JP2010131024A - 遺伝子転写を調節する特性を含むdna配列及びそのようなdna配列を検出し且つ使用するための方法 - Google Patents
遺伝子転写を調節する特性を含むdna配列及びそのようなdna配列を検出し且つ使用するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列を検出し、任意的に選択するための方法であって、転写システムに様々なフラグメント含有ベクターを備えることを含み、前記ベクターは、i)遺伝子転写を抑制する特性を有するエレメント、及びii)レポーター遺伝子の転写を指示するプロモーターを含む。また、前記方法による、様々な分野たとえば制限されるものではないがタンパク質生産、診断、形質転換植物及び動物、並びに治療分野におけるそれらの使用方法。
【選択図】図1
Description
テスト核酸のコレクションを用意すること、
プロモーターの転写制御下にあるテスト核酸及び第1のレポーター遺伝子を含む発現ベクターのコレクションを生成すること、
細胞に発現ベクターの前記コレクションを備えること、
それらの後代を含む細胞又はベクターを選択すること、ここで前記第1のレポーター遺伝子の転写は抑制されている、及び
前記細胞中の前記テスト核酸を識別すること、
を含む。前記識別されたテスト核酸は、前記プロモーター機能を抑制する能力を有し、従って遺伝子転写を抑制する特性を有する。好ましくは、前記識別されたテスト核酸はまた回収され且つクローニングされる。前記特性を有するDNA配列の不存在下におけるレベルと比較して、前記プロモーターに物理的にリンクされた場合、前記特性は前記プロモーターからの転写のレベルを減少する能力を少なくとも一部分含む。好ましい実施態様では、前記遺伝子転写抑制特性は、遺伝子転写を抑制するクロマチン特性を有する。すなわち、転写のレベルの前記減少は、遺伝子転写を抑制する構成を有するクロマチンの結果である。この構成は好ましくは、前記プロモーターを包含する。しかしながら、前記構成がエンハンサーなどを包含することもまた可能であり、それによって前記プロモーター上で前記エンハンサーの転写を助長する効果を少なくとも一部分不活性にする。特に好ましい実施態様では、遺伝子転写を抑制するクロマチン特性を有する前記DNA配列はポリコーム−グループ様応答エレメントを含む。
材料及び方法:
プラスミド及び菌株
STARエレメントのための選択ベクター、pSelect-SV40-zeo(「pSelect」、図1)は、次のようにして構築される:pREP4ベクター(Invitrogen V004-50)が、プラスミドバックボーンとして使用される。それは、霊長類の細胞株における高いコピーのエピソーマル複製のために、複製のイプシュタイン(Epstein)バール(Barr)oriPオリジン及びEBNA-1核性抗原を提供し、;哺乳動物細胞における選択のために、チミジンキナーゼプロモーター及びポリアデニレーション部位を有するハイグロマイシン(hygromycin)耐性遺伝子を提供し;及び大腸菌における維持のために、アンピシリン耐性遺伝子及び複製のcolE1オリジンを提供する。ベクターは、XbaI及びNheI制限部位の間に4つの連続したLexAオペレーター部位を含む(ブンケル及びキングストン、1994年)。LexAオペレーターとNheI部位の間に、次の制限部位から成るポリリンカーが埋め込まれる;HindIII-AscI-BamHI-AscI-HindIII。NheI部位とSalI部位の間に、SV40プロモーター及びポリアデニル化部位を有するゼオシン(zeocin)耐性遺伝子があり、それはpSV40/Zeo(Invitrogen V502-20)から導出される;これは、STARスクリーンのための選択可能なマーカーである。
pSelectにおける遺伝子ライブラリーは、トランスフェクション試薬の提供者(Life Technologies)によって推奨されているように、リン酸カルシウム沈殿(グラハム及びファン デル エブ、1973年;ウィグラーら、1978年)によってU-2 OS/Tet-Off/LexA-リプレッサー細胞株内にトランスフェクションされる。トランスフェクションされた細胞は、ハイグロマイシン選択(25マイクロg/ml)及びテトラサイクリン抑制(ドキシサイクリン(doxycycline)、10ナノg/ml)下で、1週間(50% コンフルエンス(confluence))培養される。その後ドキシサイクリン濃度は、LexA-リプレッサー遺伝子を誘発するために0.1ナノg/mlにまで減少され、そして2日後にゼオシンが250マイクロg/mlまで添加された。細胞はさらに、(エンプティpSelectでトランスフェクションされた)コントロール培養がゼオシンによって殺されるまで、更に4〜5週間培養される。
STARエレメント機能的特徴付け。ヒトゲノムDNA並びにHOX及び1q12座のスクリーンは、17個の正真正銘のSTARエレメントを生じた。基準は、(1)エレメントが、pSelectに基づくクローンを宿主U-2 OSヒト骨肉腫細胞株内に再トランスフェクションした後にSTAR活性を示した(初期スクリーンで発現される抗リプレッサー活性はプラスミド特異的であり、且つ宿主細胞内における人工的な変化によるものではないことを示す);(2)エレメントが、ヒトゲノム配列データベースにおける配列と一致するDNA配列を含む(クローンは例えばバクテリア起源又はベクター起源からの汚染するDNA配列を含まないことを示す)。
表2は、17個のSTARエレメントの夫々の染色体位置、ならびにすぐ隣の遺伝子の識別及びエレメントの反復DNA含量をリストする。STARエレメントは多くの染色体中に分布される。それらは、それらの真のDNA配列及び反復DNA含量において多様であり、且つ近隣の遺伝子との様々な程度の関連を示す。
材料及び方法:
SINCスクリーンのためのプラスミド、pSINC-Select(「pSS」、図6)は、次のようにして構築される:pREP4ベクター(Invitrogen V004-50)が、プラスミドバックボーンとして使用される。それは、複製のイプシュタイン(Epstein)バール(Barr)oriPオリジン及び霊長類細胞株における高いコピーのエピソーマル複製のためのEBNA-1核性抗原を提供し;哺乳動物細胞における選択のために、チミジンキナーゼプロモーター及びポリアデニレーション部位を有するハイグロマイシン(hygromycin)耐性遺伝子を提供し;及びアンピシリン耐性遺伝子及び大腸菌における維持のための複製のcolE1オリジンを提供する。ベクターはTet-Offプロモーターを含み、それはTet-Off転写的調節システムによる調節のために、プラスミドpUDH10-3(ゴッセン及びビュヤード、1992年)からのタンデムテット(Tet)応答エレメント(TRE)から成る。TREは、融合タンパク質(シトシンデアミナーゼ/ウラシルフォスホリボシルトランスフェラーゼ;Invivogen porf-codaupp)をコードするcodA::upp遺伝子の発現を調節する。これは、いわゆる「自殺遺伝子」である;codA::upp酵素の活性は、プロドラッグ 5−フルオロシトシン(5-FC)を毒性薬物 5−フルオロウラシル(5-FU)に転化し、それによってアポトーシス及び細胞死をもたらす(ミューレンら、1992年;ティラビーら、1998年;ウェイ及びフーバー、1996年)。Tet-Offプロモーターの上流に、スクリーニングのためのSau3AI-消化されたゲノムDNAをクローニングするためのBglII制限部位がある。pREP4 DNAは、クローニングされたSINCエレメントによってpREP4コンポーネントにおける必須のプラスミドエレメントのサイレンシングを防止するためにSTAR配列によってゲノムDNA及び自殺遺伝子から分離される。
選択期間の終わりでは、コロニーはコントロール培養(エンプティpSS)において明らかでなく、且つ多くのコロニーがゲノムDNAを有するpSSを含む培養内で明らかである。これらの生き残ったクローンは、候補SINCエレメントを含む。これらの生き残ったクローンは、候補SINCエレメントを含む。エレメントはPCRによって回収され且つ標準クローニングベクター、pBluescript内にサブクローニングされる。エレメントのDNA配列が決定され、そしてヒトゲノム配列と比較される(表3)。全ての場合において、シーケンスされたエレメントは、予想されたように、22番染色体上に見つけられる。
背景:
部位特異的組み換えは、異種のDNAをそれらの染色体の位置から正確に除去するために使用される。これは、2つのシステムの1つによって日常的に実行されている:バクテリオファージP1のcreリコンビナーゼ及びloxPターゲット(フェングら、1999年)、又は酵母のFLPリコンビナーゼ及びFRT(FLPリコンビナーゼターゲット)(ウィグレイら、1994年)。これらのシステムでは、(レポーター遺伝子及び/又は選択可能なマーカーを通常含む)DNA領域は、loxP又はFRTターゲットによって染色体中で隣接される。その後、リコンビナーゼの活性は、染色体から該DNA領域の正確な切除を触媒する。リコンビナーゼは、その2つの認識配列を単一部位に変え(resolve)、それらの間の配列を削除する。従って、DNAの全長は、リコンビナーゼの導入又は活性化が起きると、イン ビボ(invivo)で引き続き削除されるべきターゲット部位により隣接されなければならない(シュヴェンクら、1995年;ディメッキ、1996年)。Cre及びFlpリコンビナーゼは、最小の6個(loxP)又は8個(FRT)の塩基対をもつスペーサーによって分離された、2個の13塩基対の反転された反復の間での組み替えを触媒する(セネコフら、1985年)。loxP配列はATAACTTCGTATAであり、且つFRT配列はGAAGTTCCTATACである。
慣用的なDNAクローニング(サムブルックら、1989年)を使用し、(レポータータンパク質例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする)レポーター遺伝子(ビィリューゼンら、1997年)又はルシフェラーゼ(ヒメス及びシャノン、2000年)が構築され、それはSTARエレメントの対によって、SINCエレメントの対によって又はSTAR/SINC組み合わせエレメントの対によってプラスミドにおいて隣接される。各場合において、エレメントはリコンビナーゼターゲット部位によってそれら自身隣接される。1つのエレメントはloxP部位の対によって隣接され、及び他はFRT部位の対によって隣接される(図1)。転写すると、プラスミドは細胞の小さいパーセントで宿主染色体内に組み込まれ、そして組み込まれたものは、抗生物質耐性によって選択される。同様の構築物は3つのテストエレメント(STAR、SINC、STAR/SINC)の夫々のために作成される。
背景:STAR又はSINCエレメントを含むDNAフラグメントが、夫々pSelect(図1)又はpSS(図6)プラスミドを使用して遺伝子の選択によって単離される。このセクションはSTAR又はSINC活性を有するそれらのフラグメント内のDNA配列を特徴付けるためのアプローチを記載する。
DNA配列:オリゴヌクレオチドが、DNAフラグメントをシーケンスするためにpSelect及びpSS選択プラスミドの配列に基づき設計される。フラグメントはジデオキシ連鎖終止技術(サンガーら、1977年)を使用してシーケンスされる。その後、DNA配列は、公のヒトゲノム配列データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/cgi-bin/Entrez/hum_srch?chr=hum_chr.inf&query)を使用して染色体位置に配置される。フラグメント配列の近接における遺伝子及び遺伝子密度は、ゲノム配列アノテーションから記録される。それらの遺伝子の転写的活性は、公のDNAマイクロアレイのデータベース(http://arrays.rockefeller.edu/xenopus/links.html)及びSAGE(Serial Analysis of Gene Experssion;http://bioinfo.amc.uva.nl/HTM-bin/index.cgi)データから決定される。いったんSTAR及びSINC配列に対する位置の情報が編集されると、データは基礎となるコンセンサス配列の観点から分析される。コンセンサス配列又はトレンド(これは、特定のヌクレオチド組み合わせに豊む例えばC及びG塩基に豊むローカルエリアであると理解される)が、類似性探索アルゴリズム例えばclustalw(ヒギンズら、1996年)及びブロサム類似性スコアリング(blosum similarity scoring)(アルツシュル及びギッシュ、1996年)を使用し検出される。その後、任意の基礎となるコンセンサス又はトレンドは、BLAST調査(アルツシュルら、1990年)を実行することによってゲノムスケール上の他の潜在的なSTARを識別するために使用される。従来の研究は、既知のインシュレーター及び境界エレメントに結合する転写調節タンパク質を識別した(ガスツナーら、1999年;ゲラシモヴァ及びコルセス、1998年)。記載されている実施例では、タンパク質結合部位は、インシュレーター又は境界機能に必須であるところのDNase I 過敏部位と一致する。STARエレメントが既知の調節タンパク質によって結合されるという仮定は、STARエレメントにおいて生じる配列モチーフのための転写ファクターのTRANSFACデータベース(http://transfac.gdf.de/TRANSFAC/)を検索することによって試験される。STAR又はSINCコレクションのメンバー間で共通である配列モチーフは、対応する転写ファクターがそのエレメントに結合するところの指標である。
背景:
STARエレメントは、単一及び複数の導入遺伝子の発現を最適化するために使用される。STARエレメントの単一対が大きい又は複数の導入遺伝子をサイレンシングから防ぐことができるかを決定するために、STARエレメントが活動するところの範囲を決定することが必要である。同様の情報が、SINCエレメント及びSTAR/SINC組み合わせのために決定される。
STAR及びSINCエレメントは、次のようにpSelect又はpSS夫々に基づく誘導プラスミドを使用して、距離を超えるそれらの機能を試験される。500bpから10kbのランダムDNAフラグメントのライブラリーは、標準DNAクローニング技術(サムブルックら、1989年)によって組み立てられる。STAR又はSINC活性を有しないフラグメントは、上記したようにpSelect及びpSSで試験することによってこのライブラリーから選択される。STARエレメント及びSTAR/SINC組み合わせのために、これらのフラグメントは適切なpSelectプラスミド(図1)におけるクローニング部位とレポーター遺伝子のプロモーターとの間に挿入される。プラスミドのこのセットは、U-2 OS細胞株内にトランスフェクションされ、そして発現が上記したように測定される。レポーター遺伝子発現の強度は、プロモーターからのSTARエレメントを分離するランダムフラグメントの長さに関連させられる。SINCエレメントは、類似の様式で評価される:ランダムDNAフラグメントは適切なpSSプラスミドのSINCエレメントとプロモーターとの間に挿入され、そしてレポーター遺伝子の抑制の程度は、ランダムDNAフラグメントの長さに関連させられる。
STARエレメントのための遺伝的選択における自然に生じるSINCエレメントの使用
背景:
STARエレメントのための現在のスクリーンは、選択プラスミドにおいて選択可能なマーカーの抑制を提供するためにキメラlexA-PcGタンパク質を使用する。自然に生じるSINCエレメントを使用し選択を繰り返すことによって、これらの自然に生じるSINCエレメントによる抑制活性に対して特異的であるSTARエレメントが識別される。
現在の選択からのSINCエレメントは特徴付けられ、機能的特性及びDNA配列特性に基づきクラスに分類される(機能的特性は抑制の強度を含む;配列特性は識別可能な保存されたモチーフを含む;実施例3参照)。各クラスからの代表的なエレメントは、標準DNAクローニング技術(サムブルックら、1989年)を介してpSelectプラスミドにおけるlexA結合部位を置換するために使用される。遺伝子バンクは、これらの新しいプラスミドの各々で作成され、そして記載されたように(ファン デル フラッグら、2000年)新しい、SINC特異的なSTARエレメントを識別するために使用される。これは、全体のゲノムDNAを用い且つ使用されるSINCエレメントをまた含むBACクローンからのDNAを用いて行われる。
STARエレメント及びSINCエレメントの最大長の決定
背景:
STARエレメントは、pSelectプラスミドを使用して回収されたDNAのフラグメントとしてクローニングされ、それは2kbよりも少ないゲノムDNAフラグメントでおこなわれる。しかしながら、これらは、より拡張されたSTARエレメントの部分であってもよい。拡張されたSTAR活性は、次の実験によって試験される。
pSelectにおいてクローニングされたSTARエレメントは、ヒトゲノム配列にマッピングされる。それらがより拡張されたSTARエレメントの部分であるかを決定するために、クローンを包含する4kbの領域が、PCRによって増幅され且つ標準の組み換えDNA技術(サムブルックら、1989年)によってpSelect及び/又はpSDHプラスミド内にクローニングされる。生じたプラスミドは、U-2 OS細胞内にトランスフェクションされ且つ上記したようにレポーター遺伝子発現についてアッセイされる;オリジナルの2kb STARエレメントを含むプラスミドは、対照として含まれる。3つの可能な結果が予想されうる:(1)、対照及び拡張されたSTAR単離物による同様の発現、STARエレメントがオリジナルの2kbフラグメントに限られることを示す;(2)拡張されたSTAR単離物による低い発現、STARエレメントが2kbフラグメント内に含まれ且つ長距離で効果的に活動しないこと又は拡張されたフラグメントがSINCエレメントを含むことを示唆する;(3)拡張されたSTAR単離物によるより高い発現、拡張された領域がより完全なSTARエレメントを含むことを示唆する。結果(3)の場合、実行は6kbのより大きいPCRフラグメントで繰り返される。
背景:
STARエレメント及びSINCエレメントの調節特性は、ローカルなクロマチン構造に関連付けられ、それはDNAそれ自身によって及びDNAに関連付けられたタンパク質によって決定される。遺伝子発現における変化に関連付けられるクロマチン構造の変化は、巨大分子の2次的修飾、特にDNAのメチル化又はヒストンタンパク質のアセチル化によってしばしば生成される。STARエレメント及びSINCエレメントで且つ近傍の導入遺伝子で生じる2次的変性を識別することは、これらのエレメントの特質(hallmarks)を提供する。
DNAメチル化:STARエレメント又はSINCエレメント又はそれらの組み合わせは、標準技術(サムブルックら、1989年)によってpSelectプラスミド内にクローニングされる。U-2 OS細胞は、レポーター遺伝子での基本的DNAメチル化を決定するために、これらのプラスミドで且つ対照としてSTARエレメント又はSINCエレメントを欠くpSelectで安定にトランスフェクションされる。細胞は収穫され且つクロマチンは標準手法(トーマス、1998年)によって精製される。該DNAは、別の反応(サムブルックら、1989年)においてHpaII及びMspI制限エンドヌクレアーゼで消化される。これらの制限酵素の両方は、非メチル化配列CCGGを切断することができる。外側のCがメチル化される場合、MspI及びHpaIIの両方が開裂できない。しかしながら、内部のCがメチル化される場合、HpaIIと違って、MspIは配列を開裂できる。該DNAがササンブロット法に付され、そして該ブロットが間接的なエンドラベリング(パジン及びカドナガ、1998年)によって解析される。対照として、裸の対応するpSelectプラスミド、メチル化されていないDNAは記載された酵素でまた切断され、そしてサザンブロット法に付される。
背景:
クロマチンは、DNA、ヒストン及び非ヒストンタンパク質から成る。該ヒストンは、ヌクレオソームを作成するためにDNAの〜150bpによってラップされているコア粒子を形成する。ヌクレオソームは、リンカーDNAの50〜75bpによって分離される。染色体のDNA上に安定に配置されたヌクレオソームは遺伝子発現を抑制し、ヌクレオソームを排除する又はさもなくばクロマチンを改造するファクターは、この抑制を克服することができる。染色体の領域におけるヌクレオソームの配置は、ミクロコッカル(micrococcal)ヌクレアーゼ(MNase)アッセイによって分析される;MNaseは、リンカーDNAにおいて優先的にクロマチンを切断する。同様に、DNAのある領域は、構成的に非ヒストンタンパク質にさらされ、且つこれらはしばしば調節領域すなわちシス−行動(acting)調節ファクターが結合するところの部位である。実験的に、これらの部位は酵素DNaseIによる消化に対して過敏である。
レポーター遺伝子上の及びSTARエレメント又はSINCエレメントのいずれか上のヌクレオソームの位置を決定するために、MNaseが使用される(サルツ及びジョスト、1993年)。核は、培養されたU-2 OS細胞から精製され且つ上記したように(ヒストンアセチル化)MNaseで消化される。STARエレメント及びSINCエレメント又はレポーター遺伝子におけるDNase I過敏部位を探すために、精製された核が上記したように(ウォールラスら、1998年)適切な濃度(例えば、100マイクロg/mlゲノムDNA及び20〜100 U/ml DNase I)でDNaseIで処理される。裸の(naked)DNAは、対照としてDNase Iで消化される。両方の技術にとって、レポーター遺伝子及びSTARエレメント又はSINCエレメントが、(タナカら、1996年;ファン デル フラッグら、2000年)に、記載されているように、プライマーの拡張又は間接的なエンドラベリング及びサザンブロット法を使用し詳細マップされる。MNaseアッセイは、STARエレメント若しくはSINCエレメント又はレポーター遺伝子上のヌクレオソームの位置に対応するオートラジオグラム上の離れたバンドの位置(ladder)を明らかにする。DNase I過敏部位は、裸のDNA対照において存在しない又は比較的顕著でないところの生じたオートラジオグラムにおける離れたバンドとして現れる。
背景:
あるインシュレーター又は境界エレメントが組織特異性を表示しうることが報告されている(タカダら、2000年)。STARエレメントは、インシュレーター及び境界エレメントと共通の多くの特性を有する。無差別の及び組織特異的STARエレメント及びSINCエレメントは導入遺伝子的用途においてバイオテクノロジー的価値を有する。下記に記載されたアッセイは、細胞型依存性を評価するために実行される。エレメントの細胞及び組織特異性は、DNAマイクロアレイの公知のデータベース(http://arrays.rockefeller.edu/xenopus/links.html)及びSAGE(Serial Analysis of Gene Expression;http://bioinfo.amc.uva.nl/HTM-bin/index.cgi)データを使用しヒトゲノムにおけるエレメントの近傍の遺伝子の発現を検査することによってさらに検査される。
STARエレメントはpSDHプラスミド内で試験され、且つSINCエレメントはpSSプラスミド内で試験される。3つの細胞株が、標準のプロトコルを使用しトランスフェクションされる:ヒト U-2 OS骨肉腫細胞株(ヘルディンら、1986年)、アフリカサバンナモンキー(African green monkey)の腎臓由来のヴェロ(Vero)細胞株(シミズら、1967年)、及びチャイニーズハムスター卵巣由来のCHO細胞株(カオ及びプック、1968年)。すべての3つの細胞型において機能することができるエレメントは、無差別として分類される。該細胞株の1つ又は2つにおいてのみ活性を示すものは、それらの細胞型機能性において制限されていると分類される。
STARエレメント及びSINCエレメントは、2つのプロモーター、完全なサイトメガロウィルス(CMV)プロモーター又はテトラサクリン応答エレメント(Tetracycline Response Element)及び最小のCMVプロモーター(tTA転写的活性剤との組み合わせで)を用いて機能との関連で、現在選択され且つ試験される。プロモーター特異性を評価するために、STAR及びSINC機能が、他の一般に使用されるウィルスプロモーターすなわち猿のウィルス型40(SV40)初期及び後期プロモーター、アデノウィルスE1A及び主な後期プロモーター、並びにラウス肉腫ウィルス(Rous sarcomavirus;RSV)長末端反復(ドールら、1996年;スミスら、2000年;ウィバー及びカダン、2000年;クスゥら、1995年)で試験される。これらのプロモーターの夫々は、STARエレメント又はSINCエレメントとともに標準の技術(サムブルックら、1989年)によってpSelect及びpSSプラスミド内に夫々別個にクローニングされる。生じたプラスミドは、上記したように、U-2 OS細胞株内にトランスフェクションされ、且つレポーター遺伝子発現についてアッセイされる。これらのプロモーターをサイレンシングさせるSINCエレメントの能力又はサイレンシングに対して保護するためのSTARエレメントの能力は、STARエレメント又はSINCエレメントを欠くプラスミドとの比較によって決定される。
背景:
改善されたSTARエレメント及びSINCエレメントが開発される。改善は抗抑制又は抑制活性の増加した強度並びに誘発可能な及び組織特異的な活性を有するエレメントをもたらすこれらの改善は組み合わせの技術によって作成される。
強制された進化:エラープローンPCR(Error Prone PCR)(チェリーら、1999年;ヘンケ及びボルンショイヤー、1999年)は、エレメント当たり平均で1〜2の点変異を導入するために使用される。突然変異したエレメントは、例えば蛍光活性化されたセルソーティング及び抗生物質耐性(ベネットら、1998年)によってレポーター選択可能なマーカー融合タンパク質を含むpSelect(又はpSS)プラスミドを使用しスクリーンされる。エラープローンPCR及び選択の次の段階は、活性において更なる改善を有するエレメントを導出するために実行される。
調節可能なSTARエレメント及びSINCエレメントは、それらをシグナル依存性DNA結合性タンパク質のための結合部位と結合することによって生成される。1つの例では、これはSTAR若しくはSINC又はSTAR/SINC組み合わせ及びグルココルチコイド応答エレメント(GRE: glucocorticoid response element)の並置を含む。グルココルチコイド刺激の不存在下、STARエレメント又はSINCエレメントは、記載されているように機能する。刺激に応答して、自然に生じるグルココルチコイドレセプターはGREに結合し且つSTAR又はSINC機能を妨害する。
慣用のDNAクローニング(サムブルックら、1989年)を使用し、GREは、STARエレメント又はSINCエレメントに隣接したpSelect又はpSSベクター内に夫々導入される。該プラスミドは、上記したようにU-2 OS細胞内にトランスフェクションされる。細胞は、2つの培地に分割される;1つは、グルココルチコイド(10マイクロM)で処理される。レポーター遺伝子の発現は測定され且つ2つの培地間で比較される。発現における相違は、シグナル依存性DNA結合性タンパク質の活性によってSTAR及びSINC機能を調節する能力を示す。
これらの特性を試験し又は助長することは、種々の細胞株における培養、抗生物質的選択なしの長期間培養を含む(実施例8及び10)。
背景:
導入遺伝子学において、選択マーカーに頼ることは、2つの欠点がある:選択剤は通常高価であり且つ細胞に代謝コスト(metabolic cost)を与え、且つ特に導入遺伝子それ自身が製品(例えば作物、遺伝子治療ベクター)内にある場合、選択可能マーカーを導入遺伝子用途に含めることに対する法律的且つ倫理的な異議がある。STARエレメント及びSINCエレメントは、遺伝子組み換え単離物を確立した後に選択を維持することの必要性を減少し又は除去する。従って、耐性遺伝子は、導入遺伝子発現の減少した損失を有する部位特異的組み替えによって形質転換されたゲノムから除去されうる。
レポーター遺伝子に隣接する染色体的に統合されたSTARエレメントを含む安定的にトランスフェクションされたU-2 OS細胞株は、上記したようにトランス作用性の(trans-acting)抗生物質耐性プラスミドとpSDHプラスミドの同時トランスフェクションによって生成される。実験は、選択の不存在下に長期に渡る(3〜6ヶ月)培養の間にこれらの細胞株におけるレポーター遺伝子発現レベルの安定性を試験することを含む。これは、pSDHプラスミドにおけるルシフェラーゼ又はGFPレポーター遺伝子に隣接するSTARエレメントで試験される。抗生物質耐性遺伝子は、抗生物質選択マーカーがリコンビナーゼターゲット部位によって隣接されるところの(pSDHに基づく)発現プラスミドを構築することによって除去される。選択可能なマーカーは次に、上記したように(実施例2)、リコンビナーゼ活性によって切り取られる。
STARエレメントは、導入遺伝子発現ユニットに対する転写抑制機能の効果をブロックするために機能する。これらの抑制影響は、ヘテロクロマチン(「位置影響」、(ボイヴィン及びデュラ、1998年))に又は導入遺伝子の近傍のコピー(「反復導入された遺伝子サイレンシング(repeat-inducedgene silencing)」、(ガーリックら、1998年))によりうる。異種タンパク質生成のためのSTARエレメントの2つの利点は、高発現性プライマリー組み換え宿主細胞を見い出すことの増加した予測可能性、及び生成サイクルの間の増加した収率である。これら利益は本実施例において示される。
pSDHベクター及びSTAR含有誘導体の構築:pSDH-Tetベクターは、プライマーC67及びC68を使用しプラスミドpREP4-HSF-Luc(ファン デル フラッグら、2000年)からのルシフェラーゼオープンリーディングフレームのポリメラーゼ連鎖反応増幅(PCR)(PCRプライマー及び突然変異オリゴヌクレオチドのすべてが表5にリストされている)、及びSacII/BamHIフラグメントをSacII/BamHI-消化されたpUHD10-3へ挿入すること(ゴッセン及びビュヤード、1992年)によって構築された。ルシフェラーゼ発現ユニットはプライマーC65及びC66で再増幅され且つそれを2つのマルチクローニング部位(MCSI及びMSCII)に隣接するためにpUHD10-3内に再挿入された。次に、AscI部位は、EcoRIでの消化及び(アニールされたオリゴヌクレオチドD93及びD94を含む)リンカーの挿入によってMCSI内に導入された。CMVプロモーターは、ベクター pSDH-CMVを生成するために、プライマーD90及びD91を用いてプラスミドpCMV-Bsd(Invitrogen K510-01)から増幅され及びSalI/SacII消化且つライゲーションによりpSDH-Tet内のTet-Offプロモーターを置換するために使用された。このベクターにおけるルシフェラーゼオープンリーディングフレームは、次のようにしてSEAP(Secreted Alkaline Phosphatase)によって置換された:ベクター pSDH-CMVは、SacII及びBamHIで消化されそして平滑(blunt)にされた:SEAPオープンリーディングフレームは、ベクター pSDH-CSを生成するために、EcoRI/SAlI消化によってpSEAP−ベーシック(Clontech 6037-1)から分離され、平滑にされ且つpSDH-CMV内にライゲーションされた。SV40プロモーターの制御下のピューロマイシン耐性遺伝子は、プライマーC81及びC82を使用し、PCRによってプラスミドpBabe-Puro(モルゲンスターン及びランド、1990年)から単離された。これは、pGL3-puroを生成するために、NcoI/XbaIで消化されたベクターpGL3-コントロール(BamHI部位が除去された)(Promega E1741)内にライゲーションされた。pGL3-puroは、SV-40-ピューロ耐性遺伝子を分離するためにBglII/SalIで消化されて、それは平滑にされ且つ、NheI消化された、平滑末端(blunt-ended)pSDH-CS内にライゲーションされた。生じたベクターpSDH-CSPは、図7に示される。全てのクローニングステップは、従来技術で知られている方法(サムブルックら、1989年)に従い、試薬の製造者によって提供される指示書に従い実行された。
チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO-K1(ATCCCCL-61)が、HAMS-F12培地+2mMグルタミン、100 U/mlペニシリン及び100マイクログラム/ml ストレプトマイシンを含む10%ウシ胎仔血清(Fetal Calf Serum)内で、37℃/5%CO2下で培養された。細胞は、製造者によって記載されたようにSuperFect(QIAGEN)を使用し、pSDH−CSPベクター及び、MCSI及びMSCIIにおいてSTAR6又はSTAR49を含むその誘導体でトランスフェクションされた。簡単に言えば、細胞は、培養容器に接種され且つ70〜90%コンフルエンスにまで一晩成長された。SuperFect試薬は、6マイクロリットル/マイクログラムの割合(例えば10cmペトリ皿に、20マイクログラムDNA及び120マイクロリットルSuperFect)で(PvuIでの消化によって本実施例において線形化された)プラスミドDNAと一緒にされ、且つ細胞に添加された。一晩のインキュベーション後、トランスフェクション混合物は、新鮮な培地で置き換えられ、及びトランスフェクションされた細胞はさらにインキュベートされた。一晩の培養後、5マイクログラム/ml ピューロマイシンが添加された。ピューロマイシン選択は2週間内に完了し、その後個々のピューロマイシン耐性CHO/pSDH-CSPクローンがランダムに分離されそしてさらに培養された。
CHO/pSDH-CSPクローンの培養培地におけるSEAP活性(ベルゲルら、1988年;ヘンソルンら、1988年;カイン、1997年;ヤングら、1997年)は、製造者(Clontech Great EscAPe kit #K2041)によって記載されるように決定された。簡単に言えば、培地の分取は、65℃で熱不活性化され、その後アッセイバッファー及びCSPD化学発光法基質と一緒にされ、そして室温で10分間インキュベートされた。その後、基質変換の速度は、照度計(luminometer)(Turner 20/20TD)において決定された。細胞密度は、Coulter ACT10 細胞カウンターにおいてトリプシン化された細胞を算えることによって決定された。
ヒト骨肉腫U-2 OS細胞株(ATCC #HTB-96)がダルベッコMEM培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium)+グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン(上述)を含む10%ウシ胎仔血清内で、37℃/5%CO2下で培養された。細胞は、SuperFect(上述)を使用し、(プラスミドpBabe-Puroとともに)pSDH-CMVベクター及び、MCSI及びMSCIIにおいてSTAR6又はSTAR8を含むその誘導体で同時トランスフェクションされた。ピューロマイシン選択は2週間内に完了し、その後個々のピューロマイシン耐性U-2OS/pSDH-CMVクローンがランダムに分離されそしてさらに培養された。
ルシフェラーゼ活性(ヒメス及びシャノン、2000年)が、照度計(Turner 20/20TD)を使用しアッセイキット製造者の指示書(Roche 1669893)に従い、再懸濁された細胞においてアッセイされた。合計細胞タンパク質濃度は、製造者の指示書(Sigma B-9643)に従いビシンコニン酸(bicinchonic acid)方法によって決定され、且つルシフェラーゼデータを正規化するために使用された。
pSDH-CSPベクター又はSTAR6若しくはSTAR49を含むpSDH-CSPプラスミド(表6)を含む組み換えCHO細胞クローンは、3週間培養された。その後、培養上清におけるSEAP活性が決定され、且つ細胞数に基づき表わされる(図8)。見られうるように、発現ユニットにおいてSTARエレメントを有するクローンは分離され、それはSTARエレメントを含まない発現ユニットのクローンよりも2〜3倍高いSEAP活性を発現する。その上、STARのないクローンの最大の活性の又はそれより上のSEAP活性を発現するSTAR含有クローンの数は、かなり高い:STARクローン集団の25%〜40%がpSDH-CSPクローンの最高SEAP発現を超える。
組み換えられた宿主細胞の培養の間、抗生物質の選択を維持することは通常のプラクティスである。これは、導入遺伝子の転写的サイレンシング又は組み換えのようなプロセスによってゲノムからの導入遺伝子の損失を防ぐことを目的とされる。しかしながら、それは異種のタンパク質の生産にとって多くの理由のために望ましいものではない。第1に、使用される抗生物質はとても高価であり、生産物の単位コストに重大な寄与をする。第2に、生物薬剤的な使用の点から、タンパク質は、明らかに純粋でなければならず、生成物に抗生物質の痕跡があってはならない。異種タンパク質生産のためのSTARエレメントの一つの利点は、抗生物質選択の不存在下であっても、それらは、長期の培養の間、導入遺伝子に対して安定な発現を与えるということである:この特性は、本実施例で示される。
U-2 OS細胞株は、プラスミドpSDH-Tet-STAR6でトランスフェクションされ、且つ実施例11に記載されているように培養された。個々のピューロマイシン耐性クローンが分離され、かつドキシサイクリンの存在なしにさらに培養された。週間隔で、1:20の希釈率で細胞は新しい培地容器に移された。ルシフェラーゼ活性は、実施例11に記載されているように定期的な間隔で測定された。15週間後、培養物は2つの複製に分けられた:一つの複製はピューロマイシンを受け続け、一方他の複製は実験の残りにおいて抗生物質を受けなかった(25週間合計)。
表7は、抗生物質あり又はなしで、長期にわたる成長の間、STAR6に隣接された発現ユニットによるルシフェラーゼ発現についてのデータを表わす。見られうるように、レポーター導入遺伝子、ルシフェラーゼの発現は、実験の持続の間、U-2 OS宿主細胞において安定に保持される。該培養物が2つの処理(抗生物質をプラスと抗生物質なし)に分けられた後、ルシフェラーゼの発現は、抗生物質選択の不存在下で基本的に安定であった。これは、長期に渡る培養の間、サイレンシング又は損失から導入遺伝子を防ぐためのSTARエレメントの能力を示す。それは、この特性は抗生物質選択から独立であることをまた示す。それ故に、異種のタンパク質の生産は、抗生物質の又は難しい下流の処理の費用を生じることなしに可能である。
STARエレメントは実施例1に記載された遺伝子スクリーンから分離される。該スクリーンは、ほぼ0.5〜2キロ塩基(上述)にサイズ分画されたヒトゲノムDNAで構築されたライブラリーを使用する。該STARエレメントは、500から2361塩基対の範囲である(表6)。分離されている多くのSTARエレメントにとって、STAR活性は当初分離されたクローンよりも小さいDNAフラグメントによって与えられるようである。STAR活性にとって必須であるこれらの最小のフラグメントサイズを決定することは、2つの理由で有用である。第1に、より小さい機能的STARエレメントは、コンパクトな発現ベクターの設計に有利であり、なぜならばより小さいベクターが、より高い効力で宿主細胞をトランスフェクションするからである。第2に、最小必須のSTAR配列を決定することは、助長された機能性のそれらの配列の変性を許容する。2つのSTAR配列は、それらの最小必須配列を決定するためにファインマッピングされる。
STAR10(1167塩基対)及びSTAR27(1520塩基対)が、詳細マッピングされた。それらはPCRによって増幅され、ほぼ等しい長さ(図10説明)のサブフラグメントを与えた。初期のテストのために、これらは、BamHI部位でpSelectベクター内にクローニングされ、且つ実施例1に記載されているようにU-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1細胞内にトランスフェクションされた。ハイグロマイシン耐性について選択の後、LexA-HP1がドキシサイクリン濃度を低くすることによって導出された。その後、トランスフェクションされた細胞は、LexA−HP1結合による抑制からSV40−Zeo発現ユニットを保護するためのSTARフラグメントの能力をテストするために、ゼオシンとともにインキュベーションされた。
この実験では、STAR10及びSTAR27は、予想されたように遺伝子サイレンシングに対して良い保護を与える(図10)。これは、ゼオシンの存在下における強力な成長によって表わされる。
異種のタンパク質発現のための宿主細胞株の選択は、タンパク質の質、収率及び単位コストのために重要なパラメータである。考慮例えばポスト翻訳変性、分泌経路能力及び細胞株不死は、特定の生物薬剤的な生成システムのために適切な細胞株を指示する。この理由のために、収率、予測可能性及び安定性の観点においてSTARエレメントによって与えられる利点は、多様の細胞株において取得可能であるべきである。これは、それが元々クローニングされているところのヒトU-2 OS細胞株、及びバイオテクノロジーにおいて広く適用されているCHO細胞株におけるSTAR6の機能を比較することによって試験された。
実施例11の実験が参照される。
CHO細胞内のSEAPレポーター遺伝子の発現は、図8に表わされている;U-2 OS細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現は、図9に示される。これらの2つの実験の結果の比較によって、STAR6エレメントは、両方の細胞株において機能することは明らかである:レポーター遺伝子発現はそれらの両方においてより予測可能であり、及び該レポーター遺伝子がSTAR6による位置効果から保護される場合、各細胞株のクローンはより高い収率を示した。これらの2つの細胞株は、異なる種(ヒト及びハムスター)並びに異なる組織型(骨及び卵巣)から得られ、このSTARエレメントが異種タンパク質発現を改善する際にその中で利用されうるところの宿主細胞の広い範囲を反映する。
導入遺伝子転写は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを外来のプロモーターの制御下に置くことによって達成される。プロモーターの選択は、異種のタンパク質の性質及び生成システムによって影響される。ほとんどの場合、強い構造的プロモーター(constitutive promoter)は、それらが提供できる高い収率の故に好まれる。幾つかのウィルスプロモーターは、これらの特性を有する;CMV-IEG(cytomegalovirus immediate early gene)のプロモーター/エンハンサー(「CMVプロモーター」)は、通常の生物化学的な使用において最強のプロモーターであると一般にみなされている(ボシャルトら、1985年;ドールら、1996年;フェッキング及びホフステッテル、1986年)。シミアンウィルスSV40プロモーターもまた、中庸に強力であり(ボシャルトら、1985年;フェッキング及びホフステッテル、1986年)、且つ哺乳動物細胞ベクターにおける異所性の発現のためにしばしば使用される。Tet-Offプロモーターは導出可能である:該プロモーターは、tTAプラスミド(Clontech K1620-A)を発現する細胞株においてテトラサイクリン又は関連する抗生物質(ドキシサイクリンが通常使用される)の存在下で抑制され、抗生物質の除去は転写的誘発を生じる(ドイシュレら、1995年;ゴッセン及びビュヤード、1992年;イズミ及びギルバート、1999年;ウマナら、1999年)。
pSDH-Tet及びpSDH-CMVベクターの構築が、実施例11に記載されている。pSDH-SV40は、プラスミド pSelect-SV40-Zeo(実施例1)からのSV-40プロモーター(プライマー D41及びD42)のPCR増幅によって構築され、引き続きSacII及びSalIでPCR生成物を消化した。pSDH-CMVベクターは、CMVプロモーターを除去するためにSacII及びSalIで消化され、且つベクター及びSV40フラグメントはpSDH-SV40を生成するためにともにライゲーションされた。STAR6は実施例11で記載されたようにMCSI及びMCSII内にクローニングされた。プラスミド pSDH-Tet、pSDH-Tet-STAR6、pSDH-Tet-STAR7、pSDH-SV40及びpSDH-SV40-STAR6は、製造者によって記載されたようにSuperFectを使用し、U-2 OS内にpBabe-Puroで同時にトランスフェクションされた。細胞培養、ピューロマイシン選択及びルシフェラーゼアッセイは、実施例11に記載されているように実施された。
図9、11及び12は、下記の3つの異なるプロモーターからのルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を比較する:2つの強く且つ構造的なウィルスプロモーター(CMV及びSV40)、及び導出可能なTet-Offプロモーター。全ての3つのプロモーターは、U-2 OS 細胞においてSTAR6エレメントとの関連においてテストされた。結果は、全ての3つのプロモーターからの収率及び予測可能性は、STAR6によって増加されることを示す。実施例11及び14に記載されているように、STAR6はCMVプロモーターの関連において有益である(図9)。同様の改善が、SV-40プロモーターとの関連において見られる(図11):最高発現するSTAR6クローンからの収率は、最良のpSDH-SV40クローンよりも2〜3倍良く、且つ6個のSTARクローン(集団の20%)は最良のSTARのないクローンよりも高い収率を有する。導出すする(低いドキシサイクリン)濃度下でTet-Offプロモーターの関連において、STAR6は導入遺伝子発現の収率及び予測可能性をまた改善する(図12):最高発現するSTAR6クローンは、最良のpSDH-Tetクローンよりも20倍高い収率を有し、及び9個のSTAR6クローン(集団の35%)は、最良のSTARのないクローンよりも高い収率を有する。このSTARエレメントはその導入遺伝子を保護する特性において多様的であり、なぜならばそれは、転写の様々なバイオテクノロジー的に有益なプロモーターとの関連において機能するからであると結論される。
短い核酸配列が対称(例えば回文)でありうるのに対して、より長い自然に生じる配列は典型的には非対称である。結果として、核酸配列の情報内容は方向性であり、且つ配列自体はそれらの5’及び3’末端に関して記載されうる。核酸配列情報の方向性は、組み換えDNA分子が当業者に知られている標準クローニング技術(サムブルックら、1989年)を使用して組み立てられるところの準備に影響を与える。STARエレメントは、長く、非対称的なDNA配列であり、且つそれらがpSelectベクターにおいて元々クローニングされた配向に基づく方向性を有する。上記された実施例では、pSDHベクターにおける2つのSTARエレメントを使用し、この方向的に保持された。この配向は、ゼオシン耐性遺伝子に相対的に、自然の又は5’-3’配向として記載される(図13参照)。この実施例では、STAR機能のための方向性の重要性が、pSDH-Tetベクターにおいてテストされる。pSDHベクターにおけるレポーター遺伝子は目的のSTARエレメントのコピーによって両方の側で隣接される故に、各STARコピーの配向が考慮されなければならない。この実施例は、自然の配向を逆の配向と比較する(図13)。
STAR66エレメントは、実施例11に記載されているようにpSDH-Tet内にクローニングされた。U-2 OS細胞は、プラスミド pSDH-Tet-STAR66- native及びpSDH-Tet-STAR66- oppositeで同時トランスフェクションされた。夫々のクローンは分離され、そして培養された;ルシフェラーゼ発現のレベルは、記載されたように(上述)決定された。
自然の配向及び逆の配向におけるSTAR66活性の比較の結果が、図14に示される。STAR66が逆の配向にある場合、一つのクローンのみの収率がかなり高い(60ルシフェラーゼ単位)。その一方、STAR66が自然の配向にある場合の最高発現クローンの収率はかなり高く(100ルシフェラーゼ単位)、且つ予測可能性は同様にはるかに高い:自然配向の集団の7個(30%)のクローンが、逆配向の集団からの最高発現クローンのレベルより上のルシフェラーゼを発現し、且つ自然配向の集団の15個(60%)のクローンが、10相対的ルシフェラーゼ単位よりも上のルシフェラーゼを発現する。それ故に、STAR66機能は方向性であることが示される。
異質タンパク質発現のための導入遺伝子発現ユニットは、細胞分割の間の安定な保存を保証するために宿主細胞のゲノム内に一般的に組み込まれる。組み込みは、ゲノム内に挿入された発現ユニットの一つ又は複数のコピーを生じうる:複数のコピーはタンデムアレイとして存在するか又は存在しない。STARエレメントによって保護された導入遺伝子のために示された増加した収率(上述)は、STARエレメントは導入遺伝子発現ユニットがゲノム内の組み込みの部位に関連付けられた転写への影響に独立的に機能することを許容する(位置効果からの独立性(ボイヴィン及びデュラ、1998年))ことを示す。それは、STARエレメントは各発現ユニットが、それらがタンデムアレイとして組み込まれた場合に、発現ユニットの近傍するコピーに独立的に機能することを許容することをさらに示唆する(反復導出された遺伝子サイレンシングからの独立性(independence from repeat-induced gene silencing)(ガーリックら、1998年))。コピー数依存性は、下記の実施例で記載されるように導入遺伝子発現レベル及びコピー数の間の関係から決定される。
U-2 OS細胞は、pSDH-Tet-STAR10で同時トランスフェクションされ、そして記載されたように(上述)ピューロマイシン選択下で培養された。8個の個々のクローンが分離され、そしてさらに培養された。その後、細胞は収穫され、そして一つの部分は、記載したように(上述)ルシフェラーゼ活性を試験された。残った細胞は溶解され、そしてゲノムDNAはDNeasy Tissue Kit(QIAGEN 69504)を使用し製造者によって記載されたように精製された。DNAサンプルは、UV分光測定法によって数値化された。3マイクログラムの各ゲノムDNAサンプルが、製造者によって記載されたように(New England Bioabs)一晩PvuII及びXhoIで消化され、そしてアガロースゲル電気泳動法によって分離された。DNAフラグメントは、記載されたように(サムブルックら、1989年)ナイロン膜に移され、そして(BamHI/SacII-消化されたpSDH-Tetから分離された)ルシフェラーゼ遺伝子に対する放射活性的にラベル化されたプローブとハイブリダイズされた。ブロット(blot)は、記載されたように(サムブルックら、1989年)洗われ、そしてフォスファーイメージャースクリーン(Personal F/X,BioRad)にさらされた。生じたオートラジオグラム(図15)はルシフェラーゼDNAバンドの相対強度を決定するために、デンシトメトリーによって解析され、それは導入遺伝子コピー数を表わす。
pSDH-Tet-STAR10クローン集団からのコロニーにおけるルシフェラーゼの酵素活性及びコピー数(DNAバンド強度)が、図16に示される。導入遺伝子コピー数は、これらのpSDH-Tet-STAR10クローンにおけるルシフェラーゼ発現のレベルに高く相関されている(r=0.86)。このことは、STAR10が導入遺伝子発現ユニットに対してコピー数増加依存性を与え、導入遺伝子発現をタンデムアレイにおける他の導入遺伝子コピーに独立に及び組み込みの部位における遺伝子サイレンシング影響に独立にする。
遺伝子プロモーターは、転写を開始するためのそれらの能力に対してポジティブな及びネガティブな影響の両方に付される。ポジティブな影響を働かせるエレメントの重要な分類は、エンハンサーである。エンハンサーは、それらが遠くに配置された場合(多くのキロ塩基対)にでさえ、プロモーターに影響を特徴的に与えることができる。ヘテロクロマチン形成(例えばポリコーム グループタンパク質)によって作用するネガティブな影響は上記に記載されており、且つそれらはSTAR活性のターゲットである。エンハンサー機能のための及びヘテロクロマチン形成のための生化学的な基礎は、基本的に類似しており、なぜならばそれらはいずれも、DNAに対するタンパク質の結合に関係するからである。それ故に、STARエレメントがネガティブ影響ならびにポジティブ影響をブロックすることができるか、換言すれば組み込みの部位の近傍におけるゲノム的エンハンサーからの導入遺伝子を保護することができるかどうかを決定することが重要である。エンハンサー活性からの導入遺伝子を保護する能力は、バイオテクノロジーの用途において導入遺伝子の安定な且つ予測可能な能力を保証する。この実施例は、エンハンサーブロッキングアッセイにおけるSTARエレメントの能力を検査する。
ルシフェラーゼ発現ベクターは、pGL3-E-boxルシフェラーゼ(W.Romanowのギフト)を生成するために、E-boxを及び、プラスミド mu-E5+E2x6-cat(x)(ルエジンスキーら、1991年)からのヒトアルカリ性フォスファターゼ最小プロモーターを、プラスミドpGL3-basic(Promega E1751)においてルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入することによって構築される。E47発現プラスミドは、pHBApr-1-neoプラスミドにおいてベータ−アクチンプロモーターの制御下でE47オープンリーディングフレームを含む;E47は構造的にこのプラスミド(W.Romanowのギフト)から発現される。
図18は、エンハンサー−ブロッキングアッセイの結果を示す。STARエレメント(又は既知のエンハンサー−ブロッキングエレメント scs及びHS4)の不存在下で、E-47/E-boxエンハンサー複合体は、ルシフェラーゼ(「ベクター」)の発現を活性化する。;発現のこの助長されたレベルは、100に正規化された。エンハンサー活性は、テストされた全てのSTARエレメントによってブロックされる。エンハンサー活性は、予想されたように(ベルら、2001年;ゲラシモワ及びコルセス、2001年)、HS4及びscsエレメントによってまたブロックされる。これらの結果は、転写的サイレンシングの拡散をブロックするそれらの能力(ネガティブ影響)に加えて、STARエレメントはエンハンサーの活性をブロックすることができる(ポジティブ影響)ことを示す。
材料及び方法:
SINCスクリーンの一般的な特性は実施例1に記載されており、それの幾つかの観点はここに要約される。ゲノムDNAにおけるSINCエレメントをスクリーニングするために使用されるpSSベクターの一つのバージョンは、pSS-codA::uppである(図20)。それは、2つのSTAR6エレメントによって隣接された自殺遺伝子発現ユニットから成る。Tet-Offプロモーターの制御下のcodA::upp自殺遺伝子から成る発現ユニットは、BglII制限サイトの下流にある。pSSベクターの第二のバージョン、pSS-hrGFP(図21)は、一つのSTAR6エレメントをSTAR8で置換し及び自殺遺伝子を緑色蛍光タンパク質(Stratagene 240059)をコードするhrGFP遺伝子で置換することによって生成された。22番染色体(Research Genetics 96010-22)からのヒトゲノムDNAは、Sau3AIで部分的に消化され、かつサイズフラクション化された。0.5から10キロ塩基対フラクションは、pSS-codA::uppのBglII部位内にライゲーションされた。このライブラリーは、1.2キロ塩基対の平均挿入サイズを有する〜20,000独立クローンを表わした。該ライブラリーは、大腸菌内で増幅された。増幅されたライブラリーからの精製されたDNAは、標準技術(リン酸カルシウム;Life Technologies18306-019)によってU-2 OS/Tet-Off細胞(ファン デル フラッグら、2000年)内にトランスフェクションされた。対照トランスフェクションは、エンプティpSS-codA::uppベクターDNAを使用して実行され、2400のハイグロマイシン耐性コロニーを生じた。トランスフェクションされた細胞は、高ドシサイクリン(10ng/ml)で3週間にわたりハイグロマシン耐性(25mg/ml)のために選択され、そして1800のハイグロマイシン耐性コロニーは、ライブラリートランスフェクションから回収された。その後、これらのコロニーは、プロドラッグ 5−フルオロシトシン(5-FC)を4日間で5mg/mlの増加になるように1mg/mlで、10ng/mlのドキシサイクリン濃度でインキュベートされた。3週間後、全ての(3個の弱く成長するものを除き)(エンプティpSS-codA::uppでトランスフェクションされた)対照コロニーは、死んだ;ライブラリートランスフェクションされたコロニーの58が生き残った。これらのコロニーは、プロドラッグ処理から回収されることを可能にし、そしてさらに培養された。5−FC耐性単離物が回収され、該細胞は溶解され、そしてSINCエレメントを回収するために、DNAの一部分がプライマーD30及びD51を使用しPCR増幅に付された。6つの5−FC耐性コロニーからのPCR生成物は、慣用の方法(サムブルックら、1989年)によって、pBluescript II SK(+) プラスミド(Stratagene 212207)のHindIII及びXhoI部位の間でクローニングされた。候補SINCエレメントのDNA配列は、pBluescriptベクターのための商業的に入手可能なプライマー(Stratagene 300301及び300302)を使用し、記載されたように決定された(上述)。これらのSINCエレメントの配列は、表4Bにあらわされる。
GFPレポーター遺伝に近接するクローニングされたSINCエレメントは、レポーター遺伝子転写のサイレンシングを導出するであろうが、他の遺伝子の転写に影響を与えないであろう。SINC活性の正確な測定は、絶対的なGFP発現を単に測定するのではなくて、2つの参照遺伝子(reference gene)の発現に相対的なGFPの発現を決定することにより、この事実を利用する。一つの参照遺伝子は、pSS-hrGFPプラスミド(STARエレメントによって定義されるドメインの外側、図21)上のハイグロマイシン耐性遺伝子であり、及び他はゲノムベータ−アクチン遺伝子である。SINC活性は、ハイグロマイシン及びベータ−アクチンシグナルに対するGFPシグナルの割合における減少としてRNAブロット分析によって数値化される。特徴付けられている候補SINCエレメントのうち、あるものは、GFP転写において有意な相対的な減少を示し、これらのDNAはサイレントクロマチンの形成を導出することができることを示す。SINC35エレメント(表4BにおいてラベルされたPSINCS35)は、これらの候補の最強の活性を有する。それは、GFP/ハイグロマイシン割合において69%減少及びGFP/ベータ−アクチンシグナルにおける75%減少をもたらす。元の明細書中に記載された他の5つの候補及びその明細書の提出後に分離され且つ特徴付けられた多数の他の候補SINCエレメントにおけるSINC活性の強度は、より弱い。それ故に、SINC35は、多様なバイオテクノロジー的用途において、サイレントクロマチンの導出のための有力な遺伝的エレメントとして優れた能力を有する。
ヒトゲノムデータベース(htt://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)に対するSTAR DNA配列のBLAT分析は、これらの配列の幾つかがヒトゲノムの他の領域と高い配列保存を有することを明らかにした。これらの複製された領域は、候補STARエレメントである;それらがSTAR活性を示さない場合、それらはクローニングされたSTARのパラログ(paralogs)と考えられる(2個の遺伝子又は遺伝子的エレメントは、それらが複製イベントから得られる場合、パラロガス(paralogous)であると言われる(リー、1997年))。
STAR18の周りのマウス/ヒト配列保存の領域は、PCR増幅によってヒトBACクローンRP11-387A1から3つのフラグメントとして回収された:完全な領域(プライマーE93及びE94)、左方向の半分(プライマーE93及びE92)、及び右方向の半分(プライマーE57及びE94)。相同なマウス領域からの対応するフラグメントが、同一の様式でBACクローン RP23-400H17から回収された(夫々、プライマーE95及びE98、E95及びE96、並びにE97及びE98)。全てのフラグメントは、pSelectベクター内にクローニングされ、且つU-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1細胞株(上述)内にトランスフェクションされた。トランスフェクション後に、ハイグロマイシン選択は。トランスフェクションされた細胞を選択するために実行された。LexA-HP1タンパク質は、ドキシサイクリン濃度を低くすることによって導出され、且つ抗生物質ゼオシンに耐える(STAR活性の尺度)ためのトランスフェクションされた細胞の能力が、細胞成長を監視することによって評価された。
オリジナルSTAR18クローンは、ゼオシン耐性遺伝子のサイレンシングを防止するその能力に基づき、pSelectベクター内にライゲーションされた、Sau3AI消化されたヒトDNAから分離された。マウスゲノムとのヒトSTAR18クローン(497塩基対)のアラインメントは、オルトロガスヒト及びマウスSTAR18領域の間に高い配列類似性(72%)を示した。それは、クローニングされた領域の左端を定義するSau3AI部位の直接左側に488塩基対伸張する領域において高い類似性(73%)をまた明らかにした。これらの領域の外で、ヒトとマウスDNAの間の配列類似性は、60%以下に落ちる。
STARエレメントは、導入遺伝子発現の観点においてそれらの抗抑制表現型に基づき分離される。この抗抑制表現タイプは、STARエレメントに関連付けられるクロマチン形成を調節する基礎的な生化学的プロセスを反映する。これらのプロセスは、典型的に配列特異的であり且つタンパク質結合又はDNA構造から生じる。これは、STARエレメントがDNA配列類似性を共有することを示唆する。STARエレメント間の配列類似性の識別は、機能的スクリーン及びテストによってすでに識別されているエレメントの特徴である配列モチーフを提供する。該配列モチーフは、その機能が本特許の請求項に一致するところの新しいSTARエレメントを認識し且つ請求するためにまた有益である。該機能は、真核宿主細胞内で発現される導入遺伝子の改善された収率及び安定性を含む。
調節DNAエレメントは、配列特異的DNA結合性タンパク質との相互作用を介して典型的に機能する。DNAエレメント例えばその調節特性が識別されているがその相互作用タンパク質が知られていないところのSTARエレメントのバイオインフォマティックス分析は、配列モチーフの識別のための統計学的アプローチを要求する。これは、参照配列(例えば完全なヒトゲノム)と比較して、調節DNAエレメント(例えばSTARエレメント)のセットにおいて過剰に現れている短いDNA配列パターンを検出する方法によって達成されうる。該方法は、各調節エレメントにおけるパターンの観察された、及び予想された事象の数を決定する。予想された事象の数は、参照配列における各パターンの観察された事象の数から計算される。
元の特許出願に記載されている遺伝子的スクリーンを使用し、66個のSTARエレメントがヒトゲノムDNAから最初に分離され、且つ詳細に(表6)特徴付けられた。該スクリーンは、胎座(Clontech 6550-1)から精製された又はバクテリアの/P1染色体(BAC/PAC)人工染色体内に運ばれている、ヒトゲノムDNAのSau3AI消化によって構築された遺伝子ライブラリー上で実行された。BAC/PACクローンは、1番染色体の領域(クローン RP1154H19及びRP3328E19)からの、相同異質遺伝子(クローン RP1167F23、RP1170019及びRP11387A1)のHOXクラスターからの又はヒト22番染色体(Research Genetics 96010-22)からのゲノムDNAを含む。該DNAはサイズフラクションされ、そして0.5〜2kbサイズフラクションは、標準技術(サムブルックら、1989年)によって、BamHI-消化されたpSelectベクター内にライゲーションされた。低いドキシサイクリン濃度でゼオシンに対する耐性を与えたヒトゲノムDNAを含むpSelectプラスミドが分離され且つ大腸菌内で増殖された。表6のSTARエレメントを生じたスクリーンは、ヒトゲノムのほぼ1〜2%をアッセイした。
分析における第1のステップは、RSA-Toolsソフトウェア(調節配列分析ツール;http://www.ucmb.ulb.ac.be/bioinfomatics/rsa-tools/;参照(ファン ヘルデンら、1998年;ファン ヘルデンら、2000年、ファン ヘルデンら、2000年)を使用し、下記の情報を決定する:(1)ヒトゲノム内の全ての二分染色体及び六量体オリゴヌクレオチドの頻度;(2)65個のSTARエレメントにおけるオリゴヌクレオチド及び二分染色体の頻度;及び(3)ゲノムと比較してSTARエレメント内の過剰に表わされたそれらのオリゴヌクレオチド及び二分染色体の有意性インデックス。対照分析は、表6のSTARエレメントの長さに一致するヒトゲノム(すなわち、2689×103キロ塩基対))からランダムに選択された65個の配列で行われた。
過剰に表わされたオリゴヌクレオチド及び二分染色体は、線形判別式分析(ヒューベルティ、1994年)によるSTARエレメントの予測のためのモデルをトレーニングするために使用された。変異体の予備選択は、頻度分析の過剰に表わされたオリゴヌクレオチド(oligos)又は二分染色体から最高の夫々の判別力を有する50個のパターンを選択することによって実行された。次に、これらの予備選択された変異体は、変異体の最も判別できる組み合わせを選択するために(ヒュベルティ、1994年)、ステップワイズ線形判別式分析におけるモデルトレーニングのために使用された。変異体選択は、分類エラー割合(誤ったネガティブ分類のパーセント)を最小化することに基づいていた。さらに、予想されるエラー割合は、(誤ったポジティブ分類のパーセントを最小化する)ランダム配列の対照セットに対する同一の判別アプローチを適用することによって見積もられた。
パターン頻度分析は、参照配列としてヒトゲノムを使用し、65個のSTARエレメントに対してRSA−Toolsで実行された。166個の六量体のオリゴヌクレオチドがゲノム全体(表9)と比較してSTARエレメントのセット内で過剰に表わされる(sig>=0)ことが見つかった。最も大きく過剰に表わされるオリゴヌクレオチド CCCCACは、65個のSTARエレメント間で107回生じ、しかし49回のみ生じることが予想される。それは8.76の有意性係数を有する;言い換えれば、その過剰に表わされたことがランダム偶然によるものであることの蓋然性は、1/108.76、すなわち5億回に1回よりも少ない。
導入遺伝子サイレンシングは、転写的及び転写後のレベルのいずれにおいても形質転換植物において生じる(メイヤー、2000年;ヴァンス及びヴァウチェルト、2001年)。いずれの場合にも、導入遺伝子発現の望ましい結果は、サイレンシングによって危うくされうる;導入遺伝子の低い発現及び不安定性は望ましい形質(例えば害虫耐性)の貧しい発現又は組み換えタンパク質の低い収率を生じる。それは、貧弱な予測可能性をまた生じる:バイオテクノロジー的に有益なレベルで導入遺伝子を発現する形質転換植物の割合は低く、それは、有益な発現特性を有するもののために形質転換された個体の骨の折れ且つ高価なスクリーニングを必要とする。本実施例は、形質転換植物における転写的な導入遺伝子サイレンシングを防ぐ際に使用するための、双子葉植物 シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のゲノムからのSTARエレメントの分離を記載する。シロイヌナズナは、それが十分に研究されたモデル生物体である故に、本実施例のために選択された:それはコンパクトなゲノムを有し、それは遺伝子的及び組み換えDNA操作に対して敏感に反応し、かつそのゲノムは配列決定されている(ベヴァンら、2001年、イニチアティブ、2000年、マインケら、1998年)。
ゲノムDNAは、記載されているように(スタムら、1998年)、Arabidopsis thaliana ecotype Columbiaから分離され、且つMboIで部分的に消化された。該消化されたDNAは、アガロースゲル電気泳動及び該ゲルからの精製(QIAquick Gel Extraction Kit,QIAGEN 28706)によって0.5〜2キロ塩基対にサイズフラクションされ、引き続きpSelectベクター(上述)内にライゲーションされた。U-2 OS/Tet-Off/LexA-HP1 細胞株内へのトランスフェクション及び低いドキシサイクリン濃度でのゼオシン耐性の選択は、前記した様に(上述)実行された。プラスミドは、ゼオシン耐性コロニーから分離され且つU-2 OS/Tet Off/LexA-HP1細胞株内にトランスフェクションされた。
pSelectベクターにおけるシロイヌナズナゲノムDNAのライブラリーは、大腸菌内に69,000個のプライマリークローンを含み、その80%が挿入物を持っていた。平均の挿入物サイズは、ほぼ1000塩基対であった;それ故にライブラリーは、シロイヌナズナゲノムのほぼ40%を表す。
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*位置があいまい、幾つかのヒット
2正確な長さは、DNA配列分析によって決定され、およその長さが制限マッピングによって決定される。
3STAR3の配列及び位置が表2及び表4の集合故に洗練されている。
4表2及び表4におけるこれら数を有するSTARは無視されており(以下、「oldSTAR5」などとして言及される)及びSTARエレメントに割り当てられたそれら数がDNA配列別表に示される。oldSTAR5、oldSTAR14及びoldSTAR16、クローニングされたDNAは、2よりも多い染色体位置からのキメラであった;oldSTAR9及びoldSTAR13、クローニングされたDNAは、STAR4に同一であった。
5表4「STAR18」に同一
2細胞分割の数は、1週間で培養が細胞コンフルエンス(それは〜6細胞分割を表わす)に達するとの推定に基いている。
3ルシフェラーゼは、実施例1に記載されているようにアッセイされた。
460細胞分割後に、細胞は2つの培養容器に移された;一つは、第1の60細胞分割についてはピューロマイシンを含む培養培地を供給され、且つ第2は抗生物質を欠く培養培地を供給された。
2マウスゲノムにおけるSTARエレメント オルトログの細胞遺伝位置。
3高い配列類似性を示す領域の長さ、及び類似性のパーセント。ある場合では、一つより上の高い類似性のブロックが生じる;それらの場合、各ブロックは、別々に記載される。類似性<60%は、有意であると考えられない。
F, 正の(Forward)配列反応結果;R,逆の(Reverse)配列反応結果。
正の及び逆のシーケンス結果は、種々のゲノム位置にマップされ、各配列は、ヒトゲノムデータベースからの配列情報に基づき(制限マッピングによって決定されたように)オリジナルのクローンの全長にまで拡張された。
2ND: 決められていない(not determined)。
Claims (77)
- 遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列を選択するための方法であって、転写システムに様々なフラグメント含有ベクターを備えることを含み、前記ベクターは、i)遺伝子転写を抑制する特性を有するエレメント、及びii)レポーター遺伝子の転写を指示するプロモーターをさらに含み、前記方法は前記遺伝子転写を調節する特性を有する前記DNA配列を含むフラグメントを識別するために前記転写システムにおいて選択ステップを実行することをさらに含む、前記方法。
- 前記DNA配列は安定な遺伝子転写調節特性を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA配列は遺伝子転写を助長する特性を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記転写システムは、宿主細胞を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーターは前記転写システムにおいて活性であってもよく、しかし前記ベクターにおける遺伝子転写抑制は遺伝子転写を抑制するクロマチンをもたらす、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子転写抑制に関係するDNA配列がタンパク質複合体によって認識されるDNA配列であり、かつ前記転写システムが前記複合体を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複合体は、ヘテロクロマチン結合性タンパク質HP1、ポリコーム−グループ(Pc-G)タンパク質、ヒストン脱アセチル化酵素活性又はMeCP2(メチル−CpG−結合性タンパク質)を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記ベクターがエピソーム的に複製するベクターである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、イプシュタイン−バール(Epstein-Barr)ウィルス(EBV)、OriP、及び核抗原(EBNA-1)からの複製起源を含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに一項に記載の方法。
- i)植物若しくは脊椎動物から単離されたDNA配列又はそれらの誘導体、又はii)合成DNA配列すなわち遺伝子エンジニアリングの手段によって構築されたDNA配列を含むDNA配列であって、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法の手段によって検出され、選択され及び任意的にクローニングされ得る、抑制を阻害する配列であるところの前記DNA配列。
- i)植物若しくは脊椎動物から単離されたDNA配列又はそれらの誘導体、又はii)合成DNA配列すなわち遺伝子エンジニアリングの手段によって構築されたDNA配列を含むDNA配列であって、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法の手段によって検出され、選択され及び任意的にクローニングされるところの前記DNA配列。
- 遺伝子転写抑制特性を有するDNA配列を識別するための方法であって、
テスト核酸の集合を用意すること、
プロモーターの転写制御下にあるテスト核酸及び第1のレポーター遺伝子を含む発現ベクターの集合を生成すること、
細胞に発現ベクターの前記集合を備えること、
それらの後代を含む細胞又はベクターを選択すること、ここで前記第1のレポーター遺伝子の転写は抑制されている、及び
前記細胞中の前記テスト核酸を識別すること、
を含む、前記方法。 - 前記DNA配列は遺伝子転写を抑制するクロマチン特性を有する、請求項12に記載の方法。
- 前記DNA配列はポリコーム−グループ様応答エレメントを含む、請求項12又は13に記載の方法。
- 前記ベクターが第2のレポーター遺伝子をさらに含む、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記転写システムが細胞を含む、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のレポーター遺伝子がベクター含有細胞の選択を行うために使用される、請求項16に記載の方法。
- ベクターが、遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列をさらに含む、請求項12〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNA配列は安定な遺伝子転写調節特性を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記DNA配列は、請求項10又は11に記載の配列を含む、請求項18又は19に記載の方法。
- 前記DNA配列が、前記ベクターにおける前記DNA配列の一つの側に存在する、遺伝子転写を抑制する特性を有するDNA配列の転写を抑制する効果の拡散を少なくとも一部分ブロックする、請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNA配列が、前記第2のレポーター遺伝子の転写に対する遺伝子転写を抑制する効果を少なくとも一部分阻害する、請求項21に記載の方法。
- 前記第1のレポーター遺伝子が自殺遺伝子を含む、請求項12〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のレポーター遺伝子が優勢な選択可能なレポーター遺伝子を含む、請求項12〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーターが誘導性プロモーターを含む、請求項1〜9又は12〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項12〜25のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な遺伝子転写を抑制する特性を有するDNA配列。
- 表4Bに従う配列又はそれらの機能的相同物を含む、請求項26に記載のDNA配列。
- 遺伝子転写を抑制する特性を有する前記DNA配列が請求項12〜25のいずれか一項に記載の方法によって取得可能なDNA配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 約50〜5000塩基対の核酸配列内のSTAR配列の存在を検出するための方法であって、前記配列における少なくとも1つの配列パターンの出現の頻度を決定し、そして出現の頻度がSTAR配列を含む少なくとも1つの配列における前記少なくとも1つの配列パターンの出現の頻度を表わすことを決定することを含む、前記方法。
- 出現の頻度が、STAR配列を含む少なくとも1つの配列における前記少なくとも1つの配列パターンの出現の頻度を表わすことを決定する前記ステップが、前記少なくとも1つの配列パターンの出現の頻度が、前記少なくとも1つのSTAR配列及び少なくとも1つの制御配列の間で有意に異なることを決定することを含む、請求項29に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの配列パターンの出現の頻度が、前記少なくとも1つの制御配列と比較して、STAR配列を含む前記少なくとも1つの配列において有意に高い、請求項30に記載の方法。
- 前記パターンの少なくとも1つが、STAR配列を含む前記少なくとも1つの配列と制御配列との間で所望の及び好ましくは最適の判別に基づいて選択される、請求項29〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記制御配列が、STAR配列を含む前記少なくとも1つの配列と類似のAT/CG含量を有するランダム配列を含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの配列パターンが少なくとも5塩基を含む、請求項29〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの配列パターンが少なくとも6塩基を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの配列パターンが表9及び/又は表10にリストされたパターンを含む、請求項29〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記パターンが少なくとも8塩基を含む、請求項29〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記出現が、STAR配列を含む少なくとも2配列における前記少なくとも1つの配列パターンの出現の頻度を表わす、請求項29〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記出現が、STAR配列を含む少なくとも5配列における前記少なくとも1つの配列パターンの出現の頻度を表わす、請求項29〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記出現が、STAR配列を含む少なくとも10配列における前記少なくとも1つの配列パターンの出現の頻度を表わす、請求項39に記載の方法。
- 前記出現が、STAR配列を含む少なくとも50配列における前記少なくとも1つの配列パターンの出現の頻度を表わす、請求項29〜40のいずれか一項に記載の方法。
- STAR配列を含む前記配列が、図26に示された配列の少なくとも1つを含む、請求項29〜41のいずれか一項に記載の方法。
- STAR配列を含む前記配列が図26に示された配列を含む、請求項42に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの配列パターンが、配列パターンGGACCC、CCCTGC、AAGCCC、CCCCCA及び/又はAGCACCを含む、請求項29〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの配列パターンが、配列パターンCCCN{16}AGC、GGCN{9}GAC、CACN{13}AGG及び/又はCTGN{4}GCCを含む、請求項29〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 約50〜5000塩基対の核酸配列内のSTAR配列の存在を検出するための方法であって、一つの種(species)の細胞の染色体の一部分におけるSTAR配列を含む配列を識別すること、そして前記配列及び異なる種の染色体の配列との間の有意な相同性を検出することを含む、前記方法。
- 前記種が植物種又は脊椎動物種、好ましくは哺乳動物種を含む、請求項46に記載の方法。
- 脊椎動物種又は植物種の約50〜5000塩基対の核酸配列内のSTARエレメントの存在を検出するための方法であって、前記核酸配列の隣接(flanking)配列が少なくとも1つの他の種に保存されているかどうかを識別することを含む、前記方法。
- 請求項1〜9、29〜48のいずれか一項に記載の方法によって取得可能なSTAR配列。
- STAR配列を含む前記少なくとも1つの配列が請求項49に記載のSTAR配列である、請求項29〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項49に記載のSTAR配列の集合。
- 約50〜5000塩基対の核酸配列がSTAR配列を含むかどうかを決定するための方法であって、請求項51に記載されたSTAR配列の集合における前記パターンの出現の頻度を含む配列パターンの第1のテーブルを生成すること、少なくとも1つの参照配列における前記パターンの出現の頻度を含む前記パターンの第2のテーブルを生成すること、出現の頻度が前記2つのテーブル間で異なるところの少なくとも1つのパターンを選択すること、約50〜5000塩基対の核酸配列内で前記選択されたパターンの少なくとも1つの出現の頻度を決定すること、及び前記テスト核酸における出現の頻度がSTAR配列の前記集合物における前記選択されたパターンの出現の頻度を表わすかどうかを決定することを含む、前記方法。
- 約50〜5000塩基の前記核酸配列が遺伝子転写を調節する特性を含むかどうかを決定することをさらに含む、請求項29〜48、50及び52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子転写を調節する特性が請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法を使用して決定される、請求項53に記載の方法。
- STARの前記集合物が図26に記載されている配列を含む、請求項52又は53に記載の方法。
- 請求項52〜55のいずれか一項に記載の方法によって取得可能なSTAR配列を含む、単離された及び/又は組換えられた核酸配列。
- 請求項10、11、26、27、49及び56のいずれか一項に記載のDNA配列を備えられたDNA構築物。
- 請求項10、11、26、27、49及び56のいずれか一項に記載されたDNA配列が修飾されているところのDNA構築物。
- 目的の核酸に動作可能にリンクされたプロモーターを含む、請求項57又は58に記載のDNA構築物。
- 遺伝子転写を調節する及び/又は抑制する特性を有する前記DNA配列の特性の活性の量が、前記プロモーターと比較して前記構築物内での前記DNA配列の方向に依存する、請求項59に記載のDNA構築物。
- 遺伝子転写を調節する及び/又は抑制する特性がシグナルの存在に依存する、請求項57〜60のいずれか一項に記載されたDNA構築物又は請求項10、11、26、27、49又は56に記載されたDNA配列。
- 前記シグナルがDNA結合性タンパク質を含む、請求項61に記載のDNA構築物又はDNA配列。
- 前記シグナルがヒト免疫不全ウィルスTATタンパク質を含む、請求項61又は請求項62に記載のDNA構築物又はDNA配列。
- 目的の核酸の転写を調節するために、請求項10、11、26、27、49、56〜63のいずれか一項に記載のDNA構築物又はDNA配列を使用する方法。
- 細胞内で遺伝子生成物を生産するための方法であって、目的の遺伝子及び請求項10、11、26、27、49、56〜63のいずれか一項に記載のDNA配列又はDNA構築物を含む発現カセットを生成すること、及び細胞内で前記発現カセットの転写をさせることを含む、前記方法。
- 前記遺伝子生産物の生産が誘発可能である、請求項65に記載の方法。
- 遺伝子転写を調節する特性及び/又は遺伝子転写を抑制する特性を含む、単離された及び/又は組換えられた核酸のライブラリー。
- 前記核酸が同一のコンセンサス配列を含む、請求項67に記載のライブラリー。
- 前記遺伝子転写を抑制する特性が、遺伝子転写を抑制するクロマチンの形成を誘発する特性を含む、請求項67又は68に記載のライブラリー。
- 前記遺伝子転写を調節する特性が安定な転写特性を有する、請求項67〜69のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記遺伝子転写を調節する特性が、遺伝子転写を抑制するクロマチンの形成を妨げる特性を含む、請求項70に記載のライブラリー。
- 前記遺伝子転写を調節する特性が転写を助長する特性を含む、請求項67〜71のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 染色体の遺伝子転写を調節する特性を有する全てのDNA配列を本質的に含む、請求項67〜72のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記染色体が哺乳動物又は植物の染色体である、請求項73に記載のライブラリー。
- 前記染色体がヒトの染色体を含む、請求項74に記載のライブラリー。
- 細胞の核DNAの遺伝子転写を調節する特性を有する全てのDNA配列を本質的に含む、請求項73〜75のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 遺伝子転写を調節する特性を有するDNA配列を選択するための方法であって、転写システムに様々なフラグメント含有ベクターを備えることを含み、前記ベクターは、i)遺伝子転写を調節する特性を有するエレメント、及びii)レポーター遺伝子の転写を指示するプロモーターを含み、前記方法は前記遺伝子転写を調節する特性を有する前記DNA配列を含むフラグメントを識別するために前記転写システムにおいて選択ステップを実行することをさらに含む、前記方法。
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