JP2010246502A - 核酸の簡易検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光スキャナーなどの高価な装置を必要とせず、目視により容易で迅速に検出結果が得られる、核酸アレイを用いた核酸の検出方法を提供することを目的とする。
【解決手段】以下の工程を含む核酸の検出方法。：ａ）可視光を透過する担体に固定化された核酸プローブに被検試料を接触させ、核酸プローブと被検試料とを相互作用させる工程 ｂ）前記担体の可視光の透過率を変化させる処理をする工程 ｃ）透過率の変化を目視で判別する工程
【選択図】図１

Description

本発明は、可視光の透過率を変化させる処理により試験結果を可視化する核酸の検出方法に関する。

核酸アレイとは、担体上に多数の核酸プローブ（ 以下、プローブと称する場合もある）を高密度に、互いに混ざり合うことのないようにそれぞれ独立に搭載したものである。核酸アレイ上に搭載されるプローブは、その塩基配列と相補である配列によって構成される核酸分子をハイブリダイゼーションによってキャプチャーするためのセンサーとして働く。

従来、核酸アレイとしては、表面加工を施したガラスやシリコンなどの担体上に、プローブを搭載したものが利用されているが、近年ではゲル担体など、他の手法による担体の改質も行われている。

核酸アレイを利用した核酸検出方法とは、核酸アレイに搭載されているプローブに対して、検査対象となる核酸試料を配列特異的にハイブリダイズさせ、配列特異的に形成したハイブリットを蛍光物質等により検出するというものである。この方法は、複数のプローブに対応する、試料中の核酸塩基配列を含む核酸分子を、定量的又は定性的に調べることができ、複数の核酸塩基配列に関する発現量又は特定の核酸塩基配列の配列自体等を解析するために利用される。

しかしながら、現在、核酸アレイの検出においては蛍光スキャナーなどの高価な装置を必要とし、専門的な機関以外で検出を行うのは困難である。すなわち専門家以外の人にでも容易で迅速に結果が得られる手法が望まれている。

本発明は、蛍光スキャナーなどの高価な装置を必要とせず、目視により容易で迅速に検出結果が得られる核酸の検出方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ハイブリッド形成の有無により核酸アレイ上の担体の可視光の透過率を変化させることで、ハイブリッド形成の有無を目視で判別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の工程を含む核酸の検出方法である。
ａ）可視光を透過する担体に固定化された核酸プローブに被検試料を接触させ、核酸プローブと被検試料とを相互作用させる工程
ｂ）前記担体の可視光の透過率を変化させる処理をする工程
ｃ）透過率の変化を目視で判別する工程

本発明により、蛍光スキャナーなどの高価な装置を必要とせず、目視により容易で迅速に核酸を検出することができる。また、透過率を変化させる処理後の核酸アレイを重ね、上から目視で透過率が変化したプローブ位置を確認することにより、複数の核酸アレイの結果をまとめて取得し、核酸アレイの品質管理にも使用することができる（図１）。

以下、本発明を詳細に説明する。

（１）核酸アレイ
本明細書における核酸アレイについては、透過率の変化を観察できるいかなる材質を使用してもよく、適切なものとしては、透明な材質（例えばガラス、石英、プラスチックおよび他のポリマー）が挙げられる。形状は任意の形または厚さであってよいが、一般に平坦で薄いものが好ましい。具体的にはガラス（例えばガラススライド）またはプラスチック（例えば微量定量プレートのウェル）のような透明基材が好ましい。また、貫通孔にゲルとDNAプローブが保持されたゲル保持貫通孔型核酸アレイも透過率の変化が認識しやすく、好ましい。

（２）核酸プローブの固定化と固定化位置
本明細書における核酸プローブには一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡが含まれる。好ましくは一本鎖ＤＮＡである。核酸プローブを核酸アレイ担体に固定化する方法は、特に制限されず、担体の種類および核酸プローブの種類に応じて、当業者であれば好適な方法を選択できる。例として、担体表面にポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）の高分子を塗布した後、担体表面に核酸プローブをスポッティングして、核酸の荷電を利用して担体上に静電結合させ固定化する方法が挙げられる。また、担体に生体分子と反応性の官能基を導入し、該官能基と生体分子との間で共有結合を形成させることにより、強固に固定化することもできる。このような官能基は、当業者であれば生体分子に応じて適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、ビニル基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボジイミド基、エポキシ基、活性エステル基、スルホ基、イミド基等が挙げられる。

さらには、担体上に固定化せず、ゲルを介して固定化することも可能である。すなわち、ゲル保持貫通孔型核酸アレイのように、基盤に複数の貫通孔が配列されており、各貫通孔内にゲルが保持され、ゲルにはキャプチャープローブを保持方法も挙げることができる。（WO00/53736号）

また核酸プローブを固定化する位置については、透過率を変化させる処理の後、識別可能な図を描くように担体上に固定化することもできる。すなわち同種の核酸プローブが、直線上や曲線上に固定化されており、その直線や曲線が記号を描く場合などが包含される。さらには同種の核酸プローブが、複数のスポットに固定化され、それら複数のスポットが集合して記号を構成する場合も包含される。

（３）被検資料
被検試料としては、核酸を含む分析対象であれば、特に制限されず、動物由来の試料も植物由来の試料も包含される。例えば、動物の体液（例えば、尿、涙、血液、血漿、血清、腹水、汗、リンパ液、髄液）、動物および植物の組織および組織破砕物、動物および植物の細胞培養物、細胞懸濁液、細胞破砕物および細胞培養上清、これらの抽出物等が挙げられる。

被検試料と、核酸プローブとの相互作用は、核酸相補鎖間のハイブリダイゼーションであり、好ましい被検試料としては、核酸増幅産物（例えばＰＣＲ産物、Ｔ７増幅法で増幅したＲＮＡ産物）が含まれる。

（４）可視光の透過率を変化させる処理
本発明において可視光の透過率を変化させる処理とは、被検試料がハイブリダイゼーションによって核酸プローブと相互作用した位置において、発色反応または沈殿反応を生じさせる処理をいう。

例えば、発色反応を生じさせる酵素の例としてアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシターゼ等があげられ、これらの酵素の検出のためには、酵素の種類に対応して比色基質が使用される。検出のための酵素、基質、検出反応等は常法に従って行うことができる。

上記のような酵素に、標識と結合する物質を付しておくことにより、標識が存在する部位において基質反応物が生じ、可視光の透過率を変化させることができる。

具体例としては、被検試料をビオチンで標識しておき、核酸プローブとのハイブリダイゼーション後にアルカリホスファターゼとストレプトアビジンのコンジュゲートを反応させる。適切に洗浄した後、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ブロモクロロインドリルりん酸（ＢＣＩＰ）との混合物を反応させることで、被検試料と反応した核酸プローブスポット部位に、青色から紫色の不溶性沈殿が生じ、可視光の透過率が変化する。

また、これとは別に銀を沈積させることで、可視光の透過率を変化させることもできる。
金粒子は銀(I)イオンと還元剤（例えばヒドロキノン）が存在すると、触媒として作用し、銀(I)イオンを金属銀に還元する。核酸アレイにおいては、表面に捕捉された金粒子を、銀イオンと還元剤を含む溶液で処理する。銀が金粒子上に沈積されるように金は銀イオンの還元を触媒し、初期に沈積された銀はそれ自体銀イオンのさらなる還元を触媒する。結果として、スポット部位で金属銀は金に沈積して粒子が成長し可視光の透過率を変化させる。［Ｔ． Ａ．Ｔａｔｏｎ， ＣＡ． Ｍｉｒｋｉｎ， Ｒ．Ｌ． Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８９， １７５７ （２０００）］

具体例としては、被検試料をビオチンで標識しておき、核酸プローブとのハイブリダイゼーション後に金ナノ粒子とストレプトアビジンのコンジュゲートを反応させる。適切に洗浄した後、銀(I)イオンと還元剤を反応させることで、被検試料と反応した核酸プローブスポット部位に、灰色〜白色の不溶性沈殿が生じ、可視光の透過率が変化する。

上記のような処理を行うと発色反応、もしくは沈殿反応により、透明であったスポットを不透過なスポットに変化させることができ、目視で被検試料と反応した核酸プローブスポット部位を認識することができる。

また上記のような処理を行った後の複数の核酸アレイを重ね、重ねた方向の上、もしくは下から目視で被検試料と反応した核酸プローブスポット部位を確認することで一度に多数の核酸を検出することも可能である。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
本明細書においては核酸アレイとしてゲル保持貫通孔型マイクロアレイを例として説明を行うが、透過率の変化により目視で信号の変化が認識されるものであれば、これら実施例に限定されず、ガラス、プラスチップなどの可視光の透過率の変化を認識できる核酸アレイを用いてもよい。

１．ゲル保持貫通孔型核酸アレイの製造
ゲル保持貫通孔型核酸アレイを、以下の手順で製造した。

(1) プローブの調製
核酸アレイに搭載する核酸プローブとして、下記配列番号１に示す配列情報をもつ5’末端ビニル化核酸を用いた。この5’末端ビニル化核酸の調製方法を以下に示す。
まず、DNA自動合成装置により、アミダイト試薬を用いて、下記配列番号１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成した。最終段階で、アミノリンクTM（PEバイオシステムズ社製）をオリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、5’末端アミノ化核酸（5’-O-アミノヘキシル-核酸）を合成した。なお、現在、他の手法で製造された5’末端アミノ化核酸を購入することも容易である。
続いて、特許第04022149号「ビニル化核酸の製造方法」等を参考に、5’末端アミノ化核酸をビニル化し、その後精製することにより、5’末端ビニル化核酸とした。
「ＯｍｐA」
５’−
GTGTCGGCATAAGCCGAAGATATCGGTAGAGTTATATTGAGCAGATCCCCCGGTGAAGGATTTAA
−３’（配列番号１）

(2) 中空繊維束（中空繊維配列体）の製造
図２に示す配列固定器具を利用して中空繊維束（中空繊維配列体）を製造した。なお、図２中のｘ、ｙ、ｚは互いに直交する３次元軸であり、ｘ軸は上記中空繊維の長手方向と一致する。
まず、孔の中心間距離を0.42mmとして直径0.32mmの孔が縦12列、横19列で合計228個設けられた、厚さ0.1mmの多孔板２１を2枚準備した。これらの多孔板２１を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維３１（三菱エンジニアリングプラスチック社製、カーボンブラック1質量%含有）を１本ずつ通過させた。
各中空繊維３１にｘ軸方向に0.1Nの張力をかけた状態で２枚の多孔板２１の位置を移動させて、中空繊維３１の一方の端部から20mmの位置と100mmの位置の2ヶ所に上記多孔板２１を固定した。即ち、2枚の多孔板２１の間隔を80mmとした。
次いで、上記多孔板間の空間の周囲３面を板状物４１で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
得られた容器の上部から樹脂原料を流し込んだ。樹脂原料としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）製、ニッポラン4276，コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。樹脂原料を流し込んだ後、容器を25℃で1週間静置して樹脂を硬化させた。硬化後、容器から多孔板２１と板状物４１を取り除いて、中空繊維束を得た。得られた中空繊維束の繊維端のうち、一方は封止し、もう一方は開放状態にしておいた。

(3) ゲル充填中空繊維束の製造
次に、下記表１に示す配合割合（プローブに関しては濃度）で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。
調製したゲル前駆体重合性溶液を、384マイクロタイタープレートの所定のウェルに、図３に示した通りに、80μLずつ分注した。なお、図３中の「B」は何も分注していないブランクのウェルを意味する。
次に、上記分注後の384プレート及び中空繊維束をデシケーター内に配置し、デシケーター内を減圧状態にした後、中空繊維束の繊維端が固定されていない一方の端部を、384プレートに分注した溶液中に浸漬した。その後、デシケーター内に窒素ガスを封入して減圧状態を解き、中空繊維の中空部に、プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入させた。次いで、容器内を70℃とし、3時間かけて重合反応を行った。
このようにして、プローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束（ゲル充填中空繊維束）を得た。

(4) 薄片化
上記(3)で得られたゲル充填中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向に厚さ0.25mmで200枚スライスし、得られた薄片シートを核酸アレイとした。

２．被検試料を接触させる工程
(1) 被検試料の調製
配列番号１と完全に相補で５’末端にビオチン標識されている合成核酸を用意し、５０ｆｍｏｌ／μｌに濃度を調整した。

(2) 被検試料のハイブリダイゼーション
以下の組成のハイブリダイゼーション溶液を用意し、６５℃・１６時間、「１．ゲル保持貫通孔型核酸アレイの製造」で製造した核酸アレイにハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション溶液の終濃度は、0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20であった。
＜ハイブリダイゼーション溶液の組成＞
１M Tris／HCl（ｐH７．５） １８μｌ
１M NaCl １８μｌ
０．５％ Tween−２０ １５μｌ
滅菌水 ９８μｌ
ビオチン標識合成核酸 １μｌ
合計 １５０μl

(3) 洗浄
準備
洗浄液A：0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20溶液を滅菌済みの遠心管に10ml入れ、２本用意した。２本を６５℃に保温した。
洗浄液B：0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl溶液を滅菌済みの遠心管にを10ml入れ、１本用意した。これを６５℃に保温した。
ハイブリダイゼーション反応後、以下の手順(a)〜(c)で核酸アレイを洗浄した。
（a） １６時間のハイブリダイゼーションが終了するまでに、洗浄液A、Bを６５℃に保温しておいた。ハイブリダイゼーションが終了した時点でチャンバーから核酸アレイを取り出し、洗浄液Aに浸漬し、６５℃で２0分間静置した。
（ｂ） その後、６５℃の洗浄液Aからもう1本の６５℃の洗浄液AにDNAマイクロアレイを移し、６５℃で２0分間静置した。
（c）その後、６５℃の洗浄液Bに核酸アレイを移し、６５℃で１0分間静置した。

(4) ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ溶液との反応
Streptavidin-Alkaline Phosphatase Conjugate（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社＃RPN1234）を0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl溶液に500倍希釈して６ｍｌ用意し、この溶液中に、（3）までの処理が終了した核酸アレイを取り出して浸漬し、３０分間室温で放置した。

(5) 反応後の洗浄
準備
洗浄液C：室温の0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl／0.05% Tween-20溶液、６ｍｌを滅菌済みの遠心管に入れた。これを4本用意した。
保存液：0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl溶液を滅菌済みの遠心管にを６ml入れ、１本用意した。
ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼとの反応後の核酸アレイを洗浄液Cに浸漬し、ローテーターを用いて、１０ｒｐｍで室温で回転させながら洗浄した。この後、新たな、洗浄液Cにチップを移しいれ、同様の洗浄をあと3回繰り返した。
最後に、保存液に核酸アレイを移しいれた。

３．可視光の透過率を変化させる処理を実施する工程
1-Step NBT/BCIP（PIERCE社 ＃4042）キットの溶液６ｍｌを遠心管に入れ、この中に、前述の「２．被検試料を接触させる工程」が終了した核酸アレイを移しいれ、室温で３分間放置した。その後、滅菌水６ｍｌが入った遠心管に核酸アレイを移しいれた。

４．目視で判別する工程
「３．可視光の透過率を変化させる処理を実施する工程」が終了した核酸アレイを目視で確認したところ、ハイブリダイゼーションが起こったスポット部位（プローブが搭載されたスポット部位）のみ不透過となっていた。
核酸アレイを滅菌水が６ｍｌ入ったシャーレに移し、蛍光灯照明下でデジタルカメラ（ソニー社ＤＳＣ−Ｔ９０）で撮像した画像を図４に示した。

１．ゲル保持貫通孔型マイクロアレイの製造
実施例１と同様に行った。

２．被検試料を接触させる工程
下記(4)工程以外については、実施例１と同様に行った。
(4) ストレプトアビジンー金ナノ粒子溶液との反応
ストレプトアビジンで標識された金ナノ粒子溶液（NanoProbes社＃2016 NANOGOLD(R)- streptavidin 1.4 nm gold particle is attached to streptavidin）を0.12M Tris・HCl／0.12M NaCl溶液に500倍希釈して６ｍｌ用意し、この溶液中に、（3）までの処理が終了した核酸アレイを取り出して浸漬し、３０分間室温で放置した。

３．可視光の透過率を変化させる処理を実施する工程
金ナノ粒子が結合したプローブ位置に銀を沈積させるための溶液を準備した。NanoProbes社、＃2013 LI SILVER (LIS)キット（Initiator/Enhancer 各125 mL）中ののInitiator溶液３ｍｌ、Enhancer溶液３ｍｌを混合し、この中に、前述の「２．被検試料を接触させる工程」が終了した核酸アレイを移しいれ、４℃で１時間放置した。その後、滅菌水６ｍｌが入った遠心管に核酸アレイを移しいれた。

４．目視で判別する工程
「３．可視光の透過率を変化させる処理を実施する工程」が終了した核酸アレイを目視で確認したところ、ハイブリダイゼーションが起こったスポット部位（プローブが搭載されたスポット部位）のみ不透過となっていた。
核酸アレイを滅菌水が６ｍｌ入ったシャーレに移し、蛍光灯照明下でデジタルカメラ（ソニー社ＤＳＣ−Ｔ９０）で撮像した画像を図５、図６に示した。

プローブの配置を図７に変更した以外は実施例１と同様に行った。本実施例のプローブの配置（図７）は、実施例１のプローブの配置（図３）と比較して、Ａ行１５〜１９列のみ異なるものである。これを擬似欠陥チップとした。

その後、実施例１の処理を行った核酸アレイ３枚と上記の核酸アレイ1枚の計４枚を重ねて、目視でハイブリダイゼーションしているパターンを確認した。結果は図８のようになった。図６と比較し、Ａ行１５〜１９列の位置のスポットで可視光が透過しなくなった。
すなわち、擬似的に欠陥（例えばプローブのコンタミネーション）が生じたDNAマイクロアレイが混入している場合、確認できることが示された。

本発明により複数の核酸アレイを検出する際のモデル図である。 配列固定器具を示した図である。 実施例１の核酸アレイのプローブ配置図である。 実施例１の核酸アレイの検出結果である。 実施例２の核酸アレイの検出結果である。 図５の四角で囲まれた部分の拡大図である。 実施例３の核酸アレイのプローブ配置図である。 実施例１の核酸アレイと実施例３の核酸アレイとを重ねた検出結果である。

１１ 孔
２１ 多孔板
３１ 中空繊維
４１ 板状物

Claims (4)

1. 以下の工程を含む核酸の検出方法
   ａ）可視光を透過する担体に固定化された核酸プローブに被検試料を接触させ、核酸プローブと被検試料とを相互作用させる工程
   ｂ）前記担体の可視光の透過率を変化させる処理をする工程
   ｃ）透過率の変化を目視で判別する工程
2. 可視光を透過する担体がゲルである請求項１記載の検出方法
3. 可視光の透過率を変化させる処理が、沈殿物を沈積させる処理である請求項１又は２記載の検出方法
4. 透過率の目視での判別が、複数の核酸アレイを重ねて目視するものである請求項１〜３記載の検出方法