ES2274045T3 - Secuencias de adn que comprenden cualidades moduladoras de la transcripcion genetica y metodos de deteccion y utilizacion de estas secuencias de adn. - Google Patents
Secuencias de adn que comprenden cualidades moduladoras de la transcripcion genetica y metodos de deteccion y utilizacion de estas secuencias de adn. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para seleccionar una secuencia de ADN capaz al menos en parte de contrarrestar la formación de cromatina represora de la transcripción génica, que comprende proporcionar un sistema de transcripción que comprende células huésped con una variedad de vectores que comprenden fragmentos, comprendiendo dichos vectores fragmentos de ADN genómico humano, comprendiendo dichos vectores adicionalmente i) un elemento con una cualidad represora de la transcripción génica que da como resultado la cromatina represora de la transcripción génica, y ii) un promotor que dirige la transcripción de un gen de resistencia a la zeocina, la transcripción de cuyo gen de resistencia a la zeocina es reprimida por la cualidad represora de la transcripción génica, comprendiendo el método adicionalmente realizar una etapa de selección en dicho sistema de transcripción cultivando las células huésped bajo selección con zeocina a una concentración y con una duración a la cual los cultivos de control son eliminadospor la zeocina con el fin de identificar las células huésped supervivientes a la selección con zeocina, comprendiendo dichas células huésped un vector con un fragmento de ADN genómico humano que comprende dicha secuencia de ADN capaz de contrarrestar al menos en parte la formación de cromatina represora de la transcripción génica.
Description
Secuencias de ADN que comprenden cualidades
moduladoras de la transcripción genética y métodos de detección y
utilización de estas secuencias de ADN.
La invención hace referencia a los campos de la
medicina y la biología celular. La invención en particular hace
referencia a los medios y métodos para la regulación de la
transcripción génica. Adicionalmente la invención hace referencia a
los medios y métodos para determinar si una secuencia de ADN
comprende una cualidad moduladora de la transcripción génica y/o
una cualidad represora de la transcripción génica.
Con el progreso de los diversos proyectos
genoma, se han vuelto asequibles las secuencias de los genomas
completos de los organismos. La avalancha de datos ha incrementado
el interés de muchos investigadores. Uno de los descubrimientos más
notables fue la observación de que el genoma humano no codifica
significativamente más genes que el genoma de organismos simples
como la mosca de la fruta. El enfoque de muchos investigadores se
está desplazando ahora de la identificación de los genes a la
determinación de la expresión génica y la función génica. Los
ejemplos de tales tecnologías son las micromatrices de ADN, las
aplicaciones genómicas funcionales y la proteinómica. Estas
tecnologías tienen en común que están centradas en la función y
expresión de secuencias codificadoras. No obstante, si bien nuestro
conocimiento de los genes aumenta espectacularmente, la comprensión
de cómo está regulada la expresión de los genes está limitando la
capacidad de aplicar este conocimiento rápidamente creciente. Este
es por ejemplo el caso en la generación de plantas y animales
transgénicos y en la terapia génica humana. En estas aplicaciones
el ácido nucleico foráneo es introducido típicamente en células para
obtener la expresión de las secuencias codificadoras. A menudo la
integración del ácido nucleico foráneo en el genoma de la célula es
requerida para el funcionamiento prolongado de las secuencias
introducidas. No obstante, la integración de secuencias en el
genoma conduce a la imprevisibilidad de la expresión debido a que el
ADN circundante influye en la transcripción de las secuencias
integradas. Esta imprevisibilidad es debida en parte al hecho de que
las secuencias introducidas no pueden ser proporcionadas todavía
con la suficiente información genética para aislar funcionalmente
las secuencias integradas de los efectos que influyen en la
transcripción del ADN circundante. Por otra parte esto es debido al
hecho de que no se sabe suficiente sobre los efectos que influyen en
la transcripción del ADN circundante.
La presente invención tiene que ver con las
secuencias de ADN que comprenden la capacidad de influir en la
transcripción de los genes en cis. Típicamente, aunque no
necesariamente, las secuencias investigadas no codifican por sí
mismas una proteína funcional. Se han identificado diversos
elementos de secuencia con la capacidad de afectar a la
transcripción génica en cis. Estos elementos se extienden
desde promotores, intensificadores, y silenciadores de elementos
limítrofes y regiones de anclaje a la matriz.
El hecho de que se hayan descubierto tantos
tipos diferentes de secuencias reguladoras da la impresión de que
es muy fácil diseñar casetes de expresión eficaces. No obstante, más
bien es al contrario. El diseño de casetes de expresión todavía
está dirigido a menudo por el ensayo y error. Bastante a menudo es
posible obtener alguna clase de expresión de un gen foráneo en una
célula diana o en su progenie. No obstante, muy a menudo es difícil
prever con cualquier clase de exactitud el nivel de expresión o la
persistencia de la expresión que una casete de expresión puede
presentar en una célula diana.
La presente invención proporciona entre otros
los medios y los métodos para detectar y aislar nuevos elementos
reguladores de la transcripción. Se proporciona un método para
detectar, y opcionalmente seleccionar, una secuencia de ADN con una
cualidad moduladora de la transcripción génica, que comprende
proporcionar un sistema de transcripción con una variedad de
vectores que comprenden fragmentos, comprendiendo dichos vectores i)
un elemento con una cualidad represora de la transcripción génica,
y ii) un promotor que dirija la transcripción de un gen informador,
comprendiendo el método adicionalmente realizar una etapa de
selección en dicho sistema de transcripción con el fin de
identificar dicha secuencia de ADN con dicha cualidad moduladora de
la transcripción génica. En una realización preferida dichos
fragmentos están localizados entre i) dicho elemento con una
cualidad represora de la transcripción génica, y ii) dicho promotor
que dirige la transcripción de dicho gen informador. La ARN
polimerasa inicia el proceso de transcripción tras la unión a una
secuencia específica, denominada promotor, que señala dónde debe
comenzar la síntesis de ARN. Una cualidad moduladora puede
intensificar la transcripción a partir de dicho promotor en
cis, en un tipo de célula dado y/o un promotor dado. La misma
secuencia de ADN puede comprender una cualidad intensificadora en
un tipo de célula o con un tipo de promotor, mientras puede
comprender o no otra cualidad moduladora de la transcripción génica
en otro tipo de célula o con otro tipo de promotor. La
transcripción puede estar influenciada por un efecto directo del
elemento regulador (o la proteína o las proteínas que se unen a él)
sobre la transcripción de un promotor concreto. No obstante, la
trascripción puede estar influenciada por un efecto indirecto, por
ejemplo porque el elemento regulador afecta a la función de uno o
más elementos reguladores distintos. La cualidad moduladora de la
transcripción génica también puede comprender una cualidad de la
transcripción génica estable. Con estable se quiere significar que
el nivel de transcripción observado no cambia significativamente a
lo largo de al menos 30 divisiones celulares. Una cualidad estable
es útil en situaciones en las que las características de expresión
deben ser predecibles a lo largo de muchas divisiones celulares.
Los ejemplos típicos son las líneas celulares transfectadas con
genes foráneos. Otros ejemplos son los animales y plantas
transgénicos y las terapias génicas. Muy a menudo, las casetes de
expresión introducidas funcionan de manera diferente al cabo de un
número creciente de divisiones celulares o generaciones de plantas
o animales. En una realización preferida una cualidad estable
comprende la capacidad de mantener la transcripción génica en
generaciones posteriores de una planta o animal transgénico. Por
supuesto en el caso de que la expresión sea inducible, dicha
cualidad comprende la cualidad de mantener la inducibilidad de la
expresión en generaciones posteriores de una planta o animal
transgénico. Frecuentemente, los niveles de expresión caen
espectacularmente con el número creciente de divisiones celulares.
Con un método de la invención es posible detectar y opcionalmente
seleccionar una secuencia de ADN que sea capaz de prevenir al menos
en parte la espectacular caída en los niveles de transcripción con
números crecientes de divisiones celulares. De este modo en una
realización preferida dicha cualidad moduladora de la transcripción
génica comprende una cualidad de transcripción génica estable.
Sorprendentemente, los fragmentos que comprenden una secuencia de
ADN con dicha cualidad de transcripción génica estable pueden ser
detectados y opcionalmente seleccionados con un método de la
invención, a pesar del hecho de que dicho método no mide
necesariamente la estabilidad a largo plazo de la transcripción. En
una realización preferida de la invención dicha cualidad moduladora
de la transcripción comprende una cualidad intensificadora de la
transcripción génica estable. Se ha observado que la incorporación
de una secuencia de ADN a un vector de expresión con un gen de
interés, produce un nivel superior de transcripción de dicho gen de
interés, tras la integración del vector de expresión al genoma de
una célula y por otra parte que dicha expresión génica superior
también es más estable que en ausencia de dicha secuencia de ADN
con una cualidad moduladora de la transcripción génica.
En experimentos diseñados para introducir un gen
de interés en el genoma de una célula y para obtener la expresión
de dicho gen de interés, se ha observado lo siguiente. Si junto con
dicho gen de interés también se había introducido una secuencia de
ADN con una cualidad moduladora de la transcripción génica, se
podían detectar más clones que expresaban más de una cierta
cantidad de producto génico de dicho gen de interés, que cuando
dicha secuencia no era introducida junto con dicho gen de interés.
De este modo la presente invención también proporciona un método
para incrementar el número de células que expresan más de cierto
nivel de un producto génico de un gen de interés tras proporcionar
dicho gen de interés al genoma de dichas células, que comprende
proporcionar a dicha célula una secuencia de ADN que comprende una
cualidad moduladora de la transcripción génica junto con dicho gen
de interés.
Las oportunidades de detectar un fragmento con
una cualidad moduladora de la transcripción génica varían con la
fuente de la cual derivan los fragmentos. Típicamente, no existe un
conocimiento previo de la presencia o ausencia de fragmentos con
dicha cualidad. En esas situaciones muchos fragmentos no
comprenderán una secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la
transcripción génica. En estas situaciones se introduce una etapa
de selección formal para las secuencias de ADN con dicha cualidad.
Esto se realiza por medio de la selección de vectores que
comprenden dicha secuencia basándose en una característica de un
producto de dicho gen informador, que puede ser seleccionado a
favor o en contra. Por ejemplo, dicho producto génico puede inducir
fluorescencia o un depósito de color (v.g. proteína fluorescente
verde y derivados, luciferasa o fosfatasa alcalina) o conferir
resistencia a antibióticos o inducir apoptosis y muerte celular.
Un método de la invención es particularmente
adecuado para detectar y opcionalmente seleccionar una secuencia de
ADN que comprende una cualidad intensificadora de la transcripción
génica. Se ha observado que al menos alguna de las secuencias de
ADN seleccionadas, cuando son incorporadas a un vector de expresión
que comprende un gen de interés, pueden incrementar
espectacularmente la transcripción génica de dicho gen de interés en
una célula huésped incluso cuando el vector no comprende un
elemento con una cualidad represora de la transcripción génica.
Esta cualidad intensificadora de la transcripción génica es muy útil
en las líneas celulares transfectadas con genes foráneos o en
animales y plantas transgénicos.
Para la presente invención dicho sistema de
transcripción comprende células huésped. El uso de células huésped
garantiza que los fragmentos son detectados y opcionalmente
seleccionados con actividad en las células.
Un elemento con una cualidad represora de la
transcripción génica reprimirá, en el método de la invención la
transcripción de un promotor en el sistema de transcripción
utilizado. Dicha represión no tiene que conducir a niveles de
expresión no detectables. Es importante que la diferencia en los
niveles de expresión en ausencia o presencia de represión sea
detectable y opcionalmente seleccionable. En una realización
preferida, la represión de la transcripción génica en dichos
vectores produce cromatina represora de la transcripción génica. En
esta realización preferida se pueden detectar secuencias de ADN, y
opcionalmente seleccionar que sean capaces, al menos en parte, de
contrarrestar la formación de cromatina represora de la
transcripción génica. En un aspecto una secuencia de ADN capaz de
contrarrestar, al menos en parte, la formación de cromatina
represora de la transcripción génica comprende una cualidad de
transcripción génica estable. En una realización preferida la
secuencia de ADN implicada en la represión de la transcripción
génica es una secuencia de ADN que es reconocida por un complejo
proteico y donde dicho sistema de transcripción comprende dicho
complejo. Preferiblemente dicho complejo comprende una proteína de
unión a heterocromatina que comprende HP1, una proteína del grupo
Polycomb (Pc-G), una actividad histona desacetilasa
o MeCP2 (proteína de unión a metil-CpG). Muchos
organismos comprenden una o más de estas proteínas. Estas proteínas
frecuentemente muestran también actividad en otras especies. Dicho
complejo puede por tanto comprenden también proteínas de dos o más
especies. El grupo mencionado de complejos de proteínas asociadas
con cromatina conocidos es capaz de transmitir la represión de un
amplio intervalo a lo largo de muchos pares de bases. Los complejos
también están implicados en la transferencia estable del estado
reprimido de los genes a las células hijas tras la división celular.
Las secuencias seleccionadas de esta manera son capaces de
transmitir la anti-represión de amplio intervalo a
lo largo de muchos pares de genes (van der Vlag et al.,
2000).
El vector utilizado puede ser cualquier vector
que sea adecuado para la clonación de ADN y que pueda ser utilizado
en un sistema de transcripción. Cuando se utilizan células huésped,
se prefiere que el vector sea un vector de replicación episómica. De
esta manera, se evitan los efectos debidos a los sitios de
integración diferentes del vector. Los elementos de ADN que
flanquean el vector en el sitio de integración pueden tener efectos
sobre el nivel de transcripción del promotor y de ese modo imitar
los efectos de los fragmentos que comprenden secuencias de ADN con
una cualidad moduladora de la transcripción génica. En una
realización preferida dicho vector comprende un origen de
replicación del virus de Epstein-Barr (EBV), OriP,
y un antígeno nuclear (EBNA-1). Tales vectores son
capaces de replicar en muchos tipos de células eucarióticas y
ensamblarse a la cromatina en condiciones apropiadas.
En otro aspecto la invención proporciona una
secuencia de ADN que comprende i) una secuencia de ADN aislada de
una planta o vertebrado, o derivados de los mismos, o ii) una
secuencia de ADN sintético o una construida por medio de ingeniería
genética, cuya secuencia de ADN es una secuencia inhibidora de la
represión que, puede ser detectada mediante el método de la
presente invención, seleccionada y opcionalmente clonada. En otro
aspecto la invención proporciona una secuencia de ADN que comprende
i) una secuencia de ADN aislada de una planta o vertebrado, o
derivados de los mismos, o ii) una secuencia de ADN sintético o una
construida mediante ingeniería genética, cuya secuencia de ADN es
detectada, seleccionada y opcionalmente clonada por medio del método
de la invención. Preferiblemente dicha secuencia de ADN comprende
una secuencia como se representa en la Tabla 4 o un homólogo
funcional de la misma. Un homólogo funcional de una secuencia
representada en la Tabla 4 es una secuencia derivada con la
información dada en la Tabla 4. Por ejemplo, una secuencia que puede
ser derivada de una secuencia de la Tabla 4 mediante deleción,
modificación y/o inserción de bases en o de la secuencia enumerada
en la Tabla 4, donde dicha secuencia derivada comprende la misma
actividad en clase, no necesariamente en cantidad, de una secuencia
como se representa en la Tabla 4. Un homólogo funcional es
adicionalmente una secuencia que comprende una parte de dos o más
secuencias representadas en la Tabla 4. Una secuencia de ADN
sintético es una secuencia que no deriva directamente o
indirectamente de una secuencia presente en un organismo. Por
ejemplo una secuencia que comprende una secuencia scs o scs' de
drosophila no es una secuencia sintética, ni siquiera cuando la
secuencia scs o scs' es generada artificialmente.
En un aspecto la invención se refiere al
conocimiento creciente de la regulación génica de orden superior y
a los medios y métodos para utilizar este conocimiento. Si bien se
han caracterizado elementos, tales como los promotores y los
intensificadores clásicos, que dirigen y regulan la transcripción de
genes individuales, los elementos reguladores de orden superior que
gobiernan las capacidades de la transcripción génica de regiones
cromosómicas completas todavía han recibido poca atención. Gran
parte del conocimiento de los autores de la presente invención
referente a semejantes elementos de orden superior proviene del
estudio de la embriogénesis. Durante la embriogénesis las células
quedan comprometidas en diferentes rutas evolutivas. Una vez
comprometidas, las células raramente cambian su destino, ni
siquiera después de muchas divisiones celulares.
Esta quedando cada vez más claro que la
transmisión estable de los patrones de transcripción génica
específicos del tipo de célula no depende del contexto de un
promotor, sino que en lugar de eso está mediada por cambios en la
estructura del ADN y las proteínas asociadas, denominadas cromatina.
La regulación génica a nivel cromosómico implica modificaciones del
ADN (v.g. metilación), las histonas (v.g. acetilación y/o
metilación), y las interacciones de amplio intervalo entre
elementos cromosómicos distantes.
El molde de cromatina es un complejo altamente
condensado de ADN, histonas, y proteínas no histónicas, que es
capaz de empaquetar el genoma completo en el núcleo y
simultáneamente permitir la transcripción apropiada de los genes
específicos. El cromosoma eucariótico no es un molde uniforme para
la activación de la transcripción génica. Se pueden distinguir
diferentes tipos de cromatina y regiones de cromatina, que afectan
de modo diferente a la transcripción génica. Las llamadas regiones
de heterocromatina identifican estructuras de cromatina
"cerradas" mientras la eucromatina está asociada con una
estructura de cromatina "abierta" más difusa. La región de
eucromatina puede ser sometida a cambios estructurales, dando como
resultado estructuras más o menos condensadas, referidas como
heterocromatina y eucromatina facultativas. Se cree que la formación
de eucromatina o heterocromatina facultativa representa el
mecanismo subyacente de la regulación génica mediada por cromatina,
manteniendo los genes en un estado activo o reprimido, de una
manera específica del tipo célular.
En todos los eucariotas se han identificado
numerosos complejos asociados con cromatina que están implicados en
el mantenimiento de la especificidad del tipo celular, uno de los
cuales es el complejo del grupo Polycomb (PcG). El complejo PcG
está implicado en la represión estable de los genes, en los que se
cree que los cambios en la estructura de la cromatina juegan un
importante papel. De un modo similar, se ha identificado una segunda
clase de proteínas, denominada grupo trithorax (Trg), que
contrarresta la acción de las proteínas PcG. Las proteínas TrG
están implicadas en el mantenimiento de la transcripción génica.
Basándose en sus respectivos modos de acción, las proteínas PcG y
TrG representan por lo tanto un sistema de memoria celular que es
importante para la transmisión heredable de los patrones de
transcripción génica.
Cómo están asociados los complejos de PcG y TrG
con sus genes diana todavía no está claro. Estudios genéticos han
caracterizado secuencias reguladoras que actúan en cis que mantienen
estados transcripcionalmente inactivos de los genes. El silencio
mediado por estas secuencias reguladoras que actúan en cis depende
de la presencia de proteínas PcG funcionales, y por tanto estas
secuencias han sido denominadas elementos de respuesta a PcG (PRE).
Se han identificado secuencias que están implicadas en la represión
de la cromatina mediada por PcG. Sin embargo, todavía no se ha
encontrado (en vertebrados ni en plantas) PRE completos que
comprendan toda la información de la secuencia requerida para
mediar la represión de la cromatina.
Un elemento de respuesta al grupo Polycomb es un
elemento que es capaz de reprimir la transcripción de un promotor
en respuesta a la interacción directa y/o indirecta de una o más
proteínas del grupo Polycomb con dicho elemento. Un elemento de
respuesta de tipo grupo Polycomb es un elemento de respuesta al
grupo Polycomb o alternativamente es un elemento capaz de reprimir
la transcripción de un promotor tras la interacción directa y/o
indirecta de una o más proteínas con dicho elemento, donde dichas
una o más proteínas no pertenecen al grupo Polycomb, pero donde
como resultado de dicha represión de la transcripción génica por la
interacción se forma cromatina. Los ejemplos de tales proteínas son
proteínas asociadas con cromatina tales como la proteína
heterocromatina 1 (HPLJL) (Eisenberg et al., 1990). Otra
proteína asociada con la cromatina que reprime la actividad génica
es la proteína de unión a metil-CpG, MeCP2 (Nan
et al., 1997). En una realización preferida un elemento
sensible de tipo grupo polycomb de la invención comprende la
capacidad para reprimir la transcripción de un promotor a lo largo
de grandes distancias, preferiblemente a lo largo de más de 2.000
pares de bases (van der Vlag et al., 2000).
Un gen informador es un gen que codifica un
producto de expresión cuya presencia puede ser detectada
directamente o indirectamente en una célula.
Entre los ejemplos de las secuencias de ADN con
una cualidad moduladora de la transcripción génica se encuentran
los denominados elementos STAR enumerados en las Tablas 1 y 2.
Los métodos de la invención producen la
clonación e identificación de numerosos elementos que comprenden una
actividad moduladora de la transcripción génica. Semejante elemento
puede contener ácido nucleico irrelevante que no es instrumental en
el desempeño de dicha cualidad, por ejemplo no implicado en la
formación de cromatina represora de la transcripción génica. Las
secuencias funcionales de tales elementos pueden ser delineadas por
medio de diversos métodos conocidos en la técnica. En una
realización se realizan deleciones y/o sustituciones en una
secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción
génica. El ADN que es modificado de tal modo, es sometido a ensayo
en cuanto a la actividad en un método de la invención. Esto se puede
realizar utilizando un ácido nucleico modificado individual o
generando una colección de ácidos nucleicos de ensayo que comprende
dicho ácido nucleico modificado. La elucidación de las secuencias
funcionales dentro de las secuencias de ADN de la invención permite
la elucidación de las secuencias consenso para los elementos con
una cualidad moduladora de la transcripción génica. Se prevé que se
encontrará más de un tipo de secuencias consenso para un elemento
que comprenda una cualidad moduladora de la transcripción génica. La
invención proporciona de este modo adicionalmente una genoteca de
ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que comprenden
cualidades moduladoras de la transcripción génica y/o represora de
la transcripción génica tales como elementos de respuesta de tipo
grupo polycomb. En una realización dicha genoteca comprende ácidos
nucleicos aislados y/o recombinantes que comprenden la misma
secuencia consenso. En una realización preferida dicha genoteca
comprende más de un tipo de secuencias consenso. Dicha genoteca
puede ser utilizada por ejemplo para determinar si una molécula de
ADN dada comprende una cualidad moduladora del ADN. En una
realización preferida dicha genoteca comprende esencialmente todos
los elementos con una función intensificadora de la transcripción
génica, elementos que comprenden una cualidad de la transcripción
génica estable y/o elementos con una cualidad represora de la
transcripción génica tales como elementos de respuesta de tipo grupo
polycomb, de un cromosoma. Junto con el conocimiento de la
localización de estos elementos en el cromosoma esto permite a un
experto en la técnica generar una predicción de la regulación de
orden superior de la expresión génica de genes naturalmente
presentes en dicho cromosoma y de genes (ácido nucleico foráneo)
introducidos en dicho cromosoma mediante medios recombinantes.
Semejante predicción puede ser utilizada por ejemplo para
seleccionar una localización candidato adecuada en dicho cromosoma
para la inserción de ADN foráneo. Una localización adecuada puede
ser la localización que se espera que sea expresada específicamente
en una cierta célula, tipo celular y/o tejido. Preferiblemente,
dicho cromosoma comprende el cromosoma 21 o el cromosoma 22. En una
realización particularmente preferida todas las secuencias de ADN
que comprenden una cualidad moduladora de la transcripción génica o
represora de la transcripción génica en una célula, están en la
genoteca. En esta realización se puede utilizar el genoma completo
para la predicción de una localización candidato adecuada. En una
realización dicha genoteca ha sido generada en diferentes líneas
celulares de especies que oscilan entre plantas y humanos. En
diferentes líneas y/o especies celulares se expresarán proteínas
diferentes (o complejos de proteínas) capaces de interaccionar con
secuencias de ADN con una cualidad represora de la transcripción
génica, dando como resultado diferentes elementos de ADN con una
cualidad represora de la transcripción génica. De un modo similar se
expresarán diferentes proteínas que interaccionan directa o
indirectamente con secuencias de ADN que comprenden una cualidad
moduladora de la transcripción génica. Por lo tanto la elaboración
de la genoteca depende del tipo celular y depende de la presencia
de proteínas relevantes. Este también es el caso con los elementos
de respuesta de tipo grupo polycomb. Si HP1 es expresada en el tipo
celular uno, los elementos dependientes de HP1 serán detectados
mediante el método de la invención. Si HP1 no es expresada en el
tipo celular dos, el método de la invención no detectará el
elemento que ha sido recuperado del tipo celular uno.
En un aspecto de la invención dicha genoteca
comprende al menos un elemento capaz de contrarrestar, al menos en
parte, la formación de cromatina represora de la transcripción
génica. Junto con el conocimiento de la localización de las
secuencias de ADN con una cualidad represora de la transcripción
génica en un cromosoma o genoma, el conocimiento de la localización
de semejantes elementos contrarrestadores permite la predicción
exacta de la regulación de orden superior de la transcripción génica
de genes (insertados) en dicho cromosoma o genoma. Preferiblemente
dicha genoteca comprende otros elementos reguladores de la
transcripción tales como intensificadores y silenciadores. Aunque
tales secuencias han limitado la influencia sobre la regulación
génica de orden superior, la información sobre la localización de
tales otras secuencias incrementa adicionalmente la exactitud de la
predicción de las localizaciones adecuadas en el genoma para la
expresión de secuencias foráneas introducidas allí.
Preferiblemente, dicha genoteca comprende esencialmente todas las
secuencias de ADN que comprenden una cualidad moduladora de la
transcripción génica y/o todas las demás secuencias reguladoras de
un cromosoma.
Considerando que un cromosoma ya consta
típicamente de varias decenas de millones de bases, se prefiere que
la información que la genoteca pueda proporcionar sobre la
regulación génica de orden superior sea incorporada en un sistema
al menos parcialmente automatizado.
Otro uso de una genoteca de la invención es la
generación de una predicción de la transcripción de genes tras la
modificación elegida como diana de las secuencias de un cromosoma de
manera que las secuencias reguladoras de "orden superior" sean
mutadas. Por ejemplo, uno o más elementos sensibles de tipo grupo
polycomb de la invención, y/o otros elementos reguladores de dicho
cromosoma pueden ser mutados. Se espera que esto cambie los niveles
de transcripción de los genes que están en las proximidades de los
elementos sensibles de tipo grupo polycomb y/o otros elementos
moduladores de la expresión.
Otro uso más de una genoteca o sistema de la
invención es la predicción de la expresión génica resultante de las
mutaciones del genoma. En los casos en los que una mutación da como
resultado una transcripción génica alterada, la detección de
semejante transcripción génica alterada puede indicar la presencia
de dicha mutación de origen natural. Este enfoque es útil por
ejemplo al limitar el número de secuencias de proteínas que van a
ser sometidas a ensayo en un análisis de diagnóstico. Esto es
particularmente importante en los enfoques de micromatrices debido
a que en estos enfoques el número de secuencias expresadas que va a
ser sometido a ensayo, está limitado por el número de secuencias
que puede contener una matriz como máximo. Con los medios y métodos
de la invención es posible limitar el número de secuencias que van a
ser sometidas a ensayo en los enfoques de micromatrices.
Otro uso más de un sistema o genoteca de la
invención es el descubrimiento de las dianas de fármaco. Los
elementos reguladores, sean elementos de "orden superior" o
no, funcionan debido a la proteína (complejos) que se puede unir a
ellos. Se puede utilizar un sistema de la invención para determinar
si el redireccionamiento de los fármacos para interferir en la
unión o la función de una proteína concreta (complejo) proporciona
la esperanza de la alteración de un gen concreto.
También es posible proporcionar un constructo de
ADN con una secuencia de ADN de la invención, o modificar semejante
secuencia de ADN. En una realización preferida se proporciona un
constructo de ADN que comprende un promotor conectado operablemente
con un ácido nucleico de interés. Preferiblemente, la cantidad de
actividad de una cualidad de dicha secuencia de ADN con una
cualidad moduladora de la transcripción génica, depende de la
orientación de dicha secuencia de ADN en dicho constructo, en
comparación con dicho promotor. Preferiblemente dicha cualidad
moduladora de la transcripción génica depende de la presencia de una
señal. Preferiblemente, dicha señal comprende una proteína de
unión a ADN. Preferiblemente, dicha señal comprende una proteína TAT
del virus de la inmunodeficiencia humana.
Uno de los usos de una secuencia de ADN que
comprende una cualidad moduladora de la transcripción génica es por
supuesto la regulación de la transcripción de un gen de interés. La
transcripción de un gen de interés puede ser alterada alterando las
secuencias en las proximidades de dicho gen de manera que se
proporcione o se elimine una secuencia de ADN con dicha cualidad.
Las características de expresión específicas pueden ser diseñadas
combinando secuencias (partes de) de ADN con una cualidad moduladora
de la transcripción génica. Por ejemplo, la duplicación de una
secuencia con una cualidad de transcripción génica estable en un
vector de expresión conducirá a una estabilidad mejorada de la
expresión en una célula diana o progenie tras la introducción de
dicho vector en dicha célula diana. Combinando las secuencias de ADN
con cualidades moduladoras de la transcripción génica se puede
generar cualquier clase o cantidad o ambas.
Asimismo es posible diseñar secuencias de ADN
con una cualidad moduladora de la transcripción génica deseada.
Las proteínas de unión a ADN junto con otras proteínas y secuencias
de ADN determinan las cualidades de la secuencia de ADN. Es posible
insertar una o más secuencias de ADN de unión a proteínas en una
secuencia de ADN con una cualidad. Permitiendo la unión de la
proteína o las proteínas de unión es posible interferir en, o
dirigir, la cualidad, permitiendo de este modo la generación de
secuencias de ADN con cualidades constructoras. Por supuesto
también es posible separar sitios de unión a la proteína de una
secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la transcripción
génica alternado de ese modo la cualidad de las secuencias de ADN
resultantes. La combinación de la adición y eliminación también es
posible. Se pueden seleccionar cualidades moduladoras de la
transcripción génica concretas poniendo a punto los métodos de
detección descritos en la presente invención. Por ejemplo es
posible sintetizar secuencias de ADN con cualidades moduladoras de
la transcripción génica inducibles. Se encuentran disponibles
proteínas de unión a ADN que solamente se unen a su secuencia diana
en ausencia o presencia de una señal. Los ejemplos no limitantes de
tales proteínas son el represor TET y las diversas mutaciones del
mismo, el represor lac, los receptores de hormonas esteroides, el
receptor del ácido retinoico, y sus derivados. Es posible por
ejemplo diseñar una secuencia de ADN con una cualidad modulador de
la transcripción génica específica del tipo celular. La secuencia de
ADN se puede hacer específica para un complejo de proteína que sea
expresado de una manera específica del tipo célular.
Los constructos de expresión que comprenden una
secuencia de ADN que comprende una cualidad moduladora de la
transcripción génica son adecuados para obtener la expresión de
dicho constructo en células que comprenden más de una copia de
dicho constructo de expresión. Asimismo cuando el constructo de
expresión está presente en el genoma de dicha célula y, asimismo
cuando la casete de expresión está presente en más de una copia de
dicha célula. Por otra parte, incluso funcionan cuando son
integrados en la misma posición en más de una copia.
En una realización preferida de la invención
dicha secuencia de ADN con una cualidad moduladora de la
transcripción génica comprende una secuencia denominada STAR
(Stabilizing Anti-Repression). Una secuencia STAR
según se utiliza aquí hace referencia a una secuencia de ADN que
comprende una o más de las cualidades moduladoras de la
transcripción génica mencionadas.
Se presentan aquí numerosos métodos para
determinar si una secuencia comprende actividad STAR. La actividad
STAR es confirmada si la secuencia es capaz de realizar al menos una
de las siguiente funciones: (i) inhibir al menos en parte el efecto
de la secuencia que comprende un elemento de represión de la
transcripción génica de la invención, (ii) bloquear al menos en
parte la represión asociada con la cromatina, (iii) bloquear al
menos en parte la actividad de un intensificador, (iv) conferir a un
ácido nucleico conectado operablemente que codifica una unidad de
transcripción en comparación con el mismo ácido nucleico solo
(iv-a) un predictibilidad de la transcripción
superior, (iv-b) un transcripción superior, y/o una
estabilidad de la transcripción a lo largo del tiempo superior.
El gran número de secuencias que comprenden
actividad STAR identificadas en la presente invención abre una
amplia variedad de posibilidades para generar e identificar las
secuencias que comprenden la misma actividad en clase, no
necesariamente en cantidad. Por ejemplo, está dentro del alcance del
experto en la técnica alterar las secuencias identificadas en la
presente invención y someter a ensayo las secuencias alteradas en
cuanto a la actividad STAR. Tales secuencias alteradas son también
por lo tanto parte de la presente invención. La alteración puede
incluir la deleción, inserción y mutación de una o más bases en las
secuencias.
Las secuencias que comprenden actividad STAR
fueron identificadas en tramos de 400 bases. No obstante, no se
espera que sean necesarias las 400 bases para conservar la actividad
STAR. Los métodos para delimitar las secuencias que confieren una
cierta propiedad a un fragmento de entre 400 y 5.000 bases son bien
conocidos. Se estima que la longitud de la secuencia mínima de un
fragmento que comprende actividad STAR es de aproximadamente
50 bases.
50 bases.
La actividad STAR es un rasgo compartido por las
secuencias enumeradas en la Figura 20.
En otro aspecto la invención proporciona una
secuencia de ácido nucleico aislada y/o recombinante que comprende
una secuencia STAR obtenible mediante un método de la invención.
Como se ha mencionado antes, una secuencia STAR
puede ejercer su actividad de un modo direccional, es decir,
conteniéndola un lado del fragmento más que otro. Por otra parte, la
actividad STAR puede ser amplificada en cantidad multiplicando el
número de elementos STAR. Esto último sugiere que un elemento STAR
puede comprender uno o más elementos que comprendan actividad
STAR.
El término cualidad en relación con la secuencia
hace referencia a una actividad de dicha secuencia. El término
STAR, secuencia STAR o elemento STAR, según se utiliza aquí, hace
referencia a una secuencia de ADN que comprende una o más de las
cualidades moduladoras de la transcripción génica mencionadas. El
término "secuencia de ADN" según se utiliza aquí, a menos que
se especifique de otro modo, no hace referencia a un listado de
ordenamiento específico de bases sino más bien a una porción física
de ADN. Una cualidad de transcripción con referencia a una
secuencia de ADN hace referencia a un efecto que dicha secuencia de
ADN tiene sobre la transcripción de un gen de interés. Según se
utiliza aquí, "cualidad" hace referencia a las propiedades
detectables o atributos de un ácido nucleico o proteína en un
sistema de transcripción.
Plásmidos y cepas. El vector de seleción
para los elementos STAR,
pSelect-SV40-zeo ("pSelect",
Figura 1) es construido como sigue: el vector pREP4 (Invitrogen
V004-50) es utilizado como esqueleto plasmídico.
Este proporciona el origen de replicación oriP de Epstein Barr y el
antígeno nuclear EBNA-1 para la replicación
episómica de elevado número de copias en líneas celulares de
primate; el gen de resistencia a la higromicina con el promotor de
la timidina quinasa y el sitio de poliadenilación, para la selección
en células de mamífero; y el gen de resistencia a ampicilina y el
origen de replicación colE1 para el mantenimiento en Escherichia
coli. El vector contiene cuatro sitios consecutivos para el
operador LexA entre los sitios de restricción XbaI y NheI (Bunker
and Kingston, 1994). Embebido entre los operadores LexA y el sitio
NheI está un poliligador que consta de los siguientes sitios de
restricción:
HindIII-AscI-BamHI-AscI-HindIII.
Entre el sitio NheI y un sitio SalI está el gen de resistencia a
zeocina con el promotor de SV40 y el sitio de poliadenilación,
derivado de pSV40/Zeo (Invitrogen V502-20); este es
el marcador seleccionable para el rastreo de STAR.
El vector pSDH (Figura 2) es construido como
sigue: El gen informador de la luciferasa de
pGL3-Control (Promega E1741) es amplificado
mediante PCR e insertado en pUHD10-3 digerido con
SacII/BamHI (Gossen and Bujard, 1992). Este coloca la
luciferasa bajo el control del promotor Tet-Off, y
aguas arriba de la señal de poliadenilación de SV40. Se introducen
múltiples sitios de clonación mediante PCR, aguas arriba del
promotor Tet-Off (MCSI,
XhoI-NotI-EcoRI-SalI) y aguas abajo de
la señal de poliadenilación (MCSII,
NbeI-BglII-EcoRV-HindIII).
Se construyen genotecas génicas mediante
digestión con Sau3AI de ADN genómico humano, ya sea
purificado a partir de placenta (Clontech 6550-1) o
portado en cromosomas artificiales bacteriano/P1 (BAC/PAC). Los
clones BAC/PAC contienen ADN genómico de la región citogenética
1q12 (clones RP1154H19 y RP3328E19) o a partir de la agrupación HOX
de genes homeóticos (clones RP1167F23, RP1170019, y RP11387A1). Los
ADN son fraccionados por tamaño, y la fracción de tamaño
0,5-2 kb es ligada en el vector pSelect digerido con
BamHI, mediante mecanismos normalizados (Sambrook et
al., 1989).
La construcción de las células huésped ha sido
descrita (van der Vlag et al., 2000). Brevemente, se basan
en la línea celular de osteosarcoma humano U-2 OS
(American Type Culture Collection HTB-96).
U-2 OS es transfectada establemente con el plásmido
pTet-Off (Clontech K1620-A), que
codifica una quimera de proteína que consta del dominio de unión a
ADN del represor Tet y el dominio de transactivación VP16. La línea
celular es transfectada establemente con posterioridad con genes de
la proteína de fusión que contienen el dominio de unión al ADN
LexA, y las regiones codificadoras de HP1 o HPC2 (dos proteínas del
grupo Polycomb de Drosophila que reprimen la expresión génica
cuando se traban al ADN). Los genes represores de LexA están bajo el
control del sistema regulador transcripcional
Tet-Off (Gossen and Bujard, 1992).
Rastreo de la genoteca y caracterización del
elemento STAR. Los genotecas génicas de pSelect son
transfectadas en la línea celular U-2
OS/Tet-Off/represor LexA mediante precipitación con
fosfato de calcio (Graham and van der Eb, 1973; Wigler et
al., 1978) como recomendaba el proveedor del reactivo de
transfección (Life Technologies). Las células transfectadas son
cultivadas bajo selección con higromicina (25 \mug/ml) y represión
con tetraciclina (doxiciclina, 10 ng/ml) durante 1 semana
(confluencia 50%). Después la concentración de doxiciclina se reduce
a 0,1 ng/ml para inducir los genes represores de LexA, y después de
2 días se añade zeocina a 250 \mug/ml. Las células son cultivadas
durante
4-5 semanas más, hasta que los cultivos de control (transfectados con pSelect vacío) son eliminados por la zeocina.
4-5 semanas más, hasta que los cultivos de control (transfectados con pSelect vacío) son eliminados por la zeocina.
Las colonias resistentes a zeocina de esta
transfección de la genoteca son propagadas, y el ADN plasmídico es
aislado y recuperado en E. coli mediante mecanismos
normalizados (Sambrook et al., 1989). Los elementos STAR
candidatos del ADN rescatado son analizados mediante mapeo con
endonucleasas de restricción (Sambrook et al., 1989),
análisis de la secuencia de ADN (Sanger et al., 1977), y
actividad de STAR (resistencia a zeocina) después de la
re-transfección a U-2
OS/Tet-Off/represor LexA y disminución de la
concentración de doxiciclina.
Los elementos STAR candidatos que tienen una
secuencia de ADN correspondiente a una secuencia conocida en el
genoma humano son identificados mediante búsquedas BLAST (Altschul
et al., 1990) de la base de datos del genoma humano
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/HsBlast.html 20 Junio 2001).
Las localizaciones cromosómicas de los elementos son registradas,
junto con la proporción de ADN repetitivo y la identidad de los
genes adyacentes.
Aquellos candidatos que muestran actividad STAR
tras la re-transfección son caracterizados
adicionalmente por la subclonación del fragmento STAR en el
plásmido pSDH y la integración estable en el ADN cromosómico de
U-2 OS. Los plásmidos de pSDH son
co-transfectados en células U-2 OS
con pBABE puro (Morgenstern and Land, 1990), y seleccionados en
cuanto a la resistencia a la puromicina. Se aíslan y cultivan
poblaciones de aproximadamente 30 clones individuales por elemento
STAR. Los clones son analizados periódicamente en cuanto a la
actividad luciferasa según las instrucciones del fabricante (Roche
1669893).
Caracterización del elemento funcional STAR. Los
rastreos de ADN genómico y de los loci HOX y 1q12 rindieron 17
elementos STAR genuinos. Los criterios son que (a) los elementos
desplegaban actividad STAR tras la re-transfección
de los clones basados en pSelect en la línea celular de osteosarcoma
humano U-2 OS huésped (indicando que la actividad
anti-represora expresada en el rastreo inicial es
específica del plásmido y no debida a cambios por artefactos en las
células huésped); (2) los elementos contienen una secuencia de ADN
que coincide con la secuencia de la base de datos del genoma humano
(indicando que el clon no contiene una secuencia de ADN
contaminante, v.g. de fuentes bacterianas o de vectores).
Los elementos STAR son
sub-clonados en el plásmido pSDH e integrados en el
genoma de la célula huésped. La expresión de los genes informadores
es analizada en poblaciones de transfectantes estables para
demostrar la capacidad de los elementos STAR para proteger los
genes informadores del silenciamiento después de la integración al
azar en el genoma. Esto proporciona información (1) sobre la
proporción de clones que despliegan una expresión elevada, y (2)
sobre el grado de sobre-expresión logrado por los
elementos STAR.
La expresión del gen informador de la luciferasa
por un clon es considerada significativa si está dos veces por
encima del nivel medio para los plásmidos que no contienen elementos
STAR (nivel de referencia). Para todos los plásmidos se observa una
distribución en el nivel de expresión entre los clones: desde la no
expresión hasta una expresión significativamente por encima del
nivel de referencia, y desde unos pocos
sobre-expresadores a muchos
sobre-expresadores. La actividad STAR superior es
manifestada por los plásmidos que dan como resultado muchos clones
de sobre-expresión, incluyendo algunos clones
altamente sobre-expresados. Los resultados de un
experimento representativo se muestran en la Tabla 1, y en las
Figuras 3-5:
Los resultados indican que los elementos STAR
humanos que son sometidos a ensayo rinden una proporción mucho
mayor de clones de sobre-expresión que el gen
informador no protegido, o el gen informador protegido por el
elemento SCS de Drosophila (Kellum and Schedl, 1992). Además,
el grado de sobre-expresión por estos plásmidos es
mucho mayor a partir del gen informador protegido con STAR que del
informador no protegido o protegido con SCS.
Secuencia del elemento STAR y datos de la
posición genómica. En la Tabla 2 se enumeran las localizaciones
cromosómicas de cada uno de los 17 elementos STAR, así como la
identidad de los genes inmediatos y el contenido de ADN repetitivo
de los elementos. Los elementos STAR se distribuyen a lo largo de
numerosos cromosomas. Son diversos en su secuencia de ADN real y
contenido en ADN repetitivo, y despliegan diversos grados de
asociación con los genes vecinos.
Antecedentes: se utiliza la recombinación de
sitio específico para separar precisamente los ADN heterólogos de
sus localizaciones cromosómicas. Esto se lleva a cabo rutinariamente
por medio de uno de dos sistemas: la recombinasa cre y la diana
loxP del bacteriófago P1 (Feng et al., 1999), o la
recombinasa FLP y FRT (diana recombinasa FLP) de la levadura
(Wigley et al., 1994). En estos sistemas, una región de ADN
(conteniendo normalmente un gen informador y/o un marcador
seleccionable) está flanqueada en el cromosoma por la diana loxP o
FRT. La actividad de la recombinasa cataliza después la separación
por corte precisa de la región de ADN del cromosoma. La recombinasa
resuelve sus dos secuencias de reconocimiento en un único sitio,
suprimiendo la secuencia entre ellas. De este modo, un tramo de ADN
debe estar flanqueado por sitios diana que van a ser suprimidos con
posterioridad in vivo tras la introducción o activación de
la recombinasa (Schwenk et al., 1995; Dymecki, 1996). Las
recombinasas Cre y Flp catalizan la recombinación entre dos
repeticiones invertidas de 13 pares de bases, separadas por un
espaciador con un mínimo de 6 (loxP) u 8 (FRT) pares de bases
(Senecoff et al., 1985). La secuencia loxP es ATAACTTCGTATA
y la secuencia FRT es GAAGTTCCTATAC.
Protocolo: Utilizando la clonación de ADN
convencional (Sambrook et al., 1989), se construye un gen
informador (que codifica una proteína informadora, por ejemplo la
proteína fluorescente verde (GFP) (Bierhuizen et al., 1997)
o la luciferasa (Himes and Shannon, 2000) que está flanqueado en un
plásmido por un par de elementos STAR. En cada caso, los elementos
están a su vez flanqueados por sitios diana de la recombinasa. Un
elemento está flanqueado por un par de sitios loxP, y el otro está
flanqueado por un par de sitios FRT (Figura 1). Tras la
transfección el plásmido se integra en el cromosoma del huésped en
un pequeño porcentaje de células, y los integrantes se seleccionan
mediante resistencia a antibióticos.
Utilizando los mecanismos convencionales,
("SuperFect Transfection Reagent Handbook," Qiagen, Noviembre,
1997) estos plásmidos son transfectados en la línea celular de
osteosarcoma humano U-2 OS, y seleccionados en
cuanto a la resistencia a la higromicina. Los productos aislados
resistentes a la higromicina tienen el plásmido integrado
establemente en el genoma de la línea celular. Los productos
aislados individuales son propagados en medio de cultivo celular, y
la expresión del gen informador transgénico es analizada, por
ejemplo mediante citometría de flujo (Stull et al.,
2000).
Después utilizando mecanismos convencionales
(transfección, o estimulación con hormonas), los productos aislados
estables anteriores son tratados con el fin de introducir o activar
la actividad recombinasa. Esto se realiza sucesivamente, de manera
que por ejemplo la actividad de la recombinasa cre catalice la
separación por corte de STAR1, y con posterioridad la actividad
recombinasa FLP catalice la separación por corte de STAR2. El nivel
de expresión de este gen informador en estas células es analizado y
el valor comparado con el valor de referencia del producto aislado
que contiene STAR parental.
Antecedentes: Se aíslan fragmentos de ADN que
contienen elementos STAR mediante selección genética utilizando el
plásmido pSelect (Figura 1). En esta sección se describe el enfoque
para caracterizar las secuencias de ADN dentro de aquellos
fragmentos que tienen actividad STAR.
Secuencia de ADN: Se diseñan oligonucleótidos
basándose en la secuencia del plásmido pSelect para secuenciar los
fragmentos de ADN. Los fragmentos son secuenciados utilizando la
técnica de terminación de la cadena didesoxi (Sanger et al.,
1977). Las secuencias de ADN son localizadas después con respecto a
su posición en el cromosoma utilizando la base de datos de la
secuencia del genoma humano pública
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/cgibin/Entrez/
hum_srch?chr=hum chr.inf&query). Los genes y la densidad génica en la vecindad del fragmento son registrados a partir de la anotación de la secuencia del genoma. La actividad transcripcional de aquellos genes es determinada a partir de las bases de datos públicas de micromatrices de ADN (http://arrays.rockefeller.edu/xenopus/links.html) y datos SAGE (Serial Analysis of Gene Expression; http://bioinfo.amc.uva.nl/HTM-bin/index.cgi). Una vez recopilada la información posicional sobre las secuencias STAR, los datos son analizados en términos de las secuencias consenso subyacentes. Las secuencias consenso o las tendencias (por estas se entiende las áreas locales ricas en combinaciones de nucleótidos concretas, v.g. ricas en bases C y G) son detectadas utilizando algoritmos de búsqueda de la similitud tales como la puntuación de similitud clustalw (Higgins et al., 1996) y blosum (Altschul and Gish, 1996). Después se utilizan cualquiera de los consensos subyacentes o tendencias encontrados para identificar otros STAR potenciales realizando búsquedas BLAST (Altschul et al., 1990). La búsqueda previa ha identificado proteínas reguladoras de la transcripción que se unen a aislantes y elementos límite conocidos (Gaszner et al., 1999; Gerasimova and Corces, 1998). En los ejemplos descritos antes, los sitios de unión a la proteína coinciden con los sitios hipersensibles a la DNasa I que son esenciales para la función del aislante o el límite. La hipótesis de que los elementos STAR también están unidos por proteínas reguladoras conocidas es examinada investigando la base de datos TRANSFAC de factores de transcripción (http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/) en cuanto a los motivos secuenciales que existen en los elementos STAR. Los motivos secuenciales que son comunes entre los miembros de las colecciones de STAR son indicadores de que el factor de transcripción correspondiente se une a ese elemento.
hum_srch?chr=hum chr.inf&query). Los genes y la densidad génica en la vecindad del fragmento son registrados a partir de la anotación de la secuencia del genoma. La actividad transcripcional de aquellos genes es determinada a partir de las bases de datos públicas de micromatrices de ADN (http://arrays.rockefeller.edu/xenopus/links.html) y datos SAGE (Serial Analysis of Gene Expression; http://bioinfo.amc.uva.nl/HTM-bin/index.cgi). Una vez recopilada la información posicional sobre las secuencias STAR, los datos son analizados en términos de las secuencias consenso subyacentes. Las secuencias consenso o las tendencias (por estas se entiende las áreas locales ricas en combinaciones de nucleótidos concretas, v.g. ricas en bases C y G) son detectadas utilizando algoritmos de búsqueda de la similitud tales como la puntuación de similitud clustalw (Higgins et al., 1996) y blosum (Altschul and Gish, 1996). Después se utilizan cualquiera de los consensos subyacentes o tendencias encontrados para identificar otros STAR potenciales realizando búsquedas BLAST (Altschul et al., 1990). La búsqueda previa ha identificado proteínas reguladoras de la transcripción que se unen a aislantes y elementos límite conocidos (Gaszner et al., 1999; Gerasimova and Corces, 1998). En los ejemplos descritos antes, los sitios de unión a la proteína coinciden con los sitios hipersensibles a la DNasa I que son esenciales para la función del aislante o el límite. La hipótesis de que los elementos STAR también están unidos por proteínas reguladoras conocidas es examinada investigando la base de datos TRANSFAC de factores de transcripción (http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/) en cuanto a los motivos secuenciales que existen en los elementos STAR. Los motivos secuenciales que son comunes entre los miembros de las colecciones de STAR son indicadores de que el factor de transcripción correspondiente se une a ese elemento.
Secuencia esencial mínima: Utilizando este
conocimiento, los elementos STAR son truncados y sometidos a ensayo
en cuanto a su funcionalidad. Esto se realiza utilizando la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) para clonar
sub-fragmentos de los fragmentos que contienen STAR
en pSelect mediante mecanismos normalizados (Sambrook et
al., 1989). Los plásmidos que contienen los
sub-fragmentos son transfectados en células
U-2 OS y sometidos a ensayo en cuanto a la
funcionalidad analizando la resistencia a antibióticos.
Direccionalidad: Los elementos STAR son
sometidos a ensayo en cuanto a su direccionalidad utilizando el
plásmido pSelect. Por ejemplo, la dirección de los elementos STAR
aislados mediante el rastreo de pSelect es referida como
orientación 5'3'. La orientación del elemento es invertida mediante
mecanismos de recombinación de ADN convencionales (Sambrook et
al., 1989). Los plásmidos resultantes son transfectados en la
línea celular U-2 OS y la expresión del gen
informador es analizada (Bierhuizen et al., 1997; Himes and
Shannon, 2000). El nivel de expresión del plásmido con el elemento
de orientación inversa es comparado con el de orientación 5'3'. Si
el plásmido de orientación inversa tiene niveles de expresión
similares, el elemento STAR no muestra direccionalidad.
Combinaciones y múltiplos de elementos: Para
determinar si los elementos STAR son capaces de funcionar en pares
mezclados, se combinan elementos diferentes y se someten a ensayo.
El análisis se realiza en el plásmido pSDH insertando un elemento
STAR en MCSI y un STAR diferente en MCSII mediante mecanismos de ADN
recombinante (Sambrook et al., 1989). Los plásmidos
resultantes son transfectados, y la expresión del gen informador es
analizada (Bierhuizen et al., 1997; Himes and Shannon, 2000);
los resultados son comparados con la expresión de plásmidos que
contienen el mismo elemento en MCSI y MCSII; si la expresión es
similar para los dos tipos de plásmidos, se concluye que los
elementos STAR diferentes no interfieren entre sí.
La resistencia de los elementos STAR
individuales se compara con las repeticiones en tándem de los
elementos. Esto se realiza mediante concatamerización de los
elementos STAR de interés con ADN ligasa e inserción del producto
de ligadura en el plásmido pSDH mediante mecanismos de ADN
recombinante (Sambrook et al., 1989). Los plásmidos
resultantes son transfectados en células U-2 OS, y
la expresión del gen informador es analizada (Bierhuizen et
al., 1997; Himes and Shannon, 2000); Los resultados se comparan
con la expresión de plásmidos que contienen elementos STAR
individuales.
Antecedentes: se utilizan elementos STAR para
optimizar la expresión de transgenes individuales y múltiples. Para
determinar si un único par de elementos STAR puede proteger
transgenes grandes o múltiples del silenciamiento es necesario
determinar el intervalo a lo largo del cual actúan los elementos
STAR.
Protocolo: Los elementos STAR son sometidos a
ensayo en cuanto a su funcionalidad a lo largo de una distancia
utilizando plásmidos derivados basados en pSelect, como sigue. Se
ensambla una genoteca de fragmentos de ADN al azar de 500 pb a 10
kb mediante mecanismos de clonación de ADN normalizados (Sambrook
et al., 1989). De esta genoteca se seleccionan los
fragmentos que no poseen actividad STAR, sometiéndolos a ensayo en
el plásmido pSelect como se ha descrito antes. Para los elementos
STAR, estos fragmentos son insertados entre el sitio de clonación y
el promotor del gen informador en el plásmido pSelect apropiado
(Figura 1). Este grupo de plásmidos es transfectado a la línea
célular U-2 OS, y la expresión es medida como se ha
descrito antes. La resistencia de la expresión del gen informador
se corresponde con la longitud del fragmento de ADN al azar que
separa el elemento STAR y el promotor.
Antecedentes: los STAR son clonados como
fragmentos de ADN recuperados utilizando el plásmido pSelect, lo
que se realiza con fragmentos de ADN genómico de menos de 2 kb. No
obstante, estos podrían ser porciones de un elemento STAR más
ampliado. La actividad de STAR ampliada se examina mediante los
siguientes experimentos.
Protocolo: los elementos STAR clonados en
pSelect son mapeados para la secuencia del genoma humano. Con el
fin de determinar si son porciones de un elemento STAR más ampliado,
las regiones de 4 kb que abarcan los clones son amplificadas
mediante PCR y clonadas en el plásmido pSelect y/o pSDH mediante
mecanismos de ADN recombinante normalizados (Sambrook et
al., 1989). Los plásmidos resultantes son transfectados en
células U-2 OS y analizados en cuanto a la
expresión del gen informador como se ha descrito antes; los
plásmidos que contienen el elemento STAR de 2 kb original son
incluidos como control. Se pueden esperar tres posibles resultados:
(1) una expresión similar por los productos aislados de control y
ampliados, demostrando que el elemento STAR está confinado al
fragmento de 2 kb original; (2) una expresión inferior por los
productos aislados de STAR ampliado, sugiriendo que el elemento
STAR está contenido en el fragmento de 2 kb y no actúa eficazmente a
lo largo de una distancia o que el fragmento ampliado contiene un
elemento con una cualidad represora de la transcripción génica; (3)
una expresión superior por los productos aislados de STAR ampliado,
sugiriendo que la región ampliada contiene un elemento STAR más
completo. En el caso del resultado (3), el ejercicio se reitera con
un fragmento de PCR más grande de 6 kb.
Un elemento STAR también puede estar compuesto
por sitios a los cuales se unen diversas proteínas. Por lo tanto
los fragmentos de ADN grandes con una actividad STAR podrían ser
divisibles en fragmentos más pequeños con actividad STAR (ver
ejemplo 3). Los elementos que son mayores de 2 kb son reconocidos
como elementos STAR si todavía presentan actividad STAR tras el
truncamiento a menos de 2 kb (incluyendo por medio de deleción
interna).
Antecedentes: Las propiedades reguladoras de los
elementos STAR están asociadas con la estructura de la cromatina
local, que es determinada por el propio ADN y por las proteínas
asociadas al ADN. Los cambios en la estructura de la cromatina que
están asociados con los cambios en la expresión génica son
producidos a menudo por modificaciones secundarias de las
macromoléculas, especialmente la metilación del ADN o la
acetilación de las proteínas histónicas. La identificación de las
modificaciones secundarias que se producen en los elementos STAR y
en los transgenes adyacentes proporciona sellos para estos
elementos.
Protocolo: Metilación de ADN: los elementos STAR
son clonados en el plásmido pSelect mediante mecanismos normalizados
(Sambrook et al., 1989). Las células U-2 OS
son transfectadas establemente con estos plásmidos, y con pSelect
que carece de un elemento STAR como control para determinar la
metilación de ADN basal en el gen informador.
Las células son cosechadas y la cromatina
purificada mediante procedimientos normalizados (Thomas, 1998). El
ADN es digerido con las endonucleasas de restricción HpaII y
MspI en reacciones separadas (Sambrook et al., 1989).
Ambas enzimas de restricción son capaces de cortar la secuencia no
metilada CCGG. Cuando la C externa está metilada, ni MspI ni
HpaII pueden escindir. No obstante, a diferencia de
HpaII, MspI puede escindir la secuencia cuando la C
interna está metilada. El ADN es sometido a transferencia Southern
y la transferencia es analizada mediante marcaje terminal indirecto
(Pazin and Kadonaga, 1998). Como control, el correspondiente
plásmido pSelect en forma de ADN no metilado, desnudo, también es
cortado con las enzimas descritas y sometido a transferencia
Southern. La comparación de los diferentes tamaños de los fragmentos
de ADN revela si el ADN está metilado in vivo o no.
Acetilación de las histonas: Las mismas líneas
celulares transfectadas utilizadas para el análisis de metilación
del ADN se utilizan para estos experimentos. El método descrito más
abajo rinde un mapa de alta resolución del patrón de acetilación de
la histona sobre los elementos STAR y el gen informador (Litt et
al., 2001). Los productos digeridos con nucleasa Microcócica de
los núcleos son fraccionados sobre gradientes de sacarosa, y los
monómeros y dímeros de nucleosoma purificados son enriquecidos en
histonas acetiladas mediante inmunoprecipitación con anticuerpos
anti-acetilhistona. La fracción de nucleosoma y los
productos inmunoprecipitados son sometidos a análisis, por ejemplo,
mediante PCR en tiempo real (Jung et al., 2000) utilizando
cebadores y una sonda Taqman que hibrida con el gen informador o el
elemento STAR para rendir productos de 0,2 kb, con una ventana
móvil de 0,1 kb. La tasa de incremento de la señal fluorescente de
la sonda Taqman durante la PCR (que es proporcional a la abundancia
del ADN molde en la muestra) es medida después. La proporción de la
abundancia del ADN molde en la fracción de nucleosoma y los
productos inmunoprecipitados proporciona una mapa fino del patrón
de acetilación de las histonas para cada 0,1 kb sobre el gen
informador y el elemento STAR (o sobre el gen informador en
ausencia de un elemento).
Antecedentes: La cromatina está formada por ADN,
histonas, y proteínas no histónicas. Las histonas forman una
partícula núcleo que está envuelta por \sim150 pb de ADN para
formar el nucleosoma. Los nucleosomas están separados por
50-75 pb de ADN conector.
Los nucleosomas posicionados establemente sobre
el ADN cromosómico reprimen la expresión génica, y los factores que
excluyen los nucleosomas o la cromatina remodelada de otro modo
pueden superar esta represión. El posicionamiento de los
nucleosomas en una región cromosómica es analizado mediante análisis
con nucleasa microcócica (MNasa); la MNasa corta la cromatina
preferentemente en el ADN conector. De un modo similar, algunas
áreas de ADN están constitutivamente expuestas a las proteínas no
histónicas, y estas son frecuentemente regiones reguladoras, es
decir, sitios donde se unen los factores reguladores que actúan en
cis. Experimentalmente, estos sitios son hipersensibles a la
digestión por la enzima ADNasa I.
Protocolo: Para determinar la posición de los
nucleosomas sobre el gen informador y sobre los elementos STAR, se
utiliza la MNasa (Saluz and Jost, 1993). Los núcleos son purificados
a partir de las células U-2 OS cultivadas y
digeridas con MNasa como se ha descrito antes (acetilación de
histonas). Para investigar los sitios hipersensibles a la ADNasa I
en los elementos STAR o el gen informador, los núcleos purificados
son tratados con ADNasa I a una concentración apropiada (v.g. 100
\mug/ml de ADN genómico en 20-100 U/ml de ADNasa
I), como se ha descrito (Wallrath et al., 1998). El ADN
desnudo es digerido con ADNasa I como control. Para ambas técnicas,
el gen informador y los elementos STAR son sometidos a mapeo fino
utilizando la prolongación del cebador o el marcaje terminal
indirecto y la transferencia Southern, como se ha descrito (Tanaka
et al., 1996; van der Vlag et al., 2000). El análisis
de la MNasa revela una escala de bandas discretas en un
autorradiograma correspondiente a las posiciones de los nucleosomas
sobre los elementos STAR o el gen informador. Los sitios
hipersensibles a la ADNasa I se manifiestan como bandas discretas
en el autorradiograma resultante que están ausentes o son menos
prominentes en el control de ADN desnudo.
Antecedentes: Se ha informado de que algunos
elementos aislantes o límite pueden mostrar especificidad hacia el
tejido (Takada et al., 2000). Los elementos STAR tienen
muchos rasgos en común con los elementos aislantes y límite. Tanto
los elementos STAR promiscuos como los específicos de tejidos tienen
un valor biotecnológico en las aplicaciones transgénicas. El
análisis descrito más abajo se realiza para evaluar la dependencia
del tipo de célula. La especificidad de la célula y del tejido de
los elementos es examinada adicionalmente examinando la expresión
de los genes en la vecindad de los elementos en el genoma humano,
utilizando las bases de datos públicas de micromatrices de ADN
(http://arrays.rockefeller.edu/xenopus/links.html) y datos
SAGE (Serial Analysis of Gene Expression;
http://bioinfo.amc.uva.nl/HTM-bin/index.cgi).
Protocolo: los elementos STAR son sometidos a
ensayo en el plásmido pSDH. Se transfectan tres líneas celulares
utilizando protocolos normalizados: la línea celular de
osteosarcoma U-2 OS (Heldin et al., 1986), la
línea celular Vero de riñón de mono verde Africano (Simizu et
al., 1967), y la línea celular CHO de ovario de hámster Chino
(Kao and Puck, 1968). Los elementos capaces de funcionar en los
tres tipos celulares son categorizados como promiscuos. Aquellos que
solamente despliegan actividad en una o dos de las líneas celulares
se categorizan como restringidos en su funcionalidad en el tipo
celular.
Especificidad del promotor: los elementos STAR
son actualmente seleccionados y sometidos a ensayo en el contexto
de la función con dos promotores, el promotor de citomegalovirus
completo (CMV) o el Elemento de Respuesta a la Tetraciclina y el
promotor mínimo de CMV (combinado con el activador transcripcional
tTA). Para evaluar la especificidad del promotor, la función STAR
es sometida a ensayo con otros promotores virales comúnmente
utilizados, a saber los promotores temprano y tardío del virus de
simios de tipo 40 (SV40), y los promotores principal y tardío de
EIA adenoviral, y la repetición larga terminal del virus del sarcoma
de Rous (RSV) (Doll et al., 1996; Smith et al., 2000;
Weaver and Kadan, 2000; Xu et aL, 1995). Cada uno de estos
promotores es clonado por separado en el plásmido pSelect mediante
mecanismos normalizados (Sambrook et aL, 1989) junto con los
elementos STAR. Los plásmidos resultantes son transfectados en la
línea celular U-2 OS y analizados en cuanto a la
expresión del gen informador, como se ha descrito antes. La
capacidad de los elementos STAR para protegerse frente al
silenciamiento, es determinada mediante comparación con los
plásmidos que carecen de elementos STAR.
Antecedentes: Se desarrollan elementos STAR
mejorados. Las mejoras rindieron una actividad
anti-represiva de resistencia incrementada, y
elementos con actividad inducible y específica del tejido. Estas
mejoras se realizan por medio de una combinación de técnicas.
Evolución forzada: Se utiliza una PCR propensa a
errores (Cherry et al., 1999; Henke and Bornscheuer, 1999)
para introducir una media de una o dos mutaciones puntuales por
elemento. Los elementos mutagenizados son rastreados utilizando
plásmidos pSelect conteniendo proteínas de fusión
informador-marcador seleccionable por ejemplo
mediante clasificación celular activada por fluorescencia y
resistencia a antibióticos (Bennett et al., 1998).
Posteriores rondas de PCR propensas a errores y selección se llevan
a cabo para derivar elementos con mejoras adicionales en la
actividad.
Combinaciones en tándem y heterólogas: Como se
ha descrito antes, las combinaciones en tándem y heterólogas de los
elementos son sometidas a ensayo en cuanto a la actividad en
comparación con los elementos individuales (ejemplo 3).
La dominancia relativa de los elementos STAR es
sometida a ensayo caso por caso. Esto se utiliza para someter a
ensayo la resistencia de un elemento; por ejemplo, si un nuevo
elemento STAR es dominante para un elemento fuerte, conocido con
una cualidad represora de la transcripción génica, en ese caso el
STAR es clasificado como muy fuerte. También se considera la
posibilidad de que la relación de dominancia entre un STAR y un
elemento con una cualidad de represión de la transcripción génica
sea específica del tipo celular, del tejido, o del promotor
(ejemplo 8). En el ensayo de dominancia se utiliza el plásmido
pSelect, con elementos individuales con una cualidad represora de
la transcripción génica situada aguas arriba de los elementos STAR
individuales mediante mecanismos de ADN recombinante (Sambrook
et al., 1989). Los plásmidos son transfectados a células
U-2 OS y la expresión del gen informador es
analizada. La dominancia de STAR es manifestada por una expresión
superior que el plásmido con sólo un elemento con una cualidad
represora de la transcripción génica.
Introducción de sitios de unión para otras
proteínas de unión a ADN a elementos STAR para añadir
características novedosas (v.g. inducibilidad, especificidad de
tejido)
Antecedentes: se crean elementos STAR regulables
combinándolos con sitios de unión para proteínas de unión al ADN
dependientes de la señal. En un ejemplo esto implicaría la
yuxtaposición de un STAR y un elemento de respuesta a
glucocorticoides (GRE). En ausencia de estimulación por
glucocorticoides el elemento STAR funcionaría como se describe.
Tras la estimulación, el receptor de glucocorticoides de origen
natural se une a GRE e interfiere en la función de STAR.
Protocolo: Utilizando la clonación de ADN
convencional (Sambrook et al., 1989), se introduce un GRE en
el vector pSelect adyacente a los elementos STAR. El plásmido es
transfectado en células U-2 OS como se ha descrito
antes. Las células se dividen en dos cultivos; uno se trata con
glucocorticoides (10 \muM). La expresión del gen informador se
mide y se compara entre los dos cultivos. Las diferencias en la
expresión demuestran la capacidad para regular la función de STAR
mediante la acción de una proteína de unión a ADN dependiente de la
señal.
Elementos STAR promiscuos: El ensayo o la
intensificación de estas características implica el cultivo en
diferentes líneas celulares, y el cultivo a largo plazo sin
selección con antibiótico (ejemplos 8 y 10).
Antecedentes: En la transgénesis, la dependencia
de los marcadores de selección tiene dos desventajas: el agente de
selección es normalmente caro y conlleva un coste metabólico para
las células, y existen objeciones reguladoras y éticas para incluir
marcadores seleccionables en aplicaciones transgénicas,
especialmente si el propio transgen está en el producto (v.g.
plantas de cultivo, vectores de terapia génica). Los elementos STAR
reducen o eliminan la necesidad de mantener la selección después de
establecer el producto aislado transgénico. Por consiguiente, el
gen de resistencia puede ser separado del genoma transgénico
mediante recombinación de sitio específico con una pérdida
disminuida de la expresión del transgen.
Protocolo: Se producen líneas celulares
U-2 OS transfectadas establemente conteniendo
elementos STAR integrados cromosómicamente flanqueando genes
informadores por medio de co-transfección del
plásmido pSDH con un plásmido de resistencia a antibióticos que
actúan en trans como se ha descrito antes. El experimento implica
someter a ensayo la estabilidad del nivel de expresión del gen
informador en estas líneas celulares durante un cultivo prolongado
(3-6 meses) en ausencia de selección. Este se somete
a ensayo con elementos STAR flanqueando los genes informadores de
la luciferasa o GFP en plásmidos pSDH. El gen de resistencia a
antibióticos es separado construyendo un plásmido de expresión
(basado en pSDH) en el cual el marcador de selección del antibiótico
está flanqueado por sitios diana para la recombinasa. El marcador
seleccionable es separado por corte con posterioridad por medio de
la actividad de la recombinasa, como se ha descrito antes (ejemplo
2).
Los elementos STAR funcionan bloqueando las
influencias de la represión transcripcional sobre las unidades de
expresión de los transgenes. Estas influencias de represión pueden
estar debidas a la heterocromatina ("efectos sobre la
posición", (Boivin & Dura, 1998)) o a copias adyacentes del
transgen ("silenciamiento génico inducido por repeticiones",
(Garrick et al., 1998)). Dos de los beneficios de los
elementos STAR para la producción de proteínas heterólogas son el
incremento de la pronosticabilidad del descubrimiento de células
huésped recombinantes primarias con un elevado nivel de expresión y
el incremento del rendimiento durante los ciclos de producción.
Estas ventajas se ilustran en este ejemplo.
Construcción de vectores pSDH y derivados que
contienen STAR: El vector pSDH-Tet fue construido
mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) del marco de lectura abierto de la luciferasa a partir del
plásmido pREP4-HSF-Luc (van der
Vlag et al., 2000) utilizando los cebadores C67 y C68 (todos
los cebadores de la PCR y oligonucleótidos mutagénicos se enumeran
en la Tabla 5), e inserción del fragmento SacII/BamHI en
pUHD1o-3 digerido con SacIIIBamHI (Gossen &
Bujard, 1992). La unidad de expresión de la luciferasa fue
re-amplificada con los cebadores C65 y C66, y
re-insertada en pUHD10-3 con el fin
de flanquearla con dos sitios de clonación múltiple (MCSI and
MCSII). Después se introdujo un sitio AscI en MCSI mediante
digestión con EcoRI e inserción de un conector (que constaba de
oligonucleótidos hibridados D93 y D94). El promotor de CMV fue
amplificado a partir del plásmido pCMV-Bsd
(Invitrogen K510-01) con los cebadores D90 y D91, y
utilizado para remplazar el promotor Tet-Off en
pSDH-Tet mediante digestión con SaII/SacII y
ligadura para crear el vector pSDH-CMV. El marco de
lectura abierto de la luciferasa en este vector fue remplazado por
SEAP (Fosfatasa Alcalina Secretada) como sigue: el vector
pSDH-CMV fue digerido con SacII y BamHI y sus
extremos fueron convertidos en romos; el marco de lectura abierto
SEAP fue aislado de pSEAP-basic (Clontech
6037-1) por medio de digestión con EcoRI/SaII, sus
extremos fueron convertidos en romos y fue ligado en
pSDH-CMV para crear el vector
pSDH-CS. El gen de resistencia a la puromicina bajo
el control del promotor de SV40 fue aislado del plásmido
pBabe-Puro (Morgenstern & Land, 1990) mediante
PCR, utilizando los cebadores C81 y C82. Este fue ligado en el
vector pGL3-control (sitio BamHI eliminado)
(Promega E1741) digerido con NcoI/XbaI, para crear
pGL3-puro. pGL3-puro fue digerido
con BglII/SalI para aislar el gen de resistencia a SV40 puro, sus
extremos fueron convertidos en romos y fue ligado en
pSDH-CS digerido con NheI, con los extremos romos.
El vector resultante, pSDH-CSP, se muestra en la
Fig 6. Todas las etapas de clonación se llevaron a cabo siguiendo
las instrucciones proporcionadas por los fabricantes de los
reactivos, según los métodos conocidos en la técnica (Sambrook et
al., 1989).
Los elementos STAR fueron insertados en MCSI y
MCSII en dos etapas, mediante digestión del elemento STAR y el
vector pSDH-CSP con una enzima de restricción
apropiada, seguido de ligadura. La orientación de los elementos
STAR en los vectores pSDH recombinantes fue determinada mediante
mapeo de restricción. La identidad y la orientación de los insertos
fueron verificadas mediante análisis de la secuencia de ADN. La
secuenciación fue realizada mediante el método didesoxi (Sanger
et al., 1977) utilizando un secuenciador de ADN automatizado
Beckman CEQ2000, según las instrucciones del fabricante. En
resumen, el ADN fue purificado de E. coli utilizando QIAprep
Spin Miniprep and Plasmid Midi Kits (QIAGEN 27106 y 12145,
respectivamente). La secuenciación del ciclo se llevó a cabo
utilizando los oligonucleótidos C85, E25, y E42 (Tabla 5) de
costumbre, en presencia de terminadores coloreados (CEQ Dye
Terminator Cycle Sequencing Kit, Beckman 608000).
Transfección y cultivo de células CHO con
plásmidos pSDH: La línea celular de Ovario de Hámster Chino
CHO-K1 (ATCC CCL-61) en medio
HAMS-F12 + Suero de Ternera Fetal al 10% conteniendo
glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, y 100 microgramos/ml de
estreptomicina a 37°C/CO2 al 5%. Las células fueron transfectadas
con el vector pSDH-CSP, y sus derivados conteniendo
STAR6 o STAR49 en MCSI y MCSII, utilizando SuperFect (QIAGEN) como
describe el fabricante. En resumen, las células fueron sembradas en
recipientes de cultivo y se hicieron crecer durante la noche hasta
una confluencia del 70-90%. El reactivo SuperFect se
combinó con el ADN plasmídico (linealizado en este ejemplo mediante
digestión con PvuI) a una proporción de 6 microlitros por microgramo
(v.g. para una placa Petri de 10 cm, 20 microgramos de ADN y 120
microlitros de SuperFect) y se añadieron a las células. Tras
incubar durante la noche la mezcla de transfección fue remplazada
por medio de nueva aportación, y las células transfectadas fueron
incubadas adicionalmente. Tras cultivar durante la noche, se
añadieron 5 microgramos/ml de puromicina. La selección con
puromicina se completó en 2 semanas, después de lo cual se aislaron
clones CHO/pSDH resistentes a la puromicina individuales al azar y
se cultivaron adicionalmente.
Análisis con Fosfatasa Alcalina Secretada
(SEAP): La actividad SEAP (Berger et al., 1988, Henthorn
et al., 1988, Kain, 1997, Yang et al., 1997) en el
medio de cultivo de los clones CHO/pSDH-CSP fue
determinada como describe el fabricante (estuche Clontech Great
EscAPe #K2041). Brevemente, una alícuota del medio fue inactivada
con calor a 65ºC, después fue combinada con tampón de análisis y
sustrato quimioluminiscente CSPD e incubada a la temperatura
ambiente durante 10 minutos. La tasa de conversión de sustrato fue
determinada después en un luminómetro (Turner 20/20TD). La densidad
celular fue determinada sometiendo a recuento las células tratadas
con tripsina en un contador celular Coulter ACT10.
Transfección y cultivo de células
U-2 OS con plásmidos pSDH: La línea celular de
osteosarcoma humano U-2 OS (ATCC
#HTB-96) fue cultivada en Medio de Eagle Modificado
de Dulbecco + Suero de Ternera Fetal al 10% conteniendo glutamina,
penicilina, y estreptomicina (supra) a 37°C/CO2 al 5%. Las
células fueron co-transfectadas con el vector
pSDH-CMV vector, y sus derivados conteniendo STAR6 o
STAR8 en MCSII y MCSII, (junto con el plásmido
pBabe-Puro) utilizando SuperFect (supra). La
selección con Puromicina se completó en 2 semanas, tiempo tras el
cual se aislaron clones U-2
OS/pSDH-CMV resistentes a la puromicina al azar y se
cultivaron adicionalmente.
Análisis con luciferasa: la actividad luciferasa
fue analizada (Himes & Shannon, 2000) en células resuspendidas
según las instrucciones del fabricante del estuche de análisis
(Roche 1669893), utilizando un luminómetro (Turner 20/20TD). La
concentración de proteína celular total fue determinada mediante el
método del ácido bicincónico según las instrucciones del fabricante
(Sigma B-9643), y utilizada para normalizar los
datos de la luciferasa.
Los clones de las células CHO recombinantes que
contienen el vector pSDH-CSP, o los plásmidos
pSDH-CSP que contienen STAR6 o STAR49 (Tabla 6),
fueron cultivados durante 3 semanas. La actividad SEAP de los
sobrenadantes de cultivo fue determinada después, y es expresada
basándose en el número de células (Fig. 7). Como se puede observar,
se aislaron clones con elementos STAR en las unidades de expresión
que expresan una actividad SEAP 2-3 veces superior
que los clones cuyas unidades de expresión no incluían elementos
STAR. Además, el número de clones que contienen elementos STAR que
expresan actividad SEAP a la actividad máxima o por encima de ella
de los clones STAR negativos es bastante elevado: del 25% al 40% de
las poblaciones de clones STAR excedían la expresión SEAP más
elevada de los clones pSDH-CSP.
Los clones de las células U-2 OS
recombinantes que contenían el vector pSDH-CMV, o
los plásmidos pSDH-CMV que contenían STAR6 o STAR8
(Tabla 6), fueron cultivados durante 3 semanas. La actividad
luciferasa de las células huésped fue determinada después, y
expresada como unidades de luciferasa relativas (Fig. 8),
normalizadas para la proteína celular total. Los clones de
U-2 OS recombinantes con elementos STAR flanqueando
las unidades de expresión que tenían rendimiento mayores que los
clones STAR negativos: la expresión más elevada observada a partir
de los clones STAR8 era 2-3 veces superior que la
expresión observada a partir de los clones STAR negativos. Los
clones STAR6 tenían niveles de expresión máxima 5 veces superiores
que los clones STAR negativos. Los elementos STAR conferían también
una mayor pronosticabilidad: para ambos elementos STAR, de 15 al 20%
de los clones presentaban expresión luciferasa a niveles
comparables o mayores que los clones STAR negativos con el nivel de
expresión más elevado.
Estos resultados demuestran que, cuando se
utilizan con un promotor CMV potente, los elementos STAR incrementan
el rendimiento de proteínas heterólogas (luciferasa y SEAP). Los
tres elementos STAR introducidos en este ejemplo proporcionan
rendimientos elevados. El aumento de pronosticabilidad conferido por
los elementos STAR es manifestado por la gran proporción de los
clones con rendimiento iguales o mayores que los rendimientos más
elevados presentados por los clones STAR negativos.
Durante el cultivo de las células huésped
recombinantes, es una práctica común mantener la selección mediante
antibióticos. Esto está destinado a evitar el silenciamiento
transcripcional del transgen, o la pérdida del transgen a partir
del genoma mediante procedimientos tales como la recombinación. No
obstante no es deseable para la producción de proteínas
heterólogas, por numerosas razones. Primero, los antibióticos que se
utilizan son bastante caros, y contribuyen significativamente al
coste unitario del producto. Segundo, para el uso biofarmacéutico,
la proteína debe ser demostrablemente pura, sin trazas del
antibiótico en el producto. Una ventaja de los elementos STAR para
la producción de proteínas heterólogas es que confieren una
expresión estable a los transgenes durante el cultivo prolongado,
incluso en ausencia de selección con antibiótico; esta propiedad se
demuestra en este ejemplo.
La línea celular U-2 OS fue
transfectada con el plásmido
pSDH-Tet-STAR6 y cultivada como se
describe en el Ejemplo 11. Los clones resistentes a la puromicina
individuales fueron aislados y cultivados adicionalmente en
ausencia de doxiciclina. A intervalos semanales las células fueron
transferidas a recipientes de cultivo nuevos a una dilución 1:20.
La actividad luciferasa fue media a intervalos periódicos como se
describe en el Ejemplo 11. Al cabo de 15 semanas los cultivos
fueron divididos en dos productos replicados; un producto replicado
continuó recibiendo puromici-
na mientras el otro producto replicado no recibió antibiótico durante el resto del experimento (25 semanas en total).
na mientras el otro producto replicado no recibió antibiótico durante el resto del experimento (25 semanas en total).
La Tabla 7 presenta los datos de expresión de la
luciferasa mediante la unidad de expresión flanqueada por STAR6
durante el crecimiento prolongado con o sin antibióticos. Como se
puede observar, la expresión del transgen informador, luciferasa,
permanece estable en las células huésped U-2 OS
durante el experimento. Una vez que los cultivos se dividieron en
dos tratamientos (más antibiótico y sin antibiótico) la expresión de
la luciferasa era esencialmente estable en ausencia de selección
con antibiótico. Esto demuestra la capacidad de los elementos STAR
para proteger los trangenes del silenciamiento o pérdida durante el
cultivo prolongado. También demuestra que esta propiedad es
independiente de la selección con antibiótico.
Por lo tanto la producción de proteínas
heterólogas es posible sin que incurra en los costes del antibiótico
o la dificultad del procesamiento aguas abajo.
Los elementos STAR fueron aislados del rastreo
genético descrito en el Ejemplo 1. En el rastreo se utilizan
genotecas construidas con ADN genómico humano que estaba fraccionado
por tamaño entre aproximadamente 0,5-2 kilobases
(supra). Los elementos STAR oscilan entre 500 y 2.361 pb.
(Tabla 6). Es probable que, para muchos de los elementos STAR que
han sido aislados, la actividad STAR sea conferida por un fragmento
de ADN más pequeño que el clon aislado inicialmente. Es útil
determinar estos tamaños de fragmentos mínimos que son esenciales
para la actividad STAR, por dos razones.
Primera, los elementos STAR funcionales más
pequeños serían ventajosos en el diseño de vectores de expresión
compactos, puesto que los vectores más pequeños transfectan las
células huésped con mayor eficacia. Segunda, determinar las
secuencias STAR esenciales mínimas permite la modificación de
aquellas secuencias para una funcionalidad intensificada. Dos
elementos STAR han sido sometidos a mapeo fino para determinar sus
secuencias esenciales mínimas.
STAR10 (1.167 pares de bases)) y STAR27 (1.520
pares de bases) han sido sometidos a mapeo fino. Han sido
amplificados mediante PCR para rendir
sub-fragmentos de una longitud aproximadamente igual
(leyenda de la Fig. 9). Para el ensayo inicial, estos han sido
clonados en el vector pSelect en el sitio BamHI, y transfectados en
células U-2
OS/Tet-Off/LexA-HP1 como se describe
en el Ejemplo 1. Tras la selección en cuanto a la resistencia a la
higromicina, LexA-HP1 fue inducido disminuyendo la
concentración de doxiciclina. Las células transfectadas fueron
incubadas después con zeocina para someter a ensayo la capacidad de
los elementos STAR para proteger la unidad de expresión
SV40-Zeo de la represión debida a la unión a
LexA-HP1.
En este experimento STAR10 y STAR27 confieren
una buena protección frente al silenciamiento génico, como se
esperaba (Fig. 9). Esto se manifiesta por un fuerte crecimiento en
presencia de zeocina.
De los 3 sub-fragmentos de
STAR10, 10A (\sim400 pares de bases) confiere a las células
transfectadas un crecimiento vigoroso en presencia de zeocina, que
excede el del elemento STAR completo. Las células transfectadas con
los constructos pSelect que contenían los otros 2
sub-fragmentos no crecen en presencia de zeocina.
Estos resultados identifican el fragmento 10A de \sim400 pares de
bases que abarca la secuencia de ADN responsable de la actividad
anti-represión de STAR10. STAR 27 confiere un
crecimiento moderado en zeocina a las células transfectadas en este
experimento (Fig. 9). Uno de los sub-fragmentos de
este STAR, 27B (\sim500 pares de bases), permite un crecimiento
débil de las células huésped en el medio que contiene zeocina. Esto
sugiere que la actividad anti-represión de este
STAR está parcialmente localizada en el
sub-fragmento 27B, pero la actividad completa
requiere también las secuencias 27A y/o 27C (cada una de \sim 500
pares de bases).
Los elementos STAR funcionan en diversas cepas
de células de mamífero cultivadas. La elección de la línea de
células huésped para la expresión de la proteína heteróloga es un
parámetro crítico para la cualidad, el rendimiento, y el coste por
unidad de la proteína. Consideraciones tales como las modificaciones
post-traduccionales, la capacidad de la ruta
secretora, y la inmortalidad de la línea celular dictan la línea
celular apropiada para un sistema de producción biofarmacéutico
concreto. Por esta razón, las ventajas proporcionadas por los
elementos STAR en términos de rendimiento, pronosticabilidad, y
estabilidad deben ser obtenibles en diversas líneas celulares. Esto
fue sometido a ensayo comparando la función de STAR6 en la línea
celular U-2 OS humana en la cual éste había sido
clonado originalmente, y en la línea celular CHO que es ampliamente
aplicada en biotecnología.
Se refieren los experimentos del ejemplo 11.
La expresión del gen informador SEAP en células
CHO es presentada en la Fig. 7; la expresión del gen informador de
luciferasa en las células U-2 OS se presenta en la
Fig. 8. Por medio de la comparación de los resultados de estos dos
experimentos, es evidente que el elemento STAR6 es funcional en
ambas línea celulares: la expresión del gen informador era más
predecible en ambas, y los clones de cada línea celular presentaban
rendimientos más altos, cuando el gen informador era protegido de
los efectos de la posición por STAR6. Estas dos líneas celulares
derivan de diferentes especies (humano y hámster) y diferentes tipos
de tejidos (hueso y ovario), reflejando la amplia gama de huéspedes
en la cual puede ser utilizado este elemento STAR para la mejora de
la expresión de proteínas heterólogas.
Los elementos STAR funcionan en el contexto de
diversos promotores transcripcionales. La transcripción del
transgen se realiza colocando el marco de lectura abierto del
transgen bajo el control de un promotor exógeno. La elección del
promotor está influenciada por la naturaleza de la proteína
heteróloga y el sistema de producción. En la mayoría de los casos,
se prefieren los promotores constitutivos fuertes debido a que
pueden proporcionar elevados rendimientos. Algunos promotores
virales tienen estas propiedades; promotor/intensificador del gen
temprano inmediato de citomegalovirus ("promotor de CMV") se
considera generalmente como el promotor más fuerte en uso
biotecnológico común (Boshart et al., 1985, Doll et
al., 1996, Foecking & Hofstetter, 1986). El promotor del
virus de simios SV40 también es moderadamente fuerte (Boshart et
al., 1985, Foecking & Hofstetter, 1986) y es utilizado
frecuentemente para la expresión ectópica en vectores de células de
mamífero. El promotor Tet-Off es inducible: el
promotor es reprimido en presencia de tetraciclina o antibióticos
relacionados (comúnmente se utiliza doxiciclina) en líneas
celulares que expresan el plásmido tTA (Clontech
K1620-A), y la eliminación del antibiótico produce
una inducción transcripcional (Deuschle et al., 1995, Gossen
& Bujard, 1992, Izumi & Gilbert, 1999, Umana et al.,
1999).
La construcción de los vectores
pSDH-Tet y pSDH-CMV se describe en
el Ejemplo 11. pSDH-SV40 fue construido mediante
amplificación por PCR del promotor SV40 (cebadores D41 y D42) del
plásmido pSelect-SV40-Zeo (Ejemplo
1), seguido de digestión del producto de la PCR con SacII y SalI. El
vector pSDH-CMV fue digerido con SacII y SalI para
separar el promotor de CMV, y el vector y el fragmento de SV40
fueron ligados entre sí para crear pSDH-SV40. STAR6
fue clonado en MCSI y MCSII como se describe en el Ejemplo 11. Los
plásmidos pSDH-Tet,
pSDH-Tet-STAR6,
pSDH-Tet-STAR7,
pSDH-SV40 y
pSDH-SV40-STAR6 fueron
co-transfectados con pBabe-Puro en
U-2 OS utilizando SuperFect como describe el
fabricante. El cultivo celular, la selección con puromicina, y los
análisis con luciferasa se llevaron a cabo como se describe en el
Ejemplo 11.
Las Figs. 8, 10, y 11 comparan la expresión del
gen informador luciferasa de 3 promotores diferentes: dos
promotores virales fuertes y constitutivos (CMV y SV40), y el
promotor Tet-Off inducible. Los tres promotores
fueron sometidos a ensayo en el contexto del elemento STAR6 en
células U-2 OS. Los resultados demuestran que el
rendimiento y la pronosticabilidad de los 3 promotores aumentaban
con STAR6.
Como se describe en los Ejemplo 11 y 14, STAR6
es beneficioso en el contexto del promotor CMV (Fig. 8). Se
observan mejoras similares en el contexto del promotor de SV40 (Fig.
10): el rendimiento del clon STAR6 más altamente expresado es
2-3 veces mayor que el mejor de los clones
pSDH-SV40, y los clones STAR6 (20% de la población)
tienen rendimientos más altos que el mejor de los clones STAR
negativos. En el contexto del promotor Tet-Off a
concentraciones inductoras (poca doxiciclina), STAR6 también mejora
el rendimiento y la pronosticabilidad de la expresión del transgen
(Fig. 11): el clon STAR6 más altamente expresado tiene un
rendimiento 20 veces superior que el mejor clon
pSDH-tet, y los 9 clones STAR6 (35% de la población)
tienen rendimientos más altos que el mejor clon STAR negativo. Se
concluye que este elemento STAR es versátil en sus propiedades
protectoras del transgen, puesto que funciona en el contexto de
diversos promotores de la transcripción biotecnológicamente
útiles.
Si bien las secuencias de ácido nucleico cortas
pueden ser simétricas (v.g. palindrómicas), las secuencias de
origen natural más largas son típicamente asimétricas. Como
resultado, el contenido de información de las secuencias de ácido
nucleico es direccional, y las propias secuencias pueden ser
descritas con respecto a sus extremos 5' y 3'. La direccionalidad
de la información de la secuencia de ácido nucleico afecta a la
disposición en la cual son ensambladas las moléculas de ADN
recombinante utilizando mecanismos de clonación normalizados
conocidos en la técnica (Sambrook et al., 1989). Los
elementos STAR son secuencias de ADN largas, asimétricas, y tienen
una direccionalidad basada en la orientación en la cual son clonadas
originalmente en el vector pSelect. En los ejemplos dados antes,
utilizando dos elementos STAR en vectores pSDH, esta direccionalidad
es preservada. Esta orientación es descrita como la orientación
natural o 5'-3', relativa al gen de resistencia a la
zeocina (ver la Fig. 12). En este ejemplo se somete a ensayo la
importancia de la direccionalidad para la función STAR en el vector
pSDH-Tet. Puesto que los genes informadores de los
vectores pSDH están flanqueados en ambos lados por copias del
elemento STAR de interés, la orientación de cada copia STAR debe ser
considerada. En este ejemplo se compara la orientación natural con
la orientación contraria (Fig. 12).
El elemento STAR6 fue clonado en
pSDH-Tet como se describe en el Ejemplo 11. Las
células U-2 OS fueron
co-transfectadas con los plásmidos
pSDH-Tet-STAR,66-natural
y
pSDH-Tet-STAR66-contrario,
y cultivadas como se describe en el Ejemplo 11. Los clones
individuales fueron aislados y cultivados; el nivel de expresión de
luciferasa fue determinado como se ha descrito (supra).
Los resultados de la comparación de la actividad
STAR66 en la orientación natural y la orientación contraria se
muestran en la Fig. 13. Cuando STAR66 está en la orientación
contraria, el rendimiento de un solo clon es razonablemente elevado
(60 unidades luciferasa). En contraste, el rendimiento del clon de
expresión más elevada cuando STAR66 está en la orientación natural
es considerablemente mayor (100 unidades luciferasa), y la
pronosticabilidad también es mucho mayor: 7 clones de la población
de orientación natural (30%) expresan la luciferasa por encima del
nivel del clon de expresión más elevada de la población de
orientación contraria, y 15 de los clones de la población de
orientación natural (60%) expresan la luciferasa por encima de
aproximadamente 10 unidades luciferasa relativas. Por lo tanto se
demuestra que la función STAR66 es direccional.
Las unidades de expresión del transgen para la
expresión de la proteína heteróloga son integradas generalmente en
el genoma de la célula huésped para asegurar la retención estable
durante la división celular. La integración puede producir una o
múltiples copias de la unidad de expresión que esté siendo insertada
en el genoma; las copias múltiples pueden estar presentes o no en
forma de disposiciones en tándem. El rendimiento incrementado
demostrado para los transgenes protegidos por elementos STAR
(supra) sugiere que los elementos STAR son capaces de
permitir que las unidades de expresión del transgen funcionen
independientemente de las influencias sobre la transcripción
asociadas con el sitio de integración en el genoma (independencia de
los efectos de la posición (Boivin & Dura, 1998)). Esto sugiere
adicionalmente que los elementos STAR permiten que cada unidad de
expresión funcione independientemente de las copias vecinas de la
unidad de expresión cuando están integradas en forma de una
ordenación en tándem (independencia del silenciamiento del gen
inducido por la repetición (Garrick et al., 1998)). La
dependencia del número de copias se determina a partir de la
relación entre los niveles de expresión del transgen y el número de
copias, como se describe más abajo en el ejemplo.
Las células U-2 OS fueron
co-transfectadas con
pSDH-Tet-STAR10 y cultivadas bajo
selección con puromicina como se ha descrito (supra). Ocho
clones individuales fueron aislados y cultivados adicionalmente.
Después las células fueron cosechadas, y una porción fue analizada
en cuanto a la actividad luciferasa como se ha descrito
(supra). Las células restantes fueron sometidas a lisis y el
ADN genómico fue purificado utilizando el DNeasy Tissue Kit (QIAGEN
69504) como describe el fabricante. Las muestras de ADN fueron
cuantificadas mediante espectrometría de UV. Tres microgramos de
cada muestra de ADN genómico fueron digeridos con PvuII y XhoI
durante la noche como describe el fabricante (New England Biolabs),
y resueltos mediante electroforesis en gel de agarosa. Los
fragmentos de ADN fueron transferidos a una membrana de nailon como
se ha descrito (Sambrook et al., 1989), e hibridados con una
sonda marcada radiactivamente al gen de la luciferasa (aislado de
pSDH-Tet digerido con BamHI/SacII). La transferencia
fue lavada como se ha descrito (Sambrook et al., 1989) y
expuesta a una pantalla de formadora de imágenes con fósforo
(Personal F/X, BioRad). El autorradiograma resultante (Fig. 14) fue
analizado mediante densitometría para determinar la fuerza relativa
de las bandas de ADN de luciferasa, que representa el número de
copias del transgen.
Las actividades de la enzima y los números de
copias (intensidades de las bandas de ADN) de la luciferasa en los
clones de la población de clones pSDH-STAR10 se
muestran en la Fig. 15. El número de copias del transgen está
altamente correlacionado con el nivel de expresión de luciferasa en
estos clones pSDH-STAR10 (r = 0,86). Esto sugiere
que STAR10 confiere una dependencia del número de copias de las
unidades de expresión del transgen, haciendo la expresión del
transgen independiente de otras copias del transgen en disposiciones
en tándem, e independiente de las influencias del silenciamiento
del gen en el sitio de integración.
Los promotores génicos están sujetos tanto a
influencias positivas como negativas sobre su capacidad para
iniciar la transcripción. Una clase importante de elementos que
ejercen influencias positivas son los intensificadores. Los
intensificadores son característicamente capaces de afectar a los
promotores incluso cuando están localizados lejos (muchos kilopares
de bases) del promotor. Las influencias negativas que actúan
mediante la formación de heterocromatina (v.g. proteínas del grupo
Polycomb) han sido descritas antes, y estas son la diana de la
actividad STAR. La base bioquímica para la función intensificadora y
para la formación de heterocromatina es fundamentalmente similar,
ya que ambas implican la unión de proteínas al ADN. Por lo tanto es
importante determinar si los elementos STAR son capaces de bloquear
las influencias positivas así como las influencias negativas, en
otras palabras, proteger los transgenes de los intensificadores
genómicos en la vecindad del sitio de integración. La capacidad
para proteger los transgenes de la actividad intensificadora asegura
un funcionamiento estable y predecible de los transgenes en las
aplicaciones biotecnoló-
gicas. Este ejemplo examina el funcionamiento de los elementos STAR en un análisis de bloqueo del intensificador.
gicas. Este ejemplo examina el funcionamiento de los elementos STAR en un análisis de bloqueo del intensificador.
Otro rasgo de la actividad STAR que es
importante para su función es el aumento de rendimiento que
confieren a los transgenes (Ejemplo 11). Los STAR son aislados
basándose en su capacidad para mantener elevados niveles de
expresión de zeocina cuando las proteínas formadoras de
heterocromatina se unen adyacentes a los elementos STAR candidato.
Se pronostica que se producirá una elevada expresión debido a que se
prevé que los STAR bloquearán la diseminación de la heterocromatina
en la unidad de expresión de zeocina. No obstante, un segundo
escenario es que los fragmentos de ADN de los clones resistentes a
zeocina contienen intensificadores. Se ha demostrado que los
intensificadores tienen la capacidad de superar los efectos
represivos de las proteínas del grupo Polycomb tales como las
utilizadas en el método del rastreo con STAR (Zink & Paro,
1995). Los intensificadores aislados mediante este fenómeno serían
considerados falsos positivos, puesto que los intensificadores no
tienen las propiedades reivindicadas aquí para los STAR. Con el fin
de demostrar que los elementos STAR no son intensificadores, estos
han sido sometidos a ensayo en un análisis de intensificador.
El análisis de bloqueo del intensificador y el
análisis de intensificador son metodológicamente y conceptualmente
similares. Los análisis se muestran esquemáticamente en la Fig. 16.
La capacidad de los elementos STAR para bloquear los
intensificadores se realiza utilizando el sistema intensificador
E47/caja E. La proteína E47 es capaz de activar la transcripción
por medio de promotores cuando se une a una secuencia de ADN de la
caja E localizada en la vecindad de esos promotores (Quong et
al., 2002). E47 está implicada normalmente en la regulación de
la diferenciación de linfocitos B y T (Quong et al., 2002),
pero es capaz de funcionar en diversos tipos celulares cuando es
expresada ectópicamente (Petersson et al., 2002). La caja E
es una secuencia de ADN palindrómica, CANNTG (Knofler et
al., 2002). En el análisis de bloqueo del intensificador, se
coloca una caja E aguas arriba del gen informador de la luciferasa
(incluyendo un promotor mínimo) en un vector de expresión. Se
coloca un sitio de clonación para los elementos STAR entre la caja E
y el promotor. La proteína E47 es codificada en un segundo
plásmido. El análisis se realiza transfectando tanto el plásmido E47
como el vector de expresión de la luciferasa en las células; la
proteína E47 es expresada y se une a la caja E, y el complejo
E47/caja E es capaz de actuar como intensificador. Cuando el vector
de expresión de la luciferasa no contiene un elemento STAR, el
complejo E47/caja E intensifica la expresión de la luciferasa (Fig.
16A, situación 1). Cuando los elementos STAR son insertados entre
la caja E y el promotor, su capacidad para bloquear el
intensificador es demostrada mediante la expresión reducida de la
actividad luciferasa (Fig. 16A, situación 2); si los STAR no pueden
bloquear los intensificadores, la expresión de la luciferasa es
activada (Fig 16A, situación 3).
La capacidad de los elementos STAR para actuar
como intensificadores utiliza el mismo vector de expresión de la
luciferasa. En ausencia de E47, la propia caja E no afecta a la
transcripción. Al contrario, el comportamiento intensificador de
los elementos STAR dará como resultado la activación de la
trascripción de la luciferasa. El análisis es realizado
transfectando el vector de expresión de la luciferasa sin el
plásmido E47. Cuando el vector de expresión no contiene elementos
STAR, la expresión de la luciferasa es baja (Fig. 16B, situación
1). Si los elementos STAR no tienen propiedades intensificadoras, la
expresión de la luciferasa es baja cuando un elemento STAR está
presente en el vector (Fig. 16B, situación 2). Si los elementos STAR
tienen propiedades intensificadoras, la expresión de la luciferasa
será activada en los vectores que contienen STAR (Fig. 16B,
situación 3).
El vector de expresión de la luciferasa fue
construido insertando la caja E y un promotor mínimo de la fosfatasa
alcalina humana a partir del plásmido
mu-E5+E2x6-cat(x) (Ruezinsky
et al., 1991) aguas arriba del gen de la luciferasa en el
plásmido pGL3-básico (Promega E1751), para crear
pGL3-caja-E-luciferasa
(donación de W. Romanow). El plásmido de expresión de E47 contiene
el marco de lectura abierto de E47 bajo el control de un promotor
de la beta-actina en el plásmido
pHBAPr-1-neo; E47 es expresado
constitutivamente a partir de este plásmido (donación de W.
Romanow). Los elementos STAR 1, 2, 3, 6, 10, 11, 18, y 27 han sido
clonados en el vector de expresión de la luciferasa. Los clones que
contenían el elemento scs de Drosophila y el núcleo
HS4-6x de la beta-globina de pollo
("HS4") han sido incluidos como controles positivos (se sabe
que bloquean los intensificadores, y no tienen propiedades
intensificadoras intrínsecas (Chung et al., 1993, Kellum
& Schedl, 1992)), y el vector de expresión de luciferasa vacío
ha sido incluido como control negativo. Todos los análisis fueron
realizados utilizando la línea celular U-2 OS. En
el análisis de bloqueo del intensificador, el plásmido E47 fue
co-transfectado con los vectores de expresión de la
luciferasa (vector vacío, o conteniendo elementos STAR o de control
positivo). En el análisis del intensificador, el plásmido E47 fue
co-transfectado con el vector de expresión de la
luciferasa sin STAR como control positivo para la actividad
intensificadora; todas las demás muestras recibieron un supuesto
plásmido durante la co-transfección. Las células
transfectadas transitoriamente fueron analizadas en cuanto a la
actividad de la luciferasa 48 horas después de la transfección del
plásmido (supra). La actividad de la luciferasa expresada a
partir del plásmido que no contenía los elementos de la caja E o
STAR/control fueron sustraídos, y las actividades de la luciferasa
fueron normalizadas para el contenido de proteína como se ha
descrito (supra).
La Fig. 17 muestra los resultados del análisis
de bloqueo de intensificador. En ausencia de elementos STAR (o de
los elementos scs y HS4 de bloqueo del intensificador conocido), el
complejo intensificador E47/caja E activa la expresión de la
luciferasa ("vector"); este nivel de expresión intensificado ha
sido normalizado a 100. La actividad intensificadora es bloqueada
por todos los elementos STAR sometidos a ensayo. La actividad
intensificadora es bloqueada también por los elementos HS4 y scs,
como se esperaba (Bell et al., 2001, Gerasimova &
Corces, 2001). Estos resultados demuestran que además de su
capacidad para bloquear la diseminación del silenciamiento
transcripcional (influencias negativas), los elementos STAR son
capaces de bloquear la acción de los intensificadores (influencias
positivas).
La Fig. 18 muestra los resultados del análisis
de intensificador. El nivel de expresión de luciferasa debido a la
intensificación por el complejo E47/caja-E se ajusta
a 100 ("E47"). En comparación, ninguno de los elementos STAR
ocasiona una activación significativa de la expresión de la
luciferasa. Como se esperaba, los elementos scs y HS4 tampoco
ocasionan la activación del gen informador. Por lo tanto se concluye
que al menos los elementos STAR sometidos a ensayo no poseen
propiedades intensificadoras.
El análisis BLAT de la secuencia de ADN STAR
frente a la base de datos del genoma humano
(http://genome.ucsc.
edu/cgi-bin/hgGateway) revela que algunas de estas secuencias tienen una elevada conservación de la secuencias con otras regiones del genoma humano. Estas regiones duplicadas son elementos STAR candidatos; si muestran actividad STAR, serían considerados parálogos de los STAR clonados (se dice que dos genes o elementos genéticos son parálogos si derivan de un evento de duplicación (Li, 1997)). El análisis BLAST de los STAR humanos frente al genoma de ratón (http://www.ensembl.org/Mus_musculus/blastview) también revela regiones de elevada conservación de la secuencia entre ratón y humano. Esta conservación de la secuencia ha sido demostrada para fragmentos de 15 de los 65 elementos STAR humanos. La conservación oscila entre el 64% y el 89%, sobre longitudes de 141 pares de bases a 909 pares de bases (Tabla 8). Estos grados de conservación de la secuencia son notables y sugieren que estas secuencias de ADN pueden conferir actividad STAR también dentro del genoma de ratón. Algunas de las secuencias de los genomas de ratón y humano de la Tabla 8 podrían ser definidas estrictamente como ortólogos (se dice que dos genes o elementos genéticos son ortólogos si derivan de un evento de especiación (Li, 1997)). Por ejemplo, STAR6 está entre los genes SLC8A1 y HAAO en los genomas tanto humano como de ratón. En otros casos, un STAR humano clonado tiene un parálogo dentro del genoma humano, y su ortólogo ha sido identificado en el genoma de ratón. Por ejemplo, STAR3a es un fragmento de la región 15q11.2 del cromosoma humano 15. Esta región es idéntica en un 96,9% (paráloga) con un fragmento de ADN en 5q33.3 del cromosoma humano 5, que está cerca del gen de la interleuquina IL12B. Estos ADN humanos comparten aproximadamente una identidad del 80% con un fragmento de la región 11B2 del cromosoma de ratón 11. El fragmento 11B2 también está cerca del gen de la interleuquina IL112B (de ratón). Por lo tanto STAR3a y el fragmento 11B2 de ratón pueden ser definidos estrictamente como parálogos.
edu/cgi-bin/hgGateway) revela que algunas de estas secuencias tienen una elevada conservación de la secuencias con otras regiones del genoma humano. Estas regiones duplicadas son elementos STAR candidatos; si muestran actividad STAR, serían considerados parálogos de los STAR clonados (se dice que dos genes o elementos genéticos son parálogos si derivan de un evento de duplicación (Li, 1997)). El análisis BLAST de los STAR humanos frente al genoma de ratón (http://www.ensembl.org/Mus_musculus/blastview) también revela regiones de elevada conservación de la secuencia entre ratón y humano. Esta conservación de la secuencia ha sido demostrada para fragmentos de 15 de los 65 elementos STAR humanos. La conservación oscila entre el 64% y el 89%, sobre longitudes de 141 pares de bases a 909 pares de bases (Tabla 8). Estos grados de conservación de la secuencia son notables y sugieren que estas secuencias de ADN pueden conferir actividad STAR también dentro del genoma de ratón. Algunas de las secuencias de los genomas de ratón y humano de la Tabla 8 podrían ser definidas estrictamente como ortólogos (se dice que dos genes o elementos genéticos son ortólogos si derivan de un evento de especiación (Li, 1997)). Por ejemplo, STAR6 está entre los genes SLC8A1 y HAAO en los genomas tanto humano como de ratón. En otros casos, un STAR humano clonado tiene un parálogo dentro del genoma humano, y su ortólogo ha sido identificado en el genoma de ratón. Por ejemplo, STAR3a es un fragmento de la región 15q11.2 del cromosoma humano 15. Esta región es idéntica en un 96,9% (paráloga) con un fragmento de ADN en 5q33.3 del cromosoma humano 5, que está cerca del gen de la interleuquina IL12B. Estos ADN humanos comparten aproximadamente una identidad del 80% con un fragmento de la región 11B2 del cromosoma de ratón 11. El fragmento 11B2 también está cerca del gen de la interleuquina IL112B (de ratón). Por lo tanto STAR3a y el fragmento 11B2 de ratón pueden ser definidos estrictamente como parálogos.
Con el fin de someter a ensayo la hipótesis de
que la actividad STAR es compartida entre regiones de elevada
conservación de la secuencia en el genoma de ratón y humano, uno de
los STAR humanos con una secuencia conservada en el ratón, STAR18,
ha sido analizada con mayor detalle. La conservación de la secuencia
en el genoma de ratón detectada con el clon STAR18 original se
extiende hacia la izquierda del cromosoma 2 humano durante
aproximadamente 500 pares de bases (la Fig. 19; izquierda y derecha
hacen referencia a la descripción normalizada de los brazos del
cromosoma 2). En este ejemplo los autores de la presente invención
examinan si la región de conservación de la secuencia define un
elemento STAR de "origen natural" en humanos que es más extensa
en longitud que el clon original. Los autores de la presente
invención también examinan si la función STAR de este elemento STAR
está conservada entre ratón y humano.
La región de conservación de la secuencia de
ratón/humano en torno a STAR 18 fue recuperada del clon BAC humano
RP11-387A1 mediante amplificación por PCR, en tres
fragmentos: la región completa (cebadores E93 y E94), la mitad
izquierda (cebadores E93 y E92), y la mitad derecha (cebadores E57 y
E94). Los correspondientes fragmentos de la región de ratón
homóloga fueron recuperados del clon BAC RP23-400H17
de la misma manera (cebadores E95 y E98, E95 y E96, y E97 y E98,
respectivamente). Todos los fragmentos fueron clonados en el vector
pSelect y transfectados en una línea celular U-2
OS/Tet-Off/LexA-HP1 (supra).
Tras la transfección, se llevó a cabo la selección con higromicina
para seleccionar las células transfectadas. La proteína
LexA-HP1 fue inducida disminuyendo la concentración
de doxiciclina, y la capacidad de las células transfectadas para
resistir al antibiótico zeocina (una medida de la actividad STAR)
fue evaluada controlando el crecimiento celular.
El clon STAR18 original fue aislado de ADN
humano digerido con Sau3AI ligado en el vector pSelect basándose en
su capacidad para prevenir el silenciamiento de un gen resistente a
la zeocina. El alineamiento del clon STAR18 humano (497 pares de
bases) con el genoma de ratón reveló una elevada similitud de
secuencia (72%) entre las regiones STAR18 de humano y de ratón
ortólogas. También dejaba patente una elevada similitud (73%) en la
región que se prolongaba durante 488 pares de bases inmediatamente
hacia la izquierda del sitio Sau3AI que define el extremo izquierdo
de la región clonada (Fig. 19). Fuera de estas regiones la similitud
de secuencia entre el ADN humano y de ratón cae por debajo del
60%.
Como se indica en la Fig. 19, los elementos
STAR18 tanto humanos como de ratón confieren supervivencia en
zeocina a las células huésped que expresan la proteína represora
lexA-HP1. El clon STAR18 de 497 pares de bases y su
ortólogo de ratón confieren ambos capacidad de crecimiento (Fig. 19,
a y d). Las regiones de 488 pares de bases adyacentes de elevada
similitud de ambos genomas también confieren capacidad para crecer,
y de hecho su fenotipo de crecimiento es más vigoroso que el del
clon STAR18 original (Fig 19, b y e). Cuando la región completa de
similitud de secuencia era sometida a ensayo, estos ADN tanto de
ratón como de humano confieren crecimiento, y el fenotipo de
crecimiento es más vigoroso que los dos
sub-fragmentos (Fig. 19, c y f). Estos resultados
demuestran que la actividad STAR de STAR18 humano es conservada en
su ortólogo de ratón. La elevada conservación de la secuencia entre
estas regiones ortólogas es particularmente notable debido a que no
son secuencias codificadoras de proteínas, conduciendo a la
conclusión de que tienen alguna función reguladora que ha evitado
su divergencia evolutiva por medio de mutaciones.
Este análisis demuestra que los elementos STAR
clonados identificados mediante el programa de rastreo original
pueden representar en algunos casos elementos STAR parciales, y que
el análisis del ADN genómico en el cual están embebidos puede
identificar secuencias con una actividad STAR más fuerte.
Utilizando el rastreo genético descrito en la
solicitud de patente original, se aislaron inicialmente sesenta y
seis (66) elementos STAR a partir de ADN genómico humano y se
caracterizaron con detalle (Tabla 6). El rastreo se realizó sobre
genotecas génicas construidas mediante digestión con Sau3AI de ADN
genómico humano, ya sea purificado de placenta (Clontech
6550-1) o llevado a cabo en cromosomas artificiales
bacteriano/P1 (BAC/PAC). Los clones BAC/PAC contienen ADN genómico
de regiones del cromosoma 1 (clones RP1154H19 y RP3328E19), de la
agrupación HOX de genes homeóticos (clones RP1167F23, RP1170019, y
RP11387A1), o del cromosoma humano 22 (Research Genetics
96010-22). Los ADN fueron fraccionados por tamaño, y
la fracción de tamaño 0,5-2 kb fue ligada en el
vector pSelect digerido con BamHI, mediante mecanismos normalizados
(Sambrook et al., 1989). Los plásmidos pSelect que contenían
ADN genómico que confería resistencia a zeocina a bajas
concentraciones de doxiciclina fueron aislados y propagados en
Escherichia coli. Los rastreos que rendían los elementos STAR
de la Tabla 6 han analizado aproximadamente el 1-2%
del genoma humano.
Los insertos de ADN genómico humano en estos 66
plásmidos fueron secuenciados mediante el método didesoxi (Sanger
et al., 1977) utilizando un secuenciador de ADN automático
Beckman CEQ2000, empleando las instrucciones del fabricante.
Brevemente, el ADN fue purificado a partir de E. coli
utilizando QIAprep Spin Miniprep y Plasmid Midi Kits (QIAGEN 27106
y 12145, respectivamente). La secuenciación en ciclos se llevó a
cabo utilizando los oligonucleótidos de costumbre correspondientes
al vector pSelect (cebadores D89 y D95, Tabla 5), en presencia de
terminadores coloreados (CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit,
Beckman 608000). Las secuencias de ADN STAR ensambladas fueron
localizadas en el genoma humano (construcciones de bases de datos
Agosto y Diciembre 2001) utilizando BLAT (Basic Local Alignment
Tool (Kent, 2002); http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgGateway; Tabla
6). Además, las secuencias STAR combinadas comprenden 85,6 kilopares
de bases, con una longitud media de 1,3 kilopares de bases.
Fig. 1. La familia de plásmidos pSelect para la
selección y caracterización de elementos STAR. Un marcador de
resistencia (zeocina o puromicina) o un gen informador (GFP o
luciferasa) bajo el control del promotor de SV40 promiscuo es
adyacente a un sitio de clonación BamHI flanqueado por los sitios
AscI y HindIII. Aguas arriba del sitio de clonación están los
operadores lexA a los cuales se puede unir la proteína lexA. La
unión de las proteínas del grupo lexA-Polycomb
quiméricas a los operadores ocasiona la represión del gen marcador
o informador. Los fragmentos de ADN insertados en el sitio de
clonación que bloquean la represión son identificados mediante la
expresión persistente del gen marcador o informador. El plásmido
replica episómicamente en células de mamífero cultivadas debido a
la secuencia de oriP.
Fig. 2. La familia pSDH de plásmidos para
someter a ensayo los elementos STAR. Dos sitios de clonación
múltiple (MCSI y MCSII) flanquean un gen informador (GFP o
luciferasa) cuya expresión es conducida por un promotor aguas
arriba (CMV, Tet-off, o SV40). Los elementos STAR a
someter a ensayo son insertados en MCSI y MCSII. Estos contienen
sitios de restricción únicos (MCSI: XhoI, NotI, EcoRI, y SaII; MCSIL
HindIII, EcoRV, BglII, y NheI). El plásmido replica después de la
integración al azar en el genoma de células de mamífero.
Fig. 3. Proporción de clones que
sobre-expresan la luciferasa. Las células de
osteosarcoma humano U-2 OS fueron transfectadas
establemente con plásmidos pSDH (conteniendo el gen informador de la
luciferasa bajo el control del promotor tet-off), y
los clones transfectados individuales fueron aislados y cultivados.
La expresión de la luciferasa fue medida enzimáticamente. Se
determinó la expresión de luciferasa media por los clones que
contenían el pSDH sin STAR ("nivel de referencia"). Los clones
de los grupos de todos los plásmidos fueron puntuados como
"sobre-expresión" si su actividad luciferasa
era más de dos veces más alta que el nivel de referencia. Se traza
el porcentaje de clones con sobre-expresión en cada
grupo de plásmidos.
Fig. 4. Veces de sobre-expresión
por los clones con sobre-expresión. El intervalo de
sobre-expresión en los plásmidos pSDH que contienen
STAR integrado en el ADN genómico fue determinado dividiendo las
actividades de la luciferasa de cada clon por el nivel de
referencia. Para aquellos que presentaban una expresión
significativa (más de dos veces por encima del nivel de
referencia), se observaron incrementos en veces reales; los valores
mínimo y medio de estos datos se trazan para cada plásmido.
Fig. 5. Veces de sobre-expresión
por los clones con sobre-expresión. El intervalo de
sobre-expresión en los plásmidos pSDH que contienen
STAR integrado en el ADN genómico fue determinado dividiendo las
actividades de la luciferasa de cada clon por el nivel de
referencia. Para aquellos que presentaban una expresión
significativa (más de dos veces por encima del nivel de
referencia), se observaron incrementos en veces reales; los valores
máximos de estos datos se trazan para cada plásmido.
Fig 6. El plásmido pSDH-CSP
utilizado para someter a ensayo la actividad STAR. El gen informador
de la Fosfatasa Alcalina Secretada (SEAP) está bajo el control del
promotor CMV, y el marcador seleccionable de resistencia a la
puromicina (puro) está bajo el control del promotor de SV40.
Flanqueando estos dos genes se encuentran múltiples sitios de
clonación en los cuales los elementos STAR pueden ser clonados. El
plásmido también tiene un origen de replicación (ori) y un gen de
resistencia a ampicilina (ampR) para la propagación en
Escherichia
coli.
coli.
Fig. 7. STAR6 y STAR49 mejoran la
pronosticabilidad y el rendimiento de la expresión del transgen. Se
determinó la expresión de SEAP a partir del promotor CMV por las
células CHO transfectadas con pSDH-CSP,
pSDH-CSP-STAR6, o
pSDH-CSP-STAR,49. Los constructos
que contienen STAR confieren mayor pronosticabilidad y un elevado
rendimiento en relación con el constructo pSDH-CSP
solo.
Fig 8. STAR6 y STAR8 mejoran la
pronosticabilidad y el rendimiento de la expresión del transgen. Se
determinó la expresión de luciferasa a partir del promotor de CMV
por las células U-2 OS transfectadas con
pSDH-CMV,
pSDH-CMV-STAR6, o
pSDH-CMV-STAR8. Los constructos que
contienen STAR confieren mayor pronosticabilidad y un elevado
rendimiento en relación con el constructo pSDH-CMV
solo.
Fig 9. Secuencias esenciales mínimas de STAR10 y
STAR27. Las porciones de los elementos STAR fueron amplificadas
mediante PCR: STAR10 fue amplificado con los cebadores E23 y E12
para rendir el fragmento 10A, E13 y E14 para rendir el fragmento
10B, y E15 y E16 para rendir el fragmento 10C. STAR27 fue
amplificado con los cebadores E17 y E18 para rendir el fragmento
27A, E19 y E20 para rendir el fragmento 27B, y E21 y E22 para rendir
el fragmento 27C. Estos sub-fragmentos fueron
clonados en el vector pSelect. Tras la transfección en células
U-2
OS/Tet-Off/LexA-HP1, se verificó el
crecimiento de los cultivos en presencia de zeocina. Las tasas de
crecimiento variaban de vigoroso (+++) a escaso (+/-), mientras
algunos cultivos no lograban sobrevivir al tratamiento con zeocina
(-) debido a la ausencia de actividad STAR en el fragmento de ADN
sometido a ensayo.
Fig 10. Función del elemento STAR en el contexto
del promotor SV40. pSDH-SV40 y
pSDH-SV40-STAR6 fueron transfectados
en la línea celular de osteosarcoma humano U-2 OS,
y la expresión de la luciferasa fue analizada con o sin protección
del silenciamiento del gen por STAR6 en clones resistentes a la
puromicina.
Fig 11. Función del elemento STAR en el contexto
del promotor Tet-Off. pSDH-Tet y
pSDH-Tet-STAR6 fueron transfectados
en la línea celular de osteosarcoma humano U-2 OS, y
la expresión de la luciferasa fue analizada con o sin protección
del silenciamiento del gen por STAR6 en clones resistentes a la
puromicina.
Fig 12. Diagrama esquemático de la orientación
de elementos STAR a medida que son clonados en el vector pSelect
(panel A), a medida que son clonados en vectores pSDH para conservar
su orientación natural (panel B), y a medida que son clonados en el
vector pSDH en la orientación contraria (panel C).
Fig 13. Direccionalidad de la función STAR66. El
elemento STAR66 fue clonado en pSDH-Tet en
orientación natural (STAR66 natural) o en orientación contraria
(STAR66 contraria), y transfectado en células U-2
OS. La actividad de la luciferasa fue analizada en clones
resistentes a la puromicina.
Fig 14. Dependencia del número de copias de la
función STAR. Transferencia Southern de unidades de expresión de la
luciferasa en pSDH-Tet-STAR10,
integrado en ADN genómico de U-2 OS. La sonda de ADN
de luciferasa radiactiva para detectar la cantidad de ADN de
transgen en el genoma de cada clon, que después fue cuantificado con
un aparato para la formación de imágenes con fósforo.
Fig 15. Dependencia del número de copias de la
función STAR. Se determinó el número de copias de unidades de
expresión pSDH-Tet-STAR10 en cada
clon mediante formación de imágenes con fósforo, y se comparó con la
actividad de la enzima informadora luciferasa expresada por cada
clon.
Fig 16. Análisis de bloqueo del intensificador e
intensificador. Los vectores de expresión de luciferasa utilizados
para someter a ensayo los STAR en cuanto a la actividad de bloqueo
del intensificador y del intensificador se muestran
esquemáticamente. El sitio de unión a la caja-E para
la proteína intensificadora E47 está aguas arriba de un sitio de
clonación para los elementos STAR. Aguas abajo del sitio de
clonación STAR está el gen de la luciferasa bajo el control de un
promotor mínimo de la fosfatasa alcalina humana (mp). Los
histogramas indican los resultados esperados para las tres posibles
situaciones experimentales (ver el texto).
Panel A: Análisis de bloqueo del
intensificador.
Panel B: Análisis del intensificador.
Fig 17. Análisis de bloqueo del intensificador.
La expresión de la luciferasa de un promotor mínimo es activada por
el intensificador E47/caja-E en el vector vacío
(vector). La inserción de los bloqueadores del intensificador (scs,
HS4) o de los elementos STAR (elementos STAR 1, 2, 3, 6, 10, 11, 18,
y 27) bloquean la activación de la luciferasa por el intensificador
E47/caja-E.
\newpage
Fig 18. Análisis de intensificador. La expresión
de la luciferasa de un promotor mínimo es activada por el
intensificador E47/caja-E en el vector vacío (E47).
La inserción de los elementos scs y HS4 o diversos elementos STAR
(STAR 1, 2, 3, 6, 10, 11, 18, y 27) no activan las transcripción del
gen informador.
Fig 19. Conservación de la secuencia de STAR18
entre ratón y humano. La región del genoma humano que contiene
STAR18 de 497 pares de bases (recuadros negros); el elemento existe
entre los genes del homeodominio HOXD8 y HOXD4 del cromosoma humano
2. Está alineado con una región en el cromosoma de ratón 2 que
comparte una identidad de secuencia del 72%. La región del
cromosoma 2 humano inmediatamente a la izquierda de STAR18 está
altamente conservada con el cromosoma 2 de ratón (identidad del
73%, recuadros grises); más allá de esta región, la identidad cae
por debajo del 60%. Se indica la capacidad de estas regiones de
humano y de ratón, ya sea por separado o combinadas, para conferir
crecimiento en zeocina: -, sin crecimiento; +, crecimiento moderado;
++, crecimiento vigoroso; +++, crecimiento rápido.
Fig. 20. Secuencias que comprenden
STAR1-STAR65 (SEQ ID:1-65)
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La expresión del gen informador luciferasa es
medida en líneas celulares que contienen plásmidos pSDH integrados,
sin elementos STAR ("vacío", control negativo) o conteniéndolos
(incluyendo el elemento control positivo, SCS de
Drosophila). El nivel medio de expresión del control negativo
se define como el nivel de referencia, y los clones son
considerados con sobre-expresión si su nivel de
expresión es >2 veces superior al nivel de referencia. Se
informa sobre el porcentaje de clones con
sobre-expresión para cada plásmido y el número de
veces de sobre-expresión, junto con el número de
clones analizados para cada plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1} \begin{minipage}[t]{145mm} La localización cromosómica es determinada mediante una búsqueda BLAST de los datos de la secuencia de ADN de los clones STAR frente a la base de datos del genoma humano. La localización se proporciona de acuerdo con la nomenclatura normalizada que se refiere al ideograma citogenético de cada cromosoma; por ejemplo 1p2.3 es la tercera sub-banda citogenética de la segunda banda citogenética del brazo corto del cromosoma 1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/MLACourse/Genetics/ chrombanding.html). F. Resultado de la reacción de secuenciación directa; R, resultado de la reacción de secuenciación inversa. N.d. no determinado todavía.\end{minipage} | |
^{2} \begin{minipage}[t]{145mm} Basado en Human Genoma Map View Build 22 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/Entrez/hum\_srch? chr=hum\_chr.inf\amp{1}query April 2001). L, izquierdo; R, derecho.\end{minipage} | |
^{*} Posición ambigua, diversos aciertos |
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Un método para seleccionar una secuencia de
ADN capaz al menos en parte de contrarrestar la formación de
cromatina represora de la transcripción génica, que comprende
proporcionar un sistema de transcripción que comprende células
huésped con una variedad de vectores que comprenden fragmentos,
comprendiendo dichos vectores fragmentos de ADN genómico humano,
comprendiendo dichos vectores adicionalmente i) un elemento con una
cualidad represora de la transcripción génica que da como resultado
la cromatina represora de la transcripción génica, y ii) un
promotor que dirige la transcripción de un gen de resistencia a la
zeocina, la transcripción de cuyo gen de resistencia a la zeocina
es reprimida por la cualidad represora de la transcripción génica,
comprendiendo el método adicionalmente realizar una etapa de
selección en dicho sistema de transcripción cultivando las células
huésped bajo selección con zeocina a una concentración y con una
duración a la cual los cultivos de control son eliminados por la
zeocina con el fin de identificar las células huésped supervivientes
a la selección con zeocina, comprendiendo dichas células huésped un
vector con un fragmento de ADN genómico humano que comprende dicha
secuencia de ADN capaz de contrarrestar al menos en parte la
formación de cromatina represora de la transcripción génica.
2. Un método según la reivindicación 1, donde
dicho ADN genómico humano fue fraccionado por tamaños de
aproximadamente 0,5 a 2 kilobases.
3. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la concentración de zeocina es
de 250 microgramos por ml y la duración es de 5 semanas.
4. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el elemento que comprende la
cualidad represora de la transcripción génica es una secuencia de
ADN que es reconocida por un complejo de proteína y donde dicho
sistema de transcripción comprende dicho complejo.
5. Un método según la reivindicación 4, donde
dicho complejo comprende una proteína de unión a heterocromatina
HP1, una proteína del grupo Polycomb (Pc-G), una
actividad desacetilasa de histona o una proteína MeCP2 (unión
metil-CpG).
6. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el vector es un vector que
replica episómicamente.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el vector comprende un origen de
replicación del virus Epstein-Barr (EBV), OriP, y un
antígeno nuclear (EBNA-1).
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende la etapa adicional de
rescatar fragmentos de ADN rastreados por ser capaces al menos en
parte de contrarrestar la formación de cromatina represora de la
transcripción génica.
9. Un método según la reivindicación 8, que
comprende la etapa adicional de analizar el fragmento de ADN
rescatado por ser capaz al menos de una de las siguientes
funciones: (i) bloquear al menos en parte la represión asociada con
la cromatina; (ii) bloquear al menos en parte la actividad de un
intensificador, (iii) conferir a un ácido nucleico conectado
operablemente que codifica una unidad de transcripción solo;
(iii-a) una pronosticabilidad de la transcripción
superior, (iii-b) una transcripción superior, y/o
(iii-c) una estabilidad de transcripción superior
con el tiempo.
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