DE60215502T2 - Verfahren zur Selektion einer Transkription-Modulatierenden DNA-Sequenz unter Verwendung einem Vektor mit einem Transkriptions-Repressions-Aktivem Element - Google Patents

Verfahren zur Selektion einer Transkription-Modulatierenden DNA-Sequenz unter Verwendung einem Vektor mit einem Transkriptions-Repressions-Aktivem Element Download PDF

Info

Publication number
DE60215502T2
DE60215502T2 DE60215502T DE60215502T DE60215502T2 DE 60215502 T2 DE60215502 T2 DE 60215502T2 DE 60215502 T DE60215502 T DE 60215502T DE 60215502 T DE60215502 T DE 60215502T DE 60215502 T2 DE60215502 T2 DE 60215502T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
star
dna
transcription
gene
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60215502T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60215502D1 (de
Inventor
Pieter Arie OTTE
Leo Arthur Shoreline KRUCKEBERG
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chromagenics BV
Original Assignee
Chromagenics BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP01202581A external-priority patent/EP1273666A1/de
Application filed by Chromagenics BV filed Critical Chromagenics BV
Application granted granted Critical
Publication of DE60215502D1 publication Critical patent/DE60215502D1/de
Publication of DE60215502T2 publication Critical patent/DE60215502T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf die Gebiete der Medizin und der Zellbiologie. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Mittel und Verfahren zur Regulation der Gentranscription. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Mittel und Verfahren zur Bestimmung, ob eine DNA-Sequenz eine die Gentranscription modulierende Eigenschaft und/oder eine die Gentranscription reprimierende Eigenschaft hat.
  • Mit dem Fortschritt der verschiedenen Genomprojekte wurden Sequenzen von ganzen Genomen von Organismen verfügbar. Die Datenflut hat das Interesse vieler Forscher erweckt. Eine der bemerkenswerteren Ergebnisse war die Beobachtung, dass das humane Genom nicht für erheblich mehr Gene codiert als das Genom von einfachen Organismen wie der Fruchtfliege. Der Fokus vieler Forscher verschiebt sich jetzt von der Identifizierung von Genen zur Bestimmung der Genexpression und Genfunktion. Beispiele für solche Techniken sind DNA-Mikroarrays, funktionelle genomische Anwendungen und Proteomik. Diesen Techniken ist gemeinsam, dass sie um die Funktion und Expression von codierenden Sequenzen herum zentriert sind. Während unser Wissen über die Gene dramatisch zunimmt, begrenzt jedoch das Verständnis der Art und Weise, wie die Expression der Gene reguliert wird, die Fähigkeit, dieses schnell anwachsende Wissen auch anzuwenden. Dies ist zum Beispiel der Fall bei der Erzeugung von transgenen Pflanzen und Tieren und in der humanen Gentherapie. Bei diesen Anwendungen wird typischerweise fremde Nucleinsäure in Zellen eingeführt, um eine Expression von codierenden Sequenzen zu erhalten. Für eine längere Funktion der eingeführten Sequenzen ist häufig eine Integration der fremden Nucleinsäure in das Genom der Zelle erforderlich. Die Integration von Sequenzen in das Genom führt jedoch zu einer unvorhersagbaren Expression, da die umgebende DNA die Transcription der integrierten Sequenzen beeinflusst. Diese Unvorhersagbarkeit ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass eingeführte Sequenzen noch nicht mit ausreichender genetischer Information versehen werden können, um die integrierten Sequenzen gegenüber den transcriptionsbeeinflussenden Wirkungen der umgebenden DNA funktionell zu isolieren. Zu einem anderen Teil ist dies darauf zurückzuführen, dass nicht genug über die transcriptionsbeeinflussenden Wirkungen von umgebender DNA bekannt ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die eine Fähigkeit umfassen, die Transcription von Genen in cis zu beeinflussen. Typischerweise, wenn auch nicht notwendigerweise, codieren die untersuchten Sequenzen selbst nicht für ein funktionelles Protein. Verschiedene Sequenzelemente mit der Fähigkeit, die Gentranscription in cis zu beeinflussen, wurden identifiziert. Diese Elemente reichen von Promotoren, Enhancern und Silencern bis zu Isolatoren und MAR-Elementen.
  • Durch die Tatsache, dass so viele verschiedene Typen von regulatorischen Sequenzen gefunden wurden, entsteht der Eindruck, dass es sehr leicht wäre, effektive Expressionscassetten zu gestalten. Genau das Gegenteil ist jedoch wahr. Die Gestaltung von Expressionscassetten erfolgt häufig immer noch durch Versuch und Irrtum. Es ist ganz oft möglich, eine gewisse Art der Expression eines Fremdgens in einer Zielzelle oder deren Nachkommen zu erhalten. Sehr oft ist es jedoch schwierig, das Expressionsniveau oder die Persistenz der Expression, die eine Expressionscassette in einer Zielzelle aufweisen kann, auch nur ansatzweise vorherzusagen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem Mittel und Verfahren zum Nachweisen und Isolieren von neuen transcriptionsregulierenden Elementen bereit. Ein Verfahren zum Nachweisen und gegebenenfalls Selektieren einer DNA-Sequenz mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft wird angegeben, das das Versehen eines Transcriptionssystems mit einer Vielzahl von fragmentumfassenden Vektoren umfasst, wobei die Vektoren Folgendes umfassen: i) ein Element mit einer Gen-Transcription reprimierenden Eigenschaft, und ii) einen Promotor, der die Transcription eines Reporter-Gens steuert, wobei das Verfahren weiterhin das Durchführen eines Selektionsschritts in dem Transcripti onssystem umfasst, um die DNA-Sequenz mit der die Gentranscription modulierenden Eigenschaft zu identifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich diese Fragmente zwischen i) dem Element mit der die Gentranscription modulierenden Eigenschaft und ii) dem Promotor, der die Transcription des Reporter-Gens steuert. RNA-Polymerase leitet den Transcriptionsvorgang ein, nachdem sie an eine spezifische Sequenz gebunden hat, die Promotor genannt wird und die signalisiert, wo die RNA-Synthese beginnen sollte. Eine modulierende Eigenschaft kann die von dem Promotor ausgehende Transcription in cis bei einem gegebenen Zelltyp und/oder einem gegebenen Promotor verstärken. Dieselbe DNA-Sequenz kann in einem Zelltyp oder bei einem Promotortyp eine verstärkende Eigenschaft umfassen, während sie in einer anderen Zelle oder bei einem anderen Promotortyp eine andere oder keine die Gentranscription modulierende Eigenschaft umfasst. Die Transcription kann durch eine direkte Wirkung des regulatorischen Elements (oder des bzw. der daran bindenden Proteine) auf die Transcription eines bestimmten Promotors beeinflusst werden. Die Transcription kann jedoch auch durch eine indirekte Wirkung beeinflusst werden, zum Beispiel weil das regulatorische Element die Funktion von einem oder mehreren regulatorischen Elementen beeinflusst. Eine die Gentranscription modulierende Eigenschaft kann auch eine stabile Gentranscriptionseigenschaft umfassen. Mit "stabil" ist gemeint, dass das beobachtete Transcriptionsniveau sich über wenigstens 30 Zellteilungen nicht wesentlich ändert. Eine stabile Eigenschaft ist in Situationen nützlich, in denen Expressionseigenschaften über viele Zellteilungen hinweg vorhersagbar sein sollten. Typische Beispiele sind Zelllinien, die mit Fremdgenen transfiziert sind. Andere Beispiele sind transgene Tiere und Pflanzen und Gentherapien. Sehr häufig funktionieren eingeführte Expressionscassetten nach einer steigenden Anzahl von Zellteilungen oder Pflanzen- oder Tiergenerationen anders. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine stabile Eigenschaft die Fähigkeit, die Gentranscription in anschließenden Generationen einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Tiers aufrechtzuerhalten. Wenn die Expression induzierbar ist, umfasst die stabile Eigenschaft selbstverständlich auch die Eigenschaft, die Induzierbarkeit der Expression in anschließenden Generationen einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Tiers aufrechtzuerhalten. Häufig fallen die Expressionsniveaus mit steigender Zahl von Zellteilungen drastisch ab. Bei einem Verfahren der Erfindung ist es möglich, eine DNA-Sequenz, die in der Lage ist, den mit steigender Zahl von Zellteilungen auftretenden drastischen Abfall der Transcriptionsniveaus wenigstens zum Teil zu verhindern, nachzuweisen und gegebenenfalls zu selektieren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die die Gentranscription modulierende Eigenschaft also eine stabile Gentranscriptionseigenschaft. Verblüffenderweise können Fragmente, die eine DNA-Sequenz mit der stabilen Gentranscriptionseigenschaft umfassen, mit einem Verfahren der Erfindung nachgewiesen und gegebenenfalls selektiert werden, obwohl das Verfahren nicht notwendigerweise die langfristige Stabilität der Transcription misst. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die die Gentranscription modulierende Eigenschaft eine stabile, die Gentranscription verstärkende Eigenschaft. Es wurde beobachtet, dass der Einbau einer DNA-Sequenz mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft in einen Expressionsvektor mit einem interessierenden Gen nach Integration des Expressionsvektors in das Genom einer Zelle zu einem höheren Transcriptionsniveau des interessierenden Gens führt und dass das höhere Genexpressionsniveau außerdem stabiler ist als bei Abwesenheit der DNA-Sequenz mit der die Gentranscription modulierenden Eigenschaft.
  • In Experimenten, die so gestaltet wurden, dass ein interessierendes Gen in das Genom einer Zelle eingeführt wird und eine Expression des interessierenden Gens erhalten wird, wurde Folgendes beobachtet. Wenn zusammen mit dem interessierenden Gen auch eine DNA-Sequenz mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft eingeführt wurde, konnten mehr Klone nachgewiesen werden, die mehr als eine bestimmte Menge des Genprodukts des interessierenden Gens exprimierten, als wenn die DNA-Sequenz nicht zusammen mit dem interessierenden Gen eingeführt wurde. Die vorliegende Erfindung gibt also auch ein Verfahren zur Erhöhung der Zahl der Zellen an, die eine größere als eine bestimmte Menge eines Genprodukts eines interessierenden Gens exprimieren, wenn man das Genom der Zellen mit dem interessierenden Gen versehen hat, wobei das Verfahren das Versehen der Zelle mit einer DNA-Sequenz, die eine die Gentranscription modulierende Eigenschaft umfasst, zusammen mit dem interessierenden Gen umfasst.
  • Die Chancen für den Nachweis eines Fragments mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft variieren mit der Quelle, aus der die Fragmente stammen. Typischerweise gibt es kein a-priori-Wissen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Fragmenten mit dieser Eigenschaft. In diesen Situationen werden viele Fragmente keine DNA-Sequenz mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft umfassen. In diesen Situationen wird ein formaler Selektionsschritt für DNA-Sequenzen mit der Eigenschaft eingeführt. Dies geschieht durch Selektionsvektoren, die die Sequenz umfassen, auf der Grundlage eines Merkmals eines Produkts des Reporter-Gens, für oder gegen das selektiert werden kann. Zum Beispiel kann das Genprodukt eine Fluoreszenz einer Farbablagerung induzieren (z.B. grünes fluoreszentes Protein und Derivate, Luciferase oder Alkalische Phosphatase) oder Antibiotikum-Resistenz verleihen oder Apoptose und Zelltod induzieren.
  • Ein Verfahren der Erfindung ist besonders gut zum Nachweisen und gegebenenfalls Selektieren einer DNA-Sequenz, die eine die Gentranscription modulierende Eigenschaft umfasst, geeignet. Es wurde beobachtet, dass wenigstens einige der selektierten DNA-Sequenzen beim Einbau in einen Expressionsvektor, der ein interessierendes Gen umfasst, die Gentranscription des interessierenden Gens in einer Wirtszelle auch dann drastisch erhöhen können, wenn der Vektor kein Element mit einer die Gentranscription reprimierenden Eigenschaft umfasst. Diese die Gentranscription verstärkende Eigenschaft ist bei Zelllinien, die mit Fremdgenen transfiziert sind, oder bei transgenen Tieren und Pflanzen sehr nützlich.
  • Für die vorliegende Erfindung umfasst das Transcriptionssystem Wirtszellen. Die Verwendung von Wirtszellen garantiert, dass Fragmente mit Aktivität in Zellen nachgewiesen und gegebenenfalls selektiert werden.
  • Ein Element mit einer die Gentranscription reprimierenden Eigenschaft reprimiert bei einem Verfahren der Erfindung die von einem Promotor in dem verwendeten Transcriptionssystem ausgehende Transcription. Diese Repression muss nicht zu nicht nachweisbaren Expressionsniveaus führen. Wichtig ist, dass der Unterschied zwischen den Expressionsniveaus in Abwesenheit oder Anwesenheit von Repression nachweisbar und gegebenenfalls selektierbar ist. In einer bevorzugten Ausführungsform führt die Repression der Gentranscription in diesen Vektoren zu die Gentranscription reprimierendem Chromatin. In dieser bevorzugten Ausführungsform können DNA-Sequenzen nachgewiesen und gegebenenfalls selektiert werden, die wenigstens teilweise der Bildung von die Gentranscription reprimierendem Chromatin entgegenwirken können. In einem Aspekt umfasst eine DNA-Sequenz, die wenigstens teilweise der Bildung von die Gentranscription reprimierendem Chromatin entgegenwirken kann, eine stabile Gentranscriptionseigenschaft. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die an der Repression der Gentranscription beteiligte DNA-Sequenz eine DNA-Sequenz, die von einem Proteinkomplex erkannt wird, wobei das Transcriptionssystem diesen Komplex umfasst. Vorzugsweise umfasst der Komplex ein Heterochromatin-bindendes Protein, das HP1 umfasst, ein Protein der Polycomb-Gruppe (Pc-G), eine Histon-Deacetylase-Aktivität oder ein McCP2 (Methyl-CpG-bindendes Protein). Viele Organismen umfassen eines oder mehrere dieser Proteine. Diese Proteine zeigen häufig auch in anderen Spezies Aktivität. Der Komplex kann also auch Proteine von zwei oder mehr Spezies umfassen. Die genannte Menge von bekannten chromatinassoziierten Proteinkomplexen ist in der Lage, eine Repression mit großer Reichweite über viele Basenpaare hinweg zu vermitteln. Die Komplexe sind auch daran beteiligt, den reprimierten Zustand von Genen bei der Zellteilung stabil an Tochterzellen zu übertragen. Auf diese Weise selektierte Sequenzen sind in der Lage, eine Antirepression mit großer Reichweite über viele Basenpaare hinweg zu vermitteln (van der Vlag et al., 2000).
  • Der verwendete Vektor kann jeder Vektor sein, der zum Klonieren von DNA geeignet ist und der in einem Transcriptionssystem verwendet werden kann. Wenn Wirtszellen verwendet werden, ist der Vektor vorzugsweise ein episomal replizierender Vektor. Auf diese Weise werden Wirkungen aufgrund von ver schiedenen Integrationsstellen des Vektors vermieden. DNA-Elemente, die den Vektor an der Integrationsstelle flankieren, können Wirkungen auf das Transcriptionsniveau des Promotors haben und dadurch Wirkungen von Fragmenten nachahmen, die DNA-Sequenzen mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor einen Replikationsstartpunkt aus dem Epstein-Barr-Virus (EBV), OriP, und ein Zellkern-Antigen (EBNA-1). Solche Vektoren können in vielen Typen von eukaryontischen Zellen replizieren und setzen sich unter geeigneten Bedingungen zu Chromatin zusammen.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine DNA-Sequenz bereit, die Folgendes umfasst: i) eine DNA-Sequenz, die aus einer Pflanze oder einem Wirbeltier isoliert ist, oder Derivate davon oder ii) eine synthetische DNA-Sequenz oder eine, die mittels Gentechnik konstruiert wurde, wobei diese DNA-Sequenz eine repressionshemmende Sequenz ist, die nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen, selektiert und gegebenenfalls kloniert werden kann. In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine DNA-Sequenz bereit, die Folgendes umfasst: i) eine DNA-Sequenz, die aus einer Pflanze oder einem Wirbeltier isoliert ist, oder Derivate davon oder ii) eine synthetische DNA-Sequenz oder eine, die mittels Gentechnik konstruiert wurde, wobei diese DNA-Sequenz nach dem Verfahren der Erfindung nachgewiesen, selektiert und gegebenenfalls kloniert wird. Vorzugsweise umfasst die DNA-Sequenz eine Sequenz, wie sie in Tabelle 4 gezeigt ist, oder ein funktionelles Homologes davon. Ein funktionelles Homologes einer Sequenz, wie sie in Tabelle 4 gezeigt ist, ist eine Sequenz, die mit der in Tabelle 4 angegebenen Information davon abgeleitet ist, zum Beispiel eine Sequenz, die von einer Sequenz in Tabelle 4 abgeleitet sein kann, indem man Basen in oder aus einer in Tabelle 4 aufgeführten Sequenz deletiert, modifiziert und/oder insertiert, wobei die abgeleitete Sequenz dieselbe Aktivität in Bezug auf die Art, nicht notwendigerweise die Menge, wie eine in Tabelle 4 gezeigte Sequenz umfasst. Ein funktionelles Homologes ist weiterhin eine Sequenz, die einen Teil von zwei oder mehr Sequenzen, die in Tabelle 4 gezeigt sind, umfasst. Eine synthetische DNA-Sequenz ist eine Sequenz, die nicht direkt oder indirekt von einer in einem Organismus vorhandenen Sequenz abgeleitet ist. Zum Beispiel ist eine Sequenz, die eine scs- oder scs'-Sequenz von Drosophila umfasst, auch dann keine synthetische Sequenz, wenn die scs- oder scs'-Sequenz künstlich erzeugt wurde.
  • In einem Aspekt betrifft die Erfindung das zunehmende Wissen über Gen-Regulation höherer Ordnung sowie Mittel und Verfahren zur Nutzung dieses Wissens. Während Elemente wie klassische Promotoren und Enhancer charakterisiert wurden, die die Transcription einzelner Gene leiten und regulieren, haben regulatorische Elemente höherer Ordnung, die die Gentranscriptionsfähigkeiten von ganzen Chromosomenbereichen beherrschen, bisher nur wenig Aufmerksamkeit erhalten. Viele unserer Kenntnisse bezüglich solcher Elemente höherer Ordnung stammen aus dem Studium der Embryogenese. Während der Embryogenese werden Zellen auf verschiedene Entwicklungswege festgelegt. Wenn sie einmal festgelegt sind, ändern Zellen selten ihr Schicksal, auch nach vielen Zellteilungen nicht.
  • Es wurde zunehmend klar, dass die stabile Weitergabe von zelltypspezifischen Gentranscriptionsmustern nicht vom Zusammenhang eines Promotors abhängt, sondern von Veränderungen in der Struktur der DNA und von assoziierten Proteinen, die Chromatin genannt werden, vermittelt wird. Die Gen-Regulation auf dem chromosomalen Niveau beinhaltet Modifikationen der DNA (z.B. Methylierung), von Histonen (z.B. Acetylierung und/oder Methylierung) und Wechselwirkungen großer Reichweite zwischen entfernten chromosomalen Elementen.
  • Die Chromatinmatrize ist ein hochverdichteter Komplex aus DNA, Histonen und Nichthistonproteinen, der das gesamte Genom in den Zellkern packen und gleichzeitig die zweckmäßige Transcription von spezifischen Genen ermöglichen kann. Das eukaryontische Chromosom ist keine gleichmäßige Matrize für die Aktivierung der Gentranscription. Verschiedene Typen von Chromatin und Chromatinbereichen, die die Gentranscription unterschiedlich beeinflussen, können unterschieden werden. Die sogenannten Heterochromatinbereiche identifizieren "geschlossene" Chromatinstrukturen, während Euchromatin mit einer diffuseren und "offeneren" Chromatinstruktur assoziiert ist. Der Euchromatinbe reich kann strukturellen Änderungen unterliegen, die zu mehr oder weniger kondensierten Strukturen führen, welche als fakultatives Chromatin bzw. Euchromatin bezeichnet werden. Die Bildung von fakultativem Euchromatin oder Heterochromatin stellt vermutlich den Mechanismus dar, der der chromatinvermittelten Gen-Regulation zugrunde liegt, die Gene in einer zelltypspezifischen Weise in einem aktiven oder reprimierten Zustand hält.
  • Bei allen Eukaryonten wurden mehrere chromatinassoziierte Proteinkomplexe identifiziert, die an der Aufrechterhaltung der Zelltypspezifität beteiligt sind; einer davon ist der Polycomb-Gruppen(Pc-G)-Komplex. Der PcG-Komplex ist an der stabilen Repression von Genen beteiligt, wobei vermutlich Änderungen der Chromatinstruktur eine wichtige Rolle spielen. Ähnlich wurde eine zweite, Trithoraxgruppe (TrG) genannte Klasse von Proteinen identifiziert, die der Wirkung der PcG-Proteine entgegenwirken. TrG-Proteine sind an der Aufrechterhaltung der Gentranscription beteiligt. Aufgrund ihrer jeweiligen Wirkungsweisen stellen PcG- und TrG-Proteine daher ein zelluläres Gedächtnissystem dar, das für die vererbbare Weitergabe von Gentranscriptionsmustern wichtig ist.
  • Wie PcG- und TrG-Komplexe mit ihren Zielgenen assoziiert sind, ist noch unklar. Durch genetische Studien wurden cis-wirkende regulatorische Sequenzen charakterisiert, die transcriptionsinaktive Zustände von Genen aufrechterhalten. Die durch diese cis-wirkenden regulatorischen Sequenzen vermittelte Inaktivierung hängt von der Anwesenheit von funktionellen PcG-Proteinen ab, und daher wurden diese Sequenzen "PcG-Response-Elemente" (PREs) genannt. Es wurden Sequenzen identifiziert, die an der PcG-vermittelten Repression von Chromatin beteiligt sind. Bisher jedoch (sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Pflanzen) wurden keine vollständigen PREs gefunden, die die gesamte Sequenzinformation umfassen, die für die Vermittlung der Repression von Chromatin erforderlich ist.
  • Ein Polycomb-Gruppen-Response-Element ist ein Element, das die von einem Promotor ausgehende Transcription als Reaktion auf die direkte und/oder indirekte Wechselwirkung eines oder mehrerer Proteine der Polycomb-Gruppe mit dem Element reprimieren kann. Ein Polycomb-Gruppen-artiges Response- Element ist ein Polycomb-Gruppen-Response-Element oder alternativ dazu ein Element, das die von einem Promotor ausgehende Transcription aufgrund der direkten und/oder indirekten Wechselwirkung eines oder mehrerer Proteine mit dem Element reprimieren kann, wobei das eine oder die mehreren Proteine nicht zur Polycomb-Gruppe gehören, wobei aber die Gentranscription reprimierendes Chromatin als Ergebnis der Wechselwirkung gebildet wird. Beispiele für solche Proteine sind chromatinassoziierte Proteine, wie Heterochromatin-Protein 1 (HP1) (Eisenberg et al., 1990). Ein weiteres chromatinassoziiertes Protein, das die Genaktivität reprimiert, ist das Methyl-CpG-bindende Protein, McCP2 (Nan et al., 1997). In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Polycomb-Gruppen-artiges Response-Element der Erfindung die Fähigkeit, die von einem Promotor ausgehende Transcription über weite Abstände, vorzugsweise über mehr als 2000 Basenpaare, zu reprimieren (van der Vlag et al., 2000).
  • Ein Reporter-Gen ist ein Gen, das ein Expressionsprodukt codiert, dessen Anwesenheit in einer Zelle direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann.
  • Beispiele für DNA-Sequenzen mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft sind die sogenannten STAR-Elemente, die in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt sind.
  • Verfahren der Erfindung führen zum Klonieren und Identifizieren einer Anzahl von Elementen, die eine die Gentranscription modulierende Eigenschaft umfassen. Ein solches Element kann irrelevante Nucleinsäure enthalten, die für die Manifestierung dieser Eigenschaft nicht wirksam ist, die zum Beispiel nicht an der Bildung von die Gentranscription reprimierendem Chromatin beteiligt ist. Funktionelle Sequenzen in solchen Elementen können durch verschiedene Verfahren, die in der Technik bekannt sind, beschrieben werden. In einer Ausführungsform werden in einer DNA-Sequenz mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft Deletionen und/oder Substitutionen vorgenommen. DNA, die auf diese Weise modifiziert ist, wird in einem Verfahren der Erfindung auf Aktivität getestet. Dies kann unter Verwendung einer einzigen modifizierten Nucleinsäure oder durch Erzeugen einer Sammlung von Testnucleinsäuren, die die modifizierte Nucleinsäure umfassen, geschehen. Die Aufklärung von funktionellen Sequenzen innerhalb von DNA-Sequenzen der Erfindung ermöglicht die Aufklärung von Consensus-Sequenzen für Elemente mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft. Es wird erwartet, dass für ein Element, das eine die Gentranscription modulierende Eigenschaft umfasst, mehr als eine Art von Consensus-Sequenz gefunden wird. Die Erfindung stellt also weiterhin eine Bibliothek von isolierten und/oder rekombinanten Nucleinsäuren bereit, die die Gentranscription modulierende und/oder die Gentranscription reprimierende Eigenschaften umfassen, wie Polycomb-Gruppen-artige Response-Elemente. In einer Ausführungsform umfasst die Bibliothek isolierte und/oder rekombinante Nucleinsäuren, die dieselbe Consensus-Sequenz umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bibliothek mehr als eine Art von Consensus-Sequenz. Die Bibliothek kann zum Beispiel verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein gegebenes DNA-Molekül eine die DNA modulierende Eigenschaft umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bibliothek im Wesentlichen alle Elemente mit einer die Gentranscription verstärkenden Funktion, Elemente, die eine stabile Gentranscriptionseigenschaft umfassen, und/oder Elemente mit einer die Gentranscription reprimierenden Eigenschaft, wie Polycomb-Gruppen-artige Response-Elemente, eines Chromosoms. Zusammen mit Kenntnissen des Locus dieser Elemente auf einem Chromosom ermöglicht dies einem Fachmann die Gewinnung einer Vorhersage für die Regulation höherer Ordnung der Genexpression von Genen, die natürlicherweise auf dem Chromosom vorhanden sind, und für Gene (Fremdnucleinsäure), die durch rekombinante Mittel in das Chromosom eingeführt wurden. Eine solche Vorhersage kann zum Beispiel verwendet werden, um einen geeigneten, in Frage kommenden Locus auf dem Chromosom für die Einfügung von Fremd-DNA auszuwählen. Ein geeigneter Locus kann ein Locus sein, von dem erwartet wird, dass er in einer bestimmten Zelle, einem bestimmten Zelltyp und/oder einem bestimmten Gewebe spezifisch exprimiert wird. Vorzugsweise umfasst das Chromosom Chromosom 21 oder Chromosom 22. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform befinden sich alle DNA-Sequenzen, die eine die Gentranscription modulierende oder die Gentranscription reprimierende Eigenschaft in einer Zelle umfassen, in der Bibliothek. In dieser Ausführungsform kann das gesamte Genom für die Vorhersage eines geeigneten, in Frage kommenden Locus verwendet werden. In einer Ausführungsform wurde die Bibliothek in verschiedenen Zelllinien von Arten, die von Pflanzen bis zum Menschen reichen, erzeugt. In verschiedenen Zelllinien und/oder Spezies werden verschiedene Proteine (oder Proteinkomplexe), die mit DNA-Sequenzen mit einer die Gentranscription reprimierenden Eigenschaft Wechselwirken können, exprimiert, was zu verschiedenen DNA-Elementen mit einer die Gentranscription reprimierenden Eigenschaft führt. Ähnlich werden verschiedene Proteine exprimiert, die direkt oder indirekt mit DNA-Sequenzen wechselwirken, welche eine die Gentranscription modulierende Eigenschaft umfassen. Daher ist die Gestaltung der Bibliothek zelltypabhängig und von der Gegenwart der relevanten Proteine abhängig. Dies gilt auch für Polycomb-Gruppen-artige Response-Elemente. Wenn HP1 in einem ersten Zelltyp exprimiert wird, werden Elemente, die von HP1 abhängen, durch das Verfahren der Erfindung nachgewiesen. Wenn HP1 in einem zweiten Zelltyp nicht exprimiert wird, wird das Element, das aus dem ersten Zelltyp gewonnen wurde, durch das Verfahren der Erfindung nicht nachgewiesen.
  • In einem Aspekt der Erfindung umfasst die Bibliothek wenigstens ein Element, das wenigstens zum Teil der Bildung von die Gentranscription reprimierendem Chromatin entgegenwirken kann. Zusammen mit der Kenntnis des Locus von DNA-Sequenzen mit einer die Gentranscription reprimierenden Eigenschaft auf einem Chromosom oder Genom ermöglicht die Kenntnis des Locus solcher entgegenwirkender Elemente eine genauere Vorhersage der Regulation höherer Ordnung der Gentranscription von (eingefügten) Genen in dem Chromosom oder Genom. Vorzugsweise umfasst die Bibliothek weiterhin noch andere transcriptionsregulierende Elemente, wie Enhancer und Silencer. Obwohl solche Sequenzen nur einen begrenzten Einfluss auf die Gen-Regulation höherer Ordnung haben, erhöhen Informationen über den Locus solcher anderer Sequenzen die Genauigkeit der Vorhersage von geeigneten Loci im Genom für die Expression von dort eingeführten Fremdsequenzen weiter. Vorzugsweise umfasst die Bibliothek im Wesentlichen alle DNA-Sequenzen, die eine die Gentranscription modulierende Eigenschaft umfassen, und/oder alle anderen regulatorischen Sequenzen eines Chromosoms.
  • Wenn man in Betracht zieht, dass bereits ein Chromosom typischerweise aus mehreren zehn Millionen Basen besteht, ist die Information, die die Bibliothek über die Gen-Regulation höherer Ordnung liefern kann, vorzugsweise in ein wenigstens teilweise automatisiertes System eingebaut.
  • Eine weitere Verwendung einer Bibliothek der Erfindung ist die Gewinnung einer Vorhersage über die Transcription von Genen nach der zielgerichteten Modifikation von Sequenzen auf einem Chromosom, so dass regulatorische Sequenzen "höherer Ordnung" inaktiviert werden. Zum Beispiel können ein oder mehrere Polycomb-Gruppen-artige Response-Elemente der Erfindung und/oder andere regulatorische Elemente auf dem Chromosom inaktiviert werden. Es wird erwartet, dass dadurch die Transcriptionsniveaus der Gene, die sich in der Nähe der Polycomb-Gruppen-artigen Response-Elemente und/oder anderer die Expression modulierender Elemente befinden, verändert werden. Noch eine weitere Verwendung einer Bibliothek oder eines Systems der Erfindung ist die Vorhersage der Genexpression, die aus Inaktivierungen im Genom resultiert. In Fällen, bei denen eine Mutation zu einer veränderten Gentranscription führt, kann der Nachweis einer solchen veränderten Gentranscription die Anwesenheit der natürlich vorkommenden Mutation anzeigen. Dieser Ansatz ist zum Beispiel nützlich, um die Zahl der in einem diagnostischen Assay zu testenden Sequenzen oder Proteine einzuschränken. Dies ist besonders wichtig in Mikroarray-Ansätzen, weil bei diesen Ansätzen die Zahl der exprimierten Sequenzen, auf die getestet werden soll, durch die Zahl der Sequenzen, die ein Array maximal enthalten kann, beschränkt ist. Mit Mitteln und Verfahren der Erfindung ist es möglich, die Zahl der in Mikroarray-Ansätzen zu testenden Sequenzen zu begrenzen.
  • Noch eine weitere Verwendung eines Systems oder einer Bibliothek der Erfindung ist die Suche nach Wirkstoff-Targets. Regulatorische Elemente, ob es nun Elemente "höherer Ordnung" sind oder nicht, funktionieren wegen der Proteine (Komplexe), die daran binden können. Ein System der Erfindung kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob der zielgerichtete Einsatz von Wirkstoffen, die die Bindung oder Funktion eines bestimmten Proteins (oder Komplexes) stören sollen, für die Veränderung der Expression eines bestimmten Gens vielversprechend ist.
  • Es ist auch möglich, ein DNA-Konstrukt mit einer DNA-Sequenz der Erfindung zu versehen oder eine solche DNA-Sequenz zu modifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein DNA-Konstrukt bereitgestellt, das einen Promotor umfasst, der funktionell mit einer interessierenden Nucleinsäure verknüpft ist. Vorzugsweise hängt die Menge der Aktivität einer Eigenschaft der DNA-Sequenz mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft von der Orientierung der DNA-Sequenz in dem Konstrukt im Verhältnis zum Promotor ab. Vorzugsweise hängt die die Gentranscription modulierende Eigenschaft von der Anwesenheit eines Signals ab. Vorzugsweise umfasst das Signal ein DNA-bindendes Protein. Vorzugsweise umfasst das Signal ein TAT-Protein eines humanen Immunschwächevirus (HIV).
  • Eine der Verwendungen einer DNA-Sequenz, die eine die Gentranscription modulierende Eigenschaft umfasst, ist selbstverständlich die Regulation der Transcription eines interessierenden Gens. Die Transcription eines interessierenden Gens kann verändert werden, indem man Sequenzen in der Nähe des Gens so verändert, dass eine DNA-Sequenz mit dieser Eigenschaft bereitgestellt oder entfernt wird. Spezifische Expressionsmerkmale können gestaltet werden, indem man (Teile von) DNA-Sequenzen mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft kombiniert. Zum Beispiel führt die Verdopplung einer Sequenz mit einer stabilen Gentranscriptionseigenschaft in einem Expressionsvektor nach der Einführung des Vektors in eine Zielzelle zu einer verbesserten Stabilität der Expression in der Zielzelle oder deren Nachkommen. Durch Kombinieren von DNA-Sequenzen mit die Gentranscription modulierenden Eigenschaften können die Gentranscription modulierende Eigenschaften erzeugt werden, die in Bezug auf die Art oder die Menge verändert sind.
  • Es ist auch möglich, DNA-Sequenzen mit einer gewünschten die Gentranscription modulierenden Eigenschaft zu gestalten. DNA-bindende Proteine zusammen mit anderen Proteinen und DNA-Sequenzen bestimmen die Eigenschaften der DNA-Sequenz. Es ist möglich, eine oder mehrere andere proteinbindende DNA-Sequenzen in eine DNA-Sequenz mit einer Eigenschaft einzufügen. Indem man eine Bindung des bzw. der bindenden Proteine erlaubt, ist es möglich, die Eigenschaft zu stören oder zu lenken und somit die Erzeugung von DNA-Sequenzen mit gezielten Eigenschaften zu ermöglichen. Es ist selbstverständlich auch möglich, proteinbindende Stellen aus einer DNA-Sequenz mit einer bestimmten, die Gentranscription modulierenden Eigenschaft zu entfernen und dadurch die Eigenschaft der resultierenden DNA-Sequenzen zu verändern. Die Kombination von Hinzufügung und Entfernung ist ebenfalls möglich. Nach bestimmten die Gentranscription modulierenden Eigenschaften kann selektiert werden, indem man in der vorliegenden Erfindung beschriebene Nachweisverfahren abstimmt. Es ist zum Beispiel möglich, DNA-Sequenzen mit induzierbaren, die Gentranscription modulierenden Eigenschaften zu synthetisieren. Es stehen DNA-bindende Proteine zur Verfügung, die nur in Abwesenheit oder Anwesenheit eines Signals an ihre Zielsequenz binden. Nichteinschränkende Beispiele für solche Proteine sind der TET-Repressor und seine verschiedenen Mutationen, der lac-Repressor, Steroidhormonrezeptoren, der Retinsäure-Rezeptor und Derivate. Es ist zum Beispiel möglich, eine DNA-Sequenz mit einer zelltypspezifischen, die Gentranscription modulierenden Eigenschaft zu gestalten. Die DNA-Sequenz kann spezifisch für einen Proteinkomplex gemacht werden, der in zelltypspezifischer Weise exprimiert wird.
  • Expressionskonstrukte, die eine DNA-Sequenz umfassen, die eine die Gentranscription modulierende Eigenschaft umfassen, sind geeignet, um eine Expression ausgehend von dem Konstrukt in Zellen zu erhalten, die mehr als eine Kopie des Expressionskonstrukts umfassen, auch wenn das Expressionskonstrukt in dem Genom der Zelle vorhanden ist und auch wenn die Expressionscassette in mehr als einer Kopie in der Zelle vorhanden ist. Außerdem funktionieren sie sogar dann, wenn sie in mehr als einer Kopie in derselben Position integriert sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die DNA-Sequenz mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft eine sogenannte STAR-Sequenz (stabilisierende Antirepressionssequenz). Der hier verwendete Ausdruck "STAR-Sequenz" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die eine oder mehrere der genannten, die Gentranscription modulierenden Eigenschaften umfasst.
  • Mehrere Verfahren werden hier vorgestellt, um zu bestimmen, ob eine Sequenz STAR-Aktivität umfasst. STAR-Aktivität ist bestätigt, wenn die Sequenz wenigstens eine der folgenden Funktionen ausführen kann: (i) wenigstens zum Teil die Wirkung der Sequenz, die ein die Gentranscription reprimierendes Element der Erfindung umfasst, zu hemmen, (ii) wenigstens zum Teil die chromatinassoziierte Repression zu blockieren, (iii) wenigstens zum Teil die Aktivität eines Enhancers zu blockieren, (iv) einer funktionell verknüpften Nucleinsäure, die eine Transcriptionseinheit codiert, im Vergleich zu derselben Nucleinsäure allein Folgendes zu verleihen: (iv-a) eine bessere Vorhersagbarkeit der Transcription, (iv-b) eine höhere Transcription und/oder (iv-c) eine höhere Stabilität der Transcription im Laufe der Zeit.
  • Die große Zahl von in der vorliegenden Erfindung identifizierten Sequenzen, die STAR-Aktivität umfassen, eröffnet eine Vielzahl von Möglichkeiten, um Sequenzen, die dieselbe Aktivität in Bezug auf die Art, nicht notwendigerweise die Menge, umfassen, zu erzeugen und zu identifizieren. Zum Beispiel liegt es ohne weiteres im Bereich des fachmännischen Könnens, die in der vorliegenden Erfindung identifizierten Sequenzen zu verändern und die veränderten Sequenzen auf STAR-Aktivität zu testen. Solche veränderten Sequenzen sind daher ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Die Veränderung kann eine Deletion, Insertion und Mutation von einer oder mehreren Basen in den Sequenzen umfassen.
  • Sequenzen, die STAR-Aktivität umfassen, wurden in Abschnitten von 400 Basen identifiziert. Es wird jedoch erwartet, dass nicht alle dieser 400 Basen erforderlich sind, um die STAR-Aktivität zu behalten. Verfahren zur Abgrenzung der Sequenzen, die einem Fragment mit zwischen 400 und 5000 Basen eine bestimmte Eigenschaft verleihen, sind wohlbekannt. Die minimale Sequenzlänge eines Fragments, das STAR-Aktivität umfasst, wird auf etwa 50 Basen geschätzt.
  • STAR-Aktivität ist ein Merkmal, das den in 20 aufgeführten Sequenzen gemeinsam ist.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine isolierte und/oder rekombinante Nucleinsäuresequenz bereit, die eine STAR-Sequenz umfasst und nach einem Verfahren der Erfindung erhältlich ist.
  • Wie oben erwähnt, kann eine STAR-Sequenz ihre Aktivität gerichtet ausüben, d.h., mehr auf eine Seite des Fragments, das die Sequenz enthält, als auf eine andere. Außerdem kann STAR-Aktivität in Bezug auf die Menge verstärkt werden, indem man die Zahl der STAR-Elemente vervielfacht. Letzteres lässt vermuten, dass ein STAR-Element ein oder mehrere Elemente, die STAR-Aktivität umfassen, umfassen kann.
  • Der Ausdruck "Eigenschaft" in Bezug auf eine Sequenz bezieht sich auf eine Aktivität der Sequenz. Der hier verwendete Ausdruck "STAR", "STAR-Sequenz" oder "STAR-Element" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die eine oder mehrere der genannten, die Gentranscription modulierenden Eigenschaften umfasst. Der hier verwendete Ausdruck "DNA-Sequenz" bezieht sich, wenn nichts anderes angegeben ist, nicht auf eine Liste einer spezifischen Reihenfolge von Basen, sondern auf ein physisches Stück DNA. Eine Transcriptionseigenschaft in Bezug auf eine DNA-Sequenz bezieht sich auf eine Wirkung, die diese DNA-Sequenz auf die Transcription eines interessierenden Gens hat. Der hier verwendete Ausdruck "Eigenschaft" bezieht sich auf nachweisbare Eigenschaften oder Attribute einer Nucleinsäure oder eines Proteins in einem Transcriptionssystem.
  • Beispiele
  • Beispiel 1. Verfahren zum Isolieren von STAR-Elementen
  • Materialien und Verfahren
  • Plasmide und Stämme. Der Selektionsvektor für STAR-Elemente, pSelect-SV40-zeo ("pSelect", 1), wird wie folgt aufgebaut: Der pREP4-Vektor (Invitrogen V004-50) wird als Plasmidgerüst verwendet. Er liefert den Replikationsstartpunkt oriP des Epstein-Barr-Virus und das Zellkern-Antigen EBNA-1 für eine episomale Replikation in hoher Kopienzahl in Primatenzelllinien; das Hygromycin-Resistenz-Gen mit dem Thymidin-Kinase-Promotor und der Polyadenylierungsstelle für die Selektion in Säugerzellen; und das Ampicillin-Resistenz-Gen und den Replikationsstartpunkt colE1 für die Haltung in Escherichia coli. Der Vektor enthält vier aufeinanderfolgende LexA-Operator-Stellen zwischen einer XbaI- und einer NheI-Restriktionsstelle (Bunker und Kingston, 1994). Eingebettet zwischen die LexA-Operatoren und die NheI-Stelle ist ein Polylinker, der aus den folgenden Restriktionsstellen besteht: HindIII-AscI-BamHI-AscI-HindIII. Zwischen der NheI-Stelle und einer SalI-Stelle befindet sich das Zeocin-Resistenz-Gen mit dem SV40-Promotor und der Polyadenylierungsstelle, die von pSV40/Zeo (Invitrogen V502-20) abgeleitet sind; dies ist der Selektionsmarker für das STAR-Screening.
  • Der pSDH-Vektor (2) wird wie folgt aufgebaut: Das Luciferase-Reporter-Gen aus pGL3-Control (Promega E1741) wird durch PCR amplifiziert und in SacII/BamHI-verdautes pUHD10-3 (Gossen und Bujard, 1992) eingesetzt. Dadurch wird die Luciferase unter die Kontrolle des Tet-Off-Promotors gestellt, stromaufwärts des SV40-Polyadenylierungssignals. Multiple Klonierungsstellen werden durch PCR stromaufwärts des Tet-Off-Promotors (MCSI, XhoI-NotI-EcoRI-SalI) und stromabwärts des Polyadenylierungssignals (MCSII, NheI-BgIII-EcoRV-HindIII) eingeführt.
  • Genbibliotheken werden durch Sau3AI-Verdau von humaner genomischer DNA aufgebaut, die entweder aus Plazenta gereinigt (Clontech 6550-1) wird oder in künstlichen bakteriellen/P1(BAC/PAC)-Chromosomen enthalten ist. Die BAC/PAC-Klone enthalten genomische DNA aus dem cytogenetischen 1q12-Berech (Klone RP1154H19 und RP3328E19) oder aus dem HOX-Cluster von homeotischen Genen (Klone RP1167F23, RP1170019 und RP11387A1). Die DNAs werden nach Größe fraktioniert, und die Fraktion mit einer Größe von 0,5 bis 2 kb wird mit Standardtechniken (Sambrook et al., 1989) in einen BamHI-verdauten pSelect-Vektor ligiert.
  • Der Aufbau der Wirtsstämme wurde beschrieben (van der Vlag et al., 2000). Kurz gesagt, sie beruhen auf der humanen Osteosarkom-Zelllinie U-2 OS (American Type Culture Collection HTB-96). U-2 OS ist stabil mit dem Plasmid pTet-Off (Clontech K1620-A) transfiziert, das eine Proteinchimäre codiert, die aus der DNA-bindenden Domäne des Tet-Repressors und der VP16-Transaktivierungsdomäne besteht. Die Zelllinie wird anschließend stabil mit Fusionsprotein-Genen transfiziert, die die DNA-bindende Domäne von LexA und die codierenden Bereiche von entweder HP1 oder HPC2 (zwei Drosophila-Proteine der Polycomb-Gruppe, die die Genexpression reprimieren, wenn sie mit einem Spacer an DNA gebunden werden) enthalten. Die LexA-Repressorgene stehen unter der Kontrolle des Tet-Off-Transcriptionsregulationssystems (Gossen and Bujard, 1992).
  • Bibliotheks-Screening und Charakterisierung von STAR-Elementen
  • Die U-2-OS/Tet-Off/LexA-Repressorzelllinie wird durch Calciumphosphatfällung mit den Genbibliotheken in pSelect transfiziert (Graham und van der Eb, 1973; Wigler et al., 1978), wie es vom Hersteller des Transfektionsreagens (Life Technologies) empfohlen wird. Transfizierte Zellen werden 1 Woche lang (bis 50% Konfluenz) unter Hygromycin-Selektion (25 μg/ml) und Tetracyclin-Repression (Doxycyclin, 10 ng/ml) kultiviert. Dann wird die Doxycyclin-Konzentration auf 0,1 ng/ml reduziert, um die LexA-Repressor-Gene zu induzieren, und nach 2 Tagen wird Zeocin bis auf 250 μg/ml hinzugefügt. Die Zellen werden weitere 4-5 Wochen kultiviert, bis die Kontrollkulturen (mit leerem pSelect transfiziert) durch das Zeocin abgetötet sind.
  • Zeocin-resistente Kolonien aus der Bibliothekstransfektion werden vermehrt, und Plasmid-DNA wird isoliert und durch Standardtechniken (Sambrook et al., 1989) in E. coli gerettet. Die in Frage kommenden STAR-Elemente in der geretteten DNA werden nach Retransfektion auf U-2-OS/Tet-Off/LexA-Repressorzellen und Senkung der Doxycyclin-Konzentration durch Restriktionsendonuclease-Kartierung (Sambrook et al., 1989), DNA-Sequenzanalyse (Sanger et al., 1977) und in Bezug auf STAR-Aktivität (Zeocin-Resistenz) analysiert.
  • In Frage kommende STAR-Elemente, die eine DNA-Sequenz aufweisen, die der bekannten Sequenz im Humangenom entspricht, werden durch BLAST-Recherchen (Altschul et al., 1990) der Humangenomdatenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/HsBlast.html 20. Juni 2001) identifiziert. Die chromosomalen Loci der Elemente werden zusammen mit dem Anteil an repetitiver DNA und der Identität der benachbarten Gene aufgezeichnet.
  • Diejenigen in Frage kommenden Elemente, die nach Retransfektion STAR-Aktivität zeigen, werden durch Subklonieren des STAR-Fragments in das pSDH-Plasmid und stabile Integration in chromosomale DNA von U-2 OS näher charakterisiert. U-2-OS-Zellen werden mit pSDH-Plasmiden und pBABE-puro (Morgenstern and Land, 1990) cotransfiziert und in Bezug auf Puromycin-Resistenz selektiert. Pro STAR-Element werden Populationen von ungefähr 30 individuellen Klonen isoliert und kultiviert. Die Klone werden in regelmäßigen Abständen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Roche 1669893) auf Luciferase-Aktivität getestet.
  • Ergebnisse
  • Funktionelle Charakterisierung der STAR-Elemente. Das Screening von humaner genomischer DNA und des HOX- und 1q12-Locus ergab 17 mutmaßliche STAR-Elemente. Die Kriterien sind, dass (1) die Elemente nach Retransfektion der auf pSelect basierenden Klone in die Wirts-U-2-OS-Human-Osteosarkom-Zelllinie STAR-Aktivität aufwiesen (was darauf hinweist, dass die im anfänglichen Screening exprimierte Antirepressoraktivität plasmidspezifisch und nicht auf artefaktische Veränderungen in den Wirtszellen zurückzuführen ist); (2) die Elemente eine DNA-Sequenz enthalten, die zu der Sequenz in der Humangenomsequenz-Datenbank passt (was darauf hinweist, dass der Klon keine kontaminierende DNA-Sequenz enthält, zum Beispiel von bakteriellen oder Vektorquellen).
  • Die STAR-Elemente werden in das pSDH-Plasmid subkloniert und in das Wirtszellgenom integriert. Die Expression der Reporter-Gene wird in Populationen von stabilen Transfektanten bestimmt, um die Fähigkeit der STAR-Elemente nachzuweisen, Reporter-Gene nach zufälliger Integration in das Genom vor Inaktivierung zu schützen. Dadurch erhält man Informationen (1) über den Anteil von Klonen, die eine hohe Expression aufweisen, und (2) über den Grad der Überexpression, der durch die STAR-Elemente hervorgerufen wird.
  • Die Expression des Luciferase-Reporter-Gens durch einen Klon gilt als signifikant, wenn die doppelt so groß ist wie das durchschnittliche Niveau für die Plasmide, die keine STAR-Elemente enthalten (das Referenzniveau). Für alle Plasmide wird eine Verteilung des Expressionsniveaus unter den Klonen von keiner Expression bis zu einer Expression, die signifikant oberhalb des Referenzniveaus liegt, und von wenigen Überexprimierern bis zu vielen Überexprimierern beobachtet. Eine überlegene STAR-Aktivität manifestiert sich in Plasmiden, die zu vielen überexprimierenden Klonen einschließlich einiger in hohem Maße überexprimierender Klone führen. Ergebnisse eines repräsentativen Experiments sind in Tabelle 1 und in den 3 bis 5 gezeigt:
  • Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die humanen STAR-Elemente, die getestet werden, einen viel höheren Anteil an überexprimierenden Klonen ergeben als das ungeschützte Reporter-Gen oder das Reporter-Gen, das vom Drosophila-SCS-Element geschützt wird (Kellum and Schedl, 1992). Weiterhin ist der Grad der Überexpression durch diese Plasmide ausgehend vom STAR-geschützten Reporter-Gen viel größer als ausgehend vom ungeschützten oder SCS-geschützten Reporter-Gen.
  • Sequenz und genomische Positionsdaten des STAR-Elements. Tabelle 2 führt die chromosomalen Loci von jedem der 17 STAR-Elemente sowie die Identität von nahegelegenen Genen und den Gehalt der Elemente an repetitiver DNA auf. Die STAR-Elemente sind über mehrere Chromosomen verteilt. Sie sind unterschiedlich in ihrer tatsächlichen DNA-Sequenz und ihrem Gehalt an repetitiver DNA und weisen verschiedene Grade der Assoziation mit benachbarten Genen auf.
  • Beispiel 2. Expressionsmerkmale des Transgens, die auf STAR zurückzuführen sind.
  • Hintergrund: Ortsspezifische Rekombination wird verwendet, um heterologe DNAs genau aus ihren chromosomalen Loci zu entfernen. Dies wird routinemäßig durch eines von zwei Systemen durchgeführt: Die cre-Rekombinase und das loxP-Target von Bakteriophage P1 (Feng et al., 1999) oder die FLP-Recombinase und FRT (FLP-Recombinase-Target) von Hefe (Wigley et al., 1994). In diesen Systemen ist ein DNA-Bereich (der gewöhnlich ein Reporter-Gen und/oder einen Selektionsmarker enthält) im Chromosom vom loxP- oder FRT-Target flankiert. Die Aktivität der Rekombinase katalysiert dann das genaue Herausschneiden des DNA-Bereichs aus dem Chromosom. Die Rekombinase löst ihre beiden Erkennungssequenzen zu einer einzigen Stelle auf und deletiert die Sequenz dazwischen. So muss ein DNA-Stück von Targetstellen flankiert sein, um anschließend in vivo nach Einführung oder Aktivierung von Rekombinase deletiert zu werden (Schwenk et al., 1995; Dymecki, 1996). Die Cre- und die Flp-Rekombinase katalysieren die Rekombination zwischen zwei Inverted Repeats von 13 Basenpaaren, die durch einen Spacer mit mindestens 6 (loxP) oder 8 (FRT) Basenpaaren voneinander getrennt sind (Senecoff et al., 1985). Die loxP-Sequenz ist ATAACTTCGTATA, und die FRT-Sequenz ist GAAGTTCCTATAC.
  • Vorschrift: Unter Verwendung von herkömmlicher DNA-Klonierung (Sambrook et al., 1989) wird ein Reporter-Gen (das ein Reporter-Protein, zum Beispiel grünes fluoreszentes Protein (GFP) (Bierhuizen et al., 1997) oder Luciferase (Himes und Shannon, 2000) codiert) konstruiert, das in einem Plasmid von einem Paar von STAR-Elementen flankiert ist. In jedem Fall sind die Elemente selbst von Recombinase-Targetstellen flankiert. Ein Element ist von einem Paar von loxP-Stellen flankiert, und das andere ist von einem Paar von FRT-Stellen flankiert (1). Nach der Transfektion integriert sich das Plasmid in einem kleinen Prozentanteil von Zellen in das Wirtschromosom, und die Integranten werden anhand von Antibiotikum-Resistenz selektiert.
  • Unter Verwendung von herkömmlichen Techniken ("SuperFect Transfection Reagent Handbook", Qiagen, November 1997) wird die humane Osteosarkom-Zelllinie U-2 OS mit diesen Plasmiden transfiziert und in Bezug auf Hygromycin-Resistenz selektiert. Hygromycin-resistente Isolate haben das Plasmid stabil in das Genom der Zelllinie integriert. Individuelle Isolate werden in Zellkulturmedium vermehrt, und die Expression des transgenen Reporter-Gens wird zum Beispiel mittels Durchflusscytometrie bestimmt (Stull et al., 2000).
  • Dann werden die obigen stabilen Isolate unter Verwendung von herkömmlichen Techniken (Transfektion oder Hormonstimulation) so behandelt, dass Recombinase-Aktivität eingeführt oder aktiviert wird. Dies erfolgt sequentiell, so dass zum Beispiel die cre-Recombinase-Aktivität das Herausschneiden von STAR1 katalysiert und anschließend die FLP-Recombinase-Aktivität das Herausschneiden von STAR2 katalysiert. Das Expressionsniveau des Reporter-Gens in diesen Zellen wird bestimmt, und der Wert wird mit dem Referenzwert vom parentalen STAR-haltigen Isolat verglichen.
  • Beispiel 3. Sequenzanalyse von STARs; Bestimmung einer minimalessentiellen Sequenz für die Funktion des Elements; Sequenzkonservierung zwischen Elemente; und Eigenschaften von Tandem- und multiplen Elementen
  • Hintergrund: DNA-Fragmente, die STAR-Elemente enthalten, werden durch genetische Selektion unter Verwendung des Plasmids pSelect (1) isoliert.
  • Dieser Abschnitt beschreibt den Ansatz zur Charakterisierung der DNA-Sequenzen innerhalb derjenigen Fragmente, die STAR-Aktivität haben.
  • Vorschriften
  • DNA-Sequenz: Oligonucleotide werden zum Sequenzieren der DNA-Fragmente auf der Basis der Sequenz des pSelect-Plasmids bezeichnet. Die Fragmente werden unter Verwendung der Didesoxy-Kettenabbruchtechnik (Sanger et al., 1977) sequenziert. Dann werden die DNA-Sequenzen in Bezug auf die Chromosomenposition lokalisiert, und zwar unter Verwendung der öffentlichen Humangenomsequenzdatenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/cgi-bin/Entrez/hum_srch?chr=hum_chr.inf&query). Die Gene und die Gendichte in der Nähe der Fragmentsequenz werden aus der Annotation der Genomsequenz aufgezeichnet. Die Transcriptionsaktivität dieser Gene wird aus öffentlichen Datenbanken von DNA-Mikroarray- (http://arrays.rockefeller.edu/xenopus/links.html) und SAGE-Daten (Serial Analysis of Gene Expression; http://bioinfo.amc.uva.nl/HTM-bin/index.cgi) bestimmt. Sobald die Positionsinformation zu den STAR-Sequenzen zusammengestellt ist, werden die Daten in Bezug auf zugrundeliegende Consensussequenzen analysiert. Consensussequenzen oder Trends (darunter versteht man lokale Bereiche, die reich an besonderen Nucleotidkombinationen, z.B. reich an C- und G-Basen sind) werden unter Verwendung von Ähnlichkeitssuchalgorithmen, wie ClustalW (Higgins et al., 1996) und BLOSUM-Ähnlichkeitsbewertung (Altschul und Gish, 1996) nachgewiesen. Dann werden alle gefundenen Consensus oder Trends verwendet, um andere potentielle STAR-Elemente auf genomischem Maßstab zu identifizieren, indem man BLAST-Recherchen (Altschul et al., 1990) durchführt.
  • In früheren Forschungen wurden transcriptionsregulatorische Proteine identifiziert, die an bekannten Isolatoren und Grenzelemente binden (Gaszner et al., 1999; Gerasimova und Corces, 1998). In den beschriebenen Beispielen fallen die Proteinbindungsstellen mit gegenüber DNase I hyperempfindlichen Stellen zusammen, die für die Isolator- oder Grenzfunktion wesentlich sind. Die Hypothese, dass STAR-Elemente auch von bekannten regulatorischen Proteinen gebunden werden, wird untersucht, indem man die TRANSFAC-Datenbank von Transcriptionsfaktoren (http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/) nach Sequenzmotiven durchsucht, die in den STAR-Elementen vorkommen. Sequenzmotive, die den Vertretern der STAR-Sammlungen gemeinsam sind, weisen darauf hin, dass der entsprechende Transcriptionsfaktor an dieses Element bindet.
  • Minimalessentielle Sequenz: Unter Verwendung dieser Sequenz werden bekannte STAR-Elemente verkürzt und auf Funktionalität getestet. Dies geschieht unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Klonieren von Subfragmenten der STAR-haltigen Fragmente in pSelect durch Standardtechniken (Sambrook et al., 1989). Mit den Plasmiden, die die Subfragmente enthalten, werden U-2-OS-Zellen transfiziert und auf Funktionalität getestet, indem man auf Antibiotikum-Resistenz testet.
  • Direktionalität: Die STAR-Elemente werden unter Verwendung des pSelect-Plasmids auf ihre Direktionalität getestet. Zum Beispiel wird die Richtung von STAR-Elementen, die durch das pSelect-Screening isoliert werden, als 5'3'-Orientierung bezeichnet. Die Orientierung des Elements wird durch herkömmliche DNA-Rekombinationstechniken umgekehrt (Sambrook et al., 1989). Mit den resultierenden Plasmiden wird die U-2-OS-Zelllinie transfiziert, und die Expression des Reporter-Gens wird getestet (Bierhuizen et al., 1997; Himes und Shannon, 2000). Das Expressionsniveau des Plasmids mit dem Element in umgekehrter Orientierung wird mit derjenigen des Elements mit der 5'3'-Orientierung verglichen. Wenn das Plasmid mit der umgekehrten Orientierung ähnliche Expressionsniveaus hat, weist das STAR-Element keine Direktionalität auf.
  • Kombinationen und Vervielfachung von Elementen: Um zu bestimmen, ob STAR-Elemente in gemischten Paaren funktionieren können, werden verschiedene Elemente miteinander kombiniert und getestet. Die Analyse wird im pSDH-Plasmid durchgeführt, indem man ein STAR-Element durch DNA-Rekombinationstechniken (Sambrook et al., 1989) in MCSI und ein anderes STAR-Element in MCSII einfügt. Die resultierenden Plasmide werden transfiziert, und die Expression des Reporter-Gens wird getestet (Bierhuizen et al., 1997; Himes und Shannon, 2000); die Ergebnisse werden mit der Expression von Plasmiden verglichen, die dasselbe Element an MCSI und MCSII enthalten; wenn die Expression bei den beiden Arten von Plasmiden ähnlich ist, wird daraus geschlossen, dass verschiedene STAR-Elemente einander nicht stören.
  • Die Stärke einzelner STAR-Elemente wird mit der von Tandem-Repeats von Elementen verglichen. Dies geschieht durch Concatamerisierung der interessierenden STAR-Elemente mit DNA-Ligase und Insertion des Ligierungsprodukts in das pSDH-Plasmid durch DNA-Rekombinationstechniken (Sambrook et al., 1989). Mit den resultierenden Plasmiden werden U-2-OS-Zellen transfiziert und die Expression des Reporter-Gens wird getestet (Bierhuizen et al., 1997; Himes und Shannon, 2000); die Ergebnisse werden mit der Expression von Plasmiden verglichen, die einzelne STAR-Elemente enthalten.
  • Beispiel 4. Bestimmung des Abstandes, über den hinweg ein STAR funktioniert.
  • Hintergrund: STAR-Elemente werden verwendet, um die Expression von einzelnen und mehrfachen Transgenen zu optimieren. Um zu bestimmen, ob ein einzelnes Paar von STAR-Elementen große und mehrfache Transgene vor der Inaktivierung schützen kann, ist es notwendig, die Reichweite zu bestimmen, über die STAR-Elemente wirken.
  • Vorschrift: STAR-Elemente werden auf ihre Funktionalität über Abstände hinweg unter Verwendung von Derivatplasmiden auf der Basis von pSelect wie folgt getestet. Eine Bibliothek von zufälligen DNA-Fragmenten von 500 bp bis 10 kb wird durch Standard-DNA-Klonierungstechniken (Sambrook et al., 1989) zusammengesetzt. Fragmente, die keine STAR-Aktivität besitzen, werden aus dieser Bibliothek selektiert, indem man sie im pSelect-Plasmid testet, wie es oben beschrieben ist. Für STAR-Elemente werden diese Fragmente in dem geeigneten pSelect-Plasmid zwischen der Klonierungsstelle und dem Promotor des Reporter-Gens eingefügt (1). Mit diesem Satz von Plasmiden wird die U-2-OS-Zelllinie transfiziert, und die Expression wird so gemessen, wie es oben beschrieben ist. Die Stärke der Expression des Reporter-Gen korreliert mit der Länge des zufälligen DNA-Fragments, das das STAR-Element vom Promotor trennt.
  • Beispiel 5. Bestimmung der maximalen Länge von STAR-Elementen
  • Hintergrund: STAR-Elemente werden als Fragmente von DNA kloniert, die unter Verwendung des pSelect-Plasmids gewonnen werden, was mit genomischen DNA-Fragmenten von weniger als 2 kb erfolgt. Diese könnten jedoch Teile eines ausgedehnteren STAR-Elements sein. Eine ausgedehnte STAR-Aktivität wird durch die folgenden Experimente untersucht.
  • Vorschrift: In pSelect klonierte STAR-Elemente werden auf die Humangenomsequenz kartiert. Um zu bestimmen, ob sie Teile eines ausgedehnteren STAR-Elements sind, werden Bereiche von 4 kb, die die Klone umfassen, durch PCR amplifiziert und durch Standard-DNA-Rekombinationstechniken (Sambrook et al., 1989) in das pSelect und/oder pSDH-Plasmid kloniert. Mit den resultierenden Plasmiden werden U-2-OS-Zellen transfiziert und auf Expression des Reporter-Gens getestet, wie es oben beschrieben ist; Plasmide, die das ursprüngliche 2-kb-STAR-Element enthalten, werden als Kontrolle mitverwendet. Drei mögliche Ergebnisse sind zu erwarten: (1) eine ähnliche Expression durch die Kontrolle und durch die ausgedehnten STAR-Isolate, was beweisen würde, dass das STAR-Element auf das ursprüngliche 2-kb-Fragment beschränkt ist; (2) eine geringere Expression durch die ausgedehnten STAR-Isolate, was vermuten ließe, dass das STAR-Element innerhalb des 2-kb-Fragments enthalten ist und nicht effektiv über einen großen Abstand wirkt oder dass das ausgedehnte Fragment ein Element mit einer die Gentranscription reprimierenden Eigenschaft enthält; (3) eine höhere Expression durch die ausgedehnten STAR-Isolate, was vermuten ließe, dass der ausgedehnte Bereich ein vollständigeres STAR-Element enthält. Im Falle von Ergebnis (3) wird der Versuch mit einem größeren PCR-Fragment von 6 kb wiederholt.
  • Ein STAR-Element kann auch ein Verbund von Stellen sein, an den verschiedene Proteine binden. Daher könnten große DNA-Fragmente mit STAR-Aktivität zu kleineren Fragment mit STAR-Aktivität unterteilbar sein (siehe Beispiel 3). Elemente, die größer als 2 kb sind, werden als STAR-Elemente anerkannt, wenn sie nach einer Verkürzung auf weniger als 2 kb (auch durch interne Deletion) noch STAR-Aktivität aufweisen.
  • Beispiel 6. Methylierungs- und Histonacetylierungszustände von STAR-Elementen und von den benachbarten Transgenen.
  • Hintergrund: Die regulatorischen Eigenschaften von STAR-Elementen sind mit der lokalen Chromatinstruktur assoziiert, die durch die DNA selbst und durch DNA-assoziierte Proteine bestimmt wird. Änderungen in der Chromatinstruktur, die mit Änderungen in der Genexpression assoziiert sind, entstehen häufig durch sekundäre Modifikationen der Makromoleküle, insbesondere Methylierung von DNA oder Acetylierung von Histonproteinen. Durch Identifizieren der sekundären Modifikationen, die an STAR-Elementen und an benachbarten Transgenen auftreten, erhält man Merkmale für diese Elemente.
  • Vorschrift: DNA-Methylierung: STAR-Elemente werden durch Standardtechniken (Sambrook et al., 1989) in das pSelect-Plasmid kloniert. U-2-OS-Zellen werden stabil mit diesen Plasmiden und mit pSelect, dem ein STAR-Element fehlt, als Kontrolle transfiziert, um die basale DNA-Methylierung am Reporter-Gen zu bestimmen. Nach Standardverfahren (Thomas, 1998) werden Zellen geerntet und das Chromatin gereinigt. Die DNA wird in getrennten Reaktionen mit den Restriktionsendonucleasen HpaII und MspI verdaut (Sambrook et al., 1989). Diese Restriktionsenzyme sind beide in der Lage, die nichtmethylierte Sequenz CCGG zu schneiden. Wenn das äußere C methyliert ist, können MspI und HpaII beide nicht spalten. Im Unterschied zu HpaII kann MspI jedoch die Sequenz spalten, wenn das innere C methyliert ist. Die DNA wird einem Southern-Blotting unterzogen, und der Blot wird durch indirekte Endmarkierung analysiert (Pazin and Kadonaga, 1998). Als Kontrolle wird das entsprechende pSelect-Plasmid als nackte, unmethylierte DNA ebenfalls mit den beschriebenen Enzymen geschnitten und einem Southern-Blotting unterzogen. Ein Vergleich der verschiedenen Größen der DNA-Fragmente zeigt, ob die DNA in vivo methyliert ist oder nicht.
  • Histon-Acetylierung: Für diese Experimente werden dieselben transfizierten Zelllinien verwendet, die auch für die DNA-Methylierungsanalyse verwendet wurden. Das im Folgenden beschriebene Verfahren ergibt eine hochaufgelöste Karte des Histon-Acetylierungsmusters auf den STAR-Elementen und dem Reporter-Gen (Litt et al., 2001). Produkte der Verdauung von Zellkernen mit Micrococcus-Nuclease werden auf Saccharose-Gradienten fraktioniert, und gereinigte Nucleosom-Monomere und -Dimere werden durch Immunfällung mit Anti-Acetylhiston-Antikörpern mit acetylierten Histonen angereichert. Die Nucleosomfraktion und die Immunopräzipitate werden einer Analyse unterzogen, zum Beispiel durch Echtzeit-PCR (Jung et al., 2000) unter Verwendung von Primern und einer Tagman-Sonde, die mit dem Reporter-Gen oder dem STAR-Element unter Bildung von 0,2-kb-Produkten mit einem Bewegungsfenster von 0,1 kb assoziieren. Dann wird die Geschwindigkeit der Erhöhung des Fluoreszenzsignals der Taqman-Sonde während der PCR (die der Häufigkeit der Matrizen-DNA in der Probe proportional ist) gemessen. Das Verhältnis der Häufigkeit der Matrizen-DNA in der Nucleosomenfraktion und der Immunopräzipitate liefert eine feine Karte des Musters der Histonacetylierung für jeweils 0,1 kb auf dem Reporter-Gen und STAR-Element (oder auf dem Reporter-Gen bei Fehlen eines Elements).
  • Beispiel 7. In-vivo-Nucleosomen-Positionierung und DNase-I-hypersensitive Stellen
  • Hintergrund: Chromatin besteht aus DNA-Histonen und Nichthistonproteinen. Die Histone bilden ein Kernteilchen, das von ca. 150 bp DNA umhüllt ist, wodurch ein Nucleosom entsteht. Nucleosomen sind durch 50-75 bp Linker-DNA voneinander getrennt. Stabil positionierte Nucleosomen auf chromosomaler DNA reprimieren die Genexpression, und Faktoren, die Nucleosomen ausschließen oder das Chromatin in anderer Weise remodellieren, können diese Repression überwinden. Die Positionierung von Nucleosomen in einem chromosomalen Bereich wird durch einen Micrococcus-Nuclease(MNase)-Assay analysiert; MNase schneidet Chromatin vorzugsweise in der Linker-DNA. Ähnlich werden einige DNA-Bereiche konstitutiv Nichthistonproteinen ausgesetzt, und dies sind häufig regulatorische Bereiche, d.h. Stellen, wo cis-wirkende regulatorische Faktoren binden. Experimentell sind diese Stellen hypersensitiv gegenüber Verdau durch das Enzym DNase I.
  • Vorschrift: Um die Position von Nucleosomen auf dem Reporter-Gen und auf den STAR-Elementen zu bestimmen, wird MNase verwendet (Saluz and Jost, 1993). Zellkerne werden aus kultivierten U-2-OS-Zellen gereinigt und mit MNase verdaut, wie es oben beschrieben ist (Histonacetylierung). Um in den STAR-Elementen oder dem Reporter-Gen nach DNase-I-hypersensitiven Stellen zu suchen, werden gereinigte Zellkerne mit DNase I in einer geeigneten Konzentration (z.B. 100 μg/ml genomische DNA und 20-100 E/ml DNase I) behandelt, wie es beschrieben ist (Wallrath et al., 1998). Nackte DNA wird als Kontrolle mit DNase I abgebaut. Für beide Techniken werden das Reporter-Gen und die STAR-Elemente fein kartiert, wobei man Primerverlängerung oder indirekte Endmarkierung und Southern-Blotting verwendet, wie es beschrieben ist (Tanaka et al., 1996; van der Vlag et al., 2000). Der MNase-Assay zeigt eine Leiter von diskreten Banden auf einem Autoradiogramm, das den Positionen von Nucleosomen auf den STAR-Elementen oder dem Reporter-Gen entspricht. DNase-I-hypersensitive Stellen manifestieren sich in dem resultierenden Autoradiogramm als diskrete Banden, die in der als Kontrolle verwendeten nackten DNA fehlen oder weniger deutlich hervortreten.
  • Beispiel 8. Zelltyp-, Gewebe- und Promotorabhängigkeit von STAR-Elementen.
  • Hintergrund: es wurde berichtet, dass einige Isolatoren oder Grenzelemente Gewebespezifität aufweisen könnten (Takada et al., 2000). STAR-Elemente haben viele Merkmale mit Isolatoren und Grenzelementen gemeinsam. Sowohl promiskuitive als auch gewebespezifische STAR-Elemente haben einen biotechnologischen Wert bei transgenen Anwendungen. Der im Folgenden beschriebene Assay wird durchgeführt, um die Zelltypabhängigkeit zu bewerten. Die Zell- und Gewebespezifität der Elemente werden weiterhin dadurch untersucht, dass man die Expression von Genen in der Nähe der Elemente im Humangenom untersucht, wobei man öffentliche Datenbanken mit DNA-Microarray- (http:// ar rays.rockefeller.edu/xenopus/links.html) und SAGE-Daten (Serial Analysis of Gene Expression; http://bioinfo.amc.uva.nl/HTM-bin/index.cgi) verwendet.
  • Vorschrift: STAR-Elemente werden im pSDH-Plasmid getestet. Drei Zelllinien werden mit Hilfe von Standardvorschriften transfiziert: die humane Osteosarkom-Zelllinie U-2 OS (Heldin et al., 1986), die Vero-Zelllinie aus der Niere der Grünen Meerkatze (Simizu et al., 1967) und die CHO-Zelllinie aus dem Eierstock Chinesischer Streifenhamster (Kao und Puck, 1968). Elemente, die in allen drei Zelltypen funktionieren können, werden als promiskuitiv kategorisiert. Solche, die eine Aktivität nur in einer oder zweien der Zelllinien aufweisen, werden als in ihrer Zelltypfunktionalität beschränkt kategorisiert.
  • Promotorspezifität: STAR-Elemente werden zur Zeit im Zusammenhang der Funktion mit zwei Promotoren, dem gesamten Cytomegalievirus(CMV)-Promotor oder dem Tetracyclin-Response-Element und minimalen CMV-Promotor (in Kombination mit dem tTA-Transcriptionsaktivator) ausgewählt und getestet. Um die Promotorspezifität zu bewerten, wird die STAR-Funktion mit anderen häufig verwendeten viralen Promotoren getestet, nämlich dem frühen und dem späten Promotor des Affenvirus Typ 40 (SV40), dem adenoviralen E1A- und starken späten Promotor und dem Long Terminal Repeat des Rous-Sarkom-Virus (RSV) (Doll et al., 1996; Smith et al., 2000; Weaver and Kadan, 2000; Xu et al., 1995). Jeder dieser Promotoren wird getrennt zusammen mit STAR-Elementen mit Standardtechniken (Sambrook et al., 1989) in das pSelect-Plasmid kloniert. Mit den resultierenden Plasmiden wird die U-2-OS-Zelllinie transfiziert, und die Expression des Reporter-Gens wird getestet, wie es oben beschrieben ist. Die Fähigkeit von STAR-Elementen, vor einer Inaktivierung zu schützen, wird durch Vergleich mit Plasmiden, denen STAR-Elemente fehlen, bestimmt.
  • Beispiel 9. Verfahren zur Verbesserung von STAR-Elementen
  • Hintergrund: Verbesserte STAR-Elemente werden entwickelt. Verbesserungen führen zu einer erhöhten Stärke der antirepressiven Aktivität und zu Elementen mit induzierbarer und gewebespezifischer Aktivität. Diese Verbesserungen werden durch eine Kombination von Techniken erreicht.
  • Vorschriften
  • Erzwungene Evolution: Fehlerbehaftete PCR (Cherry et al., 1999; Henke und Bornscheuer, 1999) wird verwendet, um im Durchschnitt eine bis zwei Punktmutationen pro Element einzuführen. Die mutagenisierten Elemente werden unter Verwendung von pSelect-Plasmiden, die Reporter-Selektionsmarker-Fusionsproteine enthalten, zum Beispiel durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und Antibiotikaresistenz durchmustert (Bennett et al., 1998). Anschließende Durchläufe von fehlerbehafteter PCR und Selektion werden durchgeführt, um Elemente mit weiteren Aktivitätsverbesserungen zu erhalten.
  • Tandem- und heterologe Kombinationen: Wie oben beschrieben, werden Tandem- und heterologe Kombinationen von Elementen auf Aktivität im Vergleich zu den einzelnen Elementen getestet (Beispiel 3).
  • Die relative Dominanz von STAR-Elementen wird von Fall zu Fall getestet. Sie wird verwendet, um die Stärke eines Elements zu testen; wenn zum Beispiel ein neues STAR-Element dominant gegenüber einem bekannten starken Element mit einer die Gentranscription reprimierenden Eigenschaft ist, wird das STAR-Element als sehr stark klassifiziert. Die Möglichkeit, dass das Dominanzverhältnis zwischen einem STAR-Element und einem Element mit einer die Gentranscription reprimierenden Eigenschaft zelltyp-, gewebe- oder promotorspezifisch ist, wird ebenfalls in Betracht gezogen (Beispiel 8). Im Dominanztest wird das pSelect-Plasmid verwendet, wobei einzelne Elemente mit einer die Gentranscription reprimierenden Eigenschaft durch Standard-DNA-Rekombinationstechniken (Sambrook et al., 1989) stromaufwärts von einzelnen STAR-Elementen platziert werden. Mit den Plasmiden werden U-2-OS-Zellen transfiziert, und die Expression des Reporter-Gens wird getestet. Die STAR-Dominanz manifestiert sich durch eine höhere Expression im Vergleich zu dem Plasmid mit nur einem Element mit einer die Gentranscription reprimierenden Eigenschaft.
  • Einführung von Bindungsstellen für andere DNA-bindende Proteine in STAR-Elemente, um neue Eigenschaften (z.B. Induzierbarkeit, Gewebespezifität) hinzuzufügen
  • Hintergrund: Regulierbare STAR-Elemente werden geschaffen, indem man STAR-Elemente mit Bindungsstellen für signalabhängige DNA-bindende Proteine kombiniert. In einem Beispiel würde dies das Nebeneinanderstellen eines Star- und eines Glucocorticoid-Response-Elements (GRE) beinhalten. Bei fehlender Glucocorticoid-Stimulierung würde das STAR-Element wie beschrieben funktionieren. Bei Stimulierung bindet der natürlich vorkommende Glucocorticoid-Rezeptor an das GRE und stört die STAR-Funktion.
  • Vorschrift: Unter Verwendung von herkömmlicher DNA-Klonierung (Sambrook et al., 1989) wird ein GRE neben STAR-Elementen in den pSelect-Vektor eingeführt. Mit dem Plasmid werden U-2-OS-Zellen transfiziert, wie es oben beschrieben ist. Die Zellen werden in zwei Kulturen aufgeteilt; eine wird mit Glucocorticoid (10 μM) behandelt. Die Expression des Reporter-Gens wird gemessen und zwischen den beiden Kulturen verglichen. Unterschiede in der Expression beweisen die Fähigkeit, die STAR-Funktion durch Einwirkung eines signalabhängigen DNA-bindenden Proteins zu regulieren.
  • Promiskuitive STAR-Elemente: Das Testen oder Verstärken dieser Merkmale beinhaltet die Kultivierung in verschiedenen Zelllinien und die langfristige Kultivierung ohne Antibiotika-Selektion (Beispiele 8 und 10).
  • Beispiel 10. Bei STAR-Elementen ist für die Aufrechterhaltung des Transgens keine ständige Selektion notwendig.
  • Hintergrund: Bei der Transgenese hat das Zurückgreifen auf Selektionsmarker zwei Nachteile: Das Selektionsmittel ist gewöhnlich teuer und verursacht den Zellen metabolische Kosten, und es gibt regulatorische und ethische Einwände gegen die Kitverwendung von Selektionsmarkern in transgenen Anwendungen, insbesondere wenn sich das Transgen selbst im Produkt befindet (z.B. Kultur pflanzen, Gentherapievektoren). STAR-Elemente reduzieren oder beseitigen die Notwendigkeit, eine Selektion aufrechtzuerhalten, nachdem das transgene Isolat etabliert wurde. Folglich kann das Resistenz-Gen durch ortsspezifische Rekombination mit einem reduzierten Verlust der Transgen-Expression aus dem transgenen Genom entfernt werden.
  • Vorschrift: Stabil transfizierte U-2-OS-Zelllinien, die chromosomal integrierte STAR-Elemente enthalten, welche Reporter-Gene flankieren, werden durch Cotransfektion des pSDH-Plasmids mit einem trans-wirkenden Antibiotikum-Resistenz-Plasmid, wie es oben beschrieben ist, produziert. Das Experiment beinhaltet das Testen der Stabilität des Expressionsniveaus des Reporter-Gens in diesen Zelllinien während einer längeren (3-6 Monate) Kultivierung bei fehlender Selektion. Dies wird mit STAR-Elementen getestet, die die Luciferase- oder GFP-Reporter-Gene in pSDH-Plasmiden flankieren. Das Antibiotikum-Resistenz-Gen wird entfernt, indem man ein Expressionsplasmid (auf der Basis von pSDH) konstruiert, bei dem der Antibiotikum-Resistenz-Selektionsmarker von Recombinase-Zielstellen flankiert ist. Der Selektionsmarker wird anschließend durch Recombinase-Aktivität herausgeschnitten, wie es oben beschrieben ist (Beispiel 2).
  • Beispiel 11
  • Vorhersagbarkeit und Ausbeute werden durch Anwendung von STAR-Elementen in Expressionssystemen verbessert
  • STAR-Elemente funktionieren so, dass sie die Wirkung der transcriptionsreprimierenden Einflüsse auf die Transgen-Expressionseinheiten blockieren. Diese Repressionseinflüsse können auf Heterochromatin ("Positionseffekte" (Boivin & Dura, 1998)) oder auf benachbarte Kopien des Transgens ("Repeat-induzierte Geninaktivierung" (Garrick et al., 1998)) zurückzuführen sein. Zwei der Vorteile von STAR-Elementen für die heterologe Proteinproduktion sind eine erhöhte Vorhersagbarkeit des Findens von hochexprimierenden primären rekombinanten Wirtszellen und eine erhöhte Ausbeute während der Produktionszyklen. Diese Vorteile werden in diesem Beispiel veranschaulicht.
  • Materialien und Verfahren
  • Konstruktion der pSDH-Vektoren und STAR-haltigen Derivate: Der pSDH-Tet-Vektor wurde durch Polymerase-Kettenreaktionsamplifikation (PCR) des offenen Leserasters von Luciferase ausgehend von Plasmid pREP4-HSF-Luc (van der Vlag et al., 2000) unter Verwendung der Primer C67 und C68 (alle PCR-Primer und mutagenen Oligonucleotide sind in Tabelle 5 aufgeführt) und Insertion des SacII/BamHI-Fragments in SacII/BamHI-verdautes pUHD10-3 (Gossen & Bujard, 1992) konstruiert. Die Luciferase-Expressionseinheit wurde mit den Primern C65 und C66 reamplifiziert und erneut in pUHD10-3 eingefügt, um sie mit zwei multiplen Klonierungsstellen (MCSI und MCSII) zu flankieren. Dann wurde eine AscI-Stelle durch Verdau mit EcoRI und Einfügen eines Linkers (der aus assoziierten Oligonucleotiden D93 und D94 besteht) in MCSI eingeführt. Der CMV-Promotor wurde ausgehend von Plasmid pCMV-Bsd (Invitrogen K510-01) mit den Primern D90 und D91 amplifiziert und verwendet, um den Tet-Off-Promotor in pSDH-Tet durch SalI/SacII-Verdau und Ligierung unter Bildung des Vektors pSDH-CMV zu ersetzen. Das offene Leseraster von Luciferase in diesem Vektor wurde wie folgt durch SEAP (sezernierte Alkalische Phosphatase) ersetzt: Der Vektor pSDH-CMV wurde mit SacII und BamHI verdaut und glatt gemacht; das offene Leseraster von SEAP wurde durch Verdau mit EcoRI/SalI aus pSEAP-basic (Clontech 6037-1) isoliert, glatt gemacht und in pSDH-CMV ligiert, wobei der Vektor pSDH-CS entstand. Das Puromycin-Resistenz-Gen unter der Kontrolle des SV40-Promotors wurde durch PCR aus dem Plasmid pBabe-Puro (Morgenstern & Land, 1990) isoliert, wobei die Primer C81 und C82 verwendet wurden. Es wurde in den mit NcoI/XbaI verdauten Vektor pGL3-control (BamHI-Stelle entfernt) (Promega E1741) ligiert, wobei pGL3-puro entstand. pGL3-puro wurde mit BglII/SalI verdaut, um das SV40-Puro-Resistenz-Gen zu isolieren, das glatt gemacht und in NheI-verdautes, mit glatten Enden versehenes pSDH-CS ligiert wurde. Der resultierende Vektor pSDH-CSP ist in 6 gezeigt. Alle Klonierungsschritte wurden unter Befolgung der von den Herstellern der Reagentien angegebenen Anweisungen nach in der Technik bekannten Verfahren (Sambrook et al., 1989) durchgeführt.
  • STAR-Elemente wurden in zwei Schritten durch Verdau des STAR-Elements und des pSDH-CSP-Vektors mit einem geeigneten Restriktionsenzym und anschließende Ligierung in MCSI und MCSII eingefügt. Die Orientierung von STAR-Elementen in rekombinanten pSDH-Vektoren wurde durch Restriktionskartierung bestimmt. Die Identität und Orientierung der Inserts wurde durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Die Sequenzierung erfolgte nach dem Didesoxyverfahren (Sanger et al., 1977) unter Verwendung eines Beckman-CEQ2000-Sequenzierautomaten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, DNA wurde unter Verwendung von QIAprep-Spin-Miniprep- und Plasmid-Midi-Kits (QIAGEN 27106 bzw. 12145) aus E. coli gereinigt. Die zyklische Sequenzierung wurde unter Verwendung der speziell angefertigten Oligonucleotide C85, E25 und E42 (Tabelle 5) in Gegenwart von Farbstoffterminatoren (CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Beckman 608000) durchgeführt.
  • Transfektion und Kultur von CHO-Zellen mit pSDH-Plasmiden: Die CHO-Zelllinie CHO-K1 (ATCC CCL-61) wurde in HAMS-F12-Medium + 10% fetalem Kälberserum, das 2 mM Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält, bei 37 °C/5% CO2 kultiviert. Zellen wurden mit dem pSDH-CSP-Vektor und seinen Derivaten, die STAR6 oder STAR49 in MCSI und MCSII enthalten, transfiziert, wobei SuperFect (QIAGEN) gemäß der vom Hersteller angegebenen Beschreibung verwendet wurde. Kurz gesagt, Zellen wurden in Kulturgefäßen ausgesät und über Nacht bis 70-90% Konfluenz wachsen gelassen. SuperFect-Reagens wurde mit Plasmid-DNA (in diesem Beispiel durch Verdau mit PvuI linearisiert) in einem Verhältnis von 6 μl/μg kombiniert (z.B. für eine 10-cm-Petri-Schale 20 μg DNA und 120 μl SuperFect) und zu den Zellen gegeben. Nach Inkubation über Nacht wurde das Transfektionsgemisch durch frisches Medium ersetzt, und die transfizierten Zellen wurden weiter inkubiert. Nach Kultivierung über Nacht wurde 5 μg/ml Puromycin hinzugefügt. Die Puromycin-Selektion war in 2 Wochen beendet, und danach wurden die einzelnen puromycinresistenten CHO/pSDH-CSP-Klone zufällig isoliert und weiter kultiviert.
  • SEAP(sezernierte Alkalische Phosphatase)-Assay: Die SEAP-Aktivität (Berger et al., 1988, Henthorn et al., 1988, Kain, 1997, Yang et al., 1997) im Kulturmedium von CHO/pSDH-CSP-Klonen wurde so bestimmt, wie es vom Hersteller beschrieben wird (Clontech Great EscAPe Kit Nr. #K2041). Kurz gesagt, ein Aliquot von Medium wurde einer Hitzeinaktivierung bei 65 °C unterzogen, dann mit Assaypuffer und chemilumineszentem Substrat CSPD kombiniert und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die Geschwindigkeit der Substratumwandlung in einem Luminometer (Turner 20/20TD) bestimmt. Die Zelldichte wurde durch Zählen von trypsinisierten Zellen in einem Coulter-ACT10-Zellzähler bestimmt.
  • Transfektion und Kultur von U-2-OS-Zellen mit pSDH-Plasmiden: Die humane Osteosarkom-Zelllinie U-2 OS (ATCC Nr. HTB-96) wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium + 10% fetalem Kälberserum, das Glutamin, Penicillin und Streptomycin (s.o.) enthielt, bei 37 °C/5% CO2 kultiviert. Zellen wurden mit dem pSDH-CMV-Vektor und seinen Derivaten, die STAR6 oder STAR8 in MCSI und MCSII enthalten (zusammen mit dem Plasmid pBabe-Puro), transfiziert, wobei SuperFect (s.o.) verwendet wurde. Die Puromycin-Selektion war in 2 Wochen beendet, und danach wurden die einzelnen puromycinresistenten U-2-OS/pSDH-CMV-Klone zufällig isoliert und weiter kultiviert.
  • Luciferase-Assay: Die Luciferase-Aktivität (Himes & Shannon, 2000) wurde in resuspendierten Zellen gemäß den Anweisungen des Assaykit-Herstellers (Roche 1669893) unter Verwendung eines Luminometers (Turner 20/20TD) bestimmt. Die Gesamtzellproteinkonzentration wurde nach dem Bicinchoninsäure-Verfahren gemäß den Anweisungen des Herstellers (Sigma B-9643) bestimmt und verwendet, um die Luciferase-Daten zu normieren.
  • Ergebnisse
  • Rekombinante CHO-Zellklone, die den pSDH-CSP-Vektor oder pSDH-CSP-Plasmide mit STAR6 oder STAR49 enthalten (Tabelle 6), wurden 3 Wochen lang kultiviert. Dann wurde die SEAP-Aktivität in den Kulturüberständen bestimmt und auf der Basis der Zellzahl ausgedrückt (7). Wie man erkennt, wurden Klone mit STAR-Elementen in den Expressionseinheiten isoliert, die eine zwei- bis dreimal so große SEAP-Aktivität exprimieren als Klone, deren Expressionseinheiten keine STAR-Elemente enthalten. Weiterhin ist die Zahl der STAR-enthaltenden Klone, die SEAP-Aktivität auf oder oberhalb des Niveaus der maximalen Aktivität der STAR-freien Klone exprimieren, sehr hoch: 25% bis 40% der STAR-Klon-Populationen überschreiten die höchste SEAP-Expression der pSDH-CSP-Klone.
  • Rekombinante U-2-OS-Zellklone, die den pSDH-CMV-Vektor oder pSDH-CMV-Plasmide mit STAR6 oder STAR8 enthalten (Tabelle 6), wurden 3 Wochen lang kultiviert. Dann wurde die Luciferase-Aktivität in den Wirtszellen bestimmt und in relativen Luciferase-Einheiten (8), normiert auf das Gesamtzellprotein, ausgedrückt. Die rekombinanten U-2-OS-Klone mit STAR-Elementen, die die Expressionseinheiten flankieren, hatten höhere Ausbeuten als die STAR-freien Klone: Die höchste Expression, die bei STAR8-Klonen beobachtet wurde, war zwei- bis dreimal so hoch wie die Expression bei STAR-freien Klonen. STAR6-Klone hatten maximale Expressionsniveaus, die fünfmal so hoch waren wie bei den STAR-freien Klonen. Die STAR-Elemente verliehen auch eine bessere Vorhersagbarkeit: Bei beiden STAR-Elementen wiesen 15 bis 20% der Klone eine Luciferase-Expression auf Niveaus auf, die mit denen des STAR-freien Klons mit dem höchsten Expressionsniveau vergleichbar oder größer waren.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass STAR-Elemente, wenn man sie mit dem starken CMV-Promotor verwendet, die Ausbeute an heterologen Proteinen (Luciferase und SEAP) erhöhen. Alle drei in diesem Beispiel eingeführten STAR-Elemente ergeben erhöhte Ausbeuten. Die erhöhte Vorhersagbarkeit, die von den STAR-Elementen verliehen wird, manifestiert sich durch den großen Anteil von Klonen mit Ausbeuten, die gleich oder größer sind als die höchsten Ausbeuten bei den STAR-freien Klonen.
  • Beispiel 12
  • STAR-Elemente verbessern die Stabilität der Transgen-Expression
  • Während der Kultivierung von rekombinanten Wirtszellen ist es übliche Praxis, die Antibiotikum-Selektion aufrechtzuerhalten. Dadurch soll die transcriptionale Inaktivierung des Transgens oder ein Verlust des Transgens aus dem Genom durch Verfahren wie Rekombination verhindert werden. Sie ist jedoch aus mehreren Gründen für die Produktion von heterologen Proteinen unerwünscht. Erstens sind die verwendeten Antibiotika sehr teuer und tragen erheblich zu den Stückkosten des Produkts bei. Zweitens muss das Protein für die biopharmazeutische Verwendung nachweisbar rein sein, ohne Spuren des Antibiotikums in dem Produkt. Ein Vorteil von STAR-Elementen für die heterologe Proteinproduktion besteht darin, dass sie Transgenen eine stabile Expression bei längerer Kultivierung verleihen, auch in Abwesenheit einer Antibiotikum-Selektion; diese Eigenschaft wird in diesem Beispiel nachgewiesen.
  • Materialien und Verfahren
  • Die U-2-DS-Zelllinie wurde mit dem Plasmid pSDH-Tet-STAR6 transfiziert und so kultiviert, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist. Einzelne puromycinresistente Klone wurden isoliert und in Abwesenheit von Doxycyclin weiter kultiviert. In wöchentlichen Intervallen wurden die Zellen in einer Verdünnung von 1:20 auf frische Kulturgefäße übertragen. Die Luciferase-Aktivität wurde in regelmäßigen Anständen gemessen, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist. Nach 15 Wochen wurden die Kulturen in zwei Replikate unterteilt; ein Replikat erhielt weiterhin Puromycin, während das andere Replikat während des restlichen Experiments (insgesamt 25 Wochen) kein Antibiotikum erhielt.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 7 zeigt die Daten zur Luciferase-Expression durch eine von STAR6 flankierte Expressionseinheit während des verlängerten Wachstums mit oder ohne Antibiotikum. Wie man sieht, bleibt die Expression des Reporter-Transgens Luciferase in den U-2-OS-Wirtszellen während der Dauer des Experiments stabil. Nachdem die Kulturen in zwei Behandlungen (plus Antibiotikum und ohne Antibiotikum) unterteilt wurden, war die Expression von Luciferase in Abwesenheit einer Antibiotikum-Selektion im Wesentlichen stabil. Dies beweist die Fähigkeit von STAR-Elementen, Transgene vor Inaktivierung oder Verlust während einer verlängerten Kultur zu schützen. Es zeigt auch, dass diese Eigenschaft von der Antibiotikum-Selektion unabhängig ist. Daher ist eine Produktion von heterologen Proteinen möglich, ohne dass die Kosten des Antibiotikums oder einer aufwändigen Nachbearbeitung anfallen.
  • Beispiel 13
  • Minimalessentielle Sequenzen von STAR-Elementen
  • STAR-Elemente werden aus dem in Beispiel 1 beschriebenen genetischen Screen isoliert. Der Screen verwendet Bibliotheken, die mit humaner genomischer DNA aufgebaut wurden, die nach der Größe auf ungefähr 0,5 bis 2 Kilobasen fraktioniert wurde (s.o.). Die STAR-Elemente liegen im Bereich von 500 bis 2361 Basenpaaren (Tabelle 6). Wahrscheinlich wird bei vielen der STAR-Elemente, die isoliert wurden, die STAR-Aktivität von einem kleineren DNA-Fragment verliehen als dem ursprünglich isolierten Klon. Es ist aus zwei Gründen nützlich, diese minimalen Fragmentgrößen, die für die STAR-Aktivität wesentlich sind, zu bestimmen. Erstens wären kleinere funktionelle STAR-Elemente bei der Gestaltung von kompakten Expressionsvektoren vorteilhaft, da kleinere Vektoren Wirtszellen mit höherer Effizienz transfizieren. Zweitens ermöglicht die Bestimmung von minimalessentiellen STAR-Sequenzen die Modifikation dieser Sequenzen in Bezug auf eine verstärkte Funktionalität. Zwei STAR-Elemente wurden einer Feinkartierung unterzogen, um ihre minimalessentiellen Sequenzen zu bestimmen.
  • Materialien und Verfahren:
  • STAR10 (1167 Basenpaare) und STAR27 (1520 Basenpaare) wurden einer Feinkartierung unterzogen. Sie wurden durch PCR amplifiziert, was Teilfragmente von ungefähr gleicher Länge ergab (Legende zu 9). Zum anfänglichen Testen wurden diese an der BamHI-Stelle in den pSelect-Vektor kloniert und verwendet, um U-2-OS/Tet-Off/LexA-HP1-Zellen zu transfizieren, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Nach der Selektion in Bezug auf Hygromycin-Resistenz wurde LexA-HP1 eingeführt, indem man die Doxocyclin-Konzentration senkte. Dann wurden transfizierte Zellen mit Zeocin inkubiert, um die Fähigkeit der STAR-Fragmente zu testen, die SV40-Zeo-Expressionseinheit gegenüber Repression aufgrund von LexA-HP1-Bindung zu schützen.
  • Ergebnisse
  • In diesem Experiment verleihen STAR10 und STAR27 wie erwartet einen guten Schutz vor Geninaktivierung (9). Dies zeigt sich durch ein robustes Wachstum in Gegenwart von Zeocin.
  • Von den drei STAR10-Subfragmenten verleiht 10A (ca. 400 Basenpaare) den transfizierten Zellen ein kräftiges Wachstum in Gegenwart von Zeocin, welches dasjenige des STAR-Elements in voller Länge übersteigt. Zellen, die mit pSelect-Konstrukten transfiziert sind, die die anderen beiden Teilfragmente enthalten, wachsen in Gegenwart von Zeocin nicht. Diese Ergebnisse identifizieren das 10A-Fragment mit ca. 400 Basenpaaren als die DNA-Sequenz umfassend, die für die Antirepressionsaktivität von STAR10 verantwortlich ist.
  • STAR 27 verleiht bei diesem Experiment transfizierten Zellen mäßiges Wachstum in Zeocin (9). Eines der Teilfragmente dieses STAR-Elements, 27B (ca. 500 Basenpaare), erlaubt ein schwaches Wachstum der Wirtszellen in zeocinhaltigem Medium. Dies lässt vermuten, dass die Antirepressionsaktivität dieses STAR-Elements zum Teil auf dem Teilfragment 27B lokalisiert ist, aber die volle Aktivität auch Sequenzen aus 27A und/oder 27C erfordert (jeweils ca. 500 Basenpaare).
  • Beispiel 14
  • STAR-Elemente funktionieren in verschiedenen Stämmen von kultivierten Säugerzellen.
  • Die Wahl der Wirtszelllinie für die heterologe Proteinexpression ist ein entscheidender Parameter für die Qualität, Ausbeute und die Stückkosten des Proteins. Erwägungen wie posttranslationale Modifikationen, Kapazität des Sekretionswegs und Immortalität der Zelllinie legen die geeignete Zelllinie für ein bestimmtes biopharmazeutisches Produktionssystem fest. Aus diesem Grund sollten die Vorteile durch STAR-Elemente in Bezug auf Ausbeute, Vorhersagbarkeit und Stabilität bei verschiedenen Zelllinien erreichbar sein. Dies wurde durch Vergleichen der Funktion von STAR6 in der humanen U-2-OS-Zelllinie, in der es ursprünglich kloniert wurde, und der CHO-Zelllinie, die in der Biotechnologie verbreitet angewendet wird, getestet.
  • Materialien und Verfahren:
  • Auf die Experimente von Beispiel 11 wird Bezug genommen.
  • Ergebnisse
  • Die Expression des SEAP-Reporter-Gens in CHO-Zellen ist in 7 gezeigt; die Expression des Luciferase-Reporter-Gens in U-2-OS-Zellen ist in 8 gezeigt. Aus einem Vergleich der Ergebnisse dieser beiden Experimente geht hervor, dass das STAR6-Element in beiden Zelllinien funktioniert: Die Expression des Reporter-Gens war in beiden besser vorhersagbar, und Klone von jeder Zelllinie ergaben höhere Ausbeuten, wenn das Reporter-Gen durch STAR6 gegenüber Positionseffekten abgeschirmt war. Diese beiden Zelllinien sind von verschiedenen Spezies (Mensch und Hamster) und verschiedenen Gewebetypen (Knochen und Eierstock) abgeleitet, was den breiten Bereich von Wirtszellen widerspiegelt, bei denen dieses STAR-Element verwendet werden kann, um die heterologe Proteinexpression zu verbessern.
  • Beispiel 15
  • STAR-Elemente funktionieren im Kontext von verschiedenen Transcriptionspromotoren
  • Die Transcription eines Transgens wird erreicht, indem man das offene Leseraster des Transgens unter die Kontrolle eines exogenen Promotors stellt. Die Wahl des Promotors wird durch die Natur des heterologen Proteins und das Produktionssystem beeinflusst. In den meisten Fällen sind starke konstitutive Promotoren wegen der hohen Ausbeuten, für die sie sorgen können, bevorzugt. Einige virale Promotoren haben diese Eigenschaften; der Promotor/Enhancer des sehr frühen Gens des Cytomegalievirus ("CMV-Promotor") gilt im Allgemeinen als der stärkste Promotor in der üblichen biotechnologischen Verwendung (Boshart et al., 1985, Doll et al., 1996, Foecking & Hofstetter, 1986). Der Affenvirus-SV40-Promotor ist ebenfalls mäßig stark (Boshart et al., 1985, Foecking & Hofstetter, 1986) und wird häufig für die ektopische Expression in Säugerzellvektoren verwendet. Der Tet-Off-Promotor ist induzierbar: Der Promotor wird in Zelllinien, die das tTA-Plasmid exprimieren (Clontech K1620-A), in Gegenwart von Tetracyclin oder verwandten Antibiotika (gewöhnlich wird Doxycyclin verwendet) reprimiert, und die Entfernung des Antibiotikums führt zu einer Transcriptionsinduktion (Deuschle et al., 1995, Gossen & Bujard, 1992, Izumi & Gilbert, 1999, Umana et al., 1999).
  • Materialien und Verfahren:
  • Die Konstruktion des pSDH-Tet- und des pSDH-CMV-Vektors ist in Beispiel 11 beschrieben. pSDH-SV40 wurde durch PCR-Amplifikation des SV40-Promotors (Primer D41 und D42) ausgehend vom Plasmid pSelect-SV40-Zeo (Beispiel 1) und anschließenden Verdau des PCR-Produkts mit SacII und SalI konstruiert. Der pSDH-CMV-Vektor wurde mit SacII und SalI verdaut, um den CMV-Promotor zu entfernen, und der Vektor und das SV40-Fragment wurden miteinander ligiert, wobei pSDH-SV40 entstand. STAR6 wurde in MCSI und MCSII kloniert, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist. Die Plasmide pSDH-Tet, pSDH-Tet-STAR6, pSDH-Tet-STAR7, pSDH-SV40 und pSDH-SV40-STAR6 wurden zusammen mit pBabe-Puro in U-2-OS cotransfiziert, wobei SuperFect gemäß der vom Hersteller angegebenen Beschreibung verwendet wurde. Zellkultivierung, Puromycin-Selektion und Luciferase-Assays wurden so durchgeführt, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist.
  • Ergebnisse
  • In den 8, 10 und 11 wird die Expression des Luciferase-Reporter-Gens ausgehend von 3 verschiedenen Promotoren miteinander verglichen: zwei starken und konstitutiven viralen Promotoren (CMV und SV40) und dem induzierbaren Tet-Off-Promotor. Alle drei Promotoren wurden im Kontext des STAR6-Elements in U-2-OS-Zellen getestet. Die Ergebnisse beweisen, dass die Ausbeute und Vorhersagbarkeit bei allen 3 Promotoren durch STAR6 erhöht werden. Wie in den Beispielen 11 und 14 beschrieben ist, ist STAR6 günstig im Kontext des CMV-Promotors (8). Ähnliche Verbesserungen erkennt man im Kontext des SV40-Promotors (10): Die Ausbeute bei dem am höchsten exprimierenden STAR6-Klon ist zwei- bis dreimal so groß wie bei den besten pSDH-SV40-Klonen, und 6 STAR-Klone (20% der Population) haben höhere Ausbeuten als die besten STAR-freien Klone. Im Kontext des Tet-Off-Promotors unter induzierenden Konzentrationen (geringe Doxycyclinkonzentrationen) verbessert STAR6 auch die Ausbeute und Vorhersagbarkeit der Transgen-Expression (11): Der am höchsten exprimierende STAR6-Klon hat eine 20-mal so hohe Ausbeute wie der beste pSDH-Tet-Klon, und 9 STAR6-Klone (35% der population) haben höhere Ausbeuten als der beste STAR-freie Klon. Daraus wird geschlossen, dass dieses STAR-Element in seinen transgenschützenden Eigenschaften vielseitig ist, da es im Kontext von verschiedenen biotechnologisch geeigneten Promotoren der Transcription funktioniert.
  • Beispiel 16
  • Die Funktion des STAR-Elements kann direktional sein
  • Während kurze Nucleinsäuresequenzen symmetrisch (z.B. palindromisch) sein können, sind längere natürlich vorkommende Sequenzen typischerweise asymmetrisch. Infolgedessen ist der Informationsgehalt von Nucleinsäuresequenzen direktional, und die Sequenzen selbst können in Bezug auf ihre 5'- und 3'-Enden beschrieben werden. Die Direktionalität von Nucleinsäure-Sequenzinformationen beeinflusst die Anordnung, in der rekombinante DNA-Moleküle unter Verwendung von in der Technik bekannten Standardklonierungsmethoden (Sambrook et al., 1989) zusammengesetzt werden. STAR-Elemente sind lange, asymmetrische DNA-Sequenzen und haben eine Direktionalität auf der Basis der Orientierung, in der sie ursprünglich in den pSelect-Vektor kloniert wurden. In den oben angegebenen Beispielen unter Verwendung von zwei STAR-Elementen in pSDH-Vektoren blieb diese Direktionalität erhalten. Diese Orientierung wird als native oder 5'-3'-Orientierung relativ zum Zeocin-Resistenz-Gen beschrieben (siehe 12). In diesem Beispiel wird die Wichtigkeit der Direktionalität für die STAR-Funktion im pSDH-Tet-Vektor beschrieben. Da die Reporter-Gene in den pSDH-Vektoren auf beiden Seiten von Kopien des interessierenden STAR-Elements flankiert sind, muss die Orientierung jeder STAR-Kopie berücksichtigt werden. In diesem Beispiel wird die native Orientierung mit der entgegengesetzten Orientierung verglichen (12).
  • Materialien und Verfahren:
  • Das STAR66-Element wurde in pSDH-Tet kloniert, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist. U-2-OS-Zellen wurden mit den Plasmiden pSDH-Tet-STAR66-native und pSDH-Tet-STAR66-opposite cotransfiziert und so kultiviert, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist. Einzelne Klone wurden isoliert und kultiviert; das Niveau der Luciferase-Expression wurde so bestimmt, wie es beschrieben ist (s.o.).
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse des Vergleichs der STAR66-Aktivität in der nativen Orientierung und der entgegengesetzten Orientierung sind in 13 gezeigt. Wenn STAR66 in der entgegengesetzten Orientierung vorliegt, ist die Ausbeute von nur einem Klon einigermaßen hoch (60 Luciferase-Einheiten). Dagegen ist die Ausbeute des am höchsten exprimierenden Klons, wenn STAR66 in der nativen Orientierung vorliegt, beträchtlich höher (100 Luciferase-Einheiten), und die Vorhersagbarkeit ist ebenfalls viel höher: 7 Klone der Population mit der nativen Orientierung (30%) exprimieren Luciferase oberhalb des Niveaus des am höchsten exprimierenden Klons aus der Population mit der entgegengesetzten Orientierung, und 15 der Klone in der Population mit der nativen Orientierung (60%) exprimieren Luciferase oberhalb von 10 relativen Luciferase-Einheiten. Daher ist bewiesen, dass die STAR66-Funktion direktional ist.
  • Beispiel 17
  • Die Transgen-Expression im Kontext von STAR-Elementen ist kopienzahlabhängig
  • Transgen-Expressionseinheiten für die heterologe Proteinexpression sind im Allgemeinen in das Genom der Wirtszelle integriert, um eine stabile Retention während der Zellteilung zu gewährleisten. Die Integration kann dazu führen, dass eine oder mehrere Kopien der Expressionseinheit in das Genom eingefügt werden; mehrere Kopien können als Tandem-Anordnungen vorliegen oder auch nicht. Die erhöhte Ausbeute, die für durch STAR-Elemente geschützte Transgene nachgewiesen wurde (s.o.), lässt vermuten, dass STAR-Elemente es den Transgen-Expressionseinheiten ermöglichen können, unabhängig von Einflüssen auf die Transcription, die mit der Integrationsstelle im Genom assoziiert sind, zu funktionieren (Unabhängigkeit von Positionseffekten (Boivin & Dura, 1998)). Sie lässt weiterhin vermuten, dass die STAR-Elemente es jeder Expressionseinheit ermöglichen, unabhängig von benachbarten Kopien der Expressionseinheit zu funktionieren, wenn sie als Tandem-Anordnung integriert werden (Unabhängig keit von Repeat-induzierter Geninaktivierung (Garrick et al., 1998)). Die Abhängigkeit von der Kopienzahl wird anhand der Beziehung zwischen Transgen-Expressionsniveaus und der Kopienzahl bestimmt, wie es im folgenden Beispiel beschrieben ist.
  • Materialien und Verfahren:
  • U-2-OS-Zellen wurden mit pSDH-Tet-STAR10 cotransfiziert und gemäß der Beschreibung (s.o.) unter Puromycin-Selektion kultiviert. Acht einzelne Klone wurden isoliert und weiter kultiviert. Dann wurden Zellen geerntet, und ein Teil wurde gemäß der Beschreibung (s.o.) auf Luciferase-Aktivität getestet. Die übrigen Zellen wurden lysiert, und die genomische DNA wurde unter Verwendung des DNeasy Tissue Kit (QIAGEN 69504) gemäß der vom Hersteller angegebenen Beschreibung gereinigt. DNA-Proben wurden durch UV-Spektrophotometrie quantifiziert. Von jeder genomischen DNA-Probe wurden 3 μg über Nacht mit PvuII und XhoI verdaut, wie es vom Hersteller (New England Biolabs) beschrieben wurde, und durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. DNA-Fragmente wurden auf eine Nylonmembran übertragen, wie es beschrieben ist (Sambrook et al., 1989) und mit einer radioaktiv markierten Sonde gegen das Luciferase-Gen (isoliert aus BamHI/SacII-verdautem pSDH-Tet) hybridisiert. Der Blot wurde gemäß der Beschreibung (Sambrook et al., 1989) gewaschen und auf einen Phosphorimager-Schirm (Personal F/X, BioRad) einwirken gelassen. Das resultierende Autoradiogramm (14) wurde durch Densitometrie analysiert, um die relative Stärke der Luciferase-DNA-Banden, die die Kopienzahl des Transgens repräsentiert, zu bestimmen.
  • Ergebnisse
  • Die Enzymaktivitäten und Kopienzahlen (Intensitäten der DNA-Bande) von Luciferase in den Klonen aus der pSDH-Tet-STAR10-Klon-Population ist in 15 gezeigt. Die Kopienzahl des Transgens korreliert in hohem Maße mit dem Niveau der Luciferase-Expression in diesen pSDH-Tet-STAR10-Klonen (r = 0,86). Dies lässt vermuten, dass STAR10 den Transgen-Expressionseinheiten eine Kopienzahlabhängigkeit verleiht, was die Transgen-Expression unabhängig von anderen Transgenkopien in Tandem-Anordnungen und unabhängig von geninaktivierenden Einflüssen an der Integrationsstelle macht.
  • Beispiel 18
  • STAR-Elemente fungieren als Enhancer-Blocker, aber nicht als Enhancer
  • Gen-Promotoren unterliegen sowohl positiven als auch negativen Einflüssen auf ihre Fähigkeit, die Transcription einzuleiten. Eine wichtige Klasse von Elementen, die positive Einflüsse ausüben, sind Enhancer. Enhancer sind charakteristischerweise in der Lage, Promotoren zu beeinflussen, auch wenn sie sich weit weg (viele Kilobasenpaare) von dem Promotor befinden. Negative Einflüsse, die durch Heterochromatin-Bildung wirken (z.B. Proteine der Polycomb-Gruppe), wurden oben beschrieben, und diese sind der Angriffspunkt der STAR-Aktivität. Die biochemische Basis für die Enhancer-Funktion und für die Heterochromatin-Bildung ist fundamental gleich, da beide die Bindung von Proteinen an DNA beinhalten. Daher ist es wichtig, zu bestimmen, ob STAR-Elemente in der Lage sind, positive Einflüsse sowie negative Einflüsse zu blockieren, mit anderen Worten, Transgene gegenüber genomischen Enhancern in der Nähe der Integrationsstelle abzuschirmen. Die Fähigkeit, Transgene gegenüber Enhancer-Aktivität abzuschirmen, gewährleistet eine stabile und vorhersagbare Leistungsfähigkeit von Transgenen in biotechnologischen Anwendungen. In diesem Beispiel wird die Leistungsfähigkeit von STAR-Elementen in einem Enhancer-Blockierungs-Assay untersucht.
  • Ein weiteres Merkmal der STAR-Aktivität, das für ihre Funktion wichtig ist, ist die erhöhte Ausbeute, die sie Transgenen verleihen (Beispiel 11). STARs werden auf der Basis ihrer Fähigkeit isoliert, hohe Niveaus der Zeocin-Expression aufrechtzuerhalten, wenn Heterochromatin-bildende Proteine neben den in Frage kommenden STAR-Elementen gebunden sind. Eine hohe Expression wird vorhergesagt, da von STARs erwartet wird, dass sie die Ausbreitung von Heterochromatin in die Zeocin-Expressionseinheit blockieren. Ein zweites Szenario besteht jedoch darin, dass die DNA-Fragmente in Zeocin-resistenten Klonen Enhancer enthalten. Es wurde nachgewiesen, dass Enhancer die Fähigkeit haben, die repressiven Wirkungen von Proteinen der Polycomb-Gruppe, wie solchen, die bei dem Verfahren des STAR-Screen verwendet werden (Zink & Paro, 1995), zu überwinden. Durch dieses Phänomen isolierte Enhancer würden als falsch positive Resultate gelten, da Enhancer nicht die Eigenschaften haben, die hier für STARs behauptet werden. Um nachzuweisen, dass STAR-Elemente keine Enhancer sind, wurden sie in einem Enhancer-Assay getestet.
  • Der Enhancer-Blockierungs-Assay und der Enhancer-Assay sind methodologisch und begrifflich ähnlich. Die Assays sind schematisch in 16 gezeigt. Die Fähigkeit von STAR-Elementen, Enhancer zu blockieren, wird unter Verwendung des E47/E-box-Enhancer-Systems getestet. Das E47-Protein kann die Transcription durch Promotoren aktivieren, wenn es an eine DNA-Sequenz der E-Box gebunden ist, die sich in der Nähe dieser Promotoren befindet (Quong et al., 2002). E47 ist normalerweise an der Regulation der Differenzierung von B- und T-Lymphocyten beteiligt (Quong et al., 2002), ist aber in der Lage, in verschiedenen Zelltypen zu funktionieren, wenn es ektopisch exprimiert wird (Petersson et al., 2002). Die E-Box ist eine palindromische DNA-Sequenz, CANNTG (Knofler et al., 2002). Im Enhancer-Blockierungs-Assay wird eine E-Box in einem Expressionsvektor stromaufwärts eines Luciferase-Reporter-Gens (einschließlich eines Minimalpromotors) platziert. Eine Klonierungsstelle für STAR-Elemente ist zwischen der E-Box und dem Promotor platziert. Das E47-Protein ist auf einem zweiten Plasmid codiert. Der Assay wird durchgeführt, indem man Zellen sowohl mit dem E47-Plasmid als auch mit dem Luciferase-Expressionsvektor transfiziert; das E47-Protein wird exprimiert und bindet an die E-Box, und der E47/E-Box-Komplex kann als Enhancer wirken. Wenn der Luciferase-Expressionsvektor kein STAR-Element enthält, verstärkt der E47/E-Box-Komplex die Luciferase-Expression (16A, Situation 1). Wenn STAR-Elemente zwischen der E-Box und dem Promotor insertiert werden, wird ihre Fähigkeit, den Enhancer zu blockieren, anhand der reduzierten Expression der Luciferase-Aktivität nachgewiesen (16A; Situation 2); wenn STARs keine Enhancer blockieren können, wird die Luciferase-Expression aktiviert (16A, Situation 3).
  • Die Fähigkeit von STAR-Elementen, als Enhancer zu wirken, verwendet denselben Luciferase-Expressionsvektor. In Abwesenheit von E47 beeinflusst die E-Box selbst die Transcription nicht. Stattdessen führt das Enhancer-Verhalten der STAR-Elemente zu einer Aktivierung der Luciferase-Transcription. Der Assay wird durchgeführt, indem man den Luciferase-Expressionsvektor ohne das E47-Plasmid transfiziert. Wenn der Expressionsvektor keine STAR-Elemente enthält, ist die Luciferase-Expression niedrig (16B, Situation 1). Wenn STAR-Elemente keine Enhancer-Eigenschaften haben, ist die Luciferase-Expression niedrig, wenn ein STAR-Element in dem Vektor vorhanden ist (16B, Situation 2). Wenn STAR-Elemente Enhancer-Eigenschaften haben, wird die Luciferase-Expression in den STAR-haltigen Vektoren aktiviert (16B, Situation 3).
  • Materialien und Verfahren:
  • Der Luciferase-Expressionsvektor wurde konstruiert, indem man die E-Box und einen Minimalpromotor der humanen Alkalischen Phosphatase aus dem Plasmid mu-E5+E2x6-cat(x) (Ruezinsky et al., 1991) stromaufwärts des Luciferase-Gens in das Plasmid pGL3-basic (Promega E 1751) einfügt, wobei pGL3-E-box-luciferase entsteht (Spende von W. Romanow). Das E47-Expressionsplasmid enthält das offene Leseraster von E47 unter der Kontrolle eines beta-Actin-Promotors im Plasmid pHBAPr-l-neo; E47 wird von diesem Plasmid (Spende von W. Romanow) konstitutiv exprimiert.
  • Die STAR-Elemente 1, 2, 3, 6, 10, 11, 18 und 27 wurden in den Luciferase-Expressionsvektor kloniert. Klone, die das Drosophila-scs-Element und das Hühner-beta-Globin-NS4-6x-Kern("HS4")-Element enthalten, wurden als positive Kontrollen mitverwendet (bekanntermaßen blockieren sie Enhancer und haben keine intrinsischen Enhancer-Eigenschaften (Chung et al., 1993, Kellum & Schedl, 1992), und der leere Luciferase-Expressionsvektor wurde als negative Kontrolle mitverwendet. Alle Assays wurden unter Verwendung der U-2-OS-Zelllinie durchgeführt. Im Enhancer-Blockierungs-Assay wurde das E47-Plasmid zusammen mit den Luciferase-Expressionsvektoren (leerer Vektor oder Vektor, der STAR-Elemente oder Elemente der positiven Kontrolle enthält) cotransfiziert. Im Enhancer-Assay wurde das E47-Plasmid zusammen mit einem STAR-freien Luciferase-Expressionsvektor als positive Kontrolle für die Enhancer-Aktivität cotransfiziert; alle anderen Proben erhielten während der Cotransfektion ein Scheinplasmid. Die transient transfizierten Zellen wurden 48 Stunden nach der Plasmidtransfektion (s.o.) auf Luciferase-Aktivität getestet. Die Luciferase-Aktivität, die von einem Plasmid exprimiert wurde, das keine E-Box oder STAR/Kontroll-Elemente enthält, wurde subtrahiert, und die Luciferase-Aktivitäten wurden gemäß der Beschreibung (s.o.) auf den Proteingehalt normiert.
  • Ergebnisse
  • 17 zeigt die Ergebnisse des Enhancer-Blockierungs-Assays. In Abwesenheit von STAR-Elementen (oder der bekannten Enhancer-blockierenden Elemente scs und H54) aktiviert der E47/E-Box-Enhancer-Komplex die Expression von Luciferase ("Vektor"); dieses erhöhte Expressionsniveau wurde auf 100 normiert. Die Enhancer-Aktivität wird von allen getesteten STAR-Elementen blockiert. Die Enhancer-Aktivität wird wie erwartet auch vom HS4- und vom scs-Element blockiert (Bell et al., 2001, Gerasimova & Corces, 2001). Diese Ergebnisse beweisen, dass STAR-Elemente neben ihrer Fähigkeit, die Ausbreitung von transcriptionaler Inaktivierung zu blockieren (negative Einflüsse) auch in der Lage sind, die Wirkung von Enhancern zu blockieren (positive Einflüsse).
  • 18 zeigt die Ergebnisse des Enhancer-Assays. Das Niveau der Luciferase-Expression aufgrund der Verstärkung durch den E47/E-Box-Komplex wird auf 100 gesetzt ("E47"). Im Vergleich führt keines der STAR-Elemente zu einer signifikanten Aktivierung der Luciferase-Expression. Wie erwartet, führen auch das scs- und das HS4-Element zu keiner Aktivierung des Reporter-Gens. Daraus wird geschlossen, dass wenigstens die getesteten STAR-Elemente keine Enhancer-Eigenschaften besitzen.
  • Beispiel 20
  • STAR-Elemente sind zwischen Maus und Mensch konserviert
  • Eine BLAT-Analyse der STAR-DNA-Sequenz gegen die Humangenom-Datenbank (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) zeigt, dass einige dieser Sequenzen eine hohe Sequenzkonservierung mit anderen Bereichen des Humangenoms aufweisen. Diese duplizierten Bereiche sind potentielle STAR-Elemente; wenn sie STAR-Aktivität zeigen, würden sie als Paraloge der klonierten STARs gelten (zwei Gene oder genetische Elemente heißen paralog, wenn sie aus einem Duplikationsereignis stammen (Li, 1997)).
  • Eine BLAST-Analyse der humanen STARs gegen das Mausgenom (http://www.ensembl.org/Mus_musculus/blastview) zeigt ebenfalls Bereiche einer hohen Sequenzkonservierung zwischen Maus und Mensch. Diese Sequenzkonservierung wurde für Fragmente von 15 der 65 humanen STAR-Elemente gezeigt. Die Konservierung liegt im Bereich von 64% bis 89% über Längen von 141 Basenpaaren bis 909 Basenpaaren (Tabelle 8). Diese Grade der Sequenzkonservierung sind bemerkenswert und lassen vermuten, dass diese DNA-Sequenzen auch innerhalb des Mausgenoms STAR-Aktivität verleihen können. Einige der Sequenzen aus dem Maus- und Humangenom in Tabelle 8 könnten streng als Orthologe definiert werden (zwei Gene oder genetische Elemente heißen ortholog, wenn sie aus einem Artbildungsereignis stammen (Li, 1997)). Zum Beispiel liegt STAR6 sowohl im Human- als auch im Mausgenom zischen dem SLC8A1- und dem HAAO-Gen. In anderen Fällen hat ein kloniertes humanes STAR ein Paraloges innerhalb des humanen Genoms, und sein Orthologes wurde im Mausgenom identifiziert. Zum Beispiel ist STAR3a ein Fragment des 15q11.2-Bereichs des humanen Chromosoms 15. Dieser Bereich ist zu 96,9% identisch mit (paralog zu) einem DNA-Fragment an 5q33.3 auf dem humanen Chromosom 5, was in der Nähe des IL12B-Interleukin-Gens ist. Diese humanen DNAs sind zu ungefähr 80% identisch mit einem Fragment des 11B2-Bereichs auf dem Mauschromosom 11. Das 11B2-Fragment befindet sich auch in der Nähe des (Maus)IL12B-Interleukin-Gens. Daher können STAR3a und das Maus-11B2- Fragment streng als Paraloge definiert werden. Um die Hypothese zu testen, dass STAR-Aktivität Bereichen mit hoher Sequenzkonservierung im Maus- und Humangenom gemeinsam ist, wurde eines der humanen STARs mit einer in der Maus konservierten Sequenz, STAR18, ausführlicher analysiert. Die Sequenzkonservierung im Mausgenom, die mit dem ursprünglichen STAR18-Klon nachgewiesen wurde, erstreckt sich auf dem humanen Chromosom 2 etwa 500 Basenpaare nach links (19; "links" und "rechts" beziehen sich auf die Standardbeschreibung der Arme des Chromosoms 2). In diesem Beispiel untersuchen wir, ob der Bereich der Sequenzkonservierung ein "natürlich vorkommendes" STAR-Element im Menschen definiert, das in Bezug auf seine Länge ausgedehnter ist als der ursprüngliche Klon. Wir untersuchen auch, ob die STAR-Funktion dieses STAR-Elements zwischen Maus und Mensch konserviert ist.
  • Materialien und Verfahren
  • Der Bereich der Maus/Human-Sequenzkonservierung um STAR18 herum wurde durch PCR-Amplifikation aus dem humanen BAC-Klon RP11-387A1 in drei Fragmenten gewonnen: der gesamte Bereich (Primer E93 und E94), die linke Hälfte (Primer E93 und E92) und die rechte Hälfte (Primer E57 und E94). Die entsprechenden Fragmente aus dem homologen Mausbereich wurden in derselben Weise aus dem BAC-Klon RP23-400H17 gewonnen (Primer E95 und E98, E95 und E96 bzw. E97 und E98). Alle Fragmente wurden in den pSelect-Vektor kloniert, und eine U-2-O5/Tet-Off/LexA-HP1-Zelllinie (s.o.) wurde damit transfiziert. Nach der Transfektion wurde eine Hygromycin-Selektion durchgeführt, um transfizierte Zellen zu selektieren. Das LexA-HP1-Protein wurde durch Absenken der Doxycyclin-Konzentration induziert, und die Fähigkeit der transfizierten Zellen, dem Antibiotikum Zeocin zu widerstehen (ein Maß für STAR-Aktivität), wurde durch Überwachen des Zellwachstums bewertet.
  • Ergebnisse
  • Der ursprüngliche STAR18-Klon wurde auf der Basis ihrer Fähigkeit, die Inaktivierung eines Zeocin-Resistenz-Gens zu verhindern, aus mit Sau3AI verdauter humaner DNA, die in den pSelect-Vektor ligiert war, isoliert. Der Abgleich des humanen STAR18-Klons (497 Basenpaare) mit dem Mausgenom zeigte eine hohe Sequenzähnlichkeit (72%) zwischen den orthologen Human- und Maus-STAR18-Bereichen. Er enthüllte auch eine hohe Ähnlichkeit (73%) im Bereich, der sich über 488 Basenpaare unmittelbar links von der Sau3AI-Stelle, die das linke Ende des klonierten Bereichs definiert, erstreckt (19). Außerhalb dieser Bereiche fällt die Sequenzähnlichkeit zwischen Human- und Maus-DNA auf unter 60% ab.
  • Wie in 19 gezeigt ist, verleihen sowohl die humanen als auch die Maus-STAR18-Elemente Wirtszellen, die das lexA-HP1-Repressorprotein exprimieren, Zeocin-Resistenz. Der ursprüngliche STAR18-Klon mit 497 Basenpaaren und sein Maus-Orthologes verleihen beide die Fähigkeit zu wachsen (19, a und d). Die benachbarten Bereiche von 488 Basenpaaren mit hoher Ähnlichkeit aus beiden Genomen verleihen ebenfalls die Fähigkeit zu wachsen, und tatsächlich ist ihr Wachstumsphänotyp kräftiger als der des ursprünglichen STAR18-Klons (19, b und e). Als der gesamte Bereich der Sequenzähnlichkeit getestet wurde, verliehen diese DNAs sowohl von der Maus als auch vom Menschen Wachstum, und der Wachstumsphänotyp ist kräftiger als bei den beiden Teilfragmenten (19, c und f). Diese Ergebnisse beweisen, dass die STAR-Aktivität von humanem STAR18 in ihrem Orthologen aus der Maus konserviert ist. Die hohe Sequenzkonservierung zwischen diesen orthologen Bereichen ist besonders bemerkenswert, da es keine proteincodierenden Bereiche sind, was zu der Schlussfolgerung führt, dass sie eine gewisse regulatorische Funktion haben, die ihre evolutionäre Divergenz durch Mutation verhindert hat.
  • Diese Analyse beweist, dass klonierte STAR-Elemente, die durch das ursprüngliche Screening-Programm identifiziert wurden, in einigen Fällen partielle STAR-Elemente darstellen können und dass durch eine Analyse der genomischen DNA, in di9e sie eingebettet sind, Sequenzen mit stärkerer STAR-Aktivität identifiziert werden können.
  • Beispiel 21
  • Materialien und Verfahren
  • Unter Verwendung des in der ursprünglichen Patentanmeldung beschriebenen genetischen Screens wurden anfangs sechsundsechzig (66) STAR-Elemente aus humaner genomischer DNA isoliert und im Einzelnen charakterisiert (Tabelle 6). Der Screen wurde mit Genbibliotheken durchgeführt, die durch Sau3AI-Verdau von humaner genomischer DNA aufgebaut wurden, die entweder aus Plazenta gereinigt (Clontech 6550-1) wurde oder in künstlichen bakteriellen/P1(BAC/PAC)-Chromosomen enthalten ist. Die BAC/PAC-Klone enthalten genomische DNA aus Bereichen von Chromosom 1 (Klone RP1154H19 und RP3328E19), aus dem HOX-Cluster von homeotischen Genen (Klone RP1167F23, RP1170019 und RP11387A1) oder aus dem humanen Chromosom 22 (Research Genetics 96010-22). Die DNAs wurden nach der Größe fraktioniert, und die Fraktion mit einer Größe von 0,5 bis 2 kb wurde mit Standardtechniken (Sambrook et al., 1989) in einen BamHI-verdauten pSelect-Vektor ligiert. pSelect-Plasmide, die humane genomische DNA enthalten, welche Zeocin-Resistenz bei niedrigen Doxycyclinkonzentrationen verleiht, wurden isoliert und in Escherichia coli vermehrt. Mit den Screens, die die STAR-Elemente von Tabelle 6 ergaben, wurden ungefähr 1-2% des humanen Genoms getestet.
  • Die humanen genomischen DNA-Inserts in diesen 66 Plasmiden wurden nach dem Didesoxyverfahren (Sanger et al., 1977) unter Verwendung eines Beckman-CEQ2000-Sequenzierautomaten gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Kurz gesagt, DNA wurde unter Verwendung von QIAprep-Spin-Miniprep- und Plasmid-Midi-Kits (QIAGEN 27106 bzw. 12145) aus E. coli gereinigt. Die zyklische Sequenzierung wurde unter Verwendung der speziell angefertigten Oligonucleotide, die dem pSelect-Vektor entsprachen (Primer D89 und D95, Tabelle 5) in Gegenwart von Farbstoffterminatoren (CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Beckman 608000) durchgeführt. Zusammengesetzte STAR-DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung von BLAT (Basic Local Alignment Tool (Kent, 2002); http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway; Tabelle 6) im humanen Genom lokalisiert (Datenbank-Builds August und Dezember 2001). Zusammengenommen umfassen die kombinierten STAR-Sequenzen 85,6 Kilobasenpaare mit einer durchschnittlichen Länge von 1,3 Kilobasenpaaren.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1. Die pSelect-Plasmidfamilie zum Selektieren und Charakterisieren von STAR-Elementen. Ein Resistenz-Marker- (Zeocin oder Puromycin) oder Reporter-Gen (GFP oder Luciferase) unter Kontrolle des promiskuitiven SV40-Promotors ist einer BamHI-Klonierungsstelle benachbart, die von einer AscI- und einer HindIII-Stelle flankiert ist. Stromaufwärts der Klonierungsstelle befinden sich lexA-Operatoren, an die lexA-Protein binden kann. Die Bindung von Chimären aus lexA-Proteinen und Proteinen der Polycomb-Gruppe an die Operatoren verursacht eine Repression des Marker- oder Reporter-Gens. An der Klonierungsstelle eingefügte DNA-Fragmente, die die Repression blockieren, werden anhand der persistenten Expression des Marker- oder Reporter-Gens identifiziert. Aufgrund der oriP-Sequenz repliziert das Plasmid episomal in kultivierten Säugerzellen.
  • 2. Die pSDH-Plasmidfamilie zum Testen von STAR-Elementen. Zwei multiple Klonierungsstellen (MCSI und MCSII) flankieren ein Reporter-Gen (GFP oder Luciferase), dessen Expression von einem stromaufwärts gelegenen Promotor (CMV, Tet-off oder SV40) gesteuert wird. Zu testende STAR-Elemente werden an MCSI und MCSII eingefügt. Diese enthalten einzelne Restriktionsstellen (MCSI: XhoI, NotI, EcoRI und SalI; MCSII: HindIII, EcoRV, NheI und BglII). Das Plasmid repliziert nach der zufälligen Integration in dem Genom von Säugerzellen.
  • 3. Anteil von Klonen, die Luciferase überexprimieren. U-2-OS-Human-Osteosarkomzellen wurden stabil mit pSDH-Plasmiden (die das Luciferase-Reporter-Gen unter der Kontrolle des tet-off-Promotors enthalten) transfiziert, und einzelne transfizierte Klone wurden isoliert und kultiviert. Die Luciferase-Expression wurde enzymatisch gemessen. Die mittlere Luciferase-Expression durch Klone, die das STAR-freie pSDH enthalten ("Referenzniveau"), wurde bestimmt. Klone von den Mengen für alle Plasmide wurden als "überexprimierend" eingestuft, wenn ihre Luciferase-Aktivität mehr als doppelt so groß war wie das Referenzniveau. Der Prozentsatz an überexprimierenden Klonen in jeder Plasmidmenge ist aufgetragen.
  • 4. Faktor der Überexpression durch überexprimierende Klone. Der Bereich der Überexpression in STAR-haltigen pSDH-Plasmiden, die in genomische DNA integriert waren, wurde bestimmt, indem man die Luciferase-Aktivitäten jedes Klons durch das Referenzniveau dividierte. Bei solchen, die eine signifikante Expression aufwiesen (mehr als doppelt so hoch wie der Referenzwert), wurden die tatsächlichen Erhöhungsfaktoren notiert; die Minimal- und Medianwerte dieser Daten sind für jedes Plasmid aufgetragen.
  • 5. Faktor der Überexpression durch überexprimierende Klone. Der Bereich der Überexpression in STAR-haltigen pSDH-Plasmiden, die in genomische DNA integriert waren, wurde bestimmt, indem man die Luciferase-Aktivitäten jedes Klons durch das Referenzniveau dividierte. Bei solchen, die eine signifikante Expression aufwiesen (mehr als doppelt so hoch wie der Referenzwert), wurden die tatsächlichen Erhöhungsfaktoren notiert; die Maximalwerte dieser Daten sind für jedes Plasmid aufgetragen.
  • 6. Das pSDH-CSP-Plasmid, das zum Testen der STAR-Aktivität verwendet wurde. Das Reporter-Gen für sezernierte Alkalische Phosphatase (SEAP) befindet sich unter der Kontrolle des CMV-Promotors, und der Puromycin-Resistenz-Selektionsmarker (puro) befindet sich unter der Kontrolle des SV40-Promotors. Diese beiden Gene werden von multiplen Klonierungsstellen flankiert, in die STAR-Elemente kloniert werden können. Das Plasmid weist auch einen Replikationsstartpunkt (ori) und ein Ampicillin-Resistenz-Gen (ampR) für die Vermehrung in Escherichia coli auf.
  • 7. STAR6 und STAR49 verbessern die Vorhersagbarkeit und Ausbeute der Transgen-Expression. Die Expression von SEAP ausgehend von dem CMV-Promotor durch CHO-Zellen, die mit pSDH-CSP, pSDH-CSP-STAR6 oder pSDH-CSP- STAR49 transfiziert sind, wurde bestimmt. Die STAR-haltigen Konstrukte verleihen eine bessere Vorhersagbarkeit und erhöhte Ausbeute im Vergleich zu dem pSDH-CSP-Konstrukt allein.
  • 8. STARE und STAR8 verbessern die Vorhersagbarkeit und Ausbeute der Transgen-Expression. Die Expression von Luciferase ausgehend von dem CMV-Promotor durch U-2-OS-Zellen, die mit pSDH-CMV, pSDH-CMV-STAR6 oder pSDH-CMV-STAR8 transfiziert sind, wurde bestimmt. Die STAR-haltigen Konstrukte verleihen eine bessere Vorhersagbarkeit und erhöhte Ausbeute im Vergleich zu dem pSDH-CMV-Konstrukt allein.
  • 9. Minimalessentielle Sequenzen von STAR10 und STAR27. Teile der STAR-Elemente wurden durch PCR amplifiziert: STAR10 wurde mit den Primern E23 und E12 unter Bildung des Fragments 10A, mit E13 und E14 unter Bildung des Fragments 10B und mit E15 und E16 unter Bildung des Fragments 10C amplifiziert. STAR27 wurde mit den Primern E17 und E18 unter Bildung des Fragments 27A, mit E19 und E20 unter Bildung des Fragments 27B und mit E21 und E22 unter Bildung des Fragments 27C amplifiziert. Diese Teilfragmente wurden in den pSelect-Vektor kloniert. Nach der Transfektion in U-2-OS/Tet-Off/LexA-HP1-Zellen wurde das Wachstum der Kulturen in Gegenwart von Zeocin überwacht. Die Wachstumsgeschwindigkeiten variierten von kräftig (+++) bis schlecht (+/–), während einige Kulturen die Zeocin-Behandlung aufgrund fehlender STAR-Aktivität in dem getesteten DNA-Fragment nicht überlebten (–).
  • 10. Funktion des STAR-Elements im Kontext des SV40-Promotors. Mit pSDH-SV40 und pASDH-SV40-STAR6 wurde die humane Osteosarkomzelllinie U-2 OS transfiziert, und die Expression von Luciferase wurde in puromycinresistenten Klonen mit oder ohne Schutz vor Geninaktivierung durch STARE getestet.
  • 11. Funktion des STAR-Elements im Kontext des Tet-Off-Promotors. Mit pSDH-Tet und pASDH-Tet-STAR6 wurde die humane Osteosarkomzelllinie U-2 OS transfiziert, und die Expression von Luciferase wurde in puromycinresistenten Klonen mit oder ohne Schutz vor Geninaktivierung durch STAR6 getestet.
  • 12. Schematisches Diagramm der Orientierung von STAR-Elementen, wie sie im pSelect-Vektor kloniert werden (Bild A), wie sie in pSDH-Vektoren unter Beibehaltung ihrer nativen Orientierung kloniert werden (Bild B) und wie sie in pSDH-Vektoren in der entgegengesetzten Orientierung kloniert werden (Bild C).
  • 13. Direktionalität der STAR66-Funktion. Das STAR66-Element wurde entweder in der nativen (STAR66 native) oder der entgegengesetzten Orientierung (STAR66 opposite) in pSDH-Tet kloniert, und U-2-OS-Zellen wurden damit transfiziert. In puromycinresistenten Klonen wurde die Luciferase-Aktivität getestet.
  • 14. Kopienzahlabhängigkeit der STAR-Funktion. Southern-Blot von Luciferase-Expressionseinheiten in pSDH-Tet-STAR10, integriert in genomische U-2-OS-DNA. Eine radioaktive Luciferase-DNA-Sonde wurde verwendet, um die Menge der transgenen DNA im Genom jeden Klons nachzuweisen, die dann mit einem Phosphorimager quantifiziert wurde.
  • 15. Kopienzahlabhängigkeit der STAR-Funktion. Die Kopienzahl von pSDH-Tet-STAR10-Expressionseinheiten in jedem Klon wurde mit einem Phosphorimager bestimmt und mit der Aktivität des von jedem Klon exprimierten Luciferase-Reporter-Enzyms verglichen.
  • 16. Enhancer-Blockierungs-Assay und Enhancer-Assay. Die zum Testen von STARs auf Enhancer-Blockierung und Enhancer-Aktivität verwendeten Luciferase-Expressionsvektoren sind schematisch gezeigt. Die E-Box-Bindungsstelle für das E47-Enhancer-Protein befindet sich stromaufwärts einer Klonierungsstelle für STAR-Elemente. Stromabwärts der STAR-Klonierungsstelle befindet sich das Luciferase-Gen unter der Kontrolle eines Minimalpromotors (mp) der humanen Alkalischen Phosphatase. Die Histogramme gegen die entsprechenden Ergebnisse für die drei möglichen experimentellen Situationen an (siehe Text). Bild A: Enhancer-Blockierungs-Assay. Bild B: Enhancer-Assay.
  • 17. Enhancer-Blockierungs-Assay. Die Luciferase-Expression ausgehend von einem Minimalpromotor wird durch den E47/E-Box-Enhancer in dem leeren Vektor (Vektor) aktiviert. Durch die Insertion von Enhancer-Blockern (scs, HS4) oder STAR-Elementen (STAR-Elemente 1, 2, 3, 6, 10, 11, 18 und 27) wird die Luciferase-Aktivierung durch den E47/E-Box-Enhancer blockiert.
  • 18. Enhancer-Assay. Die Luciferase-Expression ausgehend von einem Minimalpromotor wird durch den E47/E-Box-Enhancer in dem leeren Vektor (E47) aktiviert. Durch die Insertion des scs- und HS4-Elements oder verschiedener STAR-Elemente (STARs 1, 2, 3, 6, 10, 11, 18 und 27) wird die Transcription des Reporter-Gens nicht aktiviert.
  • 19. Konservierung der STAR18-Sequenz zwischen Maus und Mensch. Der Bereich des humanen Genoms, der STAR18 aus 497 Basenpaaren enthält, ist gezeigt (schwarze Kästchen); das Element tritt zwischen dem HOXD8- und dem HOXD4-Homöobox-Gen auf dem humanen Chromosom 2 auf. Es wird mit einem Bereich im Maus-Chromosom 2 abgeglichen, der 72% Sequenzidentität aufweist. Der Bereich des humanen Chromosoms 2 unmittelbar links von STAR18 ist ebenfalls im Maus-Chromosom 2 hochgradig konserviert (73% Identität; graue Kästchen); jenseits dieses Bereichs fällt die Identität unter 60% ab. Die Fähigkeit dieser Bereiche von Mensch und Maus, entweder getrennt oder in Kombination, Wachstum auf Zeocin zu verleihen, ist angegeben: -, kein Wachstum; +, mäßiges Wachstum; ++, kräftiges Wachstum; +++, schnelles Wachstum.
  • 20. Sequenzen, die STAR1 bis STAR65 umfassen (SEQ ID Nr. 1-65).
  • Literatur
    • Altschul, S.F. and Gish, W. (1996) Local alignment statistics. Methods Enzymol, 266, 460-480.
    • Altschui, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. and Lipman, D.J. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215, 403-410.
    • Bell, AC, West, AG, and Felsenfeld, G. (2001) Insulators and boundariesversatile regulatory elements in the eukaryotic genome Science 291, 447-50.
    • Bennett, R.P., Cox, CA. and Hoeffer, J.P. (1998) Fusion of green fluorescent protein with the Zeocin-resistance marker allows visual screening and drug selection of transfected eukaryotic cells. Biotechniques, 24, 478-482.
    • Berger, J, Hauber, J, Hauber, R, Geiger, R, and Cullen, BR. (1988) Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells Gene 66, 1-10.
    • Bierhuizen, M.F., Westerman, Y., Visser, T.P., Wognum, A.W. and Wagemaker, G. (1997) Green fluorescent protein variants as markers of retroviral-mediated gene transfer in primary hematopoietic cells and cell lines. Biochem Biophys Res Commun, 234, 371-375.
    • Boivin, A, and Dura, JM. (1998) In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila Genetics 150, 1539-49.
    • Boshart, M, Weber, F, Jahn, G, Dorsch-Hasler, K, Fleckenstein, B, and Schaffner, W. (1985) A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus Cell 41, 521-30.
    • Bunker, C.A. and Kingston, R.E. (1994) Transcriptional repression by Drosophila and mammalian Polycomb group proteins in transfected mammalian cells. Mol Cell Biol, 14, 1721-1732.
    • Cherry, J.R., Lamsa, M.H., Schneider, P., Vind, J., Svendsen, A., Jones, A. and Pedersen, A.H. (1999) Directed evolution of a fungal peroxidase. Nat Biotechnol, 17, 379-384.
    • Chung, JH, Whiteley, M, and Felsenfeld, G. (1993) A 5' element of the chicken beta-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila Cell 74, 505-14.
    • Deuschle, U, Meyer, WK, and Thiesen, HJ. (1995) Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters Mol Cell Biol 15, 1907-14.
    • Doll, R.F., Crandall, J.E., Dyer, C.A., Aucoin, J.M. and Smith, F.I. (1996) Comparison of promoter strengths on gene delivery into mammalian brain cells using AAV vectors. Gene Ther, 3, 437-447.
    • Feng, Y.Q., Seibler, J., Alami, R., Eisen, A., Westerman, K.A., Leboulch, P., Fiering, S. and Bouhassira, E.E. (1999) Site-specific chromosomal integration in mammalian cells: highly efficient CRE recombinasemediated cassette exchange. J Mol Biol, 292, 779-785.
    • Foecking, MK, and Hofstetter, H. (1986) Powerful and versatile enhancerpromoter unit for mammalian expression vectors Gene 45, 101-5. Garrick, D, Fiering, S, Martin, DI, and Whitelaw, E. (1998) Repeat-induced gene silencing in mammals Nat Genet 18, 56-9.
    • Gaszaser, M., Vazquez, J. and Schedl, P. (1999) The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancerpromoter interaction. Genes Dev, 13, 2098-2107.
    • Gerasimova, T.I. and Corces, V.G. (1998) Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell, 92, 511-521.
    • Gerasimova, TI, and Corces, VG. (2001) Chromatin insulators and boundaries: effects on transcription and nuclear organization Annu Rev Genet 35, 193-208.
    • Gossen, M. and Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 5547-5551.
    • Graham, F.L. and van der Eb, A.J. (1973) Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5. Virology, 54, 536-539.
    • Heldin, C.H., Johnsson, A., Wennergren, S., Wernstedt, C., Betsholtz, C. and Westermark, B. (1986) A human osteosarcoma cell line secretes a growth factor structurally related to a homodimer of PDGF A-chains. Nature, 319, 511-514.
    • Henke, E. and Bornscheuer, U.T. (1999) Directed evolution of an esterase from Pseudomonas fluorescens. Random mutagenesis by error-prone PCR or a mutator strain and identification of mutants showing enhanced enantioselectivity by a resorufin-based fluorescence assay. Biol Chem, 380, 1029-1033.
    • Henthorn, P, Zervos, P, Raducha, M, Harris, H, and Kadesch, T. (1988) Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: use as a reporter for studies of gene expression Proc Natl Acad Sci U S A 85, 6342-6.
    • Higgins, D.G., Thompson, J.D. and Gibson, T.J. (1996) Using CLUSTAL for multiple sequence alignments. Methods Enzymol, 266, 383-402. Himes, S.R. and Shannon, M.F. (2000) Assays for transcriptional activity based on the luciferase reporter gene. Methods Mol Biol, 130, 165-174. Izumi, M, and Gilbert, DM. (1999) Homogeneous tetracycline-regulatable gene expression in mammalian fibroblasts J Cell Biochem 76, 280-9.
    • Jung, R., Soondrum, K. and Neumaier, M. (2000) Quantitative PCR. Clin Chem Lab Med, 38, 833-836.
    • Kain, SR. (1997) Use of secreted alkaline phosphatase as a reporter of gene expression in mammalian cells Methods Mol Biol 63, 49-60.
    • Kao, F.T. and Puck, T.T. (1968) Genetics of somatic mammalian cells, VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 60, 1275-81.
    • Kellum, R. and Schedl, P. (1992) A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mol Cell Biol, 12, 2424-2431. Kent, WJ. (2002) BLAT--the BLAST-like alignment tool Genome Res 12, 656-64.
    • Knofler, M, Meinhardt, G, Bauer, S, Loregger, T, Vasicek, R, Bloor, DJ, Kimber, SJ, and Husslein, P. (2002) Human Hand1 basic helix-loop-helix (bHLH) protein: extra-embryonic expression pattern, interaction partners and identification of its transcriptional repressor domains Biochem J 361, 641-51.
    • Li, W-H (1997) Molecular Evolution, Sinauer Associates, Sunderland MA., Meinke, DW, Cherry, JM, Dean, C, Rounsley, SD, and Koornneef, M. (1998) Arabidopsis thaliana: a model plant for genome analysis Science 282, 662, 679-82.
    • Litt, M.D., Simpson, M., Recillas-Targa, F., Prioleau, M.N. and Felsenfeld, G. (2001) Transitions in histone acetylation reveal boundaries of three separately regulated neighboring loci. EMBO J, 20, 2224-2235.
    • Morgenstern, J.P. and Land, H. (1990) Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic Acids Res, 18, 3587-3596.
    • Nan, X., Javier Campoy, F., and Bird A. (1997) McCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin. Cell 88, 471-481.
    • Petersson, K, Ivars, F, and Sigvardsson, M. (2002) The pT alpha promoter and enhancer are direct targets for transactivation by E box-binding proteins Eur J Immunol 32, 911-20.
    • Pazin, M.J. and Kadonaga, J.T. (1998) Transcriptianal and structural analysis of chromatin assembled in vitro. In Gould, H. (ed.) Chromatin: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, pp. 172-194.
    • Quong, MW, Romanow, WJ, and Murre, C. (2002) E protein function in lymphocyte development Annu Rev Immunol 20, 301-22.
    • Ruezinsky, D, Beckmann, H, and Kadesch, T. (1991) Modulation of the IgH enhancer's cell type specificity through a genetic switch Genes Dev 5, 29-37.
    • Saluz, H.P. and Jost, J.P. (1993) Approaches to characterize protein-DNA interactions in vivo. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 3, 1-29.
    • Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY.
    • Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 74, 5463-5467.
    • Simizu, B., Rhim, J.S. and Wiebenga, N.H. (1967) Characterization of the Tacaribe group of arboviruses. I. Propagation and plaque assay of Tacaribe virus in a line of African green monkey kidney cells (Vero). Proc Soc Exp Biol Med, 125, 119-123.
    • Smith, R.L., Traul, D.L., Schaack, J., Clayton, G.H., Staley, K.J. and Wilcox, C.L. (2000) Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system. J Virol, 74, 11254-11261.
    • Stull, R.A., Hyun, W.C. and Pallavicini, M.G. (2000) Simultaneous flow cytometric analyses of enhanced green and yellow fluorescent proteins and cell surface antigens in doubly transduced immature hematopoietic cell populations. Cytometry, 40, 126-134.
    • Takada, T., Iida, K., Akasaka, K., Yasue, H., Torii, R., Tsujimoto, G., Taira, M. and Kimura, H. (2000) Evaluation of heterologous insulator function with regard to chromosomal position effect in the mouse blastocyst and fetus. Mol Reprod Dev, 57, 232-237.
    • Tanaka, S., Livingstone-Zatchej, M. and Thoma, F. (1996) Chromatin structure of the yeast URA3 gene at high resolution provides insight into structure and positioning of nucleosomes in the chromosomal context. J Mol Biol, 257, 919-934.
    • Thomas, J.O. (1998) Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. In Gould, H. (ed.) Chromatin: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, pp. 1-34.
    • Umana, P, Jean-Mairet, J, and Bailey, JE. (1999) Tetracycline-regulated overexpression of glycosyltransferases in Chinese hamster ovary cells Biotechnol Bioeng 65, 542-9.
    • van der Vlag, J., den Blaauwen, J.L., Sewalt, R.G., van Driel, R. and Otte, A.P. (2000) Transcriptional repression mediated by polycomb group proteins and other chromatin-associated repressors is selectively blocked by insulators. J Biol Chem, 275, 697-704.
    • Wallrath, L.L., Swede, M.J. and E1gin, S.C.R. (1998) Mapping chromatin structure in Drosophila. In Gould, H. (ed.) Chromatin: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, pp. 59-77.
    • Weaver, L.S. and Kadan, M.J. (2000) Evaluation of adenoviral vectors by flow cytometry. Methods, 21, 297-312.
    • Wigler, M, Pellicer, A., Silverstein, S. and Axel, R. (1978). Biochemical transfer of single-copy eukaryotic genes using total cellular DNA as donor. Cell 14, 725-731.
    • Wigley, P., Becker, C., Beltrame, J., Blake, T., Crocker, L., Harrison, S., Lyons, I., McKenzie, Z., Tearle, R., Crawford, R. and et al. (1994) Site-specific transgene insertion: an approach. Reprod Fertil Dev, 6, 585-588.
    • Xu, Z.Z., Krougliak, V., Prevec, L., Graham, F.L. and Both, G.W. (1995) Investigation of promoter function in human and animal cells infected with human recombinant adenovirus expressing rotavirus antigen VP7sc. J Gen Virol, 76, 1971-1980.
    • Yang, TT, Sinai, P, Kitts, PA, and Kain, SR. (1997) Quantification of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter system Biotechniques 23, 1110-4.
    • Zink, D, and Paro, R. (1995) Drosophila Polycomb-group regulated chromatin inhibits the accessibility of a trans-activator to its target DNA Embo J 14, 5660-71.
  • Figure 00670001
  • Die Expression des Luciferase-Reporter-Gens wird in Zelllinien gemessen, die integrierte pSDH-Plasmide ohne ("empty", die negative Kontrolle) oder mit STAR-Elementen (einschließlich des positiven Kontrollelements SCS aus Drosophila) enthalten. Das mittlere Expressionsniveau der negativen Kontrolle ist als das Referenzniveau definiert, und Klone werden als überexprimierend angesehen, wenn ihr Expressionsniveau mehr als doppelt so groß ist wie das Referenzniveau. Der Prozentanteil der überexprimierenden Klone für jedes Plasmid und der Faktor der Überexpression sind zusammen mit der Zahl der analysierten Klone für jedes Plasmid angegeben. Tabelle 2. Kloniertes STAR-Element.
    Figure 00680001
    Figure 00690001
    • 1 Der chromosomale Locus wird durch BLAST-Recherche in DNA-Sequenzdaten von den STAR-Klonen gegen die Humangenomdatenbank bestimmt. Der Locus ist gemäß der Standardnomenklatur angegeben, die sich auf das cytogenetische Ideogramm jede Chromosoms bezieht; z.B. ist 1p2.3 die dritte cytogenetische Unterbande der zweiten cytogenetischen Bande des kurzen Arms von Chromosom 1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/MLACourse/Genetics/chrombanding.html). F, Ergebnis der Vorwärtssequenzierungsreaktion; R, Ergebnis der Rückwärtssequenzierungsreaktion; n.b., noch nicht bestimmt.
    • 2 Bezogen auf Human Genome Map View Build 22 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/Entrez/hum_sarch?chr=hum_chr.inf&query April 2001); L, links; R, rechts.
    • * Position zweideutig, mehrere Treffer
  • Tabelle 4: Sequenz verschiedener STAR-Elemente in einem Strang (forward oder dem entgegengesetzten Strang (reverse)
    Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Tabelle 5. Oligonucleotide, die für Polymerase-Kettenreaktionen (PCR-Primer) oder DNA-Mutagenese verwendet werden
    Figure 00750001
  • Figure 00760001
  • Tabelle 6. STAR-Elemente der Erfindung einschließlich des genomischen Locus und der Länge
    Figure 00770001
  • Figure 00780001
    • 1 Der chromosomale Locus wird durch BLAST-Recherche in DNA-Sequenzdaten von den STAR-Elementen gegen die Humangenomdatenbank bestimmt. Der Locus ist gemäß der Standardnomenklatur angegeben, die sich auf das cytoge netische Ideogramm jede Chromosoms bezieht; z.B. ist 1p2.3 die dritte cytogenetische Unterbande der zweiten cytogenetischen Bande des kurzen Arms von Chromosom 1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/MLACourse/Genetics/chrombanding.html). In Fällen, bei denen durch die Vorwärts- und die Rückwärtssequenzierungsreaktion DNAs aus verschiedenen genomischen Loci identifiziert wurden, sind beide Loci gezeigt.
    • 2 Genaue Längen werden durch DNA-Sequenzanalyse bestimmt; ungefähre Längen werden durch Restriktionskartierung bestimmt.
    • 3 Sequenz und Locus von STAR3 wurde seit dem Zusammensetzen von Tabelle 2 und 4 verfeinert.
    • 4 Die STARs mit diesen Nummern in den Tabellen 2 und 4 wurden zurückgestellt (im Folgenden als "oldSTARS" usw. bezeichnet), und ihre Nummern wurden den STAR-Elementen zugeordnet, die im DNA-Sequenzanhang gezeigt sind. Im Falle von oldSTAR5, oldSTAR14 und oldSTAR16 waren die klonierten DNAs Chimären von mehr als zwei chromosomalen Loci; im Falle von oldSTAR9 und oldSTAR13 waren die klonierten DNAs mit STAR4 identisch.
    • 5 Identisch mit Tabelle 4 "STAR18".
  • Tabelle 7. STAR-Elemente verleihen Stabilität über die Zeit hinweg bei Transgen-Expression1
    Figure 00790001
    • 1 Mitdem Plasmid pSDH-Tet-STAR6 wurden U-2-OS-Zellen transfiziert, und Klone wurden isoliert und in doxycyclinfreiem Medium kultiviert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Zellen wurden wöchentlich in einer Verdünnung von 1:20 auf frische Kulturgefäße übertragen.
    • 2 Die Zahl der Zellteilungen beruht auf der Abschätzung, dass die Kultur in einer Woche Zellkonfluenz erreicht, was ~6 Zellteilungen entspricht.
    • 3 Luciferase wurde so bestimmt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
    • 4 Nach 60 Zellteilungen wurden die Zellen auf zwei Kulturgefäße übertragen; eines wurde mit Kulturmedium versetzt, das Puromycin enthielt, wie bei den ersten 60 Zellteilungen, und das zweite wurde mit Kulturmedium ohne Antibiotikum versetzt.
  • Tabelle 8. Humane STAR-Elemente und ihre mutmaßlichen Maus-Orthologen und -Paralogen
    Figure 00810001
    • 1 Cytogenetischer Locus des STAR-Elements im humanen Genom
    • 2 Cytogenetischer Locus des STAR-Element-Orthologen im Mausgenom
    • 3 Länge des oder der Bereiche, die eine hohe Sequenzähnlichkeit aufweisen, und prozentuale Ähnlichkeit. In manchen Fällen tritt mehr als ein Block mit hoher Ähnlichkeit auf; in solchen Fällen wird jeder Block getrennt beschrieben. Eine Ähnlichkeit von < 60% gilt nicht als signifikant.

Claims (9)

  1. Verfahren zum Selektieren einer DNA-Sequenz, die wenigstens teilweise der Bildung von Gen-Transcription reprimierendem Chromatin entgegenwirken kann, umfassend das Bereitstellen von ein Transcriptionssystem umfassenden Wirtszellen mit einer Vielzahl von Fragmenten umfassenden Vektoren, wobei die Vektoren Fragmente von humaner genomischer DNA umfassen, wobei die Vektoren weiterhin Folgendes umfassen: i) ein Element mit einer Gen-Transcription reprimierenden Eigenschaft, das zu Gen-Transcription reprimierendem Chromatin führt, und ii) einen Promotor, der die Transcription eines Zeocin-Resistenz-Gens steuert, wobei die Transcription des Zeocin-Resistenz-Gens durch die Gen-Transcription reprimierende Eigenschaft reprimiert wird, wobei das Verfahren weiterhin das Durchführen eines Selektionsschritts in dem Transcriptionssystem umfasst, indem man die Wirtszellen unter Zeocin-Selektion bei einer Konzentration und während einer Zeitspanne, bei denen Kontrollkulturen durch das Zeocin getötet werden, kultiviert, um Wirtszellen zu identifizieren, die die Zeocin-Selektion überleben, wobei die Wirtszellen einen Vektor mit einem Fragment von humaner genomischer DNA umfassen, das die DNA-Sequenz umfasst, die wenigstens teilweise der Bildung von Gen-Transcription reprimierendem Chromatin entgegenwirken kann.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die humane genomische DNA auf ungefähr 0,5 bis 2 Kilobasen größenfraktioniert ist.
  3. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des Zeocins 250 Mikrogramm pro ml und die Zeitspanne 5 Wochen beträgt.
  4. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Element mit der Gen-Transcription reprimierenden Eigenschaft eine DNA-Sequenz ist, die von einem Proteinkomplex erkannt wird, und wobei das Transcriptionssystem den Komplex umfasst.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Komplex ein Heterochromatinbindendes Protein HP1, ein Protein der Polycomb-Gruppe (Pc-G), eine Histon-Deacetylase-Aktivität oder ein McCP2 (Methyl-CpG-bindendes) Protein umfasst.
  6. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Vektor ein episomal replizierender Vektor ist.
  7. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Vektor einen Replikationsstartpunkt des Epstein-Barr-Virus (EBV), OriP, und ein Zellkern-Antigen (EBNA-1) umfasst.
  8. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, das den weiteren Schritt des Isolierens von DNA-Fragmenten umfasst, die sich beim Screening als befähigt erwiesen haben, wenigstens teilweise der Bildung von Gen-Transcription reprimierendem Chromatin entgegenzuwirken.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, das den weiteren Schritt des Analysierens eines isolierten DNA-Fragments auf die Fähigkeit zu wenigstens einer der folgenden Funktionen umfasst: (i) wenigstens teilweise die Chromatinassoziierte Repression zu blockieren; (ii) wenigstens teilweise die Aktivität eines Enhancers zu blockieren; (iii) einer funktionell verknüpften Nucleinsäure, die eine Transcriptionseinheit codiert, im Vergleich zu derselben Nucleinsäure allein Folgendes zu verleihen: (iii-a) eine bessere Vorhersag barkeit der Transcription, (iii-b) eine höhere Transcription und/oder (iii-c) eine höhere Stabilität der Transcription im Laufe der Zeit.
DE60215502T 2001-07-04 2002-06-14 Verfahren zur Selektion einer Transkription-Modulatierenden DNA-Sequenz unter Verwendung einem Vektor mit einem Transkriptions-Repressions-Aktivem Element Expired - Lifetime DE60215502T2 (de)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01202581 2001-07-04
EP01202581A EP1273666A1 (de) 2001-07-04 2001-07-04 Verfahren zur Selektion einer transkription-modulatierenden DNA-Sequenz unter Verwendung einem Vektor mit einem transkriptions-repressions-aktivem Element
US30319901P 2001-07-05 2001-07-05
US303199P 2001-07-05
PCT/NL2002/000390 WO2003004704A2 (en) 2001-07-04 2002-06-14 Method of selecting dna sequence with transcription modulating activity using a vector comprising an element with a gene transcription repressing activity
US10/190,312 US7192741B2 (en) 2001-07-04 2002-07-05 DNA sequences comprising gene transcription regulatory qualities and methods for detecting and using such DNA sequences

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60215502D1 DE60215502D1 (de) 2006-11-30
DE60215502T2 true DE60215502T2 (de) 2007-08-30

Family

ID=47915807

Family Applications (8)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60236331T Expired - Lifetime DE60236331D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität
DE60215502T Expired - Lifetime DE60215502T2 (de) 2001-07-04 2002-06-14 Verfahren zur Selektion einer Transkription-Modulatierenden DNA-Sequenz unter Verwendung einem Vektor mit einem Transkriptions-Repressions-Aktivem Element
DE60236334T Expired - Lifetime DE60236334D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit anti-repressor Aktivität
DE60236332T Expired - Lifetime DE60236332D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit anti-repressor Aktivität
DE60237048T Expired - Lifetime DE60237048D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität
DE60236333T Expired - Lifetime DE60236333D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit anti-repressor Aktivität
DE60219221T Expired - Lifetime DE60219221T2 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit anti-repressor Aktivität
DE60236379T Expired - Lifetime DE60236379D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit anti-repressor Aktivität

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60236331T Expired - Lifetime DE60236331D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität

Family Applications After (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60236334T Expired - Lifetime DE60236334D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit anti-repressor Aktivität
DE60236332T Expired - Lifetime DE60236332D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit anti-repressor Aktivität
DE60237048T Expired - Lifetime DE60237048D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität
DE60236333T Expired - Lifetime DE60236333D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit anti-repressor Aktivität
DE60219221T Expired - Lifetime DE60219221T2 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit anti-repressor Aktivität
DE60236379T Expired - Lifetime DE60236379D1 (de) 2001-07-04 2002-06-14 DNS-Sequenzen mit anti-repressor Aktivität

Country Status (22)

Country Link
US (9) US7192741B2 (de)
EP (8) EP1600510B1 (de)
JP (3) JP4500044B2 (de)
KR (2) KR100942117B1 (de)
CN (1) CN1266282C (de)
AT (8) ATE466943T1 (de)
AU (3) AU2002314629B2 (de)
BR (1) BRPI0210771B8 (de)
CA (2) CA2450020C (de)
CY (1) CY1107678T1 (de)
DE (8) DE60236331D1 (de)
DK (8) DK1829971T3 (de)
ES (8) ES2285630T3 (de)
HK (1) HK1068652A1 (de)
IL (4) IL159674A0 (de)
MX (1) MXPA03011801A (de)
NO (1) NO338477B1 (de)
NZ (1) NZ530218A (de)
PT (1) PT1600510E (de)
SG (1) SG143066A1 (de)
WO (1) WO2003004704A2 (de)
ZA (1) ZA200309599B (de)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60236331D1 (de) 2001-07-04 2010-06-17 Chromagenics Bv DNS-Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität
CA2723500C (en) 2002-06-14 2014-10-28 Chromagenics B.V. A method for simultaneous production of multiple proteins; vectors and cells for use therein
WO2003106674A2 (en) * 2002-06-14 2003-12-24 Chromagenics B.V. Means and methods for regulating gene expression
ES2368733T3 (es) 2002-07-18 2011-11-21 Merus B.V. Producción recombinante de mezclas de anticuerpos.
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
NZ540471A (en) 2002-12-18 2008-07-31 Chromagenics Bv A method for improving protein production
AU2003290453A1 (en) 2002-12-20 2004-07-14 Chromagenics B.V. Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
CA2527694C (en) 2003-05-30 2015-07-14 Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
DK1670925T3 (da) 2003-10-02 2013-07-08 Crucell Holland Bv Pakningsceller til rekombinat adenovirus
WO2005059149A2 (en) * 2003-12-12 2005-06-30 Chromagenics B.V. Improved protein production
EP1737971B1 (de) 2004-01-20 2017-08-16 Merus N.V. Gemische bindender proteine
PT1763586E (pt) * 2004-07-08 2008-02-25 Chromagenics Bv Nova sequência para melhorar a expressão de ácido nucleico
EP1786908B1 (de) * 2004-08-18 2010-03-03 Bayer CropScience AG Pflanzen mit erhöhter plastidär aktivität der stärkephosphorylierenden r3-enzyme
SI1809750T1 (sl) * 2004-11-08 2012-08-31 Chromagenics Bv Izbira gostiteljskih celic, ki imajo visok nivo izraĹľanja proteina
US20100136616A1 (en) * 2004-11-08 2010-06-03 Chromagenics B.V. Selection of Host Cells Expressing Protein at High Levels
CA2581422C (en) 2004-11-08 2012-05-22 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US8999667B2 (en) 2004-11-08 2015-04-07 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US8039230B2 (en) 2004-11-08 2011-10-18 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
US20060195935A1 (en) * 2004-11-08 2006-08-31 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
CA2587712C (en) * 2004-11-18 2013-02-12 National University Of Corporation Hiroshima University Method and kit for expressing protein under regulation of the expression from repeated sequence formed by gene amplification and transformant
US7968700B2 (en) 2006-03-20 2011-06-28 Chromagenics B.V. Expression augmenting DNA fragments, use thereof, and methods for finding thereof
US20080124760A1 (en) 2006-07-26 2008-05-29 Barbara Enenkel Regulatory Nucleic Acid Elements
US20090142805A1 (en) * 2007-01-08 2009-06-04 Millipore Corporation High expression cell line that eliminates gene amplification
DK2443239T3 (en) 2009-06-15 2016-02-15 Cellagenics B V New stringent selection markers
US8566596B2 (en) 2010-08-24 2013-10-22 Cisco Technology, Inc. Pre-association mechanism to provide detailed description of wireless services
DK2611915T3 (da) 2010-09-01 2015-06-22 Cellagenics B V Nukleinsyrefragmenter fra en ribosomal proteinpromoter til forstærkning af genekspression
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
US11180572B2 (en) 2012-07-06 2021-11-23 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
SI2900694T1 (sl) 2012-09-27 2018-12-31 Merus N.V. Bispecifična IGG protitelesa kot vključitelji T-celic
US10417380B1 (en) 2013-12-31 2019-09-17 Mckesson Corporation Systems and methods for determining and communicating a prescription benefit coverage denial to a prescriber
US10489552B2 (en) 2014-02-14 2019-11-26 Mckesson Corporation Systems and methods for determining and communicating patient incentive information to a prescriber
NZ724013A (en) 2014-02-28 2019-11-29 Merus Nv Antibodies that bind egfr and erbb3
IL301147A (en) 2014-02-28 2023-05-01 Merus Nv An antibody that binds to ErbB-2 and ErbB-3
US10157262B1 (en) 2015-03-10 2018-12-18 Mckesson Corporation Systems and methods for determining patient financial responsibility for multiple prescription products
CN108026174B (zh) 2015-07-10 2023-02-17 美勒斯公司 人cd3结合抗体
AU2016340764B2 (en) 2015-10-23 2023-06-01 Fundació lnstitut de Recerca Biomèdica (IRB Barcelona) Binding molecules that inhibit cancer growth
US11514137B1 (en) 2016-03-30 2022-11-29 Mckesson Corporation Alternative therapy identification system
US10999224B1 (en) 2017-02-01 2021-05-04 Mckesson Corporation Method and apparatus for parsing an electronic message and constructing multiple differently prioritized messages therefrom
EP3600413A1 (de) 2017-03-31 2020-02-05 Merus N.V. Erbb-2- und erbb3-bindende bispezifische antikörper zur verwendung bei der behandlung von zellen mit einem ngr1-fusionsgen
MX2020001432A (es) 2017-08-09 2020-03-20 Merus Nv Anticuerpos que se unen al receptor del factor de crecimiento epidermico (egfr) y tirosina-proteina cinasa met (cmet).
US10862832B1 (en) 2018-07-24 2020-12-08 Mckesson Corporation Computing system and method for automatically reversing an action indicated by an electronic message
US11043437B2 (en) 2019-01-07 2021-06-22 Applied Materials, Inc. Transparent substrate with light blocking edge exclusion zone
US11562437B1 (en) 2019-06-26 2023-01-24 Mckesson Corporation Method, apparatus, and computer program product for providing estimated prescription costs
US11636548B1 (en) 2019-06-26 2023-04-25 Mckesson Corporation Method, apparatus, and computer program product for providing estimated prescription costs
EP3772518A1 (de) 2019-08-07 2021-02-10 Merus N.V. Modifizierte menschliche variable domänen
WO2021155369A1 (en) * 2020-01-31 2021-08-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Systems and methods to identify genetic silencers and applications thereof
US11610240B1 (en) 2020-02-17 2023-03-21 Mckesson Corporation Method, apparatus, and computer program product for partitioning prescription transaction costs in an electronic prescription transaction
IL298394A (en) 2020-05-21 2023-01-01 Merus Nv Methods and means for producing ig-like molecules
US11587657B2 (en) 2020-09-04 2023-02-21 Mckesson Corporation Method, apparatus, and computer program product for performing an alternative evaluation procedure in response to an electronic message

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US719271A (en) * 1902-01-13 1903-01-27 Solomon P Smith Furnace.
US5610053A (en) 1993-04-07 1997-03-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells
US5972605A (en) * 1994-07-07 1999-10-26 Geron Corporation Assays for regulators of mammalian telomerase expression
EP0818536A4 (de) * 1995-03-24 2000-09-06 Shionogi & Co Dna molekül gezogen auf die suppression der genexpression und entsprechendes protein
DE19539493A1 (de) * 1995-10-24 1997-04-30 Thomae Gmbh Dr K Starker homologer Promotor aus Hamster
US5773695A (en) 1996-01-26 1998-06-30 North Carolina State University Plant nuclear scaffold attachment region and method for increasing gene expression in transgenic cells
US6037525A (en) * 1996-08-01 2000-03-14 North Carolina State University Method for reducing expression variability of transgenes in plant cells
US5888809A (en) 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
WO2000005393A2 (en) 1998-07-21 2000-02-03 Cobra Therapeutics Limited A polynucleotide comprising a ubiquitous chromatin opening element (ucoe)
ATE370247T1 (de) * 1998-08-14 2007-09-15 Chromagenics Bv Dns sequenz, verfahren für dessen nachweis und herstellung und ihre benutzung
US6521419B1 (en) 1998-09-22 2003-02-18 Kanakaraju Koduri Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
US6800457B2 (en) 1998-09-22 2004-10-05 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
AU1128400A (en) 1998-10-22 2000-05-08 Medical College Of Georgia Institute, Inc. Long terminal repeat, enhancer, and insulator sequences for use in recombinant vectors
AU784506B2 (en) * 1999-08-25 2006-04-13 Immunex Corporation Compositions and methods for improved cell culture
US20030166042A1 (en) 2000-02-11 2003-09-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel seven-transmembrane proteins/G-protein coupled receptors
US6586205B1 (en) 2000-02-11 2003-07-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 43239 a novel GPCR-like molecule and uses thereof
EP1430124B1 (de) 2000-09-20 2013-11-06 EMD Millipore Corporation Artifizielle ubiquitäre chromatin öffnungselemente (ucoe)
DE60236331D1 (de) 2001-07-04 2010-06-17 Chromagenics Bv DNS-Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität
EP1273666A1 (de) 2001-07-04 2003-01-08 Chromagenics B.V. Verfahren zur Selektion einer transkription-modulatierenden DNA-Sequenz unter Verwendung einem Vektor mit einem transkriptions-repressions-aktivem Element
CA2723500C (en) * 2002-06-14 2014-10-28 Chromagenics B.V. A method for simultaneous production of multiple proteins; vectors and cells for use therein
WO2003106674A2 (en) 2002-06-14 2003-12-24 Chromagenics B.V. Means and methods for regulating gene expression
NZ540471A (en) 2002-12-18 2008-07-31 Chromagenics Bv A method for improving protein production
AU2003290453A1 (en) 2002-12-20 2004-07-14 Chromagenics B.V. Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors

Also Published As

Publication number Publication date
US20070037256A1 (en) 2007-02-15
AU2002314629B2 (en) 2007-08-30
AU2007234619A1 (en) 2007-12-13
EP1600510B1 (de) 2007-03-28
US7192741B2 (en) 2007-03-20
EP1829972B1 (de) 2010-05-12
PT1600510E (pt) 2007-06-25
EP1829971A3 (de) 2008-06-04
US20070031934A1 (en) 2007-02-08
EP1806407B1 (de) 2010-05-05
EP1829971A1 (de) 2007-09-05
ATE474053T1 (de) 2010-07-15
KR20090037485A (ko) 2009-04-15
DK1808488T3 (da) 2010-10-18
JP4500044B2 (ja) 2010-07-14
NO338477B1 (no) 2016-08-22
CY1107678T1 (el) 2013-04-18
ES2285630T3 (es) 2007-11-16
DK1842919T3 (da) 2010-08-16
EP1842919B1 (de) 2010-05-05
DE60237048D1 (de) 2010-08-26
ATE466941T1 (de) 2010-05-15
EP1404872B1 (de) 2006-10-18
KR100942117B1 (ko) 2010-02-12
ES2274045T3 (es) 2007-05-16
US20070031936A1 (en) 2007-02-08
JP2010131024A (ja) 2010-06-17
ATE467682T1 (de) 2010-05-15
JP2004533262A (ja) 2004-11-04
NZ530218A (en) 2005-09-30
EP1808488A3 (de) 2007-11-14
CA2450020C (en) 2013-08-13
EP1829972A2 (de) 2007-09-05
HK1068652A1 (en) 2005-04-29
KR100942116B1 (ko) 2010-02-12
US7662591B2 (en) 2010-02-16
DK1845162T3 (da) 2010-08-16
ATE466942T1 (de) 2010-05-15
DE60236334D1 (de) 2010-06-17
US7659094B2 (en) 2010-02-09
AU2011202193B2 (en) 2011-09-29
DE60236333D1 (de) 2010-06-17
BR0210771A (pt) 2004-07-13
MXPA03011801A (es) 2005-03-07
ES2344074T3 (es) 2010-08-17
DK1404872T3 (da) 2007-02-19
BRPI0210771B1 (pt) 2015-12-22
ZA200309599B (en) 2006-05-31
EP1845162B1 (de) 2010-05-05
EP1808488A2 (de) 2007-07-18
US20070128717A1 (en) 2007-06-07
US20030199468A1 (en) 2003-10-23
ES2344072T3 (es) 2010-08-17
IL193373A (en) 2010-12-30
NO20040011L (no) 2004-03-03
DK1806407T3 (da) 2010-08-16
EP1829972A3 (de) 2007-10-24
ATE466943T1 (de) 2010-05-15
US7749733B2 (en) 2010-07-06
CA2812799C (en) 2016-01-26
EP1808488B1 (de) 2010-07-14
IL159674A0 (en) 2004-06-20
CN1524128A (zh) 2004-08-25
EP1600510A3 (de) 2006-02-22
JP5014443B2 (ja) 2012-08-29
US7736870B2 (en) 2010-06-15
ES2348174T3 (es) 2010-11-30
EP1842919A1 (de) 2007-10-10
DE60219221T2 (de) 2008-01-03
EP1404872A2 (de) 2004-04-07
EP1600510A2 (de) 2005-11-30
KR20090037960A (ko) 2009-04-16
DE60236379D1 (de) 2010-06-24
US20070026499A1 (en) 2007-02-01
JP5014444B2 (ja) 2012-08-29
US7736868B2 (en) 2010-06-15
US20070026498A1 (en) 2007-02-01
AU2011202193A1 (en) 2011-06-02
WO2003004704A2 (en) 2003-01-16
ES2344073T3 (es) 2010-08-17
IL159674A (en) 2009-02-11
US7655441B2 (en) 2010-02-02
US20070031935A1 (en) 2007-02-08
ES2344071T3 (es) 2010-08-17
CA2450020A1 (en) 2003-01-16
ATE343004T1 (de) 2006-11-15
EP1845162A1 (de) 2007-10-17
EP1806407A3 (de) 2008-06-04
DE60215502D1 (de) 2006-11-30
ATE358183T1 (de) 2007-04-15
SG143066A1 (en) 2008-06-27
US7736869B2 (en) 2010-06-15
EP1829971B1 (de) 2010-05-05
JP2010131025A (ja) 2010-06-17
IL193374A (en) 2010-12-30
DK1600510T3 (da) 2007-06-25
ATE466944T1 (de) 2010-05-15
US7951586B2 (en) 2011-05-31
ES2344070T3 (es) 2010-08-17
DE60236331D1 (de) 2010-06-17
US20070031933A1 (en) 2007-02-08
CA2812799A1 (en) 2003-01-16
DK1829972T3 (da) 2010-09-13
DE60219221D1 (de) 2007-05-10
CN1266282C (zh) 2006-07-26
EP1806407A2 (de) 2007-07-11
DE60236332D1 (de) 2010-06-17
WO2003004704A3 (en) 2003-10-16
AU2007234619B2 (en) 2011-06-02
DK1829971T3 (da) 2010-08-16
BRPI0210771B8 (pt) 2021-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60215502T2 (de) Verfahren zur Selektion einer Transkription-Modulatierenden DNA-Sequenz unter Verwendung einem Vektor mit einem Transkriptions-Repressions-Aktivem Element
JP2004533262A5 (de)
EP1273666A1 (de) Verfahren zur Selektion einer transkription-modulatierenden DNA-Sequenz unter Verwendung einem Vektor mit einem transkriptions-repressions-aktivem Element

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition