KR20090063208A

KR20090063208A - 살아있는 세포의 조사를 위한 주사 이온 컨덕턴스 현미경

Info

Publication number: KR20090063208A
Application number: KR1020097003892A
Authority: KR
Inventors: 유리 에브게니비츠 코르체프; 맥스 요셉 랩; 다니엘 파울로 산체스-헤레라
Original assignee: 이온스코프 리미티드
Priority date: 2006-08-01
Filing date: 2007-08-01
Publication date: 2009-06-17
Also published as: WO2008015428A1; EP2047231B1; GB0615277D0; JP2009545736A; JP4912465B2; CN101517393A; EP2047231A1; CN101517393B; KR101398730B1; US20090260114A1; US8006316B2

Abstract

주사 탐침 현미경을 사용하는 표면 조사하는 방법은, 주사 탐침을 표면에 근접하게 가져가고 상기 탐침의 위치를 표면에 대해 일정한 거리를 유지하도록 조절하는 것을 포함하고, 압력이 상기 탐침을 통한 액체의 조절된 흐름에 의해 상기 표면에 적용되는 것을 특징으로 하고, 상기 탐침의 운동은 그결과의 표면의 운동을 나타낸다.

표면 조사 방법, 주사 탐침 현미경, 세포 표면 조사 장비

Description

살아있는 세포의 조사를 위한 주사 이온 컨덕턴스 현미경{SCANNING ION CONDUCTANCE MICROSCOPY FOR THE INVESTIGATION OF LIVING CELLS}

본 발명은 주사 탐침 현미경 및 특히 세포의 구조의 가요성 및 탄성의 연구에서의 그것의 용도에 관한 것이다.

세포는 동물 또는 식물이든, 살아있는 생물의 가장 기초 단위이다. 그것의 구조와 조성, 및 그것의 다양한 구성성분 기능에 대한 연구는 집적된 생물학적 시스템에서 일어나는 복잡한 공정에 대한 가치있는 통찰력을 제공한다. 이것은 세포 샘플의 조사가 실시간으로, 비-침략적으로, 그리고 세포 기능성이 유지되는 생리적 조건과 흡사한 용액에서 수행되도록 하는 기술을 요구한다.

(가시광을 사용하는) 광학 현미경은 살아있는 세포의 연구에 널리 적용되어왔다. 그러나, 해상도는 약 200~250nm의 회절에 의해 제한된다. 더 상세한 연구를 위해, 일반적으로 사용되는 방법은 전자 현미경으로, 이것은 10nm 해상도를 갖는 영상을 얻을 수 있지만, 샘플은 영상화 전에 고정되어야 한다. 따라서, 전자 현미경을 살아있는 세포를 연구하는데 사용하는 것은 불가능하다.

또 다른 가능한 고해상도 기술은 주사 탐침 현미경(SPM)의 사용을 기반으로 하고, 여기서 날카로운 탐침 팁이 연구 중인 샘플에 매우 근접하여 주사된다. 결과 의 상호작용과 그러므로 샘플의 화학적/물리적 특성은 샘플에 대한 팁의 위치의 함수로서 플롯될 수 있고, 이 측정된 상호작용의 프로파일을 생성한다. 일반적으로 생물학적 영상화에 적용되는 SPM류의 맴버들은 원자력 현미경(AFM), 주사 이온-컨덕턴트 현미경(SICM) 및 주사 근접장 광학 현미경(SNOM)이다.

SICM에서, 전해질-충전된 유리 마이크로피펫이 전해질 용액에 담긴 샘플의 표면에 걸쳐 주사된다; Hansma et al (1989) Science 243:641-3 참조. 피펫-샘플 분리는 피펫 구경을 통해 흐르는 이온-전류에 의해 일정값에서 유지된다. 흐름은 두 전극 간에 있다: 하나는 피펫 내부 그리고 다른 하나는 전해질 용액의 외부. 전극들 간의 적용된 바이어스에 대해, 이온-전류는 마이크로피펫의 저항(R_P)과, 배스로부터 마이크로피펫의 구멍으로의 수렴 경로를 따른 저항인 접근 저항(R_AC)의 결합에 의존한다. R_P는 팁의 직경과 마이크로피펫의 원추각에 의존하는 반면, P_AC는 배스와 샘플의 샘플 전기화학 특성, 기하 및 탐침으로부터의 분리에 복잡하게 의존함을 나타낸다. R_AC는 피펫-샘플 분리에 전류 민감성을 제공하고 그것의 촉진이 접촉이 일어나지 않는 거리를 유지하도록 한다.

SICM이 정밀-표면에 비-접촉 프로파일링법으로 확립되도록 하는 최적의 팁-샘플 분리는 대략 칩 직경의 반이다; Korchev et al (1997), J. Microsc. 188:17-23, 및 Biophys. J. 73:653-8 참조. 팁의 위치를 조절하는 시스템의 결과는 샘플 표면상의 지형 특성의 영상을 생성하는데 사용된다. SICM을 사용하여 얻을 수 있는 공간적 해상도는 팁 구경의 크기에 의존하고, 이것은 통상적으로 50 nm 내지 1.5 μm이다. 이것은 대응하는 해상도를 생산한다. 그러나, 표면 구조, 예를 들면 세포를 연구하기 위한 개선된 방법 및 장비에 대한 요구가 여전히 존재한다.

발명의 요약

본 발명은 국지화되고 조절된 압력 또는 힘을 연구중인 표면에 근접하게 위치된 주사 프로브를 통해 액체의 조절된 흐름에 의해 표면에 적용할 수 있다는 인식을 기반으로 한다. 이 압력의 적용은 적용된 표면과 표면에서 일어난 운동 간의 관계를 모니터링함에 의해 표면의 가요성 또는 탄성을 측정하는데 사용될 수 있다. 이것은 또한 메카니즘 민감 이온 채널과 같은 세포 표면 성분을 자극하고, 자극의 이후의 측정은 전기생리적 또는 화학적 신호의 이후의 변화를 모니터링함에 의해 수행된다.

본 발명의 제1면에 따르면, 주사 탐침 현미경을 사용한 표면의 조사방법은, 주사 탐침을 표면에 근접하게 가져오고 그리고 탐침의 위치가 일정 거리를 유지하도록 조절하는 것을 포함하고, 탐침을 통한 조절된 액체 흐름에 의해 압력을 표면에 제공하고 이후의 탐침 위치를 모니터링하는 것을 특징으로 하고, 여기서 탐침의 운동은 이후의 표면의 운동을 나타낸다.

본 발명의 제2면에 따르면, 세포에서 전기생리학 또는 화학적 변화를 유도하는 방법은, 주사 탐침을 세포 표면에 밀접하게 가져오고, 탐침을 통한 액체의 조절된 흐름에 의해 정해진 압력을 표면에 적용하고, 그리고 세포에서의 전기 생리학 또는 화학적 신호에서의 변화를 모니터링하는 것을 포함한다.

본 발명의 제3면에 따르면, 표면을 조사하기 위한 장비로, 상기 장비는 주사 탐침 현미경 및 탐침을 통한 액체의 조절된 흐름에 의해 표면에 압력을 적용하는 수단을 포함한다.

표면에서 탐침 팁까지의 평균 거리는 통상적으로 탐침의 내부 직경에 근접하기 때문에, 낮은 유속에서 흐름 패턴은 표면에 탐침 내부의 액체에 적용되는 정수압과 유사한 압력을 발생시키고 표면과 수직인 순수 힘은 그 압력과 탐침 팁의 구경의 단면적의 곱이다. 팁 아래의 표면에 의해 감지되는 국지적 압력은 압력을 발생시키는 어떠한 수단을 통해 피펫(탐침)에 외부적으로 적용되는 압력과 거의 정확리 동일하다. 이에 더하여, 표면에 적용된 힘은 압력에 팁의 단면적을 곱한 것과 거의 근접하게 된다. 이러한 면들 모두는 경험적으로 결정되었고 분석적으로 탐구되었다. 이들은 데이타의 분석을 매우 단순하게 만들고, 본 발명의 방법의 독특한 장점이다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조로 설명되고, 여기서:

도 1(A) 및 (B)는 세포 표면을 조사하는데 사용되는 SICM 시스템의 배열을 나타내고, 도 1(C)는 세포 표면의 주사 결과를 나타내고;

도 2는 접촉 및 비-접촉 접근의 SICM을 나타내고;

도 3은 SICM 피펫이 인간 DRG 뉴런에 접근할 때 [Ca²⁺]를 나타내고;

도 4는 비-접촉 접근법을 이용한 NRG 뉴런의 순차적 기계적 자극의 결과를 나타내고;

도 5는 [Ca²⁺]를 기준으로 한 기계적 자극에 대한 접촉 및 비-접촉 접근법의 결과를 나타내고;

도 6은 DRG 지각 뉴런의 기계적 자극에 의해 활성화된 전류를 나타내고; 그리고

도 7은 본 발명의 SICM을 이용하여 발생된 NRG 지각 뉴런의 형광 자극을 나타낸다.

본 발명은 고도로 국지화되고 조절된 압력 또는 힘을 표면에 적용하는 수단을 제공한다. 이것은 세포 표면의 탄성을 측정하거나 또는 기계적 자극에 대한 반응에서 전기생리적 또는 화학적 신호를 발생하는 여러 생리학적 구조를 자극하는데 사용될 수 있다.

본 발명을 수행하기 위한 장비는 대부분 탐침, 조사될 표면으로부터 탐침의 거리를 측정 및/또는 조절하는 수단 및 탐침 내부의 액체에 조절된 압력을 적용하는 수단을 포함한다. 적용된 압력은 탐침 팁을 통한 액체의 흐름을 생성하고 차례로 조사된 표면에서 관련 압력을 생성한다.

용어 '조사(interrogate)'는 구조의 표면에서의 변화를 모니터하는, 예를 들면, 단일 위치에서 또는 탐침이 표면을 주사함에 따라, 표면 상의 또는 표면에서의 구조 변화를 검출하는 능력을 말하려는 의도이다.

표면에 적용된 압력은, 표면이 충분히 유연하다면, 표면을 움직이게 할 것이다. 양압(positive pressure), 즉 탐침을 통해 표면으로의 흐름은 표면을 탐침으로부터 미는 효과를 갖고, 표면과 탐침 간의 분리를 증가시킨다. 음압은 표면을 탐침을 향해 끌어당겨, 분리를 감소시킨다. 그러나, 이것은 장치가 표면으로부터 탐침의 거리를 일정하게 조절할 것이라는 의도이므로, 어느 표면의 이동은 탐침의 상응하는 이동을 가져올 것이다. 이 결과로서, 액체 흐름, 압력 및 이동 간의 상호-관계가 모니터될 것이다. 탐침의 수직 위치에서의 어느 변화는 적용 압력의 결과일 수 있는 탐침의 수직 위치에서의 변화의 직접적 표시를 제공한다. 적용 압력과 그 결과의 표면 이동 간의 관계는 표면 구조의 탄성에 대한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 기계적 자극에 반응하는 전기생리학적 또는 화학적 신호를 방출하는 세포 구조를 자극하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 이온 채널이 자극될 수 있고, 그 결과 방출된 신호는 적합한 검출기를 사용하여 검출될 수 있다. 이것은 기계적 감각을 연구하는데 유용하다. 기계적 감각은 삼투압조절, 성장, 청력, 굴지성, 균형, 자기수용 및 촉감을 포함하여, 다양한 신체작용의 기능에 필수적이다(Ghazi et al., Biochemie, 1998; 80:357-62). G-단백질-결합 수용체의 활성화를 통해 작용하는, 냄새, 맛 그리고 시력의 감각과 달리, 촉감, 통증 및 청각의 기초가되는 기계적감각(mechanosensation)의 분자 기반은 분명하지 않게 남아있다(Sukharev 및 Corey, Sci STKE, 2004; 219:re4; Kung, J. Appl. Physiol., 2005; 98:2328-36). 기계적감각(MS) 이온 채널은 기계적 힘을 전기 또는 화학 신호로 전환하는 횡단막 단백질로 구성된다(Sukharev 및 Corey, supra 2004). MS 이온 채널 은 세균, 이스트, 식물 및 수 많은 동물 세포를 포함하여, 매우 다양한 유기물에서 전기생리학적으로 검출되고 있다(Ghazi et al, supra 1998; Kung, supra 2005). 기계적으로 활성된 채널은 대장균의 MscL 및 MscS, (6개의 횡단막 도메인(TM) (SAKCa) 및 2TM (KATP)의) 신장-활성된 K+ 채널, DEG/ENaC 형 채널, 기계적-게이트된 2-구멍 (4TM) K+ 누출 채널 및 TRP 류의 여러 맴버(Ghazi et al, supra 1998; Sukharev 및 Corey, supra 2004)를 포함하여, 다양한 이온 채널류로부터의 막 단백질의 비균질기인 듯 하다.

본 발명은 세포 또는 세포 표면 구조를 조사하기 위해 뿐 아니라, 주사 현미경에 의해 적용된 압력의 적절한 수준의 적용에 의해 변형가능한, 또는 이와 같은 압력에 대해 다른 수준의 저항을 제공하는 어느 표면의 연구에 적용될 수 있다. 표면은 고체 또는 액체일 수 있다. 예를 들면, 표면은 현택물 또는 수-기재 액체의 표면일 수 있고, 여기서 표면의 기계적 특징은 현탁액 또는 액체의 특성을 드러낸다. 예를 들면, 수-기재 액체중의 오일 방울은 물과 비교하여, 적용된 압력에 대해 다른 수준의 저항을 제공할 것이고, 그러므로 본 발명은 수중유 조성물의 특징을 확인하는데 사용될 수 있다. 이 면은 많은 음식물, 화장품 및 세정 제품의 벌크 특징을 측정하는데 사용될 수 있다. 연구 중의 액체 물은 대부분 탐침에 채우기 위해 사용된 액체와 혼합되지 않을 것이다.

이에 더하여, 본 발명은 예를 들면 고무-기재 또는 플라스틱-기재인 비-생물학적 구조의 연구에도 사용될 수 있고, 여기서 적용된 압력은 이와 같은 재료의 구조들의 차이를 나타낼 수 있다.

탐침은 또한 주사 탐침 현미경에 의해 표면을 주사하는데 사용될 수 있다. 상이 생성될 수 있고, 관심의 표면의 일부는 독특한 특징을 갖는 것으로 확인될 수 있다. 양압 또는 음압이 표면에 선택된 위치에서 매우 정밀하게 적용될 수 있고, 그것에 의해 표면의 기계적 반응 또는 운동을 측정할 수 있다. 이 공정은 표면의 동일하거나 다른 부분에서 반복되어 표면의 상세한 정보를 제공할 수 있다. 탐침은 또한 표면에 압력이 동시에 적용되는 동안 표면을 주사하는데 사용될 수도 있다. 이 방법에서, 본 발명은 적용된 압력에 대해 반응함에 따라, 표면과 표면-아래의 구조를 드러내도록 표면의 상세한 사진을 구축하는데 사용될 수 있다.

표면이 매우 가요성이고 적용된 압력이 정인 영역에서, 표면은 밑에 놓인 하부구조 위로 무너질 것이고, 예를 들면, 세포막은 밑의 세포골격의 형태를 드러낼 것이다. 표면이 매우 가요성이고 적용된 압력이 음인 영역에서, 표면까지 들어올린 정도의 변화가 나타날 것이고, 즉, 세포의 어느 부분은 세포골격에 고착하여 이동이 자유롭다. 본 발명의 이점은, 반복실험에서 표면의 손상, 팁의 오염 및 표면의 교차-오염없이 표면을 조사할 수 있다는 것이다.

본 발명은 기존의 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 주사 이온 컨덕턴트 현미경(SCIM)이 사용될 수 있다. 통상의 SCIM 시스템은 모든 주사 탐침 현미경의 특징을 이루는 성분들, 즉 주사 탐침, 압전-소자 주사 요소, 제어 전자기기 및 컴퓨터를 포함한다. 이들 성분들은 도립 현미경, 예를 들면 Diaphot 200 (Nikon Corporation, Tokyo, Japan) 내에 또는 주변에 장착된다. 어느 적합한 중공탐침이 사용될 수 있다. 통상적으로, 탐침은 마이크로페펫 또는 나노피펫이다. 이 와 같은 탐침은 보로실리케이트 유리 모세관을 레이저-기재 마이크로피펫 풀러(예를 들면, 모델 P-2000, Sutter Instrument Co., San Rafael, CA, USA)를 사용하여, 예를 들면, 외부 및 내부 직경이 각각 1.00nm와 0.58nm로 잡아 당김에 의해 제작될 수 있다. 원추형 태퍼 길이와 정점 직경이 200 nm, 400 nm 및 1.0 μM인 탐침을 얻을 수 있다. 장비는 통상적으로 표면으로부터 탐침 팁의 평균 길이가 대략 탐침의 내부 직경에 맞춰진다. 압력은 탐침을 통한 액체의 흐름을 조절하기 위해 종래의 수단에 의해 가해질 수 있다. 통상적으로, 예를 들면, PM-4, Warner Instruments, Hamden, CT, USA와 같은 프로그램가능 압력 주입 시스템은 가요성 튜브에 의해 요구되는 SICM 피펫 홀더의 축과 압력/시간 프로파일을 생성하도록 프로그램된 주입기에 결합된다. 요구되는 압력의 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 통상적으로 약 10kPa, 예를 들면, 10 내지 50 kPa의 양압이 적용된다. 더욱 통상적으로 13 내지 40 kPa의 압력이 적용된다.

본 발명은 세포 또는 생물학적 표면에 의해 발생되고 본 발명을 사용하여 자극될 수 있는 전기생리학적 또는 화학적 신호를 측정하기 위한 수단으로 수행될 수 있다. 이와 같은 측정 수단은 주사 이온 컨던턴트 현미경에서 일반적이고 본 발명에 적용될 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명을 설명한다.

실시예

다음의 실시예는 인간과 래트 DRG 감각 뉴런의 연구에서 본 발명의 비-접촉 SICM 법을 종래의 접촉 SICM법과 비교하여 조사하였다.

주사 이온 컨덕턴트 현미경 (SICM)

본 발명자들은 일반적으로 기계적 자극을 위해 사용된 더 큰 탐침에 접근할 수 없는, 막의 서브-미크론 영역을 선택하고 그들을 기계적으로 자극하기 위해 SICM 탐침을 사용하였다.

본 발명자들은 지형학적 영상을 얻었고 세포를 SICM(lonoscope Limited, London, UK)을 사용하여 기계적으로 자극하였다. 살아있는 세포의 지형학적 영상을 위한 SICM의 기본 배열은 앞에서 기재하였다(Korchev et al., Biophys. J. 1997a; 73:653-8; Korchev et al., J. Microsc. 1997b; 188 (Pt 1):17-23). 간단히 말하면, SICM은 주사 탐침으로서 샘플과 수직으로 배열된 매치-클램프 나노피펫을 사용한다. 3-축 압전 이송단계에 장착된 피펫은 세포 표면으로 접근하고, 피펫 상수를 통해 이온 전류를 유지하는 SICM 피드백 조절을 사용하여, 일정한 칩-샘플 분리 거리(도 1B)를 유지하면서 그 위를 주사한다. SICM 조절자는 세포의 표면 영상을 생성하고(도 1C), 확인된 특정 영역 또는 구조 위로 막으로부터 대략 100nm 이내로 피펫이 정확하게 똑바로 접근할 수 있도록 한다. 그리고 나서 SICM 피펫-탐침은 막 전류 또는 세포내 Ca²⁺ 영상을 측정하기 위해, 동시의 패치-클램프 전기생리학적으로 세포를 기계적으로 자극하는데 사용될 수 있다(도 1A).

SICM 나노피펫을 보로실리케이트 유리 모세관(Intrafil, 1.0 mm OD x 0.58 mm ID; lntracel Ltd, Herts, UK)으로, 레이저-기재 전극 풀러(P-2000, Sutter Instrument, Novato, California)를 이용하여 배스 용액에 담궜을 때 15~20 MΩ의 피펫 내성을 얻도록 잡아당겼다. 피펫을 배스 용액에 담궜을 때 피펫의 내성을 기준으로, 피펫 팁 내부 반경은 약 200 nm였다.

기계적 자극

본 발명자들은 SICM의 나노피펫 탐침을 사용하여 두개의 다른 유형의 기계적 자극을 적용하였다. 첫번째 접근, "접촉법"에서, SICM 피드백 대조의 스위치를 끄고 거리 및 지속시간 결정 단계에서 압전 조절에 의해 세포막에 대해 피펫을 수직으로 낮추었다(도 2A). 이 방법에서, 피펫은 작은 영역에 걸쳐(~ 700 nm = external diameter of the pipette tip) 막을 물리적으로 접촉하고 내리누르고, 피펫이 물리적으로 봉쇄됨으로써 피펫을 통해 흐르던 전류(I/Imax)가 감소되었다(도 2C). 두번째 접근은 "비-접촉법"으로, 피펫은 세포에 대한 피펫의 팁으로부터 분출되는 압력이 적용됨과 동시에 압전 조절에 의해 세포막을 향해 수직으로 낮아졌다(Fig 2B). 양압(13 내지 40 kPa)을 SICM 피펫의 대를 통해 적용하여 하류 방향 자극 단계를 적용하기 수초 전에 피펫의 팁으로부터 나오는 액체의 분출을 생성하고 직후에 멈추었다. 용액 분출은 막과의 접촉을 방지하고 따라서 피펫의 봉쇄를 막고, 이것은 피펫을 통한 전류 흐름의 상당한 감소가 없음으로써 확인되었다(Fig 2D). 이 방법은 세포에 대한 어떠한 접촉과 물리적 손상을 막기 때문에 세포의 "비-접촉" 기계적 자극을 생성한다.

본 발명자들은 피펫 이동 또는 피펫 저항에서의 변화에 기인할 수 있는 압력 분출을 적용할 때 피펫의 의사(spurious) 움직임이 있는가를 보기 위해 기록 챔버의 기저 유리 표면에 대해 압력 분출을 적용하는 실험으로 기계적으로 유도된 인공 물의 방출을 검토하였지만, SICM 피펫(< 10nm)의 중요한 움직임을 발견하지 못하였다.

세포 배양물

인간 DRG 감각 뉴런을 Anand et al., Neurosci. Lett. 2006; 399:51-56에 기재된 바와 같이 제조하였다. 즉, 전체 경추 DRG를, 최대 2주 전에 교통사고 중 상완 신경총 적출, 즉 중추 축색절제된 5명의 남성 성인 환자(n=5, 연령범위 21 내지 28세)로부터 얻었다. DRG를 환자의 서면 동의와 지역 윤리위원회의 동의하에 신경 회복의 필수 부분으로서 신경 재건 수술의 과정 중 잘라내어 연구하였다. 각각의 환자로부터 2 내지 3개의 목 신경절을 미세하게 절단하고, 페니실린(100 μg/ml), 스트렙토마이신(100 μg/ml), 0.5% 디스파아제(8U/mg, GIBCO), 및 0.2% 콜라게나제(Type IV Worthington, 168 U/mg)를 함유하는 Ham's F12 영양배지(GIBCO)에서 370℃에서 3시간 동안 효소 소화시키고 이어서 Ham's F12 + 10% 송아지 태아 혈청 중에 기계적으로 해리시켰다. 대략 3000 세포/ml을 함유하는 세포 현탁액 250㎕를 폴리-L-라이신 (20 μg/ml, Sigma), 및 라미닌 (20 μg/ml, Sigma), 코팅된 8 웰 Permanox Labtek 슬라이드(Nalge Nunc Int.)에 평판배양하였다. 모든 웰에 2 ml Ham's F12 + 10% FCS을 첨가하고, NGF-7S (100 ng/ml Sigma Aldrich), rhGDNF (50 ng/ml), 및 rhNT3 (50 ng/ml)을 웰의 반에 첨가하였다. 세포를 8% CO₂/공기의 습식 환경에서 5일 동안 37℃에서 배양하고 제3일에 매질을 교환하였다.

성숙 위스터 래트를 CO₂ 질식에 의해 죽이고 모든 척수 수준으로부터 DRG를 얻고 공동관리하였다. DRG를 Ham's F12 Nutrient Mix (Invitrogen Life Technologies Ltd, Paisley, UK)에서 모으고 신선한 Ham's F12에서 3회 회전-세척하였다. 그리고 나서 DRG를 1.5 ml 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)로 옮기고 5% CO₂ 하에서 37℃에서 50분 동안 10 U/ml 파파인 용액(Sigma) 1 ml에 집어 넣었다. 해리된 조직을 교반하고, 과량의 파파인을 제거하고, 그리고 나서 트립신 억제 용액(Sigma) 중에서 부드럽게 하였다. 래트와 인간 DRG 감각 뉴런을 폴리-L-라이신(20 μg/ml) and laminin (10 μg/ml) (both Sigma)으로 예비 코팅된 둥근 덮개 유리(직경 13mm)에 놓았다. 세포를 실험에 사용하기에 앞서, 신경영양 성장 인자(NGF-7S 100 ng/ml, GDNF 50 ng/ml, hNT350 ng/ml)가 보충된, 완전 BSF2 매질 (Ham's F12, 소 혈청 알부민, 아포트란스페린, 프로게스테론, 인슐린, 소듐 셀레나이트, 푸트레신, 페니실린, 스트렙토마이신 및 2% (래트의 경우) 또는 10% (인간의경우) 열-불활성 태아 송아지 혈청)에서 공기 95%와 CO₂ 5%의 대기 중에 37℃에서 적어도 48시간 동안 성장시켰다.

전기 생리학

덮개 슬릿에 배양된 DRG 지각 뉴런을 관류 챔버(RC-25, Warner Instruments Inc.)로 옮기고 분리 패치 클램프 해드 스테이지와 전극을 사용하여, 표준 전체-세포 전극-클램프된 기록을 수행하였다. 패치 전극을 SICM 피펫과 동일한 유리 모세관으로 제조하여 10-16 MΩ의 피펫 내성을 얻었다. 패치-클램프 피펫 용액은 130 mM CsCl, 5 mM NaCl, 5 mM EGTA-Na, 및 10 mM HEPES pH 7.3을 함유하였다. 배스와 SICM 피펫 용액은 pH 7.4에서 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂, 10 mM 글루코스 및 10 mM HEPES을 함유하였다. 모든 무기염들과 시약들은 Sigma-Aldrich Company Ltd. (Sigma, Gillingham, UK) 제품이었다. -60 mV의 유지전압을 패티 전극을 통해 패치-클램프된 세포에 적용하고, Axopatch 200B 패치-클램프 증폭기와 Clampex-pClamp 9 (Axon Instruments, Burlington, California)를 사용하여 기록을 10kHz에서 연속적으로 추출하고 2 kHz에서 온라인 여과하였다. 소프트웨어를 사용하여 전기용량 및/또는 선형 누수 전류를 제거하였다. 데이타를 Clampfit-pClamp 9 및 Origin 5 (Microcal, Northampton, Massachusetts)를 사용하여 더욱 분석하였다. 모든 실험은 23±2℃의 실온에서 수행되었다.

칼슘 영상법

DRG 지각 뉴런에 실온에서 1시간 동안 플루오로-4 아세톡시메틸 에스테르((fluo-4 AM; Molecular probes, Eugene, Oregon) 4 μM를 장전하였다. 탈에스테르화를 위해 15분 동안 남은 플루오로-4를 세척한 후 관류 챔버로 옮겼다. Ca2+ 변동을 450~480nm에서 플루오로-4를 여기시켜 영상화하고, 니콘 TE-2000 전위 현미경에 연결되고 Image-Pro Plus 소프트웨어 (Media Cybernetics, Wokingham, UK)로 조절되는, 강화된 CCD(CoolView IDI camera system, Photonic Science, Sussex, UK)를 사용하여 >520 nm에서 방출된 형광을 검출하였다. 상들을 100ms 개별 프레임 노출 시간으로 초당 2 프레임으로 얻었다. 상응하는 시간 흔적들은 관심 영역에서 초기 형광에 대한 형광의 비(F/Fo)로서 정상화된 강도 형광을 나타낸다.

결과

본 발명자들은 기계적 자극에 대한 DRG 감각 뉴런의 반응을 특징화하기 위해 Ca2+ 영상화 실험을 사용하였다. 우선, DRG 뉴런을 소마의 작은 영역(< 1 μm²)에 걸친 접촉법을 사용하여 자극하였다. 도 3은 SICM 피펫이 두번의 1㎛ 단계로 인간 DRG 뉴런 표면으로 접근한 결과를 나타낸다. 첫번째 단계에서, 뉴런은 [Ca²⁺]i에서 작은 증가를 나타낸다. 플루오로-4 형광 강도는 기저 수준(도 3A, 프레임 1)에서 프레임 2의 수준으로 증가한다. 피펫을 1㎛ 더욱 전진시키면, Ca²⁺ 반응의 피크에서 [Ca²⁺]i에서의 추가의 상승을 일으킨다(도 3A, 프레임 3). [Ca²⁺]i 는 약 2분 후 기저 수준으로 돌아가고(도 3A, 프레임 4), 2 ㎛의 세번째 자극에서 다시 [Ca²⁺]i 상승을 유발한다(도 3A, 프레임 5). 본 발명자들은 인간(n=12)과 래트(n=2) DRG 뉴런 모두에서의 접촉 접근법을 평가하였다. 그러나, 이 접촉법의 사용에 중요한 제한이 있었다. 주어진 실험에서 성공한 순차적 자극의 수는 제한되었다. 매번 피펫은 세포의 표면을 접촉하고, 이것은 막에 접착하고 세포를 물리적으로 손상시킬 수 있고; 이것은 세포에서 누수되는 형광단에 의해 증명되고, 형광의 신속한 손실을 가져온다(도 3A, 프레임 6). 뉴런의 접촉 프로토콜은 이 기준에 의해 연구된 뉴런(n=36)의 64 ± 8% 를 "손상시켰다".

비-접촉 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 접촉 접근으로 관찰된 것과 유사한 반응을 생성(인간 n=8; 래트n=32)하였지만, 생산된 자극은 거의 손상되지 않았 다. 비-접촉 접근에 의해 자극된 뉴런의 오직 2.5 ± 2.5% 만이 손상되었다(n=40) (도 5C 참조). 도 4는 래트 DRG 뉴런에 대한 비-접촉 프로토콜을 이용한 순차적 기계적 자극 적용을 나타내고, 각각 세포막을 3 ㎛씩 눌렀다. 각각의 톱니모양은 [Ca²⁺]i를 증가시켰다(도 4B 및 C). 첫번째 자극은 순차적 자극과 비교하여 더 큰 Ca2+ 반응을 생성하였다. 전달된 기계적 자극은 매우 국소화되고 주변의 세포를 훼방하지 않는다(데이타는 도시하지 않음). 도 4D는 비-접촉 프로토콜을 이용한 증가된 강도의 3개의 순차적 기계적 자극에 의해 자극된 하나의 세포의 반응의 예를 나타낸다. [Ca²⁺]i의 점진적 증가가 검출되었다.

도 5는 접촉 및 비-접촉 접근법을 비교한다. 본 발명자들은 MS에 대한 [Ca²⁺]i에서의 증가로 반응한 세포의 백분률을 계산하였다; 접촉 접근법은 비-접촉 접근보다 상당히 많은 세포 수에서 반응을 이끌어내었다(도 5A). 예를 들면, 세포 막에 대해 SICM 피펫의 총 이동 3㎛의 유사 자극으로, 세포의 75%가 접촉 MS (n=16)에 반응하였고 오직 44%만이 비-접촉에 반응하였다(n=14). 이에 더하여, 접촉 접근이 사용되었을 때, [Ca²⁺]i에서의 상승은 비-접촉 접근의 사용보다 상당히 높았다(도 5B). 그러나, 접촉 접근은 실무(all-or-none)반응의 유형을 생산하였고, 반면 비-접촉 접근은 단계적 반응을 생성하였다. 접촉 접근에서의 [Ca²⁺]i의 상승은 자극 강도와 거의 관련이 없다는 것을 나타냈고, 반면, 비-접촉 접근에서, Ca²⁺ 반 응의 진폭은 자극 강도에 의존하였다. 1.5 ㎛ 및 3 ㎛의 하강을 생성하는 기계적 자극은 점진적으로 증가하는 [Ca²⁺]i 상승을 가져왔고, 4.5 ㎛에서 가장 큰 값을 생성하였다(도 5B).

본 발명자들은 성인 래트로부터 배양된 DRG 감각 뉴런에서 기계적 자극에 의해 활성화된 전-세포 내부 전류를 관찰하였다. 접촉과 비-접촉 접근 모두를 사용하였을 때, McCarter et al, Neurosci. Lett. 1999, 273:179-82; Drew et al, J. Neurosci 2002, 22:RC228; 및 Drew et al, J. Physiol. 2004, 556:691-710에 기재된 바와 같이, 기계적 자극은 일시적 및 지속 성분으로 내부 양이온성 전류를 유발하였다(도 6A 및 6B). 접촉 접근의 사용은 제한적인 사용으로, 세포가 금방 손상되거나 패치-클램프 피펫이 이동함에 따라, 직접적인 물리적 접촉, 및/또는 기계적 자극에 의한 방해로 저항 패치가 부서진다. 그러나, 비-접촉 기계적 자극은 잠재적으로 막연히 반복될 수 있고, SICM 탐침과 세포 사이의 물리적 접촉이 없기 때문에 손삭을 막는다. 도 6A는 비-접촉 접근을 이용한 전극 클램프된 래트 DRG 뉴런에 대한 3개의 순차적 기계적 자극을 나타낸다. SICM 피펫은 세포막을 1㎛까지 누르고, 일시적으로 그리고 지속된 성분으로 내부 전류를 활성화시킨다. 유사하기는 접촉 프로토콜은 동류 전류를 활성화시켰다(도 6B). 1㎛ 기계적 자극을 가져오는 것은 도 5B에 나타난 [Ca2+] 상승과 일치하고, 접촉 접근에 의해 활성화된 전-세포 피크 전류(도 6C)는 주어진 서브-최대 기계적 자극의 경우 비접촉 자극(122.1 ± 12.4 pA, n=4)에 비해 상당히 크다(342.7±37.8 pA, n=6).

비-접촉 접근을 사용한 자극 동안 적용된 압력 제트가 기계적으로 민감한(mechanosensitive) 이온 채널을 활성화하기 위해 세포 막의 충분한 이동을 생성하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 압력 제트 단독에 의해 생성된 세포막 이동을 측정하는 실험을 조절하였다. 비-접촉 자극 동안 사용된 것보다 3배 더 높은 알벽을 사용하여, 본 발명자들은 막이 500nm까지 이동하였지만, 전세포 전류에서의 중요한 변화는 검출되지 않았다는 것을 발견하였다(도 6D). 이것은 추가의 이동이고, 압력이 적용되면 탐침이 또한 1mm 이상 움직이고, 이것은 더 큰 세포막의 변형을 가져오고 따라서 압력 단독만이 기계적민감 채널을 활성화시키는 것이 아니라는 것을 의미한다.

인간 DRG 지각 뉴런의 신경돌기는 매우 미세하고, 직경이 수백 나노미터까지 작다. 이들은 지금까지 사용된 기술로 접근하기는 매우 어렵다. 여기서 본 발명자들은 약 1~2㎛ 직경의 수지상 돌기의 기계적 자극에 대한 그들의 반응을 연구하기 위해 비-접촉 접근을 사용하였다. 본 발명자들은 다양한 뉴런의 수렴으로부터 기원하는 2㎛ 직경의 수지상 돌기들 사이의 교차점에 기계적 자극을 적용하는 예를 설명하였다(도 7, 화살표 - No. 2). SICM 피펫을 막에 접근시켰고, 동시에 13 kPa의 압력 제트를 적용하여 표면을 750nm 이동시켰다. 형광 강도를 증가시켰고, 신경돌기를 따라 12㎛/s에서 자극점으로부터 점진적으로 떼어놓았고(도 7, 화살표 - No. 1), 다른 신경동기에서는 (도 7, 화살표 - No. 3) 형광성은 증가하지 않았다.

상기의 모든 문헌의 내용은 본 명세서에 참조로 병합된다.

Claims

주사 탐침 현미경을 이용한 표면의 조사 방법으로, 주사 탐침을 표면에 근접하게 가져가고 표면에 대한 탐침의 위치를 일정 거리를 유지하도록 조절하는 것을 포함하고, 탐침을 통한 액체의 조절된 흐름에 의해 상기 표면에 압력을 적용하고 이어서 탐침의 위치를 모니터링하는 것을 특징으로 하고, 여기서 상기 탐침의 이동은 표면의 결과적인 이동을 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서, 양압이 상기 표면에 적용되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 음압이 상기 표면에 적용되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐침은 마이크로피펫 또는 나노피펫인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조사될 표면은 세포 또는 아세포 구조인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 액체의 표면인 방법.
제6항에 있어서, 상기 액체는 에멀젼인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면은 비-생물학적 구조인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주사 탐침 현미경은 주사 이온-컨덕턴스 현미경인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 내의 또는 표면에서의 전기적 또는 기계적 변화를 모니터링하기 위한 것인 방법.
세포에서의 전기생리학적 또는 화학적 변화를 유도하기 위한 방법으로, 주사 탐침을 세포 표면에 근접하게 가져가고 그리고 탐침을 통한 액체의 조절된 흐름에 의해 정해진 압력을 표면에 적용하고, 그리고 전기생리적 또는 화학적 신호의 변화에 대해 세포를 모니터링하는 것을 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 전기생리학적 또는 화학적 신호는 세포 상에 존재하는 이온 채널과 연관되는 것인 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 주사 이온 컨덕턴스 현미경은 탐침을 세포에 근접하게 가져가는데 사용되는 방법.
주사 탐침 현미경, 및 탐침을 통한 액체의 조절된 흐름에 의해 압력을 표면에 적용하는 수단을 포함하는 표면 조사 장비.
제14항에 있어서, 상기 주사 탐침 현미경은 주사 이온-컨덕턴스 현미경인 장비.