JP2018040759A - 酵母細胞の力学特性の測定方法、及び力学特性に基づいた酵母細胞のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】原子間力顕微鏡を用いた酵母細胞の力学特性の測定に際し、測定による偏差（誤差）が充分に低減された測定方法を提供すること。【解決手段】原子間力顕微鏡を用いた酵母細胞の力学特性の測定方法であって、支持体表面に固定化された酵母細胞を用意するステップと、単一の酵母細胞の複数の測定対象領域に対して原子間力顕微鏡を用いた測定を行い、各測定対象領域における高さ及び力学特性の測定値を得るステップと、酵母表面の傾斜角が２０°以下になる測定対象領域のうち、いずれか１つの測定対象領域における力学特性の測定値を当該酵母細胞の力学特性として、又はいずれか２つ以上の測定対象領域における力学特性の測定値の統計値を当該酵母細胞の力学特性として決定するステップと、を含む、酵母細胞の力学特性の測定方法。【選択図】図３

Description

本発明は、原子間力顕微鏡を用いた酵母細胞の力学特性の測定方法、及び力学特性に基づいた酵母細胞のスクリーニング方法に関する。

原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＡＦＭ）は、酵母等の微生物細胞の剛性等の力学特性を単一の細胞単位で計測できる手法である（非特許文献１及び非特許文献２）。

酵母細胞に限らず、生細胞は、同種の細胞であっても、個々の細胞の個性（例えば、形態、機能及び力学特性）には大きなばらつきが存在する。したがって、細胞の力学特性から細胞の状態を識別することが可能になることが期待される。現在、細胞単位での力学的識別については、動物細胞（正常細胞とがん細胞の力学的識別）を用いた研究報告がある（非特許文献３）。

細胞単位での力学的識別を高い精度で行うためには、個々の細胞の個性に由来する偏差の定量化の精度を上げる必要がある。細胞壁を持たない動物細胞においては、最近、ＡＦＭを用いて多数の単一細胞の力学特性の測定値から測定誤差を除去して細胞本来の個性に由来する偏差を抽出することに成功している（非特許文献４）。他方、細胞壁を有し、動物細胞と比べて弾性率が数桁大きい酵母細胞においては、ＡＦＭを用いて多数の単一細胞の力学特性の計測には成功しているが（非特許文献５）、細胞本来の個性に由来する偏差を定量化するには至っていない。

Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６年，８２（１５），ｐｐ．４７８９−４８０１ Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００８年，３（７），ｐｐ．１１３２−１１３８ Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７年，２（１２），ｐｐ．７８０−７８３ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３年，１０５，ｐｐ．１０９３−１１０２ Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１５年，１０（１），ｐｐ．１９９−２０４

細胞本来の個性に由来する偏差を定量化するには、非特許文献４に記載されるように細胞本来の個性に由来する偏差と測定による偏差（測定誤差）とを分離するか、又は測定による偏差（測定誤差）を最小限に抑えることが必要である。

本発明は、原子間力顕微鏡を用いた酵母細胞の力学特性の測定に際し、測定による偏差（測定誤差）が充分に低減された測定方法を提供することを目的とする。本発明はまた、細胞単位での力学的識別の精度がより高められた、力学特性に基づいた酵母細胞のスクリーニング方法を提供することも目的とする。

本発明は、原子間力顕微鏡を用いた酵母細胞の力学特性の測定方法であって、支持体表面に固定化された酵母細胞を用意するステップと、単一の酵母細胞の複数の測定対象領域に対して原子間力顕微鏡を用いた測定を行い、各測定対象領域における酵母細胞の高さ及び力学特性の測定値を得るステップと、酵母表面の傾斜角が２０°以下になる測定対象領域のうち、いずれか１つの測定対象領域における力学特性の測定値を当該酵母細胞の力学特性として、又はいずれか２つ以上の測定対象領域における力学特性の測定値の統計値を当該酵母細胞の力学特性として決定するステップと、を含む、酵母細胞の力学特性の測定方法を提供する。

本発明は、原子間力顕微鏡を用いた酵母細胞の力学特性の測定において、力学特性の測定値のばらつきが、測定対象領域における細胞形状（細胞表面の傾斜）に依存するという知見を見出したことに基づく。すなわち、本発明に係る測定方法は、単一の酵母細胞に対して複数の測定対象領域において高さ（細胞表面と支持体との鉛直方向の距離）及び力学特性を測定し、得られた測定値のうち、酵母表面の傾斜角が所定値以下になる測定対象領域における測定値を選択して酵母細胞の力学特性を決定するものであるため、測定による偏差（測定誤差）が充分に低減される。

本発明に係る測定方法では、上記統計値が、平均値であってもよい。酵母表面の傾斜角が所定値以下になる複数の測定対象領域における測定値の平均値を採用することにより、より精度よく酵母細胞の力学特性を決定することができる。

本発明に係る測定方法では、上記力学特性が、弾性率及び吸着力のいずれか一方、又は両方であってもよい。弾性率は、酵母細胞の弾性（例えば、形状を維持する能力）の指標となる。吸着力は、酵母細胞表面の物性（例えば、細胞間相互作用の能力）の指標となる。

本発明に係る測定方法では、複数の測定対象領域が、１辺６〜１０μｍの四角形領域を複数の１辺１〜３μｍの四角形領域に分割した各領域であることが好ましい。これにより、各測定対象領域における酵母細胞の高さ及び力学特性の測定値をより効率よく得ることができる。

本発明はまた、力学特性に基づいた酵母細胞のスクリーニング方法であって、複数の被験酵母細胞が支持体表面に固定化されたサンプルを用意するステップと、各被験酵母細胞に対して本発明に係る測定方法を実施し、各被験酵母細胞の力学特性を決定するステップと、決定された力学特性に基づき所望の酵母細胞を選抜するステップと、を含む、力学特性に基づいた酵母細胞のスクリーニング方法を提供する。

本発明に係るスクリーニング方法は、各被験酵母細胞の力学特性を決定する際に、本発明に係る測定方法を採用しているため、各被験酵母細胞の力学特性の値は、測定による偏差（測定誤差）が充分に低減されており、各被験酵母細胞本来の個性に由来する偏差が充分に反映されている。このため、本発明に係るスクリーニング方法は、細胞単位での力学的識別の精度がより高められている。

本発明に係るスクリーニング方法は、原子間力顕微鏡に付設された細胞採取手段により、選抜された酵母細胞を単離するステップを更に含むことが好ましい。単離した酵母細胞は、所望の用途に使用することができる。

本発明によれば、原子間力顕微鏡を用いた酵母細胞の力学特性の測定に際し、測定による偏差（測定誤差）が充分に低減された測定方法を提供することができる。また、本発明によれば、細胞単位での力学的識別の精度がより高められた、力学特性に基づいた酵母細胞のスクリーニング方法を提供することができる。

ＡＦＭを用いた酵母細胞の力学特性の測定方法を説明するための模式図である。 単一の酵母細胞の複数の測定対象領域において酵母細胞の高さ及び力学特性を測定する方法を説明するための模式図である。 複数の測定対象領域の設定方法の一例を示す模式図である。 弾性率（ヤング率Ｅ（Ｐａ）の対数表示ＬｏｇＥ）、ＬｏｇＥの標準偏差（σ_Ｅ（Ｐａ））及び酵母表面の傾斜角（Ｓｌｏｐｅ（°））を酵母細胞の頂点（高さが最大となる点）からの距離（鉛直方向の距離（Ｈｅｉｇｈｔ）及び鉛直方向に垂直な面における距離（Ｄｉｓｔａｎｃｅ））の関数としてプロットしたグラフである。 一実施形態に係る細胞採取手段を示す模式図である。 試験例２の結果を示す図である。 試験例３の結果を示す図である。 試験例４の結果を示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

〔酵母細胞の力学特性の測定方法〕
本実施形態に係る酵母細胞の力学特性の測定方法は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いるものであり、支持体表面に固定化された酵母細胞を用意するステップと、単一の酵母細胞の複数の測定対象領域に対して原子間力顕微鏡を用いた測定を行い、各測定対象領域における酵母細胞の高さ及び力学特性の測定値を得るステップと、酵母表面の傾斜角が２０°以下になる測定対象領域のうち、いずれか１つの測定対象領域における力学特性の測定値を当該酵母細胞の力学特性として、又はいずれか２つ以上の測定対象領域における力学特性の測定値の統計値を当該酵母細胞の力学特性として決定するステップと、を含む。

本実施形態に係る測定方法において、被測定対象となる酵母細胞は支持体表面に固定化されたものを用意する。支持体表面への固定化の強度は、ＡＦＭでの測定の際に酵母細胞が移動しない程度の強度があればよい。また、測定後の酵母細胞を更に培養又は単離する場合は、酵母細胞の生存に影響を与えない強度であることが好ましい。

酵母細胞を固定化するための支持体は特に制限されず、任意の形状を有するものであってよく、また任意の素材で形成されたものであってもよい。支持体の形状としては、例えば、平板プレート（培養ディッシュ等）、所定のピッチ（例えば、１５μｍ）で所定の深さ（例えば、５μｍ）のウェルが多数（例えば、１００〜１０００）形成されたプレート（マイクロアレイ用プレート）が挙げられる。支持体を形成する素材としては、例えば、ガラス、細胞培養器具に汎用されるプラスチック（例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン）、ゴム（例えば、シリコーン、ポリジメチルシロキサン）が挙げられる。

支持体の表面は、本技術分野において細胞及び組織の接着及び固定に汎用される表面処理が施されたものであってもよい。表面処理の具体例としては、ゼラチンコート処理、ポリＬリジンコート処理、接着タンパク質コート処理が挙げられる。

ＡＦＭでの測定の際に酵母細胞が移動しない程度の強度に加え、酵母細胞の生存に影響を与えない強度が得られるという観点から、酵母細胞を固定化する支持体としては、ポリＬリジンコート処理が施されたマイクロアレイプレートが好ましく、ポリＬリジンコート処理が施されたガラス製マイクロアレイプレートがより好ましい。マイクロアレイプレートは、酵母細胞の固定化により適することから、１０〜２０μｍのピッチで深さ３〜８μｍのウェルが多数形成されたプレートであることが好ましい。

本実施形態に係る測定方法は、支持体表面に固定化された酵母細胞に対し、単一の酵母細胞の複数の測定対象領域に対して原子間力顕微鏡を用いた測定を行い、各測定対象領域における酵母細胞の高さ及び力学特性の測定値を得る。

ＡＦＭを用いた測定では、ＡＦＭのカンチレバー先端の探針（プローブ）と酵母細胞との間に働く引力又は斥力を、カンチレバーのたわみ量から測定する。カンチレバーのたわみ量は、公知の変位検出方法（例えば、レーザー光をカンチレバーに照射し反射光の変位を測定する）で測定することができる。

図１は、ＡＦＭを用いた酵母細胞の力学特性の測定方法を説明するための模式図である。図１に示すＡＦＭ１００は、その測定部において、Ｚスキャナ１、Ｙスキャナ２及びＸスキャナ３で構成される試料載置部にディッシュ６が載置されている。ディッシュ６は底部にウェル７が多数形成されており、各ウェル７内の表面に酵母細胞８が固定化されている。固定化された酵母細胞８に対し、カンチレバー４の先端の探針（プローブ）５でＺ方向に走査することで酵母細胞の高さ及び力学特性を測定する。なお、図１には、試料載置部がＸＹＺ方向に移動する態様を示しているが、カンチレバー４及びプローブ５がＸＹＺ方向に移動するものであってもよい。

酵母細胞の高さの測定値は、例えば、コンタクトモード、ノンコンタクトモード、インターミッテントコンタクトモード又はフォースモードで酵母細胞表面の凹凸のＡＦＭ像を測定することで得ることができる。酵母細胞の弾性率の測定値は、例えば、非特許文献１に記載される方法に従い、フォースモードで酵母細胞表面のＡＦＭ像を測定し、ヤング率として得ることができる。なお、特記しない限り、本明細書において「弾性率」とは「ヤング率」を意味する。酵母細胞の吸着力の測定値は、例えば、細胞及び組織の表面接着及び固定に汎用される表面処理（例えば、ポリＬリジンコート処理）を施したプローブ５を使用し、フォースモードでＡＦＭ像を測定することで得ることができる。

本実施形態に係る測定方法では、単一の酵母細胞の複数の測定対象領域において酵母細胞の高さ及び力学特性を測定し、各測定対象領域における測定値のセット（高さ及び力学特性）を複数得る。

図２は、単一の酵母細胞の複数の測定対象領域において酵母細胞の高さ及び力学特性を測定する方法を説明するための模式図である。図２に示すように、まずＺスキャナ１により、ウェル７に固定化された酵母細胞８の第１の測定対象領域をカンチレバー４の先端のプローブ５で測定が可能な位置に移動させる（図２（Ａ））。次いで、Ｚスキャナ１、Ｙスキャナ２及びＸスキャナ３を移動させながら、第１の測定対象領域におけるＡＦＭ像を測定する（図２（Ｂ））。第１の測定対象領域のＡＦＭ像の測定が完了したら、Ｚスキャナ１、Ｙスキャナ２及びＸスキャナ３により、酵母細胞８の第２の測定対象領域がカンチレバー４の先端のプローブ５の鉛直下方に来るように試料を移動させる（図２（Ｃ））。そして、第２の測定対象領域に対して図２（Ａ）〜（Ｃ）を繰り返す。これを予め設定した測定対象領域全てにおいて、酵母細胞の高さ及び力学特性を得るまで繰り返す。

図３は、複数の測定対象領域の設定方法の一例を示す模式図である。図３は、ウェル７内に固定化された酵母細胞８を鉛直上方又は下方から観察した場合を図示したものである。図３には、一つのウェル７のみを図示している。複数の測定対象領域は、ランダムに設定することもできるが、測定対象とする領域を設定し、当該領域を重なりのない複数のサブ領域に分割してそれぞれを測定対象領域とすることもできる。例えば、測定対象とする領域を１辺６〜１０μｍの四角形領域とし、当該四角形領域を更に重なりのない複数の１辺１〜３μｍの四角形領域（サブ領域）に分割して、それぞれを測定対象領域としてもよい。図３では、酵母細胞８（又はウェル７）の中心付近を含む８μｍ四方の正方形を測定対象とする領域として設定し、当該領域を１μｍ四方の正方形からなる６４のサブ領域に分割し、それぞれを測定対象領域としている（測定対象領域は６４箇所）。測定対象とする領域は、正方形に限られるものではないが、酵母細胞８（又はウェル７）の中心付近を含む領域に設定することが好ましい。ここでいう「中心付近」とは、酵母細胞８（又はウェル７）を鉛直上方又は下方から観察した場合に、酵母細胞８（又はウェル７）の輪郭各点からの距離が略等距離になる点である。中心付近を含む領域には、酵母細胞８の頂点（高さが最大となる点）が含まれる可能性が高く、そのため測定による偏差（測定誤差）がより一層低減される。

測定対象領域の数は、酵母細胞の種類、測定する力学特性の種類等に応じて、適宜設定してよい。測定による偏差（測定誤差）をより低減する観点からは、測定対象領域の数は５箇所以上あることが好ましく、１０箇所以上あることがより好ましく、３０箇所以上あることが更に好ましい。また、測定の負荷を低減する観点からは、測定対象領域の数は１００箇所以下であることが好ましく、７０箇所以下であることがより好ましい。

本実施形態に係る測定方法では、上記のようにして得られた複数の測定値に基づき以下の手順に従って酵母細胞の力学特性を決定する。まず、複数の測定対象領域のうち、酵母表面の傾斜角が２０°以下になる測定対象領域（以下、「２０°以下領域」ともいう。）のみを酵母細胞の力学特性の決定に使用する。酵母表面の傾斜角は、測定対象領域の隣接する測定点の勾配により求めることができる。酵母表面の傾斜角は、測定の都度、当該方法により求めてもよいし、酵母表面の傾斜角が２０°以下になる測定対象領域を予め求めて設定しておいてもよい。例えば、図３に示すように測定対象領域を決める場合、６４箇所の測定対象領域のうち、高さが上位２５％に入る測定対象領域が、２０°以下領域となる。

次に、２０°以下領域における力学特性の測定値から、（ｉ）いずれか１つの２０°以下領域における力学特性の測定値を当該酵母細胞の力学特性として決定する、又は（ｉｉ）いずれか２つ以上の２０°以下領域における力学特性の測定値の統計値を当該酵母細胞の力学特性として決定することができる。このようにして酵母細胞の力学特性を決定することで、測定による偏差（測定誤差）を充分に低減することができる。（ｉｉ）における統計値としては、例えば、中央値、平均値が挙げられ、測定誤差をより一層低減できることから平均値が好ましい。

本実施形態に係る測定方法の原理を図４に基づいて説明する。図４は、酵母細胞における弾性率（ヤング率Ｅ（Ｐａ）の対数表示ＬｏｇＥ）、ＬｏｇＥの標準偏差（σ_Ｅ（Ｐａ））及び酵母表面の傾斜角（Ｓｌｏｐｅ（°））を酵母細胞の頂点（高さが最大となる点）からの距離（鉛直方向の距離（Ｈｅｉｇｈｔ）及び鉛直方向に垂直な面における距離（Ｄｉｓｔａｎｃｅ））の関数としてプロットしたグラフである。鉛直方向の距離が酵母細胞の頂点（０μｍ）から−１μｍ程の範囲にある測定点では、弾性率及び測定誤差ともに値が安定している一方、頂点からの鉛直方向の距離が−１μｍを超えて離れるにつれ弾性率が過小評価され、測定誤差も大きくなっていくことがわかる（図４（Ａ）及び図４（Ｂ））。また、鉛直方向に垂直な面における距離が１μｍから３μｍの範囲にある測定点では、弾性率及び測定誤差ともに値が安定している一方、鉛直方向に垂直な面における距離が３μｍを超えて離れるにつれ弾性率が過小評価され、測定誤差も大きくなっていくことがわかる（図４（Ｄ）及び図４（Ｅ））。図４（Ｃ）及び図４（Ｆ）から、鉛直方向の距離が０μｍから−１μｍの範囲にある測定点、及び鉛直方向に垂直な面における距離が１μｍから３μｍの範囲にある測定点の酵母表面の傾斜角はいずれも２０°以下である（それ以外の測定点は２０°を超える）。したがって、酵母表面の傾斜角が２０°以下になる測定点（測定対象領域）における測定値を酵母細胞の力学特性の決定に使用することで、測定誤差を最小限にできることがわかる。

〔力学特性に基づいた酵母細胞のスクリーニング方法〕
本実施形態に係る力学特性に基づいた酵母細胞のスクリーニング方法は、複数の被験酵母細胞が支持体表面に固定化されたサンプルを用意するステップと、各被験酵母細胞に対して本発明に係る測定方法を実施し、各被験酵母細胞の力学特性を決定するステップと、決定された力学特性に基づき所望の酵母細胞を選抜するステップと、を含む。

本実施形態に係るスクリーニング方法において、対象となる酵母細胞群は特に制限されず、任意の酵母細胞群を使用することができる。対象となる酵母細胞群はアルコールを生成できる酵母であればよく、その具体例としては、ビール用酵母、ワイン用発酵酵母、清酒用酵母、焼酎酵母及びこれらの任意の組合わせを挙げることができる。

対象となる酵母細胞群を固定化するための支持体としては、上述したものが挙げられる。各酵母細胞の力学特性を連続的に測定することができ、選抜にかかる時間を短縮できることから、支持体は、所定のピッチで所定の深さのウェルが多数形成されたプレート（マイクロアレイプレート）であることが好ましい。マイクロアレイプレートは、酵母細胞を固定化する表面にポリＬリジンコート処理が施されたものがより好ましい。ウェルが形成されるピッチは、１０〜２０μｍの範囲内であることが好ましく、１５μｍであることがより好ましい。ピッチがこの範囲内にあると、１ウェル中に１酵母細胞が存在するように固定化されることになり、連続的測定により適したものとなる。ウェルの深さは、３〜８μｍの範囲内であることが好ましく、５μｍ程であることがより好ましい。ウェルの深さがこの範囲内にあると、ＡＦＭのプローブが酵母細胞の表面に接近し易くなる。

各被験酵母細胞の力学特性を決定するステップは、上述した本発明に係る測定方法により実施することができる。本発明に係る測定方法は、測定による偏差（測定誤差）が充分に低減されており、各酵母細胞本来の個性に由来する偏差（個体差）をより正確に定量することができる。したがって、本実施形態に係るスクリーニング方法は、細胞単位での力学的識別の精度がより高められている。

本実施形態に係るスクリーニング方法では、決定された各酵母細胞の力学特性に基づき、所望の酵母細胞を選抜する。選抜する酵母細胞は、目的に応じて任意に設定してよい。例えば、剛性に優れる酵母細胞を選抜することを目的とする場合、対象となる酵母細胞群の中から、弾性率の大きさが上位１０％に入る酵母細胞を選抜してもよく、弾性率の大きさが上位５％に入る酵母細胞を選抜してもよく、弾性率の大きさが最大の酵母細胞を選抜してもよい。

本実施形態に係るスクリーニング方法は、原子間力顕微鏡に付設された細胞採取手段により、選抜された酵母細胞を単離するステップを更に含むことが好ましい。単離した酵母細胞は、所望の用途に使用することができる。

細胞採取手段としては、支持体から酵母細胞を剥離させて回収できる手段であればよく、具体的には、ポンプに接続されたマイクロピペット（ポンプによる引力で酵母細胞を回収する）が挙げられる。

図５は、一実施形態に係る細胞採取手段を示す模式図である。図５に示すＡＦＭ２００は、Ｚスキャナ１、Ｙスキャナ２及びＸスキャナ３で構成される試料載置部５０と、プローブ５を先端に有するカンチレバー４で構成される試料測定部６０と、細胞採取手段７０とを備える。細胞採取手段７０は、単離する酵母細胞を培地ごと吸引するマイクロピペット９と、マイクロピペット９に吸引力を付与するポンプ１１と、マイクロピペット９に連結されポンプ１１で発生させた吸引力をマイクロピペット９に伝えるチューブ１０とを有する。

マイクロピペット９は、先端部の口径が所望の酵母細胞を選択的に採取できるものであれば任意のものを使用できる。例えば、プッシュボタン式液体用微量体積計に接続して使用される使い捨てのピペット等を使用できる。マイクロピペット９は、プラスチック製であってもよく、ガラス製であってもよい。

ＡＦＭ２００は、まず試料載置部５０と試料測定部６０との動作により全てのウェル７について、酵母細胞８の高さ及び力学特性を測定する。次にコンピューター上（図示せず）で測定値を解析し、所望の力学特性を有する酵母細胞８を特定し単離すべき酵母細胞として選抜する。その後、カンチレバー４の先端のプローブ５の位置に取付けられた細胞採取手段７０が、ＡＦＭ２００の制御下で、試料載置部５０のＹスキャナ２及びＸスキャナ３の動作により、単離すべき酵母細胞が含まれるウェル７がマイクロピペット９の鉛直下方に移動する。そして、試料載置部５０のＺスキャナ１の動作により、単離すべき酵母細胞が含まれるウェル７が鉛直上方に移動し、マイクロピペット９の先端部がウェル７中の培地中に進入する。ポンプ１１の作動により生じた吸引力にで単離すべき酵母細胞が培地と共にマイクロピペット９に採取される。採取した酵母細胞は、例えば、培養培地を含む別の容器に移される。

以下、実施例等に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔試験例１：酵母細胞の弾性率、測定誤差及び酵母表面の傾斜角の測定〕
図４のグラフに示した結果は、以下の方法により測定したものである。

１×１０^７細胞／ｍＬに調製した酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２ｍＬをポリＬリジン（ＰＬＬ）コート処理（４０μｇ／ｃｍ^２）を施したマイクロアレイ用ガラスプレート（Ｎｕｎｃ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｒｒａｙ Ｓｌｉｄｅ １５μｍ Ｗｅｌｌ、Ｎｕｎｃ社製）に添加し、１０分間静置して酵母細胞を表面に固定化した。マイクロアレイ用ガラスプレートには、１５μｍピッチで深さ約５μｍのウェルが形成されている。

ＡＦＭの試料載置部に酵母細胞を固定化したマイクロアレイ用ガラスプレートを載置し、直径１０μｍのビーズ（プローブ）が先端についたカンチレバーを使用し、測定速度８μｍ／秒、各ウェルの中心部に８μｍ×８μｍの領域を測定対象とする領域として設定し、当該領域を１μｍ×１μｍからなる６４のサブ領域に分割して、当該サブ領域全てで測定を行った。測定は、フォースモードで行い、各測定点でのフォースカーブ（プローブをサンプルに近づけサンプルに接触させ押し込む間の、プローブ位置とプローブにかかる力との関係）を得た。

得られたフォースカーブから、Ｈｅｒｔｚの弾性接触理論に基づきフィッティングを行うことで弾性率（ヤング率：ＬｏｇＥ（Ｐａ））を導出し、プローブに力がかかり始めた時のピエゾの位置から、測定位置の高さを導出した。この値を元に、弾性率（ＬｏｇＥ）の標準偏差（σ_Ｅ（Ｐａ））及び酵母表面の傾斜角（Ｓｌｏｐｅ（°））を酵母細胞の頂点（高さが最大となる点）からの距離（鉛直方向の距離（Ｈｅｉｇｈｔ）及び鉛直方向に垂直な面における距離（Ｄｉｓｔａｎｃｅ））の関数としてプロットした。

〔試験例２：酵母細胞の弾性率及び吸着力の同時測定〕
カンチレバー探針部に接着させた直径約１０μｍのビーズに、探針部に１０μｌのＰＬＬ（１００μｇ／ｍｌ）を滴下して乾燥させることによってＰＬＬコート処理を施したこと、フォースカーブをサンプルへのプローブ押し付け時だけでなく、退避時にも取得したこと以外は試験例１と同様に測定を行った。

得られた退避時のフォースカーブから、プローブ退避時にカンチレバーにかかる力の最大値を求めることにより、吸着力（ｎＮ）を導出した。酵母細胞の高さ、弾性率（ヤング率：ＬｏｇＥ（Ｐａ））は試験例１と同様に導出した。図６に各ウェルの高さ像（図６（Ａ））、弾性率像（図６（Ｂ））、吸着力像（図６（Ｃ））を示した。図６に示すとおり、個々の細胞に特徴的な吸着力が確認された。このことはまた、弾性率及び吸着力を同時に測定できることを意味する。

〔試験例３：酵母細胞のエタノール処理前後の弾性率の測定〕
上面発酵酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用したこと以外は試験例１と同様に測定を行った。得られた測定値から、各酵母細胞について、最も高さの高い測定点における弾性率（ヤング率：ＬｏｇＥ（Ｐａ））の測定値を当該酵母細胞の弾性率とした（エタノール処理前の弾性率）。

上記測定後、測定したディッシュ内に９９．９％エタノールを終濃度が１２％となるように添加した。エタノール添加後、３７℃で２時間静置した。その後、エタノール処理前の弾性率と同様に酵母細胞の弾性率を測定及び解析し、エタノール処理後の弾性率とした。

エタノール処理後の弾性率を測定した後、ディッシュ内のエタノール溶液をピペットにて全量排除し、メチレンブルー染色液２．５ｍＬ及び生理食塩水２．５ｍＬをディッシュに添加し１０分間静置した。ディッシュ内のメチレンブルー溶液をピペットにて全量排除し、生理食塩水５ｍＬを添加した。これを写真撮影し、メチレンブルーで染色された酵母細胞と、非染色の酵母細胞を識別した。

結果を図７に示す。図７（Ａ）は、エタノール処理前の弾性率の分布（ｎ＝１００）をグラフにしたものであり、図７（Ｂ）は、エタノール処理後の弾性率の分布（ｎ＝１００）をグラフにしたものである。図７（Ａ）及び図７（Ｂ）の比較から、エタノール処理により弾性率が低下したことがわかる。また、図７（Ｃ）は、酵母細胞をメチレンブルー染色区分（ｎ＝２０）及び非染色区分（ｎ＝８０）に分けて弾性率変化量を比較したグラフである。図７（Ｃ）に示したとおり、染色区分の方が非染色区分と比較して弾性率が有意に低下していた（＊＊はｐ＜０．０１を意味する。）。これらの結果から、ストレス処理が弾性率を低下させること、ストレスの大きさによって低下幅も大きくなることが示された。

〔試験例４：酵母細胞の弾性率の測定、及び細胞採取手段による単離〕
試験例１と同様に弾性率測定及び解析を行った。弾性率が高い２つの酵母細胞をＡＦＭのカンチレバーに結合させたマイクロピペット（チューブを介してポンプに連結しており、ポンプの吸引力を利用して細胞を単離するように構成されている。）を使用して単離した。単離後、常法どおり培養した後、単離した酵母細胞に由来する細胞集団に対して、上記と同様に測定を行った。

図８に結果を示す。図８（Ａ）は、マイクロピペットで酵母細胞を吸引採取した例を示す写真である。吸引前（左図）にウェル中に存在した酵母細胞が吸引後（右図）のウェルには存在しない（吸引採取された）ことがわかる。単一細胞単位で単離が可能であった。

図８（Ｂ）は、単離前の酵母細胞集団の弾性率像（左図）と、単離後に培養した酵母細胞集団（単離した酵母細胞に由来する細胞集団）の弾性率像（右図）である。左図四角で囲ったウェルが単離前の酵母細胞に対応する。単離後の培養が可能であるとともに、単離後の弾性率は概ね単離前の弾性率と同じであった。

１…Ｚスキャナ、２…Ｙスキャナ、３…Ｘスキャナ、４…カンチレバー、５…探針（プローブ）、６…ディッシュ、７…ウェル、８…酵母細胞、９…マイクロピペット、１０…チューブ、１１…ポンプ、５０…試料載置部、６０…試料測定部、７０…細胞採取手段、１００，２００…ＡＦＭ。

Claims (6)

1. 原子間力顕微鏡を用いた酵母細胞の力学特性の測定方法であって、
   支持体表面に固定化された酵母細胞を用意するステップと、
   単一の酵母細胞の複数の測定対象領域に対して原子間力顕微鏡を用いた測定を行い、各測定対象領域における酵母細胞の高さ及び力学特性の測定値を得るステップと、
   酵母表面の傾斜角が２０°以下になる測定対象領域のうち、いずれか１つの測定対象領域における力学特性の測定値を当該酵母細胞の力学特性として、又はいずれか２つ以上の測定対象領域における力学特性の測定値の統計値を当該酵母細胞の力学特性として決定するステップと、
   を含む、酵母細胞の力学特性の測定方法。
2. 前記統計値が、平均値である、請求項１に記載の測定方法。
3. 前記力学特性が、弾性率及び／又は吸着力である、請求項１又は２に記載の測定方法。
4. 前記複数の測定対象領域が、１辺６〜１０μｍの四角形領域を複数の１辺１〜３μｍの四角形領域に分割した各領域である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定方法。
5. 力学特性に基づいた酵母細胞のスクリーニング方法であって、
   複数の被験酵母細胞が支持体表面に固定化されたサンプルを用意するステップと、
   各被験酵母細胞に対して請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定方法を実施し、各被験酵母細胞の力学特性を決定するステップと、
   決定された力学特性に基づき所望の酵母細胞を選抜するステップと、
   を含む、力学特性に基づいた酵母細胞のスクリーニング方法。
6. 原子間力顕微鏡に付設された細胞採取手段により、選抜された酵母細胞を単離するステップを更に含む、請求項５に記載のスクリーニング方法。