JP2010096645A - 周期構造を有するマイクロプレート、並びに、それを用いた表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡、蛍光マイクロプレートリーダーおよび特異的な抗原抗体反応の検出方法 - Google Patents
周期構造を有するマイクロプレート、並びに、それを用いた表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡、蛍光マイクロプレートリーダーおよび特異的な抗原抗体反応の検出方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】観測対象の試料(A)を搭載するマイクロプレート(4)を有する蛍光顕微鏡(1)または蛍光マイクロプレートリーダーであって、マイクロプレート(4)が、表面に周期構造を有するベース基板と、ベース基板の周期構造の上に形成された金属層と、金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、金属層が、表面プラズモンを発生し得る金属で形成され、マイクロプレート(4)に、ベース基板側から光(Li)を入射させて消光抑制層側に表面プラズモン共鳴光(Lp)を発生させ、それを消光抑制層表面に吸着および結合した蛍光分子の励起場とし、増強蛍光を観察することのできるプレートである。
【選択図】図2
Description
によって発生する表面プラズモン共鳴光により、蛍光物質を励起して蛍光を発生させる表面プラズモン励起増強蛍光(Surface Plasmon Fluorescence)を用いた高感度蛍光顕微鏡およびマイクロプレートリーダーに関する。
プラズモン共鳴顕微鏡では、入射光学系に高屈折率対物レンズを用いており、この対物レンズの屈折率の制限によって使用可能な光の波長が近赤外領域に制限されることになり、一般的な蛍光分子の励起光として用いることができないからである。
目的とする。
としている。
前記ベース基板の表面の前記周期構造が、矩形の周期構造であり、
前記金属層が、矩形の周期構造であり、厚さ200nmに形成され、
前記溝部の深さをdnmとし、前記周期に対する凸部の長さの割合をM%として、
5≦d<15、且つ、15≦M<45、45<M<85、若しくは85<M<100、
15≦d<25、且つ、10≦M<100、
25≦d<35、且つ、10≦M≦40、60≦M≦70、若しくは75≦M≦95、または、
35≦d<45、且つ、0<M≦40、45≦M≦55、若しくは60≦M≦70
であることを特徴としている。
前記ベース基板の表面の前記周期構造が、矩形の周期構造であり、
前記金属層が、矩形の段差部分に対応する表面に前記スロープを有し、厚さ200nmに形成され、
前記周期に対する前記スロープの長さの割合が10±5%であり、
前記溝部の深さをdnmとし、前記周期に対する山の長さの割合をM%として、
5≦d<15、且つ、0<M<70、若しくは70<M<100、
15≦d<25、且つ、0<M<80、若しくは80<M<100、
25≦d<35、且つ、0<M<60、若しくは60<M<100、または、
35≦d<45、且つ、0<M<60、若しくは60<M<100
であることを特徴としている。
ミノ化またはアルキル化の処理が施されることを特徴としている。
また、マイクロプレート界面の表面プラズモン共鳴光は入射光強度の100倍以上に増強されるので、高出力のレーザーを用いる必要がなく、ランプ光源でも既存のエピ蛍光顕微鏡よりも100倍程度明るい蛍光を観測することができる。
一般に広く普及することが難しい状況であったが、本発明によると、これらの問題を解決することができるので、汎用型の高感度蛍光顕微鏡として普及することが期待できる。特に、蛍光標識を行って試料を観測する医療・生物分野の普及に大きく貢献することが期待できる。
向および蛍光Lpの観測方向の組み合わせに応じて4種類がある。具体的には、次の通りである。
落射型正立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がIN1であり、観測方向がTである
落射型倒立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がIN2であり、観測方向がBである。
透過型正立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がIN2であり、観測方向がTである。
透過型倒立顕微鏡の場合、照明光の入射方向がIN1であり、観測方向がBである。
本発明はこれら全てを対象とするが、以下では、説明を簡潔にするために、適宜これらの一部について説明する。
向に沿ってほぼ等間隔に配置された複数の溝を有する形状であり、溝は、例えば鋸歯状溝、正弦波状溝、矩形状溝である。周期構造の周期、即ち隣接する溝の間隔は、観察に使用する波長以下、例えば10〜1000nm(ナノメートル)であり、好ましくは100〜600nmである。周期構造の高さ(溝の深さ)は4〜400nm、アスペクト比は0.005〜10である。
若しくは吸収の少ない)透明な薄膜を用いる。表面プラズモン励起増強蛍光法の特徴である増強蛍光は、蛍光分子と金属との距離が近いと、強い励起場で励起された蛍光も金属表面にエネルギー移動して消光されてしまう。従って、試料を金属層6から所定距離だけ離隔させて消光を抑制することが必要である。また、表面プラズモン共鳴による励起場は近接場であるために、金属表面から離れるにしたがってその電場強度は減衰するため、金属表面からおよそ100nm以内に存在する蛍光分子のみが効率よく励起される。そのために、消光抑制層7の膜厚は、約10nm〜100nmの範囲で金属層6の種類に応じて決定される。たとえば、膜厚の最適値は、金属層6が銀の場合10〜50nmであり、より好ましくは20〜50nmである。金の場合、膜厚の最適値は10〜70nmであり、より好ましくは40〜70nmである。
の間に、酸化を防止する層(以下、酸化防止層という)を形成することが望ましい。なお、酸化防止層は、少なくとも銀と消光抑制層7との間にあればよい。例えば、ベース基板5と銀との間に接着層として機能する第1層を形成し、銀と消光抑制層7との間に接着および酸化防止層として機能する第2層を形成する。例えば、第1層および第2層は、それぞれ膜厚0.1〜3nmの薄膜として形成される。第2層は、銀を保護できる材質の層であればよく、例えばクロム(Cr)、アルミニウム、チタン、パラジウムで形成される。なお、第2層は消光抑制層7の接着性を高める役割をもする材質が望ましく、この意味でもクロム(Cr)が適している。
な平面U1と、それに直交する平面U2である。入射光L1、L2は、光源から出力され、対物レンズによって円錐形に集光されてマイクロプレート4に入射する光のうち、それぞれ平面U1内、U2内を進行する光である。ここで、入射光L1、L2は、偏光フィルターなどによる偏光を受けていない光であるとする。従って、マイクロプレート4に対する入射光L1、L2のp偏光成分V2、V3の成分のうちV1と平行な成分によって表面プラズモン共鳴光が発生する。このように、マイクロプレート4への入射光が偏光していない場合、マイクロプレート4の表面に形成された格子8の方向V1に平行な成分をもつ入射光のp偏光によって表面プラズモン共鳴光が発生する。
厚20nm)をスパッター法により形成してマイクロプレートを製作した。コントロール(比較対照)として周期構造のないスライドガラスにも同様に成膜した。
さらにその上に約20nmの厚さで消光抑制層としてSiO2を形成した。そして、これらの
マイクロプレートを用いて、実施例1と同様に表面プラズモン共鳴を観測した。
基板1:周期が480nm、溝部の深さが31nm、デューティ比が0.4
基板2:周期が480nm、溝部の深さが39nm、デューティ比が0.54
ここで、ベース基板表面の周期構造は、断面形状が図10に示した矩形状である。デューティ比は、周期に対する凸部の長さの割合をM%、周期に対する凹部の長さの割合をV%として、M/(M+V)である。
i) 図14のように表面がほぼ垂直なスロープ(傾斜角度αが90度)をもつ周期構造で
は、表面プラズモン共鳴はデューティ比に敏感に依存し、プラズモン共鳴場が発生する条件が制限されるが、図12のような表面にスロープ(高さ10〜50nm、且つ周期40〜100nm、即ち傾斜角度αが6〜50度)のある構造では、表面プラズモン共鳴発生のデューティ比への依存度が小さく、限られた一部の条件でプラズモン共鳴が発生しないことが分かった。特にスロープの傾斜が緩い程、表面プラズモン共鳴のデューティ比への依存度は小さくなる。
ii) 金属層表面にスロープをもたせた構造にすることで、表面プラズモン共鳴の溝部の深さへの依存度も軽減される。
iii) 表面プラズモン共鳴は周期にはあまり依存しない。
金属層表面にスロープが無く垂直な段差が形成されている(α=90°)場合、ベース基板の凹部の深さをd(nm)として、
d=10±5(5以上15未満)、且つ、15≦M<45、45<M<85、若しくは85<M<100、
d=20±5(15以上25未満)、且つ、10≦M<100、
d=30±5(25以上35未満)、且つ、10≦M≦40、60≦M≦70、若しくは75≦M≦95、
d=40±5(35以上45未満)、且つ、0<M≦40、45≦M≦55、若しくは60≦M≦70
である。
金属層表面がスロープを有し(α<90°)、SL=10±5の場合(ベース基板はα=90°)、ベース基板の凹部の深さをd(nm)として、
d=10±5(5nm以上15nm未満、即ちαが約12度)、且つ、0<M<70、または70<M<100
d=20±5(15nm以上25nm未満、即ちαが約23度)、且つ、0<M<80、または80<M<100
d=30±5(25nm以上35nm未満、即ちαが約32度)、且つ、0<M<60、または60<M<100
d=30±5(35nm以上55nm未満、即ちαが約40度)、且つ、0<M<60、または60<M<100
である。
の表面を1%アミノプロピルトリエトキシシランによってアミノ化したものを調製した。試料として、Cy5蛍光標識蛋白(ストレプトアビジン)で結合されたビオチン化マイクロビーズを基板に吸着させて透過型正立顕微鏡で蛍光観測した。また、DiI蛍光標識された細胞を基板に吸着させて落射型倒立顕微鏡で蛍光観測した。蛍光観測においては、どちらもハロゲンランプを用い、フィルターとして前者では発光側にCy5用フィルター、入射側に633nm干渉フィルターを挿入し、後者ではCy3フィルターキューブを用いた。
(1)メルカプト−ポリエチレングリコール(末端ヒドロキシル基)
(2)メルカプト−ポリエチレングリコールカルボン酸(末端カルボキシル基)
(3)メルカプト−ウンデカノール(末端ヒドロキシル基)
(4)メルカプト−ドデカン(末端メチル基)
(5)メルカプト−アミノウンデカン(末端アミノ基)
(6)メルカプト−ビオチン化ポリエチレングリコール(末端ビオチン)
表面に数μMの蛋白質ストレプトアビジン溶液を注入して、その吸着量を図19に示すようなプリズムカップリング表面プラズモン共鳴法(クレッチマン型)により、評価した。その結果が図16である。
メチル基(アルキル化表面)では特異的結合の6割強、アミノ化表面では9割強の吸着がおこっている。よって、表面の構造をアルキル化、好ましくはアミノ化することで、観察する蛋白質や細胞をより高密度に結合あるいは吸着させることが可能なプレートにすることができることがわかった。
形成してマイクロプレートを製作した。
出した結果である。(a)では、溶液中に存在する未吸着の蛍光分子からの蛍光が背景光として30%以上を占めているが、(b)では、背景光の影響が3%未満である。このように、ベース基板側からの照射により、背景光が抑制されるので、消光抑制層側からの照射に比べて、蛍光観察におけるS/Nを大きく改善することができる。よって、ベース基板側から光を入射することによって、リンス操作が不要なマイクロプレートを実現することができる。
2 本体
3 ステージ
4 マイクロプレート
5、5’ ベース基板
6 金属層
7 消光抑制層
8 周期構造
9 溝部
10 凸部
IN1 消光抑制層側からの光の入射
IN2 ベース基板側からの光の入射
T 消光抑制層側からの蛍光の検出
B ベース基板側からの蛍光の検出
A 試料
Li 照明光
Lp 観測光(プラズモン励起増強蛍光)
L1、L2 入射光
V1 格子の方向
V2、V3 入射光のp偏光成分
V4 入射光のs偏光成分
φ 入射角度
U1、U2 入射平面
Claims (19)
- 蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて使用され、観測対象の試料を搭載するためのマイクロプレートであって、
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に形成された金属層と、
前記金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、
前記金属層が、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記ベース基板側から光が入射されて、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、
発生した前記電場を蛍光分子の励起場として増強蛍光が検出されることを特徴とするマイクロプレート。 - 蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて使用され、観測対象の試料を搭載するためのマイクロプレートであって、
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に形成された金属層と、
前記金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、
前記金属層が、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記消光抑制層側から光が入射されて、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、
発生した前記電場を蛍光分子の励起場として増強蛍光が、前記ベース基板側から検出されることを特徴とするマイクロプレート。 - 前記周期構造が一方向に沿って形成された複数の溝部を備え、
前記周期構造の周期が10nm以上1μm以下であることを特徴とする請求項1または2に記載のマイクロプレート。 - 前記周期構造が、前記一方向と交差する方向に沿って形成された複数の溝部をさらに備えることを特徴とする請求項3に記載のマイクロプレート。
- 前記消光抑制層の厚さが10nm以上100nm以下であることを特徴とする請求項1〜4の何れか1項に記載のマイクロプレート。
- 前記金属層が遷移金属の膜厚10〜500nmの薄膜で形成されていることを特徴とする請求項1〜5の何れか1項に記載のマイクロプレート。
- 前記ベース基板と前記金属層との間に、膜厚0.1〜3nmの接着層を備え、
前記金属層と前記消光抑制層との間に、膜厚0.1〜3nmの接着および酸化防止層を備えていることを特徴とする請求項1〜6の何れか1項に記載のマイクロプレート。 - 前記金属層が銀で形成され、
前記消光抑制層がSiO2で形成されていることを特徴とする請求項7に記載のマイク
ロプレート。 - 前記消光抑制層の厚さが10〜50nmであることを特徴とする請求項8に記載のマイクロプレート。
- 前記金属層が金で形成され、
前記消光抑制層の厚さが10〜70nmであることを特徴とする請求項1〜7の何れか
1項に記載のマイクロプレート。 - 前記ベース基板の表面の前記周期構造が、矩形の周期構造であり、
前記金属層が、矩形の周期構造であり、厚さ200nmに形成され、
前記溝部の深さをdnmとし、前記周期に対する凸部の長さの割合をM%として、
5≦d<15、且つ、15≦M<45、45<M<85、若しくは85<M<100、
15≦d<25、且つ、10≦M<100、
25≦d<35、且つ、10≦M≦40、60≦M≦70、若しくは75≦M≦95、または、
35≦d<45、且つ、0<M≦40、45≦M≦55、若しくは60≦M≦70
であることを特徴とする請求項3に記載のマイクロプレート。 - 前記金属層が、表面にスロープを有することを特徴とする請求項3に記載のマイクロプレート。
- 前記ベース基板の表面の前記周期構造が、矩形の周期構造であり、
前記金属層が、矩形の段差部分に対応する表面に前記スロープを有し、厚さ200nmに形成され、
前記周期に対する前記スロープの長さの割合が10±5%であり、
前記溝部の深さをdnmとし、前記周期に対する山の長さの割合をM%として、
5≦d<15、且つ、0<M<70、若しくは70<M<100、
15≦d<25、且つ、0<M<80、若しくは80<M<100、
25≦d<35、且つ、0<M<60、若しくは60<M<100、または、
35≦d<45、且つ、0<M<60、若しくは60<M<100
であることを特徴とする請求項12に記載のマイクロプレート。 - 前記マイクロプレートの前記消光抑制層の表面に、蛋白質または細胞を吸着または結合させるために、前記消光抑制層の前記表面にアミノ化またはアルキル化の処理が施されることを特徴とする請求項1〜13の何れか1項に記載のマイクロプレート。
- 蛍光顕微鏡または蛍光マイクロプレートリーダーにおいて使用され、観測対象の試料を搭載するためのマイクロプレートであって、
表面に周期構造を有するベース基板と、
前記周期構造の上に形成された金属層と、
前記金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、
前記金属層が、表面プラズモン共鳴光を発生し得る金属で形成され、
前記消光抑制層側から光が入射されて、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、
発生した前記電場を蛍光分子の励起場として増強蛍光が、前記消光抑制層側から検出され、
前記マイクロプレートの前記消光抑制層の表面に、蛋白質または細胞を吸着または結合させるために、前記消光抑制層の前記表面にアミノ化またはアルキル化の処理が施されることを特徴とするマイクロプレート。 - 前記マイクロプレートの前記消光抑制層の表面が、さらに末端が活性エステル化カルボキシル基で修飾されたビオチン化ポリエチレングリコールと反応させられ、
ストレプトアビジンを含む蛍光標識抗原または抗体との結合の検出に使用されることを特徴とする請求項14または15に記載のマイクロプレート。 - 請求項1〜16の何れか1項に記載のマイクロプレートを用いて特異的な抗原抗体反応
を検出する方法であって、
前記マイクロプレートの前記消光抑制層の表面に抗体を吸着あるいは結合させるステップと、
蛍光標識二次抗体を利用して特異的な抗原抗体反応を増強蛍光により検出するステップとを含み、
リンス操作が不要であることを特徴とする検出方法。 - 観測対象の試料を搭載するマイクロプレートを有する蛍光顕微鏡であって、
前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、
前記金属層が、表面プラズモンを発生し得る金属で形成され、
前記マイクロプレートに、前記ベース基板側から光を入射させて、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した該電場を蛍光分子の励起場として増強蛍光検出することを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光顕微鏡。 - 観測対象の試料を搭載するマイクロプレートを有する蛍光マイクロプレートリーダーであって、
前記マイクロプレートが、表面に周期構造を有するベース基板と、該ベース基板の周期構造の上に形成された金属層と、該金属層の上に形成された消光抑制層とを備え、
前記金属層が、表面プラズモンを発生し得る金属で形成され、
前記マイクロプレートに、前記ベース基板側から光を入射させて、表面プラズモン共鳴光によって増強された電場を発生させ、発生した該電場を蛍光分子の励起場として増強蛍光検出することを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光マイクロプレートリーダー。
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