно. Для сравнения одна группа животных получала [О1у2]ОЬР-2 (405 нмоль/кг). Также показаны результаты для контрольной группы животных, обработанных носителем (РВ8) или одним 5Ри. Соединение 1857 предотвращает 5-РИ индуцированную атрофию тонкого кишечника (снижение массы органа и укорачивание) у С57ВЬ мышей и высокие дозы соединения 1857 обладали большей эффективностью, чем высокая доза [О1у2]ОЬР-2. Значения выражены ±СКО.*Р<0,05 относится к 5-РИ. #Р<0,05 относится к [О1у2]ОЬР-2.
Фиг. 10. Пример показал воздействие соединения 1846 (16, 80 и 400 нмоль/кг/день подкожно; п=6/дозу группы) на самцов крыс 8радие-Оа^1еу, обработанных цитостатическим препаратом 5фторурацил (5-РИ). Соединение 1846 вводили в течение 3 дней перед и 4 дней совместно с 5-РИ, (75 мг/кг интраперитонеально ежедневно). Результаты сравнивали с ответами контрольных животных, обработанных носителем (солевой раствор) или одним 5-РИ. Также показаны контроли с солевым раствором и 5-РИ. Соединение 1846 предотвращает 5-РИ индуцированную атрофию тонкого кишечника (снижение массы органа и укорачивание) у крыс. Значения выражены ±СКО. *Р<0,05 по сравнению с 5-РИ.
Фиг. 11. Пример иллюстрирует терапевтическое воздействие соединения 1846 при диарее, индуцированной обработкой цитостатическим препаратом 5-фторурацил (5-РИ). Крысы были обработаны 5-РИ в течение 4 дней 75 мг/кг один раз в день (дни 1-4); (п=40 крыс). Половина животных получала дополнительную обработку соединением 1846 (400 нмоль/кг подкожно один раз в день) в течение 3 последних дней перед обработкой (дни с -3 по -1) и в течение 4 дней обработки 5-РИ (дни 0-3). Крыс наблюдали дважды в день (утром и вечером) для определения наличия диареи у животного и тяжесть диареи оценивалась по шкале: (0) нет диареи; (1) слабая диарея - фекалии остаются вокруг ануса; (2) умеренная диарея фекалии остаются на задних конечностях и хвосте; и (3) - сильная диарея - фекалии остаются на передних конечностях и брюшке. На 5 день у около 70% крыс 8радие-Оа^1еу, получавших только 5-РИ, развилась диарея (фиг. 11 А), при этом только у 30% крыс, которых обрабатывали 5-РИ совместно с соединением 1846, развилась диарея (фиг. 11В). Эти результаты показывают, что соединение 1846 эффективно предотвращает повреждение тонкого кишечника и, таким образом, развитие диареи при цитостатической обработке (5-РИ).
Фиг. 12. Этот пример иллюстрирует воздействие соединения 1846 на высоту комплекса криптаворсинка (фиг. 12А) и толщину мышечного слоя (фиг. 12В) тонкой кишки (т. е. средняя секция тонкого кишечника). Крысы 8ргадие Эа\у1еу получали внутривенно соединение 1846 (0,62; 3,41 или 6,2 мг/кг ежедневно) в течение 5 дней (п=6/дозу группы). Затем животных умертвляли и взяли биопсию (1 см) из тонкого кишечника, брали в 25 см от дистального конца пилорического сфинктера. Образцы биопсии фиксировали, погружали в парафин, разделяли на части и окрашивали гематоксилином и эозином. Окрашенные части исследовали под микроскопом и измеряли глубину крипт, высоту ворсинок, длину комплекса крипта-ворсинка и толщину мышечного слоя. Как показано, соединение 1846 вызывало дозазависимое увеличение длины комплекса крипта-ворсинка на эпителии тонкой кишки, но не наблюдалось воздействие на толщину мышечного слоя тонкой кишки. Эти результаты показывают, что соединение 1846 прежде всего влияет на пролифиративную активность тонкого кишечника через стимуляцию роста эпителия тонкого кишечника. Значения выражены ±СКО.* Р<0,05 по сравнению с контролем с носителем (0 мг/кг/день).
Фиг. 13. Этот пример иллюстрирует воздействие соединения 1848 на язвы тонкого кишечника, индуцированные индометацином. Самцы крыс 8радие-Оа^1еу были обработаны носителем (солевой рас
- 9 014184 твор; группа 1) или индометацином (7 мг/кг подкожно, ежедневно в течение 2 дней; группы 2-7). Давали только индометацин (группа 2) или в комбинации с преднизолоном (10 мг/кг подкожно, группа 3) или с 8, 40 или 200 нмоль/кг соединения 1848 подкожно раз в день (группы 4-6). Наконец, одна группа крыс получала комбинированное лечение преднизолоном (10 мг/кг подкожно) и соединением 1848 200 нмоль/кг подкожно 1 раз в день (группа 7). Лечение соединением 1848 было начато за 4 дня до обработки индометацином и продолжалось в течение 2 дней при обработке индометацином. На третий день крысы были умертвлены и после вскрытия тонкий кишечник промывали аккуратно 10% формалином и погружали в формалин на 5 мин, после чего кишку рассекали вдоль антибрыжеечного края и помещали в полипропиленовую планшету. Оставшееся содержимое кишечника удаляли с помощью пинцета. После фиксации в течение 24 ч при комнатной температуре ткань промывали деионизированной водой и поверхность окрашивали в течение 20 мин алциановым зеленым А1с1ап Огееп 3ВХ (СЬгота), полученным в виде 0,5% раствора в 1% уксусной кислоте (В1е& Вегп(кеп). После удаления избытка окрашивающего раствора деионизированной водой препарат ткани перемещали в 70% спирт и исследовали с помощью стереомикроскопа при низком увеличении (х7). Тонкий кишечник был сканирован начиная с пилоруса, и были измерены форма (круглые; линейные) и размер язв (для круглых язв - диаметр, для линейных язв длина х ширина) с использованием стандартной линейки (с точность 0,5 мм). Язва была определена как площадь, на которой отсутствует эпителий. В заживающих язвах в качестве язвы рассматривалась площадь, на которой еще отсутствовал эпителий, даже если ворсинки отсутствовали на большей площади. Все исследования проводили слепым методом. Как показано на фиг. 13, индометацин явился причиной сильного язвенного поражения тонкого кишечника (общее изъязвление тонкого кишечника=333±21 мм2). Обработка преднизалоном послужила причиной значительного снижения площади изъязвления примерно на 29%. Обработка соединением 1848 предотвратила изъязвление, вызванное индометацином, в зависимости от дозы, и максимальная доза снизила общее изъязвление почти на 50% (178±17 мм2). Этот максимальный ответ на соединение 1848 был сильнее воздействия преднизалона и, кроме того, преднизолон в комбиниции с высокой дозой соединения 1848 не производил никакого дополнительного эффекта. Эти результаты показывают, что соединение 1848 эффективно предотвращает изъязвление тонкого кишечника, вызванное индометацином. Значения выражены ±СКО. * Р<0,05 по сравнению с индометацином (группа 2). # Р<0,05 относится к преднизалону (группа 3).
Фиг. 14. Этот пример иллюстрирует воздействие соединения 1848 на содержание ΙΝΕ-α в тонком кишечнике крыс с воспалением, индуцированным индометацином. Самцы крыс 8радие-Эает1еу были обработаны носителем (солевой раствор; группа 1) или индометацином (7 мг/кг подкожно, ежедневно в течение 2 дней; группы 2-7). Давали только индометацин (группа 2) или в комбинации с преднизолоном (10 мг/кг подкожно, группа 3) или с 8, 40 или 200 нмоль/кг соединения 1848 подкожно раз в день (группы 4-6). Наконец, одна группа крыс получала комбинированное лечение преднизолоном (10 мг/кг подкожно) и соединением 1848 200 нмоль/кг подкожно 1 раз в день (группа 7). Лечение соединением 1848 было начато за 4 дня до обработки индометацином и продолжалось в течение 2 дней при обработке индометацином. На третий день крысы были умертвлены и вскрыты, при вскрытии тонкий кишечник был разделен на три части, равной длины соответственно 1) двенадцатиперстная кишка и проксимальная часть тощей кишки, 2) средняя и дистальная часть тощей кишки и 3) подвздошная кишка. Образцы немедленно были подвергнуты быстрой заморозке в жидком Ν2 и хранились при температуре -80°С до момента проведения исследования. Гомогенизацию и экстракцию клеточного белка из сегментов тонкого кишечника проводили согласно следующей процедуре: ткани сегментов взвешивали и вводили 1,5 мл ледяной воды (4°С) на грамм тканей, экстракционный буфер (10 мМ Тпк-НС1 (81дта) и 1мМ БЭТА (З.Т. Вакег), (рН 7,6) с 0,05% азида натрия (Е1ика), 1% Т\\'ееп-80 (Р1цка), 2мМ фенилметилсульфонил фторида (РМ8Р, Р1ика) и 1 цг/мл каждого из ингибиторов протеазы апротинина, леупептина и пепстатина А (КосЬе Э|адпок11ск)). Ткани нарезали с помощью ножниц на мелкие кусочки и гомогенизировали 3 раза по 20 с (1КА иНгаТиггах Т25 Нотодеш/ег 1апке&Кипке1) при 9500 об./мин и быстро замораживали на льду в течение 30 с. Гомогенат центрифугировали при 20000хд в течение 30 мин при температуре 4°С, супернатант собирали и хранили при температуре -20°С до момента проведения исследования ЮТ-а. Экстракты белка тонкого кишечника анализировали на ΊΝΡ-α с использованием коммерчески доступного набора ЕЫ8А (сверхчувствительный набор ЕЫ8А для фактора-α некроза опухоли крыс, Вюкоигсе 1п1егпа1юпа1 1пс.). Предел обнаружения в пробе составляет 0,7 пг/мл. Экстракты белков анализировали на содержание общего белка с использованием коммерчески доступного анализа (ЭС рго1ею аккау, Вю-Кай ЬаЬогаЮпек ЬТО.). Уровни содержания ΊΝΡ-α в тканях тонкого кишечника были выражены относительно общего белка. Соединение 1848 значительно снизило уровни содержания провоспалительного цитакина ЮТ-а, и этот эффект был наиболее заметен на проксимальном сигменте (первая треть тонкого кишечника). Соединение 1848 было более эффективно, чем преднизолон в проксимальной и средней частях (вторая треть тонкого кишечника). Примечательно, что соединение 1848 подавило воспаление в тонком кишечнике более эффективно, чем преднизолон, и совместное использование преднизолона и соединения 1848 не дало дополнительного эффекта. Эти результаты предполагают, что соединение 1848 обладает заметным противовоспалительным потенциалом при воспалительных заболеваниях тонкого кишечни
- 10 014184 ка. Значения выражены ±СКО. * Р<0,05 по сравнению с индометацином (группа 2).
Детальное описание изобретения
Определения.
Если не указанно иное, то следующие определения относятся к специальным терминам, использованным в приведенном ниже описании. В описании и формуле изобретения использованы традиционный однобуквенный и трехбуквенный коды как для обозначения природных аминокислот, так и для других α-аминокислот, таких как саркозин (Заг), норлейцин (Ме) и α-аминоизомасляная кислота (А1Ь). Все аминокислотные остатки в пептидах по настоящему изобретению являются предпочтительно Ь формами. Однако также могут присутствовать Ό формы аминокислот.
Предпочтительные соединения по настоящему изобретению обладают по меньшей мере одной СЕР-2 биологической активностью, а именно вызывают рост тканей кишечника. Это может быть оценено 1п νίνο опытами, например, как описано в примерах, в которых масса кишечника или его части определена после теста на животных, получавших или подвергшихся воздействию аналога СЬР-2.
Аналоги СЬР-2 по настоящему изобретению имеют один или более аминокислотный заместитель, делецию, инверсию или дополнение по сравнению с нативным СЬР-2 и как описано выше. Это определение также включает синонимы-миметики СЬР-2 и/или агонисты СЬР-2. Кроме того, аналоги по настоящему изобретению дополнительно могут иметь химическую модификацию по одной или более боковой группе аминокислот, α-углеродных атомов, по концевой аминогруппе или концевой группе карбоновой кислоты. Химические модификации включают без ограничения введение химических молекул, создание новых связей и удаление химических молекул. Модификации по боковым группам аминокислот включают без ограничения ацилирование ε-аминогрупп лизина, Ν-алкилирование аргинина, гистидина или лизина, алкилирование карбоксильных групп глутаминовой кислоты или аспарогиновой кислоты и деамидирование глутамина или аспарагина. Модификации по амино-концу включают без ограничения дезаминирование, алкилирование низшим алкилом по Ν-концу, алкилирование низшим диалкилом по Ν-концу и Ν-ацильные модификации. Модификации концевой карбоксильной группы включают без ограничения амид, образование низшего алкиламида, диалкиламида и модификации с получением эфира низших алкилов. Предпочтительно здесь низшим алкилом является С1-С4 алкил.
Кроме того, одна или более боковая группа или концевая группа могут быть защищены протективными группами, известными специалисту в области химии пептидов. α-Углерод аминокислоты может быть моно- или диметилированным.
Представленная здесь стабильная к окислению МеЬзамена аминокислоты означает замену, выбранную из группы, состоящей из Ме1(О) (метионинсульфоксида), Ме1(О)2 (метионинсульфона), Уа1, 11е, Азп, С1х (С1и или С1п), Туг, РЬе, Тгр и предпочтительно Ьеи, №е, А1а, Зег и С1у.
Следует понимать, что пептиды по настоящему изобретению также могут быть в форме соли или другого производного. Соли включают фармацевтически приемлемые соли, такие как аддитивные соли кислоты и основные соли. Примеры аддитивных солей кислоты включают хлористо-водородные соли, соли лимонной кислоты и соли уксусной кислоты. Примеры основных солей включают соли, в которых катион выбран из щелочных металлов, таких как натрий и калий, щелочно-земельных металлов, таких как кальций, и ионов аммония *Ν(Β3)3(Β4), где В3 и В4 независимо обозначают необязательно замещенный С1-6 алкил, необязательно замещенный С2-6 алкенил, необязательно замещенный арил или необязательно замещенный гетероарил. Другие примеры фармацевтически приемлемых солей описаны в ВеттдЮпз РБагтасеибса1 Заепсез 17 ебйюп. Еб. А1£опзо В. Сеппаго (Еб.), Магк РиЬНзЫпд Сотрапу, ЕазЮп, РА, и.З.А., 1985 и более поздних изданиях и в 1Пе Епсус1ораеб1а о£ Рйаттасеийса1 ТесЬпо1оду.
Другие производные аналогов СЬР-2 по настоящему изобретению включают координационный комплекс с ионами металла, такого как Мп2+ и Ζιγ', эфирами, такими как ш νί\Ό гидролизуемые эфиры, свободными кислотами или основаниями, гидратами, пролекарствами или липидами. Эфиры могут быть образованы между гидроксильными или карбоксильными группами, присутствующими в соединении и подходящей карбоновой кислотой или спиртом, участвующим в реакции, с использованием технологий, хорошо известных из предшествующего уровня техники. Производные соединений, такие как пролекарства, представляют собой одно из исходных соединений, поддающееся превращению ш νί\Ό или ш νίΙΐΌ. Как правило, по меньшей мере одна из биологических активностей соединения будет снижена в пролекарственной форме соединения и может быть активирована конверсией из пролекарства с выделением из него соединения или метаболита. Примеры пролекарств включают использование защитных групп, которые могут быть удалены ш з11и, с выделением активного соединения или служат для игибирования клиренса лекарственного препарата ш νί\Ό.
Присутствующие Ζ1 и Ζ2, каждая независимо, представляет собой пептидную последовательность из 3-20 или 4-20 аминокислотных остатков, например в пределах 4-15, более предпочтительно в пределах 4-10, в частности в пределах 4-7 аминокислотных остатков, например 4, 5, 6 или 7 аминокислотных остатков, таких как 6 аминокислотных остатков. Каждый из аминокислотных остатков в пептидных последовательностях Ζ может быть независимо выбран из А1а, Ьеи, Зег, ТЬг, Туг, Азп, С1п, Азр, С1и, Ьуз, Агд, Н1з, Ме1 Огп. Предпочтительно аминокислотный остаток выбран из Зег, ТЬг, Туг, Азп, С1п, Азр, С1и, Ьуз,
- 11 014184
Агд, Н18, От и Ме!, также как и аминокислотные остатки, входящие в формулу I, как описано в νΟ 01/04156, например ЭЬи (2,4-диаминомасляная кислота) или Эрг (2,3-диаминопропионовая кислота), более предпочтительно С1и, Ьу§ и Ме!, особенно Ьу§. Вышеприведенные аминокислоты могут быть как в Ό-, так и в Ь-форме, но предпочтительно выше приведенные аминокислоты имеют Ь-форму. Особенно предпочтительны последовательности Ζ, представляющие собой последовательности из четырех, пяти или шести последовательных остатков лизина и особенно из шести последовательных остатков лизина. Примеры последовательностей Ζ приведены в νΟ 01/04156.
В определенных вариантах воплощения настоящего изобретения Ζ1 отсутствует. В таких случаях Ζ2 может как присутствовать, так и отсутствовать.
Настоящее изобретение включает следующие пептиды дополнительно к описанным ниже в экспериментальной части.
Эталонный аналог СЬР-2
1559 Н-[О1у2]!1ОЕР-2-ОН
Η-ΗΟΟΟ8Ρ8ΟΕΜΝΤΙΕΟΝΪ,ΑΑΚΟΡ1Ν\νυ()ΤΚΙΤΟ-ΟΗ
Примеры аналогов СЬР-2 по настоящему изобретению
1809 [О1у2, ΟΚ13, ТЬг5, ЬеиЮ, А1а11 ,16,24,28]1ι6ΕΡ-2-(Εν3)ό-ΝΗ2
ΗΟΕΟΤΡδΟΕΕΑΤΙΕϋΑΕΑΑΚΟΡΙΑλνΕΙΑΤΚΙΤΟΚί-ΝΗί
1810 [С1у2, О1иЗ, Т11г5, Ееи10, А1а11,16,24,28, Ηβ21]ΗΟΕΡ-2(1-30)-(Εγ8)6-ΝΗ2 ΗαΕΟΤΡ8ΟΕΕΑΤΙΕΟΑΕΑΑΚΙΡΙΑΨΕΙΑΤΚ6-ΝΗ2
1811 [О1у2, Ргоб, Ьеи10, А1а11 ,16,24,28]Ε6ΕΡ-2-ΝΗ2
ΗΟΟΟ8Ρ8ΟΕΕΑΤΙΕΟΑΕΑΑΚΩΡΙΑΨΕΙΑΤΚΙΤΟ-ΝΗ2
1812 [С1у2, С1иЗ, ЬеиЮ, А1а11 ,24]1ι6ΕΡ-2-ΝΗ2
Η0Ε68Ρ8ΟΕΕΑΤΙΕΟΝΕΑΑΚ0ΡΙΑΨΕΙ9ΤΚΙΤ0-ΝΗ2
1813 [С1у2, ЬеиЮ, ΑΙβ11,16,24,28]1ι6ΕΡ-2-ΝΗ2
Η-ΗΟΏα8Ρ8ΟΕΕΑΤΙΕΟΑΕΑΑΙΦΓΙΑΨΕΙΑΤΚΙΤΟ-ΝΗ2
1814 [О1у2, ЬеиЮ, А1а11 ,24,28]ЬСЕР-2-ЫН2
Η-ΗΟ0Ο8Ρ80ΕΕΑΤΙΕΟΝΕΑΑΚϋΡΙΑΧνΕΙΑΤΚΙΤΟ-ΝΗ2
1815 [О1у2,01иЗ, БеиЮ, А1а11,16,24,28]ΒΟΕΡ-2-ΝΗ2
Η44ΟΕΌ5Γ5ΠΕΕΑΤΠΌΑ1,ΑΑΪ1Γ)Ρ1Αν/Ε1ΑΤΚΪΤΟ-ΝΗ2
1818 [О1у2, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11 ,24]1ιΟΕΡ-2(1 -3Ο)-Κ«-ΝΗ2
Η-ΗΟΟΟ8Ρ88ΕΕΑΤΙΕΟΝΕΑΑ№ΡΙΑΐνΕΙ0ΤΚ6-ΝΗ2
1819 [О1у2, Беи 10, 8ег11, А1а24]ЬОТ.Р-2( I -3Ο)-Κ6-ΝΗ2
Η-ΗΟϋα8Ρ8ΟΕΕ8ΤΙΕΟΝΕΑΑΚΟΡΙΑΨΕ^ΤΚ6-ΝΗ2
1820 [О1у2, ТЬг7, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11 ,24]йОЕР-2(1 -3Ο)-Κ6-ΝΗ2
Η-ΗΟΟ68ΓΤ8ΕΕΑΤΙΕϋΝΕΑΑΚΟΡΙΑλνΕΐρΤΚ6-ΝΗ2
1821 [С1у2, ЬеиЮ, Ьуз11 , А1а24]ЬСЕР-2(1-30уК6-КН2
Η-ΗΟΟ68Ε8ΟΕΕΚΤΙΕΟΝΕΑΑΚΟΡΙΑνΈΙ0ΤΚ.6-ΝΗ2
1822 [С1у2, ТЬг7. ЬеиЮ, Ьу511, А1а24]11ОЕР-2(1 -3Ο)-Κύ-ΝΗ2
Η-Η(}ΟΟ8ΡΤΟΕΕΚΤΙΕΟΝΕΑΑΚϋΡΙΑ\νΕΙ0ΤΚ6-ΝΗ2
1823 [О1у2, ТЬг7,8ег8, Беи 10, ЬузН , А1а24]11ОЕР-2(1-30)-Кб-МН2
- 12 014184
Н-НСОО8РТ8ЕЬКТ1ЬОЖАА№Р1А\ЖфТК(,-МН2
1824 [01у2, ТЬг7, ЬеиЮ, А1а11, 24]ЫЗЬР-2(1-ЗО)-К<,-МН2
Η-ΗΟϋΟ8ΡΤηΕΕΑΤΙΤ...ηΝΕΑΑΚΧ)ΡΤΑνΕΙζ>ΤΚ<·.-ΝΗ:
1825 [01у2,8ег8, ЬеиЮ, А1а11,24]ЮЬР-2(1-30)-КН2
И-ТЮООЯЕЗЯЕЕАТтОХТ.ЛАЕПРТАЧ’ГЛЦТК-МЬ
1826 [О1у2, ЬеиЮ, А1а24]116ЬР-2-К,;,-НН2 Η-ΗΟΟΟδΡδΟΕΕΝΤΙΕϋΝΕΑΑΚϋΡΙΑΨΕ^ΤΚΙΤϋΚΐ-ΝΗί
1827 [О1у2, ТЬг7, ЬеиЮ, 8ег11, А1а24]ЬСЬР-2(1 -30)-Κ6-ΝΗ2
Н-НСООЗРТОЕЬЗПЬПМЬААКОНА^ЫфТКб-ННг
1828 [О1у2, ТЬг7, ЬеиЮ, 8ег8,11, А1а24]ЬОЬР-2(1 -30)-К6-КН2 Н-НСОСЗРТЗЕЬЗИЬОНЬААКПНАХУЫОТЮ.-ЫН;.
1829 [С1у2, ЬеиЮ, 8ег8,11 , А1а24]ЪОЬР-2(1-30)-1<6-№12 Н-НСЮС8Е88ЕЬ8ТЮОНЬАЛ№Р1А^ЫОТК6-ЫН2
1830 [О1у2, ЬеиЮ, 8ег11, А1а24]11ОЬР-2(1-30')-КН2.
Н-НСЮС8Р80ЕЬ8Т1ЬОКЬЛАКПГ1АА’Ь10ТК-МН2
1831 [О1у2, ТЬг7, ЬеиЮ, 8ег11, А1а24]11ОЬР-2(1-30)-НН2
НЛЮПС8РТОЕЬ8Т1ЬОЖАЛКОЕ(ЛХ¥иОТК-Т4Н2
1832 [О1у2, ТЪг7, ЬеиЮ, 8ег8,11 , А1а24]ЬОЬР-2(1-30)-МН2
Н-НСОС8ГТ8ЕЬ8Т1ЬОЖАА1ЮР1А\УЫ(УГК-ЭН2
1833 [О1у2, ЬеиЮ, 8ег8,11 , А1а24]ЮЬР-2(Ь30)-ЫН2
Η-ί]θηθ8Ε88ΕΕ8ΤΪΕΟΝ1,ΑΑΚΪ)ΡΤΛνΕΙΟΤΚ-ΝΗ2
1834 [О1у2, ТЬг7, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11 ,24]ЬОЬР-2(1-30)-МН2
Η-ΗΟΙΧ38ΓΤ8ΕΙ.ΑΤ1143ΝΙ,ΑΑΕΟΓΙΑ\νΐ,ΐρΤΚ-ΝΗ2
- 13 014184
1835 [О1у2, ЬеиЮ, Ьуз11 , А1а24]ЬОЬР-2(1 -30)-ΝΗ2
Н-Н0ОО8Е8ОЕЬКТ1ЬПМЬАА№Р1АХ¥Ь1рТК-14Н2
1836 [С1у2, ТЬг7, ЬеиЮ, Ьуз11 , А1а24]ЬОЬР-2(1-30)-1ЧН2
Η-ΗΟΟΟ8ΓΤΟΕΕΚΤΙΕϋΝΕΑΑΚΟΡΙΑνζυ0ΤΚ-ΝΗ2
1839 [ЬеиЮ, А1а11 , А1а24]ЬОЬР-2 (1-333-Κ<,-ΝΗ2
Η-ΗΟΟΟδΕδΏΕίΑΤΙίΟΝ ЬААЕОР1Аи’Ь10ТК1Т1Ж{,-Ь[Н>
1840 [Ьеи 10, А1а11 , А1а24|ИСЬР-2 (1-33)-ΝΗ2 Н4-ЮОС8Р8ЬЕЬАТ1ЬОЖАЛКОЕ1Л\¥Ы(/ГК1ТО-ЬН;;
1841 [ЬеиЮ, А1а11, А1а24]кОЬР-2 (1-30)-ΝΗ2
Н-НООО8Р8ОЕЬАТ1ЬПЖААКОР1А\¥Ы0ТК-КН2
1842 [ТЬг7, 8ег8, ЬеиЮ, Ьуз11 , А1а24]ЬОЬР-2 (1-30)-ΝΗ2
Н-НСГ)С8РТ8Р.ЬКТ11.ТЖЬААКВР1А\¥Ь[9ТК-МН2
1843 [ТЬг7, Ьеи 10, А1а11, А1а24]ЬОЬР-2 (1-30)-ΝΗ2
П-НООС5ЕТВЕЬАТ1ЬОЖАА№ПА\¥Ы0ТК-1ЧН,.
1844 [О1у2,01иЗ, Т11г5, 8ег8,11 , ЬеиЮ, А1а16,24,28]Ь6ЬР-2(1-33)-(Ьуз)6-КН2
Н-НСЕОТГ88ЕЬ8Т1ЬВАЬ.АА1<ОР1Л\\’ЫЛТК11ВК6-ПН2
1845 [О1у2, С1иЗ, ТЬг5, ЬеиЮ, 8ег11, А1а16,24,28]11ОЬР-2(1-33)-(Ьуз)6-ЙН2
Н-НС1Е6ГР8ОЕ1.811ЬОАЬААКО1'!А\УЬ[А1КП'ОК6-ПП2
1846 [О1у2,01иЗ, 8ег8,11, ЬеиЮ, А1а16,24^8]11СЬР-2(1-33)-(Ьу8)6-МН2
Н-НОЕО8Р88ЕЬ8Т1ЬОАЬАА1ШР1А\УЫАТК.1ТПК6ЦН2
1847 [О1у2, <31и3, ЬеиЮ, Зег 11 , А1а1б,24,28]11СЬР-2(1-33)-(Ьуз)6-КН2
Н-11СгЕС8Р8ОЕЬ8Т1ЬОЛЬАЛ11ВПА¥.'ЫАТК1ТОК{,-1ч1Н2
1848 [О1у2, С1иЗ, ТЬг5, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11 ,16,24,28]116ЬР-2(1-33)-(Ьуз)6-ЫН2
Н-НОЕОТГ88Е1,АТ1ЬОАЬ.А,\Г<ОГ1Л\¥Т1АТК1ТОК6-МН2
- 14 014184
1849 [С1у2,О1иЗ, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11 ,16,24,28]ЬОЬР-2(1-33)-(Ьуз)6-ЧН2
Н-НСЕС8Р88ЕЬАТ1ЬОАЬААКГ>Р1А\УЬ1АТК1ТОКб-ЧН2
1850 [С1у2, С1иЗ, ЬеиЮ, Ьув11 , Л1а16,24.28]ЬОЬР-2('1-33)-(Еуз).:-М1Е
Н-НОЕО8Р8ОЕЬКТ1 ЬЬАЕААК1)Р!АА-Е1АТКПиК6-ЕН2
1851 [О1у2,О1иЗ, ТЬг5, ЬеиЮ, Ьуз11, А1а16.24,28]11Ст1,Р-2(1-33)-(Т,уЯ);-КН;
Н-НСЕОТГ8ОЕЬКТ1ЬОАЬ/ЗЛКРПА\У|.| ΑΊΚΙΤΟΚ^-ΝΗπ
1852 [€г1у2, <31и3, ТЬг5, 8ег8, ЬеиЮ, Ьуз11 , А1а16,24,28]ЬСЬР-2(1-33)-МН2
Н-1КЗЕ(тГН58Е1.К'111.ЭА1.АА1ШПАА'ЫА1К1ТГЖ,.-МЬ
1853 [О1у2, О1иЗ, ТЬг5, 8ег8,11 , ЬеиЮ, А1а16,24,28]ЬОЬР-2(1-33)-МН2
Н-НОЕОТР88ЕЬ8Т1ШАЬААКОР1А\УЫАТК1ТО-МН2
1854 [О1у2, О1иЗ, ТЬг5, ЬеиЮ, 8ег11 , А1а16,24,28]116ЬР-2(1-33)-МН2
Н-НОЕСТР8ОЕЬ8Т1ЬОАЬААКОР1ААУЫАТК1ТО-ЦН2
1855 [О1у2, С1иЗ, 111x5, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11 ,16,24,28]ΚιΕΡ-2(1-33)-ΝΪ12
Н-НСЕС8Р88ЕЬ8Т1ЬОАЬААКОР1А^ЫАТК1ТО-МН2
1856 [О1у2, О1иЗ, 8ег8,11 , ЬеиЮ, А1а16,24,28]ЬОЬР-2(1-33>ЦН2
Н-НСЕО8Р8ОЕЬ8Т1ЬОАЬААКОР1АЗ¥Ь1АТК1ТО-РШ2
1857 [О1у2, О1иЗ, ЬеиЮ, 8ег11 , А1а16,24,28]ЬОЬР-2(1-33)-МН2
Н-НСЕСТР88ЕЬЛТ1ЬОЛЕЛЛЕ.Г)1Г1А\¥1.1АГК!ТО-\Н2
1858 [О1у2, О1иЗ, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11 ,16,24,28]ЬОЬР-2(1-33>ЦН2
Н-НОЕО8Р88ЕЬАТ1ЬОАЬААКОР1ААУЫАТК1ТО-ЯН2
1859 [Сг1у2, О1иЗ, ЬеиЮ, Ьуз11 , А1а1б,24,28]ЬОЬР-2(1-33)-1ЧН2
Н-НСЕО8Р8ОЕЬКТ1ЬОАЬААКЦР1АЗУЫАТК1ТО-МН2
1860 [О1у2, О1иЗ, Ώιγ5, ЬеиЮ, Ьуз11 , А1а16,24,28]11ОЬР-2(1-33)-ЦН2
НОЕаТР8ОЕЬКТ1ЬОАЬАА№Р1А\УЬ1АТИТО-НН2
1861 [О1у2, О1иЗ, ТЬг5, 8ег8, ЬеиЮ, Ьуз11 , Л1а16,24,28]ЬОЬР-2(1-33)-14Н2 НОЕОТР88ЕЬКТ1ЬОАЬААКОР1А^ЫАТК1ТО
Особенно предпочтительные соединения по настоящему включают соединения 1834, 1846, 1847, 1848, 1849, 1855, 1857 и 1858.
1834 Н-НОГКт8ГТ8Р.Т.ΑΤΤΤ.ΟΝΤ.ΑΑΚΟΡΙΑΑ’ΕΤΟΤΚ-ΝΗί
1846 Н-НСЕО8Р88ЕЬ8Т1ЬПАЬААКГ>Р1А5¥Ь1АТКП1)КбКН2
1847 Н-НОЕО8Р8ЦЕЬ8Т1ЬО ΑΕΑΑΚΟΡ1ΑΨΟΑΤΚΙΤϋΚ6-ΝΗ2
1848 Н-НОЕОТР8 8ЕЬЛТ1ЬОЛЬЛЛКОПАиЪЕ-\ТК1ТОК6-ЧН2
1849 Н-НОЕО8Р88ЕЬАТ1ЬОАЬААКПР1АА¥ЫАТК1ТОК6-МН2
1855 Н-НОЕО8Р88ЕЬ8Т1ЬОАЬААК.ОР1А\УЫАТК1ТО-ЦН2
1857 Н-НОЕОТР88ЕЬАТ1ЬОАЬААКОР1АА¥ЫАТК1ТО-КН2
1858 Н-НОЕО8Р88ЕЬАЛШАБААКБР!АУ'ЫАТК1ТО-ЫН2
- 15 014184
Исследование стабильности.
Специалист в данной области техники способен разработать подходящие методы (например, количественные методы) для обнаружения продуктов деградации аналогов СЬР-2. например, на основе методов, описанных здесь ниже. Деградация может представлять собой окисление, гидролиз и дезамидирование, в зависимости от идентичности и положения аминокислот в любом из приведенных аналогов СЬР-2 и условий, таких как уровень рН раствора и температура. Соединения могут быть классифицированы по химической стабильности, когда соединения выдерживают в жестких условиях (например, в условиях, подобных вызывающим деградацию) и затем исследованы на содержание остаточных пептидов. Кроме того, знания, приобретенные в отношении основных продуктов деградации, образующихся в жестких условиях, будут важны для последующей разработки аналитического метода.
Количественный анализ определения аналогов СЬР.
Специалист в данной области техники также способен разработать методы (например, количественные методы) для определения аналогов СЬР в сложных средах или растворах (например, плазма, моча, тканевый гомогенат, клеточный гомогенат, слюна или им подобные) для исследования абсорбции, распределения, метаболизма и выделения аналогов СЬР после введения млекопитающим или как части функциональных исследований клеточных систем ш νίΙΐΌ.
В одном варианте воплощения настоящего изобретения количественный анализ может основываться на антителах, полученных против аналогов СЬР или их фрагментов.
Антитела, полученные от иммунизированных животных, могут быть использованы для количественных анализов. В одном из примеров прямой сэндвич ЕЫ8Л может быть проведен с использованием первого антитела, имеющего сродство к одной части молекулы, иммобилизованного в многолуночном планшете. Затем образец вносят в лунки, и аналог СЬР связывается первым антителом. Связанный аналог СЬР затем узнается вторым антителом, имеющим сродство к другой части СЬР. Второе антитело может быть мечено ферментом (пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или β-галактозидазой) или радиоизотопом. Количество связанного аналога СЬР затем может быть определено введением колориметрического субстрата или прямым подсчетом источников радиоизлучения или сцинтилляцией. В качестве альтернативы, количество связанного аналога СЬР может быть определено косвенно с помощью добавления меченого антитела, имеющего сродство ко второму антителу. Концентрация в образце может быть оценена по отклику, полученному из кривой внешнего стандарта, включающей известные количества аналога СЬР. В качестве альтернативы, антитела могут быть использованы для проведения прямого конкурентного иммунноанализа, где антитело, специфичное к аналогу СЬР, иммобилизовано на многолуночном планшете, после чего образец выдерживают в лунках с определенной концентрацией меченого аналога СЬР. Метка может представлять собой фермент, флуорофор, радиоизотоп или биотин и детектироваться с использованием, например, субстратов (например, колориметрически, флурометрически или хемилюменисцентно), специфичных для ферментов, сцинтилляции или авидина, связанного с ферментом, с последующим определением, как описано выше. Количество связанного меченого аналога СЬР может быть определено подходящим способом и концентрацию аналога СЬР, присутствующего в образце, устанавливают по отклику, полученному из кривой внешнего стандарта, как описано выше.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения количественный анализ может быть основан на методе жидкостной хроматомасспектрометрии. По такой схеме отклик от исследуемого фрагмента, специфичного для аналога СЬР, получают при фрагментации исходного соединения, индуцированной столкновением с инертным газом (Не или Αγ). Перед фрагментацией компоненты образца могут быть разделены с использованием обращено-фазовой хроматографии или образец может быть инжектирован непосредственно в масс-спектрометр. При необходимости, образец может быть подвергнут предварительной обработке (т. е. введению ингибиторов протеазы, осаждению белков, твердофазной экстракции, иммуноаффинной экстракции и т.п.). Концентрация аналога СЬР, присутствующего в образце, устанавливается по отклику кривой внешнего стандарта, как описано выше, потенциально после уточнения отклика с использованием внешнего стандарта, идентичного исследуемому аналогу СЬР.
Получение специфических антител.
Специфические антитела против аналогов СЬР или их фрагменты могут быть получены в млекопитающих и выделены из сыворотки. Аналоги СЬР или их фрагменты могут быть использованы для иммунизации кроликов, мышей или других млекопитающих как непосредственно с адьювантом, так и аналоги СЬР или их фрагменты могут быть химически связаны с молекулой-носителем (т.е. гемоцианином лимфы улитки, овальбумином, альбумином и т.п.) и инъецированы с адьювантом. Инъекции могут быть повторены с интервалом 2-4 недели, увеличенным для улучшения сродства и селективности антител. Поликлональные антитела могут быть выделены непосредственно из сыворотки. Для получения моноклональных антител В клетки, выделенные из иммунизированных животных, предпочтительно мышей, должны быть слиты с опухолевыми клетками с получением антителопродуцирующих гибридом. Скрининг и селекция подходящих клонов и антител могут быть осуществлены с использованием как иммунизированных аналогов СЬР, так и их пептидов с последующим определением меченых антител. В качестве альтернативы, скрининг и селекция могут основываться на иммобилизированных антителах с последующей детекцией меченных с помощью аналогов СЬР или их фрагментов. В любых случаях метка мо
- 16 014184 жет представлять собой радиоизотоп, фермент, флуорофор или биотин и детектироваться (например, колориметрически, флурометрически или хемилюменисцентно) с помощью, например, субстратов, специфических для ферментов, сцинтилляции или авидина, связанного с ферментом, с последующим определением, как описано выше.
Синтез аналогов ОЬР-2.
Аналоги по настоящему изобретению предпочтительно синтезируют посредством твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза. В этом контексте приводится ссылка на XVО 98/11125 и в том числе ИеИк, ОВ е1 а1., 2002.
Таким образом, аналоги ОЬР-2 могут быть синтезированы многочисленными путями, включая, например, способ, который включает:
(a) синтез пептида посредством твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза и выделение полученного таким образом синтетического пептида; или (b) если пептид сконструирован из природных аминокислот, кодирующая конструкция нуклеиновой кислоты экспрессирует пептид в клетке-хозяине, который выделяют из культуры клетки-хозяина, или (c) если пептид сконструирован из природных аминокислот, проводят ίη νίίΓο бесклеточную экспрессию конструкцией нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, и выделяют продукты экспрессии или комбинация способов (а), (Ь) и (с) с получением фрагментов пептида с последующим связыванием фрагментов с получением пептида и выделением пептида.
Таким образом, для некоторых аналогов по настоящему изобретению предпочтительно использование генноинженерных технологий. Это возможно в тех случаях, когда пептид достаточно большой (или получен как слитая конструкция) и когда пептид состоит только из природных аминокислот, которые могут быть транслированы из РНК в живых организмах.
Фрагменты нуклеиновой кислоты, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, представляют собой важные химические продукты для рекомбинантной генной технологии. Следовательно, дополнительный аспект настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог ОЬР-2 по настоящему изобретению, где пептид предпочтительно включает природные аминокислоты. Фрагменты нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению представляют собой как фрагменты ДНК, так и фрагменты РНК.
Фрагменты нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению обычно встраивают в подходящие векторы, чтобы получить клонирующие или экспрессионные векторы, несущие фрагменты нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению; такие новые векторы также являются частью изобретения. Детали, касающиеся конструкции указанных векторов настоящего изобретения, будут описаны ниже в рамках трансформированных клеток и микроорганизмов. Векторы, в зависимости от цели и способа применения, могут находиться в форме плазмид, фагов, космид, минихромосом или вируса, а также важньм вектором является депротеинизированная ДНК, которая экспрессируется в определенных клетках исключительно транзиентно. Предпочтительные клонирующие и экспрессионные векторы (плазмидные векторы) настоящего изобретения способны к автономной репликации, обеспечивая, таким образом, высокое число копий в целях высокого уровня экспрессии или высокого уровня репликации для последующего клонирования.
Общая схема вектора настоящего изобретения включает следующие функционально связанные элементы в 5'^3' направлении: промотор, регулирующий экспрессию фрагмента нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерный пептид, обеспечивающий секрецию указанного фрагмента (во внеклеточное пространство или, по возможности, в периплазму), или лидерный пептид для разнообразных целей, например для комбинированной секреции, в качестве тэга для аффинной очистки, для ферментативного процессинга с целью коррекции пептида, а также для интеграции в мембрану полипептидного фрагмента; фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий пептид настоящего изобретения; и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая терминатор. При работе с векторами экспрессии в штаммах-продуцентах или клеточных линиях, в целях генетической стабильности трансформированной клетки, предпочтительно, чтобы вектор, вводимый в клетку-хозяина, интегрировался в геном клетки-хозяина.
Векторы настоящего изобретения используются для трансформации клеток-хозяев в целях продукции модифицированного пептида настоящего изобретения. Такие преобразованные клетки, которые также являются частью изобретения, могут быть культивируемыми клетками или линиями клеток, используемыми для получения фрагментов нуклеиновой кислоты и векторов по настоящему изобретению, или использоваться для получения пептидов по настоящему изобретению с помощью рекомбинантных технологий.
Предпочтительные трансформированные клетки по настоящему изобретению представляют собой микроорганизмы, такие как бактерии (такого вида как ЕксйепсЫа (напр., Е. со11), ВасШик (напр., ВасШик киЬЕНк), 8а1топе11а или МусоЬас1епит (предпочтительно непатогенных видов, напр., М. Ьо\зк БЦЖ), дрожжи (такого вида, как 8ассйаготусек се^еν^к^ае) и простейшие. В качестве альтернативы трансформи
- 17 014184 рованные клетки могут происходить из многоклеточного организма, то есть указанными клетками могут являться клетки гриба, клетки насекомого, клетки растения или клетки млекопитающих. Также интерес представляют клетки, полученные от человека, сравните описание клеточных линий и векторов ниже. В целях клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка являлась способной к репликации фрагмента нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения используются клетки, экспрессирующие нуклеиновый фрагмент; причем указанные клетки могут использоваться как для мелкомасштабного, так и для крупномасштабного производства пептидов по настоящему изобретениию.
При получении пептида по настоящему изобретениию посредством трансформированных клеток, желательно, хотя и необязательно, чтобы продукт экспрессии либо экспортировался в культуральную среду, либо презентировался на поверхности трансформированной клетки.
При выделении эффективной клетки-продуцента предпочтительно на ее основе получать устойчивую линию клеток, которая несет вектор по настоящему изобретениию и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий пептид. Предпочтительно указанная устойчивая линия клеток секретирует или несет пептид по настоящему изобретениию, облегчая, таким образом, его очистку.
В основном плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, которые происходят из совместимых с клеткой-хозяином видов, используются в совокупности с хозяевами. Вектор обычно несет участок репликации, а также маркерные последовательности, которые обеспечивают фенотипический отбор трансформированных клеток. Например, Е. сой обычно трансформируют, используя рВК.322 (хотя существует ряд других полезных плазмид) плазмиду, полученную из Е. сой 5рр. (см., например, Βοϊίνατ с1 а1., 1977). Плазмида рВК.322 несет гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, что обеспечивает, таким образом, простой способ идентификации трансформированных клеток. Плазмида рВК или другая микробная плазмида или фаг должна также содержать или должна быть модифицирована таким образом, чтобы содержать промоторы, которые могут использоваться прокариотическим микроорганизмом для экспрессии.
Промоторы, обычно используемые в конструировании прокариотической рекомбинантной ДНК, включают Р-лактамазную (пенициллиназные), систему на основе лактозного промотора (Сйаид с1 а1., 1978; Иакига с1 а1., 1977; Сосббс1 с1 а1., 1979), а также систему на основе триптофанового (1гр) промотора (Сосббс1 с1 а1., 1979; ЕР 0036776 А). Хотя указанные промоторы используются наиболее часто, были открыты и использовались другие микробные промоторы, причем была опубликована подробная информация относительно их нуклеотидных последовательностей, что позволяет специалисту в данной области техники функционально объединить их с плазмидными векторами (§1еЬ\геп115( с1 а1., 1980).
В дополнение к прокариотическим, эукариотическим микробам, также могут использоваться культуры дрожжей и промотор, который должен обеспечивать регулируемую экспрессию. Бассйагошусек сеге^'Ыае или обычные хлебопекарные дрожжи являются наиболее распространенными среди эукариотических микроорганизмов, хотя доступны и множество других штаммов. Для экспрессии в Бассйагошусе§, например, обычно используют плазмиду УКр7 (БИпсйсошЬ е1 а1., 1979; Кшдкшап е1 а1., 1979; Тксйешрег е1 а1., 1980). Указанная плазмида уже содержит ген 1гр1. который является селективным маркером для мутантного штамма дрожжей, неспособного расти на среде без триптофана, например АТСС № 44076 или РЕР4-1 (1опе8, 1977). Присутствие 1гр1 мутации, как особенности генома дрожжевой клеткихозяина, обеспечивает эффективную возможность для обнаружения трансформированных клеток по росту в отсутствии триптофана.
Подходящие последовательности промотора в дрожжевых векторах включают промоторы для 3фосфоглицерат киназы (НО/шап е1 а1., 1980) или других гликолитических ферментов (Не§8 е1 а1., 1968; Голландия, 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, гексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируваткиназа, триозафосфат изомераза, фосфоглюкоизомераза и глюкокиназа. При конструировании подходящих экспрессионных плазмид, в экспрессионный вектор также включены терминальные последовательности, связанные с 3'-концом экспрессируемых генов, в целях обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации.
Другими промоторами, имеющими дополнительное преимущество транскрипции, контролируемой условиями роста, являются промоторные области алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов деградации, связанных с метаболизмом азота, а также вышеуказанной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящим является любой плазмидный вектор, включающий функционирующие в дрожжах последовательности промотора, начала репликации и терминатора.
В дополнение к микроорганизмам в качестве организмов-хозяев могут также использоваться культуры клеток, полученные из многоклеточных организмов. В принципе, может быть получена любая клеточная культура в независимости от того, является ли она культурой клеток позвоночных или беспозвоночных. Тем не менее, больший интерес вызывают клетки позвоночных и размножение позвоночного организма в культуре (культуре ткани) в последние годы ставшей стандартной методикой (Т188ие СиЙиге, 1973). Примерами таких полезных линий клеток-хозяев являются клетки УЕКО и НеЬа, линии яйцекле
- 18 014184 ток китайских хомячков (СНО), а также клетки ^138, ВНК, СО8-7 293, 8робор!ега Ггищрегба (8Р) (коммерчески доступные как полные системы экспрессии, например, от Рго!ет 8с1епсез, 1000 Кезеагсй Рагктеау, Мепбеп, СТ 06450, США и от 1пуйгодеп), линия 82 клеток Ό. те1аподаз1ег, доступная от 1пуйгодеп, РО Вох 2312, 9704 СН Огошпдеп, Тке №1йег1апбз, и линии клеток МОСК.
Экспрессионные векторы для таких клеток обычно включают (в случае необходимости) начало репликации, промотор, располагающийся перед экспрессируемым геном, наряду с любыми необходимыми участками связывания рибосомы, участками сплайсинга РНК, участками полиаденилирования и последовательностями терминатора транскрипции.
Функции регулирования в векторах экспрессии для использования в клетках млекопитающих часто обеспечиваются вирусным материалом. Например, обычно используются промоторы, полученые из вируса полиомы, аденовируса 2, и наиболее часто из вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (8ν40). Ранние и поздние промоторы вируса 8ν40 особенно полезны, так как оба легко могут быть получены из вируса в виде фрагмента, который также содержит начало репликации вируса 8ν40 (Р1егз е1 а1., 1978). Также могут использоваться меньшие или большие фрагменты 8ν40, если в них включена последовательность размером около 250 п.н., идущая от сайта НшбШ до сайта Вд11, расположенных в начале репликации вируса. Далее также возможно и чаще предпочтительно использовать промоторные или регуляторные последовательности, обычно связанные с последовательностью желаемого гена, если такие регуляторные последовательности совместимы с системами клеток-хозяев.
Начало репликации может обеспечиваться либо конструкцией вектора, чтобы включать экзогенное начало репликации, которое может быть получено из 8ν40 или другого вируса (напр., вируса полиомы, аденовируса, вируса везикулярного стоматита, коровьего вируса папиломы), либо может обеспечиваться механизмом хромосомной репликации клетки-хозяина. Если вектор интегрирован в хромосому клеткихозяина, то последнее обычно является достаточным.
Чтобы получить приемлемые уровни продукции в процессе рекомбинантного производства, может быть выгодным приготовить аналоги в виде слитых белков, или путем сшивания пептида с последовательностью, которая может служить аффинным тэгом (для простоты очистки), и/или имеющих в составе многократные повторы пептида. Указанные методы требуют присутствия подходящего сайта расщепления для пептидазы, тем не менее, специалист в данной области техники будет знать, как создать основные генетические конструкции.
После получения с помощью рекомбинантных технологий, пептиды настоящего изобретения могут быть очищены методами, известными в уровне техники, включая многостадийную хроматографию (ионообменые, гельфильтрационные и аффинные хроматографические методы).
В качестве альтернативы, в бесклеточных системах ш уйго могут быть получены пептиды, состоящие из природных аминокислот. Это особенно целесообразно в тех случаях, когда пептиды могут быть токсичны для предполагаемых клеток-хозяев. Таким образом, настоящее изобретение также рассматривает использование бесклеточной трансляции/экспрессии ш уйго для получения пептидов по настоящему изобретению. В связи с этим приведена ссылка на коммерчески доступные наборы ш уйго трансляции, материалы и техническую документацию, например, от АтЫоп 1пс, 2130 ^ооб^агб, Остин, ТХ 787441832, США.
Наконец, доступные методы могут быть, конечно, скомбинированы с целью получения, например, полусинтетических аналогов. В связи с этим, пептидные фрагменты получают, используя по крайней мере 2 отдельных стадии или метода, сопровождаемых лигированием указанных фрагментов для получения конечного пептидного продукта.
Фармацевтические композиции и введение.
Аналоги ОЬР-2 по настоящему изобретению или их соли или производные могут входить в состав фармацевтических композиций, подготовленных к хранению или введению, которые при этом включают терапевтически эффективную дозу пептида ОЬР-2 по настоящему изобретению или его соль или производное в фармацевтически приемлемом носителе.
Терапевтически эффективная доза соединения по настоящему изобретению будет зависеть от пути введения, вида обрабатываемого млекопитающего и физических особенностей определенного исследуемого млекопитающего. Указанные факторы и их отношение к определению указанной дозы известны квалифицированным специалистам, обладающим медицинскими навыками. Указанная доза и способ введения могут быть разработаны таким образом, чтобы достичь оптимальной эффективности и обеспечить доставку пептида в толстый кишечник, но будут зависеть при этом от таких факторов как вес, питание, параллельное лечение, а также от других факторов, известных квалифицированным специалистам, обладающим медицинскими навыками.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, в которой аналог ОЬР-2, или его соль присутствует в дозировке, эффективной для терапии или профилактики желудочных и кишечных расстройств.
Фармацевтически приемлемые соли соединений по настоящему изобретению, имеющих кислотную группу, могут быть образованы с использованием органических и неорганических оснований. Подходящие соли, образованные с основаниями, включают такие соли металлов, как соли щелочных или щёлоч
- 19 014184 но-земельных металлов, например соли натрия, калия или магния; соли аммония и соли таких органических аминов, как морфолин, тиоморфолин, пиперидин, пирролидин, моно-, ди- или тринизший алкиламин (например, этил-трет-бутил-, диэтил-, диизопропил-, триэтил-, трибутил- или диметилпропиламин) или моно-, ди- или тригидроксинизший алкиламин (например, моно-, ди- или триэтаноламин). Также могут быть образованы внутренние соли. Аналогичным образом, когда соединение по настоящему изобретению включает основную группу, соответствующие соли могут быть образованы с использованием органических и неорганических кислот. Например, могут быть образованы соли со следующими кислотами: уксусной, пропионовой, молочной, лимонной, винной, янтарной, фумаровой, малеиновой, малоновой, миндальной, яблочной, фталевой, хлороводородной, бромоводородной, фосфорной, азотной, серной, метансульфоновой, нафталинсульфоновой, бензолсульфоновой, толуолсульфоновой и камфорсульфоновой, а также с другими известными фармацевтически приемлемыми кислотами. Также могут быть образованы соли присоединения аминокислот с такими аминокислотами, как лизин, глицин или фенилаланин.
Квалифицированному специалисту, обладающему медицинскими навыками, будет очевидно, что терапевтически эффективная доза пептидов или фармацевтических композиций по настоящему изобретению изменится в зависимости от возраста, веса и от вида млекопитающего, подвергнутого терапии, от конкретных использованных соединений, специфического способа введения, а также желаемых эффектов и терапевтических показаний. Поскольку перечисленные факторы и их связь с определением указанной дозы известны в медицине, то определение терапевтически эффективных уровней дозировки и собственно дозы, необходимой для достижения желаемого результата профилактики и/или лечения желудочно-кишечных заболеваний, описанных здесь, а также другие медицинские показания, раскрытые здесь, будут находиться в компетенции специалиста в данной области техники.
В настоящем изобретении терапевтически эффективное количество является таким количеством, которое уменьшает симптомы данного состояния или патологии и которое предпочтительно нормализует физиологические ответы у индивидуума с указанным состоянием или патологией. Уменьшение симптомов или нормализация физиологических ответов могут быть определены с использованием стандартных методов из уровня техники и могут меняться у индивидуума с указанным состоянием или патологией. В одном аспекте терапевтически эффективное количество одного или более аналогов СЬР-2 или фармацевтической композиции, включающей один или более указанных аналогов СЬР-2, является тем количеством, которое восстанавливает измеряемый физиологический параметр, в основном, до значения параметра у индивидуума без указанного состояния или патологии (предпочтительно до +30%, более предпочтительно до +20% и еще более предпочтительно до 10% значения параметра).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения введение соединений или фармацевтической композиции по настоящему изобретению начинают при более низких уровнях дозировки с увеличением уровней дозировки до достижения желаемого эффекта профилактики/лечения, соответствующего медицинским показаниям, таким как желудочно-кишечные заболевания. Это определило бы их терапевтически эффективное количество. Для пептидов по настоящему изобретению одного или как части фармацевтической композиции такие дозы могут находиться в пределах от около 0,01 до 100 мг/на кг массы тела, в пределах от около 0,01 до 10 мг/на кг массы тела, например, 10-100 мг/на кг массы тела.
Для терапевтического применения выбранный аналог СЬР-2 объединяют с носителем, фармацевтически приемлемым для введения пептида выбранным способом. В соответствии с целями настоящего изобретения периферийные парентеральные способы введения включают внутривенные, внутримышечные, подкожные и внутрибрюшинные способы введения. Определенные соединения, используемые в настоящем изобретении, также могут быть пригодными для введения орально, ректально, назально или через нижние дыхательные пути. Указанные способы введения являются так называемыми непарентеральными способами введения. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает аналог СЬР-2 по настоящему изобретению или его соль или производное и фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие фармацевтически приемлемые носители представляют собой носители, используемые традиционно с лекарствами на основе пептидов, такие как разбавители, наполнители и т.п. Фармацевтически приемлемые носители для терапевтического использования хорошо известны из предшествующего уровня техники и описаны, например, в ВеттдЮп'з РБагтасеийса1 Заепсез, Маск РиЬНзЬтд Со. (А.В. Сеппаго ебй. 1985). Например, могут использоваться стерильный солевой и фосфатно-солевой буферы при слегка кислом или физиологическом рН. Буферными агентами могут быть фосфат, цитрат, ацетат, трис(гидроксиметил)аминометан (ТВ1З), №трис(гидрокисметил)метил-3-аминопропансульфоновая кислота (ТАРЗ), бикарбонат аммония, диэтаноламин, гистидин, являющийся предпочтительным буфером, аргинин, лизин или ацетат или их смеси. Предпочтительные значения рН буферов находятся в диапазонах рН 4-8, рН 6,5-8, более предпочтительно рН 7-7,5. В состав фармацевтической композиции могут быть включены такие консерванты, как пара-, мета- и ортокрезол, метил- и пропилпарабен, фенол, бензиловый спирт, бензоат натрия, бензойная кислота, бензилбензоат, сорбиновая кислота, пропановая кислота, эфиры п-гидроксибензойной кислоты. В состав фармацевтической композиции могут быть включены стабилизаторы, которые предотвращают окисление, дезамидирование, изомеризацию, рацемизацию, циклизацию, гидролиз пептидов, такие как, например, аскорбиновая кислота, метио
- 20 014184 нин, триптофан, ЕЭТА, аспарагин, лизин, аргинин, глутамин и глицин. В состав фармацевтической композиции могут быть включены стабилизаторы, предотвращающие агрегацию, образование волокон и преципитацию, такие как додецилсульфат натрия, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза, циклодекстрин. В состав фармацевтической композиции также могут быть включены органические модификаторы для солюбилизации или предотвращения агрегации, такие как этанол, уксусная кислота или ацетаты. В состав фармацевтической композиции могут быть включены изотонические агенты, такие как соли, например хлорид натрия, или наиболее предпочтительные из углеводов, например декстроза, маннитол, лактоза, трегалоза, сахароза или их смеси.
В фармацевтическую композицию могут входить детергенты, такие как Тетееи 20, Тетееи 80, 8Ό8, полоксамеры, например плюроник Р-68, плюроник Р-127. В фармацевтическую композицию могут входить красители и даже ароматизаторы. В другом варианте воплощения настоящего изобретения в фармацевтическую композицию может входить фармацевтически приемлемая аддитивная соль кислоты аналога пептида ОЬР-2. Могут быть использованы суспендирующие агенты. В фармацевтическую композицию для лиофилизации лиофилизируемого продукта могут входить органические модификаторы, такие как этанол, третичный бутиловый спирт, 2-пропанол, глицерин, полиэтиленгликоль. В фармацевтическую композицию для лиофилизации могут входить агенты-наполнители и изотонические агенты, такие как соль, например хлорид натрия, углеводы, например декстроза, маннитол, лактоза, трегалоза, сахароза или их смеси, аминокислоты, например глицин, глютамат, или инертные носители, такие как цистеин, лецитин или сывороточный альбумин человека или их смеси.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены и применены в виде таблеток, капсул или эликсиров для орального введения; суппозиториев для ректального введения; предпочтительно стерильных растворов или стерильного порошка или суспензии для введения инъекцией и т. п. Доза и способ введения могут быть подобраны для достижения оптимального эффекта, но зависят от таких факторов, как вес, диета, сопутствующее лечение и другие факторы, которые известны специалисту в области медицины.
При парентеральном введении, таком как, например, внутривенное и подкожное, ежедневно инъецируемые фармацевтические композиции могут быть получены в традиционных формах, таких как водные растворы или суспензии; лиофилизованные формы, твердые формы или суспензии или эмульсии, подходящие для восстановления жидкостью непосредственно перед инъекцией.
Разбавители для восстановления лиофилизованного продукта могут представлять собой подходящие буферы из выше приведенного списка, воду, физиологический раствор, декстрозу, маннитол, лактозу, трегалозу, сахарозу, лецитин, альбумин, глютамат натрия, цистеина гидрохлорид или воду для инъекций с введением детергентов, таких как Тетееп 20, Тетееп 80, полоксамеры, например плюроник Р-68 или плюроник Р-127, полиэтиленгликоль и/или с введением консервантов, таких как пара-, мета- и ортокрезол, метил- и пропилпарабен, фенол, бензиловый спирт, бензоат натрия, бензойная кислота, бензилбензоат, сорбиновая кислота, пропионовая кислота, эфиры п-гидроксибензойной кислоты, и/или с введением органического модификатора, такого как этанол, уксусная кислота, лимонная кислота, молочная кислота и их соли.
Кроме того, если требуется, инъецируемые фармацевтические композиции могут включать незначительное количество нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты или рН забуферивающие агенты. Могут быть использованы вещества, усиливающие абсорбцию (например, липосомы, детергенты и органические кислоты).
В одном варианте воплощения настоящего изобретения получают соединения для введения инфузией, например, в качестве жидких питательных добавок для пациентов, получающих общую парентеральную нутритивную терапию (например, новорожденные или пациенты, страдающие кахексией или анорексией) или инъекцией, например, подкожно, интраперитонеально или внутривенно и, таким образом, примененные в виде водных растворов в стерильной и апирогенной форме и необязательно забуференных до физиологически допускаемого рН, например слабо кислый или физиологический рН. Состав для внутримышечного введения может быть основан на растворах или суспензиях в растительном масле, например масле канолы, кукурузном масле или соевом масле. Эти масла в основе составов могут быть стабилизированы антиоксидантами, например ВНА (бутилированный гидроксианизол) и ВНТ (бутилированный гидрокситолуол).
Таким образом, пептидные соединения по настоящему изобретению могут быть введены с носителями, такими как дистиллированная вода или физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, 5% растворы декстрозы или масел. Растворимость аналога ОЬР-2 может быть повышена, если требуется, введением усилителя растворимости, такого как детергенты и эмульгаторы.
Водный носитель или носитель может быть добавлен для применения в инъекциях с желатином, который служит для пролонгированного действия аналога ОЬР-2 в месте инъекции или рядом с ним для его медленного выделения при желаемом местном воздействии. В качестве альтернативы могут быть использованы такие желирующие агенты, как гиалуроновая кислота, которые также могут быть использованы в качестве агентов, замедляющих всасывание.
В одном варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:
- 21 014184
A. Ь-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций от 0,5 до 300 мМ, предпочтительно от 3 до 200 мМ, наиболее предпочтительно от 20 до 100 мМ;
B. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ;
C. Уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ и более предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:
A. Ь-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций от 0,5 до 300 мМ, предпочтительно от 3 до 200 мМ, наиболее предпочтительно от 20 до 100 мМ Ь-гистидина;
B. Ь-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;
C. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ;
Ό. Уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:
A. Ь-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 3 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ Ь-гистидина;
B. Ь-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 мМ до 50 мМ;
C. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 мМ до 230 мМ;
Ό. Уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:
A. Ь-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций от 0,5 до 300 мМ, предпочтительно от 3 до 200 мМ, наиболее предпочтительно от 20 до 100 мМ Ь-гистидина;
B. Ь-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;
C. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ;
Ό. Уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:
- 22 014184
Α. Ь-гистидин, растворенный в воде с получением конечных концентраций вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 3 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ Ь-гистидина;
B. Ь-аргинин с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;
C. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ;
Ό. Уксусную кислоту с получением вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,05 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 0,5 до 50 мМ в растворе.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения состав включает:
Α. Ν-ацетат, растворенный в воде с получением конечных концентраций вплоть до 200 мМ, предпочтительно от 0,5 до 100 мМ, наиболее предпочтительно от 5 до 50 мМ;
В. Маннитол с получением вплоть до 350 мМ, предпочтительно от 30 до 300 мМ, наиболее предпочтительно от 100 до 230 мМ.
Соответствующее количество терапевтического соединения вводят с получением концентраций от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 5 до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
рН регулируют до конечного рН от 4 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5, наиболее предпочтительно от 6,7 до 7,3. Полученный в результате раствор корректируют до заданной массы, проводят стерилизующую фильтрацию и распределяют в соответствующих аликвотах в ампулы для фармацевтического применения. Состав дополнительно обрабатывают в соответствии с тем, жидкий продукт или продукт лиофилизованный.
Аналоги СЬР-2 по настоящему изобретению также могут входить в состав композиции для медленного высвобождения из имплантируемого устройства для пролонгированного и замедленного выделения пептида аналога СЬР-2. Такие составы замедленного выделения могут быть в форме пластыря, расположенного на внешней поверхности тела. Примеры составов замедленного выделения включают композиции биологически совместимых полимеров, таких как полимолочная кислота, сополимер молочной и гликолевой кислот, метилцеллюлоза, гиалуроновая кислота, сиаловая кислота, силикат, коллаген, липосомы и т. п. Составы замедленного выделения могут быть особенно полезны, когда требуется обеспечить высокую местную концентрацию аналога СЬР-2 по настоящему изобретению.
Аналог СЬР-2, прошедший стерильную фильтрацию, может быть помещен в ампулу или емкость в количестве, оказывающем трофическое воздействие на кишечник. Емкость или ампула может содержать аналог СЬР-2 в качестве состава, готового для введения, и необходимый носитель. В качестве альтернативы, емкость или ампула может содержать пептид СЬР-2 в таких формах, как лиофилизованная форма, подходящая для восстановления в подходящем носителе, таком как стерильная вода или физиологический раствор, забуференный фосфатом.
В качестве альтернативы инъектируемым составам аналог СЬР-2 может входить в композицию, вводимую другим способом. В соответствии со стандартной фармацевтической практикой могут быть получены композиции лекарственных форм для орального введения, такие как таблетки, капсулы и т.п. Согласно настоящему изобретению аналог СЬР-2 вводят для лечения индивидуумам для оказания положительного влияния на рост тканей тонкого кишечника.
Лекарственные формы для назального введения могут иметь в своем составе усилители, такие как хитозан или детергенты, такие как Тетееп 20, Тетееп 80, полоксамеры, например плюроник Е-68 или плюроник Е-127; Вгу 35, Вгу 72, кремофор ЕЬ.
Пептидные соединения по настоящему изобретению могут применяться как по отдельности, так и в комбинации с соединениями, обладающими противовоспалительным воздействием. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения предположили, что комбинированное лечение может усилить положительные эффекты лечения аналогом пептида по настоящему изобретению.
Терапевтическая дозировка и режим, наиболее подходящие для лечения пациента, конечно, варьируют в зависимости от лечимого заболевания или состояния и зависят от веса и других параметров пациента. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы считают, что дозы в показателях мг/кг и длительность или частота повторяемости лечения позволяют получить терапевтически эффективные результаты, такие как статистически значимое повышение, в частности, массы тонкого кишечника. В некоторых примерах терапевтический режим может включать введение поддерживающей дозы, подходящей для предотвращения тканевой регрессии, что случается после прекращения проводимого лечения. Дозировка и режим, наиболее подходящие для применения человеком, могут быть определены по результатам, полученным в настоящем изобретении, и могут быть подтверждены проведением собственно кли
- 23 014184 нических испытаний.
Эффективная дозировка и протоколы лечения могут быть определены традиционными способами, начиная с низкой дозы на лабораторных животных и повышая дозировку с проведением мониторинга воздействия и систематически варьируя схему приема. При определении оптимальной дозы для конкретного субъекта должны быть приняты во внимание различные факторы. Такие факторы известны специалисту в данной области.
Дозировка пептида ОЬР-2 для человека по настоящему изобретению в одном варианте воплощения настоящего изобретения может составлять от около 10 до около 10 мг/кг/день, предпочтительно от около 50 до около 5 мг/кг /день и наиболее предпочтительно от около 100 до около 1 мг/кг /день.
Медицинские показания.
Пептиды по настоящему изобретению применяют в качестве фармацевтических агентов для профилактики или лечения индивидуума, страдающего заболеваниями желудочно-кишечного тракта, включая пищевод верхнего отдела желудочно-кишечного тракта, введением эффективного количества аналога ОЬР-2 или его соли, как описано здесь. Заболевания желудочно-кишечного тракта включают язвы любой этиологии (например, пептидные язвы, язвы, обусловленные действием лекарственных препаратов, язвы, обусловленные инфекциями или другими патогенами), нарушения пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченной тонкой кишки, синдром прямокишечно-маточного углубления, воспалительные заболевания кишечника, брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или целиакии), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, энтериты, язвенные колиты, поражения тонкого кишечника и диарею/воспаления слизистой оболочки, обусловленные химиотерапией (СГО).
Как было указанно выше, как правило, кандидатами для лечения настоящими аналогами ОЬР-2 являются индивидуумы, которые будут ощущать положительное воздействие от увеличения массы тонкого кишечника и последствий и/или поддержания нормальной структуры слизистой тонкого кишечника и ее функции. Конкретные состояния, которые могут быть вылечены аналогом ОЬР-2, включают различные формы спру, включая глютеновое спру, которое является результатом токсической реакции на альфаглиадин из-за нагревания и может быть результатом глютеновой энтеропатии или целиакии, и отмечается значительная потеря ворсинок тонкого кишечника; тропические спру являются результатом инфекции и отмечается частичное уплощение ворсинок; гипогаммаглобулемические спру, наблюдаемые, как правило, у пациентов с общим неклассифицируемым иммунодефицитом или гипогаммаглобулемией, и отмечается значительное понижение высоты ворсинок. Терапевтическая эффективность лечения аналогом ОЬР-2 может быть проконтролирована кишечной биопсией для исследования морфологии ворсинок, оценкой поглощения питательных веществ, прибавкой в весе пациента или улучшением симптомов, связанных с этими состояниями.
Другие состояния, которые могут лечиться аналогами ОЬР-2 по настоящему изобретению или для которых аналоги ОЬР-2 могут быть использованы в качестве профилактического средства, включают в дополнение к выше приведенным лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты, повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химических агентов.
Аналоги ОЬР-2 также могут быть применены для лечения нарушений питания, например кахексии и анорексии.
Конкретный вариант воплощения настоящего изобретения относится к применению пептидов по настоящему изобретению для профилактики и/или лечения повреждений кишечника и его дисфункции. Такие повреждения и дисфункция хорошо известны как побочный эффект лечения рака химиотерапией. Применение химиотерапии часто связано с неожиданными побочными эффектами, оказываемыми на пищеварительную систему, такими как мукозиты, диарея, бактериальная транслокация, синдром пониженного всасывания, абдоминальные спазмы, желудочно-кишечные кровотечения и рвота. Эти побочные эффекты являются клиническими последствиями повреждения структуры и функции кишечного эпителия и часто требуют снижения доз и частоты применения химиотерапии. Введение агонистов пептида ОЬР-2 по настоящему изобретению может усилить воздействие на кишечные крипты и быстро обеспечить рост новых клеток для замещения поврежденного кишечного эпителия, вызванного химеотерапией. Конечная цель, достигаемая введением пептидов по настоящему изобретению, снижение заболеваемости, связанной с повреждениями желудочно-кишечного тракта у пациентов, получающих химиотерапию, при этом создается оптимальный режим проведения химиотерапии для лечения рака. Сопутствующая профилактика или терапевтическое лечение могут быть проведены в соответствии с настоящим изобретением у пациентов, получающих лучевую терапию, или тех, кто будет ее получать.
Стволовые клетки слизистой тонкого кишечника, по существу, потенциально страдают от цитотоксических воздействий химиотерапии из-за большой скорости пролиферации (КееГе а! а1., Си1 2000; 47: 632-7). Повреждения слизистой тонкого кишечника, вызванные химиотерапией, клинически часто относят к мукозитам желудочно-кишечного тракта, и они характеризуются ослаблением абсорбции и защитного барьера тонкого кишечника. Например, было выявлено, что широко применяемые химиотерапевтические агенты 5-Ри, иринотекан и метотрексат повышают апоптоз, ведущий к атрофии ворсинок и гипоплазии крипт тонкого кишечника грызунов (КееГе а! а1., Си1 47: 632-7,2000; О1Ьзоп е! а1., I ОАз1гоеп1его1
- 24 014184
Нера!о1. Зер; 18(9):1095-1 100, 2003; Татак1 е! а1., I Гп! Меб Вез. 31(1):6-16, 2003). Было выявлено, что химиотерапевтические агенты повышают апоптоз кишечных крипт через 24 ч после введения и, как следствие, снижают площадь ворсинок, глубину крипт, количество митозов в крипте и рост энтероцитов через три дня после химиотерапии у людей (Кее£е а! а1., Си! 2000;47: 632-7). Таким образом, структурные изменения тонкого кишечника напрямую ведут к дисфункции кишечника и в некоторых случаях к диарее.
Желудочно-кишечные мукозиты после химиотерапии рака представляют собой большую проблему, которая, по существу, не решается моментально, но может быть снята поэтапно. Исследования, проведенные с использованием противоопухолевых цитостатических препаратов 5-РИ и иринотекана показали, что химиотерапевтический эффект этих лекарственных препаратов, главным образом, оказывает неблагоприятное воздействие на структурную целостность и функцию тонкого кишечника, при этом толстая кишка менее чувствительна и отвечает, главным образом, повышенным образованием слизи (С1Ьзоп е! а1., I. Саз!гоеп!его1 Нера!о1 Зер; 18(9): 1095-110, 2003; Татак1 е! а1., I. 1п! Меб Вез. 31(1):6-16,2003).
Новые аналоги СЬР-2 по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики и/или лечения повреждения желудочно-кишечного тракта и побочных эффектов химиотерапевтических агентов. Это потенциально важное терапевтическое применение может быть проведено на сегодняшний день с использованием химиотерапевтических агентов, таких как, но без ограничений, 5-РИ, альтретамин, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, крисантаспас, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, флударабин, флюороурацил, гемцитабин, гидроксикарбамид, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, липосомальный доксорубицин, лейковорин, ломустин, мельфалан, меркаптопурин, месна, метотрексат, митомицин, митоксантрон, оксалиплатин, паклитаксель, пеметрексет, пентостатин, прокарбазин, ралтитрексед, стрептозоцин, тегафур-урацил, темозоломид, тиотепа, тиогуанин, топотекал, треосульфан, винбластин, винкристин, виндесин, и винорелбин.
Предполагается, что пептиды по настоящему изобретению могут быть применены в способе лечения новорожденных введением эффективного количества аналога СЬР-2 или его соли. Осложнения при вскармливании новорожденных, связанные с недоразвитостью желудочно-кишечного тракта, могут быть преодолены применением агонистов пептида по настоящему изобретению.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения описан способ лечения состояний, обусловленных ИРР-ГУ (дипептидилпептидаза-ΐν), введением пациенту при необходимости эффективного количества аналога СЬР-2 или его соли. Такие заболевания включают состояния, при которых фермент ИРР-ΐν вырабатывается в повышенном количестве.
В одном варианте воплощения настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть получена для замедленного выделения указанного аналога СЬР-2, или его соли, или производного, как описано выше.
Примеры
Следующие примеры предназначены для пояснения предпочтительных аспектов настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.
Общий пептидный синтез
Приборы и стратегия синтеза.
Пептиды синтезировали ступенчато в полиэтиленовой емкости, оборудованной полипропиленовым фильтром для фильтрации, с использованием 9-флуоренилметилоксикарбонильной группы (Ртос) в качестве Ν-оРаминозащитной группы, как стандартно используемой группы для защиты боковых цепей.
Растворители.
ДМФА (Ν,Ν-диметилформамид, В1ебе1 бе-Наеп, Сегтапу) очищали с помощью колонки, загруженной высокоэффективной катионобменной смолой (Ье^ай! З 100 МВ/Н з!гопд ааб, Вауег АС Ьеуегкизеп, Сегтапу) и исследовали перед использованием на наличие свободных аминов путем добавления 3,4дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин (РЬЬ!-ОН), при наличии свободных аминов происходит окрашивание в желтый цвет (ИНЫ-О-анион). Растворитель ИСМ (дихлорметан, чда, В1ебе1 бе-Наеп, Сегтапу) использовали непосредственно без предварительной очистки. Ацетонитрил (НРЬС-дгабе, ЬаЬЗсап, ИцЫш 1ге1апб) использовали непосредственно без предварительной очистки.
Аминокислоты.
Ртос-защищенные аминокислоты были получены от Абνаηсеб СЬетТесЬ (АСТ).
Сшивающие агенты.
Сшивающий агент диизопропилкарбодиимид (ИГС) был получен от В1ебе1 бе-Наеп, Сегтапу. Твердые подложки.
Пептиды синтезировали на смолах Теп!аСе1 З 0,22-0,31 ммоль/г. Теп!аСе1 З-Ват, Теп!аСе1 З ВАМЬуз(Вос)Ртос (Варр полимер, Сегтапу) использовали в случаях, когда был предпочтительным амидированный по С-концу пептид, в то время как Теп!аСе1 З РНВ, Теп!аСе1 З РНВ Ьуз(Вос)Ртос использовали, когда была предпочтительной свободная С-концевая карбоксильная группа.
Катализаторы и другие реагенты.
Диизопропилэтиламин(П1ЕА) были получены от А1бпсЬ, Сегтапу, пиперидин и пиридин от В1ебе1
- 25 014184 йе Наеп, ЕгапкГиг!, Оегтапу. Этандитиол был получен от К1ейе1-йе Наеп, ЕгапкГиг!, Оегтапу. 3,4-дигидро3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин(ОЬЫ!-ОН), 1-гидроксибензотриазол (НОВ!) (НОА!) были получены от Е1ика, 8\\'Цхег1апй. Уксусный ангидрид был получен от Пика.
Процедуры сшивания.
Аминокислоты сшивали посредством получения ш кйи НОЫ! или НОА! эфиров из соответствующей Ν-α-защищенной аминокислоты и НОВ! или НОА! с ΟΙΟ в ОМЕ. Степень ацилирования проверяли с использованием нингидринового теста, выполненного при 80°С, в целях предотвращения Ртосдепротекции (Еагкеп, В.О. и Но1т, А., 1п!. 1. Рерййе Рго!еш Кек. 43, 1994, 1-9).
Депротекция Ν-α-защитной группы(Етос).
Снятие Етос-группы выполняли обработкой 20% пиперидином в ОМЕ (1x5 и 1х 10 мин), с последующей отмывкой с использованием ОМЕ (5х 15 мл, по 5 мин каждая), пока после добавления ОЬЫ!-ОН к слитому ОМЕ не переставал обнаруживаться желтый цвет.
Сшивание НОВ!-эфиров.
экв. Ν-α-защищенных аминокислот растворяли в ОМЕ с 3 экв. НОВ! и 3 экв. О1С, после чего полученный раствор добавляли к смоле.
Снятие пептида кислотой со смолы.
Пептиды снимали со смолы путем обработки 95%-м (по объему) водным раствором трифторуксусной кислоты (ТЕА, К1ейе1-йе Наеп, ЕгапкГиг!, Оегтапу) или 95%-м (по объему) раствором ТЕА с 5% этандитиола при комнатной температуре в течение 2 ч. Профильтрованные смолы промывали 95%-м водным раствором ТЕА, после чего фильтраты и промывки выпаривали при пониженном давлении. Остаток промывали эфиром и лиофильно высушивали от водной уксусной кислоты. Неочищенный лиофильно высушенный продукт анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и идентифицировали масс-спектрометрией (М8).
Ступенчатый пептидный синтез на смоле Теп!аОе1 (РЕО-Р8).
Смола Теп!аОе1 (1 г, 0,23-0,24 ммоль/г) была помещена в полиэтиленовую емкость, оборудованную полипропиленовым фильтром для фильтрации. После набухания в ОМЕ (15 мл), смолу обработали 20% раствором пиперидина в ОМЕ для удаления начальной Етос группы либо на линкере Теп!аОе1 8 КАМ, либо на первой аминокислоте на смоле Теп!аОе1 8 КАМ-Ьук(Вос)Етос. Смола была высушена и промыта ОМЕ, пока после добавления ОЬЫ!-ОН к слитому ОМЕ не переставал обнаруживаться желтый цвет. Аминокислоты в соответствии с последовательностью были присоединены в виде Етос-защищенных НОВ! эфиров (3 экв.), как описано выше. Сшивание проводилсь в течение 2 ч, если не указано другое. Смола была высушена и промыта ОМЕ (5x15 мл, 5 минут каждый), чтобы удалить избыток реагента. Степень ацилирования была проверена с помощью нингидринового теста, как описано выше. После завершения синтеза смола с пептидом была промыта ОМЕ (3x15 мл, по 5 мин), ОСМ (3x15 мл, по 1 мин) и, наконец, диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин), после чего высушена в вакууме. Пептид был снят со смолы, как описано ранее, после чего неочищенный пептид был проанализирован и очищен, как описано ниже.
Параметры ВЭЖХ.
Градиент ВЭЖХ-анализ проводили с использованием ВЭЖХ-системы Не\\1е11 Раскагй НР 1100, состоящей из насоса для четырехкомпонентных смесей НР 1100, автосэмплера НР1100, колоночного термостата НР 1100 и НР 1100 многоволнового детектора. Для управления прибором и снятия данных использовали Не\\1е11 Раскагй СЬетκ!а!^ои с программным обеспечением для ЖХ (геу. А.06.01). Использовались следующие колонки и система ВЭЖХ буферов.
Колонка: УУОАС 238ТР5415, С-18, 5 мм, 300^150x4,6 мм.
Буферы: А: 0,1% ТЕА в МОУ; В: 0,085% ТЕА, 10% МОУ, 90% МеСК
Градиент: 0-1,5 мин 0% В
1,5-25 мин 50% В
25-30 мин 100% В
30-35 мин 100% В
35-40 мин 0% В
Поток 1 мл/мин, температура 40°С, УФ детекция: I = 215 нм.
ВЭЖХ очистка пептида.
Неочищенные пептидные продукты очищали с помощью Рег8ер!1уе Вюкук!етк VI8ЮN \Уогкк1а1юп. Для управления прибором и получения данных использовали программу VI8ЮN 3.0. Использовали следующую колонку и систему ВЭЖХ буферов.
Колонка: Кготакй КК 100^, 10 мм С-8, 250x50,8 мм.
Буферная система: Буферы: А: 0,1% ТЕА в МОУ; В: 0,085% ТЕА, 10% МОУ, 90% МеСК
Градиент: 0-37 мин 0-40% В
Поток 35 мл/мин, УФ детекция: I = 215 нм и 280 нм.
Масс-спектрометрия.
Пептиды растворяли в суперградиенте метанола (ЬаЫксап, ОиЫ1ш, ЛеИпй), деионизированной воды (М1Шроге, ВейГогй, МА) и муравьиной кислоты (Мегск, Оатк!ай!, Оегтапу) (50:50:0,1 по об.) до концен
- 26 014184 траций в диапазоне 1-10 мг/мл. Растворы пептидов (20 мл) анализировали в режиме положительной поляризации Ε8Ι-ΤΟΕ-Μ8 с использованием масс-спектрометра ЬСТ (Мкготакк, МапсйеЧег. ИК) с точностью +/-0,1 т/ζ.
Общая стратегия синтеза.
Во всех синтезах сухую смолу Теп1аСе1-8-Еат (1 г, 0,22-0,31 ммоль/г) помещали в полиэтиленовую емкость, снабженную полипропиленовым фильтром для фильтрации. После набухания в ΌΜΕ (15 мл), смолу обрабатывали 20% пиперидином в ΌΜΕ, чтобы обеспечить присутствие непротонированных аминогрупп на смоле. Смолу высушивали и отмывали ΌΜΕ, пока после добавления Э11Ь1-ОН к слитому ΌΜΕ не переставал обнаруживаться желтый цвет. Аминокислоты в соответствии с последовательностью пептида присоединяли в виде Етос-защищенных ΗΟВί эфиров (3 экв.), как описано выше. Если иное не определено, то сшивку продолжали в течение 2 ч. Смолу высушивали и промывали в ΌΜΕ (5x15 мл, по 5 мин каждый цикл) для того, чтобы удалить лишний реактив. Степень ацилирования проверяли нингидриновым тестом, выполненным при 80°С. После окончания синтеза пептида смолу промывали ΌΜΕ (3x15 мл, по 5 мин каждый цикл), ΩΟΜ (3x15 мл, по 1 мин каждый цикл) и, наконец, диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый цикл) и высушивали в вакууме. После чего пептид снимали со смолы, как описано выше, лиофильно высушивали.
После очистки, используя препаративную ВЭЖХ, как описано выше, пептид собирали, и идентичность пептида подтверждали с помощью Ε8-Μ8. Эта процедура использовалась для синтеза всех пептидов, приведенных в качестве примеров далее ниже.
Синтезируемые соединения.
Используя вышеупомянутые методы, соединения с 1809 по 1861 и эталонное соединение 1559 (Н[О1у2]йОЬР-2-ОН) синтезировали, как описано выше (табл. 1).
Таблица 1
Соед. № Последователь ность Рассветная Мол. масс. Получ. Мол. масс. чистота, % Вых. прол.
1559 Η-ΗΟΟαδΓδϋΕΜΝΤΙΕΟΝΕΑΑΚΟΡΙΝψυΟΤΚΙΤΟ-ΟΗ 3749,80 3749,16 95 5,4
1809 Η-ΗΟΕΟΤΡ5ΟΕΕΑΤΙΕΟΑΕΑΑΚΌΡΙΑν/ΕΙΑΤΚΙΤΟΚ6-ΝΗ2 4341,41 4341,62 96 46,5
1810 Η-ΗΟΕΟΤΡ8ΟΕΕΑΤΙΕΟΑΕΑΑΚΙΡΙΑ1¥ΕΙΑΤΚ6-ΝΗ2 4010,32 4010,63 91 20
1811 Н-Н0О65Р8ОЕЕАТ1ЕОАЕААК0Р1А\УЕ1АТКГГО-!\Н, 3494,8 3494,13 94 44,7
- 27 014184
1812 Н-НОЕОЗРЗОЕЬАТПВЬТЛАКСНА^иСТКПО-КН, 3658,86 3658,3 91 8
1813 П-НООСЗГ8ОЕЬАТ1ЕОАЕААР4ЖА\УЕ1АТКГГО-НН, 3544,82 3545 95 15,9
1814 Η-Η6ΟΟ5Ρ5ΟΕΕΑΤ1ΕΟΝΕΑΑΚϋΡΙΑ3νΕΙΑΤΚΙΤΟ-ΝΗ2 3587,83 3588 92 31
1815 Н-Н6ЕС8Р80ЕЕАТ1ЬОАРАА1ЮР1АЖ4АТК1ТО-Ш2 3558,84 3559 95 33
1818 ΙΗΙΩΟαδΓΞδΕΕΑΤΙΕΟΝΕΑΑΚϋΡΙΑν/ΕΙΟΤΚ.-ΝΗ, 4056,26 4056,25 92 68,3
1819 Н-Н6ОСЗР5ОЕЕ8Т1ЕОМЕААКОЕ1А№'Е1С>ТЮ-МН2 4100,35 4100,13 92 38,7
1820 Η-ΗΟΟΰδΡΤδΕΕΑΤΙΕΟΝΕΑΗΕϋΡΙΑ'λΈΙΟΤ^-ΝΗ, 4070,28 4070,38 94 63,3
1821 Н-НСОаЗГЗОЕЕКТП.ОНЕААР.ОПАЖЮЖ-Ж 4141,32 4141,5 93 57,3
1822 Η-Η(1ΙΚ33ΡΤΡΕΙ.ΚΤΙΕΙ>ΝΙΛΛΚΙ)ΚΙΛ\νΐ49ΊΚο-ΝΗ2 4155,33 4155,13 94 72
1823 Η-ΗΟΟΰ3ΡΤ8ΕΕΚΤΓΕΟΝΕΑΑΡΕ)ΡΙΑνιΌ0ΤΚΕ-ΜΗ2 4127,34 4127,9 95 100,3
1824 Н-НОГ)СЗРТГ>ЕЕАТ1ЕОМЕААЕОР1А'ЛЕГОТ1Ь,-МН, 4098,27 4098,25 95 33,9
1825 Η-ΗΟΠΟ8Ρ38ΕΕΑΤΙΕΠΝΕΑΑΚΟΡΙΑ\νΕΙ9ΤΚ-ΝΗ2 3287,69 3287,75 92 82,0
1826 Η-ΗΟΟΟδΡδΟΕΕΝΤΙΕΟΝΕΑΑΚΏΡΙΑΑνΕΙΟΤΚΪΤϋΚί-ΝΗί 4456,42 4456,38 93 68,9
1827 Η-ΗΟΟΟδΕΤΟΕΕ8ΤΙΕΟΝΕΑΑΚΟΡΙΑ\νΕΙ9ΤΚ6-ΝΗ2 4114,27 4114,63 93 20,2
1828 Η-ΗΟΟΟ£Ε'Γ3ΕΕ3ΤΙΕΟΝΕΑΑΚΙ)ΡΙΑΆΈΙΟΤΚ6-ΝΗ; 4086,27 4086,63 94 84,2
1829 Η-ΗΟΟΟ.5Ε33ΕΕ3ΤΙΕΟΝΕΑΑΕΌΡΙΑ\νΕΐαΤΚ.<-ΝΗ2 4072,26 4072,5 95 51,8
1830 Η-ΗΟΟΟ8Ρ8ϋΕΕδΤΙΕΟΝΕΑΑΜ)ΡΙΑ\νΕΙ9ΤΚ-ΝΗ2 3331,68 3331,88 94 26,4
1831 Η·Η6ΙΧ.13ΕΓΡΕΙ,8'!'ΐυ)ΝΕΛΑΕ!)Ε1Λ\νΕΙ0ΊΚ·ΝΗ; 3345,7 3345,38 94 46,0
1832 Η-ΗΩΟΟ3ΡΤ3ΕΕ3ΠΕΟΚΤΑΑ№ΕΙΑνΛ4ρΤΚ-ΝΗ2 3317,7 3117,88 94 17,5
1833 Η-ΗΟΟΟδΡδδΕΕδΤΙΕΌΝΕΑΑΒΌΡΙΑίνΕΙΟΤΚ-ΝΗί 3303,69 3304,13 97 34,5
1834 Н-Н(.;ГХ'йЕ'1'8ЕЕА'1Н ΟΝΕΑΛΕΕΗΑΆ'Ι,ΙΟΊΚ-ΝΗ; 3301,71 3301,75 94 16,0
- 28 014184
1835 ΙΙ-ΙΙΟϋσδΡδΟΕΕΚΤΙΕΟΝΕΑΑΒ.ΟΡΙΑ’ΛΈΚ/ΤΚ-ΝΗ: 3372,75 3373,13 94 89,7
1836 Η-ΗϋΟΟΪΡ'ΓϋΕΕΚΤΙΕυΝΕ^ΑΚΟΡΙΑΆ'υ^ΤΚ-ΝΗ; 3386,76 3386,88 92 26,0
1839 Η-Η6ΟΟ8ΡΤΟΕΕΚΤΙΕΟΝΕΑΑΚΟΡΙΑ\νυρΤΚ-ΝΗ5 4413,42 4413,88 92 18,2
1840 Η-Η6Ο6δΓδΟΕΕΑΤΙΕΟΝΕΑΑΚΙ)ΡΓΑ\¥ΕΙ(}ΤΚΙΤΕ>-ΝΗ2 3644,85 3644,88 95 21,3
1841 Η-ΗΟΟΟ8Γ5ΌΕΕΑΤΙΕϋΝΕΑΑΚΒΓΙΑ1¥ΕΙ<)ΤΚ-ΝΗ2 3315,69 3315,88 91 73,6
1842 Η-ΗΟϋαΒΡΤδΕΕΚΤΙΕΟΝΕΑΑΚϋΡΙΑΨΕΙΟΤΚ-ΝΗί 3358,77 3358,88 97 26,8
1843 Η-ΗΟϋαδΡΤΟΕΕΑΤΙΕΟΝΕΑΑΚϋΡΙΑ^Έ^ΤΚ-ΝΗ;: 3329,7 3329,88 90 23,6
1844 Н-Н6ЕСТР55ЕЕ8Т1ЕОАЕААК.ОР1А\УЕ1АТК1ТОКЙ-Р1Н2 4329,42 4329,63 90 46,0
1845 Η-ΗΟΕΟΤΡ50ΕΕδΤΙΕΟΑΕΑΑΚΟΓΙΑΐνΕΙΑΤΚΙΤΟΚ6-ΝΗ2 4357,42 4357,38 93 52,5
1846 Η-ΗΟΕΟ5Ρ88ΕΕεΤΙΕΌΑΕΑΑΚΟΡΙΑν/ΕΙΑΤΚΙΊΌΚ6ΝΗ2 4315,41 4315,38 90 28,8
1847 ΙΙ-ΙΙ<3ΕΟ5Γ5ΟΕΕ3ΤΙΕΟΑΕΑΑΡ.ΟΓΙΑ'ΛΈΙΑΤΚ.ΠΈιΚ«-ΝΙΙ! 4343,4 4343,5 90 59,4
1848 ΙΙ-ΙΙΟΕΟΤΡ55ΕΕΑΤΙΕΟΑΕΑΑΓ<ΟΓΙΑ'λΈΙΑΤΚΙΤΟΚ6-ΜΠ2 4313,43 4313,63 90 230,0
1849 Н-НСЕОЗР35ЕЕАТ1ЕОАЕААРВР1А%Ъ1АТК1ТОКе-МН2 4299,41 4299,5 97 68,0
1850 Н-НСЕ68Р8ОЕЕКТ1 ΕΕ)ΑΙ.ΑΑΚΕιΓ1Αΐνΐ.!ΑΤΚΙΤΓ1Κ,-ΝΗ2 4384,46 4384,63 93 38,0
1851 Н-НОЕетРЗПЕЕКТП.ОАЕААРТЖАХУЕТАТКПГЖб-ЧН, 4398,48 4398,38 95 90,6
1852 Η-Η6ΕΟΤΡε3ΕΕΚΤΙΕϋΑΕΑΑΚΙ)ΡΙΑ\νΕ1ΛΤΕΙΤΟΚί,-ΝΗ2 4370,48 4370,63 95 63,5
1853 Н-НСЕ6ТР88ЕЕЗТ1ЕОАЕААКОР1АЖ1АТК1ТО-Т4Н2 3560,85 3560,13 97 18,0
1854 Η-ΗΟΕΟΤΡδΟΕΕ5ΤΙΕΟΑΕΑΑΚϋΡΙΑΐΛΈ1ΑΤΚΙΤΟ-ΝΗ2 3588,85 3589,13 96 15,5
1855 Η-ΗΟΕα8Ρ38ΕΕ8ΤΙΕΟΑΕΑΑΚΟΡΙΑλνΕΙΑΤΚΙΤΟ·ΝΗ2 3546,84 3547 96 27,3
1856 Η-ΗΟΕΟ8Ρ3ϋΕΕ3ΤΙΕΟΑΕΑΑΜ>ΡΙΑτνΕΙΑΤΚίΤΟ-ΝΗ2 3574,83 3575 96 18,0
1857 Η-ΗΟΕ6ΤΡ88ΕΕΑΤΙΕϋΑΕΑΑΐωρΐΑΨΕΙΑΤΚΙΤΟ-ΝΗ2 3544,86 3544,88 94 39,3
1858 Н-НСЕ65Р38ЕЬАТ1ЕОАЕААРЛЭР1АЖЛАТК1ТО-МН2 3530,84 3530,88 90 43,3
1859 Н-НСЕСЗР8ОЕЬтЕОАЬАА1ШР1АШЕ1АТК1ТП-«Н2 3615,89 3615,13 90 11,4
1860 ΤΤ-Η6ΓΓ,ΤΓδΏΡ.ΕΤ<πΕΟΑΕΑΑΚΏΡΙΑ\7ΕΙΑΤΚΙΤΟ-Μ1Ι2 3629,91 3629,13 92 10,9
1861 Н-НОЕ6ТГ58ЕЕКТ1ЕОАЕААКГ>Г1АЖ1АТК.1ТО -ΝΗ2 3601,91 3601,13 99 16,2
*) выход продукта; выход продукта/г смолы
- 29 014184
Пример 1. Синтез соединения 1846.
Н-Н|5-С1у-С1и-С1у-8ег-Р11е-8ег-8ег-С1и-Ьеи-8ег-Т11г-Пе-Ьеи-Л5р-Л1а-Ьеи-Л1а-Л1а-Лг8-Л5р-Р11е-ПеЛ1а-Тгр-Реи-Пе-Л1а-Т11г-Руь-Пе-Т11г-Л5р-Р-у5-Ру'5-Ру5-Ру'5-Ру5-Ру5^Н2 на Теп1аСе1 8 КЛМ-Ьу8(Вос)Етос.
Сухой Теп1аСе1 8 РЛМ-Ьу5(Вос)Етос (0,24 ммоль/г, 1 г) помещали в полиэтиленовую емкость, снабженную полипропиленовым фильтром для фильтрации, обрабатывали, как описано в множественном пептидном синтезе на смоле Теп1аСе1 до окончания сшивки Ν-концевого гистидина. Все сшивки проводили в течение ночи. Степень ацилирования проверяли, как описано ранее. После окончания синтеза и снятия защитной Ν-концевой Етос группы, пептид снимали со смолы, как описано выше. После очистки, используя препаративную ВЭЖХ, как описано ранее, получали 28,8 мг пептида с чистотой более чем 90%, идентичность пептида подтверждали М8 (полученная масса 4315,38, расчетная масса 4315,41).
Пример 2. Синтез соединения 1848.
Н-Н|5-С1у-С1и-С1у-Т11г-Р11е-8ег-8ег-С1и-Реи-Л1а-Т11г-Пе-Реи-Л5р-Л1а-Ьеи-Л1а-Л1а-Лг8-Л5р-Р11е-ПеЛ1а-Тгр-Реи-Пе-Л1а-Т11г-Руь-Пе-Т11г-Л5р-Ру'5-Ру'5-Ру5-Ру'5-Ру5-Ру'5-ХН2 на Теп1аСе1 8 КЛМ-Ьук (Вос)Етос.
Сухой Теп1аСе1 8 РЛМ-Ьу5(Вос)Етос (0,24 ммоль/г, 1 г) помещали в полиэтиленовую емкость, снабженную полипропиленовым фильтром для фильтрации, обрабатывали, как описано в множественном пептидном синтезе на смоле Теп1аСе1 до окончания сшивки Ν-концевого гистидина. Все сшивки проводили в течение ночи. Степень ацилирования проверяли, как описано ранее. После окончания синтеза и снятия защитной Ν-концевой Етос группы пептид снимали со смолы, как описано выше. После очистки, используя препаративную ВЭЖХ, как описано ранее, получали 230 мг пептида с чистотой более чем 90%, идентичность пептида подтверждали М8 (полученная масса 4313,63, расчетная масса 4313,43).
Пример 3. Синтез соединения 1855.
Н-Н|5-С1у-С1и-С1у-8ег-Р11е-8ег-8ег-С1и-Реи-8ег-Т11г-Пе-Реи-Л5р-Л1а-Ьеи-Л1а-Л1а-Лг8-Л5р-Р11е-ПеЛ1а-Тгр-Ьеи-Пе-Л1а-Т11г-Ру5-Пе-Т11г-Л5р-ХН; на Теп1аСе1 8 РЛМ-Л5р(О1Ви)Ртос.
Сухой Теп1аСе1 8 РЛМ-Л5р(О1Ви)Ртос (0,2 ммоль/г, 1 г) помещали в полиэтиленовую емкость, снабженную полипропиленовым фильтром для фильтрации, обрабатывали, как описано в множественном пептидном синтезе на смоле Теп1аСе1 до окончания сшивки Ν-концевого гистидина. Все сшивки проводили в течение ночи. Степень ацилирования проверяли, как описано ранее. После окончания синтеза и снятия защитной Ν-концевой Етос группы, пептид снимали со смолы, как описано выше. После очистки, используя препаративную ВЭЖХ, как описано ранее, получали 27,3 мг пептида с чистотой более чем 96%, идентичность пептида подтверждали М8 (полученная масса 3547, расчетная масса 3546,84).
Пример 4. Синтез соединения 1857.
Н-Н|5-С1у-С1и-С1у-Т11г-Р11е-8ег-8ег-С1и-Реи-Л1а-Т11г-Пе-Реи-Л5р-Л1а-Ьеи-Л1а-Л1а-Лг8-Л5р-Р11е-ПеЛ1а-Тгр-Ьеи-Пе-Л1а-Т11г-Ру5-Пе-Т11г-Л5р-ХН; на Теп1аСе1 8 РЛМ-Л5р(О1Ви)Ртос.
Сухой Теп1аСе1 8 РЛМ-Л5р(О1Ви)Ртос (0,2 ммоль/г, 1 г) помещали в полиэтиленовую емкость, снабженную полипропиленовым фильтром для фильтрации, обрабатывали, как описано в множественном пептидном синтезе на смоле Теп1аСе1 до окончания сшивки Ν-концевого гистидина. Все сшивки проводили в течение ночи. Степень ацилирования проверяли, как описано ранее. После окончания синтеза и снятия защитной Ν-концевой Етос группы пептид снимали со смолы, как описано выше. После очистки, используя препаративную ВЭЖХ, как описано ранее, получали 39,3 мг пептида с чистотой более чем 94%, идентичность пептида подтверждали М8 (полученная масса 3544,88, расчетная масса 3544,86).
Пример 5. Синтез соединения 1846 (ацетат).
Противоионный обмен трифторацетата на ацетат соединения 1846.
Очищенный синтезированный пептид соединения 1846 выделяют, как трифторацетат в присутствии трифторуксусной кислоты (0,1% по объему) в буферах ВЭЖХ, используемых для очистки неочищенного синтезированного пептида.
Для того чтобы поменять трифторацетатный противоион на ацетатный, раствор пептида пропускали через колонку, нагруженную высокоэффективной ионообменной основной смолой (Эо\уех 1x8). 365 мг соединения 1 растворяли в 40 мл воды. Раствор пропускали через колонку, содержащую 40 мл высокоэффективной ионообменной основной смолы (Эо\уех 1x8; емкость 1,33 мэк/мл смолы). Затем смолу промывали водой 4x30 мл, после чего собранный элюат лиофилизировали, получив в результате 312 мг ацетата с чистотой согласно анализу ВЭЖХ 97%.
Пример 6. Синтез соединения 1848 С (хлорид).
Противоионный обмен трифторацетата (Т£а) на хлорид (С1-) соединения 1848.
100 мг соединения 1 растворяли в 50 мл 0,1М соляной кислоты и результирующий раствор лиофилизировали. Осадок растворяли в 50 мл воды и снова лиофилизировали с получением 80 мг хлорида с чистотой согласно ВЭЖХ 93%.
Пример 7. Исследование химической стабильности.
Аналоги СЬР-2 растворяли в очищенной воде и затем растворяли в растворах, включающих НС1,
- 30 014184
ΝηΟΗ, Η2Ο2 или NΗ4ΗСΟз. Растворы выдерживали при 40°С с целью получения продуктов гидролиза, дезамидирования и окисления. Пробы анализировали обращенно-фазовой ВЭЖХ и определяли процент оставшегося непрореагировавшего продукта, как меру относительной стабильности. Главные продукты деградации были экспериментально идентифицированы ЬС-М§. Пептиды перечислены в табл. 3.
Таблица 2
Исследованные аналоги ОЬР-2, сравниваемые по химической стабильности
Соединение № Партия № Моноизотопный молярная масса, (г/моль) Содержание пептида, (%) Чистота ОФ- ВЭЖХ, (%)
ΖΡ1559 70.30 АВ и К 1А 3749.80 90 96
ΖΡ1820 78.65 1А 4070.28 80 94
ΖΡ1834 78.90 1А 3301.71 88 94
ΖΡ1846 107.07 1А 4315.41 80 90
ΖΡ1848 91.58 1А 4313.43 80 90
ΖΡ1849 91.60 1А 4299.41 79 97
ΖΡ1855 88.49 1А 3546.84 89 96
ΖΡ1857 108.01 1А 3544.86 89 94
ΖΡ1858 108.05 1А 3530.84 89 90
Соединение ΖΓ1559, О1у2-ОЬР-2, использовали как эталон для других тестируемых аналогов ОЬР-2. В аналогах ОЬР-2 положения, в которых последовательность отличается от эталонного соединения ΖΓ1559, выделены жирным шрифтом. Последовательности перечислены в табл. 3.
Соединения перечислены парами по последовательностям, соответственно, с и без С-концевого удлиняющего К6-фрагмента.
Таблица 3
Последовательности О1у2 -ОЬР-2 и аналогов ОЬР-2
Соединение Последовательность
ΖΡ1559 Η6ΌΟ8 Ρ8ΌΕΜ ΝΤΙΕΌ ЖАЛЯ ΌΕΙΝΨ' ЫЦТК ΙΤΌ-0
ΖΡ1820 ΗΟΌΟ8 РТ8ЕЬ ΑΤΙίΌ ΝΕΑΑΚ ΌΡΙΑΨ ЫЦТК Κ6-ΝΗ2
ΖΡ1834 ΗΟΌΟ8 РТ8ЕБ ΑΤΙΕΌ ЖААН ΌΡΙΑΨ ЫЦТК -ΝΗ2
ΖΡ1846 НОЕС8 Ε88ΕΕ 8Т1ЬО АЬААК ΟΡΙΑΨ ЫАТКΙΤΌ Κ6-ΝΗ2
ΖΡ1855 ΗΟΕΟ8 Р88ЕЬ 8Т1ЫЗ АЬААК. ΌΡΙΑΨ ЫАТК ΙΤΌ-ΝΗ2
ΖΡ1848 НОЕОТ Р88ЕЬ АТ1ЬО АЬААК ΌΡΙΑΨ ЫАТК ΙΤΟ Κβ-ΝΗ3
ΖΡ1857 НСтГ.ОТ Р88ЕЬ ΑΤΙΤ.Ώ АЬААК ΌΡΙΑΨ ЫАТК ΙΤΟ-ΝΗ2
ΖΡ1849 ТГОЕОЯ Р88ЕЬ АТ1Ы) АЬААК ΌΡΙΑΨ ЫАТК ΓΓΌ Κ8-ΝΗ2
ΖΡ1858 ΗΟΕΟ8 Р88ЕЬ АТТЬО АЬААК ΟΡΙΑΨ ЫАТК ΙΤΌ-ΝΗ3
Реактивы, используемые в эксперименте, перечислены в табл. 4.
Таблица 4
Реактивы и реагенты, используемые в аналитических методах
Вещество Качество Производитель Продукт
Ацетонитрил (МеСЫ) ВЭЖХ КлеБеРБеНаёп 34851
Трифторуксусная кислота (ТРА) 99.9% Иегсе 28904
Муравьиная кислота (РА) 98-100% Мегск 1.00264.1000
Хлороводородная кислота НС1 «Вакег» Ι.Τ,Вакег 7088
Гидроксид натрия КаОН «Вакег» 1.Т.Вакег 7098
Перекись водорода Н3О2 30% по весу 81§ша-А1<1г1сЬ Н1009
ИНдНСОз 99.0% Апа1аг 103025Е
- 31 014184
Воду сначала деминерализовали до сопротивления >18 МОст и затем пропускали через деионизирующую систему (М1Шроге, Бедфорд, США). Очищенную на деионизаторе воду (Мр\У) окончательно отфильтровали через 0,22-цм стерильный фильтр (М1Шрак 40 Сатта Со1б, М1Шроге).
Тестируемые аналоги СЬР-2 и эталон С1у2-СЬР-2, ΖР1559, были растворены в воде и затем растворены в растворах, содержащих НС1, №ОН, Н2О2 или ИН4НСО3. Образцы инкубировали при 40°С с получением продуктов гидролиза, дезамидирования и окисления. Соединения проанализировали на ОФ-ВЭЖХ на чистоту первоначального основного пика и с помощью ЬС-МЗ для подтверждения идентичности по массе главного пика и основных продуктов деградации.
Приготовление агрессивных растворов:
0.2 М НС1: 4 мл ΜφΨ на 1 мл 1 И НС1.
0.02 Μ ИаОН: 4 мл М0\У на 1 мл 0.1 М ИаОН.
0.2 М ЫН4НСО3. рН 8: 0.79 г. НН4НСО3 растворяли в 50 мл М(Ж
1% Н2О2: 5.8 мл и 0.2 мл 30%-ой Н2О2.
Растворы образцов.
Аналоги СЬР-2 сначала растворяли в Мр\У в концентрации 4 мг/мл и затем растворяли в агрессивных растворах в соотношении 1:1 (например, 125 цл плюс 125 цл). Окончательные концентрации аналогов СЬР-2 в агрессивных растворах составили 2 мг/мл в 0,1М НС1, 0,01М №ОН, 0,1М ИН4НСО3 и 0,5% Н2О2.
Растворы инкубировали при 40°С в темноте и затем растворяли в элюенте А в концентрации 0,5 мг/мл (добавлено 750 цл) перед анализом методом обратно-фазовой ВЭЖХ и ЬС-МЗ.
Таблица 5
Условия для проведения теста в агрессивных условиях
Раствор 0.1МНС1 Ο.ΟΙΜΝβΟΗ 0.1МЫН4НСО3 аналоги
Температура (°С) 40 40 40 40
Хранение (дни) 12 3 6 3
Обратно-фазовая ВЭЖХ.
ОФ-ВЭЖХ анализы были выполнены на системе Адйеп! Зепез 1100 ВЭЖХ под контролем СЬетЗ1аОоп (Ве\ззюп А.08.03 [847]) с использованием программного обеспечения от Адйеп! ТесЬпо1од1ез, Гпс. Необработанные данные и результаты площади пика были депонированы на сервере СБетЗ!оге С/З с использованием программного обеспечения Адйеп! ТесЬпо1од1ез Веу1з1оп В01.03.
Таблица 6
Способ обратно-фазовой ВЭЖХ
Название файла метода Р2204071.М
Колонка Ууйас 218М852, 5 мкм, 300 А, 21x250 мм
Градиент (время; %В) 0;5,2;5,7; 15,25;30, 45;40,65;50, 70; 100, 73; 100, 75;5, 90;5
Элюент А 0.05% ТРА, 0.05% РА в МГЛУ
Элюент В 0.05% ТРА, 0.05% РА в МеСИ
Скорость потока 0.200 мл/мин
Вводимый объем 20 цл
Температура колонки 25°С
Температура автосэмплера 4°С
УФ-детекция 220 нм
Аналитические ЬС-МЗ исследования были выполнены на ВЭЖХ установке Адйеп! ТесЬпо1од1ез 1100, которая состоит из он-лайн дегазатора, градиентного насоса для четырехкомпонентных смесей, автосэмплера, нагревателя колонки, УФ-детектора.
Установка ВЭЖХ была соединена с Мкготазз ЬСТ (ЕЗГ-ТОР) масс-спектрометром под контролем программы Мазз1упх 3.5, от МкгоМазз, ИК.
- 32 014184
Таблица 7
Метод ЬС-М8
Название файла метода Р22Д)4„071_003.М
Колонка Уус1ас 218М852, 5 мкм, 300 А, 21x250 мм
Градиент (время; %В) 0;5,2;5, 7;15,25;30,45;40,65;5О, 70;!00, 73; 100,75;5, 90;5
Элюент А 0.05% ТРА, 0.05% РА в Μ0Ψ
Элюент В 0.05% ТРА, 0.05% РА в МсСИ
Скорость потока 0.200 мл/мин
Вводимый объем 30 рл
Температура колонки 25°С
Температура автосэмплера 4°С
УФ-детекция 220 нм
Таблица 8
Параметры МС в соответствии с 8ОР 22-3003.
Напряжение конуса 30 Вольт
Напряжение капилляра 3,1 кВольт
Поток газообразного азота из небулайзера 100 л/час
Поток десольватирующего газа 500 л/час
Температура десольвации 250 °С
Температура исходного блока 100 °С
Результаты, показанные в табл. 9, показывают степень чистоты соединения, измеренную ОФ-ВЭЖХ после инкубирования в жестких условиях. Указанная степень чистоты соединения после инкубации в жестких условиях измерялась относительно чистоты соединения при Т=0. Эти результаты не принимают во внимание возможные скрытые продукты деградации, недетектируемые обратно-фазовой ВЭЖХ.
Основные продукты деградации тестируемых образцов были экспериментально идентифицированы методом ЬС-М8. Любые изомеры к исходным соединениям и к минорным продуктам деградации не рассматривались аналитическим методом ЬС-М8. Экспериментальные данные перечислены в табл. 11-15.
Тестируемые аналоги СЬР-2 перечислены в соответствии с их последовательностями с или без Сконцевого удлиняющего К6-фрагмента.
Таблица 9 Наблюдаемая степень чистоты исследуемых соединений после инкубирования в жестких условиях
аналоги СЬР-2 Последовательность +/· Сконцевого Кб Степень чистоты НС1ОД М 12 дней (%) Степень чистоты Н2О2 0,5% 3 дня(%) Степень чистоты ΝΙΙ,ΙΚΌ,Ο,Ι М 6 дней (%)
ΖΡ1559 Эталон 57 <5 66
ΖΡ1820 к6 45 62 85
ΖΡ1834 - 38 53 91
ΖΡ1846 Кб 70 64 82
ΖΡ1855 - 85 14 97
ΖΡ1848 Кб 63 68 93
ΖΡ1857 - 86 59 96
ΖΡ1849 Кб 64 78 86
ΖΡ1858 - 88 60 91
Результаты, полученные для соединений, которые инкубировали в ЫаОН, не перечислены, поскольку различия в стабильности не наблюдались. Для продуктов деградации и основного пика по мето
- 33 014184 ду ЬС-Μδ получают одинаковую массу; эти соединения, вероятно, рацемизировали в течение долгого времени. Результаты, представленные в табл. 9, показывают, что исследуемые аналоги ОЬР-2, в основном, более химически устойчивы, чем О1у2-ОЬР-2 эталон, ΖΓ1559.
Во время кислотного гидролиза исследуемые аналоги ОЬР-2 являются более устойчивыми, чем О1у2-ОЬР-2 эталон, ΖР1559, за исключением ΖР1820 и ΖР1834. Главным образом, указанное происходит из-за наличия Акр в положении 3. По сравнению с Акр О1и может минимизировать расщепление между Акр-О1у в положении 3 и в положении 4. Другие исследуемые ΖР аналогов ОЬР-2 действительно имеют приблизительно ту же самую стабильность с тенденцией немного более высокой стабильности для соединений без С-концевого-К6, ΖР1855, ΖР1857 и ΖР1858. Это различие объясняется аминокислотой в положении 33 Акр. В соединении без С-концевого-К6 эта аминокислота является С-концевой, и расщепление между аминокислотой в положении 32 и в положении 33 Туг-Акр происходит медленнее, чем расщепление между аминокислотой в положении 33 и 34 Акр-Ьук. Различие в стабильности происходит изза Акр, а не на С-концевом-К6.
При условиях ускоренного окисления (Н2О2, см. также табл. 10 и 13) исследуемые аналоги ОЬР-2 намного более устойчивы, чем О1у2-ОЬР-2 эталон, ΖР1559. Вероятно, это происходит из-за окисления Μеί в положении 10 в ΖР1559. Исключение составляет ΖР1855, который показывает необъяснимо низкую стабильность. Это может быть специфичным для ΖР1855, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы это объяснить.
При условиях, способствующих дезамидированию (ХН4НСО3), исследуемые аналоги ОЬР-2 более устойчивы, чем О1у2-ОЬР-2 эталон, ΖР1559. Вероятно, указанное происходит из-за наличия нескольких дезамидированных участков Акп в положениях 11, 16 и 24 в ΖР1559, которые не присутствуют в последовательностях исследуемых аналогов ОЬР-2.
Предварительная идентификация с помощью ЬС-М8 основных продуктов деградации
Таблица 10 Главные участки расщепления в ΖР аналогов ОЬР-2 и эталон ΖР1559
ΖΡ1559Η6ϋψΟ8 Р8БЕМ Ν;ΤΙΤϋ М.ААК ΠΕΙΝΆ ЫОТК ΙΙΙΙ-ΟΗ
ΖΡ1820Η6ϋφΟ8 ЕТ8ЕЬ АТП.© Ν1.ΑΑΚ ©ΕΙΑΆ' ЫОТК Κ„-ΝΉ2
ΖΡ1834ΗΟϋψΟ8 ГТ8ЕЬ АТ1Ь© МЬААК ©ΓΙΑΆ’ ы<?тк -νη2
ΖΡ1846ΗΟΕ68 Г88ЕЬ 8Т1Ы) АЬААК ©ΕΙΑΆ' ЫАТК ΙΤϋ^-ΝΗί
ΖΡ1855ΗΟΕΟ8 Е88ЕЬ 8Т1ЬП АЬААК ΙΙΕΙΑΆ ЫАТК ΙΤ^-ΝΗί
ΖΡ1848Η6Ε6Τ Г88ЕЬ АТТЫ) АЬААК ΠΕΙΑΆ' ЫАТК 1ТП;К,-МЬ
ΖΡ1857Η6ΕΟΤ Е88ЕТ. АТ1Ы) АЬААК ΠΓΙΑΆ ЫАТК ΙΤ^-ΝΗι
ΖΡ1849Η6Ε68 Е88ЕЬ АГ1Ы) АЬА АВ БИАУУ ЫАТК ΙΤϋφΚ6-ΝΗ2
ΖΡ1858ΗΟΕ68 Ε88ΕΙ, АТТЬП АЬААК ΠΡΤΑΆ' ЫАТК ΙΤ^Ο-ΝΙΤ,
Растворы, обработанные НС1
Таблица 11
Ааналоги ОЬР-2 инкубировали 12 дней при 40°С в 0,1Μ НС1
аналоги (31Ρ-2 Полученная молярная масса (Да) Рассветная молярная масса (Да) Различия* в массе (Да) Основной/минорный продукт, возможные причины деградации
ΖΡ1559 3749.88 3749.80 +0.08 Основной продукт
3732.75 Νπ -17.13 Минорный, циклическое дез-амидирование
3751.88 Иа +2.00 Минорный, 2 х дезамидирование
ΖΡ1820 4070.13 4070.28 -0.15 Основной продукт А'-А30
4071.25 № +1.12 Минорный, дезамидирование
3761.25 3761.17 +0.08 Минорный, гидролиз А4-А”’
2526.75 2526.56 +0.19 Минорный, гидролиз А|(,-Ал
3762.25 3762.16 +0.09 Минорный, гидролиз А4-А36, дез- амидирование
ΖΡ1834 3302.00 3301.71 +0.29 Основной продукт
- 34 014184
3303.00 Иа +1.00 Минорный, дезамидирование
3283.88 На -18.12 Минорный,циклическое дезамидирование
3302.88 Νη +0.88 Минорный, дезамидирование
2992.88 2992.60 -309.12 Минорный, гидролиз А4-Ази, дезамидирование
2993.88 2993.59 -308.12 Минорный, гидролиз А4-А''·'
2993.75 2993.59 -308.25 Минорный, гидролиз А4-А‘У··'
ΖΡ1846 4315.00 4315.41 +0.59 Основной продукт Л'-Л’’
3547.50 3547.82 -0.32 Минорный, гидролиз А'-А33
3934.88 3935.26 -0.38 Минорный, гидролиз А^-А33
2755.38 2755.70 -0.32 Минорный, гидролиз А'^-А3*
2158.25 2158.37 -0.12 Минорный, гидролиз А22-Азу
3155.16 Иа -1160.25 Нет предположений
ΖΡ1855 3548.13 3546.84 +1.29 Основной продукт/дезамидиров.
3548.13 Иа +1.29 Минорный, дезамидирование
3225.13 3223.71 +1.42 Минорный, гидролиз Α4Ά33, дезамидирование
3433.13 3432.79 +0.34 Минорный, гидролиз А’-А3
3354.50 3352.76 +1.76 Минорный, гидролиз А3-А33, дезамидирование
ΖΡ1857 3544.50 3544.86 -0.36 Основной продукт А'-А и
3430.63 3430.81 -0.18 Минорный, гидролиз А'-А’‘
3351.38 3350.78 +0.60 Минорный, гидролиз А3-А33
3165.50 3164.71 +0.79 Минорный, гидролиз А'-А1·
3222.50 3221.73 +0.77 Минорный, гидролиз А’-А1'
2830.25 2829.56 +0.69 Минорный, гидролиз А&-А33
3545.13 Ν» +0.63 Минорный,рацемизация
ΖΡ1849 4299.63 4299.41 +0.22 Основной продукт А1-Азу
2755.88 2755.70 +0.18 Минорный, гидролиз А’-А‘:!
3532.00 3531.82 +0.18 Минорный, гидролиз А'-Ап
2158.38 2159.05 2158.37 -0.67 +0.01 Минорный, гидролиз А'-А^1 или А^-А
3976.88 3976.29 +0.59 Минорный, гидролиз А4-Азу
4105.13 4105.33 -0.20 Минорный, гидролиз А3-Азу
3920.50 3919.27 +1.23 Минорный, гидролиз А5-Аи,
дезамидирование
1561.84 1561.73 +0.11 Минорный, гидролиз А'-А15
ΖΡ1858 3532.13 3530.84 +1.29 Основной продукт/дезамидирование
па = не доступный, не вычисляли молекулярную массу и не предлагали теоретическую молекулярную массу.
* различие в массе между полученной молекулярной массой и рассчитанной молекулярной массой для основного пика или для предложенного соединения.
Результаты табл. 12 показывают, что полученная молекулярная масса для исследуемых аналогов СЬР-2 и С1у2-СЬР-2 эталона, ΖР1559, соответствует теоретической молекулярной массе.
Самые распространенные продукты деградации - это продукты расщепления между аминокислотами в положении 3 и 4; Акр и С1у в ΖР1559, ΖР1820 и ΖР1834. Для соединений ΖР1846, ΖР1848 и ΖР1849, которые являются продуктами С-концевой-К6 деградации, были обнаружены продукты деградации, со
- 35 014184 ответствующие потере С-концевого-К6 (Ьук6) в положении 33-39. Для соединений ΖР1855 и ΖР1857, которые являются соединениями без С-концевого-К6, были обнаружены продукты деградации, соответствующие потере С-концевого Акр в положении 33.
Обнаруженные минорные продукты деградации были расщеплены между аминокислотами в положении 15 и 16 (Акр и Акп или Акр и А1а), аминокислоты в положении 4 и 5 (О1у и 8ег), аминокислоты в положении 21 и 22 (Акр и РЬе).
Растворы, обработанные Н2О2
Таблица 12
Аналоги ОЬР-2 инкубировали 3 дня при 40°С в 0,5% Н2О2
аналоги ОЬР-2 Полученная молекулярная масса(Да) Рассчитанная молекулярная масса (Да) Различия* б массе (Да) Основной/минорный продукт, возможные причины деградации
ΖΡ1559 η.ά. 3749.80 Нет интактного продукта
3766.00 N8 +16.2 Основной продукт, окисление М
ΖΡ1820 4070.63 4070.28 -0.35 Основной продукт
4052.38 Ка -18.25 Основной продукт прешественник дезамидирования
4086.50 N8 +15.87 Минорный продукт, окисление XV .
4068.75 Ыа -1.88 Минорный, 2 х дезамидирование
ΖΡ1834 3301.75 3301.71 +0.04 Основной продукт
3283.75 N8 -18.00 Основной продукт прешественник дезамидирования
3317.88 N8 +16.13 Минорный продукт, окисление Ψ
3299.75 Νβ -2.00 Минорный, 2 х дезам идирование
ΖΡ1846 4315.50 4315.41 +0.09 Основной продукт
4331.88 N8 +16.38 Минорный продукт окисление XV
ΖΡ1855 3547.00 3546.84 +0.16 Основной продукт
3481.88 N8 -65.12 Минорный продукт, неидентифицированный
3410.00 N8 -137.00 Минорный продукт, А*-А'и
3563.00 Иа +16.00 Минорный продукт, окисление XV
ΖΡ1848 4313.50 4313.43 +0.07 Основной продукт
4329.63 Νβ + 16.13 Минорный продукт, окисление XV
ΖΡ1857 3545.00 3544.86 +0.14 Основной продукт
3408.00 N8 -137.00 Минорный продукт, Аг-Д·*3
3561.00 Ыа +16.00 Минорный продукт, окисление XV
3479.88 N3 -65.12 Минорный продукт, неидентифицированный
ΖΡ1849 4299.50 4299.41 +0.09 Основной продукт
4315.75 N8 +16.25 Минорный продукт, окисление XV
ΖΡ1858 3531.00 3530.84 +0.16 Основной продукт
3394.13 N8 -136.87 Минорный продукт, А+А”
3547.00 N8 +16.00 Минорный продукт, окисление XV
3466.00 N8 -65,00 Минорный продукт, неидентифицированный
па = не доступный, не вычисляли молекулярную массу и не предлагали теоретическую молекулярную массу.
* различие в массе между полученной молекулярной массой и рассчитанной молекулярной массой для основного пика.
- 36 014184
Результаты табл. 13 показывают, что полученная молекулярная масса для исследуемых аналогов СЬР-2 и С1у:-СЬР-2 эталона, ΖΓ1559, соответствует расчетной молекулярной массе.
Для ΖΓ1559 найден главный продукт деградации с молекулярной массой +16 Да, с вероятно окисленным Ме( в положении 10. Для ΖΓ1820 и ΖΓ1834 найден главный продукт деградации с молекулярной массой +18 Да. Вероятно, это связано с потерей воды в предшественнике при дезамидировании. При этом найдены минорные продукты с молекулярной массой -2 Да из-за дезамидирования по двум участкам. Для всех соединений найдены минорные продукты с молекулярной массой +16 Да, вероятно полученные при окислении Тгр. Для соединений без С-концевого-К6 ΖΓ1855, ΖΓ1857 и ΖΓ1858 найдены минорные продукты деградации с молекулярной массой -137 Да и молекулярной массой -65 Эа, что соответствует потере НЕ в положении 1 и неидентифицируемому продукту деградации соответственно.
Растворы, обработанные ΝαΟΗ
Таблица 13
Аналоги СЬР-2 инкубировали 3 дня при 40°С в 0,01М Ν;·ιΟΗ
ОЬР-2 аналоги Полученная молекулярная масса (Да) Рассчитанная молекулярная масса (Да) Различия* в массе (Да) Комментарии
ΖΡ1559 3750.38 3749.80 +0.58 Нет изменений в Μ\ν
ΖΡ1820 4070.63 4070.28 +0.35 Нет изменений в МХУ
ΖΡ1834 3302.00 3301.71 +0.29 Нет изменений в МХУ
ΖΡ1846 4315.63 4315.41 +0.22 Нет изменений в МХУ
ΖΡ1855 3547.25 3546.84 +0.41 Нет изменений в МХУ
ΖΡ1848 4313.88 4313.43 +0.45 Нет изменений в М\У
ΖΡ1857 3545.13 3544.86 +0.27 Нет изменений в МХУ
ΖΡ1849 4299.88 4299.41 +0.47 Нет изменений в МХУ
ΖΡ1858 3531.13 3530.84 +0.29 Нет изменений в МХУ
па = не доступный, не вычисляли молекулярную массу и не предлагали теоретическую молекулярную массу.
* различие в массе между полученной молекулярной массой и рассчитанной молекулярной массой для основного пика.
Исследования ЬС-М8 показывают молекулярную массу соединения во всех пиках для каждого соединения. Это означает, что самые обычные продукты деградации представляют собой, вероятно, рацемизацию Ь-формы в Ό-форму одной или более аминокислот в последовательности. Главный пик может тогда включать один или несколько рацемизированных продуктов, что не позволяет определить остаточную чистоту интактного пептида. Какие-либо основные продукты деградации в результате расщепления не были обнаружены.
- 37 014184
Ратворы, подвергнутые жесткому воздействию ΝΗ4Η€Ό3
Таблица 14
Аналоги СЬР-2, выдержанные 6 дней при 40°С в 0,1М ИН4НСО3, рН 8
аналоги СЬР-2 Полученная молекулярная масса (Да) Рассчитанная молекулярная масса (Да) Различия* в массе (Да) Основной/минорный продукт, возможные причины деградации
ΖΡ1559 3750.00 3749.80 +0.20 Основной продукт
3751.13 Иа +1.13 Минорный, возможно дезамидорование
3751.13 Ν& +1.13 Минорный, возможно дезамидорование
ΖΡ1820 4070.13 4070.28 -0.15 Основной продукт
4070.13 Иа -0.15 Минорный, возможно рацемизация
ΖΡ1834 3302.00 3301.71 +0.29 Основной продукт
3302.00 Иа +0.29 Минорный, возможно рацемизация
ΖΡ1846 4315.25 4315.41 -0.16 Основной продукт
4315.63 Νβ +0.38 Минорный, возможно рацемизация
ΖΡ1855 4547.13 3546.84 +0.29 Основной продукт
ΖΡ1848 4313.75 4313.43 +0.32 Основной продукт
ΖΡ1857 3544.75 3544.86 -0.11 Основной продукт
ΖΡ1849 4299.50 4299.41 +0.09 Основной продукт
ΖΡ1858 3531.00 3530.84 +0.16 Основной продукт
па = не доступный, не вычисляли молекулярную массу и не предлагали теоретическую молекулярную массу.
* различие в массе между полученной молекулярной массой и рассчитанной молекулярной массой для основного пика.
Результаты табл. 14 показывают полученную молекулярную массу проверенных аналогов СЬР-2 и эталона С1у-СЬР-2, ΖР1559, которая соответствует теоретической молекулярной массе. Для ΖР1559 наблюдались незначительные продукты деградации с молекулярной массой +1 Ьа, которые могли, вероятно, быть продуктами дезамидирования. Для ΖР1820, ΖР1834 и ΖР1846 наблюдались незначительные продукты деградации с такой же молекулярной массой, как и у основного соединения. Они, вероятно, могли быть продуктами рацемизации или дезамидирования. Тем не менее, МЗ разрешение настоящего прибора не было достаточным для подтверждения или опровержения указанных предположений. Кроме того, указанные продукты могли присутствовать в других соединениях, но были не обнаружены, поскольку они могли быть скрыты основным пиком.
Все настоящие исследованные аналоги СЬР-2 имеют более высокую химическую стабильность по сравнению с эталонным соединением С1у2-СЬР-2, 1559, в жестких условиях гидролиза, окисления и дезамидирования. Соединения 1820 и 1834 менее устойчивы в результате кислотного гидролиза, чем остальные шесть кандидатов. Самая высокая химическая стабильность наблюдалась, когда аминокислота А3 представляла собой С1и, а не Азр.
Какого-либо существенного различия в химической стабильности остальных шести кандидатов не наблюдалось, за исключением немного большей стабильности пептидов без -К6, что происходило главным образом из-за лабильной позиции после Азр и потери -К6 у кандидатов, несущих С-концевой-К6.
Пример 8. Скрининг влияния соединений на рост кишечника у С57ВЬ мышей.
Способность настоящих соединений стимулировать рост кишечника была определена у самцов мышей С57ВЬ. Индивидуальным группам (п=6) мышей давали по 30 нмоль/кг каждого соединения, подкодно, два раза в день в течение десяти последовательных дней. Для сравнения другим группам животных давали либо эквимолярную дозу [С1у2]СЬР-2, либо носитель (физиологический раствор, забуференный фосфатом, рН 7,4) при таком же режиме дозирования. Спустя 24 ч после введения последней дозы соединения мышей умертвляли, извлекали и взвешивали тонкую кишку (от пилоруса до слепой кишки) и толстую кишку (дистальный отдел кишечника до слепой кишки). С целью внесения поправок на небольшие различия в массе тела (В^), масса тонкой кишки (ЗГ) и масса толстой кишки были выражены в отношении к В\У. Неселективное эталонное соединение [С1у2]СЬР-2 было выбрано для стимулирования
- 38 014184 роста ткани в таких отделах желудочно-кишечного тракта, как пищевод, желудок, тонкий кишечник и толстая кишка, и оценки различий в профиле роста, вызванном соединениями, причем индекс чувствительности тонкого/толстого кишечника к действию соединения Х был вычислен как (8Гмасса толстой кишки),./(8[/масса толстой кишки)[С1у2]СЪР-2%
Соединения, чувствительность к которым тонкого/толстого кишечника была >1,05, считали относительно селективными для тонкого кишечника (табл. 15).
Соединения, чувствительность к которым тонкого/толстого кишечника была <0,95, считали относительно селективными для толстого кишечника (табл. 15).
Таблица 15 Список селективных соединений анологов СЬР-2 % (О1у2]ОЬР-2
Позиция 1 4 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
Неселективное эталонное соединение = [Л|у;]ЛЬР-2
н б О О 8 Г 8 Р Е м N Т I ъ Р N Е А А В. Р г [ N Б I 6 Τ Κ [ τ Ρ он 100 )00 юо
Селективные соединения для тонкого кишечника
1844 н с Е О т Г 5 8 Е Б 5 Т 1 ъ б А Б А А К б г I А Ε 1 Α Τ Κ 1 τ ΰ Κ6 ΝΉ2 106 89 119
1845 н 6 Е О т Г 5 Р Е б 8 т 1 Б Р А Е А А К Р г [ А V/ Ε 1 Α Τ Κ [ τ 6 Κ6 ΝΗ2 Г05 98 107
1846 н О Е О 3 Г 8 8 Е ь 5 т 1 Б б А Б А А К Р Е [ А \ν Ε 1 Α Τ Κ I τ ΰ Кб ΝΗ2 120 102 118
1848 н 6 Е б т Р 8 3 Е ь А т 1 Е б А Ъ А А к б Е 1 А V/ Ε 1 Α Τ κ. ι τ 6 Кб ΝΗ2 109 93 117
1849 и с Е б 5 Е 8 8 Е б А т 1 Е Р А Б А А к Р Г I А Б I Α Τ Κ ί τ 6 Кб ΝΉ2 109 95 115
1850 н б Е б 5 Р 5 б Е Б К т 1 Е б А Е А А в Р Г Т А \ν Ε I Α Τ Κ 1 τ Ρ Кб ΝΗ2 103 89 116
1851 н О Е О Т Р 5 Р Е б К т ! Б Р А Б А А в б г [ А V/ Б 1 Α Τ Κ ί τ Ρ Кб ΝΗ2 109 96 114
1852 н б Е О Т Р 8 8 Е 1 к т 1 Б б А Е А А К Р Р I А νν Ε I Α τ Κ 1 τ Ρ Кб ΝΗ2 106 97 109
1635 м А
1855 н 6 Е О 5 Р 8 3 Е Е 5 т I Б б А Ъ А А К б ? 1 А νν Ε 1 Α τ Κ I τ Ρ ΝΗ2 106 88 120
1857 н б Е б Т Р 8 8 Е Б А т I Е б А Б А А в б Р Т А \ν Ε 1 Α τ Κ I τ Ρ ΝΗ2 117 90 130
1858 н б Е б 8 Е 8 8 Е Ь А т 1 Е Р А Б А А и Р Е 1 А Б ϊ Α τ Κ 1 τ 6 ΝΗ2 104 96 108
1859 н 0 Е б $ Р 8 Р Е Е К т 1 Б Р А Б А А й Р Е 1 А \ν Ε 1 Α τ Κ 1 τ Ρ ΝΉ2 83 73 114
Селективные соединения для толстого кишечника
1830 н О Р О 5 Р 8 Р Е Е 5 т 1 Е Р А Б А А я Р Е 1 А V/ Б I Α τ κ ΝΗ2 100 106 94
1831 н б Р О 8 Р 8 Р Е Б 5 т 1 Б б А Б А А в Р Е 1 А \ν Б 1 Α τ κ ΝΗ2 90 102 88
1835 и О Р О 5 Р 3 б Е Ь К т 1 Б Р А Б А А в ϋ Е 1 А V/ Б I Α τ κ ΝΗ2 96 505 91
1836 н О Р б 8 Е $ Р Е Е К. т 1 Е Р А Б А А К Р Е 1 А Ε I Α τ κ ΝΗ2 94 105 90
1839 н 6 б б 5 Р 8 б Е Б А т 1 Е б А Б А А в Р Е 1 А VI Б I Α τ Κ 1 τ Ρ Кб ΝΗ2 112 133 84
1840 н ΰ Р б 8 Р 8 б Е Ь А т 1 Б Р А Е А А К Р Р I А V Б Г Α τ Κ ί τ 6 ΝΗ2 ИЗ 131 86
1841 н б Р б 8 Р 8 Р Е Е А т 1 Б б А Б А А в Р Е 1 А V/ Б I Α τ κ ΝΉ2 113 126 90
1843 н О Р б 8 Е 8 б Е Е А т 1 Е Р А Б А А К Р Е I А Б I Α τ κ ΝΗ2 111 130 «5
Воздействие соединений по настоящему изобретению на рост тканей кишечника определяли на основе способности пептидов к дозозависимому росту 8I массы по сравнению с воздействием эквимолярных доз неселективного соединения как эталонного соединения [С1у2]СЬР-2.
Полученные результаты исследований показывают, что варианты СЬР-2, имеющие заместителей в позициях 8, 16, 24 и/или последовательности дикого типа СЬР-2 имеют повышенную биологическую активность по сравнению с [С1у2]СЬР-2 у мышей С57ВЬ.
Пример 9. Дозазависимый эффект селективных соединений на рост тканей кишечника у мышей С57ВБ.
1820, 1855, 1846, 1858, 1849, 1848 и 1857 были выбраны, в качестве соединений-прототипов в силу того, что эти соединения как увеличивали массу тонкого кишечника по сравнению с [С1у2]СЬР-2 (пример 8), так и обладали повышенной химической стабильностью по сравнению с [С1у2]СЬР-2 в жестких условиях (пример 7). Дозазависимый эффект 1820, 1855, 2Р1846, 1858, 1849, 1848 и 1857 на массу тонкого кишечника определяли у самцов мышей С57ВЬ. Индивидуальные группы (и=6) мышей получали 5, 15, 45, 135 или 405 нмоль/кг каждого соединения, подкожно, дважды в день в течение трех дней последовательно. Для сравнения другие группы животных получали или эквимолярные дозы [С1у2]СЬР-2 или носитель (физиологический раствор, забуференный фосфатом, рН 7,4) в таком же режиме дозировки. Через 24 ч после получения последней дозы соединения мышей умертвляли и тонкую кишку (от пилоруса до слепой кишки) извлекали и взвешивали для определения воздействия на массу тонкого кишечника.
- 39 014184
Результаты.
Воздействие 1820, 1855, 1846, 1858, 1849 и 1857 на массу тонкого кишечника по сравнению с воздействием эталонного соединения [О1у2]ОЬР-2 показано на фиг. 1-5. Для каждой из доз тестировали воздействие [О1у2]ОЬР-2 на массу тонкого кишечника как 100%. Воздействия на рост тканей кишечника соединений 1820, 1855, 1846, 1858, 1849, 1848 и 1857 по настоящему изобретению определяли на основании способности пептидов к доза зависимому увеличению 81 массы по сравнению с воздействием эквимолярных доз [О1у2]ОЬР-2. Основываясь на этих полученных данных, авторы настоящего изобретения заключили, что аналоги ОЬР-2, содержащие 8 заместителей (02, Е3, Т5, Ь10, А11, А16, А24, А28 в отношении 1809 ОЬР-2) вызывают значительное увеличение массы тонкого кишечника по сравнению с массой тонкого кишечника мышей, получавших [О1у2]ОЬР-2.
В частности, замещение АкрЗ для О1и и Аки16 для А1а и О1и28 для А1а увеличивает массы тонкого кишечника селективнго по сравнению с толстой кишкой (1839 или 1840 по сравнению с 1809). Таким образом, замещение трех аминокислот АкрЗ, Аки16 и О1и28 ведет к селективному увеличению массы тонкого кишечника по сравнению с массой толстой кишки.
Кроме того, замещение Акр8 для серина ведет к дополнительному селективному увеличению, таким образом, в результате приводя к дополнительному увеличению массы тонкого кишечника без значительного воздействия на массу толстой кишки (1818, 1820, 1844,1846,1848, 1849,1852,1853,1855,1858).
На фиг. 1-4 показаны результаты экспериментов, в которых дозазависимый эфеект соединений, приведенных в качестве примера, 1846, 1855, 1848, 1857, 1849 на соотношение 8!-В\\; к Β\ν толстой кишки, показанное по сравнению с соединением [О1у2]ОЬР-2. Для каждой из доз тестировали воздействие [О1у2]ОЬР-2 на массу тонкого кишечника как 100%. Все соединения, приведенные в качестве примера, имеют модификации в позициях 8, 16 и/или 28 и стали причиной селективного роста для тонкого кишечника по сравнению с толстой кишкой.
Пример 10. Дозазависимый эффект 1846, 1848, 1855 и 1857 на атрофию тонкого кишечника у мышей, получавших 5-РИ.
Большая скорость пролиферации стволовых клеток тонкого кишечника делает их сенсибилизированными к цититоксическим воздействиям химиотерапевтических агентов, применяемых при противораковой терапии. В результате клинического применения химиотерапевтический агент 5-флюороурацил (5-РИ) часто ассоциируется с повреждениями тонкого кишечника (атрофия и диарея) у раковых пациентов. Ранее авторы показали, что интраперитонеальное введение 50 мг/кг 5-РИ ежедневно в течение четырех дней индуцирует значительную атрофию тонкого кишечника у мышей С57ВЬ. 1846, 1848, 1855 или 1857 вводили дважды в день в течение трех дней перед 5-РИ и в течение четырех дней совместно с введением 5-РИ. Каждое из соединений-прототипов вводили в пяти различных дозах (5, 15, 45, 135 и 405 нмоль/кг), которые ранее были показаны для эффективной стимуляции роста тонкого кишечника у здоровых мышей (пример 9). Для сравнения группа животных получала 405 нмоль/кг [О1у2]ОЬР-2. Для определения воздействия 5-РИ на тонкий кишечник одна группа животных получала только 5-РИ и не получала ничего кроме 5-РИ (контроль 5-РИ), и другая группа животных, которые получали только носитель (РВ8 контроль).
Результаты.
5-РИ индуцировал значительное уменьшение 8Ι-Βν и длины 81 у мышей С57ВЬ по сравнению с РВ8 контролем. На фиг. 6-9 показан дозазависимый эффект 1846, 1848, 1855 или 1857 на 81-В\\; и длину 8Ι у мышей, которым вводили 5-РИ. Также показано воздействие 405 нмоль/кг [О1у2]ОЬР-2. 1846, 1848, 1855 или 1857 дозазависмо предотвращали 8Ι атрофию, индуцированную 5-РИ, и поддерживали 81-В\\; на уровнях, подобных РВ8 контролю. 2Р1848, 2Р1855 и 2Р1857, вводимые в эквимолярной дозе, были значительно более эффективны на 81-В\\;, чем 405 нмоль/кг [О1у2]ОЬР-2. 1848 и 1857 были значительно более эффективны на длину 8Ι, чем 405 нмоль/кг [О1у2]ОЬР-2.
Пример 11. Дозазависимое воздействие 1846 на атрофию тонкого кишечника и диарею у 8Ό крыс, которым вводили 5-РИ.
Воздействие клинического кандидата 1846 на атрофию тонкого кишечника и диарею, индуцированную 5-РИ, исследовали на 8Ό крысах. Ранее показано интраперитонеальное введение 75 мг/кг 5-РИ ежедневно в течение четырех дней, индуцирующее значительную атрофию тонкого кишечника и диарею у 8Ό крыс. 1846 (16, 80 и 400 нмоль/кг/день; п=20 крыс/дозу группы) вводили дважды в день в течение трех дней перед введеним 5-РИ и четырех дней совместно с введением 5-РИ. В исследование включены 5-РИ контроль и РВ8 контроль. Через 24 ч после последней дозы 1846 субпопуляцию животных умертвляли для определения воздействия 1846 на атрофию тонкого кишечника. Для опредения воздействия 1846 на диарею всех животных наблюдали дважды в день (утром и вечером) и дополнительно в течение шести дней. В течение всего периода наблюдения наличия диареи у животного и тяжесть диареи оценивалась по шкале: (0) нет диареи; (1) слабая диарея - фекалии остаются вокруг ануса; (2) умеренная диарея фекалии остаются на задних конечностях и хвосте и (3) сильная диарея - фекалии остаются на передних конечностях и брюшке.
Результаты.
5-РИ индуцировал значительное уменьшение 8I-ΒV и длины 8Ι у 8Ό крыс по сравнению с РВ8
- 40 014184 контролем. На фиг. 10-11 показан дозазависмый эффект 1846 на предотвращение атрофии тонкого кишечника, индуцированную 5-ЕИ, и поддержание 8!-В\У и длины 8I на уровнях, подобных контролю. При наивысшей дозе введения 1846 (400 нмоль/кг) снижались степень распространения и тяжесть диареи у крыс, которым вводили 5-ЕИ.
Пример 12. Дозазависмый эффект 1846 на длину комплекса крипта-ворсинка и толщину мышечного слоя тонкого кишечника у 8Ό крыс.
Исследовалось воздействие клинического кандидата 1846 на длину комплекса крипта-ворсинка и толщину мышечого слоя тонкого кишечника у 8Ό крыс. 1846 (0,62; 3,41 или 6,2 мг/кг/день, п=6 крыс/ дозу группы) вводили в качестве болюсного внутривенного вливания ежедневно в течение пяти дней последовательно. Через 24 ч после ведения последней дозы крыс умертвляли и брали 1 см биопсии из тощей кишки (30 см от дистального конца двенадцатиперстной кишки) и из подвздошной кишки (30 см от проксимального конца подвздошной кишки) для гистологического исследования.
Результаты.
На фиг. 12 показано дозазависисмое воздействие 1846 на длину комплекса крипта-ворсинка и толщину мышечного слоя тощей кишки и подвздошной кишки. 1846 дозазависмо увеличивает среднюю длину комплекса крипта-ворсинка в тощей кишке и подвздошной кишке и толщину мышц подвздошной кишки.
Пример 13. Воздействие 1846 на метки воспаления тонкого кишечника у индометацин индуцированной модели болезни Крона.
Болезнь Крона является хроническим заболеванием, которое является причиной периодического воспаления тонкого кишечника. Было исследовано воздействие аналога ОЬР-2 1848 на воспаление тонкого кишечника у индометацин индуцированной модели болезни Крона. Сначала показано, что введение индометацина (подкожно ежедневно в течение двух дней) индуцирует воспаление тонкого кишечника, характеризующееся изъязвлением и повышением уровня провоспалительного цитокина, фактора некроза опухолей-альфа (ЮТ-а). Для определения воздействия ΖР1848 на изъязвление 1848 (8, 40 и 200 нмоль/кг подкожно дважды в день (9:00 и 16:00)) вводили в течение четырех дней перед введением первой дозы индометацина и дополнительно в течение двух дней совместно с индометацином. Кортикостероид преднизолон (10 мг/кг перорально) использовали как положительный контроль, поскольку кортикостероиды обычно применяют при лечении активного воспаления при болезни Крона. Кроме того, группа животных получала 1848 (200 нмоль/кг) и преднизалон для определения воздействиия комбинированного лечения. Через 24 ч после последней дозы 1848 животных умервляли, и тонкий кишечник аккуратно промывали и фиксировали. Для определения величины изъязвления рассекали вдоль антибрыжеечного края, суспендировали на полипропиленовом планшете и поверхность окрашивали алциановым зеленым А1с1ап Огееп 3ВХ. Начиная с пилоруса, тонкий кишечник был сканирован и были измерены форма (круглые; линейные) и размер (для круглых язв - диаметр, для линейных язв - длина х ширина) с использованием стандартной линейки (с точность 0,5 мм). Язва была определена как площадь, на которой отсутствует эпителий. В заживающих язвах в качестве язвы рассматривалась площадь, на которой еще отсутствовал эпителий, даже если ворсинки отсутствовали на большей площади. Наконец, общая площадь повреждений была высчитана для каждого животного, как сумма площадей всех отдельных язв.
Для определения воздействия 1848 на концентрации ЮТ-а в тонком кишечнике 1848 и индометацин вводили, как описано выше. При вскрытии тонкий кишечник был разделен на три части равной длины (проксимальная, средняя и дистальная). В каждом отдельном сегменте измеряли концентрации ЮТα с использованием коммерчески доступного набора ЕЫ8А.
Индометацин вызывает значительное изъязвление тонкого кишечника по сравнению с контрольной группой (общее изъязвление тонкого кишечника = 333±21 мм2 по сравнению с 10 мм2). Воздействие 1848 на общее изъязвление (мм2) показано на фиг. 13. Лечение 1848 (8 нмоль/кг, 40 нмоль/кг и 200 нмоль/кг) значительно снижает общее изъязвление (230±12 мм2, 216±17 мм2 и 178±17 мм2 соответсвенно р<0,001 по сравнению с индометацином). При наивысшей дозе (200 нмоль/кг) применение ΖР1848 было более эффективно, чем позитивный контроль - преднизолон (р<0,05).
Индометацин явился причиной повышения приблизительно в 2,9 раза уровней ЮТ-а в проксимальном сегменте (97±14 пг/мг белка) по сравнению с контрольными животными (34±7 пг/мг белка, р<0,05 по сравнению с индометацином). Воздействие 1848 на концентрации ЮТ-а тонкого кишечника показано на фиг. 14. Лечение 1848 (8, 40 и 200 нмоль/кг) значительно снижает уровни ЮТ-а (45±14 пг/мг белка, 44±9 пг/мг белка и 45±7 пг/мг белка соответственно) с незначительной разницей между тремя дозами.
Индометацин явился причиной повышения приблизительно в 3,2 раза уровней ЮТ-а в тканях среднего сегмента (108±9 пг/мг белка) по сравнению с контрольными животными (34±6 пг/мг белка, р<0,05 по сравнению с индометацином). 1848 (40 или 200 нмоль/кг) значительно снижает уровни ЮТ-а в тканях соответственно, р<0,05 по сравнению с индометацином.
Индометацин явился причиной повышения приблизительно в 1,7 раза уровней ТО-а в тканях дистального сегмента (75±5 пг/мг белка) по сравнению с контрольными животными (45±3 пг/мг белка,
- 41 014184 р<0,05 по сравнению с индометацином). 1848 оказывал ингибирующее воздействие на уровни ΤΝΕ-α в дистальном сегменте, но воздействие было менее выражено по сравнению с другими сегментами. Только один преднизолон не оказал значительного воздействия на уровни ΤΝΕ-α в тканях всех трех сегментов, но введение преднизолона усилило ингибирующее воздействие 1848 (200 нмоль/кг) на уровни ΤΝΕ-α исключительно в дистальном сегменте.
Пример 14. Состав ΖΓ1846, 10 мг/мл в гистидине, маннитоле и ацетате.
1. В 1 л лабораторный стакан наполняли 800 мл (νΕΙ) инъекционной воды.
2. В лабораторный стакан отвешивали 13,964 г Ь-гистидина и вводили в 1 л лабораторный стакан.
3. В лабораторный стакан отвешивали 32,200 г маннитола и вводили в 1 л лабораторный стакан.
4. В лабораторный стакан вводили 629 цл уксусной кислоты или отвешивали 12,58 г 5% (масса/объем) раствора уксусной кислоты и вводили в лабораторный стакан.
6. Дополняли до 950 мл.
7. Измеряли рН и регулировали до рН 6,9-1,0 10% уксусной кислотой или 0,25М гистидином при необходимости.
8. Отвешивали 11,312 г лекарственного вещества (содержание пептида 88,4%) и вводили в лабораторный стакан.
9. Дополняли до 1,015 кг (= приблизительно 1000 мл) и измеряли рН, осмоляльность и плотность.
10. Проводили стерилизующее фильтрование через два последовательно соединенных стерилизующих фильтра.
11. Состав по 0,5 аликвот распределяли в ламинарном боксе по 2 мл в емкости, соответствующие стандартам фармпроизводства.
12. Перед помещением в лиофилизатор, предварительно стерилизованный и охлажденный до 4°С, укупоривали пробками для сублимационной сушки.
13. Цикл лиофилизации завершали через 40,5 ч, включая замораживание, первичную и вторичную фазу сушки. Емкости закупоривали в атмосфере азота в лиофилизационной камере.
14. Емкости сортируют и обеспечивают дополнительным укупорочным средством, предотвращающим незаконное вскрытие тары и обжимают.
Пример 15. Состав Ζ₽1846,10 мг/мл в гистидине, аргинине, маннитоле и трегалозе.
1. В 1 л лабораторный стакан наполняли 800 мл (νΕΙ) инъекционной воды.
2. В лабораторный стакан отвешивали 6,206 г Ь-гистидина и вводили в 1 л лабораторный стакан.
3. В лабораторный стакан отвешивали 3,484 г Ь-аргинина и вводили в 1 л лабораторный стакан.
4. В лабораторный стакан отвешивали 33,46 г маннитола и вводили в 1 л лабораторный стакан.
5. В лабораторный стакан отвешивали 11,16 г трегалозы и вводили в 1 л лабораторный стакан.
6. Дополняли до 950 мл.
7. Измеряли рН и регулировали до рН 6,9-7,0 10% уксусной кислотой или 0,25М гистидином при необходимости.
8. Отвешивали 11,312 г лекарственного вещества (содержание пептида 88,4%) и вводили в лабораторный стакан.
9. Дополняли до 1,015 кг (= приблизительно 1000 мл) и измеряли рН, осмоляльность и плотность.
10. Проводили стерилизующее фильтрование через два последовательно соединенных стерилизующих фильтра.
11. Состав по 0,5 мл распределяли в ламинарном боксе по 2 мл в емкости, соответствующие стандартам фармпроизводства.
12. Перед помещением в лиофилизатор, предварительно стерилизованный и охлажденный до 4°С, укупоривали пробками для сублимационной сушки.
13. Цикл лиофилизации завершали через 40,5 ч, включая замораживание, первичную и вторичную фазу сушки. Емкости закупоривали в атмосфере азота в лиофилизационной камере.
14. Емкости сортируют и обеспечивают дополнительным укупорочным средством, предотвращающим незаконное вскрытие тары, и обжимают.
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что объем настоящего изобретения не ограничивается описанием и конкретными вариантами воплощения настоящего изобретения, поскольку на их базе могут быть получены эквивалентные варианты и модификации. Конкретные варианты воплощения настоящего изобретения иллюстрируют его, но не ограничивают. В варианты воплощения настоящего изобретения могут быть внесены различные изменения, без отклонения от цели и объема настоящего изобретения. Все цитируемые здесь документы введены ссылкой.

Claims (56)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Аналог глюканоподобного пептида СЬР-2, представленный общей формулой I
    Κ'-Ζ'-Ηίδ^-Χβ-ΟΙγ-Χί-Χό-ΧΤ-Χδ-Χ^ΧΙΟ-ΧΙΙ-ΧΙΣ-ΧΗ-Χ^ΧΙδ-ΧΙό-ΧΙ?А1а-Х19-Х20-Х21-РЬе-11е-Х24-Тгр-Ьеи-Пе-Х28-ТЬг-Ьуз-Х31-Х32-ХЗЗ-22-К2,
    - 42 014184 где К1 представляет собой водород, С1-4 алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил,
    Х2 представляет собой О1у, А1а или Баг,
    Х3 представляет собой О1и или Акр,
    Х5 представляет собой Бег или ТЬг,
    Х6 представляет собой РЬе или Рго,
    Х7 представляет собой Бег или ТЬг,
    Х8 представляет собой Акр или Бег,
    Х9 представляет собой О1и или Акр,
    Х10 представляет собой Ме!, Ьеи, Ы1е или стабильно окисленную Ме!-замещенную аминокислоту,.
    Х11 представляет собой Акп, А1а, Ьук или Бег,
    Х12 представляет собой ТЬг или Ьук,
    Х13 представляет собой 11е, О1и или О1п,
    Х14 представляет собой Ьеи, Ме! или Ы1е,
    Х15 представляет собой Акр или О1и,
    Х16 представляет собой Акп или А1а,
    Х17 представляет собой Ьеи или О1и,
    Х18 представляет собой А1а или А1Ь,
    Х19 представляет собой А1а или ТЬг,
    Х20 представляет собой Агд или Ьук,
    Х21 представляет собой Акр или 11е,
    Х24 представляет собой Акп, А1а или О1и,
    Х28 представляет собой О1п, А1а или Акп,
    Х31 представляет собой Рго, 11е или удален,
    Х32 представляет собой ТЬг или удален,
    Х33 представляет собой Акр, Акп или удален,
    К2 представляет собой ΝΗ2 или ОН,
    Ζ1 и Ζ2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 3-20 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из А1а, Ьеи, Бег, ТЬг, Туг, Акп, О1п, Акр, О1и, Ьук, Агд, Н1к, Ме! и От; и где аналог ОЬР-2 включает один или более заместитель, выбранный из Х8, представляющего собой Бег, и/или Х16, представляющего собой А1а, и/или Х24, представляющего собой А1а, и/или Х28, представляющего собой А1а;
    или его фармацевтически приемлемая соль или производное.
  2. 2. Аналог ОЬР-2 по п.1, представленный общей формулой II ^^^-0^3-0^5^^7^8^9^10^11^12^13^14^15^16^17^^19^1^^^-1^Х24-Тгр-Ьеи-11е-Х28-ТЬг-Ьук-Х31-Х32-Х3 3-Ζ2-Κ2, где К1 представляет собой водород, С1-4 алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил,
    Х3 представляет собой 01ц или Акр,
    Х5 представляет собой Бег или ТЬг,
    Х7 представляет собой Бег или ТЬг,
    Х8 представляет собой Акр или Бег,
    Х9 представляет собой О1и или Акр,
    Х10 представляет собой Ме1, Ьеи, ΝΕ или стабильно окисленную Ме!-замещенную аминокислоту,
    Х11 представляет собой Акп, А1а, Ьук или Бег,
    Х12 представляет собой ТЬг или Ьук,
    Х13 представляет собой 11е, О1и или О1п,
    Х14 представляет собой Ьеи, Ме! или ΝΚ,
    Х15 представляет собой Акр или О1и,
    Х16 представляет собой Акп или А1а,
    Х17 представляет собой Ьеи или О1и,
    Х19 представляет собой А1а или ТЬг,
    Х24 представляет собой Акп или А1а,
    Х28 представляет собой 01п, А1а или Акп,
    Х31 представляет собой Рго, 11е или удален,
    Х32 представляет собой ТЬг или удален,
    Х33 представляет собой Акр или удален,
    К2 представляет собой ΝΗ2 или ОН,
    Ζ1 и Ζ2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 3-20 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из А1а, Ьеи, Бег, ТЬг, Туг, Акп, О1п, Акр, О1и, Ьук, Агд, Н1к, Ме! и От; и где аналог ОЬР-2 включает один или более заместитель, выбранный из Х8, представляющего собой Бег, и/или Х16, представляющего собой А1а, и/или Х24, представляющего собой А1а,
    - 43 014184 и/или Х28, представляющего собой А1а;
    или его фармацевтически приемлемая соль или производное.
  3. 3. Аналог ОЬР-2 по п.1 или 2, представленный общей формулой III
    К1^1-Н1к-О1у-Х3-О1у-Х5-Рйе-Х7-Х8-О1и-Х10-Х11-Тйг-11е-Ьеи-Акр-Х16-Ьеи-А1а-А1а-Агд-Акр-Рйе11е-Х24-Тгр-Ьеи-11е-Х28-Тйг-Ьук-Х31-Х32-Х33^2-К2, где К1 представляет собой водород, С1-4 алкил (например, метил), ацетил, формил, бензоил или трифторацетил,
    Х3 представляет собой О1и или Акр,
    Х5 представляет собой 8ег или Тйг,
    Х7 представляет собой 8ег или Тйг,
    Х8 представляет собой Акр или 8ег,
    Х10 представляет собой Μеί, Ьеи, Ы1е или стабильно окисленную Μеί-замещенную аминокислоту,
    Х11 представляет собой Акп, А1а, Ьук или 8ег,
    Х24 представляет собой Акп или А1а,
    Х28 представляет собой О1п или А1а,
    Х31 представляет собой 11е или удален,
    Х32 представляет собой Тйг или удален,
    Х33 представляет собой Акр или удален,
    К2 представляет собой Ν42 или ОН,
    Ζ1 и Ζ2 независимо отсутствуют или представляют пептидную последовательность из 3-20 аминокислотных единиц, выбранных из группы, состоящей из А1а, Ьеи, 8ег, Тйг, Туг, Акп, О1п, Акр, О1и, Ьук, Агд, Н1к, Μеί и От; и где аналог ОЬР-2 включает один или более заместитель, выбранный из Х8, представляющего собой 8ег, и/или Х16, представляющего собой А1а, и/или Х24, представляющего собой А1а, и/или Х28, представляющего собой А1а;
    или его фармацевтически приемлемая соль или производное.
  4. 4. Аналог ОЬР-2 по любому из пп.1-3, где аналог ОЬР-2 имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную последовательности ОЬР-2 дикого типа (1-33), и обладает биологической активностью, являющейся причиной увеличения массы кишечника ш νί\Ό.
  5. 5. Аналог ОЬР-2 по любому из предшествующих пунктов, имеющий более чем один заместитель в позициях Х8, Х16, Х24 и/или Х28 и/или один из многих указанных заместителей в комбинации с одним или более заместителей в позициях Х3, Х5, Х7, Х10 и/или Х11.
  6. 6. Аналог ОЬР-2 по п.5, где указанные заместители в позиции Х10 представляют собой Ьеи, Ы1е или стабильно окисленную Μеί-замещенную аминокислоту, такую как Μеί(Ο) или Μеί(Ο)2.
  7. 7. Аналог ОЬР-2 по п.5, где указанные заместители в позиции Х11 представляют собой А1а, 8ег или Ьук.
  8. 8. Аналог ОЬР-2 по п.4, где аналог ОЬР-2 включает один или более из следующей группы заместителей:
    8ег8, А1а16
    8ег8, А1а24
    8ег8, А1а28
    А1а1б, А1а24
    А1а16, А1а28
    А1а24, А1а28
    8ег8, А1а16, А1а24
    8ег8, А1а16, А1а28
    8ег8, А1а24, А1а28
    А1а16, А1а24, А1а28
    8ег8, А1а16, А1а24, А1а28.
  9. 9. Аналог ОЬР-2 по п.5, где аналог ОЬР-2 включает один или более из следующей группы заместителей:
    - 44 014184
    С1иЗ, ЬеиЮ, А1а11,24 (31и3, ТИг5, ЬеиЮ, 8ег11, А1а16,24, 28
    СНиЗ, Тйг5, ЬеиЮ, Ьуз 11, А1а16,24, 28
    С1иЗ, ТЬг5,8ег8, ЬеиЮ, Ьуз 11, А1а16,24,28
    О1иЗ, ТЬг5, 8ег8,11, ЬеиЮ, А1а16, 24, 28
    О1иЗ, ТЬг5, 8ег8, 11, ЬеиЮ, А1а16, 24, 28
    С1иЗ, 8ег8, 11, ЬеиЮ, А1а16,24, 28
    01иЗ, ЬеиЮ, 8ег11, А1а16,24, 28
    01иЗ, ЬеиЮ, Ьуз11, А1а16,24, 28
    О1иЗ, ТЬг5, ЬеиЮ, А1а11,16, 24, 28
    С1иЗ, ТЬг5, ЬеиЮ, А1а11, 16, 24, 28, Пе21
    01иЗ, ТЬг5, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11, 16, 24,28
    01иЗ, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11, 16, 24,28
    С1иЗ, ЬеиЮ, А1а11,16, 24, 28
    ТНг 7. ЬеиЮ, А1а11, 24
    ТЬг7, ЬеиЮ, Ьуз 11, А1а24
    ТИг7. ЬеиЮ, 8ег11, А1а24
    ТЪг7, ЬеиЮ, 8ег8,11, А1а24
    ТЬг7, 8ег8, ЬеиЮ, А1а11, 24
    ТИг7, 8ег8, ЬеиЮ, Ьуз11, А1а24
    8ег8, ЬеиЮ, А1а11,24
    ЬеиЮ, 24
    ЬеиЮ, А1а11, А1а24
    ЬеиЮ, А1а11,24, 28
    ЬеиЮ, А1а11, 16, 24, 28
    ЬеиЮ, Ьуз11, А1а24
    ЬеиЮ, 8ег11, А1а24
    ЬеиЮ, 8ег8, 11, А1а24 или удалена одна или более из позиций Х31-Х33.
  10. 10. Аналог СЬР-2 по любому из предшествующих пунктов, который описан в табл. 1, или его фар- мацевтически приемлемая соль или производное.
  11. 11. Аналог СЬР-2 по п.10, который представляет собой
    - 45 014184
    1834 Η-ΗΟΟΟ8ΡΤ8ΕΕΑΤΙΕΟΝΕΑΑΚΠΡΙΑΨΕΙ0ΤΚ-ΝΗ2
    1846 Η-ΗΓιΕ(38Ρ88ΕΕ8ΤΙΤ ,Γ) ΑΤ. Α ΑΚΌΡΙΑΨΈΙΑΤΚΙΤΌΚ^ΝΗί
    1847 Н-НОЕ68Е8Е)ЕЕ8Т1ЬОΑίΛΑΙΦΡίΛΨΕΙΑΤΚΙΤΟΚί,-ΝΗ.
    1848 Η-ΗΟΕΟΤΡ88ΕΕΑΤΙΕΟΑΕΑΑΚΌΡΙΑΨΕΙΑΤΚΙΤΟΚ6-ΝΗ2
    1849 Н-НСЕО8Р88ЕЬАТ1ЬОАЬААМ)Р1ААУЫАТК1ТОКб-Ш2
    1855 ЕЕНОЕ<д8Р88ЕЬ8Т1ЬЬАЬААК19Е11АА'ЫАТК1ТО-НЕ12
    1857 Н-НСЕСТР88ЕЬА41ЬЬАЬААК1)ГЕА%г1ЛА'1КГт-ЬН2
    1858 Н-НОЕО8Р88ЕЬАТ1ЬОАЬАА№Р1АХУЬ1АТКЛТО-КН2
  12. 12. Аналог ОЬР-2 по любому из пп.1-9, где аналог ОЬР-2 включает более чем один заместитель в позиции Х3, Х7, Х16, Х24, Х28, Х31, Х32 и/или Х33.
  13. 13. Аналог ОЬР-2 по п.12, где аналог ОЬР-2 включает один или более заместитель, выбранный из группы Х3 О1и, Х7 §ег, Х16 А1а, Х28 А1а, Х31 11е, Х32 ТЬг и Х33 Акр, и аминокислотные остатки в поцизиях Х31, Х32 и Х33 необязательно удалены; или его фармацевтически приемлемая соль или производное.
  14. 14. Аналог ОЬР-2 по п.12 или 13, который представляет собой
    1827 Η-ΗΟΌ68ΡΤϋΕΕ8ΤΙΕϋΝίΑΑΚΌΡΙΑΨΕΐςΤΚΚΚΚΚΚ-ΝΗ2
    1844 Н-НСЕ6ТР88ЕЬ8Т1ЬО АЬΑΑΚΠΡΙΑΨΕΙΑΤΚΪΤΌΚΚΚΚΚΚ-ΝΗι
    1845 Η-ΗΟΕΟΤΡ8ΌΕΙ.8ΤΙΕΟАЬААГ<ОТ1ЛХХ’ЫЛТК1ТОКККККК-ЫН2
    1846 Н-НС)ЕСг8Р88ЕТ,8ТП,Г1АЬАΑΚΌΡΙΑΨΕΙΑΤΚΙΤϋΚΚΚΚΚΚΝΗϊ
    1848 Н-НОЕОТР88ЕЬΑΤΙΕΕ)АЬАΑΚΟΓΙΑΨΕΙΑΤΚΙΤΌΚΚΚΚΚΚ-ΝΗ2
    Н-Н<1ЕЬ8Е88ЕЬЛ'Г1ЬОЛЬЛА1<ЬЕ'1А\ЕЕЕ-\ТЫТОКККККК-1\Н2
    185011-Н6ЕО8Г8ВЕЬКТ1 ЬОАЬААКОЕ1А\УЫАТКГГОКККККК-МЕ12
    1851 Н-НОЕОТГ8ОЕЬКТ1ЬПАЬААКЕ)Р1 ΑΨΕΙΑΤΚΙΤϋΚΚΚΚΚΚ-ΝΗ2
    1852 Н-Н(ЗЕ<ЗТЕ88ЕЕКТ1ЬОЛЬААКПР1Л\¥ЫАТК1ТОКККККК-ЫН2
    1855 Н-НОЕО8Е88ЕЬ8Т1ЬОЛЬАЛГ<ПГЬАА7ЫАТК1ТО-МН2
    1857 Η-ΗσΕστΤΕ88ΕΕΑΤϋ.ΓλΑΕΑΑΡΟΡΤΑ\ΑΤΪΑΤΚΙΤΓ)-ΝΗ2
    1858 Н-ЕЮЕС8Р88ЕЬАТ1ЬОАЬААКОЕ1А\¥ЫАТК1ТОЖГН2
    1859Н-НОЕО8Р80ЕЬКТ1Ь0АЬААКОР1А1УЫАТК1Т0-Ш2;
    или его фармацевтически приемлемая соль или производное.
  15. 15. Аналог ОЬР-2 по любому из пп.1-9, где аналог ОЬР-2 включает более чем один заместитель в позициях Х3, Х8 и/или Х24.
  16. 16. Аналог ОЬР-2 по п.15, где аналог ОЬР-2 включает более чем один заместитель, выбранный из Х3 Акр, Х8 Акр и Х24 А1а; и аминокислотные остатки в позициях Х31, Х32 и Х33 необязательно удалены; или его фармацевтически приемлемая соль или производное.
  17. 17. Аналог ОЬР-2 по п.15 или 16, который представляет собой
    - 46 014184
    1830 Η-ΗΟ0Ο8Ρ80ΕΕ8ΤΙΕ0ΝΕΑΑΚΟΡΙΑΨΕΐςΤΚ-ΝΗ2
    1831 Η-ΗΟΟ<38ΓΊΒΕΕ8ΐΙΕΒΝ[.ΑΑΚΟ1·ΊΑ'λΈ[0ΊΚ-ΝΗ2
    1835 Η-Η(1ΒΟ8Ρ8ΒΡ.ΕΚΤΠ_ΒΝΕ А А КПП АХУЕЩТК -ΝΗ2 ]836Η-Η6ΓΚί8ΡΤΒΕΕΚΤΙΙ.ΠΝΕΑΑΚΠΠΑ\νυβτΚ-ΝΗ2
    1839 Η-ΗσϋΟδΡδϋΕΕΑΤΙΕϋΝ ΕΑΑΚΏΡΙΑΨΕ^ΤΚΙΤϋΚΚΚΚΚΚ-ΝΗ2
    1840 Н-Н(?гО68Р8ОЕЕЛТ11.Г)М_.Л АКПР1Л\¥Е19ТК1ТП-КН2
    1841 Н-НаПС>8Р8ПЕЕАТП .ΠΝΕΑ А Κ ΠΡΙ Αλνΐ.ΤΟΤΚ -ΝΗ2
    1843 Н-Н6ГА’г8РТПЕЕАТ1ЕПЧЕА ΑΚΠΡΐΑ\νΐ .ΙβΤΚ-ΝΗ2;
    или его фармацевтически приемлемая соль или производное.
  18. 18. Аналог ОЬР-2 по любому из пп.1-9, который имеет заместитель в одной или более позиции Х3, Х33, Х10, Х11, Х16 и/или Х24.
  19. 19. Аналог ОЬР-2 по любому из предшествующих пунктов для применения в терапии.
  20. 20. Фармацевтическая композиция, содержащая аналог ОЬР-2 по любому из предшествующих пунктов или его соль или производное в смеси с носителем.
  21. 21. Фармацевтическая композиция по п.20, где аналог ОЬР-2 представляет собой фармацевтически приемлемую аддитивную соль кислоты.
  22. 22. Фармацевтическая композиция по п.20 или 21, представляющая собой жидкость, подходящую для введения посредством инъекции или инфузии, или которая составлена таким образом, чтобы обеспечить медленное выделение указанного аналога ОЬР-2.
  23. 23. Применение аналога ОЬР-2 по любому из пп.1-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта.
  24. 24. Применение по п.23, где заболевания желудочно-кишечного тракта представляют собой язвенные заболевания, гастриты, расстройства пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченного кишечника, синдром прямокишечно-маточного углубления, воспалительные заболевания кишечника, брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или глютенового заболевания), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, энтериты, региональный энтерит (болезнь Крона), язвенные колиты, синдром раздраженного кишечника, связанный с диареей, повреждения тонкого кишечника и синдром укороченной тонкой кишки.
  25. 25. Применение по п.23, где заболевания желудочно-кишечного тракта представляют собой лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты, повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химических агентов.
  26. 26. Применение аналога ОЬР-2 по любому из пп.1-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии.
  27. 27. Применение по п.26, где побочными эффектами химиотерапии являются диарея, абдоминальные спазмы и рвота и структурные и функциональные повреждения кишечного эпителия в результате химиотерапии или лучевой терапии.
  28. 28. Применение аналога ОЬР-2 по любому из пп.1-18 для получения лекарственного средства для лечения новорожденных, остеопороза или состояний, связанных с ЭРР-ГУ (дипептидилпептидазой-ГУ).
  29. 29. Применение аналога ОЬР-2 по любому из пп.1-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики состояний, вызванных недостаточностью или нарушением питания.
  30. 30. Применение по п.29, где состояния, вызванные недостаточностью или нарушением питания, представляют собой кахексию или анорексию.
  31. 31. Молекула нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аналог ОЬР-2 по любому из пп.1-18.
  32. 32. Вектор экспрессии, включающий последовательность нуклеиновой кислоты по п.31 в комбинации с регуляторными последовательностями для управления его экспрессией.
  33. 33. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.32.
  34. 34. Способ получения аналога ОЬР-2 по любому из пп.1-18, включающий культивирование клетокхозяев по п.33 в условиях, подходящих для экспрессии аналога ОЬР-2, и выделение полученного таким образом аналога ОЬР-2.
  35. 35. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.31, вектора экспрессии по п.32 или клеткихозяина по п.33 в терапии.
  36. 36. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.31, вектора экспрессии по п.32 или клеткихозяина по п.33 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта, или для лечения и/или профилактики побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии, или для лечения новорожденных, остеопороза или состояний, связанных с ЬРРАУ
    - 47 014184 (дипептидилпептидазой-ΐν).
  37. 37. Способ лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта у нуждающегося пациента введением эффективного количества аналога СЬР-2 по любому из пп.1-17.
  38. 38. Способ лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта у нуждающегося пациента введением эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты по п.31.
  39. 39. Способ лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта у нуждающегося пациента введением эффективного количества вектора экспрессии по п.32.
  40. 40. Способ лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта у нуждающегося пациента введением эффективного количества клетки-хозяина по п.33.
  41. 41. Способ по любому из пп.37-40, где заболевания желудочно-кишечного тракта представляют собой язвенные заболевания, гастриты, расстройства пищеварения, синдром недостаточности всасывания, синдром укороченного кишечника, синдром прямокишечно-маточного углубления, воспалительные заболевания кишечника, брюшные спру (например, возникающие из-за глютеновой энтеропатии или глютенового заболевания), тропическую спру, гипогаммаглобулемическую спру, энтериты, региональный энтерит (болезнь Крона), язвенные колиты, синдром раздраженного кишечника, связанный с диареей, повреждения тонкого кишечника и синдром укороченной тонкой кишки.
  42. 42. Способ по любому из пп.37-40, где заболевания желудочно-кишечного тракта представляют собой лучевые энтериты, инфекционные или постинфекционные энтериты, повреждения тонкого кишечника из-за воздействия токсических или других химических агентов.
  43. 43. Способ лечения или предотвращения побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии у нуждающего пациента, включающий введение эффективного количества аналога СЬР-2 по любому из пп.1-18.
  44. 44. Способ лечения или предотвращения побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии у нуждающего пациента, включающий введение эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты по п.31.
  45. 45. Способ лечения или предотвращения побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии у нуждающего пациента, включающий введение эффективного количества вектора экспрессии по п.32.
  46. 46. Способ лечения или предотвращения побочных эффектов химиотерапии или лучевой терапии у нуждающего пациента, включающий введение эффективного количества клетки-хозяина по п.33.
  47. 47. Способ по любому из пп.43-46, где побочными эффектами химиотерапии являются диарея, абдоминальные спазмы и рвота или структурные или функциональные повреждения кишечного эпителия в результате химиотерапии или лучевой терапии.
  48. 48. Способ лечения у новорожденных нарушений кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с ЭРР-1У (дипептидилпептидазой-ΐν), у нуждающегося пациента, включающий введение эффективного количества аналога СЬР-2 по любому из пп.1-18.
  49. 49. Способ лечения у новорожденных нарушений кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с ЭРР-ГУ (дипептидилпептидазой-ΐν), у нуждающегося пациента, включающий введение эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты по п.31.
  50. 50. Способ лечения у новорожденных нарушений кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с ЭРР-ГУ (дипептидилпептидазой-ΐν), у нуждающегося пациента, включающий введение эффективного количества вектора экспрессии по п.32.
  51. 51. Способ лечения у новорожденных нарушений кишечной функции, остеопороза или состояний, связанных с ЭРР-1У (дипептидилпептидазой-ГУ), у нуждающегося пациента, включающий введение эффективного количества клетки-хозяина по п.33.
  52. 52. Терапевтический набор, содержащий лекарственный препарат для химиотерапии рака и аналог СЬР-2 по любому из пп.1-18, молекулу нуклеиновой кислоты по п.31, вектор экспрессии по п.32 или клетку-хозяин по п.33, каждый необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
  53. 53. Фармацевтическая композиция, содержащая лекарственный препарат для химиотерапии рака и аналог СЬР-2 по любому из пп.1-18, необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
  54. 54. Фармацевтическая композиция, содержащая лекарственный препарат для химиотерапии рака и молекулу нуклеиновой кислоты по п.31, необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
  55. 55. Фармацевтическая композиция, содержащая лекарственный препарат для химиотерапии рака и вектор экспрессии по п.32, необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
  56. 56. Фармацевтическая композиция, содержащая лекарственный препарат для химиотерапии рака и клетку-хозяин по п.33, необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
EA200702408A 2005-05-04 2006-05-04 Аналоги глюкагонподобного пептида-2 (glp-2) EA014184B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67806605P 2005-05-04 2005-05-04
PCT/GB2006/001633 WO2006117565A2 (en) 2005-05-04 2006-05-04 Glucagon-like-peptide-2 (glp-2) analogues

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200702408A1 EA200702408A1 (ru) 2008-10-30
EA014184B1 true EA014184B1 (ru) 2010-10-29

Family

ID=36649773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200702408A EA014184B1 (ru) 2005-05-04 2006-05-04 Аналоги глюкагонподобного пептида-2 (glp-2)

Country Status (25)

Country Link
US (7) US7563770B2 (ru)
EP (4) EP2295451A1 (ru)
JP (3) JP5405105B2 (ru)
KR (3) KR101242951B1 (ru)
CN (2) CN101171262B (ru)
AT (1) ATE498631T1 (ru)
AU (1) AU2006242998B2 (ru)
BR (1) BRPI0610091B1 (ru)
CA (1) CA2607150C (ru)
CY (1) CY1111411T1 (ru)
DE (1) DE602006020123D1 (ru)
DK (1) DK1877435T4 (ru)
EA (1) EA014184B1 (ru)
ES (1) ES2361095T5 (ru)
HK (1) HK1108898A1 (ru)
IL (3) IL186746A (ru)
MX (1) MX2007013431A (ru)
NO (1) NO345236B1 (ru)
NZ (4) NZ591179A (ru)
PL (1) PL1877435T5 (ru)
PT (1) PT1877435E (ru)
SI (1) SI1877435T2 (ru)
UA (1) UA95235C2 (ru)
WO (1) WO2006117565A2 (ru)
ZA (2) ZA200709384B (ru)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
ES2372978T3 (es) 2002-06-07 2012-01-30 Dyax Corp. Polipéptido con dominio de kunitz modificado.
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
HUE042899T2 (hu) 2002-08-28 2019-07-29 Dyax Corp Eljárás szervek és szövetek tartósítására
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
NZ591179A (en) * 2005-05-04 2012-06-29 Zealand Pharma As Glucagon-like-peptide-2 (glp-2) analogues
US20070213275A1 (en) * 2006-03-10 2007-09-13 Dyax Corp. Formulations for ecallantide
EP2340846A1 (en) † 2006-07-26 2011-07-06 Sandoz Ag Caspofungin formulations
EP2081555A2 (en) * 2006-09-12 2009-07-29 Cosmo Technologies Ltd. Pharmaceutical compositions for the oral or rectal administration of protein substances
NZ576260A (en) * 2006-11-08 2012-04-27 Zealand Pharma As GLUCAGON-LIKE-PEPTIDE-2 (GLP-2) ANALOGUES comprising one of more substitutions as compared to h[Gly2]GLP-2
US20090004243A1 (en) 2007-06-29 2009-01-01 Pacetti Stephen D Biodegradable triblock copolymers for implantable devices
KR20090035279A (ko) * 2007-10-05 2009-04-09 경희대학교 산학협력단 위장관 손상 예방 및 치료용 조성물
US20090110713A1 (en) * 2007-10-31 2009-04-30 Florencia Lim Biodegradable polymeric materials providing controlled release of hydrophobic drugs from implantable devices
CN102307594A (zh) 2009-01-06 2012-01-04 戴埃克斯有限公司 用激肽释放酶抑制剂治疗粘膜炎
CN101824087A (zh) * 2009-03-05 2010-09-08 连云港恒邦医药科技有限公司 胰高血糖素样肽-2类似物及其制备方法和用途
EP2314616A1 (en) * 2009-10-23 2011-04-27 Ferring B.V. Peptidic GLP-2 agonists
PT2521568T (pt) 2010-01-06 2018-10-26 Dyax Corp Proteínas de ligação à calicreína plasmática
US9782455B2 (en) * 2010-08-30 2017-10-10 Nps Pharmaceuticals, Inc. Solid phase synthesis of h(Gly2)GLP-2
KR102169651B1 (ko) 2011-01-06 2020-10-23 다이액스 코포레이션 혈장 칼리크레인 결합 단백질
CN102212127B (zh) * 2011-05-17 2015-02-04 上海景泽生物技术有限公司 胰高血糖素样肽-2聚乙二醇结合物及其制备方法和用途
CN102924589B (zh) * 2011-08-11 2016-08-24 中肽生化有限公司 胰高血糖素样肽-2(glp-2)的类似物及其制备方法和用途
PT2755675T (pt) 2011-09-12 2018-10-11 Amunix Operating Inc Composições de péptido semelhante a glucagão-2 e métodos para produzir e utilizar as mesmas
KR101895047B1 (ko) 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
US10172953B2 (en) 2012-02-27 2019-01-08 Amunix Operating Inc. XTEN conjugate compositions and methods of making same
US9453064B2 (en) 2012-05-03 2016-09-27 Zealand Pharma A/S Glucagon-like-peptide-2 (GLP-2) analogues
US20150038674A1 (en) * 2013-08-05 2015-02-05 Bayrak Bertan Boran Use of glp-2 analogues in pulmonary diseases for therapeutic purpose
US10428158B2 (en) 2014-03-27 2019-10-01 Dyax Corp. Compositions and methods for treatment of diabetic macular edema
US20160067311A1 (en) * 2014-09-10 2016-03-10 Helsinn Healthcare Sa Use of elsiglutide to treat gastrointestinal mucositis including chemotherapy-induced diarrhea
US20170087216A1 (en) * 2015-09-17 2017-03-30 Helsinn Healthcare Sa Therapeutic Uses of Elsiglutide
CN108602893A (zh) 2015-12-11 2018-09-28 戴埃克斯有限公司 血浆激肽释放酶抑制剂及其治疗遗传性血管性水肿发作的用途
CN107987170B (zh) 2016-10-27 2018-12-18 浙江道尔生物科技有限公司 一种用于治疗肠道疾病的融合蛋白
CA3043151A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Zealand Pharma A/S Acylated glp-1/glp-2 dual agonists
WO2018104558A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Zealand Pharma A/S Acylated glp-1/glp-2 dual agonists
WO2018104559A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 Zealand Pharma A/S Glp-1/glp-2 dual agonists
CA3044915A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Zealand Pharma A/S Glp-1/glp-2 dual agonists
WO2018142363A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Orbicular Pharmaceutical Technologies Private Limited Ready to use compositions of glp-2 analogues through self-administrable devices
PE20200678A1 (es) * 2017-06-16 2020-06-11 Zealand Pharma As Posologias para la administracion de analogos de peptido de tipo glucagon-2 (glp-2)
JP2020534840A (ja) * 2017-09-28 2020-12-03 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド Ｇｌｐ−２誘導体の持続型結合体
WO2019086559A1 (fr) 2017-10-31 2019-05-09 Adocia Composition comprenant un agoniste du recepteur du glp-2 et un co-polyaminoacide porteur de charges carboxylates et de radicaux hydrophobes
WO2020020904A1 (en) 2018-07-23 2020-01-30 Zealand Pharma A/S Therapeutic uses of glp-2 agonists
EP3628683A1 (en) 2018-09-28 2020-04-01 Zealand Pharma A/S Formulations of glucagon-like-peptide-2 (glp-2) analogues
EP3628682A1 (en) 2018-09-28 2020-04-01 Zealand Pharma A/S Formulations of glucagon-like-peptide-2 (glp-2) analogues
WO2020165900A1 (en) * 2019-02-11 2020-08-20 Opko Biologics Ltd. Long-acting glp-2 analogs
CN110305223B (zh) 2019-06-26 2022-05-13 重庆派金生物科技有限公司 重组串联融合蛋白制备目标多肽的方法
WO2021071837A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Kallyope, Inc. Gpr119 agonists
US20230110689A1 (en) 2020-03-30 2023-04-13 Zealand Pharma A/S Agonist combination
BR112022019518A2 (pt) * 2020-04-03 2023-02-07 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composição farmacêutica para prevenir ou tratar mucosite induzida por radioterapia, quimioterapia, ou uma combinação das mesmas, que compreende derivados de glp-2 ou um conjugado de atuação duradoura do mesmo
JP2023526625A (ja) 2020-05-19 2023-06-22 キャリーオペ，インク． Ａｍｐｋアクチベーター
CN111560061A (zh) * 2020-05-26 2020-08-21 成都圣诺生物制药有限公司 一种Gelpaglutide的制备方法
CN111560062A (zh) * 2020-05-26 2020-08-21 成都圣诺生物制药有限公司 一种Elisiglutide的制备方法
IL298964A (en) 2020-06-09 2023-02-01 Vectivbio Ag Manufacture, formulation and dosage of APRAGLUTIDE
CA3183575A1 (en) 2020-06-26 2021-12-30 Iyassu Sebhat Ampk activators
JP2024500343A (ja) 2020-12-16 2024-01-09 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ 腎不全患者におけるｇｌｐ－２アナログの使用
CN115636876A (zh) * 2021-07-20 2023-01-24 重庆派金生物科技有限公司 胰高血糖素样肽-2突变体的定向化学偶联物及其应用
KR20240055083A (ko) 2021-09-10 2024-04-26 질랜드 파마 에이/에스 글루카곤 유사 펩티드-2(glp-2) 아날로그를 포함하는 조성물을 제제화하는 방법
WO2023118416A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Zealand Pharma A/S Processes for synthesizing glucagon-like-peptide 2 (glp-2) analogues
WO2024068933A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Zealand Pharma A/S Glucagon-like-peptide-2 (glp-2) analogues and their medical uses for the treatment of short bowel syndrome (sbs)
CN116751278B (zh) * 2023-06-21 2024-02-13 杭州信海医药科技有限公司 一种Glepaglutide的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997039031A1 (en) * 1996-04-12 1997-10-23 1149336 Ontario Inc. Glucagon-like peptide-2 analogs
US20030109449A1 (en) * 1996-07-19 2003-06-12 1149336 Ontario Inc. Antagonists of intestinotrophic GLP-2 peptides

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
JP2961045B2 (ja) * 1993-02-24 1999-10-12 日清製粉株式会社 腸管粘膜増強促進剤
US6184208B1 (en) 1994-06-29 2001-02-06 Immunotech Developments Inc. Peptide, a method for its preparation and a pharmaceutical composition containing the peptide
US5789379A (en) 1995-04-14 1998-08-04 Allelix Biopharmaceutical Inc. Glucagon-like peptide-2 analogs
US5834428A (en) * 1995-04-14 1998-11-10 1149336 Ontario Inc. Glucagon-like peptide-2 and its therapeutic use
US5990077A (en) † 1995-04-14 1999-11-23 1149336 Ontario Inc. Glucagon-like peptide-2 and its therapeutic use
US6184201B1 (en) * 1995-04-14 2001-02-06 Nps Allelix Corp. Intestinotrophic glucagon-like peptide-2 analogs
US5912229A (en) * 1996-03-01 1999-06-15 Novo Nordisk Als Use of a pharmaceutical composition comprising an appetite-suppressing peptide
ES2306685T3 (es) † 1996-03-01 2008-11-16 Novo Nordisk A/S Peptido supresor del apetito, su composicion y uso.
US20020025933A1 (en) * 1996-08-30 2002-02-28 Knudsen Liselotte Bjerre GLP-2 derivatives
ATE290014T1 (de) 1996-09-09 2005-03-15 Zealand Pharma As Festphasen-peptidsynthese
US5952301A (en) * 1996-12-10 1999-09-14 1149336 Ontario Inc. Compositions and methods for enhancing intestinal function
CA2236519C (en) * 1997-05-02 2011-09-13 1149336 Ontario Inc. Methods of enhancing functioning of the large intestine
US6051557A (en) * 1997-05-16 2000-04-18 1149336 Ontario Inc. Methods of enhancing functioning of the upper gastrointestinal tract
AU746633B2 (en) † 1997-05-16 2002-05-02 1149336 Ontario Inc. Methods of enhancing functioning of the upper gastrointestinal tract
DE04029691T1 (de) * 1998-02-02 2007-11-08 Trustees Of Tufts College, Medford Verwendung von Dipetidylpeptidasehemmer zur Regulierung des Glukosemetabolismus
EP1950223A3 (en) 1998-03-09 2009-05-13 Zealand Pharma A/S Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
EP1076066A1 (en) * 1999-07-12 2001-02-14 Zealand Pharmaceuticals A/S Peptides for lowering blood glucose levels
WO2001041779A2 (en) 1999-12-08 2001-06-14 1149336 Ontario Inc. Combined use of glp-2 receptor agonist and chemotherapeutic agent in treatment
US7186683B2 (en) * 2000-09-18 2007-03-06 Sanos Bioscience A/S Use of GLP for the treatment, prevention, diagnosis, and prognosis of bone-related and nutrition-related disorders
US7371721B2 (en) * 2000-09-18 2008-05-13 Sanos Bioscience A/S Use of GLP-2 and related compounds for the treatment, prevention, diagnosis, and prognosis of bone-related disorders and calcium homeostasis related syndromes
AU2002213925A1 (en) * 2000-09-18 2002-03-26 Osteometer Biotech As Use of glp-1 and flp-2 peptides for treatment of bone disorders
WO2002066062A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-29 Drucker Daniel J Enhancement of glp-2 activity
EP1360202B1 (en) * 2001-02-16 2008-05-21 ConjuChem Biotechnologies Inc. Long lasting glucagon-like peptide 2 (glp-2) for the treatment of gastrointestinal diseases and disorders
EP1542712A2 (en) 2001-06-01 2005-06-22 Eli Lilly And Company Glp-1 formulations with protracted time action
US7411039B2 (en) * 2002-10-14 2008-08-12 Novo Nordisk A/S GLP-2 compounds, formulations, and uses thereof
JP2007525425A (ja) * 2003-03-24 2007-09-06 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ Ｇｌｐ−２誘導体
CA2539253A1 (en) * 2003-09-19 2005-03-31 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides
CA2585482C (en) * 2004-11-01 2018-01-02 Nps Allelix Corp. Treatment of short bowel syndrome patients with colon-in-continuity
NZ591179A (en) 2005-05-04 2012-06-29 Zealand Pharma As Glucagon-like-peptide-2 (glp-2) analogues
NZ576260A (en) 2006-11-08 2012-04-27 Zealand Pharma As GLUCAGON-LIKE-PEPTIDE-2 (GLP-2) ANALOGUES comprising one of more substitutions as compared to h[Gly2]GLP-2
CA2747109A1 (en) 2008-12-15 2010-06-24 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
UY33462A (es) 2010-06-23 2012-01-31 Zealand Pharma As Analogos de glucagon
KR102011924B1 (ko) 2011-05-18 2019-08-21 메더리스 다이어비티즈, 엘엘씨 인슐린 저항성에 대한 개선된 펩티드 제약

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997039031A1 (en) * 1996-04-12 1997-10-23 1149336 Ontario Inc. Glucagon-like peptide-2 analogs
US20030109449A1 (en) * 1996-07-19 2003-06-12 1149336 Ontario Inc. Antagonists of intestinotrophic GLP-2 peptides

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DACAMBRA M.P. ET AL.: "Structural determinants for activity of glucagon-like peptide-2" BIOCHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. EASTON, PA, US, vol. 39, no. 30, 1 August 2000 (2000-08-01), pages 8888-8894, XP002293748 ISSN: 0006-2960 see "Experimental procedures", "peptides" p. 8889 *
DRUCKER D.J. ET AL.: "INDUCTION OF INTESTINAL EPITHELIAL PRLIFERATION BY GLUCAGON-LIKE PEPTIDE 2" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC, US, vol. 93, no. 15, 1996, pages 7911-7916, XP000602070 ISSN: 0027-8424 abstract *
DRUCKER D.J. ET AL.: "REGULATION OF THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF GLUCAGON-LIKE PEPTIDE 2 IN VIVO BY DIPEPTIDYL PEPTIDASE IV" NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP, NEW YORK, NY, US, vol. 15, no. 7, July 1997 (1997-07), pages 673-677, XP000867401 ISSN: 1087-0156 abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2295452A1 (en) 2011-03-16
CY1111411T1 (el) 2015-08-05
SI1877435T1 (sl) 2011-05-31
JP2008539713A (ja) 2008-11-20
JP6272284B2 (ja) 2018-01-31
US20150368314A1 (en) 2015-12-24
US20110152186A1 (en) 2011-06-23
US8263552B2 (en) 2012-09-11
JP5876434B2 (ja) 2016-03-02
NO20076043L (no) 2008-02-04
AU2006242998B2 (en) 2012-03-22
KR101242951B1 (ko) 2013-03-13
CN101171262A (zh) 2008-04-30
ZA200709384B (en) 2011-04-28
IL210669A0 (en) 2011-03-31
CN101171262B (zh) 2012-06-27
US8163696B2 (en) 2012-04-24
US9580487B2 (en) 2017-02-28
DK1877435T3 (da) 2011-06-06
BRPI0610091B1 (pt) 2021-08-03
NO345236B1 (no) 2020-11-16
EP1877435A2 (en) 2008-01-16
US9125882B2 (en) 2015-09-08
MX2007013431A (es) 2008-01-18
ES2361095T5 (es) 2021-11-23
IL186746A (en) 2012-08-30
ZA201100753B (en) 2022-12-21
US20110098222A1 (en) 2011-04-28
BRPI0610091A2 (pt) 2008-12-09
IL186746A0 (en) 2008-02-09
CA2607150A1 (en) 2006-11-09
DK1877435T4 (da) 2021-03-29
CA2607150C (en) 2014-08-05
IL210668A (en) 2013-05-30
IL210668A0 (en) 2011-03-31
KR20110095397A (ko) 2011-08-24
CN102659938A (zh) 2012-09-12
US20070117752A1 (en) 2007-05-24
NZ562943A (en) 2011-03-31
WO2006117565A2 (en) 2006-11-09
US20070231308A1 (en) 2007-10-04
EP3473646A1 (en) 2019-04-24
JP2013189436A (ja) 2013-09-26
ATE498631T1 (de) 2011-03-15
NZ591179A (en) 2012-06-29
JP2016006125A (ja) 2016-01-14
EP1877435B2 (en) 2021-03-17
NZ591178A (en) 2012-06-29
PT1877435E (pt) 2011-05-24
IL210669A (en) 2013-08-29
EP1877435B1 (en) 2011-02-16
JP5405105B2 (ja) 2014-02-05
UA95235C2 (en) 2011-07-25
US20170137487A1 (en) 2017-05-18
SI1877435T2 (sl) 2021-05-31
PL1877435T3 (pl) 2011-07-29
PL1877435T5 (pl) 2021-09-27
EA200702408A1 (ru) 2008-10-30
KR101242795B1 (ko) 2013-03-12
KR101200227B1 (ko) 2012-11-13
US7563770B2 (en) 2009-07-21
US20120289466A1 (en) 2012-11-15
US7745403B2 (en) 2010-06-29
ES2361095T3 (es) 2011-06-13
CN102659938B (zh) 2016-01-20
KR20080015827A (ko) 2008-02-20
DE602006020123D1 (de) 2011-03-31
NZ593050A (en) 2012-12-21
KR20110093924A (ko) 2011-08-18
WO2006117565A3 (en) 2007-01-11
HK1108898A1 (en) 2008-05-23
EP2295451A1 (en) 2011-03-16
AU2006242998A1 (en) 2006-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA014184B1 (ru) Аналоги глюкагонподобного пептида-2 (glp-2)
JP5819586B2 (ja) 選択的グルカゴン様ペプチド−２（ｇｌｐ−２）類似体
TW202241927A (zh) 一類用於修復皮膚損傷或黏膜損傷之多肽及其應用