CN114632559B - 基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字pcr芯片及制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片，包括微槽阵列，供电模块、时钟产生模块、数字控制逻辑模块、驱动模块、模数转换器、反向散射模块和上电复位模块。无线供电模块将产生标准电压与电流，时钟产生模块产生数字模块、模数转换器所需时钟以及阻抗测试激励，上电复位模块为数字电路产生复位信号，反向散射模块完成ADC输出信号到上位机的无线传输，所述数字控制逻辑完成对阵列单元的依次选通与时分测量。系统实现了检测单元与芯片的全集成化，无需外部测试板及复杂连接，同时采用电阻抗的测试原理，摒弃了荧光PCR所需的前置步骤以及昂贵仪器。本发明可以实现PCR的准确分析，具有简单、便携、低成本的优势。

Description

基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片及制作方法
技术领域
本发明属于电路技术领域，尤其涉及一种基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片及制作方法。
背景技术
PCR作为分子诊断中最为基础和广泛的技术，在医学诊断、基因复制、犯罪取证、考古等应用领域具有重要意义。其中第三代技术数字PCR，通过实现成千上万个微室的分化扩增与对单一微室的检测，得到数字化0/1数据，并由此计算PCR反应结果，实现了全新、精确、高效的绝对核酸定量技术。
随着集成电路及相关生物传感器工艺的发展，数字PCR可以被集成于一块小小的芯片并完成特定功能。集成有反应微室、电极、模数传感器、检测电路等的基因芯片,由于其便携小巧、低功耗、易操作、低成本的优势，逐渐打败了需要化学试剂的原有繁杂dPCR/qPCR装置，迅速建立市场。为了简化PCR系统，带来更加便携、高性价比的应用，人们将电化学技术应用至PCR系统。EIS式PCR技术逐渐进入市场。顾名思义，它采用了电化学阻抗的测量原理，通过测量微室单元内不同PCR循环后的阻抗变化，以判断是否完成反应。此类PCR系统的检测电极与样品直接接触，不需固定预处理与外置复杂光学仪器。通过在电极端施加特定频率幅度的信号，可以得到不同PCR循环下不同范围的实部或虚部阻抗，进行反应阴性/阳性的判断。交流信号对样品带来的损坏可以忽略不计。
纵观数字PCR行业发展，其总是向着便携、简便、低功耗的趋势进行演变。现有的传统荧光dPCR仪器往往不具备上述优点，无法满足临床使用或随时随地的诊疗目的。而现有的电化学检测扩增子通常采用伏安法测样品阻抗，为了增强所需检测的信号，通常采用前置标记过程，这导致了额外的插层剂或是需要额外的固定预处理来提高信噪比。相比伏安法，EIS系统通过测量不同频率下样品的复阻抗，虽有效解决了以上问题和缺陷，但已有相关研究及系统或是未做样品电极接触式实验，抑或是只测量了DNA浓度与频域阻抗的关系，而没有进行PCR的实时检测。此外，由于qPCR长足的发展时间以及较低的技术门槛，如今其仍占据着绝大部分的分子诊断临床应用技术市场。dPCR，尤其是电阻抗式dPCR仍存在很大的研究空间。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片及制作方法,以解决上述的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明的一种基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片及制作方法的具体技术方案如下：
一种基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片，包括微槽阵列，供电模块、时钟产生模块、数字控制逻辑模块、驱动模块、模数转换器、反向散射模块和上电复位模块，所述供电模块包括整流器和电源管理模块，所述时钟产生模块包括基于无线供电的时钟产生模块和片上振荡器；无线信号接入整流器，所述整流器连接电源管理模块，所述电源管理模块连接上电复位模块、基于无线供电的时钟产生模块、片上振荡器和数字控制逻辑模块，所述上电复位模块和片上振荡器连接数字控制逻辑模块，所述数字控制逻辑模块和片上振荡器连接微槽阵列，所述微槽阵列、电源管理模块连接驱动模块，所述驱动模块、基于无线供电的时钟产生模块、电源管理模块连接模数转换器，所述模数转换器连接反向散射模块，所述反向散射模块与天线连接；
所述微槽阵列由多个片上微槽单元组成，所述微槽阵列用做PCR反应物的容器；
所述供电模块采用无线供电方式给芯片进行供电；
所述基于无线供电的时钟产生模块用做ADC时钟；所述片上振荡器用作数字控制逻辑的时钟以及阻抗检测的方波激励；
所述数字控制逻辑模块包括开关阵列，开关阵列的每个开关分别与微槽阵列的每个微槽单元连接，所述数字控制逻辑模块用于产生控制码字，完成对片上微槽阵列的时分选通，一段时刻内只对一个微槽单元进行阻抗测试；
所述驱动模块对微槽单元的双电极两端电压进行放大及驱动，使其能够驱动后端模数转换器；
所述模数转换器用于完成电压信号从模拟到数字的转换，所述模数转换器为单端输出，检测得到的串行信号连接至反向散射模块；
所述反向散射模块用于完成无线信号的传输；
所述上电复位模块用于产生一个复位信号，作为数字模块以及ADC的复位输入。
进一步的，所述微槽单元由芯片主体、立方体溶液槽和底部双电极构成，所述立方体溶液槽和底部双电极设置在芯片主体上，所述底部双电极在立方体溶液槽围成的容腔内。
进一步的，所述底部双电极从下到上依次为第一粘附层、第二粘附层和电极层，所述第一粘附层为金属铝（Al），第二粘附层为金属铬（Cr），所述电极层为金属金（Au）、铂（Pt）中的一种。
进一步的，所述第一粘附层、第二粘附层和电极层组合形成铝（Al）-铬（Cr）-金（Au）结构。
进一步的，所述第一粘附层、第二粘附层和电极层的厚度分别为10-30nm、5-20nm、50-200nm。
进一步的，所述立方体溶液槽由SU8构成。
进一步的，所述立方体溶液槽的槽孔高度与槽孔内径为20um至100um。
进一步的，单一芯片主体上微槽单元密度为2.5*109-1.2*107个/m2。
本发明还公开了一种制备微槽阵列的方法，包括以下步骤：
步骤1：在设计芯片主体时预留金属铝开窗区作为每个立方体溶液槽的底部双电极的位置；
步骤2：在划片后的芯片主体上使用磁控溅射的方式制作覆盖金属铝开窗的第一粘附层，第一粘附层为金属铝（Al）；
步骤3：在丙酮中进行剥离，得到微槽单元的铝电极；
步骤4：使用去离子水进行清洗后，在芯片主体上电极区域以步骤2和步骤3同样的方式溅射金属铬（Cr）和金属金（Au），剥离得到铝（Al）-铬（Cr）-金（Au）电极；
步骤5：在芯片主体上旋涂SU8光刻胶，光刻并坚膜后得到光刻胶层，形成回字形的立方体溶液槽，所述回字形的立方体溶液槽即为微槽单元；
步骤6：最后用等离子机进行亲疏水性的改变，使反应物能够顺利进入微槽单元。
进一步地，所述步骤4使用去离子水进行清洗后，在芯片主体上电极区域以步骤2和步骤3同样的方式溅射金属铬（Cr）和金属铂（Pt）、剥离得到铝（Al）-铬（Cr）-金属铂（Pt）电极。
本发明的基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片及制作方法具有以下优点：本发明无需外部测试板及复杂连接，同时采用电阻抗的测试原理，摒弃了荧光PCR所需的前置步骤以及昂贵仪器。本发明可以实现PCR的准确分析，其简单、便携、低成本的优势使其在数字PCR分析领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明的数字PCR芯片系统框图；
图2 为本发明的片上微槽单元结构俯视图；
图3为本发明的片上微槽单元结构侧面视图；
图4 为本发明的全集成的片上微槽阵列俯视图；
图中标记说明：1、芯片主体；2、立方体溶液槽；3、底部双电极；31、第一粘附层；32、第二粘附层；33、电极层。
具体实施方式
为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合附图，对本发明一种基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片及制作方法做进一步详细的描述。
如图1所示，本发明的一种基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片，包括微槽阵列，供电模块、时钟产生模块、数字控制逻辑模块、驱动模块、模数转换器、反向散射模块和上电复位模块。供电模块包括整流器和电源管理模块，时钟产生模块包括基于无线供电的时钟产生模块和片上振荡器。
无线信号接入整流器，整流器连接电源管理模块，电源管理模块连接上电复位模块、基于无线供电的时钟产生模块、片上振荡器和数字控制逻辑模块，上电复位模块和片上振荡器连接数字控制逻辑模块，数字控制逻辑模块和片上振荡器连接微槽阵列，微槽阵列、电源管理模块连接驱动模块，驱动模块、基于无线供电的时钟产生模块、电源管理模块连接模数转换器，模数转换器连接反向散射模块，反向散射模块与天线连接。
微槽阵列由多个片上微槽单元组成，微槽阵列用做PCR反应物的容器。
供电模块采用无线供电方式给芯片进行供电，供电模块由整流器和电源管理模块组成。整流器输入为来自天线的信号，进行交流-直流的转化，为芯片工作进行供电，电源管理模块包括带隙基准电路和LDO，带隙基准电路产生与温度无关的多路基准电流，作为后续模块的输入；同时产生与温度无关的基准电压，作为LDO模块的输入标准，产生芯片所需的VDD电压值；LDO为低压差典型稳压器，输入为整流器输出与带隙基准的参考电压，其作用是通过一个负反馈将整流器带有一定纹波的电压输出稳定在所需VDD电压值。
时钟产生模块用于产生两个频率的时钟。分为基于无线供电的时钟产生模块和片上振荡器，基于无线供电的时钟产生模块是无线信号同时在发射端做一定调制，片上解调后可得所需频率的时钟信号，用做ADC时钟。片上振荡器用作数字控制逻辑的时钟以及阻抗检测的方波激励。
数字控制逻辑模块包括开关阵列，开关阵列的每个开关分别与微槽阵列的每个微槽单元连接，数字控制逻辑模块连接产生控制码字，完成对片上微槽阵列的时分选通，一段时刻内只对一个微槽单元进行阻抗测试。
驱动模块为差分输入差分输出结构，对微槽单元的双电极两端电压进行放大及驱动，使其能够有效驱动后端模数转换器（SAR-ADC）。
模数转换器包括SAR逻辑、CDAC、采样开关、CDAC开关，用于完成电压信号从模拟到数字的转换。模数转换器为单端输出，检测得到的串行信号连接至反向散射模块。
反向散射模块用于完成无线信号的传输。
上电复位模块用于产生一个复位信号，当系统上电时，电源信号将发生从0V至VDD的一个阶跃，当电压靠近VDD时，该模块产生一个复位信号，作为数字模块以及ADC的复位输入，保证正常工作。
如图2、图3所示，微槽单元由芯片主体1、立方体溶液槽2和底部双电极3构成。立方体溶液槽2和底部双电极3设置在芯片主体1上，底部双电极3在立方体溶液槽2围成的容腔内。底部双电极3从下到上依次为第一粘附层31、第二粘附层32和电极层33。第一粘附层31为10-30nm厚的金属铝（Al），第二粘附层32为5-20nm厚的金属铬（Cr），最上面一层电极层33选自金属金（Au）、铂（Pt）中的一种，厚度为50-200nm，优选为金属金（Au），第一粘附层31、第二粘附层32和电极层33组合形成铝（Al）-铬（Cr）-金（Au）结构。立方体溶液槽2由SU8构成，耐热、绝缘、化学稳定性较好，根据实际应用，槽孔高度与槽孔内径可达20um至100um。如图4所示，单一芯片主体1上微槽单元数量视芯片面积而定，密度可达2.5*109-1.2*107个/m2。
制备上述微槽阵列包括以下步骤：
步骤1： 在设计芯片主体1时预留金属铝开窗区作为每个立方体溶液槽2的底部双电极3的位置，厚度约为4 um。
步骤2：在划片后的芯片主体1上使用磁控溅射的方式制作覆盖金属铝开窗的第一粘附层2，第一粘附层2为6-26nm厚的金属铝（Al）。
步骤3：在丙酮中进行剥离，得到微槽单元的铝电极。
步骤4：使用去离子水进行清洗后，在芯片主体1上电极区域以步骤2和步骤3同样的方式溅射金属铬（Cr）和金属金（Au）或金属铂（Pt）、剥离得到Al-Cr-X（X为Au或Pt）电极，厚度分别为10-30nm、5-20nm、50-200nm。
步骤5：在芯片主体1上旋涂20- 100um厚度的SU8光刻胶，光刻并坚膜后得到具有较好化学稳定性、耐热性的光刻胶层，形成回字形的立方体溶液槽2，所述回字形的立方体溶液槽2即为微槽单元，做PCR反应物容器用。
步骤6：最后用等离子机进行亲疏水性的改变，使反应物能够顺利进入微槽单元。
使用时，首先，整个PCR芯片采用无线供电的方式进行供电，选取供电频率处于医疗电子频段内。供电所用的无线信号同时在发射端做一定调制，片上解调后可得所需频率的时钟信号，用做ADC时钟。信号发生器产生的方波，作为数字控制逻辑的时钟以及阻抗检测的激励。该频段的选择源自PCR样品测试结果，选用了阻值变化最为敏感的频段范围。方波信号经过样品，获得阻抗信息相关的电压值（U=I*Z）并经过线性放大以及驱动后输入模数转换器进行采样，反向散射模块传输信息并在PC端进行离散傅里叶变换（DFT）数据处理，得到阻抗信息，从而判断阴性/阳性。
本数字PCR芯片的检测原理基于实际测试结果进行设计。对于特定体积的溶液，依次进行不同数量循环周期的PCR反应，应用电化学工作站CHI660E进行电阻抗谱测量，发现随着PCR反应进程的增加，样品的阻抗值降低，并在10KHz及更低的频段处显示出较为明显的区别。因此对于一个微槽单元，测量其PCR反应前后的阻抗值并进行比较，即能得出该微槽单元的阴性/阳性状态，并进行最终PCR判断。对于一个微槽单元的阻抗测量，采用方波作为激励信号，在实现低功耗的同时，可以得到高次谐波作为附加激励信号。从而实现同时在三个频点下f0（基波）、3f0（三次谐波）、5f0（五次谐波）的阻抗测量，并在上位机端设计投票算法。由于潜在误差因素，采用单一频率进行单次测量会存在较大不确定性，因此采用多频率测量后进行投票的方式，当大于等于两个频点都发生了符合预期的阻值增加，即判断为阳性，在提高检测效率的同时增强了准确性。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (8)

1.一种基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片，包括微槽阵列，供电模块、时钟产生模块、数字控制逻辑模块、驱动模块、模数转换器、反向散射模块和上电复位模块，其特征在于，所述供电模块包括整流器和电源管理模块，所述时钟产生模块包括基于无线供电的时钟产生模块和片上振荡器；无线信号接入整流器，所述整流器连接电源管理模块，所述电源管理模块连接上电复位模块、基于无线供电的时钟产生模块、片上振荡器和数字控制逻辑模块，所述上电复位模块和片上振荡器连接数字控制逻辑模块，所述数字控制逻辑模块和片上振荡器连接微槽阵列，所述微槽阵列、电源管理模块连接驱动模块，所述驱动模块、基于无线供电的时钟产生模块、电源管理模块连接模数转换器，所述模数转换器连接反向散射模块，所述反向散射模块与天线连接；
所述微槽阵列由多个片上微槽单元组成，所述微槽阵列用做PCR反应物的容器；
所述供电模块采用无线供电方式给芯片进行供电；
所述基于无线供电的时钟产生模块用做ADC时钟；所述片上振荡器用作数字控制逻辑的时钟以及阻抗检测的方波激励；
所述数字控制逻辑模块包括开关阵列，开关阵列的每个开关分别与微槽阵列的每个微槽单元连接，所述数字控制逻辑模块用于产生控制码字，完成对片上微槽阵列的时分选通，一段时刻内只对一个微槽单元进行阻抗测试；
所述驱动模块对微槽单元的双电极两端电压进行放大及驱动，使其能够驱动后端模数转换器；
所述模数转换器用于完成电压信号从模拟到数字的转换，所述模数转换器为单端输出，检测得到的串行信号连接至反向散射模块；
所述反向散射模块用于完成无线信号的传输；
所述上电复位模块用于产生一个复位信号，作为数字模块以及ADC的复位输入。
2.根据权利要求1所述的基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片，其特征在于，所述微槽单元由芯片主体（1）、立方体溶液槽（2）和底部双电极（3）构成，所述立方体溶液槽（2）和底部双电极（3）设置在芯片主体（1）上，所述底部双电极（3）在立方体溶液槽（2）围成的容腔内。
3.根据权利要求2所述的基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片，其特征在于，所述底部双电极（3）从下到上依次为第一粘附层（31）、第二粘附层（32）和电极层（33），所述第一粘附层（31）为金属铝（Al），第二粘附层（32）为金属铬（Cr），所述电极层（33）为金属金（Au）、铂（Pt）中的一种。
4.根据权利要求3所述的基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片，其特征在于，所述第一粘附层（31）、第二粘附层（32）和电极层（33）组合形成铝（Al）-铬（Cr）-金（Au）结构。
5.根据权利要求3所述的基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片，其特征在于，所述第一粘附层（31）、第二粘附层（32）和电极层（33）的厚度分别为10-30nm、5-20nm、50-200nm。
6.根据权利要求2所述的基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片，其特征在于，所述立方体溶液槽（2）由SU8构成。
7.根据权利要求6所述的基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片，其特征在于，所述立方体溶液槽（2）的槽孔高度与槽孔内径为20um至100um。
8.根据权利要求1所述的基于电阻抗检测的片上微槽阵列数字PCR芯片，其特征在于，单一芯片主体（1）上微槽单元密度为2.5*109-1.2*107个/m2。
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