JP2009524818A - キャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画法を用いたタンパク質分離装置およびその方法 - Google Patents
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Abstract
Description
分子生物学およびゲノミクス(ゲノム科学)を含んだ薬物発見のための基礎研究の発展に伴い、最近、薬物発見の領域が急速に変化している。特に、ゲノミック薬物発見で代表される、薬物発見のための新規方法が開発されている。
このため、前述した生命科学および新規医薬品開発などの医薬分野では、特定の疾患または特定の環境で生理学的活性を持つ物質を確認しなければならない。このような生物学的活性を持つ物質は大部分タンパク質からなっており、このようなタンパク質の構造および機能の解明は前記生命科学および医薬分野における本質的な問題に該当する。
また、前記タンパク質がpIの順序に基づいて分離された後、ポリアクリルアミドゲル板の上端の横方向にゲルストリップを固定させた後、縦方向に電気泳動を行うと、タンパク質は分子量の大きさの順で縦方向に分離されるが、この際、タンパク質分子量の小さいものがゲル板の下端に多く移動する。前述した2D−PAGE分離にかかる総時間は約36時間程度である。
ここで、前記等電点電気泳動は、前述した2D−PAGEの等電点電気泳動(IEF)と同一の原理を持つが、ゲルストリップではなく、シリカキャピラリー内で行われる点で差異を示している。前記キャピラリー等電点電気泳動は、キャピラリー内で分離が行われるため、少量のタンパク質試料を処理することができ、高い感度を持つ場合にはpI値が0.003の小さい差異を持つタンパク質の分離も可能である[Quigley, W.C.; Dovichi, N. J. Anal. Chem. 2000, 76, 4645-4658]。
ここで、本発明に係るキャピラリー等電点電気泳動(CIEF)装置は、キャピラリー内で等電点電気泳動を行う装置を意味するものであって、等電点電気泳動用キャピラリー、好ましくはテフロン(登録商標)キャピラリー内に両性電解質担体をタンパク質試料と共に満たした後、電場をかけてタンパク質をタンパク質のpIに基づいて分離する装置を意味する。前記中空糸フローフィールドフロー分画部は、中空糸膜を用いて、中空糸膜に流入されるタンパク質試料混合物からタンパク質を分子量の大きさによって分離する装置を意味する。
また、本発明に係る第1バルブは、その内部のキャピラリー等電点電気泳動装置でpIに基づいて分離されたタンパク質試料の一側に試料ループが備えられ、キャピラリー等電点電気泳動装置でpIに基づいて分離されたタンパク質試料が満たされる。
I)分離分析しようとするタンパク質試料と両性電解質溶液の混合物を第1注入ポンプに満たした後、等電点電気泳動用キャピラリーに前記混合物を供給する段階と、
II)前記等電点電気泳動用キャピラリーに10〜50分間200〜700V/cm、好ましくは約500V/cmの電場をかけて等電点電気泳動させた後、全ての分離が終了するまで200〜700V/cm、好ましくは300V/cmの電場を維持する段階と、
III)第2注入ポンプに陽電解質溶液を満たした後、これを等電点電気泳動用キャピラリーに注入し、等電点電気泳動されたタンパク質分取液を第1バルブに移動させて試料ループに充填させる段階と、
ここで、前記段階III)の試料ループに満たされる等電点電気泳動されたタンパク質の体積は1〜10μL、好ましくは約2μLに調節するが、所望のpI領域の大きさだけ調節する。この際、使用された両性電解質のpH領域が3〜10の場合、1μLの体積は約pI1間隔だけに該当するところ、例えば一番目の試料注入過程で1μLを試料ループに充填すると、タンパク質のpI領域は約9〜10領域に該当する。
一方、本発明に係る第3連結部材14および第4連結部材16を互いに連結設置するにおいて、前記第3連結部材14の一側に連結設置された等電点電気泳動用キャピラリー12でpIに基づいて分離されたタンパク質試料が第4連結部材16へ移動しないようにタンパク質試料が通過し得ない別途の分離膜64、好ましくは分子量透過限界30kDa以下、より好ましくは約10kDaの半透膜が備えられたキャピラリー、特定的にシリカキャピラリー38を用いて前記第3連結部材14および第4連結部材16を連結設置する。
本発明に係る中空糸フローフィールドフロー分画部4は、キャピラリー等電点電気泳動部2の第3連結部材14の一側に連結設置され、キャピラリー等電点電気泳動装置2で分離されたタンパク質試料が流入される第1バルブ26と、前記第1バルブ26の一側に連結設置された中空糸膜32と、前記第1バルブ26が連結設置された中空糸膜32の一側に対向する他側に連結設置された検出器52と、前記第1バルブ26および前記第1バルブ26に連結設置された中空糸膜32の一側の終端に対向する他側の終端に連結設置され、内部に緩衝溶液を貯留する緩衝溶液貯留部材48と、前記緩衝溶液貯留部材48に連結設置され、貯留された緩衝溶液を前記第1バルブ26および前記中空糸膜32に供給する供給ポンプ50とから構成される。
まず、分離分析しようとするタンパク質試料と両性電解質溶液、好ましくはpH3〜10、濃度2〜5%の両性電解質溶液混合物を第1注入ポンプ10に満たした後、等電点電気泳動用キャピラリー12、好ましくはテフロン(登録商標)キャピラリーに前記混合物を供給する。
タンパク質分離装置の製造
図2に示すように、等電点電気泳動用キャピラリーとして、9.5cm×310μm(内径)のテフロン(登録商標)キャピラリー(Vernon Hills、Cole−Parmer社、米国)の一側終端に外径360μm、内径50μmのシリカキャピラリー(Phoenix、Polymicro Technologies社、米国)を連結管として2つのマイクロ−ティーを順次連結設置した。
タンパク質標準物に対するキャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画装置の分離
実施例1によって製造されたタンパク質分離装置(キャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画装置)の分離能を評価するために、5つのタンパク質標準物を混合してタンパク質混合物試料を準備した。ここで、前記タンパク質標準物の混合物の組成は表1の通りであった。
また、タンパク質試料の5番ピークは、分離された時間が、分子量領域からみるとき150kDarが検出される時間帯に現れたことからみて、タンパク質試料の変性を回避することができるものと確認された。
実施例2に使用されたタンパク質試料(タンパク質標準物の混合物)を2D−PAGE方法によって分離した。
その結果を図6に示した。
キャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画装置を用いたヒト尿タンパク体の分離
実施例1によって製造されたタンパク質分離装置(キャピラリー等電点電気泳動−中空糸フローフィールドフロー分画装置)を用いてヒトの尿から抽出したタンパク体試料の分離に適用しようとした。
収去した小便は、分子量透過限界30kDaを有する分離膜を用いてろ過することにより、分子量透過限界30kDa以上のタンパク体試料のみを使用した。
まず、実施例2と同様の方法で行うが、実施例2のタンパク質標準物の混合物の代わりに濾過された尿タンパク体試料40μgを使用し、中空糸膜における分子量分離の際には等電点電気泳動されたタンパク質試料バンドを6つのpH領域に分けて注入した。pH9〜10、8〜9、7〜8、7〜7、5〜6、および3〜5の6段階に分けられて注入されたタンパク質体試料バンドは、中空糸フローフィールドフロー分画でそれぞれ分離された。
図7に示すように、キャピラリー等電点電気泳動による分取液のpHが減少するにつれて、分離時間5分帯で現れるピークの強度は大きく増加するものと確認された。また、5分以後には2番目のピークがpH6〜7で新しく現れ始めた。
反面、キャピラリー等電点電気泳動による分取液Fはいずれのピークも示していないものと思われるところ、これは、キャピラリー等電点電気泳動チュービング内でフィールドフロー分画分離して待機しているタンパク質のうち、pH3〜5の分取液は最後の分離段階まで待機しなければならず、この際、電気浸透流れによる影響で一部のタンパク質が陰極方向に移動し、その結果pI3〜5に該当するタンパク質が前側の分取液に移動したものと推定される。
実施例3に使用された尿タンパク体試料400μgを2D−PAGE方法によって分離した。
その結果を図8に示した。
ナノ流速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法を用いた尿タンパク質分取液に対するタンパク質分析
実施例3によって分離されるタンパク質を5分間隔で収去したタンパク質分取液の総24個をそれぞれトリプシン酵素を用いて加水分解した後、ペプチド混合物に転換してそれぞれの24個の試料に対してナノ流速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析法で分離分析してタンパク質識別過程を行った。
その結果を図9に示した。
流速は勾配溶離全区間にわたって200nL/minを維持した。
Claims (15)
- タンパク質試料をpIに基づいて1次分離するキャピラリー等電点電気泳動装置、および前記キャピラリー等電点電気泳動装置の一側に連結設置され、1次分離されたタンパク質を2次分離する中空糸フローフィールドフロー分画部を含むことを特徴とする、タンパク質分離装置。
- 前記キャピラリー等電点電気泳動装置は、等電点電気泳動用キャピラリーと、前記等電点電気泳動用キャピラリーの終端の一側に連結設置された第1連結部材と、前記第1連結部材の一側に連結設置され、タンパク質試料および両性電解質混合物を注入する第1注入ポンプと、前記第1連結部材の一側に連結設置された第2連結部材と、前記第2連結部材の一側に連結設置され、陽電解質溶液を注入する第2注入ポンプと、前記第2連結部材の一側に連結設置された陽極と、前記第1連結部材が連結設置された等電点電気泳動用キャピラリーの一側の終端に対向する他側の終端に連結設置された第3連結部材と、前記第3連結部材の一側に連結設置された第4連結部材と、前記第4連結部材の一側に連結設置された陰極電解質蓄積部材と、前記陰極電解質蓄積部材が連結設置された第4連結部材の一側に対向する他側に連結設置された陰極とを含むことを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質分離装置。
- 前記等電点電気泳動用キャピラリーがテフロン(登録商標)キャピラリーであることを特徴とする、請求項2に記載のタンパク質分離装置。
- 前記第3連結部材および前記第4連結部材は、分子量透過限界約10kDaの半透膜が備えられたキャピラリーによって連結設置されることを特徴とする、請求項2に記載のタンパク質分離装置。
- 前記中空糸フローフィールドフロー分画部は、キャピラリー等電点電気泳動装置の第3連結部材の一側に連結設置され、キャピラリー等電点電気泳動装置で分離されたタンパク質試料が流入される第1バルブと、前記第1バルブの一側に連結設置された中空糸膜と、前記第1バルブが連結設置された中空糸膜の一側に対向する他側に連結設置された検出器と、前記第1バルブおよび前記第1バルブに連結設置された中空糸膜の一側の終端に対向する他側の終端に連結設置され、内部に緩衝溶液を貯留する緩衝溶液貯留部材と、前記緩衝溶液貯留部材に連結設置され、貯留された緩衝溶液を前記第1バルブおよび前記中空糸膜に供給する供給ポンプとを含むことを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質分離装置。
- 前記中空糸フローフィールドフロー分画部は、緩衝溶液貯留部材から排出される緩衝溶液の移動回路を2つの流れ経路に分離した後、それぞれの流れ経路に第2バルブおよび第3バルブをそれぞれ連結させ、前記第2バルブの一側に第1圧力バルブおよび第1バルブを順次連結させ、前記第3バルブの一側を第1バルブが連結設置された中空糸膜の一側に対向する他側の終端に連結設置したことを特徴とする、請求項5に記載のタンパク質分離装置。
- 前記第1バルブと前記中空糸膜との間に備えられ、第1バルブから流入されるタンパク質および試料を中空糸膜に移動させる経路を提供すると同時に、その一側が放射流れに連結設置された第5連結部材をさらに含むことを特徴とする、請求項5または6に記載のタンパク質分離装置。
- 前記中空糸膜がポリスチレンスルホン酸、ポリ塩化ビニール、ポリアクリロニトリルまたはこれらの混合物からなることを特徴とする、請求項5または6に記載のタンパク質分離装置。
- 前記第1バルブに試料ループがさらに備えられたことを特徴とする、請求項5または6に記載のタンパク質分離装置。
- 前記第1バルブが6ポートバルブであることを特徴とする、請求項5または6に記載のタンパク質分離装置。
- I)分離分析しようとするタンパク質試料と両性電解質溶液の混合物を第1注入ポンプに満たした後、等電点電気泳動用キャピラリーに前記混合物を供給する段階と、
II)前記等電点電気泳動用キャピラリーに約10〜50分間200〜700V/cmの電場をかけて等電点電気泳動させた後、全ての分離が終了するまで200〜700V/cmの電場を維持する段階と、
III)第2注入ポンプに陽電解質溶液を満たした後、これを等電点電気泳動用キャピラリーに注入し、等電点電気泳動されたタンパク質分取液を第1バルブに移動させて試料ループに満たす段階と、
IV)緩衝溶液貯留部材の一側に連結設置された供給ポンプを作動させ、緩衝溶液貯留部材に貯留された緩衝溶液を第1バルブに供給して、前記試料ループに満たされたタンパク質分取液を中空糸膜に供給すると同時に、前記第1バルブに連結設置された中空糸膜の終端の一側に対向する他側の終端へ緩衝供給を供給して平衡を維持する段階と、
V)前記段階IV)の平衡が終了した後、第3バルブを閉鎖し、その後緩衝溶液貯留部材の緩衝溶液を第1バルブを介して中空糸膜に流入されるようにして、フローフィールドフロー分画法で分子量の小さいタンパク質から分子量の大きいタンパク質の順でタンパク質を分離して検出器に流入させる段階とを含むことを特徴とする、タンパク質分離方法。 - 前記段階V)の後、エレクトロスプレーイオン化質量分析器を直接連結して分析する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項11に記載のタンパク質分離方法。
- 前記段階V)の後、分離されたタンパク質試料を回収してプロテオームを分析する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項11に記載のタンパク質分離方法。
- 前記段階III)の試料ループに満たされる等電点電気泳動されたタンパク質の体積は、1〜10μLに調節するが、所望のpI領域の大きさだけ調節することを特徴とする、請求項11〜13のいずれか1項に記載のタンパク質分離方法。
- 前記段階IV)において、前記第1バルブおよび前記第1バルブに連結設置された中空糸膜の終端の一側に対向する他側の終端に流れる緩衝溶液の流速比率が1:9〜5:5に調節され、中空糸膜の両側の終端に流入される緩衝溶液は中空糸膜の入口から全長の約10〜50%となる位置で集中し、前記タンパク質分取液試料は中空糸膜の入口から全長の約10〜50%となる位置で平衡を成すことを特徴とする、請求項11〜13のいずれか1項に記載のタンパク質分離方法。
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