CN101573376A - 选择性胰高血糖素样肽-2（glp-2）类似物 - Google Patents

选择性胰高血糖素样肽-2（glp-2）类似物 Download PDF

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Abstract

本文公开了与h[Gly2]GLP－2相比包含一个或多个替换的GLP－2类似物，其可具有提高的小肠/结肠和胃/结肠选择性的特性。更具体地，本文公开的优选GLP－2类似物包含野生型GLP－2序列中(11、16、20、24)和/或(28)位中一个或多个位置上的替换，其任选地与以下相组合：(2)位以及(3、5、7)位和(10)位中一个或多个位置上的其他替换，和/或缺失(31)至(33)位的一个或多个氨基酸，和/或添加N端或C端稳定肽序列。所述类似物在预防或治疗胃肠相关疾病以及减轻化学治疗的副作用方面特别有用。

Description

选择性胰高血糖素样肽-2(GLP-2)类似物
技术领域
本发明涉及选择性胰高血糖素样肽-2(glucagon-like-peptide-2，GLP-2)类似物及其医药用途，例如在预防或治疗胃和肠相关疾病以及减轻化学治疗和/或放射治疗的胃肠相关副作用方面的医药用途。
背景技术
GLP-2是33个氨基酸的肽，其来自于对肠中肠内分泌L细胞中以及脑干的特定区域中胰高血糖素原(proglucagon)的特定翻译后加工。它与胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胃泌酸调节素和肠高血糖素(glicentin)一起应答于养分摄入而共分泌。
GLP-2通过刺激隐窝中干细胞增殖和抑制绒毛凋亡来诱导小肠粘膜上皮的显著生长(Drucker等Proc Natl Acad Sci U S A.1996，93：7911-6)。GLP-2还对结肠具有生长效应。GLP-2还抑制胃排空和胃酸分泌(Wojdemann等J Clin Endocrinol Metab.1999，84：2513-7)、增强肠屏障功能(Benjamin等Gut.2000，47：112-9)、通过上调葡萄糖转运蛋白来刺激肠的己糖转运(Cheeseman，.Am J Physiol.1997，R1965-71)以及提高肠的血流量(Guan等Gastroenterology.2003，125，136-47)。
GLP-2与属于II类胰高血糖素分泌素家族的单G蛋白偶联受体结合。GLP-2受体在已知应答于GLP-2的部位(小肠、结肠和胃)中表达(Yusta等.Gastroenterology.2000，119：744-55)。然而，胃肠道中GLP-2受体刺激的靶细胞仍不清楚，并且对与GLP-2受体偶联的下游胞内递质(mediator)的了解甚少。
GLP-2在小肠中已被证实的特异性并有益的效果已经引起了人们在治疗肠疾病或损伤中使用GLP-2的极大兴趣(Sinclair和Drucker，Physiology2005：357-65)。而且，已显示GLP-2在多种临床前肠损伤模型中预防或降低粘膜上皮损伤，所述模型包括化学治疗诱发的肠炎、缺血-再灌注损伤、硫酸葡聚糖诱导的结肠炎以及炎性肠病的遗传模型(Sinclair and DruckerPhysiology 2005：357-65)。
另外，GLP-2R mRNA在胃中的表达(Yusta等，2000)与GLP-2减少胃动力及胃酸分泌的观察结果(Meier等，2006)一起提供了充足的证据证明胃直接或间接地应答于GLP-2。
尽管如此，对于GLP-2或GLP-2类似物在特征为胃壁内衬(gastriclining)损伤之病症中的用途还没有进行研究。
GLP-2以具有以下序列的33个氨基酸的肽的形式分泌：H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH。其迅速地被酶DPP IV在NH2端的2位丙氨酸(A)处切割，形成无活性的人GLP-2(3-33)。除了肾清除之外，GLP-2(1-33)的这种快速酶降解导致该肽的半衰期为约7分钟(Tavares等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.278：E134-E139，2000)。
US 5,994,500(Drucker等)描述了GLP-2拮抗剂及其对胃肠组织生长的影响。其提出了将所述拮抗剂配制成药物用于治疗增生或诱导发育不全。US 5,994,500通过突变例如替换和缺失来改变哺乳动物GLP-2的结构。
US 6,184,208、US 5,789,379和US 6,184,201公开了GLP-2类似物及其医药用途。这些类似物全是通过人GLP-2的替换和/或缺失得到的。
DaCambra等(Biochemistry 2000，39，8888-8894)描述了GLP-2活性的结构决定因素。这种决定因素的实例是Phe6和Thr5，所述Phe6和Thr5称为对GLP-2受体结合和活化是至关重要的。
WO97/39031公开了GLP-2类似物[Gly2]GLP-2。其中2位的丙氨酸被甘氨酸取代，以使所述肽抵抗DPP IV切割。显示丙氨酸的取代提高所述肽的稳定性和效能(potency)。该专利申请描述了如何使用GLP-2类似物对抗肠上皮粘膜炎症和破坏相关的疾病。它们包括大规模小肠切除、炎性肠病、化学疗法和/或放射诱发的粘膜炎以及缺血性损伤。
WO02/066511描述了体内半衰期延长的GLP-2类似物及其作为治疗胃肠病症如炎性肠疾病的药物的用途。
WO 01/41779描述了h[Gly2]GLP-2用作抑制化学疗法诱导之凋亡和促进小肠上皮细胞存活的预处理的用途。
本文引用的所有参考文献明确地通过参考整体并入本文。
许多科学家已提出将GLP-2或GLP-2类似物用于治疗多种疾病。但是，仍然需要改进的和具有小肠选择性的GLP-2类似物。
发明内容
一般而言，本发明涉及GLP-2类似物：其与野生型GLP-2相比包含一个或多个替换，并可具有小肠相对于结肠的选择性提高、体内生物活性提高和/或化学稳定性提高(例如体外稳定性测定中所评估的)的特性。更具体地，优选的本发明GLP-2类似物包含野生型GLP-2序列中8、11、12、13、16、17、18、20、21、24和/或28位中一个或多个位置上的非保守性替换，其任选还具有野生型GLP-2序列中2位(如引言中所述的)以及3、5、7和10位中一个或多个位置上的其他保守性或非保守性替换和/或31至33位上一个或多个相应氨基酸的替换或缺失，并任选地还具有N端或C端稳定肽序列的添加。另外，本发明的GLP-2类似物可包含对应于9、14和15位的一个或多个氨基酸的保守性替换。除了提供可具有提高的化学稳定性和/或生物活性的GLP-2类似物之外，本发明还涉及提供与结肠相比在小肠中具有偏好性肠生长促进活性(反之亦然)的化合物，特别是通过包含对野生型GLP-2中Asn11和/或Asn16和/或Arg20和/或Asn24和/或Gln28位中的一个或多个位置进行修饰来实现。
因此，在一个方面中，本发明提供了通式I代表的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物：
R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2·
其中：
R1是氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
X2是Gly、Ala或Sar；
X3是Glu或Asp；
X5是Ser或Thr；
X6是Phe或Pro或保守性替换；
X7是Ser或Thr；
X8是Asp或Ser或保守性替换；
X9是Glu或Asp或保守性替换；
X10是Met、Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸；
X11是Y1；
X12是Thr或Lys或保守性替换；
X13是Ile、Glu或Gln或保守性替换；
X14是Leu、Met或Nle或保守性替换；
X15是Asp或Glu或保守性替换；
X16是Y2；
X17是Leu或Glu或保守性替换；
X18是Ala或Aib或非保守性替换；
X19是Ala或Thr或保守性替换；
X20是Y3；
X21是Asp或Ile或保守性替换；
X24是Y4；
X28是Y5；
X31是Pro、Ile或缺失；
X32是Thr或缺失；
X33是Asp，Asn或缺失；
R2是NH2或OH；
其中
Z1和Z2独立地不存在或者是选自以下的1-10个氨基酸单元的肽序列：Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn；通过HPP＝∑hpiX11+hpiX16+hpiX20+hpiX24+hpiX28算出的式I中X11、X16、X20、X24、X28残基的亲水性图(hydrophaticityprofile，HPP)≥-10
其中
Y1、Y2、Y4和Y5可各自选自Asn、Asp、Glu、Gln、Lys、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、Met或Phe；并且
Y3可选自Asn、Asp、Glu、Gln、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、Met或Phe；
前提条件是，当X20是Arg时，则X11是Ser，X16是Ala，X24是Ala，X28是Ala并且Z2是Lys。
在一个实施方案中，本发明包括如上所述的胰高血糖素样肽-2(GLP-2)类似物，其中HPP≥-4。
在另一个实施方案中，本发明包括如上所述的胰高血糖素样肽-2(GLP-2)类似物，其中HPP≥0。
在另一个方面中，本发明提供了由通式II代表的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物：
R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
其中：
R1是氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
X2是Gly、Ala或Sar；
X3是Glu或Asp；
X5是Ser或Thr；
X6是Phe或Pro；
X7是Ser或Thr；
X8是Asp或Ser；
X9是Glu或Asp；
X10是Met、Leu、Nle或氧化性稳定的Met取代氨基酸；
X11是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X12是Thr或Lys；
X13是Ile、Glu或Gln；
X14是Leu、Met或Nle；
X15是Asp或Glu；
X16是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X17是Leu或Glu；
X18是Ala或Aib；
X19是Ala或Thr；
X20是Asn、Arg、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X21是Asp或Ile；
X24是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X28是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X31是Pro、Ile或缺失；
X32是Thr或缺失；
X33是Asp、Asn或缺失；
R2是NH2或OH；
其中
Z1和Z2独立地不存在或者是选自以下的1-10个氨基酸单元的肽序列：Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn；
前提条件是，当X20是Arg时，则X11是Ser，X16是Ala，X24是Ala，X28是Ala并且Z2是Lys。
在一个实施方案中，本发明包括如上所述的GLP-2类似物，其中
X11是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X16是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X20是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X24是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X28是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val。
在另一个实施方案中，本发明包括如上所述的GLP-2类似物，其中
X11是Ala、Ile、Leu、Phe或Val；
X16是Ala、Ile、Leu、Phe或Val
X20是Ala、Ile、Leu、Phe或Val
X24是Ala、Ile、Leu、Phe或Val
X28是Ala、Ile、Leu、Phe或Val。
在又一个实施方案中，本发明包括如上所述的GLP-2类似物，其中所述GLP-2类似物与野生型GLP-2(1-33)具有至少60％的氨基酸序列同一性，并且具有在体内导致肠质量增加的生物活性。
在又一个实施方案中，本发明包括如下所述的GLP-2类似物，其具有X11、X16、X20、X24和/或X28位上的多于一个替换(即相对于上文给出的野生型序列具有多于一个替换)和/或一个或多个所述替换与X3、X5、X7和/或X10位上的一个或多个替换相组合。
在又一个实施方案中，本发明包括X10的替换是Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸(例如Met(O)或Met(O)2)的GLP-2类似物。因此，作为上述替换的补充或替代，所述GLP-2类似物可在X10位上具有Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸(例如Met(O)或Met(O)2)。
在本发明的一些实施方案中，所述GLP-2类似物与具有本申请背景技术部分中所示序列的野生型GLP-2(1-33)具有至少60％的氨基酸序列同一性，更优选地，至少63％的序列同一性，更优选至少66％的序列同一性，再优选至少69％的序列同一性。
就GLP-2多肽序列而言，“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与野生型GLP-2序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，所述定义在以下步骤后得出：比对序列和必要时引入缺口以实现最高序列同一性百分比，并且不将任何保守性替换认为是序列同一性的一部分。本领域技术人员可使用本领域熟知的技术例如使用公众可用的软件如BLAST、BLAST2或Align软件进行序列比对，比对程序参阅：Altschul等(Methods in Enzymology，266：460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html)或Pearson等(Genomics，46，24，36，1997)和http://molbiol.soton.ac.uk/compute/align.html。
使用这些程序及其默认设置测定本文使用的以及根据本发明的序列同一性百分比。更一般地，技术人员能够容易地确定用于测定比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最佳比对所需的任何算法。
在本发明的另一个实施方案中，如上所述的GLP-2类似物包含X3、X5、X7、X11、X16、X20、X24、X28、X31、X32和/或X33位上的多于一个替换(即相对于上文所述野生型序列的多于一个替换)。
在本发明的又一个实施方案中，如上文所述的GLP-2类似物包含选自X11、X16、X20、X24、X28是Ile、Ala、Leu、Phe或Val的一个或多个替换；X31、X32和X33位的氨基酸残基任选是缺失的；或者是其可药用盐或衍生物。
在本发明的又一个实施方案中，如上所述的GLP-2类似物包含X11、X16、X20、X24和/或X28位中一个或多个位置上的替换(即相对于上文所述野生型序列的替换)。
在本发明的一个优选实施方案中，如上所述的GLP-2类似物公开于本文表1或表2中，或是其可药用盐或衍生物。
在本发明的一个优选实施方案中，所述GLP-2类似物定义为通式III或者其可药用盐或衍生物：
R1-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-X8-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-X15-X16-Leu-Ala-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2；
其中
R1是氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
X8是Asp或Ser，优选Asp；
X11是Ser、Ala、Glu、Lys或Asn；
X15是Glu或Asp，优选Glu；
X16是Ser、Ala或Glu；
X20是Ser、Ala或Glu；
X24是Ser、Ala或Glu；和
X28是Ser、Ala、Gln或Glu。
本发明的目的化合物(式I)描述于下表中，其中所述化合物可在N端如式III中针对R1所述被修饰，并且包括其可药用盐或衍生物：
  ZP2263   His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala-Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
  ZP2264   His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
  ZP2266   His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Glu-Glu-Leu-Ala-Ala-Glu-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Glu-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
  ZP2267   His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
  ZP2268   His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
  ZP2269   His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Lys-Thr-Ile-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
  ZP2270   His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-LeuN-Thr-Ile-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala-Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
  ZP2272   His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2
  ZP2242   His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-OH
本发明的另一些化合物在下文表1中显示。
本发明提供了相对于结肠而言在小肠中具有偏好性生长促进活性的化合物。具体地，本文所述实验显示，在施用给试验动物时，野生型GLP-2中X11和/或X16和/或Asn20和/或X24和/或X28位的某些替换提供了与结肠质量增加相比小肠重量的偏好性增加。这些发现意味着，所举例的化合物可用于治疗这样的病症：其中小肠中生长促进作用提高而结肠中的效应较低是有利的，或者用于治疗小肠损坏而结肠完整的病症。
因此，优选导致小肠生长的化合物通常包含野生型GLP-2中11、16、20、24和/或X28位的一个或多个替换(即相对于上文所述的野生型序列)。这些化合物可选择性地导致小肠(而不是结肠)生长。因此，它们可用于影响或涉及小肠的病况。
优选地，这些小肠选择性化合物包含X11、X16、X20、X24和/或X28位中多于一个位置上的替换(即相对于上文所述的野生型序列)。因此，所述小肠选择性化合物可包含以下多于一个替换，其中X11是Ser，X16是Ala，X20、X24是Ala，X28是Ala，X31是Ile，X32是Thr且X33是Asp。X31、X32和X33位的氨基酸残基可任选地缺失。
在小肠选择性化合物中，X11、X16、X20、X24和X28可独立地是Ala、Ser、Gly或Thr。
例如，X11和X16可各自独立地是Ala或Ser，X20、X24和X28可独立地是Ala、Ser、Gly或Thr。
例如，X11和X16可以都是Ala，X20、X24和X28可独立地是Ala、Ser、Gly或Thr。
例如，X11和X16可以都是Ala，X20、X24和X28可独立地是Ala、Ser。
应了解，落在这些一般性标准之外的其它残基组合也可提供小肠选择性。
优选的X11、X16、X20、X24和X28位残基组合包括Ser/Ser/Ser/Ser/Ser；Ala/Ala/Ser/Ser/Ser，Ala/Ala/Ala/Ala/Ser，Ser/Ala/Ser/Ser/Ser，Ala/Ser/Ser/Ser/Ser；Ala/Ala/Ala/Ser/Ala；Ala/Ala/Ser/Ala/Ala；Ser/Ala/Ala/Ala/Ala；Ser/Ala/Arg/Ala/Ala；Ala/Ser/Ala/Ser/Ala；Ala/Ala/Ala/Ala/Ala。
偏好性刺激小肠上皮生长的示例化合物包括ZP2264，ZP2268，ZP2242，ZP2272，ZP2411，ZP2380，ZP2384，ZP2398，ZP2417，ZP2423，ZP2385，ZP2399，ZP2418，ZP2381，ZP2420和ZP2397。
本发明还扩展至与结肠相比具有胃偏好性生长促进活性的化合物。因此，它们可用于影响胃或涉及胃的病症。
优选地，这些胃选择性化合物包含X11、X16、X20、X24和/或X28位上的多于一个替换(即相对于上文所述野生型序列)。X31、X32和X33位的氨基酸残基可以任选是缺失的。
例如，在胃选择性化合物中，
X11可以是Leu、Phe或Lys，
X16可以是Leu、Phe或Lys，
X20可以是Ala或Ser，
X24可以是Ala、Ser或Lys，
X28可以是Ala、Ser或Lys。
例如，X11和X16可独立地是Leu或Phe，X24和X28可独立地是Lys或Ser，X20可以是Ser。
例如，X11和X16可以独立地是Leu或Phe，X20、X24和X28可以是Ser。
应了解，落在这些一般性标准之外的其它残基组合也可提供胃选择性。
优选的X11、X16、X20、X24和X28位的残基组合包括Lvs/Lvs/Lvs/Lvs/Lvs；Phe/Phe/Ser/Ser/Ser；Leu/Leu/Ala/Ala/Ala和Leu/Leu/Ser/Ser/Ser。
偏好性刺激胃上皮生长的示例化合物包括ZP2400、ZP2412、ZP2396、ZP2395、ZP2394和ZP2401。
优选地，所述GLP-2类似物在下文实施例7中所述的至少一个降解测试中维持相对于初始纯度而言至少为70％的实测纯度。另外的或者作为替代的，它可在HCl 0.1M溶液中12天后维持相对于初始纯度而言至少为60％的实测纯度。另外的或者作为替代的，它可在NH4HCO30.1M溶液中6天后维持相对于初始纯度而言至少为70％的实测纯度。
本发明的另一个方面涉及如上所述至少具有1nM的EC50并因此被定义为GLP-2激动剂的GLP-2类似物。如实施例9中所述分析本发明化合物。在图5中，给出ZP2264的EC50作为GLP-2激动剂的示例。
在另一个方面中，本发明提供组合物，其包含与载体混合的如本文所定义GLP-2类似物或者其盐或衍生物。在一些优选的实施方案中，所述组合物是可药用组合物，所述载体是可药用载体。所述GLP-2肽类似物可以是GLP-2类似物的可药用酸加成盐。
在一个实施方案中，本发明涉及如本文所定义的GLP-2类似物作为药物组合物的用途，其被配制为适于通过注射或输注施用的液体，或者配制为导致所述GLP-2类似物缓慢释放。
在另一个方面中，本发明提供了用于治疗的如本文所定义GLP-2类似物或其盐。
本发明还提供了如上所述的GLP-2类似物在制备用于治疗和/或预防胃和肠相关疾病的药物中的用途。
在一个优选实施方案中，本发明涉及GLP-2或者其盐或衍生物在制备用于治疗和/或预防胃肠相关疾病的药物中的用途，例如治疗患有肠功能受损的新生儿、骨质疏松和DPP-IV(二肽基肽酶-IV)所介导的病症。例如，所述胃肠相关疾病包括溃疡、佐-埃综合征(zollinger-ellisonsyndrome)、胃炎、消化疾病、吸收障碍综合征、短肠综合征(short-gutsyndrome)、盲管综合征、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、腹型斯泼卢腹泻(celiac sprue)(例如由麸质诱发的肠病或乳糜泻病引起)、热带型斯泼卢腹泻(tropical sprue)、低丙种球蛋白血症型斯泼卢腹泻、肠炎、与腹泻相关的肠易激综合征、小肠损伤和短肠综合征(short bowelsyndrome)。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及如上所述GLP-2类似物的用途，其中所述胃肠相关疾病是放射性肠炎、感染性或感染后肠炎或者由于有毒试剂或其它化学治疗剂造成的小肠损伤。
本发明还提供了如本文所定义的GLP-2类似物在制备用于治疗和/或预防化学治疗或放射治疗副作用的药物上的用途。
所述化学治疗或放射治疗的副作用有腹泻、腹部痛性痉挛、呕吐或者化学治疗导致的肠上皮结构性和功能性损伤。
本发明还提供了如本文所定义的GLP-2类似物在制备用于治疗新生儿、骨质疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)所介导疾病的药物上的用途。
因此，本发明还提供治疗药盒，其包含癌症化学治疗药物和本发明的GLP-2类似物，其中每一种均任选地与可药用载体组合。所述两种治疗剂可以分开包装(例如在分开的瓶中)以分别施用，或可以在同一组合物中提供。因此本发明还提供包含与可药用载体组合的癌症化学疗法药物和本发明GLP-2类似物的药物组合物。
对于患有胃肠粘膜瘤形成或胃肠粘膜瘤形成风险提高的患者，可能期望选择化合物以降低或消除已降低之副作用(例如刺激或加重胃肠粘膜瘤形成)的风险。例如，选择用于治疗患有结肠瘤形成(良性或恶性)或有发生结肠瘤形成风险的患者的化合物时，选择对小肠的选择性高于结肠的化合物比非选择性化合物或对结肠的选择性高于小肠的化合物可能更合适。
在其它一些方面中，本发明提供GLP-2类似物用于制备治疗和/或预防营养不良(例如衰竭综合征(wasting syndrome)恶病质和厌食症之类的病症)的药物的用途。
在又一个方面中，本发明提供了包含编码如本文所定义GLP-2类似物之核酸序列的核酸分子。
在其他方面中，本发明提供包含任选地与指导其表达的序列组合的上述核酸序列的表达载体，以及用所述表达载体转化的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞能够表达并分泌GLP-2类似物。在另一方面中，本发明提供生产GLP-2类似物的方法，所述方法包括在适于表达所述GLP-2类似物的条件下培养宿主细胞以及纯化由此制备的GLP-2类似物。
本发明还提供用于治疗的本发明核酸、本发明表达载体或者能够表达并分泌本发明GLP-2类似物的宿主细胞。应当理解，所述核酸、表达载体和宿主细胞可用于治疗任何可用GLP-2类似物本身进行治疗的本文所述病症。因此提到包含本发明GLP-2类似物的治疗组合物或施用本发明的GLP-2类似物时，应解释为包括施用本发明的核酸、表达载体或宿主细胞，除非其上下文中另有说明。
在一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的核酸分子、表达载体或宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防胃肠相关疾病，或者用于治疗和/或预防化学治疗或放射治疗的副作用，或者用于治疗新生儿、骨质疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)所介导的疾病。
在又一个方面中，本发明提供了在有此需要的患者中通过施用有效量的本发明核酸、表达载体或宿主细胞来治疗胃肠相关疾病的方法。胃肠相关疾病的实例在上文给出。
在又一个方面，本发明提供了在有此需要的患者中治疗或预防化学治疗或放射治疗之副作用的方法，所述方法包括施用有效量的本发明的核酸、表达载体或宿主细胞。
在另一方面中，本发明提供治疗和/或预防有此需要的患者中营养不良(例如衰竭综合征恶病质和厌食症之类的病症)的方法，所述方法包括施用有效量的本文定义的GLP-2类似物或者其盐或衍生物或者本发明的核酸、表达载体或宿主细胞。
下文通过举例而非限制性的参考附图进一步详细说明本发明的实施方案。
附图说明
图1.与载体对照相比，施用参照化合物、[Gly2]GLP-2和化合物ZP2264、ZP2266-ZP2268(800nmol/kg，每天一次，共3天)之后相对小肠质量的改变。以载体动物为100％来显示相对小肠质量。＊：P＜0.05，与载体相比；$：P＜0.05，与[Gly2]GLP-2处理相比。
图2.与载体对照相比，施用参照化合物、[Gly2]GLP-2和化合物ZP2242、ZP2269和ZP2272(800nmol/kg，每天一次，共3天)之后相对小肠质量的改变。以载体动物为100％来显示相对小肠质量。＊：P＜0.05，与载体相比；$：P＜0.05，与[Gly2]GLP-2处理相比。
图3、与[Gly2]GLP-2处理的动物相比，施用化合物ZP2264、ZP2266-ZP2268(800nmol/kg，每天一次，共3天)之后的小肠/结肠质量比的改变。以载体动物为100％来显示相对小肠(small intestinal，SI)质量。$：P＜0.05，与[Gly2]GLP-2处理相比。
图4.与[Gly2]GLP-2处理的动物相比，施用化合物ZP2242、ZP2269、ZP2272和ZP2271(800nmol/kg，每天一次，共3天)之后的小肠/结肠质量比的改变。以[Gly2]GLP-2处理的动物为100％来显示相对小肠(SI)质量。
图5.体外筛选ZP2264对BHK-21细胞中重组表达的GLP-2受体的激动作用。ZP2264的IC 50是3.55E-12，完全在激动剂的定义范围内。
图6.对小肠有选择性的ZP化合物的小肠/结肠敏感性指数
图7.对胃有选择性的ZP化合物的胃/结肠敏感性指数
图8.非选择性ZP化合物的小肠/结肠敏感性指数
发明详述
定义
除非另有具体说明，为上文陈述中使用的具体术语提供了下述定义。
在说明书和权利要求书全篇中，使用天然氨基酸的常规单字母代码和三字母代码以及其它α-氨基酸例如肌氨酸(Sar)、正亮氨酸(Nle)和α-氨基异丁酸(Aib)的普遍公认的三字母代码。本发明的肽中所有氨基酸残基优选为L-构型，然而，也可以存在D-构型的氨基酸。
本文所使用的“保守性替换”表示天然人GLP-2肽序列某些位置上的氨基酸残基被改变为属于如下表所定义的同一组(I、II、III、IV、V、1、2、3)的氨基酸残基。
Figure A20078004149000291
本文所使用的“非保守性”替换意为天然人GLP-2序列中氨基酸残基的任何其它替换，例如用非蛋白质氨基酸(Sar、Nle、Aib)进行替换或者用不属于同一组的氨基酸进行替换。
为了描述所得的α螺旋一侧的亲水性图，我们选择了Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.(1982)157，105-132所述的各个氨基酸的亲水性指数(Hydropathy index，hpix)。在本发明中，通过氨基酸位置X11-X16-X20-X24-X28对目的螺旋进行大致描述。
使用Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.(1982)157，105-132所述的亲水性指数HPI来描述各个氨基酸的亲水性指数(HPI)。
各个氨基酸的HPI值为：
氨基酸   hpi指数
I        4,5
V        4,2
L        3,8
F        2,8
C        2,5
M        1,9
A        1,8
G        -0,4
T        -0,7
W        -0,9
S        -0,8
Y        -1,3
P        -1,6
H        -3,2
E        -3,5
Q        -3,5
D        -3,5
N        -3,5
K        -3,9
R        -4,5
根据HPP＝∑hpiX11+hpiX16+hpiX20+hpiX24+hpiX28来计算式I中X11、X16、X20、X24、X28残基所得的亲水性图(HPP)
HPP≥-10
HPP≥-4
HPP≥0
Y1、Y2、Y4和Y5可各自选自：Asn、Asp、Glu、Gln、Lys、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、Met或Phe。Y3可选自：Asn、Asp、Glu、Gln、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、Met或Phe。
对于小肠选择性化合物，在HPP≥-10、-4或0的总体标准内，可以期望11和16位的HPI应独立地为-0.8≤HPI≤3.8，例如-0.8≤HPI≤2.8，如HPI＝1.8。
对于20、24和28位，可以期望HPI应独立地为-0.8≤HPI20、24、28≤1.8，例如-0.8≤HPI20、24、28≤1.8，如HPI20、24、28＝-0.8。
因此，X11、X16、X20、X24和X28位中每个位置上的残基可独立地为Ala、Ser、Gly或Thr。
例如，X11和X16可以各自独立地是Ala或Ser，X20、X24和X28可以是Ala、Ser、Gly或Thr。
例如X11和X16可以是Ala，以及X20、X24和X28可以是Ala、Ser、Gly或Thr。
X11、X16、X20、X24和X28位的优选组合可包括Ala/Ala/Ala/Ser/Ser、Ala/Ala/Ser/Ser/Ser、Ala/Ala/Thr/Ser/Ser和Ala/Ala/Gly/Ser/Ser。
对于胃选择性化合物，在HPP≥-10、-4或0的总体标准内，可能期望11和16位的HPI应独立地为-3.9≤HPI11、16≤3.8，例如HPI11、16可以是2.8≤HPI11、16≤3.8，或者HPI11、16可以是-3.9。
对于20、24和28位，可能期望HPI应独立地为-3.9≤HPI20、24、28≤1.8，例如HPI20、24、28可以是-0.8≤HPI20、24、28≤1.8，或HPI20、24、28可以是-3.9。
因此，X11位的残基可以是Leu、Phe或Lys。
X16位的残基可以是Leu、Ser、Phe、Lys或Thr。
X20位的残基可以是Ala、Ser、Leu、Gly或Thr。
X24位的残基可以是Ala、Ser、Lys、Glu、Gly或Thr。
X28位的残基可以是Ala、Ser、Lys、Gln、Gly或Thr。
例如，X11和X16可以独立地是Leu或Phe，X24和X28可以独立地是Ala或Ser。
本发明优选的化合物具有至少一种GLP-2生物活性，特别是导致肠或胃生长。这可以如实施例中所述在体内测定中进行评估，其中在用GLP-2类似物处理或接触测试动物之后测定肠或其部分的质量。
如上文所述，与天然GLP-2相比较，本发明的GLP-2类似物具有一个或多个氨基酸替换、缺失、倒位或添加。这一定义还包括同义术语GLP-2模拟物和/或GLP-2激动剂。此外，本发明的类似物还可具有一个或多个其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基、或末端羧酸基的化学修饰。化学修饰包括但不限于添加化学部分、形成新键以及去除化学部分。氨基酸侧基修饰包括但不限于赖氨酸ε-氨基的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化以及谷氨酸或天冬氨酸的脱酰胺作用。末端氨基修饰包括但不限于去氨基(des-amino)、N-低级烷基、N-二低级烷基以及N-酰基修饰。末端羧基修饰包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺以及低级烷基酯修饰。本文优选的低级烷基为C1-C4烷基。此外，可通过肽化学普通技术人员公知的保护基保护一个或多个侧基或端基。氨基酸的α-碳可被单甲基化或二甲基化。
在其存在时，氧化稳定的Met-取代氨基酸指选自以下的氨基酸：Met(O)(甲硫氨酸亚砜)、Met(O)2(甲硫氨酸砜)、Val、Ile、Asn、Glx(Glu或Gln)、Tyr、Phe、Trp，优选为Leu、Nle、Ala、Ser和Gly。
应当理解，本发明的肽还可以以盐或其它衍生物的形式提供。盐包括可药用盐例如酸加成盐和碱盐。酸加成盐的实例包括盐酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐。碱盐的实例包括阳离子选自以下的盐：碱金属例如钠和钾、碱土金属例如钙以及铵离子+N(R3)3(R4)(其中R3和R4独立地表示任意取代的C1-6烷基、任意取代的C2-6烯基、任意取代的芳基或任意取代的杂芳基)。可药用盐的其它实例描述于“Remington′sPharmaceutical Sciences”第17版.Alfonso R.Gennaro(编辑)，MarkPublishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985和更新的版本以及theEncyclopaedia of Pharmaceutical Technology中。
本发明GLP-2类似物的其它衍生物包括与金属离子如Mn2+和Zn2+的配位络合物、酯如体内可水解的酯、游离酸或碱、水合物、前药或脂质。可以使用本领域熟知的技术在化合物中存在的羟基或羧酸基之间以及适当的羧酸或醇反应配偶体之间形成酯。作为前药的化合物衍生物可在体内或体外转化成母体化合物之一。一般地，化合物的至少一种生物活性将在化合物前药形式中降低，并且可通过前药转化被活化，以释放该化合物或其代谢物。前药的实例包括使用保护基，所述保护基可原位除去以释放活性化合物，或者可在体内抑制药物的清除。
在其存在时，Z1和Z2各自独立地代表3至20个或4至20个氨基酸残基的肽序列，例如在4至15个氨基酸残基范围内、更优选在4至10个氨基酸残基范围内，尤其是在4至7个氨基酸残基范围内，例如4、5、6或7个氨基酸残基，比如6个氨基酸残基。肽序列Z中每个氨基酸残基可独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met、Orn。优选地，所述氨基酸残基选自Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Orn和Met以及落入WO01/04156中所定义式I范围内的氨基酸，例如Dbu(2，4-二氨基丁酸)或Dpr(2，3-二氨基丙酸)，更优选选自Glu、Lys和Met，尤其是Lys。上述氨基酸可为D-或L-构型，但优选上述氨基酸为L-构型。特别优选的序列Z是4个、5个或6个连续赖氨酸残基、特别是6个连续赖氨酸残基的序列。示例性序列Z示于WO 01/04156。
在某些实施方案中不存在Z1。在这种情况下，可以存在或不存在Z2。
将具有EC50至少为1nM的GLP-2类似物定义为GLP-2激动剂。
本发明包括在下文实验部分进一步描述的下列肽。
本发明特别优选的化合物包括化合物ZP2264、ZP2267、ZP2268和ZP2270。
稳定性研究
技术人员能设计适当方法(例如定量法)用于检测GLP-2类似物的降解产物，例如基于下面描述的方法。降解可以以氧化、水解和脱酰胺作用的形式发生，这取决于任何给定的GLP-2类似物中氨基酸的特性和位置以及条件例如pH、溶液和温度。当在应激条件(即可能引起降解的条件)下孵育化合物并且随后分析化合物中剩余完整肽的含量时，可根据化学稳定性对化合物进行分级。此外，得到的对应激条件下所得主要降解产物的了解对于任何后来分析方法的开发都是很重要的。
检测GLP类似物的定量测定
技术人员还能够设计方法(例如定量法)用于检测复杂环境或溶液(例如血浆、尿、组织匀浆、细胞匀浆、唾液等)中的GLP类似物，以研究施用于哺乳动物之后GLP类似物的吸收、分布、代谢和排泄，或者作为体外细胞体系功能研究的一部分。
在一个实施方案中，定量测定可基于针对GLP类似物或其片段的抗体。从免疫动物中得到的抗体可用于定量分析。在一个实施例中，可利用固定在多孔板中的与所述分子中一部分具有亲和力的第一抗体制备直接夹心ELISA。然后将样品施加至孔中，GLP类似物被第一抗体捕获。然后所捕获的GLP类似物被与GLP类似物另一部分具有亲和力的第二抗体识别。可用酶(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶)或放射性同位素标记所述第二抗体。然后可通过加入比色底物或直接计数辐射或通过闪烁来检测所捕获的GLP类似物的量。或者，通过加入与第二抗体具有亲和力的标记抗体来间接检测所捕获的GLP类似物的量。可由含有已知量GLP类似物的外标曲线得到的应答来估计样品中的浓度。或者，所述抗体可用于制备直接竞争性免疫测定，其中将对GLP类似物具有特异性的抗体固定在多孔板上，并将样品与预定固定浓度的标记GLP类似物一起在孔中孵育。所述标记可以是酶、荧光团、放射性同位素或生物素，并使用以下方法检测，例如对所述酶具有特异性的底物(例如比色、荧光或化学发光)、闪烁或者与酶连接的抗生物素蛋白，随后进行上述检测。可通过适当的方法检测已结合的标记GLP类似物的量，并可由得自上述外标曲线的应答来得出样品中GLP类似物的浓度。
在另一个实施方案中，定量测定可基于液相层析-串联质谱法。在这样的设置中，根据与惰性气体(He或Ar)碰撞引起的母体化合物断裂来监测对待研究GLP类似物具有特异性的片段的应答。断裂之前通过反相层析分离样品组分，或直接将样品注入质谱仪中。适当时可对样品进行预处理(即加入蛋白酶抑制剂、蛋白质沉淀、固相萃取、免疫-亲和萃取等)。由上述外标曲线所得应答得出样品中存在的GLP类似物浓度，这可以是在使用与待研究的GLP类似物相似的内标校正应答之后。
产生特异性抗体
可在哺乳动物中诱导并从血清中纯化针对GLP类似物或其片段的特异性抗体。GLP类似物或片段可直接与佐剂一起用于免疫兔、小鼠或其它哺乳动物，或者GLP类似物或其片段可与载体分子(即匙孔槭血蓝蛋白、卵清蛋白、白蛋白等)化学连接，并与佐剂一起注射。可在延长的时间中以2至4周的间隔重复所述注射，以提高抗体的亲和力和选择性。可直接从血清获得多克隆抗体。为了得到单克隆抗体，应将分离自免疫动物(优选小鼠)的B细胞与肿瘤细胞融合，以形成产生抗体的杂交瘤。利用固定的GLP类似物或其肽随后用标记的抗-抗体检测来筛选和选择适当的克隆和抗体。或者，所述筛选和选择可基于固定抗体随后用标记的GLP类似物或其片段检测。在所有情况下，所述标记均可以是放射性同位素、酶、荧光团或生物素，并使用以下方法检测，例如对所述酶具有特异性的底物(例如比色、荧光或化学发光)、闪烁或者抗生物素蛋白与酶连接，随后进行上述检测。
合成GLP-2类似物
优选通过固相或液相肽合成手段合成本发明的类似物。在该上下文中，参照WO98/11125和Fields，GB等，2002，“Principles and practice ofsolid-phase peptide synthesis”.In：Synthetic Peptides(2nd Edition)以及本文的实施例。
因此，可用多种方式合成GLP-2类似物，例如包括以下步骤的方法：
(a)通过固相或液相肽合成手段合成肽并回收这样得到的合成肽；或
(b)当所述肽由天然氨基酸组成时，在宿主细胞中表达编码所述肽的核酸构建体，并从所述宿主细胞培养物中回收表达产物；或
(c)当所述肽由天然氨基酸组成时，实现编码所述肽的核酸构建体的无细胞体外表达，并回收所述表达产物；或
(a)、(b)和(c)方法的组合以得到所述肽的片段，随后连接所述片段以得到所述肽，并回收所述肽。
因此，对于本发明的一些类似物，使用基因工程技术可能是有利的。这可能是当肽足够大(或作为融合构建体产生)和当肽仅包含可由活生物RNA翻译的天然存在氨基酸的情况。
就重组基因技术而言，编码本发明肽的核酸片段是重要的化学产物。因此，本发明的另一方面提供包含编码本发明GLP-2类似物的核酸序列的核酸分子，其中所述肽优选由天然氨基酸构成。本发明的核酸片段为DNA或RNA片段。
本发明的核酸片段通常插入适当的载体中，以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体；这种新载体也是本发明的一部分。涉及构建本发明这些载体的细节将在下文转化细胞和微生物的上下文中讨论。取决于应用的目的和类型，所述载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、微染色体或病毒的形式，但仅在某些细胞中瞬时表达的裸DNA也是重要的载体。本发明优选的克隆载体和表达载体(质粒载体)能自主复制，从而能够为了用于随后克隆的高水平表达或高水平复制而实现高拷贝数。
本发明载体的一般概况包括在5’→3’方向有效连接的下述特征：用于驱动本发明核酸片段表达的启动子，任选的编码允许分泌(分泌至胞外相或适当时分泌至周质中)的前导肽或多种目的(如组合分泌、纯化标记和酶修饰以校正肽或将多肽片段整合到膜中)的前导肽的核酸序列、编码本发明肽的核酸片段以及任选的编码终止子的核酸序列。当用表达载体在生产株或细胞系中操作时，为了转化细胞的遗传稳定性，优选所述载体在引入宿主细胞时整合进宿主细胞基因组中。
使用本发明的载体转化宿主细胞以产生经修饰的本发明肽。这样的转化细胞也是本发明的一部分，可以是用于扩增本发明核酸片段和载体或用于重组产生本发明肽的培养细胞或细胞系。
本发明优选的转化细胞是微生物例如细菌(如埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌属(Salmonella)或分枝杆菌属(Mycobacterium)(优选非致病性的，如牛分枝杆菌(M.bovis)BCG)的物种)、酵母(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和原生动物。或者，所述转化细胞来自多细胞生物，即可以是真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。来自人的细胞也是有意义的，参照下文对细胞系和载体的讨论。为了克隆和/或最优化表达的目的，优选所述转化细胞能复制本发明核酸片段。本发明的实施方案优选使用表达所述核酸片段的细胞；它们可用于小规模或大规模制备本发明的肽。
通过转化细胞生产本发明的肽时，虽然远非必要，但将表达产物运出至培养基或携带到转化细胞表面是方便的。
已经鉴定了有效的生产细胞时，优选基于所述生产细胞建立携带本发明载体和表达编码所述肽的核酸片段的稳定细胞系。优选地，这种稳定细胞系分泌或携带本发明的肽，从而便于纯化。
一般而言，将含有复制子和控制序列的质粒载体(来源于与宿主细胞相容的物种)与宿主一起使用。所述载体通常带有复制位点以及能在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，一般使用来源于大肠杆菌物种的质粒pBR322(但是存在许多其它可用的质粒)转化大肠杆菌(参阅如Bolivar等，1977)。pBR322质粒含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，因而提供鉴定转化细胞的简单手段。pBR质粒或其它微生物质粒或噬菌体必须还包含启动子或经修饰以包含启动子，其可被原核微生物用于表达。
在原核重组DNA构建中最普遍使用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，1978；ltakura等，1977；Goeddel等，1979)以及色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，1979；EP 0036776A)。尽管这些是最常用的，但也已发现并使用了其它微生物启动子，其核苷酸序列的细节已公开，使得技术人员能将其与质粒载体功能性连接(Siebwenlist等，1980)。
除了原核生物以外，还可使用真核微生物例如酵母培养物，而且这时所述启动子也应能够启动表达。在真核微生物中，酿酒酵母或普通面包酵母是最常用的，尽管许多其它菌株也可普遍获得的。例如，对于酵母属中的表达，质粒YRp7是常用的(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。该质粒已含有为不能生长在色氨酸中的酵母突变株(如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977))提供选择标记的trp1基因。然后，作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1损伤的存在提供了用于通过在无色氨酸情况下培养来检测转化的有效环境。
酵母载体中适当的启动序列包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)的启动子，例如烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶以及葡糖激酶的启动子。在构建适当的表达质粒时，还将与这些基因相关的终止序列还被连接到表达载体中待表达序列的3’处，以提供mRNA多聚腺苷酸化和终止。
具有转录由生长条件控制的额外优点的其它启动子为乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶和上述甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。含有酵母兼容性启动子、复制起点和终止序列的任何质粒载体都是适用的。
除了微生物以外，来源于多细胞生物的细胞培养物也可用作宿主。原则上任何这样的细胞培养物都是可使用的，不管来自脊椎动物或无脊椎动物培养物。然而，脊椎动物细胞是最有意义的，近年来，在培养(组织培养)中扩增脊椎动物已经成为常规方案(Tissue Culture，1973)。这种可用的宿主细胞系的实例为VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系以及W138、BHK、COS-7293、草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda，SF)细胞(完整的表达系统可购自i.a.Protein Sciences，1000ResearchParkway，Meriden，CT 06450，U.S.A.和Invitrogen)、Invitrogen(PO Box2312，9704 CH Groningen，The Netherlands)提供的黑腹果蝇(D.melanogaster)细胞系S2以及MDCK细胞系。
这些细胞的表达载体通常包括(如果需要)复制起点、位于待表达基因之前的启动子以及任何必需的核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点以及转录终止子序列。
对于哺乳动物中的应用，表达载体的控制功能通常由病毒物质提供。例如，常用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2，最常用的是猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子是特别有用的，因为它们都容易以同时包括SV40病毒复制起点的片段的形式从病毒中得到(Fiers等，1978)。还可以使用更小或更大的SV40片段，只要其包括从Hind III位点至病毒复制起点中BglI位点的约250bp序列。此外，还可以(并且通常希望)利用正常情况下与目的基因序列相关的启动子或控制序列，只要这样的控制序列与宿主细胞系统相容。
复制起点可通过构建载体提供以包含外源起点来提供，例如可来自SV40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)，或者可以由宿主细胞染色体复制机制提供。如果所述载体整合进宿主细胞染色体中，后者通常是足够的。
为了在重组生产方法中得到满意的产量，通过将肽与可用作亲和标记(为了易于纯化)的融合配偶体和/或通过具有多个肽重复来将所述类似物制备为融合蛋白可能是有利的。这些方法需要存在适当的肽酶切割位点，但是技术人员会知道如何加工其背后的基因构建体。
重组制备后，可通过本领域普遍公知的方法纯化本发明的肽，包括多步层析(离子交换、大小排阻以及亲和层析技术)。
或者，可在无细胞体系中体外制备由天然存在的氨基酸组成的肽。这在肽可能对推定的宿主细胞有毒性的情况下特别有利。因此，本发明还考虑使用无细胞体外翻译/表达以制备本发明的肽。在这种情况下，参照来自例如Ambion Inc.，2130 Woodward，Austin，TX 78744-1832，USA的市售体外翻译试剂盒、材料和技术文件。
最后，当然可以组合可用方法，从而制备如半合成类似物。在这样的设置中，使用至少2个分开的步骤或方法制备肽片段，随后连接所述片段以得到最终的肽产物。
药物组合物和施用
本发明的GLP-2类似物或者其盐或衍生物可配制成用于保存或施用的药物组合物，并且其在可药用载体中包含治疗有效量的本发明GLP-2肽或者其盐或衍生物。
本发明化合物的治疗有效量取决于给药途径、受治哺乳动物的类型以及所考虑的具体哺乳动物的身体特征。这些因素及其与确定该量之间的关系是医药领域中技术人员熟知的。可调整该量和施用方法以达到最佳效力，从而将肽递送到大肠，但是将取决于医药领域技术人员熟知的因素例如体重、饮食、同时用药(concurrent medication)和其它因素。
本发明中提供药物组合物，其中所述GLP-2类似物或其盐以有效治疗或预防胃肠相关病症的量存在。
利用有机和无机碱可形成具有酸性部分的本发明化合物的可药用盐。与碱形成的适当盐包括金属盐比如碱金属或碱土金属盐，例如钠、钾或镁盐；铵盐和有机胺盐，比如与吗啉、硫代吗啉、哌啶、吡咯烷、单-、二-或三低级烷基胺(如乙基-叔丁基-、二乙基-、二异丙基-、三乙基-、三丁基-或二甲基丙基-胺)或单-、二-或三羟基低级烷基胺(例如单-、二-或三乙醇胺)形成的盐。还可以形成内盐。相似地，当本发明的化合物包含碱性部分时，可利用有机和无机酸形成盐。例如，可由下述酸形成盐：醋酸、丙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、延胡索酸、马来酸、丙二酸、苦杏仁酸、苹果酸、邻苯二甲酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲基磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸和樟脑磺酸以及其它公知的可药用酸。还可利用氨基酸例如赖氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸形成氨基酸加成盐。
对医药领域中技术人员显而易见地，本发明的肽或药物组合物的“治疗有效量”将根据年龄、体重和受治哺乳动物的物种、使用的具体化合物、具体的给药方式以及所期望效果和治疗适应证进行变化。由于这些因素与确定该量的关系是医药领域熟知的，因此确定治疗有效的剂量水平、实现预防和/或治疗本文描述的肠和胃相关疾病的期望结果所需的量以及本文公开的其它医学适应证将在技术人员的能力范围内。
本文使用的“治疗有效量”是降低给定病症或病理的症状、优选使患有所述病症或病理的个体的生理反应正常化的量。可以使用本领域的常规方法确定症状的降低或生理反应的正常化，并且可根据给定的病症或病理而改变。在一个方面中，一种或多种GLP-2类似物或含有一种或多种GLP-2类似物的药物组合物的治疗有效量是这样的量：其将可检测的生理参数恢复到与未患所述病症或病状的个体中所述参数基本相同的值(优选在所述值的+30％以内，更优选在+20％以内，并且还更优选在10％以内)。
在本发明的一个实施方案中，开始以较低的剂量水平施用本发明的化合物或药物组合物，提高剂量水平直至实现预防/治疗相关医疗适应证例如肠和胃相关疾病的期望效果。这将定义为治疗有效量。对于单独的或作为药物组合物一部分的本发明的肽，这样的剂量可以在约0.01mg/kg体重至100mg/kg体重之间，比如在约0.01mg/kg体重至10mg/kg体重之间，例如在10至100μg/kg体重之间。
对于治疗用途，将选定的GLP-2类似物与可药用并且适于通过选定的给药途径递送所述肽的载体配制在一起。就本发明目的而言，外周肠胃外途径包括静脉内、肌内、皮下以及腹膜内给药途径。用于本发明的某些化合物还可适用于通过口服、直肠、鼻腔或下呼吸道途径给药。这些是所谓的非胃肠外(non-parenteral)途径。本发明的药物组合物包含本发明的GLP-2类似物或者其盐或衍生物以及可药用载体。适当的可药用载体是常规地与基于肽的药物一起使用的载体，比如稀释剂、赋形剂等。用于治疗用途的可药用载体是药学领域熟知的，并且描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑1985)。例如，可以使用弱酸性或生理pH的无菌盐水和磷酸缓冲液。pH缓冲剂可以是磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸(是优选的缓冲剂)、精氨酸、赖氨酸、或乙酸盐或其混合物。优选的缓冲范围是pH 4至8、pH 6.5至8，更优选pH 7至7.5。所述药物组合物中可包含防腐剂，例如对甲酚、间甲酚和邻甲酚、对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、酚、苯甲醇、苯甲酸钠、苯甲酸、苯甲酸苄酯、山梨酸、丙酸、对羟基苯甲酸酯。所述药物组合物中可包含防止氧化、脱酰胺、异构化、消旋化、环化、肽水解的稳定剂，例如抗坏血酸、甲硫氨酸、色氨酸、EDTA、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸。所述药物组合物中可包含防止聚集、纤维化和沉淀的稳定剂，比如十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、羧甲基纤维素、环糊精。所述药物组合物中可包含增溶或防止聚集的有机改性剂，比如乙醇、乙酸或乙酸酯及其盐。所述药物组合物中可包含等渗剂比如盐例如氯化钠或最优选的碳水化合物例如葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖或其混合物。
所述药物组合物中可包含去污剂比如吐温20、吐温80、SDS、泊洛沙姆例如Pluronic F-68、Pluronic F-127。所述药物组合物中可包含染料甚至是芳香剂。在另一个实施方案中，提供GLP-2肽类似物的可药用酸加成盐。可以使用助悬剂。
所述药物组合物中可包含有机改性剂比如乙醇、叔丁醇、2-丙醇、乙醇、甘油、聚乙二醇，用来冷冻冻干的产品。所述药物组合物中可包含填充剂和等渗剂比如盐例如氯化钠，碳水化合物例如葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖或其混合物、氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸或赋形剂半胱氨酸、卵磷脂或人血清白蛋白或其混合物用于冷冻干燥。
本发明的药物组合物可以配制成以下形式并使用：用于口腔给药的片剂、胶囊剂或酏剂；用于直肠给药的栓剂；用于注射给药的优选的无菌溶液或无菌粉剂或悬液等等。可调整给药量和方法以实现最佳效力，但是将取决于这样的因素比如体重、饮食、并行的药物处理和其它因素，这是医药领域中技术人员应当认识到的。
当进行胃肠外给药时，比如静脉内和皮下，例如以每日为基础，注射用药物组合物可制备成水溶液或悬液的常规形式；适用在临用前重构或在注射前悬于液体中的冻干固体形式，或作为乳剂。
用于重构冻干产品的稀释剂可以是上述列表中的适当缓冲剂、水、盐水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、盐酸半胱氨酸；或添加洗涤剂比如Tween 20、Tween 80、泊洛沙姆例如Pluronic F-68或Pluronic F-127、聚乙二醇和或添加防腐剂比如对甲酚、间甲酚和邻甲酚、对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、酚、苯甲醇、苯甲酸钠、苯甲酸、苯甲酸苄酯、山梨酸、丙酸、对羟基苯甲酸酯和或添加有机改性剂比如乙醇、乙酸、柠檬酸、乳酸或其盐的注射用水。
此外，如果需要，所述注射用药物组合物可包含少量非毒性辅助物质，比如湿润剂或pH缓冲剂。可使用增强吸收的制剂(例如脂质体、洗涤剂和有机酸)。
在本发明的一个实施方案中，将所述化合物配制成用于输注给药，例如在用作全胃肠外营养治疗的患者(例如新生儿，或患有恶病质或厌食症的患者)的液体营养补充剂时，或用于注射给药，例如皮下、腹膜内或静脉内，并且相应地以无菌和无热原形式的水溶液使用，并任选地缓冲至生理上可接受的pH，例如弱酸性或生理pH。用于肌内给药的制剂可基于植物油溶液或悬液，例如芥花籽油、玉米油或大豆油。这些基于油的制剂可利用抗氧化剂进行稳定，例如BHA(丁化羟基苯甲醚)和BHT(丁化羟基甲苯)。
因此，本发明的肽化合物可在载体如蒸馏水或盐水、磷酸缓冲液、5％葡萄糖溶液或油中施用。如果需要，可通过掺入增溶剂例如去污剂和乳化剂提高GLP-2类似物的溶解度。
为了用作注射剂，可向水性载体或赋形剂中补充明胶，用于在注射部位处或附近驻留GLP-2类似物使得GLP-2类似物向期望作用部位缓慢释放。替代的凝胶剂比如透明质酸也可用作驻留剂(depot agents)。
在本发明的一个实施方案中，所述制剂包含：
a.溶解在水中的L-组氨酸，使得终浓度为0.5mM至300mM，优选3至200mM，最优选20至100mM；
b.甘露醇，使得最高为350mM，优选30至300mM，最优选100mM至230mM；和
c.乙酸，使得溶液中最高为200mM，优选0.05至100mM，最优选0.5至50mM。
添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。
将pH调整为终pH为4至8，优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整至目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体制品或冻干制品进一步处理所述制剂。
在本发明的另一个实施方案中，所述制剂包含：
a.溶解在水中的L-组氨酸，使得终浓度为0.5mM至300mM，优选3至200mM，最优选20至100mM的L-组氨酸；
b.L-精氨酸，使得最高为200mM，优选0.5至100mM，最优选5至50mM；
c.甘露醇，使得最高为350mM，优选30至300mM，最优选100至230mM；和
d.醋酸，使得溶液中最高为200mM，优选0.05至100mM，最优选0.5至50mM。
添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。
将pH调整为终pH为4至8，优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整至目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体制品或冻干制品进一步处理所述制剂。
在本发明的又一个实施方案中，所述制剂包含：
a.溶解在水中的L-组氨酸，使得终浓度最高为200mM，优选3至100mM，最优选5至50mM L-组氨酸；
b.L-精氨酸，使得最高为200mM，优选0.5至100mM，最优选5至50mM；
c.甘露醇，使得最高为350mM，优选30至300mM，最优选100至230mM；和
d.醋酸，使得溶液中最高为200mM，优选0.05至100mM，最优选0.5至50mM。
添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。
将pH调整为终pH为4至8，优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整至目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体制品或冻干制品进一步处理所述制剂。
在本发明的又一个实施方案中，所述制剂包含：
a.溶解在水中的L-组氨酸，使得终浓度为0.5mM至300mM，优选3至200mM，最优选20至100mM的L-组氨酸；
b.L-精氨酸，使得最高为200mM，优选0.5至100mM，最优选5至50mM；
c.甘露醇，使得最高为350mM，优选30至300mM，最优选100至230mM；和
d.醋酸，使得溶液中最高为200mM，优选0.05至100mM，最优选0.5至50mM。
添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。
将pH调整为终pH为4至8，优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整至目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体制品或冻干制品进一步处理所述制剂。
在本发明的又一个实施方案中，所述制剂包含：
a.溶解在水中的L-组氨酸，使得终浓度最高为200mM，优选3至100mM，最优选5至50mM L-组氨酸；
b.L-精氨酸，使得最高为200mM，优选0.5至100mM，最优选5至50mM；
c.甘露醇，使得最高为350mM，优选30至300mM，最优选100至230mM；和
d.醋酸，使得使得溶液中最高为200mM，优选0.05至100mM，最优选0.5至50mM。
添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。
将pH调整为终pH为4至8，优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整至目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体制品或冻干制品进一步处理所述制剂。
在本发明的又一个实施方案中，所述制剂包含：
a.溶解在水中的N-乙酸盐，使得终浓度最高为200mM，优选0.5至100mM，最优选5至50mM L-组氨酸；
b.甘露醇，使得最高为350mM，优选30至300mM，最优选100至230mM。
添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。
将pH调整为终pH为4至8，优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整至目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体制品或冻干制品进一步处理所述制剂。
还可将本发明的GLP-2类似物配制成缓慢释放的植入装置，用于延长和持续施用GLP-2肽类似物。这样的持续释放制剂可以是位于身体表面的贴片形式。持续释放制剂的实例包括生物相容性聚合物的复合材料，比如聚(乳酸)、乳酸-羟基乙酸共聚物、甲基纤维素、透明质酸、唾液酸、硅酸盐、胶原、脂质体等。当希望提供高局部浓度的本发明GLP-2类似物时，所述持续释放制剂是特别有意义的。
可以以含有肠营养(intestinotrophic)量的肽的无菌-填充小瓶或安瓿形式、以单位剂量或多剂量的量应用GLP-2类似物。所述小瓶或安瓿可含有GLP-2类似物和理想的载体，作为可立即施用的制剂。或者，所述小瓶或安瓿可含有适于在适当载体(如无菌水或磷酸缓冲盐水)中重建的形式(如冻干形式)的GLP-2肽。
作为注射制剂的替代方案，所述GLP-2类似物可配制成用于通过其它途径给药。可根据标准药物实践配制口服剂型比如片剂、胶囊剂等。根据本发明，施用GLP-2类似物以治疗将受益于小肠组织生长的个体。
可通过加入增强剂例如壳聚糖或去污剂例如吐温20、吐温80、泊洛沙姆例如Pluronic F-68、Pluronic F-127、Brij 35、Brij 72、cremophorEL来配制鼻用剂型。
本发明的肽化合物可单独使用，或者与具有抗炎效应的化合物组合使用。不限于理论地，设想这样的组合治疗可增强本发明肽类似物的有益治疗效果。
当然，最适于患者治疗的治疗剂量和方案将根据待治疗的疾病或病症以及患者的体重和其它参数而变化。不希望限于任何特定理论地，预计μg/kg范围内的剂量以及更短或更长的治疗时间或频率可产生治疗上有用的结果，比如尤其是小肠质量的统计学显著性增加。在一些情况下，治疗方案可包括施用维持剂量，所述剂量适于预防初始治疗停止后出现的组织退回治疗前状态。可根据本发明得到的结果指导最适于人类应用的剂量大小和给药方案，并可在正确设计的临床试验中进行证实。
可通过常规手段确定有效剂量和治疗方案，从实验动物中的低剂量开始，然后提高剂量同时监测效果，并系统性地变化给药方案。在对给定的对象确定最佳剂量时，临床医生可考虑许多因素。这样的考虑因素是技术人员公知的。
在一个实施方案中，本发明GLP-2肽的人剂量可以从约10μg/kg体重/天至约10mg/kg/天，优选约50μg/kg/天至约5mg/kg/天，并且最优选约100μg/kg/天至约1mg/kg/天。
医学状况
通过施用有效量的本文所述的GLP-2类似物或其盐，本发明的肽可用作预防或治疗患有胃肠(包括食管的上消化道)病症的个体的药物。所述胃肠相关病症包括任何病因的溃疡(例如消化性溃疡、佐-埃综合征、药物诱发的溃疡、与感染或其它病原体有关的溃疡)、消化病症、吸收不良综合征、短肠综合征、盲管综合征、炎性肠病、腹型斯泼卢腹泻(例如由麸质诱发的肠病或乳糜泻病引起)、热带型斯泼卢腹泻、低丙种球蛋白血症型斯泼卢腹泻以及化学治疗和/或放射治疗诱发的粘膜炎和腹泻。
对于患有胃肠粘膜瘤形成或胃肠粘膜瘤形成风险提高的患者，可能期望选择化合物以降低或消除已降低之副作用(例如刺激或加重胃肠粘膜瘤形成)的风险。例如，选择用于治疗患有结肠瘤形成(良性或恶性)或有发生结肠瘤形成风险的患者的化合物时，选择对小肠的选择性高于结肠的化合物比非选择性化合物或对结肠的选择性高于小肠的化合物可能更合适。
如上文一般所述，将受益于小肠质量提高以及随后发生和/或维持正常小肠粘膜结构和功能的个体是采用本发明GLP-2类似物治疗的候选者。可用GLP-2类似物治疗的具体病症包括多种形式的斯泼卢腹泻，包括腹型斯泼卢腹泻，其由热对α-麦醇溶蛋白的毒性反应引起，并且可能是麸质诱发的肠病或乳糜泻病的结果，以小肠绒毛的显著丧失为特征；热带型斯泼卢腹泻，由感染引起，以绒毛的部分扁平为特征；丙种球蛋白血症型斯泼卢腹泻，通常在患有普通变异型免疫缺乏或低丙种球蛋白血症的患者中观察到，以绒毛高度显著降低为特征。GLP-2类似物治疗的治疗效力可通过检查绒毛形态的肠活检、营养吸收的生物化学评估、小肠通透性的非侵入性测定、患者的体重增加、或这些病症相关症状的改善来监测。
本发明的GLP-2类似物可用作预防或治疗胃相关疾病的药剂，所述疾病包括任何病因的溃疡(例如消化性溃疡、佐-埃综合征、药物诱发的溃疡、与感染或其它病原体相关的溃疡)。
可用本发明GLP-2类似物治疗或可用GLP-2类似物预防的其它病症包括上述放射性肠炎、传染性肠炎或感染后肠炎以及由于癌症化学治疗剂或毒剂引起的小肠损伤。
所述GLP-2类似物还可用于治疗营养不良，例如恶病质和厌食症。
本发明的具体实施方案涉及使用本发明的肽预防和/或治疗肠损伤和功能障碍。由于增殖迅速，小肠粘膜干细胞对化学疗法的细胞毒效应特别敏感(Keefe等，Gut 2000；47：632-7)。施用本发明的GLP-2肽激动剂可增强肠隐窝的营养效应并且迅速提供新细胞以取代化学疗法后损伤的肠上皮。施用本发明肽实现的最终目标是降低进行化学疗法治疗患者中相关胃肠损伤的发病率，同时增加对更具攻击性的化学治疗、放射治疗以及放化学治疗组合疗法的耐受。可以根据本发明对正在进行或准备进行放射治疗的患者提供并行的预防或治疗性处理。
抗癌化学疗法后的胃肠粘膜炎是一旦出现就基本上不能治疗的日益严重的问题，尽管其能逐渐缓和。利用常用的细胞抑制癌症药物5-氟尿嘧啶和伊立替康进行的研究证明，使用这些药物的有效化学疗法主要影响小肠的结构完整性和功能，而结肠的敏感性较低，并且主要应答为粘液形成的增加(Gibson等，J Gastroenterol Hepatol.18(9)：1095-1100，2003；Tamaki等，J lnt Med Res.31(1)：6-16，2003)。
本发明的新GLP-2类似物可用于预防和/或治疗胃肠损伤和化学治疗剂的副作用。这种可能很重要的治疗应用可适用于目前使用的化学治疗剂，例如但不限于：5-氟尿嘧啶、六甲蜜胺、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、门冬酰胺酶(Crisantaspase)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、脂质体多柔比星、亚叶酸、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、Pemetrexed、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、链脲菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、塞替派、硫鸟嘌呤/硫代鸟嘌呤、托泊替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、门冬酰胺酶、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、脂质体多柔比星、亚叶酸、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、Pemetrexed、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、链脲菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、塞替派、硫鸟嘌呤/硫代鸟嘌呤、托泊替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
设想可通过施用有效量的GLP-2类似物或其盐将本发明的肽用于治疗新生儿的方法中。通过利用本发明的肽激动剂可克服由于缺少肠发育造成的喂养新生儿的相关并发症。
在本发明的另外一个实施方案中，描述了通过向有此需要的患者施用有效量的GLP-2类似物或其盐来治疗DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介导的病症的方法。这样的疾病包括DPP-IV酶过表达的病症。
在一个实施方案中，可如上所述将药物组合物配制成引起所述GLP-2类似物或者其盐或衍生物的缓慢释放。
设想可通过施用有效量的GLP-2类似物或其盐将本发明的肽用于治疗新生儿的方法中。通过利用本发明的肽激动剂可克服由于缺少肠发育造成的喂养新生儿的相关并发症。
在本发明的另外一个实施方案中，描述了通过向有此需要的患者施用有效量的GLP-2类似物或其盐来治疗DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介导的病症的方法。这样的疾病包括DPP-IV酶过表达的病症。
实施例
提供下述实施例用于说明本发明的优选方面，而不意在限制本发明的范围。
一般性肽合成
仪器和合成策略
在装有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中分批合成肽，使用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作为N-α-氨基保护基和适当的通用侧链功能性保护基。
溶剂
将溶剂DMF(N，N-二甲基甲酰胺，Riedel de-
Figure A20078004149000501
Germany)通过填充强阳离子交换树脂(Lewatit S 100MB/H strong acid，Bayer AGLeverkusen，Germany)的柱进行纯化，并在使用前加入3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)分析其中的游离胺，如果存在游离胺，则产生黄色(Dhbt-O-阴离子)。不经纯化直接使用溶剂DCM(二氯甲烷，分析级，Riedel de-Germany)。不经纯化直接使用乙腈(HPLC-级，Lab-Scan，Dublin Ireland)。
氨基酸
以适当的侧链保护形式从Advanced ChemTech(ACT)购得Fmoc保护的氨基酸。
偶联试剂
偶联试剂二异丙基碳二亚胺(DIC)购自Riedel de-
Figure A20078004149000511
Germany。
固体支持物
在TentaGel S树脂0.22-0.31mmol/g上合成肽，在优选C端酰胺化肽的情况下使用TentaGel S-Ram、TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(Rapp polymere，Germany)，而当优选C端游离羧酸时使用TentaGel SPHB，TentaGel S PHB Lys(Boc)Fmoc。
催化剂和其它试剂
二异丙基乙胺(DIEA)购自Aldrich，Germany，哌啶和吡啶来自Riedel-de
Figure A20078004149000512
Frankfurt，Germany。乙二硫醇购自Riedel-de
Figure A20078004149000513
Frankfurt，Germany。3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(HOAt)得自Fluka，Switzerland。乙酸酐得自Fluka。
偶联方案
在DMF中通过DIC法由适当的N-a-保护的氨基酸和HObt或HOAt将氨基酸偶联为原位合成的HObt或HOAt酯。在80℃进行茚三酮测试检查酰化作用，以防止测试期间Fmoc去保护(Larsen，B.D.andHolm，A.，Int.J.Peptide Protein Res.43，1994，1-9)。
N-α-氨基保护基(Fmoc)的去保护
按以下进行Fmoc基的去保护：利用DMF中的20％哌啶进行处理(1×5和1×10分钟)，随后用DMF冲洗(5×15ml，每次5分钟)直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能检测到黄色为止。
HOBt-酯的偶联
将3份N-α-氨基保护的氨基酸与3份HObt和3份DIC一起溶解在DMF中，然后加入树脂中。
用酸从树脂中切割肽
利用95％三氟乙酸(TFA，Riedel-de
Figure A20078004149000521
Frankfurt，Germany)-水(体积/体积)或95％TFA和5％乙二硫醇(体积/体积)在室温下处理2小时从树脂中切割肽。用95％TFA-水洗涤过滤的树脂，减压蒸发滤液和洗液。用醚冲洗残留物并在醋酸-水中冻干。通过高效液相层析(HPLC)分析粗冷冻产物并通过质谱(MS)进行鉴定。
在Tenta Gel树脂(PEG-PS)上进行分批肽合成
将TentaGel树脂(1g，0.23-0.24mmol/g)置于装有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中。所述树脂在DMF(15ml)中膨胀，并用DMF中的20％哌啶处理，以除去接头TentaGel S RAM上或树脂TentaGel SRAM-Lys(Boc)Fmoc的第一个氨基酸上的初始Fmoc基团。排干树脂并用DMF洗涤直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能检测到黄色为止。如上述将根据该序列的氨基酸偶联为预先形成的Fmoc-保护的HObt酯(3份)。除非另外指出，继续偶联2小时。排干树脂并用DMF(5×15ml，每次5分钟)洗涤以除去过量的试剂。通过上述茚三酮测试检查所有的酰化作用。完成合成后，用DMF(3×15ml，每次5分钟)、DCM(3×15ml，每次1分钟)以及最后用二乙醚(3×15ml，每次1分钟)洗涤肽-树脂，并真空干燥。如上所述从树脂中切割肽并如下所述分析和纯化粗肽产物。
HPLC条件
用HP 1100四元泵、HP 1100自动进样器、HP 1100柱恒温器和HP 1100多波长检测器组成的Hewlett Packard HP 1100HPLC系统进行梯度HPLC分析。使用用于LC的Hewlett Packard Chemstation软件(A.06.01版)进行仪器控制和数据采集。使用以下的柱和HPLC缓冲系统：
柱：VYDAC 238TP5415，C-18，5mm，
Figure A20078004149000522
150×4.6mm。
缓冲液：A：MQV中0.1％的TFA；B：0.085％TFA、10％MQV、90％MeCN。
梯度：0-1.5分钟.0％B
1.5-25分钟50％B
25-30分钟100％B
30-35分钟100％B
35-40分钟0％B
流速1ml/分钟，柱箱温度40℃，UV检测：I＝215nm。
粗肽的HPLC纯化
通过PerSeptive Biosystems VISION工作站纯化粗肽产物，VISION 3.0软件用于仪器控制和数据采集。使用下述柱和HPLC缓冲系统：
柱：Kromasil KR
Figure A20078004149000531
10mm C-8，250×50.8mm。
缓冲体系：缓冲液：A：MQV中0.1％的TFA；B：0.085％TFA、10％MQV、90％MeCN。
梯度：0-37分钟.0-40％B
流速35ml/分钟，UV检测：I＝215nm和280nm。
质谱
将肽溶解在超梯度甲醇(Labscan，Dublin，Ireland)、milli-Q水(Millipore，Bedford，MA)和甲酸(Merck，Damstadt，Germany)(50∶50∶0.1v/v/v)中得到1至10mg/ml的浓度。利用准确度为+/-0.1m/z的LCT质谱仪(Micromass，Manchester，UK)通过ESI-TOF-MS以正极性方式分析肽溶液(20ml)。
一般性合成方案
在所有合成中，将干燥的TentaGel-S-Ram树脂(1g，0.22-0.31mmol/g)置于装有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中。所述树脂在DMF(15ml)中膨胀，并用含有20％哌啶的DMF处理以保证树脂上非质子化氨基的存在。排干树脂并用DMF洗涤，直到向排出的DMF中加Dhbt-OH后不能检测到黄色为止。如上述将根据该序列的氨基酸偶联为预先形成的Fmoc-保护的HObt酯(3份)。除非另外指出，继续偶联2小时。排干树脂并用DMF(5×15ml，每次5分钟)洗涤以除去过量的试剂。在80℃进行茚三酮测试检查所有的酰化作用。完成合成后，用DMF(3×15ml，每次5分钟)、DCM(3×15ml，每次1分钟)以及最后用二乙醚(3×15ml，每次1分钟)洗涤肽-树脂，并真空干燥。如上所述从树脂中切割肽并冻干。利用上述制备性HPLC纯化后，收集肽产物并通过ES-MS确定肽的身份。该方案用于合成下文进一步示例的所有肽。
合成的化合物
利用上述技术，使用上述方法合成化合物1809至1861以及参照化合物1559(H-[Gly2]hGLP-2-OH)(表1)。
表1：合成的化合物
Figure A20078004149000551
Figure A20078004149000561
实施例1.合成化合物2264
在TentaGel S RAM上合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2。
将干燥的TentaGel S RAM(0.2mmol/g，1g)置于带有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯管中，如“TentaGel树脂上的批量肽合成”所述进行处理，直至完成N端组氨酸的偶联。所有偶联均持续过夜。如前所述检查酰化作用。在完成合成和脱去N端Fmoc保护基团之后，如上所述将肽从树脂上切割下来。在如上所述使用制备型HPLC纯化之后，收集到413mg肽产物，纯度大于93％，通过MS确认肽的身份(测量值M3488.13，计算值M 3487.79)。
实施例2.合成化合物2268
在TentaGel S RAM上合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2。
将干燥的TentaGel S RAM(0.2mmol/g，1g)置于带有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯管中，如“TentaGel树脂上的批量肽合成”所述进行处理，直至完成N端组氨酸的偶联。所有偶联均持续过夜。如前所述检查酰化作用。在完成合成和脱去N端Fmoc保护基团之后，如上所述将肽从树脂上切割下来。在如上所述使用制备型HPLC纯化之后，收集到132mg肽产物，纯度大于91％，通过MS确认肽的身份(测量值M3535.88，计算值M 3535.77)。
实施例3.合成化合物2264(Lys6)
在TentaGel S RAM-Lys(Boc)-Fmoc上合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys NH2。
将干燥的TentaGel S RAM-Lys(Boc)-Fmoc(0.24mmol/g，1g)置于带有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯管中，如“TentaGEl树脂上的批量肽合成”所述进行处理，直至完成N端组氨酸的偶联。所有偶联均持续过夜。如前所述检查酰化作用。在完成合成和脱去N端Fmoc保护基团之后，如上所述将肽从树脂上切割下来。在如上所述使用制备型HPLC纯化之后，收集肽产物，纯度大于90％，通过MS确认肽的身份(测量值M 4256.40，计算值M 4256.36)。
实施例4.合成化合物2268(Lys6)
在TentaGel S RAM-Lys(Boc)-Fmoc上合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys NH2。
将干燥的TentaGel S RAM-Lys(Boc)-Fmoc(0.24mmol/g，1g)置于带有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯管中，如“TentaGel树脂上的批量肽合成”所述进行处理，直至完成N端组氨酸的偶联。所有偶联均持续过夜。如前所述检查酰化作用。在完成合成和脱去N端Fmoc保护基团之后，如上所述将肽从树脂上切割下来。在如上所述使用制备型HPLC纯化之后，收集肽产物，纯度大于90％，通过MS确认肽的身份(测量值M 4304.10，计算值M 4304.34)。
实施例5.合成化合物2264A(乙酸盐)
从三氟乙酸盐进行反离子交换得到化合物2264的乙酸盐。
由于纯化合成肽粗产物所用的HPLC缓冲液中存在三氟乙酸盐(0.1％v/v)，所以纯化的化合物2264合成肽产物以三氟乙酸盐的形式分离。
为了用乙酸盐交换反离子三氟乙酸盐，将所述肽的溶液通过装填有带乙酸根的强碱性离子交换树脂的柱(Dowex 1×8)。化合物2264T溶于水中。将所述溶液通过含有带乙酸根的强碱性离子交换树脂(Dowex 1×8；载荷量1.33meq/ml树脂)的柱。然后，用水清洗所述树脂，收集洗脱液并冻干得到纯度大于90％的乙酸盐。
实施例6.合成化合物2264C(盐酸盐)
从三氟乙酸盐(Tfa)进行反离子交换得到化合物2264的盐酸盐(Cl-)。
将化合物2264T溶解于0.1M的盐酸中，冻干所得溶液。将剩余物溶于水中，再次冻干得到纯度大于90％的盐酸盐。
另一些选择性GLP-2类似物化合物在表2中列出。
Figure A20078004149000601
Figure A20078004149000611
Figure A20078004149000621
实施例7.相对化学稳定性测试
将表3中所列出的化合物溶于0.1M HCl中至名义浓度为0.5mM。将所述样品在黑暗中在40℃下孵育7天，然后稀释至0.2mg/ml的名义浓度，通过RP-HPLC分析以回收主峰，并通过LC-MS分析通过质量来确认主峰的身份。
化合物以0.2mg/ml的名义浓度在Phenomenex Gemini C18柱，3μm，
Figure A20078004149000631
3×150mm上通过RP-HPLC和LC-MS进行分析，流动相为MQW和MeCN中的0.1％TFA，在39分钟中从25％逐步至48％MeCN。流速为0.400mL/分钟。柱箱温度为50℃，自动加样器温度为4℃，在220nm处进行UV检测。
表3中列出了回收纯度的结果。
表3ZP化合物的回收纯度
  ZP号   回收率(％)
  2242   87
  2263   95
  2264   ＊
  2266   73
  2267   ＊
  2268   ＊
  2269   39
  2270   52
  2272   ＊
＊在分析型RP-HPLC的清洗相中洗脱。实施例7中显示的重复数据使用了改进的分析型RP-HPLC方法。
通过此分析方法，在清洗相的后期洗脱了4种化合物(ZP2264、ZP2267、ZP2268和ZP2272)，通过如下所述的改进方法使用这四种化合物进行重复实验。
实施例8.相对化学稳定性检验
将表4中所列出的化合物溶于0.1M HCl中至名义浓度为0.25mM。将所述样品在黑暗中在40℃下孵育2天，然后稀释至0.2mg/ml的名义浓度，通过RP-HPLC分析以回收主峰。
化合物以0.25mg/ml的名义浓度在Phenomenex Gemini C18柱，3μm，
Figure A20078004149000641
3×150mm上通过RP-HPLC和LC-MS进行分析，流动相为MQW和MeCN中的0.1％TFA，在39分钟中从25％逐步至80％MeCN。流速为0.400mL/分钟。柱箱温度为50℃，自动加样器温度为4℃，在220nm处进行UV检测。
表4中列出了回收纯度的结果。
表4ZP化合物回收的纯度
  ZP号   回收率(％)
  1846   95
  2264   61
  2267   61
  2268   62
  2272   61
实施例9、体外筛选对BHK-21细胞中重组表达的GLP-2受体有激动作用的GLP-2类似物＊)
使用瞬时转染了GLP-2受体和CRE-萤光素酶报告基因构建体的BHK21细胞进行筛选。使用从10fM至10nM的7个浓度以及每个浓度三个重复点来测定剂量应答曲线和EC50值。在所有测试板上均使用对照肽。
＊)在匈牙利布达佩斯通过AMRI进行所述测试。
材料和方法
所使用的材料和细胞：
Nunc或Greiner组织培养瓶
Nunc或Greiner 10cm TC培养皿(Nunc 172931)
用于分板的Nunc或Greiner 96孔板(Nunc 167008)
BHK-21(C13)细胞
白色96孔板(PerkinElmer 6005680)
用于稀释的深孔板(Nunc 278752)
Glasgow MEM(Sigma G5154)
无酚红DMEM(Invitrogen/Gibco 31053-028)
胎牛血清(FCS，Invitrogen/Gibco Zealand batch)
非必需氨基酸(100×)(Invitrogen/Gibco 11140-035)
200mM谷氨酰胺(100×)(Invitrogen/Gibco 25030-024)
青霉素/链霉素(100×)(Invitrogen/Gibco 15140-122)
丙酮酸钠(100×)(Invitrogen/Gibco 11360-039)
D-PBS(Invitrogen/Gibco 14190-094)
1×胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen/Gibco 25300-054)
Opti-MEM(Invitrogen/Gibco 31985-047)
Lipofectamine 2000(Invitrogen 11668-027)
CRE-luc载体(Zealand batch)
hGLP2R载体(Zealand batch)
DMEM中的10％(w/v)无菌BSA(Sigma 05488)
DMEM中的10mM(200×)IBMX(Sigma I5879)
LucLite试剂盒(Perkin Elmer 6016911)
Topseal-A(Perkin Elmer 6005185)
培养基和缓冲液
用于BHK-21(C13)细胞的生长培养基：
Glasgow MEM+2mM谷氨酰胺(1∶100)+10％FCS+1％NEAA+1％
青霉素/链霉素+1mM丙酮酸钠(1∶100).
用于BHK-21(C13)细胞的无抗生素转染培养基：
Glasgow MEM+2mM谷氨酰胺(1∶100)+1％NEAA+1mM丙酮酸钠(1∶100)
用于BHK-21(C13)细胞的转染后培养基：
Glasgow MEM+2mM谷氨酰胺(1∶100)+0.2％FCS+1％NEAA+1％青霉素/链霉素+1mM丙酮酸钠(1∶100)
包被液：D-PBS+1％BSA
肽溶解缓冲液：
D-PBS+0.1％BSA
刺激缓冲液：
无酚红DMEM+2mM谷氨酰胺(1∶100)+50μM IBMX+0.3％BSA在经转染的BHK21(C13)细胞中筛选肽的方案
将BHK-21细胞接种于10厘米TC-培养皿，培养至70-80％汇合。接着，将培养基换成无血清转染培养基。将DNA(7.5微克hGLP-2受体载体和7.5微克CRE-萤光素酶载体)和Lipofectamine 2000稀释于OptiMEM中，将其合并然后在20-30分钟后添加至细胞中。在培养箱中在37℃5％CO2下孵育细胞4小时，胰酶消化，以35000个细胞/孔重新接种到96孔板。将细胞在完全培养基中孵育过夜以使转基因表达。所有用于制备稀释GLP-2类似物溶液的平板均用磷酸盐缓冲液中1％的BSA预包被2小时并干燥过夜。将GLP-2类似物溶于PBS/0.1％BSA中至250μM，分别在两个步骤中用含有磷酸二酯酶抑制剂和0.3％BSA的无酚红无血清培养基(刺激缓冲液)稀释至10μM和100nM，之后，在相同的刺激缓冲液中连续稀释GLP-2类似物，产生10nM至10fM的浓度。仅使用刺激缓冲液作为基线活性的对照。这些溶液预先加温至37℃30分钟。用预温(37℃)的刺激缓冲液洗涤细胞，然后与100微升预温的肽稀释液和对照在37℃5％CO2下孵育5小时。在孵育临结束前制备LucLite酶底物/裂解缓冲液。每孔加入100微升LucLite底物，在合适的计数器(例如Wallac Victorll)中对发光进行计数。通过用4参数Logistic方程进行拟合而从原始数据中得到EC50值(Microcal Origin5.0或GraphPad 4)。
在表5中列出结果
表5在表达GLP-2受体的BHK21细胞中筛选GLP-2类似物
ZP ID  2263    2264    2266   2267    2268    2269     2270    2272    2242
pEC50  10.84   11.5    9.253  10.87   11.21   10.04    10.231  1.27    12,41
SEM    0.1929  0.2419  0.2272 0.3139  0.2239  0.09546  0.1449  0.1668  0,1971
结论：结果清楚地显示，所有测试的化合物都是GLP-2激动剂。
实施例10.体内测试，在雄性C57BL小鼠中测定对肠生长的刺激
在C57BL小鼠中测定本发明化合物(ZP2264、ZP2266、ZP2267、ZP2268、ZP2242、ZP2269、ZP2270、ZP2272和ZP2242)选择性刺激小肠质量(与结肠质量相比)的能力。连续三天每天一次对各个组(n＝6-10)小鼠皮下给予800nmol/kg的每种化合物。出于比较的目的，对其它组动物以相同给药方案给予等摩尔剂量的[Gly2]GLP-2(ZP1559)或载体(磷酸盐缓冲液，pH7.4)。在最后一次给予化合物后24小时，将小鼠处死，将小肠(从幽门到盲肠)和结肠(盲肠以下的肠)排空并称重。
为了校正体重(body weight，BW)的微小差异，将小肠(smallintestine，SI)和结肠的器官重表示为相对于BW的值。非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2已被报道为刺激幽门、胃、小肠和结肠的胃肠生长，为了评价化合物所诱导生长模式的差异，按照如下计算化合物X的小肠-结肠敏感性指数：
(SI/结肠)X/(SI/结肠)[Gly2]GLP-2％
具有大于或等于1.10的小肠-结肠敏感性的化合物被认为对小肠具有相对选择性。
Figure A20078004149000681
Figure A20078004149000691
结果
基于所述肽选择性增加小肠质量(与结肠质量相比)的能力来确定本发明测试化合物的作用。在图1和2中，显示了施用参照化合物[Gly2]GLP-2和ZP2264、ZP2266、ZP2267、ZP2268、ZP2242、ZP2269和ZP2272后与载体对照相比的小肠相对质量。在图3和4中，显示了与参照化合物[Gly2]GLP-2相比，所述测试化合物对小肠质量与结肠质量之比值的影响。将给予[Gly2]GLP-2的动物中小肠质量与结肠质量之比值标准化为100％。基于计算出相对于参照化合物[Gly2]GLP-2的小肠-结肠敏感性指数，将具有小肠选择性的测试化合物显示于表6。将给予[Gly2]GLP-2的动物中的小肠-结肠敏感性指数标准化为1。相对于参照化合物[Gly2]GLP-2，所述测试化合物对小肠和结肠质量的影响在表7中显示。将给予[Gly2]GLP-2的动物中小肠质量和结肠质量标准化为100％。
实施例11.体内测试，在雄性C57BL小鼠中测定对肠生长的刺激
在雄性C57BL小鼠中测定了另一些化合物选择性刺激小肠质量(相对于结肠质量)的能力。使用与实施例10中相似的方案，只是每天施用200nmol/kg每种化合物。连续三天每天一次对各个组(n＝6-10)小鼠皮下给予200nmol/kg的每种化合物。对其它组动物以相同给药方案给予等摩尔剂量的[Gly2]GLP-2(参照化合物)或载体(磷酸盐缓冲液，pH7.4，阴性对照)。在最后一次给予化合物后24小时，将小鼠处死，将胃、小肠和结肠排空并称重。
如图6所示，本发明的化合物ZP2380、ZP2381、ZP2384、ZP2385、ZP2397、ZP2398、ZP2399、ZP2411、ZP2417、ZP2418、ZP2420、ZP2423具有选择性增加小肠质量(相对于结肠质量)的能力。
实施例12.体内测试，在雄性C57BL小鼠中测定对肠生长的刺激
基于所述肽相对于载体对照选择性增加胃质量的能力来测定本发明测试化合物的作用。在雄性C57BL小鼠中测定本发明化合物(ZP2395、ZP2396、ZP2400、ZP2412、ZP2394和ZP2401)选择性刺激胃质量(相对于结肠质量)的能力。连续三天每天一次对各个组(n＝6-10)小鼠皮下给予200nmol/kg的每种化合物。出于比较的目的，对其它组动物以相同给药方案给予等摩尔剂量的[Gly2]GLP-2或载体(磷酸盐缓冲液，pH7.4)。在最后一次给予化合物后24小时，将小鼠处死，将胃和小肠(从幽门到回盲肠)排空并称重。为了校正体重(BW)的微小差异，将胃的器官重表示为相对于BW的值。图7中显示，化合物ZP2395、ZP2396、ZP2400、ZP2412、ZP2414、ZP2416、ZP2394和ZP2401具有选择性增加胃质量(相对于结肠质量)的能力。
尚未报道过参照化合物[Gly2]GLP-2刺激胃质量，而许多所述ZP化合物增加胃质量(相对于体重)(图7)。为评价与[Gly2]GLP-2相比，ZP化合物对胃诱导的差异生长模式，按照如下计算化合物X的胃-结肠敏感性指数：
(胃/结肠)X/胃/(结肠)[Gly2]GLP-2％
具有大于或等于1.05的胃/结肠敏感性的化合物被认为对胃具有相对选择性。
化合物ZP2267、ZP2386、ZP2404、ZP2413、ZP1415、ZP2402、ZP2403、ZP2382、ZP2266、ZP2378、ZP2414、ZP2416、ZP2424、ZP2379、ZP2269对小肠、结肠或胃没有选择性(图8)。
图8显示了实施例10至12所得数据的总结
图8数据总结
Figure A20078004149000721
＊NT：未测试
GLP-2受体特异性
底物显示对给定受体具有特异性的机制涉及所述底物与所述受体之间基于氢键、疏水作用、静电相互作用等的多种相互作用。
在我们的构效关系研究中，看来GLP-2序列的11、16、20、24和28位残基与GLP-2受体的识别和结合密切相关。因此，这些特定位置的氨基酸谱的改变将GLP-2类似物分为三个不同的组别：小肠特异性、胃特异性和非特异性肽。
发现GLP-2类似物的受体特异性取决于11、16、20、24和28位氨基酸的疏水性和氢键结合势。
实施例13.HPI对小肠特异性的影响
在表9中显示了根据SI/结肠敏感性指数具有小肠特异性之GLP-2肽的HPI数据。
表9小肠特异性GLP-2类似物-亲水性图(hydrophaticity profile，HPP)
Figure A20078004149000731
数据显示，小肠特异性GLP-2类似物中11、16、20、24和28位中各个位置的HPI区间应该独立地为：11位和16位至少为-0.8≤HPI≤3.8，或者优选为-0.8≤HPI≤2.8或更优选为HPI＝1.8。
对20、24和28位来说，HPI区间应独立地为：-0.8≤HPI20、24 28≤1.8，或者优选为-0.8≤HPI20≤1.8或更优选为HPI24和28＝-0.8。
根据HPI区间，小肠选择性肽的可能的氨基酸替换模式在表10中显示。
表10小肠特异性GLP-2类似物亲水性图(HPP)
Figure A20078004149000741
因此，X11、X16、X20、X24和X28各自可独立地是Ala、Ser、Gly或Thr。特别地，X11和X16各自可独立地是Ala或Ser，X20、X24和X28可独立地是Ala、Ser、Gly或Thr。例如，X11和X16可以都是Ala，X20、X24和X28可以独立地是Ala、Ser、Gly或Thr。
实施例14.HPI对胃特异性的影响
在表11中，显示了根据胃/SI-敏感性指数具有胃特异性之GLP-2肽的HPI数据。
表11胃特异性GLP-2类似物亲水性图(HPP)
Figure A20078004149000742
数据显示，胃特异性GLP-2类似物中11、16、20、24和28位中各个位置的HPI区间应独立地为：11位和16位至少为-3.9≤HPI11、16≤3.8，或者优选为2.8≤HPI11、16≤3.8或HPI11、16＝-3.9。
对于20、24和28位，HPI应独立地是-3.9≤HPI20、24、28≤1.8，或者优选为-0.8≤HPI20、24、28≤1.8或HPI20、24、28＝-3.9。
根据HPI区间，可能的氨基酸替换模式在表12中显示。
表12可能的氨基酸替换模式
Figure A20078004149000751
因此，对于胃特异性化合物
X11可以是Leu、Phe或Lys。
X16可以是Leu、Phe或Lys。
X20可以是Ala或Ser。
X24可以是Ala、Ser或Lys。
X28可以是Ala、Ser或Lys。
作为举例，X11和X16可独立地是Leu或Phe，以及X20、X24和X28可以是Ser。
氢键结合势(hydrogen bonding potential，HBP)对受体特异性的影响
如之前所述，还发现GLP-2类似物的受体特异性由上述11、16、20、24和28位的氢键结合势决定。
W.D.Stein“The movement of molecules across cell membranes”，Academic Press N.Y.1967，65-125页引入并定义了各个氨基酸的氢键结合势(HBP)，并且提供了给定氨基酸侧链形成氢键的能力。
各个氨基酸的HBP在表13中给出
表13各个氨基酸的HBP
Figure A20078004149000761
实施例15.氢键结合势(HBP)对胃特异性的影响
胃特异性类似物的实例在表14中显示。
表14胃特异性GLP-2肽类似物
Figure A20078004149000762
根据此表，胃特异性GLP-2类似物11、16、20、24和28位中各个位置的HBP区间应独立地为：对所有位置来说至少为0≤HBP11、16、 20、24、28≤2。根据HBP区间，可能的氨基酸替换模式在表15中显示。
表15、可能的氨基酸替换模式
Figure A20078004149000771
优选的胃特异性类似物是如下的GLP-2类似物：其HBP区间对于11和16位为HBP11、16＝0，20、24和28位独立地为0≤HBP20、24、28≤2。
一些胃特异性GLP-2类似物如下：
X11可以是Leu、Phe或Lys。
X16可以是Leu、Phe或Lys。
X20可以是Ala或Ser。
X24可以是Ala、Ser或Lys。
X28可以是Ala、Ser或Lys。
例如，X11和X16可以独立地是Leu或Phe，X24和X28可以独立地是Lys或Ser，X20可以是Ser。
例如，X11和X16可以独立地是Leu或Phe，X20、X24和X28可以是Ser。
实施例16、氢键结合势(HBP)对小肠特异性的影响
还发现小肠特异性GLP-2类似物由参数例如上述11、16、20、24和28位的氢键结合势决定。各个氨基酸的HBP在表16中给出。
表16、氢键结合势(HBP)对小肠特异性的影响
Figure A20078004149000781
根据此表，小肠特异性GLP-2类似物的11、16、20、24和28位中各个位置的HBP区间应独立地为：对所有位置来说至少为0≤HBP11、 16、20、24、28≤2。
优选的类似物具有如下HBP区间：对11和16位为HBP11、16＝0，20、24和28位独立地具有0≤HBP20、24、28≤2的HBP区间。
显示小肠特异性的更优选GLP-2类似物是具有如下HBP区间的肽：对11和16位来说为HBP11、16＝0，HBP20＝0-2，HBP24、28＝2。
由此，一些替换模式显示于表17中。
表17、小肠特异性肽
因此，在小肠选择性化合物中，X11、X16、X20、X24和X28可各自独立地是Ala、Ser、Gly或Thr。例如，X11和X16可独立地是Ala或Ser，X20、X24和X28可独立地是Ala、Ser、Gly或Thr。例如，X11和X16可以都是Ala，X20、X24和X28可以独立地是Ala、Ser、Gly或Thr。
尽管已经结合上述示例性实施方案描述了本发明，但是在给出这一公开内容后，许多等价的改良和变化对于本领域技术人员是显而易见的。因此，认为所提出的本发明示例性实施方案是用于说明而非限制。可对所述实施方案进行多种变化而不背离本发明的精神和范围。将本文引用的所有文献均明确地以参考方式并入本文。

Claims (56)

1.通式I所代表的胰高血糖素样肽2(GLP-2)或者其可药用盐或衍生物：
R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
其中：
R1是氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
X2是Gly、Ala或Sar；
X3是Glu或Asp；
X5是Ser或Thr；
X6是Phe或Pro或保守性替换；
X7是Ser或Thr；
X8是Asp或Ser或保守性替换；
X9是Glu或Asp或保守性替换；
X10是Met、Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸；
X11是Y1；
X12是Thr或Lys或保守性替换；
X13是Ile、Glu或Gln或保守性替换；
X14是Leu、Met或Nle或保守性替换；
X15是Asp或Glu或保守性替换；
X16是Y2；
X17是Leu或Glu或保守性替换；
X18是Ala或Aib或非保守性替换；
X19是Ala或Thr或保守性替换；
X20是Y3；
X21是Asp或IIe或保守性替换；
X24是Y4；
X28是Y5；
X31是Pro、Ile或缺失；
X32是Thr或缺失；
X33是Asp、Asn或缺失；
R2是NH2或OH；
其中
Z1和Z2独立地为不存在或者是选自以下的1-10个氨基酸单元的肽序列：Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn；如下计算式I中X11、X16、X20、X24、X28残基的亲水性图(HPP)≥-10
HPP＝∑hpiX11+hpiX16+hpiX20+hpiX24+hpiX28
其中
Y1、Y2、Y4和Y5各自可选自Asn、Asp、Glu、Gln、Lys、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、Gly、Leu、Ile、Val、Met或Phe；并且
Y3可选自Asn、Asp、Glu、Gln、His、Arg、Ala、Ser、Thr、Pro、GIy、Leu、Ile、Val、Met或Phe；
前提条件是，当X20是Arg时，则X11是Ser，X16是Ala，X24是Ala，X28是Ala并且Z2是Lys。
2.根据权利要求1的胰高血糖素样肽2(GLP-2)类似物，其中HPP≥-4。
3.根据权利要求1的胰高血糖素样肽2(GLP-2)类似物，其中HPP≥0。
4.通式II代表的胰高血糖素样肽2(GLP-2)类似物或者其可药用盐或衍生物：
R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
其中：
R1是氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
X2是Gly、Ala或Sar；
X3是Glu或Asp；
X5是Ser或Thr；
X6是Phe或Pro；
X7是Ser或Thr；
X8是Asp或Ser；
X9是Glu或Asp；
X10是Met、Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸；
X11是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X12是Thr或Lys；
X13是Ile、Glu或Gln；
X14是Leu、Met或Nle；
X15是Asp或Glu；
X16是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X17是Leu或Glu；
X18是Ala或Aib；
X19是Ala或Thr；
X20是Asn、Arg、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X21是Asp或Ile；
X24是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X28是Asn、Ala、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr或Val；
X31是Pro、Ile或缺失；
X32是Thr或缺失；
X33是Asp、Asn或缺失；
R2是NH2或OH；
其中
Z1和Z2独立地为不存在或者是选自以下的1-10个氨基酸单元的肽序列：Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn；
前提条件是，当X20是Arg时，则X11是Ser，X16是Ala，X24是Ala，X28是Ala并且Z2是Lys。
5.根据权利要求4的GLP胰高血糖素样肽2(GLP-2)，其中
X11是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X16是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X20是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X24是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val
X28是Ala、Gly、Ile、Leu、Phe、Ser、Thr或Val。
6.根据权利要求4的GLP胰高血糖素样肽2(GLP-2)，其中
X11是Ala、Ile、Leu、Phe或Val；
X16是Ala、Ile、Leu、Phe或Val
X20是Ala、Ile、Leu、Phe或Val
X24是Ala、Ile、Leu、Phe或Val
X28是Ala、Ile、Leu、Phe或Val。
7.根据权利要求1-6中任一项的GLP-2类似物，其中所述GLP-2类似物与野生型GLP-2(1-33)具有至少60％的氨基酸序列同一性，并且具有在体内导致肠质量增加的生物活性。
8.根据前述权利要求中任一项的GLP-2类似物，其中所述GLP-2类似物包含X11、X16、X20、X24和/或X28位的多于一个替换和/或一个或多个所述替换与X3、X5、X7和/或X10位的一个或多个替换相组合。
9.权利要求1或4的GLP-2类似物，其中所述X10位替换是Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸，例如Met(O)或Met(O)2。
10.由通式III所定义的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物：R1-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-X8-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-Leu-X15-X16-Leu-Ala-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2；
其中
R1是氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
X8是Asp或Ser，优选Asp；
X11是Ser、Ala、Glu、Lys或Asn；
X15是Glu或Asp，优选Glu；
X16是Ser、Ala或Glu；
X20是Ser、Ala或Glu；
X24是Ser、Ala或Glu；并且
X28是Ser、Ala、Gln或Glu。
11.公开于本文表1和表2中的前述权利要求中任一项的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物。
12.权利要求11的GLP-2类似物，其为：
2263 HGEGSFSDELSTILESLAASDFISWLISTKITD-NH2
2264 HGEGSFSDELATILEALAAADFIAWLIATKITD-NH2
2266 HGEGSFSDELETILEELAAEDFIEWLIETKITD-NH2
2267 HGEGSFSDELSTILESLAAADFIAWLIATKITD-NH2
2268 HGEGSFSDELATILEALAASDFISWLISTKITD-NH2
2269 HGEGSFSDELKTILESLAAADFIEWLIQTKITD-NH2
2270 HGEGSFSDELNTILESLAASDFISWLISTKITD-NH2
2272 HGEGSFSDELATILESLAAADFISWLIATKITD-NH2
2242 HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK-OH
13.前述权利要求中任一项的GLP-2类似物，其中所述GLP-2类似物包含X3、X5、X7、X11、X16、X20、X24、X28、X31、X32和/或X33位上的多于一个替换。
14.权利要求13的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物，其中所述GLP-2类似物包含选自X11、X16、X20、X24、X28位是Ile、Ala、Leu、Phe或Val的一个或多个替换；并且X31、X32和X33位的氨基酸残基任选是缺失的。
15.权利要求1-9中任一项的GLP-2类似物，其包含X11、X16、X20、X24和/或X28位中一个或多个位置上的替换。
16.权利要求1、4或10的GLP-2类似物，其中X11、X16、X20、X24和X28各自独立地选自Ala、Ser、Gly和Thr，并且其中所述类似物相对于结肠而言对小肠具有偏好性生长促进活性。
17.权利要求16的GLP-2类似物，其中X11和X16各自独立地选自Ala和Ser，X20、X24和X28各自独立地选自Ala、Ser、Gly和Thr。
18.权利要求17的GLP-2类似物，其中X11和X16都是Ala，X20、X24和X28独立地选自Ala、Ser、Gly和Thr。
19.权利要求17的GLP-2类似物，其中X11和X16都是Ala，X20、X24和X28独立地选自Ala和Ser。
20.权利要求16的GLP-2类似物，其包含X11、X16、X20、X24和X28位残基的下述组合之一：
Ser/Ser/Ser/Ser/Ser，Ala/Ala/Ser/Ser/Ser，Ala/Ala/Ala/Ala/Ser，Ser/Ala/Ser/Ser/Ser，Ala/Ala/Ala/Ser/Ala；Ala/Ala/Ser/Ala/Ala；Ser/Ala/Ala/Ala/Ala；Ser/Ala/Arg/Ala/Ala；Ala/Ser/Ala/Ser/Ala；Ala/Ala/Ala/Ala/Ala。
21.权利要求16的GLP-2类似物，其为
ZP2264，ZP2268，ZP2242，ZP2272，ZP2411，ZP2380，ZP2384，ZP2398，ZP2417，ZP2423，ZP2385，ZP2399，ZP2418，ZP2381，ZP2420或ZP2397。
22.权利要求1、4或10的GLP-2类似物，其中
X11选自Leu、Phe和Lys；
X16选自Leu、Phe和Lys；
X20选自Ala、Ser、Leu、Gly和Thr；
X24选自Ala和Ser；
X28选自Ala、Ser或Lys；
并且其中所述类似物相当于结肠而言对胃具有偏好性生长促进活性。
23.权利要求22的GLP-2类似物，其中X11和X16独立地选自Leu和Phe，X24和X28独立地选自Lys和Ser，X20是Ser。
24.权利要求23的GLP-2类似物，其中X11和X16独立地选自Leu和Phe，X20、X24和X28是Ser。
25.权利要求22的GLP-2类似物，其包含X11、X16、X20、X24和X28位残基的下述组合之一：
Lys/Lys/Lys/Lys/Lys；Phe/Phe/Ser/Ser/Ser；Leu/Leu/Ser/Ser/Ser；Leu/Leu/Ala/Ala/Ala。
26.权利要求22的GLP-2类似物，其为ZP2400，ZP2412，ZP2396，ZP2394，ZP2401或ZP2395。
27.根据前述权利要求中任一项的GLP-2类似物，其中小肠特异性GLP-2类似物的11、16、20、24和28位中各个位置的HBP区间对所有位置来说应独立地至少为0≤HBP11、16、20、24、28≤2。
28.权利要求27的GLP-2类似物，其中11和16位的HBP区间为HBP11、 16＝0，20、24和28位的HBP区间独立地为0≤HBP20、24、28≤2。
29.权利要求1-26中任一项的GLP-2类似物，其中胃特异性GLP-2类似物的11、16、20、24和28位中各个位置的HBP区间对所有位置来说应独立地至少为0≤HBP11、16、20、24、28≤2。
30.权利要求29的GLP-2类似物，其中11和16位的HBP区间为HBP11、 16＝0，20、24和28位的HBP区间独立地为0≤HBP20、24、28≤2。
31.用于治疗的前述权利要求中任一项的GLP-2类似物。
32.药物组合物，其包含与载体混合的前述权利要求中任一项的GLP-2类似物或者其盐或衍生物。
33.权利要求32的药物组合物，其中所述GLP-2类似物是可药用的酸加成盐。
34.权利要求32或33的药物组合物，其配制成适于通过注射或输注施用的液体，或者配制成缓慢释放所述GLP-2类似物。
35.权利要求1-26中任一项的GLP-2类似物在制备用于治疗和/或预防胃肠相关疾病的药物中的用途。
36.权利要求35的用途，其中所述胃肠相关疾病是溃疡、佐-埃综合征、消化疾病、吸收障碍综合征、短肠综合征(short-gut syndrome)、盲管综合征、炎性肠病、腹型斯泼卢腹泻(例如由麸质诱发的肠病或乳糜泻病引起)、热带型斯泼卢腹泻、低丙种球蛋白血症型斯泼卢腹泻、肠炎、局限性肠炎(克罗恩病)、溃疡性结肠炎、小肠损伤和短肠综合征(shortbowel syndrome)。
37.权利要求35的用途，其中所述胃肠相关疾病是放射性肠炎、感染性或感染后肠炎或者由于有毒试剂或其它化学治疗剂造成的小肠损伤。
38.权利要求1至26中任一项的GLP-2类似物在制备用于治疗和/或预防化学治疗或放射治疗之副作用的药物上的用途。
39.权利要求39的用途，其中所述化学治疗的副作用是腹泻、腹部痛性痉挛、呕吐或者化学治疗导致的肠上皮的结构性和功能性损伤。
40.权利要求1至26中任一项的GLP-2类似物在制备用于治疗新生儿、骨质疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)所介导疾病的药物上的用途。
41.权利要求1至26中任一项的GLP-2类似物在制备用于治疗和/或预防与营养不良相关之病症的药物上的用途。
42.权利要求41的用途，其中所述与营养不良相关的病症是恶病质或厌食症。
43.核酸分子，其包含编码权利要求1-26中任一项的GLP-2类似物的核酸序列。
44.表达载体，其包含权利要求40的核酸序列与指导其表达的控制序列的组合。
45.转化有权利要求34之表达载体的宿主细胞。
46.产生权利要求1-26中任一项的GLP-2类似物的方法，所述方法包括在适于表达所述GLP-2类似物的条件下培养权利要求41的宿主细胞以及纯化由此产生的所述GLP-2类似物。
47.用于治疗的权利要求43的核酸分子、权利要求44的表达载体或权利要求41的宿主细胞。
48.权利要求43的核酸分子、权利要求40的表达载体或权利要求45的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防胃肠相关疾病或者用于治疗和/或预防化学治疗或放射治疗副作用或者用于治疗新生儿、骨质疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)所介导疾病之药物中的用途。
49.通过施用有效量的权利要求1-26任一项的GLP-2类似物、权利要求43的核酸、权利要求44的表达载体或权利要求45的宿主细胞而在有此需要的患者中治疗胃肠相关疾病的方法。
50.权利要求49的方法，其中所述胃肠相关疾病是溃疡、佐-埃综合征、消化疾病、吸收障碍综合征、短肠综合征(short-gut syndrome)、盲管综合征、炎性肠病、腹型斯泼卢腹泻(例如由麸质诱发的肠病或乳糜泻病引起)、热带型斯泼卢腹泻、低丙种球蛋白血症型斯泼卢腹泻、肠炎、局限性肠炎(克罗恩病)、溃疡性结肠炎、小肠损伤和短肠综合征(shortbowel syndrome)。
51.权利要求49的方法，其中所述胃肠相关疾病是放射性肠炎、感染性或感染后肠炎、或者由于毒性试剂或其它化学治疗剂造成的小肠损伤。
52.一种在有此需要的患者中治疗或预防化学治疗或放射治疗之副作用的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求1-26任一项的GLP-2类似物、权利要求43的核酸、权利要求44的表达载体或权利要求45的宿主细胞。
53.权利要求52的方法，其中所述化学治疗的副作用是腹泻、腹部痛性痉挛、呕吐或者化学治疗导致的肠上皮的结构性和功能性损伤。
54.一种在有此需要的患者中治疗新生儿疾病、肥胖、骨质疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介导疾病的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求1-26任一项的GLP-2类似物、权利要求43的核酸、权利要求44的表达载体或权利要求45的宿主细胞。
55.治疗药盒，其包含癌症化学治疗药物以及权利要求1-26任一项的GLP-2类似物、权利要求43的核酸、权利要求44的表达载体或权利要求45的宿主细胞，它们各自任选地与可药用载体相组合。
56.药物组合物，其包含癌症化学治疗药物以及权利要求1-26任一项的GLP-2类似物、权利要求43的核酸、权利要求44的表达载体或权利要求45的宿主细胞，并与可药用载体相组合。
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