CN105606671A - 一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的检测方法及其应用。本发明主要是利用经典巯基自组装的方式将能够与PARP特异结合的单链DNA(c-kit-1)修饰于金电极表面，经处理使c-kit-1形成四聚体构型；与PARP孵育后，加入该酶特定的催化底物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，即可促使PARP自催化产生一条带有高负电荷的聚腺苷二磷酸核糖(PAR)；利用PAR的负电荷吸附带正电荷的电信号分子六氨合钌(RuHex)，通过电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过电化学信号与PARP浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的电化学信号，通过计算即可实现PARP的灵敏检测。该方法具有好的重复性，高的灵敏度，可应用于PARP及其抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)的检测。

Description

一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的检测方法
技术领域
本发明涉及一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的检测方法，特别是一种PARP检测的电化学方法，属于分析化学领域。
背景技术
多聚腺苷二磷酸核糖基化是由PARP家族所催化的一类必不可少的蛋白质翻译后修饰过程。在该过程中，PARP由特定的DNA激活，对底物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)进行切割，使其裂解成为烟酰胺和腺苷二磷酸核糖(ADP核糖)，并将后者聚合至受体蛋白，通过若干重复反应，即可形成一个线性或分枝结构的ADP-核糖聚合物(PAR)。该聚合物一般含有200个左右的ADP核糖单元，同时具有很高的电负性。人体内约90％的多聚腺苷二磷酸核糖基化修饰反应，都是由PARP所完成的，它在DNA修复、转录调控、细胞凋亡等方面起到重要作用。同时，PARP抑制剂也是有效的癌症治疗辅助药物。
现今，PARP的常见检测技术主要包括放射性免疫法、荧光法以及酶联免疫法等。这些检测方法往往需要昂贵的仪器，同时需要对催化底物进行放射性标记或酶标记。众所周知，标记过程往往是非常耗时且昂贵，甚至可能会导致生物分子的变性。电化学检测技术具有设备简单，价格低廉、灵敏度高、简便快捷，同时可以实现无标记检测等优点，近年来，被成功的应用于蛋白质蛋白糖基化和磷酸化等后修饰过程的检测。
发明内容
本发明的目的是发挥电化学检测技术的优势，建立一种简单、无需标记且成本低廉，同时又具有高灵敏度的PARP检测方法。
本发明的技术方案：一种PARP的电化学检测方法，利用经典巯基自组装的方式将能够与PARP特异结合的单链DNA(c-kit-1)修饰于金电极表面，经处理使c-kit-1形成四聚体构型；与PARP孵育后，加入该酶特定的催化底物NAD，促使PARP发生自催化产生一条带有高负电荷的聚ADP核糖(PAR)；利用PAR的高负电性吸附带正电荷的电信号分子六氨合钌(RuHex)，利用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过制定标准曲线，即可实现PARP及其抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)的灵敏检测。
方法包括以下步骤：金电极的预处理、c-kit-1修饰电极的组装、样品与修饰电极的孵育和酶催化、PARP的电化学检测。
(1)金电极的预处理
采用经典的预处理方式进行金电极的预处理。具体步骤如下：用1微米、0.3微米的三氧化二粉末分别对直径为3mm金圆盘电极进行抛光，之后用酒精和超纯水分别超声5分钟。清洗之后将金电极分别置于水虎鱼(浓硫酸∶H2O2的体积比＝3∶1)和50％的硝酸溶液中浸泡5分钟和30分钟。之后将处理好的电极置于0.5MH2SO4中，在0V-1.5V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速参数设置为0.1V/s，直至达到稳定后，用氮气吹干电极表面。
(2)c-kit-1修饰电极的组装
将上述(1)中经过经典方法预处理的金电极浸泡于100μL含0.2μMc-kit-1的固定溶液(10mMTris-HCl，10mMTCEP，0.1MNaCl，pH7.4)室温孵育12小时，再将该电极浸泡于含1mM巯基己醇溶液1小时。用蒸馏水冲洗后，再将电极浸泡于100μL的四聚体形成溶液(50mMTris-HCl，100mMKCl，pH7.4)，放置于95℃孵育5分钟后，缓慢冷却至室温(约6小时)，促使c-kit-1形成四聚体构型。
上述c-kit-1的序列为：5′-SH-CCCGGGCGGGCGCGAGGGAGGGGAGG-3′。
(3)样品与修饰电极的孵育和酶催化
将上述(2)中c-kit-1修饰的金电极与100μL含有不同浓度PARP的反应溶液(50mMTris-HCl，50mMKCl，2mMMgCl2，50μMZn(OAc)2，pH7.4)25℃孵育1小时，再将电极浸泡于100μL含有500μMNAD反应溶液中，25℃孵育1小时。
(4)PARP的电化学检测
将经过上述(3)处理的电极置于5mL含5μM六氨合钌(RuHex)的缓冲溶液(10mMTris-HCl，pH7.4)中，进行电分析定量检测。本检测采用的电化学工作站(CHI660E)，以饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极。使用的扫描方法为方波伏安法，参数设置：初始电位-0.5V，终止电位-0.2V，电位增量0.004V，振幅0.025V，频率30Hz。PARP越多，吸附的电信号分子RuHex也就越多，因此，得到的电化学信号也就越大。以RuHex的电化学信号为纵坐标，PARP的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算PARP的浓度，即可实现PARP的灵敏检测。
(5)3-AB的检测步骤如下：
不同浓度的3-AB分别与100μL含1U的PARP的反应溶液于4℃孵育12小时。将经过(2)处理的c-kit-1修饰金电极与经3-AB处理的PARP孵育，孵育的过程同(3)，再经(4)的检测过程，得到经不同浓度3-AB处理的PARP的电化学信号，绘制标准曲线，计算出的3-AB浓度。
在0.01U-1U范围内，电信号随着PARP浓度的升高而增加，电信号与浓度存在线性关系；在1nM-50nM的范围内，电信号随3-AB浓度的升高而降低，电信号与浓度存在线性关系。
本发明的有益效果：方法简便快速、灵敏度高，实现了PARP及其抑制剂的无标记检测，简化了实验步骤，避免了标记过程，对各类疾病包括癌症的监控与治疗具有重要意义。
附图说明
图1：PARP的检测原理图。
图2：不同浓度PARP存在下，电化学信号值与PARP浓度关系标准曲线图。
图3：不同浓度3-AB处理1UPARP，电化学信号值与3-AB浓度关系标准曲线图。
具体实施方式
实施例1.PARP标准溶液电化学信号值-浓度标准曲线图的测定
将100μL不同浓度PARP标准液分别按照上述步骤与c-kit-1修饰的金电极孵育、催化并测电化学信号。如图2所示电化学信号值(ip)与PARP浓度的变化关系曲线，在PARP0.01U-1U范围内，ip与浓度存在线性关系，线性回归方程为y＝-0.8912-2.17559x，R2＝0.998，式中y为SWV的峰电流ip(μA)，x为PARP的浓度(U)。
实施例2.3-AB标准溶液电化学信号值-浓度标准曲线图的测定
不同浓度的3-AB分别与100μL含1U的PARP的反应溶液于4℃孵育12小时。分别按照上述步骤与c-kit-1修饰的金电极孵育、催化并测电化学信号。如图3所示电化学信号值(ip)与3-AB浓度的变化关系曲线，3-AB在1nM-50nM范围内，ip与浓度存在线性关系，线性回归方程为y＝-3.32915+0.03898x，R2＝0.997，式中y为SWV的峰电流ip(μA)，x为3-AB的浓度(nM)。

Claims (4)

1.一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的检测方法，其特征在于利用经典巯基自组装的方式将能够与PARP特异结合的单链DNA(c-kit-1)修饰于金电极表面，经处理使c-kit-1形成四聚体构型；与PARP孵育后，加入该酶特定的催化底物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，促使PARP发生自催化产生一条带有高负电荷的聚腺苷二磷酸核糖(PAR)；利用PAR的负电荷吸附带正电荷的电信号分子六氨合钌(RuHex)，利用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过制定标准曲线，即可实现PARP及其抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)的灵敏检测。
2.根据权利要求1所述的PARP的检测方法，其特征是利用经典巯基自组装的方式将c-kit-1修饰于金电极表面，经处理使c-kit-1形成四聚体构型。该修饰过程，首先将经过经典方法预处理的金电极浸泡于100μL含0.2μMc-kit-1的固定溶液(10mMTris，10mMTCEP，0.1MNaCl，pH7.4)室温孵育12小时，再将该电极浸泡于1mM巯基己醇溶液1小时。用蒸馏水冲洗后，再将电极浸泡于100μL四聚体形成溶液(50mMTris-HCl，100mMKCl，pH7.4)，放置于95℃孵育5分钟后，缓慢冷却至室温(约6小时)，促使c-kit-1形成四聚体构型。
3.根据权利要求1所述的PARP的检测方法，其特征是c-kit-1修饰的金电极与PARP孵育后，加入该酶特定的催化底物NAD，促使PARP自催化产生一条带有高负电荷的PAR。上述2中c-kit-1修饰的金电极与100μL含有不同浓度PARP的反应溶液(50mMTris-HCl，50mMKCl，2mMMgCl2，50μMZn(OAc)2，pH7.4)25℃孵育1小时，再将电极浸泡于100μL含有500μMNAD反应溶液中，25℃孵育1小时。
4.根据权利要求1所述的PARP的检测方法，其特征是利用PAR的负电荷吸附带正电荷的电信号分子六氨合钌(RuHex)，利用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过制定标准曲线，通过电信号与PARP浓度的关系，即可实现PARP酶活性的灵敏检测。将经过上述3处理的电极置于5mL含5μMRuHex的10mMTris-HCl缓冲溶液(pH7.4)中，进行电化学定量分析。扫描方法为方波伏安法，参数设置：初始电位-0.5V，终止电位-0.2V，电位增量0.004V，振幅0.025V，频率30Hz。
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