CN108351353B - 用于增强荧光的基底 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用基底来增强荧光分子的荧光的用途,其中所述基底包括具有多个彼此不同的凹陷的固体聚合物载体并且固体载体至少部分地涂覆有至少一种金属。
Description
本发明涉及提供纳米结构化的表面,当适合的分子接近该表面时,这些纳米结构化的表面适合以特别有利的方式增强所述分子的荧光。这种效应也被称为金属增强荧光(MEF)或表面增强荧光(SEF)。
MEF和SEF基于入射(激发)的、通常相干(即激光)的光与金属纳米结构的电子等离子体的电磁相互作用。当荧光分子接近(例如,结合(键合))具有这种金属结构的表面时,这导致荧光分子的光产量的增强。由此,表面结合的分子会更强烈地发光,因为它们的荧光得以增强。
由于荧光的增强,结合到表面的分子可在最低浓度下测量。例如,经荧光标记的抗体的结合可以其结合动力学的形式直接追踪。
增强的量取决于金属纳米结构的形状、大小和距离以及使用的金属的类型(例如Au、Ag、Al等)。在文献中有关于球形(常常为胶体;参见例如Yang等人Small 6(2010):1038-43;Corrigan T等人J Fluorescence 15(2005):777-784)、三角形或金字塔状(参见例如Pompa等人Nature Nanotechnology 1(2006):126-130;Cade等人Nanotechnology.15(2009):20(28))或者线状或棒状金属结构的描述,它们是不连续的并形成所谓的金属岛。然而,获得的增强因子相差很大,并且金属纳米结构在大多数情况下都是不可再现的。
在US 2005/214841中描述了具有多个凹陷并且至少部分地涂覆有金属的基底。基底可由各种材料组成,例如玻璃、陶瓷或金属。根据US 2005/214841,在基底的表面上、特别地在其凹陷中施加有连接器,其能够由于官能团而固定生物物质。在这个美国申请中没有提到其中描述的基底适合于增强分子的荧光。
在US 6,902,705中描述了如下的基底,其也可包括凹陷并且可以金属(例如金)涂覆。基底的表面被修饰,以使生物物质(例如DNA)结合到基底的表面上。在基底上提供凹陷似乎具有如下的优点,即可由此进行荧光测量而不获得任何干扰和妨碍信号。然而,使用这些基底无法实现荧光信号的增强。然而,使用这些基底无法实现荧光信号的增强。
本发明的目的在于提供如下的基底,该基底可以可再现的方式来制造并且一旦使荧光物质进入该基底附近(例如10nm或更小),该基底就能够增强荧光物质的荧光,其中这些基底在MEF测量中应该允许高于平均值的高增强因子。
本发明涉及基底及其用于增强一种或多种荧光分子的荧光的用途,其中所述基底包括具有彼此分离的多个凹陷的固体聚合物载体并且固体载体至少部分地涂覆有至少一种金属。
已经令人惊讶地发现,如果至少个荧光分子或荧光团位于具有根据本发明的构造的基底附近,则具有根据本发明的构造的基底能够使用相干光或不使用相干光来显著地增加荧光分子或荧光团的荧光产率(量子产率)(金属增强荧光;MEF)。“荧光产率”或“量子产率”应理解为发射和吸收的光子数量之间的比率。
使用根据本发明的基底的荧光产率甚至比使用迄今已知的基底(其表面上通常存在金属岛)的情况下的产率高许多倍。荧光产率的这种增加是令人惊讶的,因为迄今为止假设MEF效应仅可发生在如下的表面上,其具有沉积的含金属胶体形式的金属岛或表面上的其它彼此分离的并且经金属涂覆的区域(Matveeva E.等人,Anal Biochem 334(2004):303-11;Geddes CD.,等人J Fluoresc 12(2002):121-129)。已知具有连续的金属层或没有任何隆起的基底由于金属表面自身的荧光猝灭效应而不显示任何或仅具有非常小的MEF效应(Pineda E.C.,等人J.Chem.Phys.83(1985):5330-5337;Barnes W.L.,J Mod Opt,45(1998):661-699)。出于这些原因,本领域技术人员在不知晓本发明的情况下将会选择具有隆起的固体载体而不是具有凹陷的载体来用金属涂覆。
根据本发明的基底用于增强荧光团的荧光。也就是说,根据本发明的基底被用于任何需要荧光增强(即提高荧光产率)的地方。因此,根据本发明的基底可用于例如免疫测定、借助于核酸的任何形式的分子诊断(PCR,RT-PCR)、基于细胞的生物测定(如通常在高通量筛选下的那些)、组织学检查或细胞检查,多路复用测试系统(例如LUMINEX),前提是使用荧光来检测靶分子。
根据本发明的一个优选实施方案,荧光的增强发生在距离位于固体聚合物载体表面上的金属0至50nm、优选地1至50nm、更优选地1至40nm、更优选地2至40nm、更优选地1至30nm、更优选地2至30nm、更优选地3至30nm、更优选地1至20nm、更优选地2至20nm、更优选地3至20nm、更优选地5至20nm、更优选地5至15nm的距离处。
如本文所用,“荧光分子”根据本发明包括在被电磁波例如确定(特定)波长的光激发后将自发地发光的分子。本文中的“荧光团”是这样的分子的总称和同义词,并因此还包括发荧光或弱发荧光并且通常不被称为荧光团的分子。这种分子的实例是蛋白质或核酸,其荧光(“固有荧光”)是通过芳族结构(例如通过氨基酸色氨酸或酪氨酸)介导的。
根据本发明,“固体载体”也可由任何聚合物材料构成,只要其可以用金属来涂覆并且可产生凹陷即可。例如,固体聚合物载体包括合成聚合物或由其组成,例如聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚碳酸酯、环烯烃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸酯或其组合。原则上,也可以使用非聚合物载体,例如金属、陶瓷或玻璃,只要它们可用金属来涂覆并且可产生凹陷即可。
固体载体包括至少一种选自由热塑性聚合物和缩聚物组成的组的材料。
根据本发明的优选实施方案,热塑性聚合物选自:聚烯烃、乙烯基聚合物、苯乙烯聚合物、聚丙烯酸酯、聚乙烯咔唑、聚缩醛和氟塑料。
缩聚物优选地选自热塑性缩聚物、热固性缩聚物和加聚物。
根据本发明的一个特别优选的实施方案,固体聚合物载体的材料包括有机和/或无机添加剂和/或填料,其中这些添加剂和/或填料优选地选自TiO2、玻璃、碳、颜料、脂质和蜡。
本发明的另一方面涉及制备用于增强荧光团的荧光的基底的方法,其包括用至少一种金属涂覆根据本发明的固体载体的步骤。
本发明的另一方面涉及可根据本发明的方法制备的用于增强荧光团的荧光的基底。
包括凹陷的根据本发明的固体载体原则上可使用各种方法来制造(参见图15)。
(a)固体载体连同凹陷一起在一个步骤(例如注塑)中制造(参见图15(a))。
(b)在其它的工艺步骤(例如,与反应离子蚀刻或激光烧蚀相结合的热冲压、电子束光刻或“极紫外”(EUV))中将凹陷引入到现有的固体载体中(参见图15(b))。
(c)在固体载体上,施加薄的可结构化的聚合物层,将凹陷引入所述聚合物层中,例如在BD-50蓝光光盘的制造(UV纳米压印光刻)中(参见图15(c))。
特别适用于制造这些结构的是使用所谓的纳米压印光刻技术(Chou S.等人,Nano-imprint lithography,Journal of Vacuum Science&Technology B Band 14,No.6,1996,S.4129-4133)。为了通过纳米压印光刻制造纳米结构,需要一种通常为单体或聚合物的正片(Positiv),以及纳米结构化的压头(“原版(母版,Master)”)。压头本身也可通过纳米光刻来制造,其中这也可替代地通过蚀刻来制造。在压入压头前,将正片施加到基底上并且之后加热至超过玻璃化转变温度,即将其液化。为了实现可控(和短期)的加热而经常使用激光或UV光。由于加热时的正片的粘度,压头的间隙被完全由此填充。冷却后,压头被再次移除。借助于溅射工艺用金属涂覆作为根据本发明的基底的固体载体的正片。
用于光刻的压头的结构化可再次使用纳米压印来实现。在此使用玻璃或透光塑料作为材料。
特别优选的是通过注射成型(注塑)制造包括凹陷的固体载体。为此,通常借助Ni电镀技术从以光刻的方式生产的Si晶片上移除模具插入物。
固体载体原则上可具有任何形状(例如球形、平面),其中平面形状是特别优选的。
如本文所用,“凹陷”涉及围绕凹陷的固体载体的表面的水平(高度),其延伸到载体中并且不像隆起或凸起那样伸出载体。本发明意义上的凹陷具有由侧壁限定的底部。因此,深度为从表面到凹陷底部的距离。固体载体上的凹陷可具有各种形状(例如,圆形、椭圆形、四边形、矩形)。
如本文所用,“多个”凹陷意指根据本发明的固体载体具有至少一个、优选地至少两个、更优选地至少5个、更优选地至少10个、更优选地至少20个、更优选地至少30个、更优选地至少50个、更优选地至少100个、更优选地至少150个、更优选地至少200个凹陷。这些凹陷可设置在1000μm2、优选地500μm2、更优选地200μm2、更优选地100μm2的固体载体的表面上。备选地,凹陷可延伸穿过优选地1000μm、更优选地500μm、更优选200μm、更优选地100μm的长度。
如本文所用,“彼此分离的凹陷”意指凹陷由于其侧向限制而彼此分离并且彼此不具有连接(也不在固体载体的表面上)。
根据本发明的优选实施方案,固体载体的凹陷具有长度和宽度,其中长度对宽度的比率为2:1至1:2,特别地约1:1。
固体载体上的凹陷原则上可具有任何形状。然而,特别优选如下的凹陷,其具有2:1至1:2、优选地1.8:1、优选地1.6:1、优选地1.5:1、优选地1.4:1、优选地1.3:1、优选地1.2:1、优选地1.1:1、优选地1:1.8、优选地1:1.6、优选地1:1.5、优选地1:1.4、优选地1:1.3、优选地1:1.2、优选地1:1.1、特别地1:1的长度对宽度的比率。
根据本发明的另一个优选的实施方式,凹陷的长度和宽度为0.1μm至2μm、优选地0.2μm至2μm、优选地0.3μm至2μm、优选地0.1μm至1.8μm、优选地0.2μm至1.8μm、优选地0.3μm至1.8μm、优选地0.1μm至1.5μm、优选地0.2μm至1.5μm、优选地0.3μm至1.5μm、优选地0.1μm至1.2μm、优选地0.2μm至1.2μm、优选地0.2μm至1.2μm、优选地0.1μm至1μm、优选地0.2μm至1μm、优选地0.3μm至1μm、优选地0.1μm至0.8μm、优选地0.2μm至0.8μm、优选地0.3μm至0.8μm、优选地0.1μm至0.6μm、优选地0.2μm至0.6μm、优选地0.3μm至0.6μm、最优选地0.2μm至0.6μm。
特别优选地,根据本发明的固体载体的凹陷具有基本圆形的形状,其中“基本圆形”还包括卵圆形和椭圆形。凹陷的形状在固体载体表面的顶视图中可见。
凹陷优选地具有0.1μm至5μm、优选地0.1μm至4μm、优选地0.1μm至3μm、优选地0.1μm至2μm、优选地0.1μm至1.5μm、优选地0.1μm至1.2μm、优选地0.1μm至1μm、优选地0.1μm至0.9μm、优选地0.1μm至0.8μm、优选地0.2μm至5μm、优选地0.2μm至4μm、优选地0.2μm至3μm、优选地0.2μm至2μm、优选地0.2μm至1.5μm、优选地0.2μm至1.2μm、优选地0.2μm至1μm、优选地0.2μm至0.9μm、优选地0.2μm至0.8μm、优选地0.3μm至5μm、优选地0.3μm至4μm、优选地0.3μm至3μm、优选地0.3μm至2μm、优选地0.3μm至1.5μm、优选地0.3μm至1.2μm、优选地0.3μm至1μm、优选地0.3μm至0.9μm、优选地0.3μm至0.8μm的深度。凹陷的深度是从蒸镀有金属的固体载体的表面到凹陷的底部的距离。
根据本发明的优选的实施方式,凹陷彼此的距离(“周期”)为0.2μm至2.5μm、优选地0.3μm至1.4μm、更优选地0.4μm至1.3μm.在本发明的优选的实施方式中,凹陷彼此的距离为0.2μm至2μm、优选地0.2μm至1.8μm、优选地0.2μm至1.6μm、优选地0.2μm至1.5μm、优选地0.2μm至1.4μm、优选地0.2μm至1.3μm、优选地0.3μm至2.5μm、优选地0.3μm至2μm、优选地0.3μm至1.8μm、优选地0.3μm至1.6μm、优选地0.3μm至1.5μm、优选地0.3μm至1.3μm、优选地0.4μm至2.5μm、优选地0.4μm至2μm、优选地0.4μm至1.8μm、优选地0.4μm至1.6μm、优选地0.4μm至1.5μm、优选地0.4μm至1.4、优选地0.5μm至2.5μm、优选地0.5μm至2μm、优选地0.5μm至1.8μm、优选地0.5μm至1.6μm、优选地0.5μm至1.5μm、优选地0.5μm至1.4μm、优选地0.5μm至1.3μm、优选地0.6μm至2.5μm、优选地0.6μm至2μm、优选地0.6μm至1.8μm、优选地0.6μm至1.6μm、优选地0.6μm至1.5μm、优选地0.6μm至1.4μm、优选地0.6μm至1.3μm、优选地0.7μm至2.5μm、优选地0.7μm至2μm、优选地0.5μm至1.8μm、优选地0.7μm至1.6μm、优选地0.7μm至1.5μm、优选地0.7μm至1.4μm、优选地0.7μm至1.3μm,其中凹陷彼此的距离最优选地为0.2μm至1.4μm或0.3μm至1.3μm。凹陷之间的距离(“周期”)是从凹陷中心测量的。
根据本发明的另一优选的实施方式,固体载体上的金属层具有10nm至200nm、优选地15nm至100nm的厚度。尤其优选地,固体载体上的金属层具有10nm至190nm、优选地10nm至180nm、优选地10nm至170nm、优选地10nm至160nm、优选地10nm至150nm、优选地10nm至140nm、优选地10nm至130nm、优选地10nm至120nm、优选地10nm至110nm、优选地10nm至100nm、优选地10nm至90nm、优选地10nm至80nm、优选地10nm至70nm、优选地10nm至60nm、优选地10nm至50nm、优选地15nm至200nm、优选地15nm至190nm、优选地15nm至180nm、优选地15nm至170nm、优选地15nm至160nm、优选地15nm至150nm、优选地15nm至140nm、优选地15nm至130nm、优选地15nm至120nm、优选地15nm至110nm、优选地15nm至90nm、优选地15nm至80nm、优选地15nm至70nm、优选地15nm至60nm、优选地15nm至50nm、优选地20nm至200nm、优选地20nm至190nm、优选地20nm至180nm、优选地20nm至170nm、优选地20nm至160nm、优选地20nm至150nm、优选地20nm至140nm、优选地20nm至130nm、优选地20nm至120nm、优选地20nm至110nm、优选地20nm至100nm、优选地20nm至90nm、优选地20nm至80nm、优选地20nm至70nm、优选地20nm至60nm、优选地20nm至50nm的厚度。
根据本发明,固体聚合物载体“至少部分地”涂覆有至少一种金属。如本文所用,“至少部分地”意指凹陷所在的固体载体的区域被至少一种金属涂覆至少达20%、优选地至少达30%、甚至更优选地至少达40%、甚至更优选地至少达50%、甚至更优选地至少达60%、甚至更优选地至少达70%、甚至更优选地至少达80%、甚至更优选地至少达90%、甚至更优选地至少达95%、甚至更优选地至少达98%、特别地达100%。由于MEF效应需要金属表面,因而特别优选的是固体载体的表面至少在凹陷的区域中被至少一种金属涂覆。以这种方式,固体载体还可包括一个在另一个之上(叠置)的由相同或不同的金属组成的多个(例如,至少两个、至少三个、至少四个或至少五个)金属层。在固体载体上使用多层金属的优点在于,直接施加到载体上的第一金属层(例如铬)可改善其它金属层的附着性。
如本文所用,术语“一个在另一个之上(叠置)”是指金属层间接或直接设置在另一金属层上。以这种方式,形成由相同金属或不同金属构成的金属层的多层系统。
金属层优选地是连续的而不是间断的。然而,根据本发明可发现,固体聚合物载体上的一个或多个金属层也可以是间断的,而荧光增强效果不会因此受到损害。例如,间断的金属层可例如通过根据本发明的基底表面的电导率测量来实现(认知)。较低的电导率或无电导率意味着基底表面处的金属层是间断的。例如,间断的金属层可如下制造,其中使基本上完全被金属涂覆的基底与优选的含盐溶液例如具有150mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液接触一段确定的时间(10-90分钟)。
本发明的固体载体被“至少一种金属涂覆”。优选地,金属层包括至少两种、更优选地至少三种、更优选地至少四种、更优选地至少五种不同的金属。可借助现有技术中已知的方法将金属施加到固体载体上,其中优选使用溅射(阴极溅射)或热蒸发(蒸镀)、电子束物理气相沉积(电子束物蒸镀)、脉冲激光蒸镀、电弧蒸镀、分子束外延法、离子束辅助沉积和离子电镀。
根据本发明的优选的实施方式,金属选自银、金、铝、铬、铟、铜、镍、钯、铂、锌、锡以及包含这些金属中的一种或多种的合金。
根据本发明,这些金属或合金可用于涂覆根据本发明的固体载体。特别优选的是使用银或包含银的合金涂覆固体载体,因为银或其合金显示出特别高的增强效果。特别优选的是包含银、铟和锡的合金。含银的合金优选地具有超过10%、更优选地超过30%、更优选地超过50%、更优选地超过70%、更优选地超过80%、更优选地超过90%的银含量。
在用至少一种金属涂覆固体载体之后,或者在使用本发明的基底或本发明的固体载体之前,将固体载体或基底用包括至少一种选自氟、氯、溴和碘的卤素的酸或盐处理。
已经表明,通过用包括至少一种卤素的酸或其盐的水溶液(例如缓冲剂)预处理基底或固体载体可进一步提高荧光增强。因此,特别优选地用含酸或含盐的溶液预处理固体载体或基底。
备选地,也可在测量过程中使用包括至少一种卤素的酸或盐的水溶液(例如缓冲液)代替其它溶液。
根据本发明,卤素族的所有酸或其盐都适用,然而其中放射性卤素在实践中并不是所希望的。因此,特别优选地使用卤素氟、氯、溴和碘的酸或盐,最优选地氯化物、特别地金属氯化物。根据本发明使用的酸或盐特别优选地为碱金属盐或碱土金属盐、特别地钠盐、钾盐或锂盐。
根据本发明的一个特别优选的实施方案,含水组合物包含选自由以下组成的组的至少一种酸或盐:HCl、HF、HBr、HI、NaCl、NaF、NaBr、NaI、KCl、KF、KBr和KI。
包括至少一种卤素的酸或其盐的含水组合物除至少一种酸或其盐之外还可包括其它物质,例如其它酸或盐。特别优选地使用具有缓冲功能的物质(例如磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、碳酸盐)。
根据本发明的另一优选的实施方案,固体载体用含水组合物处理至少1分钟、优选地至少2分钟、更优选地至少5分钟、更优选地至少10分钟、更优选地至少20分钟。
根据本发明已经表明,如果固体载体用包括至少一种卤素的酸或其盐的含水组合物温育至少1分钟,优选地在室温(22℃)下,则涂覆有至少一种金属的载体的荧光增强效果会特别地高。如果温育在较高的温度(例如30℃至40℃)下进行,则温育时间可相应地减少(例如至少30秒)。然而,如果温育在较低的温度(例如10℃至20℃)下进行,则可相应地延长温育时间(例如至少2分钟)。
根据优选的实施方案,根据本发明的基底是毛细管、微量滴定板、微流体芯片、测定条(用于“横向流动测定”)、用于荧光显微镜的载体(例如载玻片载体)的部件(一部分),特别地用于高分辨率的方法例如根据点扫描仪原理的共焦激光显微镜、以及4Pi显微镜和STED(受激发射损耗)显微镜、传感器阵列或另一光学检测器领域。
特别优选的是,在微量滴定板中使用根据本发明的基底,其中微量滴定板可包括6、12、24、48、96、384或1536个孔。微量滴定板用于各种测量和分析,其中经常测量样品的荧光。通过在微量滴定板的孔中设置根据本发明的基底,样品的荧光产率可显著地增加。基底可通过各种方法引入并固定在孔中。在此,优选地通过胶水、焊接技术(例如激光焊接)和热接合将基底固定在孔中。
根据本发明的一个特别优选的实施方案,固体载体包括或由以下组成:环烯烃共聚物或环烯烃聚合物,并且是微量滴定板的一部分或微量滴定板的孔的一部分。在这方面,COP 1060R(1060R)已被证明是特别合适的。在此,载体优选地涂覆有10至60nm、优选地至多40nm的金属(例如银)。
使用荧光物质例如荧光团的某些测量在毛细管中进行。因此,优选地将根据本发明的基底设置在毛细管中。示例性用途为细胞仪或流式细胞仪,其中荧光细胞或经荧光标记的细胞的数量以及类型通过荧光测量来确定。
许多用于荧光测量的应用在微流体芯片中进行(例如,作为“芯片实验室(Lab-on-a-chip)”应用),其中可在这种芯片的检测区域内设置根据本发明的基底。
根据本发明的基底也可设置在传统的比色皿中。通过这种方式,荧光测量中的荧光产率也可被显著增加,从而即使样品中的最小量的荧光物质也可被测量到。根据本发明可使用任何比色皿形式。
在用于快速测试或现场测试(护理点)的测定条系统(“横向流动分析”)中,也可使用根据本发明的基底(例如,在检测区域“Detection Line”中),以增强经标记的分析物(例如经荧光标记的抗体)的荧光,并且以这种方式提高测试的灵敏度。
在本发明的另一个优选的实施方案中,将根据本发明的基底施加到显微镜、特别地荧光显微镜中使用的载玻片上。用于标记细胞结构的荧光团的荧光由此可被选择性地增强,并且方法的光学分辨率可被大大提高,因为需要较少的光强度,这将优化信噪比。应用领域将是高分辨率的方法,例如根据点扫描仪原理的共焦激光显微镜以及4Pi显微镜和STED(受激发射耗尽)显微镜。
根据本发明的另一个优选的实施方案,基底表面处的金属涂层至少部分地包括用于荧光分子的直接和/或间接结合的分子。
当荧光团在空间上接近(优选地小于20nm)根据本发明的基底时,根据本发明的基底可增强荧光分子或荧光团的荧光。荧光团或荧光物质在此可在液体中自由移动,其中仅当这些荧光团或荧光分子接近根据本发明的基底时才实现荧光增加。为了增加荧光团或荧光分子接近基底的可能性,特别有利的是,分子不可逆地或可逆地结合到基底表面处(即在金属涂层上),所述分子可要么结合荧光团或荧光分子本身(“直接结合”)要么结合与荧光团或荧光分子偶联的分子(例如经荧光标记的抗体;“间接结合”)。将这种类型的分子结合至金属结构的方法已众所周知。在最简单的情况下,通过蛋白质在金属表面上的物理化学吸附(通过离子和疏水相互作用介导)来实现结合(例如Nakanishi K.等人J BiosciBioengin 91(2001):233-244)。还已知在金属表面衍生化之后用于固定蛋白质的共价方法(例如GB Sigal等人Anal Chem 68(1996):490-7)。
用于荧光分子或荧光团的直接和/或间接结合的分子优选地选自:抗体、抗体片段、优选地Fab、F(ab)'2或scFv片段、核酸、酶、脂质、病毒颗粒,适体及其组合。
一方面,这些分子能够直接结合荧光团或荧光分子(例如抗体及其片段、核酸、酶),另一方面,这些分子也可结合其它提供荧光团或荧光物质的分子。
本发明的另一方面涉及毛细管、芯片、优选地微流体芯片、比色皿、微量滴定板、用于荧光显微镜的载体或光学检测器领域,其包括根据本发明的基底。
本发明的另一方面涉及包括以下的套组:包括根据本发明的基底和用荧光团标记的结合分析物的分子或用酶标记的结合分析物的分子和用于酶的荧光基底的至少一个微量滴定板、至少一个毛细管、至少一个芯片、优选地微流体芯片、至少一个比色皿和/或至少一个测定条。
如本文所用,“用于酶的荧光基底”是能够结合在酶的活性中心内或酶的活性中心上的基底,由此基底可获得荧光性质。当然,基底在积聚到酶上之前也可具有荧光特性。
随后,用一种或多种金属(例如2、3、4或5种金属)涂覆具有如上定义的凹陷的固体载体。用金属涂覆固体载体的方法在本领域技术人员中是已知的,其中特别优选地使用PVD工艺(PVD:“物理气相沉积”)例如溅射工艺和蒸镀工艺。
因此,根据本发明的优选的实施方案,通过溅射工艺或热蒸发(蒸镀)、使用电子束蒸镀、激光脉冲蒸镀、电弧蒸镀、分子束外延、离子束辅助沉积或离子电镀或根据相应的现有技术的任何其它工艺将至少一种金属施加到固体载体的表面上。
为了能够将荧光团或任何其它荧光物质直接和/或间接地结合到根据本发明的基底的表面上,在基底表面处的金属涂层上至少部分地施加用于经由表面的吸附或共价化学衍生化而直接和/或间接地结合荧光团的分子。
如本文所用,“至少部分”意指用金属涂覆的固体载体的至少10%、优选地至少30%、更优选地至少50%、更优选地至少70%、更优选地至少90%、更优选地至少90%、特别地100%设有用于荧光团的直接和/或间接结合的分子。
根据本发明的优选的实施方案,用于荧光团的直接和/或间接结合的分子选自:抗体、抗体片段、优选地Fab、F(ab)'2或scFv片段、核酸、酶、脂质、病毒颗粒、适体及其组合。
本发明的另一方面涉及用于确定或定量样品中的至少一种分析物的方法,其包括以下步骤:
a)任选地用至少一种荧光团直接或间接地标记至少一种分析物,
b)将来自步骤a)的至少一种经标记的分析物或荧光分析物施加到根据本发明的基底上,
c)通过用适当波长的光照射基底来激发至少一个荧光团,和
d)测量荧光以确定样品中至少一种分析物的存在。
能够显著增加荧光团和任何其它荧光分子或物质的荧光产率的根据本发明的基底可用于其中应当测量样品的荧光的方法。通过在这些方法中使用根据本发明的基底,可显著增加这些方法的灵敏度,使得不仅可确定最小量的待确定的分析物的存在,而且还可更准确地进行(少量)分析物的量化。
在第一步骤中,用荧光团或荧光物质直接或间接地标记样品中的待确定或待量化的分析物。在直接地标记分析物的情况下,至少一种荧光团或至少一种荧光物质共价或非共价地(例如通过氢桥、静电结合、范德华力、疏水相互作用)结合至待确定或待量化的分析物。在间接地标记的情况下,将能够结合至分析物上的经荧光标记的分子(例如抗体或其片段)引入到样品中。所述第一步骤是任选的,因为已存在本身已经能够(在适当的激发下)发出荧光的待确定或待量化的分析物。包括这样的分析物的样品可被直接地或者在样品处理(加工)后施加到根据本发明的基底上(参见根据本发明的方法的步骤b)。
在将来自步骤a)的至少一种经标记的分析物或荧光分析物施加至根据本发明的基底之后,通过使用适当波长的相干或非相干光(例如激光或氙气闪光)照射基底来激发荧光团或荧光物质或荧光分析物以进行荧光发射。
如本文所用,“适当波长的光”意指在根据本发明的方法中使用的光具有适于在接触时引发(诱导)物质的荧光发射的波长。例如,具有485nm的波长的光适合引发异硫氰酸酯荧光素(FITC)的荧光发射。
在借助光激发荧光物质之后,这些物质发射限定波长的光(荧光)。这种限定波长的发射的光可被测量并且可用于量化或确定样品中分析物的存在。发射的光可使用检测器(例如光电倍增器)来测量。在此,可使用市售的微量滴定板读取器(Tecan F200pro、BioTekSynergy、Molecular Devices FilterMax或SpectraMax系列等)、平板荧光扫描仪(例如Tecan LS-Reloaded、荧光显微镜或任何其它专有分析系统(Roche COBAS、Abbot AxSYM、Behring Opus Plus),如果整合了相应的荧光检测器的话)。
根据本发明的优选的实施方案,至少一种荧光团具有在360至780nm、优选地490至680nm的范围内的激发波长。
根据本发明的另一个优选的实施方案,至少一种荧光团具有在410至800nm、优选地510至710nm的范围内的发射波长。
所述至少一种荧光团优选地选自:甲氧基香豆素、氨基香豆素、Cy2、Alexa Fluor488、异硫氰酸酯荧光素(FITC)、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 532、Cy3、Alexa Fluor555,5-TAMRA、Alexa Fluor 546、藻红蛋白(PE),四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、Cy3.5、罗丹明、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Cy5、Alexa Fluor 660、Cy5.5、Alexa Fluor 680和Cy7,优选地选自:异硫氰酸酯荧光素(FITC)、Cy3、藻红蛋白(PE)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、Cy5和Alexa Fluor 680。
根据本发明的优选的实施方案,借助于经荧光团标记的并且结合分析物的分子来实现用至少一种荧光团间接地标记分析物。
根据本发明的进一步优选的实施方案,结合分析物的分子选自:抗体、抗体片段、优选地Fab、F(ab)'2或scFv片段、核酸、酶、脂质、病毒颗粒、适体和其组合。
依照以下附图和实施例来更详细地解释本发明,但本发明不限于此。
图1示出了涂覆有金属的根据本发明的平面状固体载体的三维AFM(“原子力显微镜”)图示(参见实施例1)。
图2示出了取决于荧光团类型和0.20和50nm Ag的银层厚度的MEF效应。MEF效应彰显于观察到的“相对增加”中,即600秒后测量时间结束时的信号(t600)与测量开始时的信号t(0)的比值。1.0的相对增加意味着信号没有变化,并因此没有MEF。相对增加越多,则MEF效应越强。随着金属层厚度的增加,观察到朝向更强的MEF的总体趋势,然而,从荧光团到荧光团会有所不同。
图3示出了针对AlexaFlour 680的MEF对银层厚度(增量为5nm)的依赖性(参见实施例2)。从5nm的层厚开始,可观察到MEF效应的显著增加。
图4和5示出了包括具有不同周期的凹陷的根据本发明的基底/结构的AFM图片。
图6示出了MEF效应对结构的周期(0.8至2.2μm)的依赖性。
图7示出了MEF对结构的深度的依赖性。
图8和9示出了与现有技术的经胶体涂覆的表面和MEF表面(PLASMONIX公司;Quanta-Wells 2;“竞争结构”)相比较的获得的MEF增强因子。
图10示出了纳米柱(隆起)和倒置纳米柱(凹陷)上的MEF动力学。
图11示出了使用根据本发明的基底进行的抗兔IgG荧光免疫分析。
图12示出了包括被金属层涂覆的载体的根据本发明的基底。固体载体具有带深度、宽度和长度的凹陷。凹陷以相对于彼此确定的距离(周期)位于所述固体载体上。
图13示出了根据本发明的固体载体的顶视图(A)和截面图(B)。所述固体载体上的凹陷由宽度、长度和深度表征,并具有相对于彼此确定的距离(周期)。
图14示出了使用各种缓冲液时的MEF效应。
图15示出了可用来制造包括凹陷的根据本发明的固体载体的各种方法。
实施例:
实施例1:制造根据本发明的基底
基于已知的现有技术(尤其参见Pompa等人Nature Nanotechnology 1(2006):126-130;Cade等人Nanotechnology.15(2009):20(28);US 2009/0262640),尝试生产了尽可能高和细长的塔形或柱状结构(“纳米柱”),由于底座(Basis)直径对结构高度的比例(“纵横比”)高(1:2至1:3),在蒸镀的过程中使金属层变薄,从而根据文献形成MEF效应所需的金属岛结构。由此,产生了具有不同底座直径(250-550nm)和不同高度(250-850nm)的“柱”(隆起)。
为了制造基底,使用了特定形式的注塑,即压塑()。在压塑的过程中,将热塑性塑料熔体引入略微打开的工具中,同时进行压制过程(=压印)。借助于镍电镀从光刻产生的硅母版(Silizium-Master)去除用于注塑的纳米结构化压头。在此硅母版是指用正片漆(Positivlack)涂覆的硅晶片,其已通过“激光光刻”曝光并且随后被显影。
令人惊讶的是,只有涂覆有金属的具有凹陷(INP)的固体载体显示出明显的MEF效应,而基于具有隆起的固体载体的基底没有或仅显示最小的MEF效应(参见图10)。由此,INP结构被进一步研究。
实施例2:金属层厚度的影响
为了研究金属层厚度对具有直径为约450μm的凹陷的固体载体表面的影响而蒸镀各种层厚度的银。
在表面上直接吸附经荧光标记的抗体是对各种结构化表面在灵敏度和增强因子方面进行比较的最简单的方法。在此,MEF效应表明,与没有MEF的表面相反,可直接实时地监测抗体的结合动力学(“MEF-动力学”)。这是如下实现的:只有在表面附近的分子会发光得更多,而进一步远离的未结合的分子则不会。在此,将含有经荧光标记的抗体的溶液逐滴施加到相应的纳米结构化的表面上,并使用合适的荧光测量装置(Tecan 200F pro)跟踪信号随时间的变化。
除了参数“MEF动力学”之外,通过对具有纳米金属结构的表面上的一定浓度的经荧光标记的抗体的信号和在没有这种结构的表面上的相同抗体的信号进行比较可定义增强因子。在此,仅需确保有效占用密度(覆盖范围)(即表面上抗体的实际数量)是相同的。
在制备金属层厚度变体的情况下显示,与测试的荧光团无关,在0-50nm Ag范围内的MEF效应显著增加(参见图2;为1的相对增加意味着没有MEF效应)。
图3显示为了获得MEF需要5nm的最小层厚度。图3还显示,在金属层厚度以5nm增量增加的情况下,观察到MEF效应的连续增加。
实施例3:结构周期的影响
凹陷相对于彼此的距离(“周期”)可对根据本发明的基底的MEF效应产生影响。为此,例如用银涂覆具有不同周期的各种固体载体:
区域(Feld) | 周期(μm) |
1 | 0.8 |
2 | 1.0 |
3 | 1.4 |
4 | 1.6 |
5 | 1.8 |
6 | 2.0 |
7 | 2.2 |
图4和5分别示出了具有0.8μm或2.2μm的周期和50nm的银层厚度的两个根据本发明的基底的AFM图片。
为了证明MEF效应,对于所有区域1至7创建AlexaFlour 680(在10mM PBS中13nM,pH7.4)的MEF动力学(参见图6)。在这种情况下可确定,在0.8和1.0μm的周期下MEF效应最高。从1.2μm的周期开始,MEF效应虽然明显较低,但仍然存在。
下表显示了针对区域1(0.8μm)和2(1.0)的各种经荧光标记的抗体的MEF动力学测量的相对增加(信号t=300s/信号t=0s)。用于这些测量的INP上的银层厚度为20nm,其中使用了用相应的荧光团标记的、抗家兔IgG的山羊抗体(在10mM PBS pH 7.4中稀释;c=13nM):
因此,对于波长范围Ex/Em为485/520(FITC)至680/720(AlexaFlour 680)内的各种荧光团均可展示出在INP上的MEF效应。INP的使用不限于特定的荧光团。
实施例4:凹陷的深度对MEF效应的影响
为了研究凹陷(倒置纳米柱;INP)的深度的影响,制造了具有不同凹陷深度(60nm、240nm、550nm、755nm和874nm)的固体载体,并且使用银进行蒸镀(20nm层厚度)。
用经荧光标记的抗体进行的吸附试验(“MEF动力学”)表明,随着凹陷深度的增加,MEF效应也增加。然而,对于凹陷深度小于60nm的固体载体,确定了MEF效应,然而,与其它载体相比,这显著更低(参见图7)。
实施例5:比较试验
与通常使用的结构相比,根据本发明的基底显示增强的MEF效应。为了证明这一点,根据文献(Direct monitoring of molecular recognition processes usingfluorescence enhancement at colloid-coated microplates.,C Lobmaier等人2001年7月;14(4):215-22)中已知的方法用银胶体涂覆微量滴定板,并且其增强因子(定义为在相同抗体表面浓度下的没有银胶体的表面上的信号与具有银胶体的表面上的信号的比率)与具有凹陷(20nm Ag,0.8μm周期)的根据本发明的结构相比较来确定。另外,研究了单独的根据制造商信息基于MEF的商业微量滴定板系统(PLASMONIX公司;Quant-Wells 2)。
如图9中所示,根据本发明的基底的增强因子是胶体平板或PLASMONIX的平板上的约10倍高。除了显著较低的增强因子外,PLASMOX的微量滴定板也未显示典型的MEF动力学(参见图9与图7的比较)。
实施例6:抗兔IgG荧光免疫分析
使根据本发明的基底、经胶体涂覆的微量滴定板(MTP)和Greiner公司的标准微量滴定板(如根据现有技术用于免疫测定法的那些)的表面与兔IgG(2μg/ml)在PBS(具有150mM NaCl的10mM磷酸盐缓冲液pH10.4)中的溶液在室温下接触2小时。然后除去溶液,用含有0.1%Triton X-100的PBS洗涤表面并使其与5%聚乙烯吡咯烷酮溶液接触1小时以阻断任何非特异性结合。在使用PBS/Triton X100进行的进一步的洗涤之后,在室温下用不同浓度的经生物素标记的抗-兔IgG抗体孵育1小时。最后,在最终洗涤步骤后通过用Cy3标记的链亲和素(Streptavidin)在600秒内测量MEF动力学来证明该抗-兔IgG抗体的结合(参见图11)。清楚可见的是,在标准微量滴定板上没有发生任何MEF动力学,因此免疫分析也不可执行。然而,经胶体涂覆的微量滴定板仅显示出弱的MEF动力学,而根据本发明的基底显示出非常明显的MEF动力学并因此还显示具有基本更陡峭的校准曲线(即显著更高的灵敏度)的免疫分析。
在该实施例中使用的根据本发明的基底在用抗体涂覆之前显示出导电性。在实施测量MEF动力学之后,不能检测到基底的电导率。这可能是由于与PBS缓冲液接触时形成了氯化银。
实施例7:取决于使用的缓冲液的MEF效应
为了研究MEF效应对使用的缓冲液的依赖性,如在实施例3中那样对通过吸附经荧光标记的抗体(用Cy5标记的山羊抗兔抗体)引起的MEF动力学进行观察,其中代替PBS缓冲液使用纯磷酸盐缓冲液(PB;10mM磷酸盐缓冲液)、1%(w/v)柠檬酸钠水溶液和去离子水(diH2O)。测试是在具有1μm的周期的基底上进行的(对应于区域2,参见实施例3)。从图14可见,从PBS的吸附确实给出了最高的相关信号增加,但从其它溶液吸附抗体时也观察到显著的信号。这也可为同样在实施例6中描述的可能的氯化银层形成的结果,其对增强效果具有积极影响。
Claims (57)
1.使用基底来增强一种或多种荧光分子的荧光的用途,其特征在于,所述基底包括具有多个彼此分离的凹陷的固体聚合物载体并且固体载体至少部分地涂覆有至少一种金属,其中所述固体聚合物载体的表面至少在凹陷的区域中被至少一种金属涂覆,
其中所述凹陷具有0.2μm至2.5μm的相对于彼此的距离,并且具有0.1μm至5μm的深度,
其中固体载体上的金属层具有10nm至60nm的厚度,以及
其中固体载体至少部分地涂覆有银或包含银的合金。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,固体载体的凹陷具有长度和宽度,其中长宽比为2:1至1:2。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述长宽比为1:1。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,固体载体的凹陷具有长度和宽度,其中所述凹陷的长度和宽度为0.1μm至2μm。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述凹陷具有圆形的形状。
6.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,固体载体至少部分地包括一个或多于一个的叠置的金属层。
7.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述合金包含银、铟和锡。
8.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,固体载体包括至少一种选自热塑性聚合物和缩聚物的材料。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述热塑性聚合物选自:聚烯烃、乙烯基聚合物、苯乙烯聚合物、聚丙烯酸酯、聚乙烯咔唑、聚缩醛和氟塑料。
10.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述缩聚物选自:热塑性缩聚物、热固性缩聚物和加聚物。
11.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,固体聚合物载体的材料包括有机和/或无机添加剂和/或填料。
12.根据权利要求11所述的用途,其特征在于,有机和/或无机添加剂和/或填料选自:TiO2、玻璃、碳、颜料、脂质和蜡。
13.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述基底为毛细管、微量滴定板、微流体芯片、测定条、用于荧光显微镜的载体、传感器阵列或光学检测器领域的部件。
14.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,基底表面处的金属涂层至少部分地包括用于荧光分子的直接和/或间接结合的分子。
15.根据权利要求14所述的用途,其特征在于,用于荧光分子的直接和/或间接结合的分子选自:抗体、抗体片段、核酸、酶、脂质、病毒颗粒、适体及其组合。
16.根据权利要求15所述的用途,其特征在于,所述抗体片段为Fab、F(ab)'2或scFv片段。
17.用于增强一种或多种荧光分子的荧光的基底,其特征在于,该基底包括具有多个彼此分离的凹陷的固体聚合物载体并且固体载体至少部分地涂覆有至少一种金属,其中所述固体聚合物载体的表面至少在凹陷的区域中被至少一种金属涂覆,
其中所述凹陷具有0.2μm至2.5μm的相对于彼此的距离,并且具有0.1μm至5μm的深度,
其中固体载体上的金属层具有10nm至60nm的厚度,以及
其中固体载体至少部分地涂覆有银或包含银的合金。
18.根据权利要求17所述的基底,其特征在于,固体载体的凹陷具有长度和宽度,其中长宽比为2:1至1:2。
19.根据权利要求18所述的基底,其特征在于,所述长宽比为1:1。
20.根据权利要求17所述的基底,其特征在于,固体载体的凹陷具有长度和宽度,其中所述凹陷的长度和宽度为0.1μm至2μm。
21.根据权利要求17所述的基底,其特征在于,所述凹陷具有圆形的形状。
22.根据权利要求17所述的基底,其特征在于,固体载体至少部分地包括多于一个的叠置的金属层。
23.根据权利要求17所述的基底,其特征在于,所述合金包含银、铟和锡。
24.根据权利要求17所述的基底,其特征在于,固体载体包括至少一种选自热塑性聚合物和缩聚物的材料。
25.根据权利要求24所述的基底,其特征在于,所述热塑性聚合物选自:聚烯烃、乙烯基聚合物、苯乙烯聚合物、聚丙烯酸酯、聚乙烯咔唑、聚缩醛和氟塑料。
26.根据权利要求25所述的基底,其特征在于,所述缩聚物选自:热塑性缩聚物、热固性缩聚物和加聚物。
27.根据权利要求17所述的基底,其特征在于,固体聚合物载体的材料包括有机和/或无机添加剂和/或填料。
28.根据权利要求27所述的基底,其特征在于,所述有机和/或无机添加剂和/或填料选自:TiO2、玻璃、碳、颜料、脂质和蜡。
29.根据权利要求17所述的基底,其特征在于,该基底表面处的金属涂层至少部分地包括用于荧光分子的直接和/或间接结合的分子。
30.根据权利要求29所述的基底,其特征在于,用于荧光分子的直接和/或间接结合的分子选自:抗体、抗体片段、核酸、酶、脂质、病毒颗粒、适体及其组合。
31.根据权利要求30所述的基底,其特征在于,所述抗体片段为Fab、F(ab)'2或scFv片段。
32.毛细管、芯片、比色皿、微量滴定板,用于荧光显微镜的载体或光学检测器领域,其包括根据权利要求17至31之一所述的基底。
33.根据权利要求32所述的毛细管、芯片、比色皿、微量滴定板,其中所述芯片为微流体芯片。
34.包括至少一个微量滴定板和/或至少一个毛细管和/或至少一个芯片和/或至少一个比色皿和/或至少一个测定条的套组,所述至少一个微量滴定板和/或至少一个毛细管和/或至少一个芯片和/或至少一个比色皿和/或至少一个测定条包括根据权利要求17至31之一所述的基底和用荧光分子标记的结合分析物的分子或用酶标记的结合分析物的分子和用于所述酶的荧光基底。
35.制造用于增强荧光团的荧光的基底的方法,包括如下的步骤:用至少一种如权利要求17至23中定义的金属至少部分地涂覆如权利要求17至22和24至28中定义的固体载体。
36.根据权利要求35所述的方法,其特征在于,借助于选自溅射法、热蒸镀、电子束蒸镀、激光束蒸镀、电弧蒸镀、分子束外延法、离子束辅助沉积和离子电镀的方法将至少一种金属施加到固体载体的表面上。
37.根据权利要求35或36所述的方法,其特征在于,用包括至少一种选自氟、氯、溴和碘的卤素的酸和/或盐的含水组合物处理至少部分涂布的固体载体。
38.根据权利要求37所述的方法,其特征在于,所述含水组合物包括选自以下的至少一种酸和/或盐:HCl、HF、HBr、HI、NaCl、NaF、NaBr、NaI、KCl、KF、KBr和KI。
39.根据权利要求37所述的方法,其特征在于,固体载体用所述含水组合物处理至少1分钟。
40.根据权利要求39所述的方法,其特征在于,固体载体用所述含水组合物处理至少2分钟。
41.根据权利要求39所述的方法,其特征在于,固体载体用所述含水组合物处理至少5分钟。
42.根据权利要求39所述的方法,其特征在于,固体载体用所述含水组合物处理至少10分钟。
43.根据权利要求39所述的方法,其特征在于,固体载体用所述含水组合物处理至少20分钟。
44.根据权利要求35或36所述的方法,其特征在于,将用于荧光团的直接和/或间接结合的分子至少部分地施加在基底表面处的金属涂层上。
45.根据权利要求44所述的方法,其特征在于,用于荧光团的直接和/或间接结合的分子选自:抗体、抗体片段、核酸、酶、脂质、病毒颗粒、适体及其组合。
46.根据权利要求45所述的方法,其特征在于,所述抗体片段为Fab、F(ab)'2或scFv片段。
47.用于增强荧光团的荧光的基底,其可按照根据权利要求35至46之一所述的方法来制造。
48.用于确定或定量样品中的至少一种分析物的方法,包括以下步骤:
a)任选地用至少一种荧光团直接或间接地标记至少一种分析物,
b)将来自步骤a)的至少一种经标记的分析物或将荧光分析物施加到根据权利要求17至33之一所述的基底上,
c)通过用适当波长的光照射基底来激发至少一个荧光团,和
d)测量荧光以确定样品中至少一种分析物的存在或以定量样品中至少一种分析物。
49.根据权利要求48所述的方法,其特征在于,至少一种荧光团具有在360至780nm的范围内的激发波长。
50.根据权利要求49所述的方法,其特征在于,至少一种荧光团具有在490至680nm的范围内的激发波长。
51.根据权利要求48或49所述的方法,其特征在于,至少一种荧光团具有在410至800nm的范围内的发射波长。
52.根据权利要求51所述的方法,其特征在于,至少一种荧光团具有在510至710nm的范围内的发射波长。
53.根据权利要求48或49所述的方法,其特征在于,所述至少一种荧光团选自:甲氧基香豆素、氨基香豆素、Cy2、Alexa Fluor 488、异硫氰酸酯荧光素(FITC)、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 532、Cy3、Alexa Fluor 555、5-TAMRA、Alexa Fluor 546、藻红蛋白,四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、Cy3.5、罗丹明、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、AlexaFluor 633、Alexa Fluor 647、Cy5、Alexa Fluor 660、Cy5.5、Alexa Fluor 680和Cy7。
54.根据权利要求53所述的方法,其特征在于,所述至少一种荧光团选自:异硫氰酸酯荧光素(FITC)、Cy3、藻红蛋白、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、Cy5和Alexa Fluor 680。
55.根据权利要求48或49所述的方法,其特征在于,用至少一种荧光团间接标记分析物是借助于经荧光团标记的并且结合分析物的分子进行的。
56.根据权利要求55所述的方法,其特征在于,结合分析物的分子选自:抗体、抗体片段、核酸、酶、脂质、病毒颗粒、适体及其组合。
57.根据权利要求56所述的方法,其特征在于,所述抗体片段为Fab、F(ab)'2或scFv片段。
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