CN110218628B

CN110218628B - 一种数字pcr芯片及其制备方法

Info

Publication number: CN110218628B
Application number: CN201910534596.6A
Authority: CN
Inventors: 刘文文; 节俊尧; 胡诗铭; 蒋莉娟; 魏清泉; 俞育德
Original assignee: Institute of Semiconductors of CAS
Current assignee: Institute of Semiconductors of CAS
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2039-06-19
Also published as: CN110218628A

Abstract

一种数字PCR芯片及其制备方法，该数字PCR芯片包括：基片(11)，该基片(11)一表面设有微孔结构(12)阵列，所有微孔结构(12)均不贯穿该基片(11)；金属膜层(13)，其形成于每个微孔结构(12)内表面的局部区域或全部区域，基片(11)表面除微孔结构(12)的其它区域无金属膜层(13)，该金属膜层(13)具有高反射率。该芯片能够大幅度增强特异性的阳性荧光信号强度，提高信噪比，在较低循环数条件下即可实现荧光信号检测，极大地缩短检测时间，提高检测效率。

Description

一种数字PCR芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及DNA检测领域，尤其涉及一种数字PCR芯片及其制备方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。PCR技术以其指数扩增的特点，可短时内将目标DNA扩增百万倍；以其简便易行、灵敏度高的优点，被广泛应用于基础科学和临床研究。随着生命科学和医学检测的不断发展，研究者们越来越希望在保留PCR反应的特异性、灵敏性、保真度的同时，能尽量的缩短检测时间，实现快速定量和检测。因此，自传统PCR技术被发明以来，出现了多种半定量、定量、以及各种以快速检测为目的PCR检测方法(逆转录PCR、原位PCR、实时PCR等)，在大批量样本检测和疾病早期快速诊断等方面获得重要应用。

数字PCR(digital PCR，dPCR)不依赖标准曲线，是仅根据一次反应即可确定目标DNA数量的绝对定量技术。微孔式dPCR具有固相载体，即微孔dPCR芯片。其原理是利用微流控技术，将PCR预混液均匀导入芯片微孔进行大量分割，使得每个反应单元中目标DNA分子数为0或1。PCR反应后，具有一个DNA分子的微孔内产生特异性的阳性荧光信号。使用荧光成像仪或者荧光显微镜检测荧光信号，并用图像处理软件统计和分析即可得到目标DNA分子拷贝数(即目标物浓度)。由于dPCR每个微孔体积多数情况是皮升量级，因此，其荧光信号检测时，孔内荧光分子数少，且荧光强度弱。

从定量角度而言，微孔式dPCR已经是绝对定量技术，优于所有已知的PCR衍生技术。从快速检测的角度，一方面dPCR系统仍然依赖外部热循环，提高升降温速率可缩短检测时间；另一方面，对dPCR荧光信号进行放大或者采用更加灵敏的成像系统，可降低dPCR反应所需循环数，缩短反应时间，达到快速检测目的。

然而，基于上述以快速检测为目的dPCR技术，多集中在改善温度控制、CCD灵敏度、光路系统、荧光分子设计等外部设备和试剂方面，很少有针对芯片本身的设计。

发明内容

(一)要解决的技术问题

针对于现有的技术问题，本发明提出一种数字PCR芯片及其制备方法，用于解决现有技术中荧光信号检测时，荧光分子数少和荧光强度弱等问题。

(二)技术方案

本发明提供一种数字PCR芯片，包括：基片11，基片11一表面设有微孔结构12阵列，所有微孔结构12均不贯穿基片11；金属膜层13，其形成于每个微孔结构12内表面的局部区域或全部区域，基片11表面除微孔结构12的其它区域无金属膜层13。

可选地，金属膜层13的材质为金、铜、钼、铝、银或金属氧化物。

可选地，金属膜层13的厚度为5-2000nm。

可选地，单个微孔结构12的宽度为5-2000μm，深度为5-1000μm。

可选地，单个微孔结构12的宽度与深度的比值大于1。

可选地，微孔结构12的孔形状为圆形或n边形，其中，n≥3。

可选地，基片11的材质为硅、金属或固体有机材料。

可选地，金属膜层13形成于每个微孔结构12的底面。

可选地，金属膜层13形成于每个微孔结构12的侧壁。

本发明另一方面提供一种PCR芯片的制备方法，包括：S1，在基片11表面旋涂光刻胶，对光刻胶进行紫外光刻，得到刻蚀图案；S2，按照刻蚀图案刻蚀基片11，得到微孔结构12阵列；S3，在所有微孔结构12内表面局部区域或全部区域蒸镀金属膜层13，清洗光刻胶，得到数字PCR芯片。

(三)有益效果

本发明提出一种数字PCR芯片及其制备方法，有益效果为：

1、该芯片表面的微孔结构(荧光信号区域)内表面局部区域或全部区域设有高反射率的金属膜层，除微孔结构的其它区域(非信号区域)无高反射率的金属膜层。通过该种芯片设计方式，其一，可使入射照明光在微孔中多次反射，提高微孔溶液中荧光分子被激发的机会；其二，使处于微孔溶液中被激发的荧光信号在微孔金属膜层的作用下，提高反射，降低微孔侧壁和底面对荧光的吸收；其三，由于芯片上表面不具有膜层，并不提高荧光背景，对荧光信号具有特异性的增强作用；其四，该芯片用于检测微孔阵列内部反应溶液的荧光强度，不仅仅局限于芯片表面，使得金属膜层表面无需进行生物分子化学修饰，可最大程度的增强荧光信号；其五，可降低微孔溶液中荧光信号的漫反射。基于上述五个方面，大幅度增强特异性的阳性荧光信号强度，提高信噪比，在较低循环数条件下即可实现荧光信号检测，极大地缩短检测时间，提高检测效率。

2、芯片的微孔阵列可对微升量级dPCR反应预混溶液进行高通量分割，使每个微孔里的溶液体积可达飞升～皮升量级(根据微孔尺寸)。

附图说明

图1示意性示出了本发明实施例数字PCR芯片的俯视和剖面结构示意图。

图2示意性示出了本发明实施例数字PCR芯片的制备工艺流程图。

图3示意性示出了采用本发明实施例数字PCR芯片测量DNA分子浓度的荧光增强作用示意图。

图4示意性示出了采用本发明实施例数字PCR芯片测量DNA分子浓度的荧光信号增强作用的实验结果图。

图5示意性示出了采用本发明实施例数字PCR芯片测量DNA分子浓度的荧光值与循环次数的曲线图。

【附图标记】

11-基片

111-基片上表面

12-微孔结构

121-阳性微孔结构

122-阴性微孔结构

13-金属膜层

14-光刻胶

15-掩膜版

16-紫外光

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

本发明针对于芯片本身的设计，提出一种数字PCR芯片及其制备方法，用于检测DNA分子浓度。该芯片在检测DNA分子浓度时，可大幅度增强特异性的阳性荧光信号强度，提高信噪比，在较低循环数条件下即可实现荧光信号检测，极大地缩短检测时间，提高检测效率。

实施例1

本实施例提出一种数字PCR芯片，具体包括：

基片11，该基片11一表面设有微孔结构12阵列，所有微孔结构12均不贯穿该基片11，如图1中上图所示。基片11的材质为硅、金属或耐高温的固体有机材料，具有良好的导热性能。

进一步的，单个微孔结构12的宽度为5-2000μm，深度为5-1000μm，其宽度与深度的比值大于1。通过对微孔结构12不同宽度和深度的设计，形成不同的反应体积，可对微升量级dPCR反应预混溶液进行高通量分割，使每个微孔里的溶液体积可达飞升～皮升量级(根据微孔尺寸)，并且每个微孔包含目标DNA分子数不大于1个。

进一步的，该微孔结构12的孔形状为圆形或n边形，其中，n≥3。

金属膜层13，其形成于每个微孔结构12内表面的局部区域或全部区域，该基片11表面除微孔结构12的其它区域无金属膜层13。该金属膜层13可形成于每个微孔结构12的底面，可形成于每个微孔结构12的侧壁，也可形成于每个微孔结构12的底面及侧壁。

进一步的，金属膜层13的材质为金、铜、钼、铝、银等高反射率金属或金属氧化物，厚度为5-2000nm。

通过在微孔结构12内表面形成金属膜层13，并选取合适的材料及厚度，使得该芯片在检测DNA分子浓度时，具有如下优势：

其一、可使入射照明光在微孔中多次反射，提高微孔溶液中荧光分子被激发的机会；

其二，使处于微孔溶液中被激发的荧光信号在微孔金属膜层的作用下，提高反射，降低微孔侧壁和底面对荧光的吸收；

其三，由于芯片上表面不具有金属膜层，并不提高荧光背景，对荧光信号具有特异性的增强作用；

其四，该芯片用于检测微孔阵列内部反应溶液的荧光强度，不仅仅局限于芯片表面，使得膜层表面无需进行生物分子化学修饰，可最大程度的增强荧光信号；

其五，可降低微孔溶液中荧光信号的漫反射。

基于上述五个方面，可大幅度增强特异性的阳性荧光信号强度，提高信噪比，在较低循环数条件下即可实现荧光信号检测，极大地缩短检测时间，提高检测效率。

实施例2

本实施例提出一种上述数字PCR芯片的制备方法，采用微纳加工工艺或机械加工制备，制备工艺流程如图2所示，包括：

S1，在基片11表面旋涂光刻胶，对光刻胶进行紫外光刻，得到刻蚀图案。

具体地，在清洗干净的基片11的表面旋涂光刻胶14；采用紫外光刻工艺使部分紫外光16通过掩膜版15对光刻胶14光刻，有机清洗获得如图所示的表面覆盖刻蚀图案的基片11。

S2，按照刻蚀图案刻蚀基片11，得到微孔结构12阵列。

S3，在所有微孔结构12内表面局部区域或全部区域蒸镀金属膜层13，清洗光刻胶，得到数字PCR芯片。

具体地，使用电子束蒸发，并通过调整基片11与蒸发源之间的角度，蒸镀高反射率金属材料。当蒸发方向与芯片表面始终垂直，可选择性的仅在微孔结构12底面和芯片表面制备膜层13；当蒸发方向与芯片表面不垂直且角度不断变化(基片旋转)，可在整个芯片表面(包含微孔侧壁)获得金属膜层13。蒸镀工艺完成后，清洗光刻胶即获得仅制备于微孔结构12金属膜层的数字PCR芯片。

实施例3

基于上述制备的数字PCR芯片，对DNA浓度进行了检测。具体地，将被用于进行PCR预混液分割。调节待测DNA分子浓度和微孔尺寸(芯片制备时)，使得每个微孔的预混液里包含有不大于1个待测DNA分子，之后将芯片进行油密封，并置于温度控制设备(PCR仪)上进行PCR反应。如图3所示，根据dPCR反应原理，含有目标分子的微孔在PCR反应进行中将逐渐产生大量特异性荧光分子，光源激发和高反射率金属膜层的共同作用将形成高强度荧光信号，称之阳性孔121；不含有目标分子的微孔因为在PCR反应完成后不含特异性荧光信号或仅含极少量杂质荧光信号，因此光源激发和高反射率金属膜层共同作用也无法形成较强荧光信号，称之阴性孔122；另有芯片上表面111因未制备金属膜层13产生非常微弱的杂散背景荧光。

基于上述反应结果，得到荧光信号增强作用的实验结果图，如图4所示。该结果是在除微孔结构12内表面膜层之外的其它实验和分析参数完全相同的条件下获得。请参见图4，左图为本发明所述的dPCR芯片的对荧光的增强结果图，右图是无金属膜层的dPCR芯片的荧光结果图。图中标识(1)是上述阳性孔121的荧光值，标识(2)是上述阴性孔122的荧光值，标识(3)是上述芯片表面的111的荧光值。对比可知，本发明实施例的数字PCR芯片具有显著增强阳性荧光信号的作用。

请参见图5，图中长虚线为普通PCR荧光曲线，实线为本发明实施例的数字PCR芯片所致的增强型荧光曲线。在相机检测灵敏度不变的前提下，若相机捕获相同强度荧光信号f(比如最小可识别强度)，本发明实施例的数字PCR芯片所需反应循环数c1远小于普通芯片所需反应循环数c2，循环次数越少，检测时间越短，即本发明实施例数字PCR芯片极大地缩短了检测时间，提高了检测效率。

虽然以上内容已经描述了本发明的示例性实施例，但是本领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的条件之下，可对芯片的设计和应用进行多种改变。例如，微孔的形状，微孔阵列的数量，膜层的厚度，或进行仅局限于微孔底面荧光的检测均可从上述示例变化，并根据期望进行配置。

综上所述，本发明提出一种数字PCR芯片及其制备方法，该芯片微孔内表面局部或全部制备高反射率金属膜层，使得芯片对特异性荧光信号的反射能力增加，提高信噪比，在较低循环数条件下即可获得可检测到的荧光信号，缩短检测时间，提高检测效率。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种数字PCR芯片，包括：

基片（11），所述基片（11）表面设有微孔结构（12）阵列，所述微孔结构（12）不贯穿所述基片（11），所述基片（11）的材质为硅或固体有机材料；

金属膜层（13），其形成于所述微孔结构（12）内表面的底面和侧壁，所述基片（11）表面除微孔结构（12）的其它区域无所述金属膜层（13）。

2.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，所述金属膜层（13）的材质为金、铜、钼、铝、银或金属氧化物。

3.根据权利要求1或2所述的数字PCR芯片，所述金属膜层（13）的厚度为5-2000 nm。

4.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，单个微孔结构（12）的宽度为5-2000 μm，深度为5-1000 μm。

5.根据权利要求4所述的数字PCR芯片，单个微孔结构（12）的宽度与深度的比值大于1。

6.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，所述微孔结构（12）的孔形状为圆形或n边形，其中，n≧3。

7.一种基于权利要求1-6任一项所述数字PCR芯片的制备方法，包括：

S1，在基片（11）表面旋涂光刻胶，对所述光刻胶进行紫外光刻，得到刻蚀图案；

S2，按照所述刻蚀图案刻蚀所述基片（11），得到微孔结构（12）阵列；

S3，在所述微孔结构（12）内表面的底面和侧壁蒸镀金属膜层（13），清洗光刻胶，得到所述数字PCR芯片。