FI103438B - Kapillaarielektroforeesilaite - Google Patents

Description

103438

Kapillaarielektroforeesilaite - Kapillarelektroforesanordning

Keksinnön kohteena on kapillaarielektroforeesilaite, joka soveltuu erilaisten kapil-5 laarielektroforeesimenetelmien, kuten vyöhyke-elektroforeesin, isoelektrisen fokusoinnin, isotakoforeesin ja elektrokineettisen misellikromatografian, helppoon suorittamiseen.

Elektroforeesi on sähkökemiallinen menetelmä, jolla voidaan erottaa toisistaan 10 elektrolyyttiliuoksessa olevia sähkövarauksellisia ja tietyillä erikoismenetelmillä myös varauksettomia hiukkasia, joiden koko voi vaihdella pienimmistä ioneista ja molekyyleistä kolloidisiin hiukkasiin. Hiukkaset kulkevat niiden sähkövarauksesta ja muista ominaisuuksista riippuen eri nopeuksilla sähkökentässä. Elektroforeettiset menetelmät voidaan luokitella monin eri tavoin. Eräs luokitus perustuu kantaja-ai-15 neeseen tai laitteeseen, jolla eliminoidaan konvektio nestefaasissa, esim. paperi, geeli, kolonni tai kapillaari.

Kapillaarielektroforeesi on yksi analyytisen kemian nopeimmin etenevistä sovellutusalueista. Menetelmässä taustaliuos on niin ohuessa putkessa, kapillaarissa, että 20 nesteen viskoosivoimat estävät konvektion. Kapillaarin sisähalkaisija on tavallisesti välillä 0,01 ja 1 mm. Elektroforeesi suoritetaan siis vapaassa liuoksessa, millä eliminoidaan kantaja-aineen aiheuttamat häiriöt. Kapillaarista on myös helppo poistaa sähkövirran kehittämä lämpöenergia, joten voidaan käyttää suurta sähkökenttää, mikä nopeuttaa erottumista. Kapillaarielektroforeesi on lisäksi helppo automatisoida.

} 25

Kapillaarielektroforeesissa kaksi taustaelektrolyyttiliuosta sisältävää astiaa on yhdis- • · · : tetty kapillaariputkella, joka sisältää samaa liuosta. Kumpikin astia on varustettu elektrodilla. Tutkittava näyte sijoitetaan kapillaarin alkupäähän lyhyeksi vyöhyk-keeksi. Yleensä näytteen syöttöä varten kapillaarin pää siirretään taustaliuosastiasta 30 näyteastiaan ja takaisin. Tämä operaatio aiheuttaa häiriöitä ja vääristymiä tausta-# liuoksessa kapillaarin pään kohdalla ja näytevyöhykkeessä ja huonontaa menetel- män tarkkuutta. On myöskin välttämätöntä kääntää virta pois päältä kapillaarin siirtämisen ajaksi astiasta toiseen, mikä saattaa aiheuttaa muutoksia ajo-olosuhteissa.

•...: Samat haitat aiheutuvat myös siitä, jos taustaliuos vaihdetaan ajon aikana.

35 ...,: Myöskin elektrodeilla tapahtuvat reaktiot muuttavat taustaliuosastioissa olevan liuoksen koostumusta ja nämä muutokset saattavat kulkeutua kapillaariin aiheuttaen koesarjan parametrien vääristymistä.

2 103438

Kapillaarielektroforeesi voidaan suorittaa erilaisia sovelluksia käyttäen. Tavallisimmin käytetyt sovellukset ovat kapillaarivyöhyke-elektroforeesi (CZE), kapillaari-iso-elektrinen fokusointi (CIEF), kapillaari-isotakoforeesi (CITP) ja elektrokineettinen misellikapillaarikromatografia (MECC). Vaikka nämä sovellukset näyttävät ulospäin 5 erilaisilta, ohjaavat niitä samat sähkökemialliset lait. Eri sovelluksia saadaan aikaan soveltamalla erilaisia alku-ja reunaehtoja elektroforeesijärjestelmään.

Yleensä kaupalliset kapillaarielektroforeesilaitteet sallivat eri elektroforeesisovellus-ten suorittamisen. Laitteilla on kuitenkin tiettyjä haittoja tai rakennepiirteitä, jotka 10 rajoittavat helppoa siirtymistä sovelluksesta toiseen ja myöskin järjestelmäparamet-rien muuttamista ajon aikana.

Useat tutkijat ovat esitelleet laiteratkaisuja, joilla edellä mainitut haitat kyetään osittain poistamaan. Virtanen, Acta Polytechnica Scandinavica, Chemistry Including 15 Metallurgy Series, No. 123 (1974), s. 1-67, käytti jo 1960-luvulla injektiotekniikkaa, joka sallii näytteen injektoimisen sähkövirran aikana. Verheggen et ai., J. Chroma-togr., 452 (1988), s. 615-622, ja Zare et ai., US-patentti 5 141 621, ovat myöskin esittäneet menetelmän näytteen injektoimiseksi kapillaarielektroforeesi-laitteeseen sähkövirtaa katkaisematta. Nämä menetelmät ja laitteet eivät kuitenkaan tarjoa väli-20 neitä käyttää hyväksi niitä monia mahdollisuuksia, joita eri elektroforeesisovellusten teoreettinen yhdenmukaisuus tarjoaa.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan uusi kapillaarielektroforeesi- laite, jolla edellä mainitut haitat voidaan poistaa, ja jolla kyetään helposti suoritta- 25 maan kaikki kapillaarielektroforeesin eri sovellukset samalla laitteella. Tämän saa- v.: vuttamiseksi on keksinnölle tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksen 1 tunnus- • · · • merkkiosassa on esitetty.

• · • · • · ·

Tietyn elektroforeesisovelluksen suorittamiseksi tulee valita tietyt alku- ja reunaeh- 30 dot. Reunaehtojen säätely kapillaarielektroforeesijärjestelmässä tarkoittaa, että ka- ^ pillaarin päiden läheisyydessä olevan taustaliuoksen koostumusta tulee kontrolloida.

*·;·. Tämä suoritetaan keksinnön mukaisesti siten, että pumpataan jatkuvasti uutta liuosta • · * erotuskapillaarin päiden ohitse. Tällä estetään myöskin elektrodirektioissa syntynei-' den reaktiotuotteiden kulkeutuminen kapillaariin. Taustaliuoksen suuren kulutuksen 35 välttämiseksi liuoskanavilla tulee olla mahdollisimman pieni tilavuus. Esillä oleva keksinnön mukaisen laitteen suunnittelu perustuu tähän periaatteeseen. Keksinnön mukaisessa laitteessa koeolosuhteet voidaan valita ilman rajoituksia ja niitä voidaan muuttaa vapaasti ajon aikana.

103438

Keksintöä selostetaan seuraavassa yksityiskohtaisesti viittaamalla oheisiin piirustuksiin, joissa kuva 1 esittää keksinnön mukaista erästä suoritusmuotoa; ja 5 kuva 2 esittää keksinnön mukaista erästä toista suoritusmuotoa.

Kuvissa 1 ja 2 on esitetty keksinnön mukainen laite, jossa erotuskapillaarin 1 päät on sijoitettu erilaisten liuosten syöttämiseen säiliöistä R1-R6 tarkoitettujen, kapil-laarikanavien 2 ja 3 alapäistä jatkuviin laajennuksiin 7 ja 5 (kuvio 2). Laajennusten 10 läpimitta on edullisesti noin 0,5-3 mm. Nämä laajennukset 5 ja 7 jatkuvat oleellisesti laajennuksen levyisinä jätekanavina W1 ja W2 jätesäiliöihin. Kapillaarikanavien 2 ja 3 sisähalkaisija on edullisesti 0,01-1,0 mm ja edullisemmin 0,02-0,5 mm. Kapil-laarikanavat 2 ja 3 voidaan sijoittaa myös muulla tavalla kuin kuvissa on esitetty Taustaliuoksena käytettävä elektrolyyttiliuos virtaa jostain säiliöistä R1-R3 ja jos-15 tain säiliöistä R4-R6 näitä kapillaarikanavia 2 ja 3 pitkin hitaasti ohi molempien erotuskapillaarin 1 päiden jätekanavissa W1 ja W2 sijaitsevia, jännitelähteeseen kytkettyjä virtaelektrodeja E kohti, ja lopuksi poistuu järjestelmästä jätekanavia pitkin jätesäiliöihin. Jätesäiliöt on sijoitettu välimatkan päähän erotuskapillaarin 1 päistä ja elektrodit E on edullisesti sijoitettu jätekanavien W1 ja W2 loppupäihin, jolloin 20 elektrodeilla muodostuvien elektrolyysituotteiden kulkeutuminen erotuskapillaariin estyy mm. pitkän ja tilavan jätekanavan vuoksi. Virtausnopeus säädetään siten, että vaaditut olosuhteet erotuskapillaarissa 1 säilyvät ja lisäksi elektrodien elektrolyysi-tuotteiden kulku erotuskapillaariin estyy.

: 25 Liuossäiliöistä R1-R6 tulevaa syöttöliuosta voidaan vaihtaa itsenäisesti pumppujen v.: P avulla, ja myöskin eri syöttöliuoksien virtausnopeutta voidaan säätää itsenäisesti.

• · * • Sen jälkeen kun elektroforeesiajo on suoritettu loppuun, jossain säiliöistä R1-R6 si- :*·.· jaitsevat pesu- ja tasapainotusliuokset voidaan pumpata kapillaarijärjestelmän läpi.

Pumppu voidaan myös asentaa jätekanavaan W2, jolloin se toimii imuperiaatteella.

30 Tällöin kuvissa 1 ja 2 pumppujen P asemasta voidaan käyttää venttiilejä ja imu saa- ' daan aikaan pumpun SP avulla. Pumppujen ja venttiilien määrä on valinnainen ja se *·:·. voidaan valita käytetyn sovelluksen mukaan. Mikäli ei tarvita virtausnopeudelle • · · korkeaa tarkkuutta, voidaan pumput myöskin kokonaan korvata venttiileillä ja luoda virtaus painovoiman avulla tai liuosastioissa R1-R6 olevan alipaineen tai ylipaineen 35 avulla.

Oleellisesti erotuskapillaarin 1 ulostulopään läheisyyteen on sijoitettu ilmaisin 4, jonka avulla kapillaarissa erotetut hiukkaset detektoidaan. Detektointi voidaan suo- 4 103438 littaa esim. näytteen absorbanssiin perustuen. Koko laitteen toimintaa voidaan ohjata mikroprosessorin avulla.

Käyttämällä sopivia pumppuja ja venttiileitä, voidaan suorittaa suljettu tai avoin 5 kapillaarielektroforeesi tai aikaansaada ennalta laskettu virtausnopeus kapillaariin. Keksinnön mukaisella laitteella on myöskin mahdollista ajaa erilaisia kemiallisia gradientteja ja pulsseja ajon aikana erotuskapillaarin kummasta päästä tahansa.

Keksinnön mukaisessa laitteessa näyte voidaan injektoida periaatteessa ainakin kah-10 della eri tavalla. Ensinnäkin yksi kuvioiden 1 ja 2 esittämien laitteiden injektiopuo-lella sijaitsevista liuossäiliöistä R1-R3 voi sisältää näyteliuosta. Tällöin näyte syötetään kapillaaria 2 pitkin erotuskapillaariin 1.

Toisen näytteensyöttötavan periaate on esitetty kuviossa 2. Tätä näytteensyöttötapaa 15 kuvataan myöskin hakijan aikaisemmassa FI-patenttihakemuksessa 961069, joka sisällytetään tähän viitteenä. Tässä keksinnön mukaisen laitteen suoritusmuodossa laitteen injektiopuolella erotuskapillaarin 1 pää on sijoitettu ylhäältä avoimeen putkeen 5, joka muodostaa edellä mainitun kapillaarikanavan 2 alapäästä jatkuvan laajennuksen vastaten kuvion 1 laajennusta 7, ja jonka sisähalkaisija on erotuskapillaa-20 rin ulkohalkaisijaa suurempi. Putki 5 toimii myös jätekanavan W1 osana. Tausta-liuos virtaa erotuskapillaarin 1 pään läheisyyteen oleellisesti putken 5 pohjan kohdalta kapillaaria 2 pitkin. Tässä näytteensyöttötavassa näyteliuos tuodaan erotuskapillaarin 1 pään läheisyyteen liikkuvan näytteensyöttökapillaarin 6 avulla, jonka sisähalkaisija, ollen edullisesti noin 0,5-1,5 mm, on suurempi kuin kapillaarielektro-. : 25 foreesilaitteen erotuskapillaarin 1 pään ulkohalkaisija. Näytteensyöttökapillaarin 6 sisähalkaisijan ja erotuskapillaarin 1 ulkohalkaisijan ero on tyypillisesti noin 0,2-# 5 mm. Näytteensyöttökapillaari 6 täytetään näyteliuoksella ja sen pää asetetaan ero- tuskapillaarin 1 pään ympärille siten, että päät menevät sisäkkäin. Näytteensyöttökapillaarin sisältämä näyteliuos ympäröi erotuskapillaarin pään kokonaan, jolloin .. 30 taustaliuos korvautuu täysin näyteliuoksella erotuskapillaarin 1 pään ympärillä.

• · Näytteessä olevat sähköisesti varautuneet hiukkaset kulkeutuvat erotuskapillaariin 1 sähkövirran vaikutuksesta. Liuoksen elektro-osmoottinen virtaus kuljettaa näyte-liuosta erotuskapillaariin 1. Myöskin imupumppua SP voidaan käyttää näytteen injektoimisessa. Näytettä syötetään tietty aika, jonka jälkeen näyteensyöttökapillaari 6 35 vedetään pois erotuskapillaarin 1 sisäänmenopään ympäriltä.

5 103438

Myös kuvion 2 mukaisessa laitejärjestetyssä näyte voidaan syöttää käyttämättä erillistä näytteensyöttökapillaaria 6, jolloin näyteliuos syötetään jostain säiliöstä R1-R3 kapillaaria 2 pitkin.

5 Mikäli näyteliuosta syötetään pumppaamalla sähkökentän ollessa kytkettynä, säädeltävissä oleva määrä näytettä kulkeutuu erotuskapillaariin 1. Injektoitavan näytteen määrä määrätään säätämällä pumppausaikaa, sähkökenttää ja elektro-osmoottista virtausnopeutta.

10 Elektro-osmoottinen ja hydrodynaaminen nettovirtaus erotuskapillaarissa voidaan estää sulkemalla kanavajärjestelmä detektorin 4 puolella. Tällöin syöttö voidaan tehdä puhtaasti sähkökineettisesti. Eri parametrejä, injektiotyyppiä, sähkökenttää ja liuoksen virtausta vaihtelemalla on keksinnön mukaisella laitteella mahdollista saada helposti aikaan useita erilaisia näytteensyöttötapoja.

15

Haluttaessa voidaan valita mikä tahansa sovellustapa ja ajo-olosuhteet ja modifioida niitä ajon aikana.

Keksinnön mukaista laitetta käyttämällä on helppoa valita ja toteuttaa alku- ja reu- 20 naehdot erilaisille elektroforeesisovelluksille. Lisäksi on mahdollista käyttää yhdistettyjä menetelmiä muuttamalla reunaehtoja elektroforeesiajon aikana. Seuraavassa esitetään muutamia esimerkkejä esillä olevan keksinnön mukaisen laitteen monipuolisista käyttömahdollisuuksista.

25 Esimerkki 1 • · t • · · • · • · :*.t< Kuvion 2 avulla kuvataan keksinnön mukaisen laitteen yksinkertainen vyöhyke- elektroforeesisovellutus. Injektiopuolella tarvitaan vain yksi pumppu taustaliuoksen syöttämistä varten taustaliuossäiliöstä (esim. säiliö Rl). Detektoripuolella tarvitaan .. 30 pumppu taustaliuoksen syöttämistä varten (esim. säiliöstä R4) ja lisäksi haluttaessa pumput pesu- ja tasapainotusliuoksille (esim. säiliöt R5 ja R6). Imupumppu SP ei » · « ole tarpeen. Taustaliuosta pumpataan jatkuvasti ohi erotuskapillaarin 1 molempien päiden. Jännitettä pidetään yllä koko ajan. Molemmat jätekanavat W1 ja W2 pidetään auki ympäristön paineeseen, joten hydrostattinen paine-ero erotuskapillaarissa 35 on nolla ja elektro-osmoottinen virtaus tapahtuu vapaasti. Kun ajo-olosuhteet ovat stabilisoituneet, näyte injektoidaan asettamalla näyteliuosta sisältävä näytteensyöttö-kapillaari 6 erotuskapillaarin 1 pään ympärille putkeen 5. Näytteenottokapillaari vedetään pois sopivan ajan kuluttua ja erotusajo alkaa. Kun ajo on suoritettu loppuun, 6 103438 erotuskapillaari 1 valmistellaan seuraavaa näyteinjektointia varten. Tämä voidaan tehdä monilla eri tavoilla tapauksesta riippuen. Mikäli pesu ei ole tarpeen, voidaan odottaa kunnes sähkövirta ja elektro-osmoottinen virtaus uudistaa taustaliuoksen erotuskapillaari s s a. Uudistaminen voidaan tehdä nopeasti sulkemalla jätekanavan 5 venttiili siten, että taustaliuoksen virtaus ohjautuu erotuskapillaarin 1 kautta. Kun olosuhteet ovat jälleen stabiloituneet, laite on valmis seuraavaa näyteinjektointia varten.

On mahdollista pitää jätekanava W2 kiinni detektoripuolella ajon aikana. Tätä kut-10 sutaan suljetuksi kapillaarisovellukseksi. Tällöin myöskin pumppaus detektoripuolella tulee lopettaa, mikäli sen ei haluta aiheuttavan laminaarista hydrodynaamista virtausta erotuskapillaari ssa 1. Vaikkakin pumppaaminen lopetetaan, elektrodeilla E muodostuvien elektrolyysituotteiden kulkeutuminen erotuskapillaariin 1 estyy pitkän ja tilavan jätekanavan vuoksi. Tässä tapauksessa ei esiinny elektro-osmoottista net-15 tovirtausta, joka saattaa aiheuttaa mm. vaihtelua ajoajoissa.

Esimerkki 2

Toisena sovelluksena mainitaan isoelektrinen fokusointi. Se suoritetaan kuvion 1 20 mukaisella laitteella. Tässä sovelluksessa käytetään injektiopuolella kolmea pumppua (säiliöt Rl, R2 ja R3) ja detektoripuolella kahta pumppua (esim. säiliöt R4 ja R5). Imupumppu SP ei ole välttämätön. Alkutasapainotuksen ja kapillaarijärjestel-män täyttämisen jälkeen toimitaan seuraavasti. Erotuskapillaari 1 täytetään amfo-. lyyttiliuoksella sulkemalla jätekanava Wl. Jätekanava W2 on auki. Pumpataan : . : 25 amfolyyttiliuosta säiliöstä R2. Näyteliuosta pumpataan säiliöstä R3 ja sen jälkeen pumpataan säiliöstä R2 vielä lyhyt tulppa amfolyyttiliuosta. Näyte voidaan myös :·. etukäteen sekoittaa amfolyyttiliuokseen, joka voi täyttää koko kapillaarijärjestelmän.

*·:·. Järjestelmä valmistellaan fokusointia varten avaamalla jätekanava W1 ja pumppaa malla anolyyttiä H3PO4 säiliöstä Rl ja katalyyttiä NaOH säiliöstä R4 erotuskapil- .. 30 laarin päiden ohi jätekanaviin. Virta kytketään päälle ja fokusointi alkaa. Fokusoin- • · : " nin loppuun suorittamisen jälkeen erotuskapillaarissa oleva liuos työnnetään hitaasti *·* * detektorin 4 ohitse sulkemalla jätekanava W1 ja jatkamalla pumppaamista säiliöistä

Rl ja R4. Kapillaarijärjestelmän valmisteleminen uutta ajoa varten voi käsittää pesun NaOH:lla säiliöstä R4 ja vedellä säiliöstä R5, kun jätekanava W2 on suljettuna 35 ja jätekanava W1 on auki.

7 103438

Edellä on esitetty eräitä keksinnön sovelluksia. Keksintöä luonnollisesti ei rajoiteta edellä esitettyihin esimerkkeihin, vaan keksinnön mukaista periaatetta voidaan muunnella patenttivaatimusten suoja-alan puitteissa.

* * « • · · • · • · • · • · • * · « · * • · · « · • · ·

Claims (9)

1. Kapillaarielektroforeesilaite, joka käsittää taustaelektrolyyttiliuosta sisältävät säiliöt, jotka ovat yhteydessä toisiinsa erotuskapillaarin (1) välityksellä, jännite-5 lähteeseen kytketyt virtaelektrodit (E) ja detektorin (4) oleellisesti erotuskapillaarin (1) ulostulopään läheisyydessä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää yhden tai useamman liuossäiliön (R1-R3) laitteen injektiopuolella ja yhden tai useamman liuos-säiliön (R4-R6) laitteen detektoripuolella ja että erotuskapillaarin (1) päät on sijoitettu erilaisten liuosten syöttämiseen säiliöistä (R1-R6) tarkoitettujen, kapillaarika-10 navien (2, 3) alapäistä jatkuviin laajennuksiin (5, 7), jotka laajennukset jatkuvat jä-tekanavina (Wl, W2) jätesäiliöihin, jotka jätesäiliöt sijaitsevat välimatkan päässä erotuskapillaarin (1) päistä, ja että virtaelektrodit (E) sijaitsevat jätekanavissa (Wl, W2) edullisesti niiden loppupäiden läheisyydessä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kapillaarielektroforeesilaite, tunnettu siitä, että laajennusten (5, 7) läpimitta on edullisesti noin 1-10 mm.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kapillaarielektroforeesilaite, tunnettu siitä, että kapillaarikanavien (2, 3) ja erotuskapillaarin (1) sisähalkaisija on edullisesti 20 0,01-1,0 mm ja edullisemmin 0,02-0,5 mm.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kapillaarielektroforeesilaite, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi pumput (P) liuossäiliöiden (R1-R6) yhteydessä, joiden avulla liuosastioista (R1-R6) tuleva syöttöliuos valitaan ja sen virtausnopeus säädetään it- , 25 senäisesti. • · · » · · • · • · · : V

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kapillaarielektroforeesilaite, tunnettu siitä, • # : ’·· että se käsittää imupumpun (SP) jätekanavassa (W2), ja venttiilit ja/tai pumput (P) I»» :#: : liuossäiliöiden (Rl-R6) yhteydessä. 30

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kapillaarielektroforeesilaite, tunnettu siitä, • · että pumput (P) on korvattu venttiileillä ja virtaus kapillaarikanavissa (2, 3) syntyy / , painovoiman avulla tai liuosastioissa (R1-R6) olevan alipaineen tai ylipaineen • < « ' · ‘: avulla. 35 ·.

· 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kapillaarielektroforeesilaite, tunnettu siitä, . . että laite käsittää laitteen injektiopuolella ylhäältä avoimen, kapillaarikanavan (2) 9 103438 alapäästä jatkuvan laajennuksen muodostavan putken (5), johon erotuskapillaarin (1) pää on sijoitettu.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kapillaarielektroforeesilaite, tunnettu siitä, 5 että se käsittää näytteensyöttökapillaarin (6), jonka sisähalkaisija on suurempi kuin kapillaarielektroforeesilaitteen erotuskapillaarin (1) pään ulkohalkaisija ja jonka ul-kohalkaisija on pienempi kuin putken (5) sisähalkaisija ja jonka avulla näyteliuos tuodaan erotuskapillaarin (1) pään läheisyyteen putken (5) sisään siten, että näytteensyöttökapillaarin (6) pää sijaitsee erotuskapillaarin (1) pään ympärillä.

8 103438

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen kapillaarielektroforeesilaite, tunnettu siitä, että näytteensyöttökapillaarin (6) sisähalkaisija on edullisesti noin 0,5-1,5 mm. 15