JP2009545736A - 生細胞を調べるための走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、非常に局所的で制御された圧力または力を表面に加える手段を提供する。この手段は、細胞表面の弾性を測定したり、機械的刺激に反応して電気生理学的または化学的な信号を生成する様々な生物学的構造体を刺激したりするために用いられ得る。
以下の実施例は、ヒトおよびラットのDRG知覚ニューロンの研究において、本発明の非接触式SICM法を従来の接触式SICM法と比較して調べたものである。
我々は、SICMプローブを用いて、機械的刺激を与えるのに用いられる大きなプローブでは通常アクセスできない、膜のサブミクロン領域を選び出し、機械的に刺激した。我々は、SICM(イオンスコープ社(Ionscope Limited)、英国ロンドン)を用いて、形状の画像を得て細胞を機械的に刺激した。生細胞の形状の画像を撮るためのSICMの基本的な設定については、これまでに説明されている(Korchevら、バイオフィジカル・ジャーナル(Biophys. J.)、1997a、73:653-8、Korchevら、ジャーナル・オブ・マイクロスコピー(J. Microsc.)、1997b、188(Pt1):17-23)。簡単に言うと、本SICMでは、試料に対して垂直に配置されたパッチクランプナノピペットを走査型プローブとして用いる。ピペットは、3軸ピエゾ平行移動ステージに取り付けられており、細胞表面に接近し、ピペットを通るイオン電流を一定に保つSICMフィードバック制御を用いて先端と試料との離隔距離を一定に維持しながら、細胞表面を走査する(図1B)。SICM制御部が細胞の表面画像を生成し(図1C)、細胞の、識別された特定の領域または構造に対してピペットが直接、正確に、膜から約100nm以内にまで接近できるようにする。そして、SICMのピペットプローブを用いて、パッチクランプによる電気生理学的手法を同時に施しながら細胞を機械的に刺激し、膜電流を測定したり細胞内のCa2+イメージングを行ったりすることができる(図1A)。
我々は、SICMのナノピペットプローブを用いて、2つの異なる種類の機械的刺激を加えた。第1の手法である「接触法」では、SICMフィードバック制御をオフにし、ピエゾ制御によって、決められた距離および継続時間ずつピペットを細胞膜に対して垂直に下げた(図2A)。この方法では、ピペットが膜の小さな領域(〜700nm=ピペット先端の外径)に物理的に接触して押し下げ、ピペットの物理的な閉塞によりピペットを通って流れる電流(I/Imax)が減少した(図2C)。第2の手法は「非接触法」であり、ピペットの先端から細胞に対する圧力噴射の印加と同時に、ピエゾ制御によってピペットを細胞膜に向けて垂直に下げた(図2B)。下向き刺激ステップを行う数秒前にSICMピペットの軸部を介して正圧(13〜40kPa)を加えてピペットの先端から液体を噴出させ、ステップ直後に停止した。溶液噴射が膜との接触を防ぎ、それによりピペットの閉塞を防いだが、このことは、ピペットを通る電流の流れに著しい減少が無かったことにより確認された(図2D)。この方法は、細胞膜に対する接触および物理的損傷を防ぐので、細胞に対する「非接触」の機械的刺激をもたらす。
ニューロサイエンスレター(Neurosci. Lett.)2006年399:51-56のAnandらの記述のように、ヒトDRG知覚ニューロンを準備した。簡単に言うと、2週間前までの、交通事故における腕神経叢裂離、すなわち中枢軸索切断の5人の成人男性患者(n=5、年齢幅は21〜28歳)から、全頸部DRGを得た。神経修復に必須の部分として神経再建術の過程においてDRGを切除し、患者の書面によるインフォームドコンセントと地域の倫理委員会の承認を得てこれを研究した。各患者からの2つないし3つの頸神経節を細かく切断し、ペニシリン(100μg/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、0.5%ディスパーゼ(8U/mg、GIBCO)、および0.2%コラゲナーゼ(タイプIV、ワージントン社(Worthington)、168U/mg)を含有するハムF12培地(GIBCO)にて、37℃で3時間、酵素消化し、続けてハムF12+10%ウシ胎仔血清(fetal calf serum)にて機械的解離を行った。約3000cells/mlを含有する250μlの細胞懸濁液を、ポリ−L−リジン(20μg/ml、シグマ社(Sigma))およびラミニン(20μg/ml、シグマ社)でコーティングされた8ウェルのパーマノックス製Lab−Tekスライド(ナルジェヌンク社(Nalge Nunc Int.))上に蒔いた。2mlのハムF12+10%FCSをすべてのウェルに加え、NGF−7S(100ng/ml、シグマアルドリッチ社(Sigma-Aldrich))、rhGDNF(50ng/ml)、およびrhNT3(50ng/ml)をウェルの半数に加えた。8%CO2/airの湿潤環境下、37℃で5日間、細胞を培養し、培地は3日間で交換した。
カバースリップで培養したDRG知覚ニューロンを潅流チャンバー(ワーナー社(Warner Instruments Inc.)のRC-25)へ移し、分離型のパッチクランプヘッドステージおよび電極を用いて、標準的な全細胞電圧クランプ記録を行った。パッチ電極は、SICMピペットと同じガラス毛細管から作ったものであり、10〜16MΩのピペット抵抗を実現した。パッチクランプピペット溶液は、CsClを130mM、NaClを5mM、EGTA−Naを5mM、および、pH7.3のHEPESを10mM含有した。電解槽およびSICMピペット溶液は、NaClを140mM、KClを5mM、MgCl2を2mM、CaCl2を1.8mM、グルコースを10mM、およびpH7.4のHEPESを10mM含有した。無機塩および試薬はすべてシグマアルドリッチ社(Sigma-Aldrich Company Ltd.)(シグマ社、英国ジリンガム)のものとした。Axopatch 200Bパッチクランプ増幅器およびClampex-pClamp 9(アクソン社(Axon Instruments)、カリフォルニア州バーリントン)を用いて、パッチクランプした細胞にパッチ電極を通じて−60mVの保持電位をかけ、記録を10kHzで継続してサンプリングして2kHzでオンラインでフィルタ処理した。ソフトウェアを用いて容量性電流および/または線形のリーク電流を減じた。Clampfit-pClamp 9およびOrigin 5(マイクロキャル社(Microcal)、マサチューセッツ州ノーサンプトン)を用いてデータをさらに解析した。実験はすべて23±2℃の室温にて行った。
DRG知覚ニューロンにfluo-4アセトキシメチルエステル(オレゴン州ユージーンのモレキュラープローブス社(Molecular Probes)のfluo-4 AM)を4μM、室温で1時間添加した。残ったfluo-4を洗浄し、続いて15分間の脱エステル化の後、潅流チャンバーへ移した。fluo-4を450〜480nmにて励起し、放射された520nmを超える蛍光を、増感CCD(英国サセックス州のフォトニックサイエンス社(Photonic Science)のCoolView IDIカメラシステム)をニコンのTE-2000倒立顕微鏡につなげてImage-Pro Plusソフトウェア(メディアサイバネティクス社(Media Cybernetics)、英国ウォーキンガム)で制御したものを用いて検出することによって、Ca2+の変動を撮像した。画像は、毎秒2フレーム、個々のフレーム露出時間100msにて取得した。対応するタイムトレースが、関心領域における初期蛍光に対する蛍光の比(F/F0)として、正規化された蛍光強度を示す。
我々は、Ca2+イメージング実験を用いて、機械的刺激に対するDRG知覚ニューロンの反応の特徴を明らかにした。まず、細胞体の小領域(<1μm2)に接触接近を用いて、DRGニューロンを刺激した。図3に、SICMピペットがヒトDRGニューロンの表面に1μmを2ステップ分だけ接近した時の結果を示す。第1ステップでは、ニューロンは[Ca2+]iのわずかな増加を示す。fluo-4の蛍光強度は、基底水準(図3A、フレーム1)からフレーム2の水準まで増加する。ピペットをさらに1μm進めると、Ca2+の反応のピークとなって、[Ca2+]iがさらに上昇する(図3A、フレーム3)。約2分後には[Ca2+]iは基底レベルに戻り(図3A、フレーム4)、そこで2μmの第3の刺激によって再び[Ca2+]iが上昇する(図3A、フレーム5)。我々は、両者、つまりヒト(n=12)およびラット(n=24)のDRGニューロンについて、接触接近法による評価を行った。しかしながら、この接触法を用いるにあたっては大きな限界があった。所与の実験において、成功した順次刺激の数が限られたのである。ピペットが細胞の表面に接触するたびに、ピペットが膜にくっついて、細胞を物理的に損傷させる恐れがある。これは、蛍光色素分子が細胞から漏れ出て蛍光が急激に低下したこと(図3A、フレーム6)から明らかである。この基準によれば、接触手順は研究対象のニューロン(n=36)の64±8%を「損傷させた」。
Claims (15)
- 走査型プローブ顕微鏡法を用いて表面を調べる方法であって、走査型プローブを前記表面へ接近させ、一定の距離を維持するように前記表面に対する前記プローブの位置を制御することを含み、前記プローブを通る液体の調整流によって前記表面に圧力を加え、続けて前記プローブの位置を監視することを特徴とし、前記プローブの動きが、結果として生じる前記表面の動きを示すようになっている方法。
- 前記表面に正圧を加えることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記表面に負圧を加えることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記プローブは、マイクロピペットまたはナノピペットであることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 調べられる前記表面は、細胞構造または細胞内構造であることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記表面は、液体の表面であることを特徴とする請求項1ないし4のいずれかに記載の方法。
- 前記液体は、乳濁液であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記表面は、非生物学的構造のものであることを特徴とする請求項1ないし4のいずれかに記載の方法。
- 前記走査型プローブ顕微鏡法は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法であることを特徴とする上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記表面の、または前記表面における電気的または機械的な変化を監視するための上記請求項のいずれかに記載の方法。
- 細胞の電気生理学的または化学的な変化を誘発する方法であって、走査型プローブを前記細胞の表面へ接近させ、前記プローブを通る液体の調整流によって前記表面に既定圧力を加え、前記細胞の電気生理学的または化学的な信号の変化を監視することを含む方法。
- 前記電気生理学的または化学的な信号は、細胞に存在するイオンチャネルに関連したものであることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法を用いて前記プローブを前記細胞へ接近させることを特徴とする請求項11または12に記載の方法。
- 表面を調べる装置であって、走査型プローブ顕微鏡と、前記プローブを通る液体の調整流によって前記表面に圧力を加える手段とを備える装置。
- 前記走査型プローブ顕微鏡は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡であることを特徴とする請求項14に記載の装置。
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