DE102011076230B4

DE102011076230B4 - Verfahren zur Probentrennung in der Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung

Info

Publication number: DE102011076230B4
Application number: DE102011076230.2A
Authority: DE
Inventors: Roland Welz
Original assignee: Postnova Analytics GmbH
Current assignee: Postnova Analytics GmbH
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2011-05-20
Publication date: 2022-06-30
Anticipated expiration: 2031-05-21
Also published as: DE102011076230A1; WO2012160019A1

Abstract

Verfahren zur Analyse einer Probe mittels Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung, umfassend die folgenden Schritte:(i) die Injektion einer Probe unter Verwendung eines Laufmittels in eine oder mehrere Hohlfaser(n) (6),(ii) die Fokussierung der Probe mit Hilfe des Laufmittels in der/den Hohlfaser(n) (6) und(iii) die Elution der Probe mit dem Laufmittel aus der/den Hohlfaser(n) (6) unter dem Einfluss eines Trennfeldes und die Detektion der aufgetrennten Probe mit einem oder mehreren Detektor(en) (10) dadurch gekennzeichnet, dass der Volumenstrom (VD) und die Flussrichtung des Laufmittels durch den/die Detektor(en) (10) zumindest während der Schritte (ii) und (iii) einschließlich des Übergangs von Schritt (ii) zu Schritt (iii) gleich bleiben, wobei während der Fokussierung in Schritt (ii) das Laufmittel mit Hilfe einer Rückdruckkapillare (9) und eines T-Verbinders (8) in einen ersten Teil, der in Richtung des Auslasses der Hohlfaser(n) (6) strömt, und einen zweiten Teil, der in Richtung des/der Detektors/Detektoren (10) strömt, aufgeteilt wird und die Länge und der Durchmesser der Rückdruckkapillare (9) so gewählt sind, dass der Rückdruck durch die Kapillare immer höher ist als der Druckabfall über die Hohlfaser(n) (6) .

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Probentrennung mittels Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung (HF5) sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Stand der Technik
Die Feld-Fluss Fraktionierung (FFF) ist ein quasichromatographisches Analyseverfahren zur Trennung makromolekularer und kolloidaler Proben. Im Gegensatz zur Chromatographie erfolgt die Probentrennung bei der Feld-Fluss Fraktionierung nicht in einer gepackten Säule sondern in einem speziellen, sehr flachen offenen Trennkanal, der keine stationäre Phase enthält. Aufgrund der geringen Kanalhöhe bildet sich innerhalb des Kanals ein laminarer Fluss mit einem parabolischen Strömungsprofil aus. Die Auftrennung der Proben erfolgt durch ein Kraftfeld, das innerhalb des Kanals senkrecht zu diesem Fluss angelegt wird.
Unter dem Einfluss des angelegten Kraftfelds und der entgegenwirkenden Diffusion der Probenteilchen erfolgt die Trennung der einzelnen Probenbestandteile. Zunächst stellt sich ein Gleichgewichtszustand ein, in dem die einzelnen Probenbestandteile in separaten Schichten mit einer bestimmten Schichtdicke innerhalb des Trennkanals im Bereich der Anreicherungswand des Kanals vorliegen. Kleinere Partikel mit einem größeren Diffusionskoeffizienten gelangen in höher gelegene Schichten und somit in Bereiche größerer Strömungsgeschwindigkeiten. Diese eluieren zuerst. Größere Partikel mit einem niedrigeren Diffusionskoeffizienten bewegen sich in weiter unten gelegenen Schichten, d.h. Bereichen mit einer geringeren Strömungsgeschwindigkeit, und eluieren dadurch später.
In Abhängigkeit von der Art der Erzeugung des verwendeten Kraftfelds, d.h. der physikalischen Natur dieses Feldes, sind verschiedene Feld-Fluss Fraktionierungstechniken entwickelt worden. Diese umfassen die Fluss Feld-Fluss Fraktionierung, die Sedimentations Feld-Fluss Fraktionierung, wie z.B. die Zentrifugal-Feld-Fluss Fraktionierung, sowie die thermische Feld-Fluss Fraktionierung. Von diesen ist die Fluss Feld-Fluss Fraktionierung mit den Subtechniken der symmetrischen Fluss Feld-Fluss Fraktionierung, der asymmetrischen Fluss Feld-Fluss Fraktionierung (AF4) sowie der Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung (HF5) am weitesten verbreitet.
Die Vorteile der Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung sind ein geringes Kanalvolumen, wodurch die Probenverdünnung verringert werden kann, die Möglichkeit der Verwendung von Einweg-Hohlfaserkartuschen, die das Risiko der Probenverschleppung zwischen verschiedenen Probenläufen minimiert, sowie geringe Flussraten, die eine online Kopplung der Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung mit der Massenspektrometrie ermöglichen (A. Zattoni et al.; Improved Hollow-Fiber Flow Field-Flow Fractionation Methods for the Analysis and Characterization of Complex Protein Mixtures; Abstract, NanoTech Conference and Expo 2011).
Verfahren und Vorrichtungen für die Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung werden z.B. beschrieben in WO 2007/0129806 A1 sowie von J.Y. Lee et al. (J.Y. Lee et al.; Profiling of Phospholipids in Lipoproteins by Multiplexed Hollow Fiber Flow Field-Flow Fractionation and Nanoflow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry; Journal of Chromatography A; 1217, 2010, 1660-1666), D. Kang et al. (D. Kang et al.; Lectin-Based Enrichment Method for Glycoproteomics Using Hollow Fiber Flow Field-Flow Fractionation: Application to Streptococcus pyogenes; Journal of Proteome Research; 9, 2010, 2855-2862), H.J. Kim et al. (H.J. Kim et al.; Hollow-Fiber Flow/Hyperlayer Field-Flow Fractionation for the Size Characterization of Airborne Particle Fractions Obtained by SPLITT Fractionation; Journal of Separtaion Sciences; 29, 2006, 423-428) and J.E.G.J. Wijnhoven et al. (J.E.G.J. Wijnhoven et al.; Hollow-Fibre Flow Field-Flow Fractionation of Polystyrene Sulphonats; Journal of Chromatography A, 699, 1995, 119-129).
Bei den darin beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen wird jedoch immer ein dem Detektor nachgeschaltetes, d.h. stromabwärts installiertes, Schaltventil verwendet, um die Fokussierung einer Probe in dem jeweiligen Hohlfasertrennkanal zu ermöglichen. Während der Fokussierung ist die Flussrichtung des Laufmittels im Detektor entgegengesetzt zur Flussrichtung während der Probentrennung und -detektion. Nach Abschluss der Fokussierung wird dieses Ventil dann so geschaltet, dass die Probe aus dem Hohlfasertrennkanal eluiert und detektiert werden kann. Dabei kommt es zu einer Umkehrung der Flussrichtung im Detektor verbunden mit entsprechenden Druckschwankungen im gesamten System. Durch diese Druckschwankungen wird die zuvor erreichte und für eine optimale Trennung notwendige Fokussierung der Probe gestört oder sogar aufgelöst, so dass die Trennleistung der Hohlfaser entscheidend beeinträchtigt wird. Auf dieses Problem wird z.B. von P. Reschiglian et al. hingewiesen (P. Reschiglian et al.; Hyperlayer Hollow-Fiber Flow Field-Flow Fractionation of Cells; Journal of Chromatography A, 985, 2003, 519-529).
In DE 689 21 458 T2 werden ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung ohne Verwendung eines dem Detektor nachgeschalteten Schaltventils beschrieben. Auch in diesem Verfahren bzw. in dieser Vorrichtung kommt es jedoch nach Abschluss der Fokussierung beim Übergang zur Elution zu einer Umkehrung der Flussrichtung im Detektor und damit zu den bereits beschriebenen Druckschwankungen mit den entsprechenden Auswirkungen auf die Trennleistung.
In US 6,192,764 B1 werden ein Verfahren und eine Vorrichtung mit einer dem/den Detekor(en) nachgeschalteten Umkehrpumpe für die Stabilisierung des Detektorflusses in einem Fluss Feld-Fluss Fraktionierungs-System beschrieben.
Ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung, worin es beim Übergang von der Fokussierung zur Elution nicht zu einer Umkehr des Detektorflusses kommt wird von C. Johann et al. beschrieben (C. Johann et al.; A Novel Approach to Improve Operation and Performance in Flow Field-Flow Fractionation; Journal of Chromatography A; 2011, Article in press, doi: 10.1016/j.chroma.2010.12.077). Die Vorrichtung weist jedoch ein dem Hohlfasertrennkanal nachgeschaltetes und dem Detektor vorgeschaltetes Schaltventil auf. Dieses Schaltventil befindet sich während der Fokussierung und der Elution in unterschiedlichen Positionen, so dass beim Übergang von der Fokussierung zur Elution ein Schaltvorgang des Ventils nötig wird. Dieser Schaltvorgang geht mit den bereits beschriebenen Druckschwankungen und den entsprechenden Auswirkungen auf die Trennleistung einher. So wird zum Beispiel die Wiederfindungsrate mit durchschnittlich 60 % und damit niedriger als erwartet angegeben.
Zudem kommt es auch zu Schwankungen des Volumenstroms des Laufmittels durch den/die jeweils verwendeten Detektor(en). Ein konstanter Volumenstrom während des gesamten Probenlaufs ist jedoch insbesondere für die Konzentrationsbestimmung der einzelnen Probenbestandteile aus den erhaltenen Detektorsignalen unabdingbar. Gleiches gilt für die absolute Molmassenbestimmung einzelner Probenbestanteile mittels statischer Lichtstreuung, die ein korrektes Konzentrationssignal der verwendeten Detektoren erfordert.
Neben dem unerwünschten Einfluss auf die Probenfokussierung und die Trennleistung sowie den Volumenstrom können Druckschwankungen in einer Vorrichtung zur Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung auch das Detektorsignal druckempfindlicher Detektoren, wie z.B. eines Brechungsindexdetektors, stören. In solchen Detektoren können sich Druckschwankungen bis über mehrere Minuten auf das Messsignal auswirken. Dadurch werden die Qualität des Detektorsignals und damit auch des Messergebnisses insgesamt beeinträchtigt.
Darstellung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung bereitzustellen, worin das Laufmittel mit einem konstanten Volumenstrom und ohne Umkehr der Flussrichtung in nur einer Richtung durch den/die verwendeten Detektor(en) strömt und die die zuvor beschriebenen Probleme im Hinblick auf die Entstehung von Druckschwankungen und deren Einfluss auf die Fokussierung, die Trennleistung und den Volumenstrom sowie auf die Verwendung druckempfindlicher Detektoren vermeiden und die gleichzeitig eine zufriedenstellende Probentrennung gewährleisten.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 und die Vorrichtung nach Anspruch 10 gelöst.
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Analyse einer Probe mittels Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung, umfassend die folgenden Schritte:

(i) die Injektion einer Probe unter Verwendung eines Laufmittels in eine oder mehrere Hohlfaser(n),
(ii) die Fokussierung der Probe mit Hilfe des Laufmittels in der/den Hohlfaser(n) und
(iii) die Elution der Probe mit dem Laufmittel aus der/den Hohlfaser(n) unter dem Einfluss eines Trennfeldes und die Detektion der aufgetrennten Probe mit einem oder mehreren Detektor(en),

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Injektion“ die Einbringung der Probe in das Laufmittel und die Einspülung der Probe zusammen mit dem Laufmittel in die Hohlfaser(n).
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Fokussierung“ die Aufkonzentrierung der Probe zu einer schmalen Bande in der/den Hohlfaser(n). Während der Fokussierung wird Laufmittel sowohl durch den Einlass als auch durch den Auslass der Hohlfaser(n) in diese hineingepumpt, wobei die Fokussierung der Probe im Bereich der aufeinandertreffenden Laufmittelströme innerhalb der Hohlfaser(n) erfolgt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Elution“ das Ausspülen der Probe mit Hilfe des Laufmittels aus der/den Hohlfaser(n) in Richtung des/der Detektors/Detektoren, wobei das Ausspülen unter dem Einfluss eines Trennfeldes erfolgt, dessen Stärke je nach Art der zu analysierenden Probe variiert werden kann.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Detektion“ die Erfassung der Probe in dem Laufmittel durch den/die verwendeten Detektor(en) und die Erzeugung eines entsprechenden Messsignals durch die Probe, wenn diese mit Hilfe des Laufmittels durch den/die Detektor(en) geleitet wird.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst einen oder mehrere Vorratsbehälter, eine oder mehrere Pumpe(n), ein Injektionssystem, einen Hohlfasertrennkanal oder mehrere Hohlfasertrennkanäle, jeweils bestehend aus einem Hohlfasergehäuse und einer oder mehreren Hohlfaser(n), einen Flussregler, einen T-Verbinder, eine Rückdruckkapillare, einen oder mehrere Detektor(en) und einen Abfallbehälter, wobei der T-Verbinder vor die Rückdruckkapillare geschaltet ist und die Rückdruckkapillare zwischen dem/den Hohlfasertrennkanal/Hohlfasertrennkanälen und dem/den Detektor(en) angeordnet ist und wobei die Länge und der Durchmesser der Rückdruckkapillare so gewählt sind, dass der Rückdruck durch die Kapillare immer höher ist als der Druckabfall über die Hohlfaser(n).
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird ein neuer flusstechnischer Aufbau bzw. ein neues Flussschema für die Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung bereitgestellt. Dieses Flussschema ermöglicht die Regelung der Flüsse während der einzelnen Phasen der Fraktionierung (Injektion, Fokussierung und Elution/Detektion) ohne die Verwendung von Schaltventilen und entsprechende Ventilschaltungen. Druckschwankungen und eine Umkehr der Flussrichtung des Laufmittels in den verwendeten Detektoren werden dadurch vermieden. Die Regelung der Flüsse erfolgt computergesteuert unter Verwendung einer speziellen Software mit der sich entsprechende Trennmethoden programmieren lassen.
Das erfindungsgemäße Flussschema wird durch die Verwendung einer Rückdruckkapillare zwischen dem/den Hohlfasertrennkanal/Hohlfasertrennkanälen und dem/den Detektor(en) erzeugt. Zusätzlich wird ein T-Verbinder vor die Rückdruckkapillare geschaltet. Mit Hilfe der Rückdruckkapillare und des T-Verbinders wird während der Fokussierung in Schritt (ii) Laufmittel in einen ersten Teil, der in Richtung des Auslasses der Hohlfaser(n) strömt, und einen zweiten Teil, der in Richtung des/der Detektors/Detektoren strömt, aufgeteilt.
Diese Aufteilung bewirkt einen gleichbleibenden Volumenstrom und eine gleichbleibende Flussrichtung des Laufmittels durch den/die Detektor(en).
Entscheidend für das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung ist, dass der innere Durchmesser und die Länge der Rückdruckkapillare so gewählt werden, dass der entstehende Rückdruck durch die Kapillare immer größer ist als der Druckabfall über die Hohlfaser.
Die Abmessungen der Rückdruckkapillare sind ferner abhängig von der jeweils verwendeten Trennmethode und den entsprechend gewählten Flüssen während der einzelnen Phasen der Fraktionierung und daher variabel. Insbesondere sind die Abmessungen der Rückdruckkapillare abhängig von dem jeweils eingestellten und erfindungsgemäß gleichbleibenden Volumenstrom durch den/die Detektor(en).
Typische bzw. bevorzugte Werte sind eine Länge von 100 bis 500 mm und ein Innendurchmesser (ID) von 50 bis 200 µm Besonders bevorzugt ist ein Innendurchmesser von 125 µm.Als Material für die Rückdruckkapillare kann jedes Material verwendet werden, das inert gegenüber dem jeweils verwendeten Laufmittel und der zu analysierenden Probe ist. Bevorzugte Materialien sind Polyetheretherketon (PEEK), Fluoriertes Ethylen-Propylen-Copolymer (FEP), Perfluoralkoxy (PFA), hochreines Perfluoralkoxy (HPFA), und nichtrostender Stahl (Stainless Steel, SS).
Als T-Verbinder zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind alle handelsüblichen T-Verbinder zum Einbau in ein Feld-Fluss Fraktionierungssystem geeignet. Als Material für den T-Verbinder kann jedes Material verwendet werden, das inert gegenüber dem jeweils verwendeten Laufmittel und der zu analysierenden Probe ist. Es können zum Beispiel T-Verbinder aus Metal oder PEEK verwendet werden, wobei die Bohrung innerhalb des T-Verbinders ein möglichst kleines Totvolumen aufweisen sollte. Die Größe der Bohrung innerhalb des T-Verbinders sollte daher zwischen 125 µm und max. 250 µm und bevorzugt 250 µm betragen. Bohrungen über 250 µm können zu Peakverbreiterungen und damit zu einer Beeinträchtigung des Messergebnisses führen.
Erfindungsgemäß bleiben der Volumenstrom und die Flussrichtung des Laufmittels durch den/die Detektor(en) zumindest während der Fokussierung in Schritt (ii) und der Elution und Detektion in Schritt (iii) gleich.
Dies schließt auch den Übergang von Schritt (ii) zu Schritt (iii) ein, so dass auch während des Übergangs von der Fokussierung in Schritt (ii) zur Elution und Detektion in Schritt (iii) der Volumenstrom und die Flussrichtung des Laufmittels durch den/die Detektor(en) gleich bleiben.
In einer bevorzugten Ausführungsform bleiben der Volumenstrom und die Flussrichtung des Laufmittels durch den/die Detektor(en) während der Schritte (i), (ii) und (iii) des erfindungsgemäßen Verfahrens gleich.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bleiben der Volumenstrom und die Flussrichtung des Laufmittels durch den/die Detektor(en) auch beim Übergang von der Injektion in Schritt (i) zur Fokussierung in Schritt (ii) gleich.
Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, in dem

- in Schritt (ii) Laufmittel, in das eine Probe eingebracht wurde, mit einem konstanten Volumenstrom über den Einlass der Hohlfaser(n) in diese hineingespült wird und ebenfalls mit einem konstanten Volumenstrom zusätzliches Laufmittel durch einen T-Verbinder über den Auslass der Hohlfaser(n) in diese hineingepumpt wird, wobei das Laufmittel mit Hilfe einer Rückdruckkapillare und des T-Verbinders in einen ersten Teil, der in Richtung des Auslasses der Hohlfaser(n) strömt, und einen zweiten Teil, der in Richtung eines oder mehrerer Detektors/Detektoren strömt, aufgeteilt wird und
- in Schritt (iii) zunächst der Volumenstrom des Laufmittels über den T-Verbinder in den Auslass der Hohlfaser(n) bis auf Null reduziert und zeitgleich der Volumenstrom des Laufmittels in den Einlass der Hohlfaser(n) um den entsprechenden Betrag erhöht wird und die Probe anschließend unter dem Einfluss eines Trennfeldes über den T-Verbinder und die Rückdruckkapillare aus der/den Hohlfaser(n) eluiert und in einem oder mehreren Detektor(en) detektiert wird, wobei der Volumenstrom und die Flussrichtung des Laufmittels durch den/die Detektor(en) gleich bleiben und wobei die Stärke des Trennfeldes mit Hilfe eines Flussreglers an der/den Hohlfaser(n) kontrolliert wird und gleichzeitig der Volumenstrom des Laufmittels so variiert wird, dass bei einer Veränderung der Stärke des Trennfeldes der Volumenstrom des Laufmittels durch den/die Detektor(en) gleich bleibt.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeuten die Begriffe „konstant“ und „gleich“ bzw. „gleich bleiben/bleibt“ in Bezug auf einen Volumenstrom, dass dieser Volumenstrom um nicht mehr als ± 2 %, bevorzugt um nicht mehr als ±1,2 % variieren darf. So sollte beispielsweise ein Volumenstrom durch den/die Detektor(en) von 1 ml/min um nicht mehr als 12 µl/min schwanken.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Volumenstrom“ das Volumen eines Laufmittels, das pro Zeiteinheit durch die erfindungsgemäße Vorrichtung oder Teile davon, wie z.B. die Hohlfaser(n), der T-Verbinder, die Rückdruckkapillare oder der/die Detektor(en), fließt.
Die Flüssigkeits- und Volumenströme während der Injektion, der Fokussierung sowie der Elution und Detektion in den Schritten (i), (ii) und (iii) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden von einer oder mehreren Pumpen erzeugt und kontrolliert. Bevorzugt werden eine oder zwei Pumpen verwendet, besonders bevorzugt werden zwei Pumpen verwendet.
Als Pumpen können in dem erfindungsgemäßen Verfahren und in der erfindungsgemäßen Vorrichtung jegliche Pumpen verwendet werden, die im Bereich der Feld-Fluss Fraktionierung oder der Flüssigchromatografie (Liquid Chromatography, LC) bekannt sind. Geeignete Pumpen sind zum Beispiel HPLC-Pumpen, Spritzenpumpen oder auch Massenflussregler. Bevorzugt werden Spritzenpumpen verwendet.
Als Laufmittel zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung können wässrige und nicht wässrige organische Lösungsmittel verwendet werden. Beispiele umfassen wässrige Lösungen von 0,5 - 5 g/l NaCl und 0,1 - 5 g/l Natriumdodecylsulfat (Sodium dodecyl sulfate, SDS) sowie die organischen Lösungsmittel Tetrahydrofuran (THF), Toluol, Aceton, Methanol, Ethanol, Chloroform, Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsulfoxid (DMSO) sowie Mischungen davon.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Flussrichtung“ die Bewegung des Laufmittels in eine bestimmte Richtung. In dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. in der erfindungsgemäßen Vorrichtung fließt Laufmittel während der Injektion, der Fokussierung sowie der Elution und Detektion in den Schritten (i), (ii) und (iii) permanent aus Richtung des T-Verbinders in Richtung eines Abfallbehälters durch den/die Detektor(en). Die Flussrichtung des Laufmittels innerhalb des/der Detektors/Detektoren ist in den Schritten (i), (ii) und (iii) also immer dieselbe und wird nicht umgekehrt. Darauf bezieht sich auch der Begriff „gleich“ bzw. „gleich bleiben/bleibt“, wenn er im Zusammenhang mit dem Begriff „Flussrichtung“ verwendet wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Analyse“ die Auftrennung und Detektion einer Probe mittels Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Probe“ jegliche Art von Analyten, die sich mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung auftrennen und detektieren lassen. Dies können Substanzen mit einem Molekulargewicht von 500 Da bis 16 MDa oder mit einer Größe von 2 nm bis 5 µm sein, die in dem jeweils verwendeten Laufmittel gelöst oder suspendiert vorliegen.
Der Begriff „Probe“ umfasst insbesondere auch Gemische, wobei das Molekulargewicht und/oder die Größe der einzelnen Bestandteile gleich oder verschieden sein kann/können.
Proben zur Auftrennung und Detektion mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind z.B. Proteine aus den Bereichen der pharmazeutischen Industrie und der Forschung, Nanopartikel und Kohlenstoffnanoröhrchen (Carbon Nanotubes) sowie natürliche und synthetische Polymere.
Die Probe wird während der Injektion in Schritt (i) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Hilfe eines Injektionssystems in das Laufmittel eingebracht.
Ein Injektionssystem zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann ein manuell zu bedienendes Injektionsventil oder ein automatischer Probengeber (Autosampler) sein, das/der dem Hohlfasertrennkanal bzw. den Hohlfasertrennkanälen vorgeschaltet, d.h. stromaufwärts installiert, ist.
Bei den Hohlfasern zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung handelt es sich um Größenausschlussmembranen mit einem runden Querschnitt. Diese haben einen Innendurchmesser (ID) von 0.5 bis 1 mm. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Innendurchmesser der verwendeten Hohlfasern 1 mm. Die Hohlfasern haben in der Regel eine Länge von 100 bis 370 mm, bevorzugt von 300 bis 320 mm und besonders bevorzugt 305 mm. Der Cut-off der Hohlfasern liegt bei 300 Da bis 100 kDa, bevorzugt bei 300 Da bis 30 kDa und besonders bevorzugt bei 10 kDa. Als Material für die Hohlfasern wird bevorzugt regenerierte Cellulose, Polyethersulfon (PES) oder Polyvinylidenfluorid (PVDF) verwendet.
Die Hohlfasern zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung befinden sich in einem gekapselten Gehäuse (Hohlfasergehäuse). Dieses weist jeweils einen Anschluss für den Einlass und den Auslass des Laufmittels sowie einen Anschluss für einen Flussregler auf.
Eine Hohlfaser und das Gehäuse, in dem sich die Hohlfaser befindet, bilden einen Hohlfasertrennkanal.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können auch zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr, wie z.B. bis zu zehn, bis zu zwanzig, bis zu einhundert oder bis zu fünfhundert, parallel geschaltete gleiche Hohlfasern bzw. Hohlfasertrennkanäle verwendet werden. Diese werden zu einem Trennmodul zusammengefasst. Neben den genannten Obergrenzen stellen auch alle darunter liegenden Anzahlen an parallel geschalteten gleichen Hohlfasern bzw. Hohlfasertrennkanälen mögliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.
Die Parallelschaltung erfolgt entweder durch das Einbringen der gewünschten Anzahl an Hohlfasern in ein einzelnes Gehäuse, so dass ein entsprechender Hohlfasertrennkanal mehr als eine Hohlfaser aufweist, oder durch die Verwendung mehrer Hohlfasertrennkanäle, die jeweils nur eine Hohlfaser enthalten.
Die Verwendung mehrerer parallel geschalteter Hohlfasern bzw. Hohlfasertrennkanäle ermöglicht die Injektion größerer Probenmengen während des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. eine höhere Probenbeladung der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Bevorzugt werden nur eine oder zwei parallel geschaltete gleiche Hohlfaser(n) bzw. nur ein Hohlfasertrennkanal oder zwei parallel geschaltete gleiche Hohlfasertrennkanäle verwendet. Besonders bevorzugt werden zwei parallel geschaltete gleiche Hohlfasern bzw. Hohlfasertrennkanäle verwendet.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Hohlfasertrennkanal mit zwei parallel geschalteten, in einem Gehäuse enthaltenen gleichen Hohlfasern verwendet.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. in der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist das während der Elution und Detektion in Schritt (iii) anliegende Trennfeld ein Flüssigkeitsstrom (Querfluss), der mit Hilfe eines an das Gehäuse eines Hohlfasertrennkanals angeschlossenen Flussreglers senkrecht zur Flussrichtung des Laufmittels in dem Hohlfasertrennkanal erzeugt wird.
Zudem kann mit Hilfe des an das Gehäuse eines Hohlfasertrennkanals angeschlossenen Flussreglers der Querfluss und damit die Stärke des Trennfeldes variiert werden.
Bei einem Flussregler zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren und in der erfindungsgemäßen Vorrichtung handelt es sich um ein Spritzenpumpensystem, das im Pendelbetrieb arbeitet, um ein unkontrolliertes Ausströmen des Querflusses zu verhindern. In einer weiteren Ausführungsform können Massenflussregler als Flussregler verwendet werden.
Als Detektor(en) können in dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. in der erfindungsgemäßen Vorrichtung jegliche Detektoren verwendet werden, die im Bereich der Feld-Fluss Fraktionierung oder der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bekannt sind. Beispiele sind UV-Detektoren, Brechungsindex- (RI) Detektoren, (Mehrwinkel-) Lichtstreudetektoren, Massenspektrometer, Fluoreszenzdetektoren, ICP-Massenspektrometer, Dynamische Lichtstreudetektoren (DLS) und Kleinwinkel-Röntgenstreuungs-(SAXS) Detektoren.
Figurenliste

1 zeigt den Aufbau einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
2a und 2b zeigen die Fraktogramme einer BSA-Trennung, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wurde.

Wege zur Ausführung der Erfindung
1 zeigt den schematischen Aufbau einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Diese umfasst einen Vorratsbehälter (1) für das Laufmittel, eine erste Pumpe (2), eine zweite Pumpe (3), ein Injektionssystem (4), einen Hohlfasertrennkanal bestehend aus einem Hohlfasergehäuse (5) und einer Hohlfaser (6), einen Flussregler (7), einen T-Verbinder (8), eine Rückdruckkapillare (9), einen Detektor (10) und einen Abfallbehälter (11).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren, das unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß 1 durchgeführt wird, die folgenden Schritte:

(i) die Injektion einer Probe unter Verwendung eines Laufmittels in die Hohlfaser (6),
(ii) die Fokussierung der Probe mit Hilfe des Laufmittels in der Hohlfaser (6) und
(iii) die Elution der Probe mit dem Laufmittel aus der Hohlfaser (6) unter dem Einfluss eines Trennfeldes und die Detektion der aufgetrennten Probe mit einem Detektor (10),

■ in Schritt (ii) über eine Zeit (t₁)
- - eine erste Pumpe (2) mit Hilfe des Laufmittels aus dem Vorratsbehälter (1) und mit einem konstanten Volumenstrom (V_P1) eine mittels des Injektionssystems (4) in das Laufmittel eingebrachte Probe über den Einlass der Hohlfaser (6) in diese hineinspült und
- - eine zweite Pumpe (3) ebenfalls mit einem konstanten Volumenstrom (V_P2) zusätzliches Laufmittel aus dem Vorratsbehälter (1) durch den T-Verbinder (8) über den Auslass der Hohlfaser (6) in diese hineinpumpt,

_FR

■ in Schritt (iii)
- - zunächst der von der zweiten Pumpe (3) erzeugte Volumenstrom (V_P2) des Laufmittels über eine Zeit (t₂) bis auf Null reduziert und zeitgleich der von der ersten Pumpe (2) erzeugte Volumenstrom (V_P1) des Laufmittels um den entsprechenden Betrag erhöht wird, und
- - anschließend über eine Zeit (t₃) die Probe mit Hilfe des von der ersten Pumpe (2) in das System gepumpten Laufmittels unter dem Einfluss eines Trennfeldes aus der Hohlfaser (6) über den T-Verbinder (8) und die Rückdruckkapillare (9) eluiert und in einem Detektor (10) detektiert wird,

_FR

_D

₂

₃

_P1

_D

In dem erfindungsgemäßen Verfahren sind die Zeiten (t1), (t2) und (t3) frei programmierbar. Je nach Art der zu analysierenden Probe, d.h. je nach Applikation, können die Zeiten (t1), (t2) und (t3) dadurch individuell eingestellt und angepasst werden, um so eine optimale Probentrennung zu erreichen. In einer Ausführungsform kann beispielsweise die Zeit (t1) 60 bis 600 Sekunden, die Zeit (t2) 2 bis 300 Sekunden und die Zeit (t3) 5 Minuten bis 2 Stunden betragen.

Ferner gelten für die Volumenströme in Schritt (ii) und Schritt (iii) des erfindungsgemäßen Verfahrens die folgenden Bedingungen:

■ Schritt (ii) :	V_P1 << V_P2
	V_P1 + V_P2 - V_FR = V_D = konstant

■ Schritt (iii) :	für (t₂) : V_P1 + V_P2 = konstant
	V_FR = konstant
	V_D = konstant
	für (t₃) : V_P2 = 0
	V_P1 - V_FR = V_D = konstant,

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Volumenstrom (V_P2) in Schritt (ii) 5- bis 60-mal größer ist als der Volumenstrom (V_P1).
Die Wiederfindungsrate, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bzw. mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erzielt werden kann, liegt bei > 90 %. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Wiederfindungsrate bei > 95 % und besonders bevorzugt bei > 97 %.
Beispiel
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurde eine Analyse von Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin, BSA) durchgeführt. BSA ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 66 kDa, das neben dem Monomer auch ein Dimer des Proteins enthält. Ziel war die Auftrennung der BSA-Probe in eine Monomer- und eine Dimerfraktion.

Die Messungen wurden mit einem Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierungssystem der Firma Postnova Analytics GmbH Landsberg, Germany, durchgeführt. Dabei wurden die folgenden Einstellungen verwendet.

Hohlfaser:	Es wurde ein Hohlfasertrennkanal eingesetzt, der zwei parallel geschaltete gleiche Hohlfasern mit einer Länge von jeweils 30.5 cm, einem Innendurchmesser von jeweils 1 mm und einem Cut-off von jeweils 10 kDa in einem Gehäuse enthielt.
Querfluss:	1,5 ml/min
Volumenstrom durch den Detektor:	0,75 ml/min
Detektor:	UV-Detektion bei 280 nm
Laufmittel:	0,1 mol/l NaCl mit 0,2 g/l NaN₃

Die Ergebnisse sind in den 2a und 2b dargestellt. Sie zeigen eine vollständige Auftrennung der BSA-Probe in eine Monomer- und eine Dimerfraktion. Die Retentionszeit des Monomers beträgt 12.39 min ± 0.25 % und die Retentionszeit des Dimers beträgt 15.11 min ± 0.33 %.
Die 2b zeigt zudem die ausgezeichnete Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens. Darin sind die Detektorsignale aus fünf Einzelmessungen übereinandergelegt. Aus dieser Darstellung ergibt sich, dass die erhaltenen Detektorsignale für alle fünf Einzelmessungen nahezu identisch sind.
Aus der Integration der erhaltenen Peakflächen ergibt sich ferner eine Wiederfindungsrate von 97.8 % ± 2.0 %.

Claims

Verfahren zur Analyse einer Probe mittels Hohlfaser Fluss Feld-Fluss Fraktionierung, umfassend die folgenden Schritte: (i) die Injektion einer Probe unter Verwendung eines Laufmittels in eine oder mehrere Hohlfaser(n) (6), (ii) die Fokussierung der Probe mit Hilfe des Laufmittels in der/den Hohlfaser(n) (6) und (iii) die Elution der Probe mit dem Laufmittel aus der/den Hohlfaser(n) (6) unter dem Einfluss eines Trennfeldes und die Detektion der aufgetrennten Probe mit einem oder mehreren Detektor(en) (10) dadurch gekennzeichnet, dass der Volumenstrom (V_D) und die Flussrichtung des Laufmittels durch den/die Detektor(en) (10) zumindest während der Schritte (ii) und (iii) einschließlich des Übergangs von Schritt (ii) zu Schritt (iii) gleich bleiben, wobei während der Fokussierung in Schritt (ii) das Laufmittel mit Hilfe einer Rückdruckkapillare (9) und eines T-Verbinders (8) in einen ersten Teil, der in Richtung des Auslasses der Hohlfaser(n) (6) strömt, und einen zweiten Teil, der in Richtung des/der Detektors/Detektoren (10) strömt, aufgeteilt wird und die Länge und der Durchmesser der Rückdruckkapillare (9) so gewählt sind, dass der Rückdruck durch die Kapillare immer höher ist als der Druckabfall über die Hohlfaser(n) (6) .
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Volumenstrom (V_D) und die Flussrichtung des Laufmittels durch den/die Detektor(en) (10) während der Schritte (i), (ii) und (iii) gleich bleiben.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei beim Übergang von der Injektion in Schritt (i) zur Fokussierung in Schritt (ii) der Volumenstrom (V_D) und die Flussrichtung des Laufmittels durch den/die Detektor(en) (10) gleich bleiben.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem ■ in Schritt (ii) über eine Zeit (t₁) - eine erste Pumpe (2) mit Hilfe des Laufmittels aus dem Vorratsbehälter (1) und mit einem konstanten Volumenstrom (V_P1) eine mittels des Injektionssystems (4) in das Laufmittel eingebrachte Probe über den Einlass der Hohlfaser(n) (6) in diese hineinspült und - eine zweite Pumpe (3) ebenfalls mit einem konstanten Volumenstrom (V_P2) zusätzliches Laufmittel aus dem Vorratsbehälter (1) durch den T-Verbinder (8) über den Auslass der Hohlfaser(n) (6) in diese hineinpumpt, wobei das mit Hilfe der zweiten Pumpe (3) in das System gepumpte Laufmittel mit Hilfe der Rückdruckkapillare (9) und des T-Verbinders (8) in einen ersten Teil, der in Richtung des Auslasses der Hohlfaser(n) (6) strömt, und einen zweiten Teil, der in Richtung des/der Detektors/Detektoren (10) strömt, aufgeteilt wird und wobei das Volumen des mit Hilfe der beiden Pumpen (2) und (3) in das System gepumpten Laufmittels größer ist als das Volumen des durch den Flussregler (7) mit einem Volumenstrom (V_FR) aus dem System abfließenden Laufmittels; und ■ in Schritt (iii) - zunächst der von der zweiten Pumpe (3) erzeugte Volumenstrom (V_P2) des Laufmittels über eine Zeit (t₂) bis auf Null reduziert und zeitgleich der von der ersten Pumpe (2) erzeugte Volumenstrom (V_P1) des Laufmittels um den entsprechenden Betrag erhöht wird, und - anschließend über eine Zeit (t₃) die Probe mit Hilfe des von der ersten Pumpe (2) in das System gepumpten Laufmittels unter dem Einfluss eines Trennfeldes aus der/den Hohlfaser(n) (6) über den T-Verbinder (8) und die Rückdruckkapillare (9) eluiert und in einem oder mehreren Detektor(en) detektiert wird, wobei der Volumenstrom (V_FR) des durch den Flussregler (7) aus dem System abfließenden Laufmittels und der Volumenstrom (V_D) des Laufmittels durch den/die Detektor(en) (10) über die Zeit (t₂) gleich bleiben und wobei die Stärke des Trennfeldes über die Zeit (t₃) mit Hilfe des Flussreglers (7) kontrolliert wird und gleichzeitig der von der ersten Pumpe (2) erzeugte Volumenstrom (V_P1) des Laufmittels so variiert wird, dass bei einer Veränderung der Stärke des Trennfeldes der Volumenstrom (V_D) des Laufmittels durch den/die Detektor(en) (10) gleich bleibt.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei Zeit (t₁) 60 bis 600 Sekunden, die Zeit (t₂) 2 bis 300 Sekunden und die Zeit (t₃) 5 Minuten bis 2 Stunden beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei für die Volumenströme in Schritt (ii) und Schritt (iii) die folgenden Bedingungen gelten: ■ Schritt (ii) : V_P1 << V_P2 V_P1 + V_P2 - V_FR = V_D = konstant ■ Schritt (iii) : für (t₂) : V_P1 + V_P2 = konstant V_FR = konstant V_D = konstant für (t₃) : V_P2 = 0 V_P1 - V_FR = V_D = konstant,

wobei in Schritt (ii) der Volumenstrom (V_P2) 5- bis 60-mal größer ist als der Volumenstrom (V_P1).
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-6, wobei nur eine Hohlfaser (6) verwendet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-6 wobei zwei parallel geschaltete gleiche Hohlfasern (6) verwendet werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-6, wobei bis zu zehn parallel geschaltete gleiche Hohlfasern (6) verwendet werden.
Vorrichtung zur Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-9, umfassend einen oder mehrere Vorratsbehälter (1), eine erste Pumpe (2), eine zweite Pumpe (3), ein Injektionssystem (4), einen Hohlfasertrennkanal oder mehrere Hohlfasertrennkanäle, jeweils bestehend aus einem Hohlfasergehäuse (5) und einer oder mehreren Hohlfaser(n) (6), einen Flussregler (7), einen T-Verbinder (8), eine Rückdruckkapillare (9), einen oder mehrere Detektor(en) (10) und einen Abfallbehälter (11), wobei der T-Verbinder vor die Rückdruckkapillare geschaltet ist und die Rückdruckkapillare zwischen dem/den Hohlfasertrennkanal/Hohlfasertrennkanälen und dem/den Detektor(en) (10) angeordnet ist und wobei die Länge und der Durchmesser der Rückdruckkapillare (9) so gewählt sind, dass der Rückdruck durch die Kapillare immer höher ist als der Druckabfall über die Hohlfaser(n) (6).
Vorrichtung gemäß Anspruch 10, umfassend nur einen Hohlfasertrennkanal, bestehend aus einem Hohlfasergehäuse (5) und einer Hohlfaser (6).
Vorrichtung gemäß Anspruch 10, umfassend einen Hohlfasertrennkanal, bestehend aus einem Hohlfasergehäuse (5) und zwei parallel geschalteten gleichen Hohlfasern (6) in dem Hohlfasergehäuse (5).
Vorrichtung gemäß Anspruch 10, umfassend einen Hohlfasertrennkanal, bestehend aus einem Hohlfasergehäuse (5) und bis zu zehn parallel geschalteten gleichen Hohlfasern (6) in dem Hohlfasergehäuse (5).