JP2005503269A - 分子アレイの製造 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明はナノテクノロジー、より詳しくは分子アレイの製造に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、ナノメータースケールにおいて物質を操作および研究する、ナノテクノロジーに大きな関心が向けられている(最近の、Science review、Nov. 24,2000を参照されたい)。長期的に見ると、ナノテクノロジーはナノメータースケールで機能する有用な装置または構造物を導くであろうと信じられている。ここ数年の間に小分子および原子の操作が確立されている;たとえば、走査型トンネル顕微鏡チップを用いてキセノン原子による「IBM」という文字が描かれ、また、金属表面上で局所触媒が行なわれた。原子間力顕微鏡(AFM)チップを用いていわゆる「ディップ−ペン」ナノリソグラフィー(Piner et al、Science 1999,28,3661)を行なって、特徴部の大きさ(feature size)が10−20nmの特徴部(feature)が、チオール化合物を用いて金表面との接触により描かれた。しかしこれらの方法は生物学的分子への使用に適するものではなく、実施するには複雑であった。というのは、それらには非常に清浄な表面および沈着条件の注意深い制御が必要とされるからである。
【0003】
今日までの生物学的分子の操作のための注目に値する方法は、光学的ピンセット(optical tweezers)、原子間力顕微鏡(AFM)およびマイクロ流体工学(microfluidics)のみである。光学的ピンセットはミクロン・サイズのビーズに付着した生物学的分子に対して適用される。例えば、該ピンセットはDNA分子を伸ばすために用いられる。AFMは、チップ上の一つの分子を表面上の分子と接触するように運ぶために用いられる。これらの方法はともに同時に1つの分子を操作することに制限されている(概説としてNature Reviews 2000,1,130を参照されたい)。
【0004】
パターン付けられたポリマーフィルムを用いるマイクロ流体工学は、生物学的分子をチャンネルへと流動させて分離および分析するのに用いられる。これはチャンネルを通って流動する大きな単一のDNA分子を1分子ごとに分析するのに用いられる(Science 2000、294,1536)。この方法は適用可能範囲が制限されており、生物学的分子によって描くことはできない。
【0005】
マイクロ密着焼付け(microcontact printing)も直接的スタンピングによって表面上に生物学的分子のパターンを作成するのに用いられる。これは1つのタイプの生物学的分子に制限され、可能な特徴部の大きさにも制限がある。
【0006】
単一のチップ上に提供されるDNAおよびペプチドアレイは分生物学における重要なツールである。商業規模でのその製造には様々な問題点が有る。
【0007】
生物学的分子によってものを描く最近の方法は、空気中でのピペットまたは圧電送達を使用したスポット作成に基くものである。例えば、DNAアレイの製造において、特徴部の大きさは約50−100μmである。Affymetrixによって開発されたDNAチップ製造のための写真平板法には、約250nmの回折のために基本的に特徴部の大きさに制限がある。さらにこの制限は化学分野での能力不足によりいまだに認識されていない。
【0008】
最近、Schreiberにより、アルデヒド−機能化ガラススライド上にタンパク質をスポットすることにより得られる簡便なタンパク質アレイが記載された(Science 2000、289、1760-1763)。スポットの解像度は150μmであり、タンパク質を溶媒和させて維持し、未反応アルデヒド部分をふさがなければならないという技術的問題があった。したがって、生物学的物質による操作やものを描くことは、好適な方法が無いために原子や小分子によるものよりも遅れている。
【0009】
走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法(SICM)は走査型プローブ顕微鏡法の1つの形態であり、生細胞の表面を例えば50nmの解像度で画像化する。該方法はマイクロピペットにより細胞表面を走査することに基き、ピペットの内側の電極に流れるイオン電流を用いて表面からの距離を維持および調節するものである。
【0010】
国際特許出願第WO−A−00/63736号に開示されているように、サンプル−ピペット間の距離が調節されると、さらに変調された電流が発生し、DC電流に加わる。変調される信号はピペットがサンプルに近接した場合にのみ有意になる。これにより強力かつ信頼できる距離制御方法が提供され、イオン強度におけるdcドリフトまたは変化の問題が実質的に排除される。
【0011】
Zhang et al、J Vac. Sci. Technology 1999、B17(2)、269-272には、マイクロピペットを用いて超小型回路および微細構造をSICMにより基板上に作ることができることが開示されている。これは導電性表面および電気化学的反応に制限される。マイクロピペットチップと表面との間隔はイオン電流によって制御され、距離調節を要しない。より小さい電圧が印加されると、沈着が少なくなるが、これは表面に対するピペットの位置にも影響を与える;というのは電流が小さくなると、マイクロピペットは一定の電流を維持するために表面から離れるからである。したがって制御は不可能ではないにしても困難である。
【0012】
(発明の概要)
本発明は、SICMにおいて用いられるピペットのサイズをナノメータースケールにまで小さくすることによって生物学的分子によって描くこと(writing)が達成されるという認識に基く。したがって、SICMにおいて用いられるタイプのマイクロピペットにより生物学的分子を表面に適用することができる。SICMはこの課題に好適である。というのは、生理的緩衝液中における細胞の画像化のために開発されたものであり、したがって、完全に生物学的物質に適用できるからである。ピペットは多くの用途に適用できる高濃度の分子の局所的で大きな貯蔵所である。マイクロピペットの直径は典型的には50−1000nmであり、用いるプリング(pulling)パラメーターを調整することによって簡単に変化させることができる。マイクロピペットとサンプルとの距離は、典型的にはマイクロピペット半径に対するイオン電流によって制御され、これは新規な、1μmより小さい、例えば10−100nmの特徴部の大きさが達成されることを意味する。適用(application)は完全に溶液中で行なわれ、ピペットからの流れの特徴と拡散のみが特徴部の大きさに影響を与える因子である(表面上に局所的に吸着しない分子は、迅速に浴への拡散によって希釈される)。さらに、本方法は、直接的に、複数のバレルのマイクロピペットの使用により、複数の適用にまで拡張され得る。したがって、生物学的分子のマイクロピペットによる適用はその他の方法に比べて多くの潜在的利点を有していると考えられる。
【0013】
本新規方法を用いることにより、生物学的分子を表面上の特定の位置に沈着させることができ、沈着の制御およびモニターが1分子レベルで可能になる。生物学的分子により可能なセルフアセンブリーおよび特異的認識により、新規なナノ構造およびバイオセンサーの製造の興味深い可能性が開かれる。さらに、生物学的分子の特異的認識を利用して、1つのマスター構造が一度作成されると直接的に多数のコピーをプリントすることが可能となりうる。
【0014】
一本鎖DNA分子のナノピペットによるパルス送達を実証した。ピペットの円錐状の形態により、局所的な電界がもたらされる。というのは、可能性のあるすべての滴下がチップ領域において起こるからである。DNA分子の規則的送達は、印加する電圧を制御することによって高精度で実験的に簡単な手段で達成できる。ナノピペットにおける一分子の検出および蛍光相関分光法により送達された分子の数の測定が可能となった。ピペット中のDNA分子の異例にゆっくりとした拡散が観察された。このナノポンピング技術は局所ドラッグデリバリーにおける適用可能性を有し、水性環境中での表面上の生物分子のナノ製造を可能とする。
【0015】
(好適な態様の記載)
本発明は多様な基板の上に所望の分子を沈着させるのに用いることができる。沈着させうる分子としては、例えばポリヌクレオチドおよびポリペプチド(これらの語は、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む)などの生物学的分子が含まれる。より具体的には、本発明は、長鎖および短鎖DNA、ビオチンなどの小分子、ストレプトアビジンおよび抗体などのタンパク質、好ましくは酵素および抗体などのタンパク質、DNAおよびその他の小分子を沈着させるのに用いることができる。サイズは重要ではない;ほとんどの生物学的分子は5−10nmであるが、長鎖DNAは長細い円柱状である。特定の場合にはピペットの壁をそのチップにおいてコーティングすることにより、分子がガラスに付着しないようにすることが望ましい。
【0016】
本発明の基礎となる原理を、添付の図面の図1Aに示す。ピペットを溶液中に浸漬し、適用が行なわれる表面の上に位置させる。局所的適用は付加される静水圧および電気泳動的流れの大きさおよび方向、そしてピペットとサンプルとの間の距離によって制御できる。分子は表面から制御された距離からの沈着によって適用される。すなわち、「タッピング・モード」においてピペットの振動(周期的運動)の振幅が増加してピペットが適用される表面の非常に近くに来るか、あるいは接触する。ピペットが描いている間に表面が走査される。表面とピペットとの距離は変調された(modulated)イオン電流を用いてナノメーターレベルの正確さで制御される。
【0017】
マイクロピペット中のイオン強度は浴中とは異なる。したがって、適用の際のピペットのチップにおけるコンダクタンスは明らかに変化する。というのは、コンダクタンスは浴中の溶液のものからマイクロピペット中の溶液のものへと変化するからである。これによってインサイチュでの適用のモニタリングが可能となる。印加した電圧を変化させて適用およびピペットとサンプルの間の距離を制御することもできる。表面に適用される分子の量は、高感度蛍光分光法、例えば、倒立顕微鏡を用いてモニタリングできる。イオン電流の部分的阻害によって大きな分子の送達をモニターすることもできる。
【0018】
表面に形成された特徴部の大きさは、とりわけ、以下のパラメーターに依存し得る:
1.ピペットの直径;これは例えば、10−100nmとすればよい。
2.ピペットとサンプルの間の距離;これは変調されたイオン電流を用いて制御できる。
3.印加する電圧;これは電気泳動的流れの大きさと方向を制御する。
4.付加される圧力(これは静水学的な流れを引き起こす)。
5.ピペット中の生物分子の濃度。
6.イオン強度;これは帯電した分子と表面との間の静電気的な相互作用によりピペットの有効直径を減少させ得る。
7.適用の持続時間および態様、即ち、固定距離またはタッピングモード。タッピングモードにおいては、特徴部の大きさを増大させること無く、適用の回数により適用される分子の数を制御することができる。
【0019】
送達される分子は典型的にはオリゴヌクレオチド(DNA)またはオリゴペプチドである。これらの分子は標識されていてもよい。例えば、蛍光により標識された分子の使用によって、適用中あるいは適用の直後にレーザー共焦点顕微鏡観察を用いて表面上の特徴部を直接可視化することができる。好ましくは顕微鏡はFRET(蛍光共鳴エネルギー転移)または二色(dual colour)実験のために2つのチャンネルを有する。金−コーティングした雲母を用いるとより高解像度のAFM画像処理が可能となる。
【0020】
適用されるべき表面上への送達された分子の固定化は、様々な物理的および化学的方法によって達成できる。例えば、ビオチン−(ストレプト)アビジン結合または電荷が挙げられる。
【0021】
図1Aは2つのバレルからなるピペットを示すが、送達される1または複数の分子に応じて1または3以上のバレルを用いてもよい。例えば、DNAまたはペプチドなどの水溶性分子を一方のバレルから送達し、別の分子を他方から同時にまたは逐次に送達すればよい。基板表面の同じ位置に戻り、異なる分子を同じ位置で沈着させ、所望の構造または分子が適当な部位に提供されるまでこれを繰り返すことによって、構造が構築される。
【0022】
制御ソフトウェアを用いて基板の表面上に分子の線またはパターンを作ることができ、それによって同じ表面で、しかし異なる位置で操作を行なうことができる。例えば、切断用の表面に一連の異なるDNA分子の平行な線を描くことができる。このDNAの線に適当な酵素をピペットからアプライすることにより、制御および実験を行なうことができる。
【0023】
マイクロピペットに沈着用の1または複数の溶液を入れるために、様々な方法を用いることができる。特に、負の圧力または適当な極性の電圧の印加が用いられる。このようにすると、適当な洗浄工程を用いてピペットまたは複数のピペットのバレルの中の1つにおける溶液を迅速に交換することができる。
【0024】
ピペット送達を特徴付けるために、ピペットからのストレプトアビジンなどの蛍光標識されたDNAおよびタンパク質の流れを、圧力、印加電圧およびピペットサイズの関数として測定すればよい。これは以下のすべての実験において重要であり、生細胞の機能的マッピング実験にも有用である。これを一分子蛍光を用いてバルク溶液に対して行なって、直接ピペットのチップにおけるフルオロフォアで標識された分子の軌道を追跡すればよい。これは500nmピペットについて、Zander et al、Chem. Phys. Lett. 1998、286、457によって以前に行なわれた。非特異的吸着を減らすために、例えばシラン化合物を用いて所望によりピペットの表面修飾を適用してもよい。
【0025】
本発明の好適な態様は、アレイの製造である。圧電−駆動マイクロピペットを用いたスポット形成または送達によって製造されたDNAアレイは、典型的には直径200μmまたはそれ以上の特徴部の大きさを有するが、本発明のマイクロピペットによるとこのサイズを100nm未満に減じることができる。スポット形成操作においてDNAを送達することにより、ピペットのガラス表面上へのタッピングをすばやくするほど、アレイをすばやく構築することができる。これは溶液中で行なえばよい。DNAは典型的にはストレプトアビジン−ビオチン相互作用を用いることにより表面に結合される。2つのバレルのピペットを用いると様々な組合せのDNA分子を1つの位置または別々の位置で送達することができる。これは2種類のフルオロフォアによって標識された2種類の蛍光によって標識されたDNA分子を用いて2色共焦点顕微鏡により画像処理することによってアッセイできる。
【0026】
マイクロピペットはタンパク質アレイを構築するのに用いることもできる。例えば、表面をカルボキシ末端を有するデキストランでコーティングすればよい(これによりピペットがソフトに着地でき、それによって損傷が妨げられるという利点がある)。カルボキシル基は要求されるカップリング剤をピペットの別のバレルから送達することによって局所的に活性化できる。例えばこのようにして、タンパク質が送達される直前にその部位においてNHSエステルを形成することができ、あるいは、Ni2+を局所的に送達してNTA/His6相互作用を促進することができる。
【0027】
本発明の方法により、特徴部の大きさを1μm以下にすることができる。さらに溶液中でのタンパク質送達およびカップリング剤の局所適用により、前掲のSchreiberによって記載された問題を回避することができる。特徴部の大きさがより小さければより少量のタンパク質が必要とされ、これはたとえばインビトロ翻訳系によって産生することができることは注目に値する。
【0028】
タンパク質アレイを構築すると、種々のタンパク質−タンパク質、およびタンパク質−小分子相互作用を調査することができる。前掲のSchreiberによって、アレイの有用性を立証する一般的な(市販の)系が記載されている。例えば、タンパク質G(蛍光によって標識されたもの)およびイムノグロビンGがタンパク質−タンパク質相互作用のモデルとして有用であり、蛍光によって標識されたビオチンと固定化されたストレプトアビジンが、タンパク質−小分子相互作用のモデルとして有用である。
【0029】
以前に銀でコーティングしたDNAが比較的短いナノワイヤーとして作用することが示されている(Braun et al、Nature 1998、391,775)。伸展されたdsDNA鎖は、ピペットから押出すことによって表面上に送達できる(表面上に歯磨き粉の線を形成するような要領で)。DNAの負に帯電した表面、例えばガラスへの付着は、Zn2+などの2価カチオンの存在または不在によって調節することができることが示された。DNAは、ピペットの別のバレルからZn2+を局所的に送達することによって連続的または断続的に表面に固定される。様々な長さの粘着末端DNAがこのようにして次々と送達されると、DNAの伸長鎖が表面上でアセンブルし、これはタッピングモードAFMによって特徴付けることができる。これらの断片化したワイヤーをリガーゼによって引き続き処理してこれらを互いに結合させることができるし、あるいは、エンドヌクレアーゼを用いて局所的に切断することもできる。DNAは表面に対して扁平に沈着するが、DNAは酵素の基質として作用するのが好ましく、これは2つの固定化された部位の間を局所的に解離させることによって可能となる。長鎖のフルオロフォア−標識されたファージDNAをこういった実験に用いることができ、DNAはYOYOなどのインターカレーター色素によって可視化することができる。前掲のBraunらの方法を用いて、表面に付着したDNA上に銀を沈着させることによって銀ワイヤーを形成することができる。
【0030】
タンパク質および/またはDNAから作られた多成分三次元構造を組み立てることができる。これを行なうための最も簡単な方法は、ビオチン/ストレプトアビジン系を使用することである。例えば、ストレプトアビジンとビオチン標識したタンパク質をピペットの別々のバレルから交互に送達することによって、あるスポットにストレプトアビジンとビオチン標識したタンパク質の交互層が送達され得る。このようにして、表面上から塔を積み上げることができる。可視化のためにストレプトアビジンとタンパク質は異なるフルオロフォアで標識するとよい。同様に、表面に対して直角に配向する種々の長さの粘着末端DNAを接ぎ合わせることができるし、末端がビオチン標識されたDNAとストレプトアビジンスペーサーとを交互に積み上げることができる。
【0031】
国際特許出願第PCT/GB02/01382号には、1つの心筋細胞に1つのアルファトキシンチャンネルを沈着させ、これをパッチクランプによって検出することができることが開示されている。パッチクランプ記録は1つのアルファトキシンチャンネルの特徴である。本発明によると、蛍光のモニタリングまたはマイクロピペットにおける電流の部分的阻害に基く、より一般的で柔軟な制御送達方法の開発が可能となる。
【0032】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例1】
【0033】
先に示唆したように、本発明により、正確に距離制御をしてピペットを操作することにより生細胞上の特定の位置に治療用DNAまたはタンパク質を送達することが可能となる。剪断力およびイオンコンダクタンスの両方が、距離調整手段として可能性が有る。ピペットを制御された送達に使用する際の第一段階として、印加する電圧を変化させた場合のナノピペット内の生物分子の流れを特徴付ける必要がある。本実施例において、電気的制御によってナノピペットを通る色素標識されたDNA分子の、プログラム制御可能な送達を報告する。一分子分光法および蛍光相関分光法(FCS)を用いた定量的測定により、送達された分子の数の測定が可能となる。
【0034】
(計測手段)
自家製の一分子共焦点蛍光顕微鏡を用いた;Ying et al、J. Phys. Chem. B、2000、104、5171-8; およびWallace et al、PNAS USA 2001、98、5584-9を参照されたい。この顕微鏡は、圧電ナノマニュピュレーターを備えており、レーザー焦点においてピペットを観察および位置付けるために用いられ、また、色素標識されたDNAからの蛍光信号の検出にも用いられた。488nmのアルゴンイオンレーザー(Ion Laser Technology 5490AWC-00)を励起源として用いた。平行線形偏光レーザービームを2色性ミラーを介して倒立顕微鏡(Nikon Diaphot 200)に当て、油浸レンズ(Nikon Fluor 100X、NA 1.30)によって焦点をしぼった。蛍光を同レンズによって集光し、100nmピンホールに像を形成させて焦点から蛍光その他のバックグラウンドを排除した。蛍光を次に帯域通過フィルターおよびロングパスフィルター(Omega Optical 535AF45 および OG515)に通しアバランシェ・フォトダイオード、APD(EG&G SPCM AQR-141)に集光させた。APDからの出力をPCを備えた多重チャンネルスカラーカード(EG&G MCS-Plus)に連動させた。ベント(bent)ナノピペットを、モジュラー集光ユニット(Nikon 883320)、機械的変換ステージおよび二軸圧電変換ステージ(Piezosystem Jena Tritor38)からなる自家製ナノマニュピュレーションシステムに搭載した。モジュラー集光ユニットおよび機械的変換ステージはナノピペットの粗位置付けに用いた。圧電ステージは微調整に用いた。
【0035】
内側半径約50nmのガラスピペットをレーザー−ベース・ピペット・プラー(Sutter Instrument P-2000)を用いて常套手段によって作成した。2つのAg/AgCl電極を介してナノピペットに電圧を印加した。一方の電極は浴中に有り、他方はピペット内に有り、それぞれサービング電極およびワーキング電極として用いた。イオン電流はピペットを通って流れ、高インピーダンス増幅器によって増幅し、オシロスコープによってモニターした。
【0036】
(材料および実験方法)
DNAオリゴヌクレオチド(配列番号1)をCruachem (Glasgow、UK)によって合成し、HPLCで2回精製した。3’末端をローダミングリーン(Molecular Probes)で修飾した。色素標識されたDNAの濃度を260nmでのUV−Vis吸光度によって測定し、504nmでの吸光度を内部基準として用いた。この内部チェックに基くサンプルの純度は95%より大であった。
【0037】
100nMのDNA溶液をマイクロフィラー(World Precision Instruments Microfil 34)によってベントナノピペットに充填した。ナノピペットが詰まらないように、溶液を20nmのフィルターでろ過した。2−3mlの溶液を含むカバーガラス底のシャーレ(Willco Wells GWST-1000)を浴として用いた。ピペットチップをシャーレ表面から5から10μm上方に位置付けた。同じ緩衝液(10mM Tris−HCl、100mM NaCl)をピペットと浴の両方に用いた。ナノピペットにおける一分子検出のために、5nMのDNA溶液を用いレーザー出力を0.25mWとした。蛍光相関測定をリアルタイムでMCS信号を相関させることにより行ない、ここでLabview environment (National Instruments Evaluation Version 5.0)において開発された本発明者らの独自のソフトウェアを用いた。
【0038】
図1Bは実験設備の模式図である。集光された488nmのレーザービームで励起された、ナノピペットおよびチップの近くの蛍光スポットのビデオ画像は、約500nmのスポットサイズを示し、これは遠視野光学的分解能の制限によりピペットの内径よりも大きかった。これはFCSを用いたプローブ体積測定と一致している。レーザー焦点をピペット内へ動かすと、長さ約1.5mmの楕円形の蛍光スポットが観察された。
【0039】
2つの電極の間に電圧を印加すると、ピペットの円錐状の形態によりチップ領域のほぼ全体で電圧降下が起こった。与えられた電界は非常に不均一でチップの非常に近くに位置していた(電界強度はチップから10μmはなれた距離において最大の1%未満に下降した)。高い電界強度(数kV/cm)は、印加した電位が非常に低くても(数百mV)、チップの近くで簡単に達成され、これは標準的なキャピラリー電気泳動法が高電圧源を必要とするのと対照的であった。
【0040】
関数発生器を用いて制御された周波数において方形波によって印加される電圧を変調させた場合、図2に示すように高度に反復的なDNAのパルス送達が達成された。高いオン/オフ比の最適なパルスは、変調振幅および負荷サイクルを操作することによって得ることができた。
【0041】
送達された分子数は一分子光子放出量および特有の拡散時間測定に基いて評価され、これを以下に説明する。図2Aにおいて、正の電圧持続時間30ミリ秒にて10Hzにおいて−0.1Vから0.6Vまで変調させた場合、1パルス当たり約150±20分子が検出された;一方、図2Bにおいて正の電圧持続時間5ミリ秒のみにて−0.1Vから1.5Vまで変調させた場合、1パルス当たり約460±50分子が検出された。後者の場合の結果により、ナノピペットチップに対するDNA分子の非線型集束が示唆される。というのは、時間的に平均された平均場が負であり、これは系の応答が線形であればマクロイオンはピペットの深くに駆動され、観察されたようにピペットから出ないからである。このメカニズムは非線型電気泳動と類似している。
【0042】
1パルス当たりに送達される分子数を評価するために、ナノピペットチップの近くで一分子測定を行なった。この実験において、レーザー焦点はナノピペットの開口部にしぼった。回折により制限されるスポットサイズはピペット半径よりかなり大きく、ピペットチップから出てくる分子のほとんどを検出することができた。一分子放出量分析により、各分子から検出される光子の平均数は、励起レーザー出力250μWにおいてミリ秒当たり35であると判明した。様々な印加電圧での一分子測定により、どのようにバースト振動数が電圧によって変化するかが明らかになった;図3Aを参照されたい。一分子検出によるDNA分子のパルス送達を図3Bに示す。1サイクル当たり約20の別々の分子が検出された。
【0043】
S/N比は高かった(バックグラウンド0.7カウント/ミリ秒、最大一分子バースト150カウント/ミリ秒)。水とガラス媒体の間には屈折率にかなりの差が有るにもかかわらず、厳密に焦点をしぼったレーザービームには、ガラス壁上での後方散乱はそれほどなかった。
【0044】
蛍光相関測定をピペットのチップの内側で開放体積において行ない、DNAの拡散定数を決定し、いかにしてガラス表面がss−DNA分子の拡散を妨害しているかを明かにした。自由溶液中での色素標識されたss−DNAの拡散係数は、1.7x10−6cm2sec−1であり、ナノピペット中では時間的指数部0.81であり、拡散係数は8.1x10−8cm2sec−1であった。DNAの異例の拡散は、ガラス壁での限局の結果であると考えられる。限局された短鎖ss−DNA分子について、拡散時間が約20長い因子が観察された。数百ミリボルトの電位を印加した場合、自己相関曲線において有意な差は無く、拡散に比べて流速が非常に遅いことが示される。しかし、電圧を50mVから300mVに変化させると相関振幅の大幅な減少(〜20の因子)が観察された。これはチップ領域における有意な濃度増大を示唆している。というのは、相関振幅は共焦点体積における分子数に反比例するからである。レーザー焦点を通る平均拡散時間および一分子蛍光の平均カウント速度が得られると、ビームをピペット開口部に当てた場合、レーザー焦点を通る個々のローダミングリーン−標識されたDNA分子について100μWのレーザー励起出力によって平均で28カウントが検出できると評価される。この計算において蛍光寿命の可能性およびナノピペットチップにおいて形成される微小空洞の限局効果によるスペクトル変化は無視できる。
【0045】
図4Aは、様々な変調電圧において生じる規則的送達パターンを示す。小さな負の電位が蛍光信号における高い変調深度を達成するために要求される。低電圧においては、蛍光のゆっくりとした上昇および迅速な減衰が観察される。高電圧においては、電圧を逆にした場合減衰はより遅くなり、これは、DNA分子が局所濃度勾配によって駆動されてピペットの外へ出続けていることを示す。チップ領域におけるDNA濃度は好適なサイン電圧パルスを印加することにより二桁の規模で上昇し得る。パルスの持続時間はナノピペットを通るDNA送達の制御に用いられる。その結果、ナノピペットを通じて高度に制御されたDNA送達を観察することが可能である。例えば、0.2ミリ秒当たり200カウントのピーク蛍光強度は、検出体積中72分子に対応する。50nmピペットについて有効共焦点体積を0.01fLと仮定すると、焦点領域において、濃度は約12μMであろう。しかし、狭い円錐構造における濃度分布は、表面電荷の効果を考慮すると不均一であると予想された。電圧の関数としての変調サイクル当たりの送達効果を図4Bに示す。電圧が0.5Vより大きい場合は線形の相関が観察された。検出された分子数についての線形ダイナミック・レンジは、100nMのサンプルを用いたパルス送達において100から2000である。1パルス当たり数分子から数千分子の送達が変調振幅とサンプル濃度を変化させることによって簡単に制御できる。連続送達モードにおいて、線形の相関は印加電位が0.2Vから1.0Vの間で観察された。より高い電位は有意なタッピング効果を引き起こし、系の応答は非線型となる。
【0046】
規則的送達についてのナノピペット系の周波数応答も調べた。200Hzより高い周波数ではカウント速度における変化を観察するのは困難であった。というのは、カウント数は短い回収時間では非常に小さくなるからである。したがって、蛍光自己相関関数を用いて、時間領域における変動を明かにした。1000Hzでは、強度の変調が達成できる。5000Hzにおいては、変調はほとんど観察されなかった。それゆえ規則的送達は1000Hzまでで作動するとよい。
【0047】
要約すると、実施例1は、DNA分子の規則的送達は、ナノピペットを用いて簡便かつ信頼できる方法で達成できることを示す。この超高感度技術によって1パルス当たり数分子を送達することができる。ピペットの内壁の表面修飾およびサイズの減少を組合せることによって、核酸だけでなくタンパク質およびその他のナノ粒子の送達をより正確に制御することが可能となろう。この技術により単一の生細胞への正確なアンチセンスドラッグデリバリーに対して新たな道が開ける。さらにこの技術はSICM技術と簡単に組合せることができ、水性環境中でバイオチップのミクロおよびナノ製造のための多目的のナノペンの開発が可能となる。
【実施例2】
【0048】
本実施例では、ピペットを用いて、ストレプトアビジン−コーティングした表面に対してビオチン化およびフルオロフォア−標識されたDNAの送達を行なう。
【0049】
第一に、ナノピペットからの一本鎖DNA(上述)の流れを、ピペットのチップにおける蛍光測定を用いて研究した。図5Aを参照されたい。実施例1と同じローダミングリーン−標識されたオリゴヌクレオチドを用いた。
【0050】
ナノピペットは常套方法によってレーザー−ベース・ピペットプラー(Sutter Instrument P-2000)を用いて作成した。蛍光は自家製一分子共焦点蛍光顕微鏡(Nikon Diaphot 200を基礎とし油浸レンズ(100x、NA 1.30)およびアバランシェ・フォトダイオード検出器(EG&G SPCM AQR-141)を備えたもの)を用いて測定した。アルゴンイオンレーザーからの100Wの488nmの照射を励起のために用いた。
【0051】
前述のように一分子カウンティングを用いてピペットを離れるDNA分子の数を評価した。DNAの流れはカウンター電極とピペットの内側の電極の間に印加された電位によって制御できることが判明した。ピペットに対してカウンター電極が負の電位である場合、ごくわずかなDNAがチップから流れ出た。正の電位を印加すると、DNAの流れが起こり、流動は印加された電位に対して線形であった;図6Bを参照されたい。これは、便宜に穏やかな電圧範囲にわたって印加する電位を制御することよりDNA送達の速度が微調整できることを示す。
【0052】
次にピペット・サンプル距離のイオンコンダクタンス制御を用いてストレプトアビジン−コーティングしたガラス表面に、DNAを沈着させた。図5Cを参照されたい。より具体的には、ガラス底のシャーレ(WillCo、Wells B.V.、NL)をBioTeZ Berlin-Buch GmbHによってストレプトアビジンでコーティングした。このコーティングに対するビオチン−結合能は280fmol/mm2(68pg/mm2)である。描く実験を倒立顕微鏡(Eclipse TE 200、Nikon)を用いて行なった。これは2つの圧電xyz−ステージを備えており、1つはピペットを動かすためのもので、1つはサンプルを走査するためのものである。チップを±50nmに調節し、ロックイン増幅器によって記録した変調されたイオン電流を用いて距離を制御した。リン酸緩衝液(10mM Na2HPO4、137mM NaCl)を浴およびピペット中に用い、ピペット中には100nMのssDNAを含有させた。
【0053】
ガラススライドを支持するサンプル圧電ステージは手動で入力電圧を変化させることによってナノメーターの正確さで操作した。これらの実験においてカウンター電極に印加する電圧は600mVの一定に保持した。それによってピペットからの流出は約4000分子/秒であった。図6AはDNAのスポットを示し、ここでピペットは5から160秒の様々な時間、表面の近くに置かれた。ストレプトアビジン−ビオチン結合によりDNAが表面に固定化され、ローダミン−標識されたDNAの蛍光を走査型共焦点顕微鏡観察によって検出した。検出は0.5μmの光学解像度にて同じ装置で行なった(図5D)。画像を300μWの488nmでの照明下で記録した。蛍光信号は油浸レンズ(100x、NA= 1.25)および光電子倍増管検出器を用いて検出した。二色光信号分配器、ロングパス・フィルターおよび50μmピンホールを用いて蛍光信号を分離し、バックグラウンド信号およびレーザー散乱を除いた。
【0054】
沈着したDNAのスポットが明かに画像中に見られる。総強度は沈着時間に比例して増加する(図6B)一方、ピーク強度は半減時間40秒の飽和効果を示す。その結果、検出されたベル型強度プロフィールの半値全幅(fwhm)は1.1μmから3.0μmに増加した。図6Cは25のスポットのアレイを示す。各スポットは10秒間沈着されたものである。測定した半値全幅は1.0±0.1μmであり、強度は±6%のみの変動を示し、これは本方法の再現性が良好であることを示す。
【0055】
コンピュータ制御によりステージを走査することによってより複雑なパターンを作成することができる。図7Aは間隔が3μmの線を示す。この場合は幅は1.0μmである。図7Bは、四角を次々重ねて描いたものであり、異なる強度の領域が作成された。これによってパターンの形成のみならず、「グレースケール」で描くことが可能であることが示された。圧電ステージの入力電圧を手動で変化させてピペットを動かすことにより、DNAでストレプトアビジン表面上に6−8μmの大きさの文字を描くことが可能となる。図7Cを参照されたい。
【0056】
操作はイオン性溶液内であるため、特徴部の大きさは表面からのピペットの距離および拡散に依存する。特徴部の大きさは Bond et al、J. Electroanal. Chem. 1988、245、74 に記載のように拡散を制限した条件で超微小電極に送達された定常状態濃度プロフィ−ルを用いて抽出できる。表面から75nmにある100nmピペットについて特徴部の半値全幅は約300nmであると予想される。観察される特徴部の大きさは3より大きい因子でありこれは表面上のDNAの2次元拡散およびガラス表面上のストレプトアビジン部位の低密度によると考えられる。しかし、特徴部の大きさは空気中のDNA沈着について得られる大きさよりも少なくとも一桁は小さく、送達されるDNA量の制御は簡単である。
【0057】
ミクロンより小さい構造を本方法を最適化することにより達成することができる。本方法には、高密度の表面および共有結合化学を用いた、より微細なピペットの使用が含まれる。しかし、この特徴部の大きさは光学的読み出しにより好適である。本方法は、簡便であり、生理的条件で行なうことができる。これは、タンパク質Gおよびストレプトアビジンについての予備実験によって示されるように、直接その他の生物学的分子、また、酵素および抗体にも拡張適用できる。これは表面上に複雑な生物学的構造を作成するのにも使用できる。
【実施例3】
【0058】
DNAアレイと同じ実験設備を用いてタンパク質アレイを作成した。リン酸緩衝液(10mM Na2HPO4、137mM NaCl)中の100nMの蛍光により標識されたタンパク質Gの溶液をピペットに充填し、同じリン酸緩衝液を浴に用いた。100MΩの抵抗のピペットを用いて、浴中のAg/AgCl電極に−500mVの電圧を印加することによりタンパク質をピペットの外へ出した。顕微鏡カバーグラスの表面をアミノシランで処理して正の表面電荷を与えた。ピペットを、フィードバック信号として変調されたイオン電流を用いて表面から約75nmの距離に制御した。ピペット変調は約±50nmであった。こういった条件で表面上でピペットを動かしてガラス表面上にタンパク質を沈着させた。表面に送達されたタンパク質の量は1箇所にピペットが保たれていた時間に依存する。これをDNAアレイについて用いたのと同じ共焦点蛍光顕微鏡を用いて488nmにて10μWの励起にて検出した。
【実施例4】
【0059】
本実施例では、ガラスナノピペットを改変してタンパク質吸着を減少させた。
【0060】
3−[メトキシ(ポリエチレネオキシ)プロピルトリメトキシシラン](PEG-シラン、>90%、av.FW 460)をABCR (Germany)から購入し、無水1,4−ジオキサンをAldrichから購入した。
【0061】
(1)新たにプラーで作ったガラスナノピペットを新たに調製した5%PEG-シラン(v/v無水1,4−ジオキサン中)溶液に5-10分浸した。ピペットを純粋な1,4−ジオキサンで20分間洗浄した。これはチップを純粋な1,4−ジオキサン溶液に浸し、そして純粋な1,4−ジオキサン溶液から引き出すことによって行なった。浸し、引き出すサイクルによりピペットのチップ領域に1,4−ジオキサンが出入りするのが共焦点顕微鏡によって観察された。
【0062】
(2)改変したチップを次に周囲雰囲気中2時間100℃でオーブンで焼いた。この焼き工程はPEG−シランをチップのガラス表面に共有結合させるために必要である。
【0063】
焼き工程の後、ピペットを用いてAlexa 488 修飾ストレプトアビジン(Molecular Probes)をビオチン−修飾したガラス表面にPBS緩衝液(10mM リン酸、150mM NaCl、2mM NaN3、pH7.20)中100または10nMの濃度で送達し、マイクロメーターより小さいサイズのタンパク質アレイを形成した。
【0064】
ピペットの表面特性を特徴付けるのは難しいため、ガラスカバーグラスの水和性についての対照実験を行なった。純水に対する接触角は改変前は5度以下であった。改変後、接触角は約37±1度であり、これはPEG-末端処理した表面についての文献値とよく一致し、ガラス表面の改変が成功したことが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1】図1Aは、本発明に用いることができる装置の模式図である。
図1Bは、実験設備の模式図である。SPAD:単光子計数アバランシェ・フォトダイオード 、MCS:多重チャンネルスカラー。
【図2】図2は、10Hzに変調した電圧によるDNA分子の規則的送達の結果を示す。高度に反復的なパルスが観察された。最適なパルスは変調振幅および負荷サイクルの操作によって得られる。レーザーの焦点はチップ開口部の約0.5mm前にしぼった。MCS統合時間ビン幅は0.2ミリ秒である。(A)−0.1Vから0.6Vの変調、正の電圧持続時間は30ミリ秒であり、約150±20分子が1パルス当たりに検出された;(B)−0.1Vから1.5Vの変調、正の電圧持続時間は5ミリ秒であり、約460±50分子が1パルス当たりに検出された。
【図3】図3は、ナノピペットから出るローダミングリーン−標識された20−マーのss−DNAの一分子検出を示す。レーザーの焦点は、ピペットチップ開口部に当てられた。MCSビン幅は1ミリ秒である。(A)様々な電圧を印加した場合;(B)−0.1Vから1.0Vの電圧変調。
【図4】図4:A)様々な変調振幅での蛍光のパルスパターン。変調周波数は10Hzであり、負荷サイクルは0.3である。MCSビン幅は0.2ミリ秒である。ショットノイズを減らすために10サイクルの平均をとった。B)印加した電圧Vonの関数としてのパルスあたりに検出されたDNA分子数である。線形の相関が観察された。
【図5】図5:A)ピペットからのDNA分子の流れを測定する実験の模式図である。ピペットには100nMのローダミングリーンで標識された、一本鎖(ss)DNA分子が満たされている。正の電圧が浴中のAg/AgCl電極に印加されると、分子はピペット外に出される。488nmのレーザー励起(100μW)下での蛍光は、顕微鏡および光子計数アバランシェ・フォトダイオードを用いて検出できる。青色領域は、共焦点レーザー照明を示す。B)電極電位の関数としてのローダミングリーンで標識されたssDNAの蛍光強度である。右側のy−軸は、一分子計数実験によって評価された、チップから出た分子の流れを示す。C)リン酸緩衝液(10mM Na2HPO4、137mM NaCl)中のストレプトアビジンでコーティングしたガラス表面上へのssDNAの沈着の模式図である。DNAは分子はビオチンおよびローダミングリーンで標識されている。チップを流れるイオン電流を用いてチップと表面との距離を制御し、DNAはストレプトアビジン−ビオチン結合によって固定化される。D)走査型共焦点蛍光顕微鏡による描かれた構造の検出であり、ローダミングリーン標識されたDNAは488nmで励起され、530nmに集光された蛍光が記録される。
【図6】図6:A)ストレプトアビジンでコーティングした表面上でDNAによって描かれたドットの蛍光画像であり、沈着時間を5、10、20、40、80、および160秒と増加させ、画像サイズを25μmx25μmとした。強度を表示するために用いた、カラーマップは図2Bに示される。B)沈着時間の関数としての、図2Aにおけるドットのピーク強度(青色四角)および総強度(黒丸)。C)それぞれ10秒の沈着時間の25のドットであり、画像サイズは25μmx25μmとし、カラーマップは図1Dに示される。D)画像2Cにおける最下列のライン走査により、沈着および1.0±0.1μmの半値全幅(fwhm)の再現性が示される。
【図7】図7:イオン電流距離制御下でのサンプルの走査による、DNAで描かれた線の蛍光画像であり、各線に付き35μm/秒で10サイクルを行ない、画像サイズは25μmx25μmである。B)20μmから5μmの幅の四角を互いの上に1つ重ねて描くことにより強度が徐々に増加するパターンを作成した。画像サイズは25μmx25である。C)50μmx50μmの領域に描かれた「UNIVERSITY OF CAMBRIDGE」の言葉であり、個々の文字は6−8μmの高さである。
Claims (14)
- 分子を含むマイクロピペットから、液体環境中で基板に分子を沈着させる工程を含み、マイクロピペットから基板の距離が液体中のイオン電流に応答して制御される、基板に固定化された分子のアレイを製造する方法。
- 分子がポリヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 分子がポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- マイクロピペットが基板の表面に対して実質的に垂直方向に振動し、距離が表面のイオン電流を変調することによって制御される、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- マイクロピペットが沈着に際し、基板表面上か基板の非常に近くになるよう、マイクロピペットが基板の表面に対して実質的に垂直方向に、大きいまたは増加した振幅で振動する、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- マイクロピペットが2以上のバレルを有する請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 各バレルから異なる分子が送達される請求項6に記載の方法。
- 所望の位置に構造または分子を構築するために、基板の同じ点に異なる分子を送達する工程を含む、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 沈着が圧力および/または電圧の印加によって制御される、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- アレイの特徴部の大きさが1μmより小さい、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 特徴部の大きさが10から100nmである、請求項10に記載の方法。
- 特徴部の大きさが1μmより小さい、基板上に沈着された生物学的分子のアレイ。
- 特徴部の大きさが10から100nmである、請求項12に記載のアレイ。
- 請求項1から9のいずれかに記載の方法によって得られる、請求項12または13に記載のアレイ。
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Cited By (4)
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JP2007112021A (ja) * | 2005-10-20 | 2007-05-10 | National Univ Corp Shizuoka Univ | 光硬化性樹脂の微細加工方法及び装置 |
JP2007136568A (ja) * | 2005-11-15 | 2007-06-07 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 極小線状柔軟物の切断方法及び切断装置 |
JP2009545736A (ja) * | 2006-08-01 | 2009-12-24 | イオンスコープ リミテッド | 生細胞を調べるための走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法 |
JP2014508300A (ja) * | 2011-03-04 | 2014-04-03 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 可逆的なイオン及び分子検出又は移動用ナノポアデバイス |
Families Citing this family (9)
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WO2011156500A2 (en) * | 2010-06-08 | 2011-12-15 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Electrochemical methods for wire bonding |
GB201013436D0 (en) | 2010-08-11 | 2010-09-22 | Univ Warwick | Electrochemical measurements and functional imaging |
CN103502424B (zh) | 2011-03-03 | 2015-09-09 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于操作细胞的纳米吸管装置 |
WO2015161161A1 (en) * | 2014-04-17 | 2015-10-22 | Drexel University | A method and apparatus for measuring biological activity with single cell resolution |
US9869658B2 (en) * | 2014-07-22 | 2018-01-16 | International Business Machines Corporation | Electronic label free detection of DNA complexes using nanogap |
CN109971830B (zh) * | 2019-04-04 | 2023-08-18 | 温州医科大学 | 一种简易的用于dna斑点杂交的实验装置 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4924091A (en) * | 1989-02-01 | 1990-05-08 | The Regents Of The University Of California | Scanning ion conductance microscope |
DE69212062T2 (de) * | 1991-04-30 | 1996-11-28 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma, Osaka | Raster-Abtastmikroskop, molekulares Verarbeitungsverfahren unter Verwendung des Mikroskops und Verfahren zum Wahrnehmen der DNA-Basen-Anordnung |
DE19542620A1 (de) | 1995-11-15 | 1997-05-22 | Univ Albert Ludwigs Freiburg | Vorrichtung zur Oberflächenanalyse und -strukturierung |
ATE308770T1 (de) | 1999-04-19 | 2005-11-15 | Imp College Innovations Ltd | Optische mikroskopie und deren verwendung bei der untersuchung von zellen |
-
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007112021A (ja) * | 2005-10-20 | 2007-05-10 | National Univ Corp Shizuoka Univ | 光硬化性樹脂の微細加工方法及び装置 |
JP2007136568A (ja) * | 2005-11-15 | 2007-06-07 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 極小線状柔軟物の切断方法及び切断装置 |
JP2009545736A (ja) * | 2006-08-01 | 2009-12-24 | イオンスコープ リミテッド | 生細胞を調べるための走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法 |
JP4912465B2 (ja) * | 2006-08-01 | 2012-04-11 | イオンスコープ リミテッド | 生細胞を調べるための走査型イオンコンダクタンス顕微鏡法 |
KR101398730B1 (ko) * | 2006-08-01 | 2014-05-27 | 이온스코프 리미티드 | 살아있는 세포의 조사를 위한 주사 이온 컨덕턴스 현미경 |
JP2014508300A (ja) * | 2011-03-04 | 2014-04-03 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 可逆的なイオン及び分子検出又は移動用ナノポアデバイス |
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