JP2009518297A - 両性リポソーム製剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、癌の治療のための組成物およびそれを用いる方法に関する。具体的には、本発明は、癌の治療のための、両性リポソームにより捕捉されたDNAi オリゴヌクレオチドに関する。
癌遺伝子は癌生物学の理解における中心概念となっており、治療薬のための価値ある標的を提供しうる。多くのタイプのヒト腫瘍、例えば、リンパ腫および白血病において、癌遺伝子が過剰発現しており、腫瘍形成能と関連しうる(Tsujimoto et al.、Science 228:1440-1443 [1985])。例えば、高レベルのヒトbcl-2遺伝子の発現がt(14; 18) 染色体転座を伴うすべてのリンパ腫においてみられており、ほとんどのろ胞性の B細胞リンパ腫および多くの大細胞型非ホジキンリンパ腫が含まれる。高レベルの bcl-2 遺伝子発現はt(14; 18) 染色体転座を有さない特定の白血病においてもみられており、例えば、多くの場合の慢性リンパ球性白血病急性、多くのプレB細胞型リンパ球性白血病、神経芽細胞腫、上咽頭癌、多くの前立腺、乳房および結腸腺癌が含まれる (Reed et al.、Cancer Res. 51:6529 [1991]; Yunis et al.、New England J. Med. 320:1047; Campos et al.、Blood 81:3091-3096 [1993]; McDonnell et al.、Cancer Res. 52:6940-6944 [1992); Lu et al.、Int. J Cancer 53:29-35 [1993]; Bonner et al.、Lab Invest. 68:43A [1993]。その他の癌遺伝子としてはTGF-α、c-ki-ras、ras、her-2 およびc-mycが挙げられる。
本発明は、癌の治療のためのDNAi オリゴヌクレオチドの送達のための両性リポソームを調製および使用するための組成物および方法を提供する。かかる両性リポソームは、例えば、生理的 pHではアニオン性または中性の電荷を有し、約 4の酸性pHではカチオン性の電荷を有しうる。有利なことに、本発明の組成物は、脂質濃度約 10〜100 mMまたはそれ以下にて約 1 〜4 mg/ml (例えば、約 2 mg/ml)の多量の DNAi オリゴヌクレオチドを捕捉する;コロイドおよび血清安定性を示す;平均リポソームサイズが200 nm未満であることから細胞および腫瘍への取り込みが増強している;そして、常套のトランスフェクション試薬に用いられるカチオン性脂質により形成されるリポソームと比べて低い毒性を示す。
図 1は、SCIDマウスにおける非ホジキンリンパ腫 WSU-DLCL2 異種移植片からの腫瘍サイズに対する、両性リポソームに捕捉された配列番号1251の効果を示す。
配列番号1:c-erb-2 (her-2) 上流領域
配列番号2-281:c-erb-2 (her-2) DNAi オリゴヌクレオチド
配列番号282:c-ki-ras 上流領域
配列番号283-461:c-ki-ras DNAi オリゴヌクレオチド
配列番号462:c-Ha-ras 上流領域
配列番号463-935:c-Ha-ras DNAi オリゴヌクレオチド
配列番号936:c-myc 上流領域
配列番号937-1080:c-myc DNAi オリゴヌクレオチド
配列番号1081:TGF-α 上流領域
配列番号1082-1248:TGF-α DNAi オリゴヌクレオチド
配列番号1249:bcl-2 上流領域
配列番号1250:PNT-100 DNAi オリゴマー メチル化
配列番号1251:PNT-100 DNAi オリゴマー
配列番号1252:DNAi オリゴマー メチル化
配列番号1253:DNAi オリゴマー
配列番号1255:bcl-2 第2プロモーター配列
配列番号1256-1266:bcl-2 配列
配列番号1267-1477および1250-1254:bcl-2 DNAi オリゴマー
I.定義
本発明の理解を助けるため、多数の用語を以下に定義する。
(i) 荷電した基の少なくとも1のpK が4〜8であり、
(ii)カチオン性電荷がpH 4にて優勢であり、
(iii)アニオン性電荷がpH 8にて優勢であり、
その結果、中性の正味の電荷pH 4〜 pH 8の等電点を有する。この定義による両性の特性は双性イオンの特性とは異なり、双性イオンは上記範囲の pKを有さない。その結果、双性イオンはpH値の範囲に渡って本質的に中性に荷電している。ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンは双性イオンの性質を有する中性脂質である。
ある態様において、本発明は癌遺伝子のアンチジーン阻害剤を提供する。本発明は特定の癌遺伝子の阻害に限定されない。実際、本発明は多数の癌遺伝子、例えばこれらに限定されないが以下に記載するものを含むものに対するアンチジーン阻害剤を包含する。
多くの科学者に注目された1つの遺伝子は、ヒト癌原遺伝子、c-Ha-rasである。この遺伝子は中心的司令塔として作用し、化学シグナルを細胞に伝え、細胞分裂を制御する。Ras 遺伝子変化は遺伝子を「オン」位置に置かせうる。ras 癌遺伝子は30%の癌の基礎となっていると考えられ、結腸癌、肺癌、膀胱癌および乳癌 (Bos、Cancer Res. 49:4682-4689 [1989])が含まれる。ras 癌遺伝子はそれゆえ治療薬の標的となっている。
her-2 (neu 癌遺伝子またはerbB-2としても知られる) 癌遺伝子はいくつかのヒト癌(Hynes and Stern、Biochim. et Biophy. Acta 1198:165-184 [1994]; Dougall et al.、Oncogene 9:2109-2123 [1994])および哺乳類発生(Lee et al.、Nature 378:394-398 [1995]).におけるその役割のためによく調べられている受容体-様チロシンキナーゼ (RTK) をコードする。Her-2 は癌においてもっとも頻繁に変化している遺伝子の1つである。それはチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通受容体 (p185としても知られる)をコードし、上皮増殖因子(EGF) ファミリーのメンバーであるため、上皮増殖因子受容体(EGFRまたは HER-1)と関連している。異常な her-2 遺伝子発現は多種多様な癌でみられ乳癌、卵巣癌および胃癌でもっとも一般的である。 HER-2はすべてのヒト乳癌および卵巣癌の25-30%で過剰発現している。HER-2過剰発現のレベルは乳癌の臨床段階、予後および転移能とよく相関している。HER-2の過剰発現はより低い生存率、高い再発率および高い転移能と相関している。Tan et al.、(Cancer Res.、57:1199 [1997]) は、HER-2遺伝子の過剰発現は形質転換能を上昇させることなく乳癌細胞の転移能を上昇させることを示している。
c-myc 遺伝子産物は最初期応答遺伝子によってコードされ、その発現は様々な分裂促進因子によって誘導されうる。C-myc 発現は細胞分裂を導くシグナル伝達経路に関与している。研究により、増殖中の細胞は静止状態の細胞よりも高いレベルのc-myc mRNA およびc-myc タンパク質を有することが示された。ヒト c-myc タンパク質に対して作成された抗体はヒト細胞から単離された核におけるDNA 合成を阻害することが知られている。逆に、遺伝子導入により生じるc-mycの構成的発現はいくつかの細胞株の誘導性の分化を阻害する。c-mycの構成的発現はトランスジェニックマウスの腫瘍の発達の素因になる。
多くのタイプのヒト腫瘍、例えば、リンパ腫および白血病において、ヒト bcl-2 遺伝子が過剰発現しており、腫瘍形成能と関連している可能性がある (Tsujimoto et al.、Science 228:1440-1443 [1985])。bcl-2 遺伝子の高レベルの発現がt (14; 18) 染色体転座を伴うすべてのリンパ腫、例えば、ほとんどのろ胞性 B細胞 リンパ腫および多くの大細胞型 非ホジキンリンパ腫において見いだされた。bcl-2 遺伝子の高レベルの発現は、 t(14; 18) 染色体転座を有さない特定の白血病、例えばほとんどのケースの慢性リンパ球性白血病急性、多くのプレB細胞型リンパ球性白血病、神経芽細胞腫、上咽頭癌および多くの前立腺、乳房および結腸の腺癌においても見いだされた(Reed et al.、Cancer Res. 51:6529 [1991]; Yunis et al.、New England J. Med. 320:1047; Campos et al.、Blood 81:3091-3096 [1993]; McDonnell et al.、Cancer Res. 52:6940-6944 [1992); Lu et al.、Int. J Cancer 53:29-35 [1993]; Bonner et al.、Lab Invest. 68:43A [1993])。
トランスフォーミング増殖因子アルファ (TGF-α)は、50 アミノ酸のポリペプチドである。それは最初、レトロウイルス-形質転換マウス細胞株から単離され、次いで、ヒト腫瘍細胞、初期ラット胚細胞およびヒト脳下垂体由来細胞培養において同定された。TGF-αは構造および機能の両方で上皮増殖因子(EGF) に密接に関連しており、両者は同じ受容体、即ち、上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合する。EGFおよびTGF-αの両方の配列および三次元構造が決定されている(Campbell et al.、Prog. Growth Factor Res. 1:13 [1989])。TGF-αはEGFと残基の約 40%の相同性を有する50 アミノ酸ポリペプチドである。両ペプチドは3つのよく規定されたループ(A、BおよびCと称される) を特徴とし、3つの分子内ジスルフィド結合を有する。
c-Ki- Ras (KRAS) 癌遺伝子は遍在的に発現している。30 kbを超える長さであるKRASは、HRASまたはNRASよりもかなり大きい。3つのras 遺伝子、HRAS、KRAS、およびNRASは異なる遺伝子構造を有するが、それらすべては189 アミノ酸残基のp21と総称されるタンパク質をコードする。これら遺伝子は対応するp21の第12または第61アミノ酸残基の組込みに影響する単一の点突然変異により悪性特性を獲得する。KRASはHRASよりもかなり高頻度に悪性腫瘍に関与している。NIH 3T3 形質転換系における96のヒト腫瘍または腫瘍細胞株の研究において、Pulciani et al.(Nature 300: 539 (1982)は T24 膀胱癌細胞においてのみ突然変異したHRAS座を見いだしたが、形質転換KRAS遺伝子は8 種類の癌および肉腫において同定された。
本発明は上記の癌遺伝子に限定されない。本発明の方法は既知のプロモーター領域を有するあらゆる癌遺伝子との使用に好適なものである。例示的な癌遺伝子としては、これらに限定されないが、BCR/ABL、ABL1/BCR、ABL、BCL1、CD24、CDK4、EGFR/ERBB-1、HSTF1、INT1/WNT1、INT2、MDM2、MET、MYB、MYC、MYCN、MYCL1、RAF1、NRAS、REL、AKT2、APC、BCL2-ALPHA、BCL2-BETA、BCL3、BCR、BRCA1、BRCA2、CBL、CCND1、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CRK、CRK-II、CSF1R/FMS、DBL、DDOST、DCC、DPC4/SMAD4、E-CAD、E2F1/RBAP、ELK1、ELK3、EPH、EPHA1、E2F1、EPHA3、ERG、ETS1、ETS2、FER、FGR、FLI1/ERGB2、FOS、FPS/FES、FRA1、FRA2、FYN、HCK、HEK、HER3/ERBB-2、ERBB-3、HER4/ERBB-4、HST2、INK4A、INK4B、JUN、JUNB、JUND、KIP2、KIT、KRAS2A、KRAS2B、LCK、LYN、MAS、MAX、MCC、MLH1、MOS、MSH2、MYBA、MYBB、NF1、NF2、P53、PDGFB、PIM1、PTC、RB1、RET、ROS1、SKI、SRC1、TAL1、TGFBR2、THRA1、THRB、TIAM1、TRK、VAV、VHL、WAF1、WNT2、WT1、YES1、ALK/NPM1、AMI1、AXL、FMS、GIP、GLI、GSP、HOX11、HST、IL3、INT2、KS3、K-SAM、LBC、LMO-1、LMO-2、L-MYC、LYL1、LYT-10、MDM-2、MLH1、MLL、MLM、N-MYC、OST、PAX-5、PMS-1、PMS-2、PRAD-1、RAF、RHOM-1、RHOM-2、SIS、TAL2、TAN1、TIAM1、TSC2、TRK、TSC1、STK11、PTCH、MEN1、MEN2、P57/KIP2、PTEN、HPC1、ATM、XPA/XPG、BCL6、DEK、AKAP13、CDH1、BLM、EWSR1/FLI1、FES、FGF3、FGF4、FGF6、FANCA、FLI1/ERGB2、FOSL1、FOSL2、GLI、HRAS1、HRX/MLLT1、HRX/MLLT2、KRAS2、MADH4、MAS1、MCF2、MLLT1/MLL、MLLT2/HRX、MTG8/RUNX1、MYCLK1、MYH11/CBFB、NFKB2、NOTCH1、NPM1/ALK、NRG/REL、NTRK1、PBX1/TCF3、PML/RARA、PRCA1、RUNX1、RUNX1/CBFA2T1、SET、TCF3/PBX1、TGFB1、TLX1、P53、WNT1、WNT2、 WT1、αv-β3、PKCα、TNFα、クラスタリン、サバイビン、TGFβ、c-fos、c-SRC、およびINT-1が挙げられる。
本発明は癌遺伝子の標的化に限定されない。本発明の方法および組成物はその発現の下方制御が望ましいあらゆる遺伝子 の標的化に有用である。例えば、ある態様において、標的とすべき遺伝子としては、これらに限定されないが、免疫グロブリンまたは抗体遺伝子、凝固因子遺伝子、プロテアーゼ、下垂体ホルモン、プロテアーゼ阻害剤、増殖因子、ソマトメジン、ゴナドトロピン、走化性因子(chemotactin)、ケモカイン、血漿タンパク質、血漿プロテアーゼ阻害剤、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、転写因子、または病原体標的 (例えば、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、微生物遺伝子、真菌遺伝子)が挙げられる。
脂質についての略語は主に文献における標準的使用であり、参考として本明細書に記載する:
DMPC:ジミリストイルホスファチジルコリン
DPPC:ジパルミトイルホスファチジルコリン
DSPC:ジステアロイルホスファチジルコリン
POPC:パルミトイル-オレオイルホスファチジルコリン
OPPC:1-オレオイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DOPC:ジオレオイルホスファチジルコリン
DOPE:ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
DMPE:ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン
DPPE:ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
DOPG:ジオレオイルホスファチジルグリセロール
POPG:パルミトイル-オレオイルホスファチジルグリセロール
DMPG:ジミリストイルホスファチジルグリセロール
DPPG:ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
DLPG:ジラウリルホスファチジルグリセロール
DSPG:ジストラロイルホスファチジルグリセロール
DMPS:ジミリストイルホスファチジルセリン
DPPS:ジパルミトイルホスファチジルセリン
DOPS:ジオレオイルホスファチジルセリン
POPS:パルミトイル-オレオイルホスファチジルセリン
DMPA:ジミリストイルホスファチジン酸
DPPA:ジパルミトイルホスファチジン酸
DOPA:ジオレオイルホスファチジン酸
POPA:パルミトイル-オレオイルホスファチジン酸
DSPA:ジステアロイルホスファチジン酸
DLPA:ジラウリルホスファチジン酸
CHEMS:コレステロールヘミスクシナート
DC-Chol:3-β-[N-(N´,N´-ジメチルエタン) カルバモイル]コレステロール
Cet-P:セチルホスファート
DODAP:(1,2)-ジオレオイルオキシプロピル)-N,N-ジメチルアンモニウム クロリド
DOEPC:1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン
DAC-Chol:3-β-[N-(N,N´-ジメチルエタン) カルバモイル]コレステロール
TC-Chol:3-β-[N-(N´,N´、N´-トリメチルアミノエタン) カルバモイル] コレステロール
DOTMA:(1,2-ジオレイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド) (Lipofectin(登録商標))
DOGS:((C18)2GlySper3+) N,N-ジオクタデシルアミド-グリシル-スペルミン (Transfectam(登録商標))
CTAB:セチル-トリメチルアンモニウムブロミド
CPyC:セチル-ピリジニウムクロリド
DOTAP:(1,2-ジオレオイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DMTAP:(1,2-ジミリストイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DPTAP:(1,2-ジパルミトイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DOTMA:(1,2-ジオレイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド)
DORIE:(1,2-ジオレイルオキシプロピル)-3 ジメチルヒドロキシエチル アンモニウムブロミド)
DDAB:ジメチルジオクタデシルアンモニウム ブロミド
DPIM:4-(2,3-ビス-パルミトイルオキシプロピル)-1-メチル-1H-イミダゾール
CHIM:ヒスタミニル-コレステロールカルバメート
MoChol:4-(2-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロールヘミスクシナート
HisChol:ヒスタミニル-コレステロールヘミスクシナート
HCChol:Nα-ヒスチジニル-コレステロールカルバメート
HistChol:Nα-ヒスチジニル-コレステロール-ヘミスクシナート
AC :アシルカルノシン、ステアリル- & パルミトイルカルノシン
HistDG:1,2-ジパルミトイルグリセロール-ヘミスクシナット-N-ヒスチジニル-ヘミスクシナート、& ジステアロイル-、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体
IsoHistSuccDG:1,2-イパルミトイルグリセロール-O-ヒスチジニル-Nα-ヘミスクシナット、& ジステアロイル-、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体
DGSucc:1,2-ジパルミトイルグリセロール-3-ヘミスクシナート & ジステアロイル-、ジミリストイル- ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体
EDTA-Chol:エチレンジアミンテトラ酢酸のコレステロール エステル
Hist-PS:Nα-ヒスチジニル-ホスファチジルセリン
BGSC:ビスグアニジニウム-スペルミジン-コレステロール
BGTC:ビスグアニジニウム-tren-コレステロール
DOSPER:(1.3-ジオレオイルオキシ-2-(6-カルボキシ-スペルミル)-プロピルアルニド
DOSC:(1,2-ジオレオイル-3-スクシニル-sn-グリセリル コリン エステル)
DOGSDO:(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-スクシニル-2-ヒドロキシエチル ジスルフィド オルニチン)
DOGSucc:1,2-ジオレオイルグリセロール-3-ヘミスクシネート
POGSucc:パルミトリル-オレオイルグリセロール-オレオイル-3-ヘミスクシナート
DMGSucc:1,2-ジミリストイルグリセロール-3-ヘミスクシナート
DPGSucc:1,2-ジパルミトイルグリセロール-3-ヘミスクシナート
両性リポソームは約 pH 7.5でアニオン性または中性の電荷を有し pH 4でカチオン性電荷を有する最近記載されたリポソームのクラスを表す。PCT 国際公開 WO 02/066490、WO 02/066120 および WO 03/070220(これらはそれぞれ引用により本明細書に含める)は、両性リポソームおよびそれに好適な脂質を詳細に記載している。本発明によるDNAi オリゴヌクレオチドの担体として両性リポソームを使用して、例えば腫瘍増殖の阻害および/または低下により、細胞および哺乳類における癌を治療することは、リポソームが血流および組織において安定であることを必要とする。特に、全身適用の後、DNAI オリゴヌクレオチドは標的組織または細胞に最終的に取り込まれるまで安定にリポソームに捕捉されなければならない。したがって、FDAのリポソーム製剤についてのガイドラインはリポソーム薬のための特定の前臨床試験を管理している(http://www.fda.gov/cder/guidance/2191dft.pdf)。例えば、封入された薬剤の遊離の薬剤に対する比を血流における循環時間にわたって測定しなければならない。
1.両性脂質
両性脂質はPCT 国際公開 WO02/066489 およびWO03/070735に開示されており、それら両方の内容は引用により本明細書に含める。分子全体は「両性物質」分子部分におけるカチオン性およびアニオン性基の同時存在によりそのpH-依存的電荷特性をもつ。より具体的には、両性物質はその電荷成分の和が特定の pH値において正確にゼロとなる事実を特徴とする。この点は等電点 (IP)と称される。IPより上では、化合物は負の電荷を有し、IPより下では正のカチオンとみなされ、両性脂質のIP の範囲は4.5から8.5である。
z = Σni×((qi-1) + (10(pK-pH)/(1+10(pK-pH)))
qi:そのpKより下でのイオン性基の絶対電荷(例えば、カルボキシル = 0、一窒素塩基 = 1、ジ-エステル化ホスファート基 = -1)
ni: 分子におけるかかる基の数。
Z-X-W1-Y-W2-HET
[式中:
Zは、ステロールまたは脂肪族;
ステロールは、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、22-ケトステロール、20-ヒドロキシステロール、シグマステロール、22-ヒドロキシコレステロール、25 ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、7-デヒドロコレステリル、ジヒドロコレステロール、19-ヒドロキシコレステロール、5αコレスト-7-エン-3β-オール、7-ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール デヒドロエルゴステロール、およびそれらの誘導体からなる群から選択される;
各W1は、独立に、非置換脂肪族;
各W2は、独立に、HO(O)C-脂肪族-アミノまたはカルボキシにより置換されていてもよい脂肪族;
XおよびYはそれぞれ独立に、非存在、-(C=O) -O-、- (C=O) -NH-、- (C=O) -S-、-O-、-NH-、-S-、-CH=N-、-O- (O=C) -、-S- (O=C) -、-NH- (O=C) -、および-N=CH-;そして、
HETは、アミノ、置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または置換されていてもよいヘテロアリール]。
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-モルホリニル
または、
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-イミダゾリル。
さらに別の側面において、ステロールはコレステロールである。
Z-X-W1-Y-W2-HET
[式中:
Z は下記一般式の構造
ステロールは、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、22-ケトステロール、20-ヒドロキシステロール、シグマステロール、22-ヒドロキシコレステロール、25 ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、7-デヒドロコレステリル、ジヒドロコレステロール、19-ヒドロキシコレステロール、5αコレスト-7-エン-3β-オール、7-ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール デヒドロエルゴステロール、およびそれらの誘導体からなる群から選択される;
各W1は、独立に8までの炭素原子を有する非置換脂肪族;
各W2は、独立に、8までの炭素原子および0、1、または2のエチレン性(ethyleneically)不飽和結合を有する脂肪族 、カルボン酸;
Xは、非存在 およびYは、 -(C=O)-O-; -(C=O)-NH-; -NH-(C=O)-O-; -O-; NH-; -CH=N-; -O-(O=C)-; -S-; -(O=C)-; -NH-(O=C)-; -O-(O=C)-NH-、-N=CH- および/または -S-S-; そして、
HET は、アミノ、置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または、置換されていてもよいヘテロアリール]。
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-モルホリニル
または
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-イミダゾリル。
さらに別の側面において、ステロールはコレステロールである。
あるいは、脂質相はPCT 国際公開 WO02/066012(その内容は引用により本明細書に含める)に開示のようにpH-応答性アニオン性および/またはカチオン性成分を用いて製剤することができる。pH感受性のカチオン性脂質はPCT 国際公開 WO02/066490 およびWO03/070220、Budker、et al. (1996)、Nat Biotechnol. 14(6):760-4、および米国特許 6,258,792に開示されており、それらの内容はすべて引用により本明細書に含まれる。あるいは、カチオン性電荷はpH 感受性アニオン性脂質と組み合わせて当業者に知られた構成的に荷電した脂質から導入してもよい。構成的に荷電 (例えば、特定のpH範囲、例えばpH約 4〜9にわたって安定に荷電)したアニオン性およびカチオン性脂質の組合せ、例えば DOTAP および DPPGは好ましくない。したがって、ある態様において、脂質成分の混合物は、(i)安定なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質、(ii)荷電可能なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質または(iii)安定なアニオン性脂質および荷電可能なカチオン性脂質を含みうる。
(1)強く (例えば、構成的に荷電した)カチオン性、pKa > 9、正味の正の電荷: その化学的性質に基づき、これらは、例えば、アンモニウム、アミジニウム、グアニジウムまたはピリジニウム基または適時、二級または三級アミノ官能基。
(2) 弱くカチオン性、pKa < 9、正味の正の電荷: その化学的性質に基づき、これらは特に、窒素塩基、例えば ピペラジン、イミダゾールおよびモルホリン、プリンまたはピリミジン。生物学的系に生じるかかる分子断片は、例えば、4-イミダゾール(ヒスタミン)、2-、6-、または9-プリン(アデニン、グアニン、アデノシンまたはグアノシン)、1-、2-または4-ピリミジン(ウラシル、チミン、シトシン、ウリジン、チミジン、シチジン) またはピリジン-3-カルボン酸 (ニコチンエステルまたはアミド)である。好ましい pKa 値を有する窒素塩基はまた、窒素原子を1回以上、低分子量アルカンヒドロキシル、例えば、ヒドロキシメチルまたはヒドロキシエチル基で置換することにより形成される。例えば、アミノジヒドロキシプロパン、トリエタノールアミン、トリス-(ヒドロキシメチル)メチルアミン、ビス-(ヒドロキシメチル)メチルアミン、トリス-(ヒドロキシエチル)メチルアミン、ビス-(ヒドロキシエチル)メチルアミンまたは対応する置換エチルアミンが挙げられる。
(3) 弱くアニオン性、pKa > 4、正味の負の電荷: その化学的性質に基づき、これらは、特にカルボン酸である。これらには、12までの炭素原子および0、1 または2 エチレン性不飽和結合を有する脂肪族、直鎖状または分枝状 モノ、ジまたはトリカルボン酸が含まれる。好適な挙動のカルボン酸は芳香族系の置換基としてもみられる。その他の弱くアニオン性の基は、アスコルビン酸、N-置換アロキサン、N-置換バルビツール酸、ベロナール、フェノールにおいて解離し、生じうる、ヒドロキシルまたはチオールであり、またはチオール基として存在しうる。
(4) 強く (例えば、構成的に荷電した) アニオン性、pKa < 4、正味の負の電荷:その化学的性質に基づき、それらは、例えば スルホナートまたはホスファートエステルなどの官能基である。
式中、qiはその pKより下での個々のイオン性基の絶対電荷(例えば、カルボキシル = 0、一窒素塩基 = 1、第二解離段階のホスファート基= -1等)
niはリポソームにおけるこれらの基の数。
L-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-HET
[式中:
Lは、ステロールまたは[脂肪族(C(O)O)-]2アルキル-;
ステロールは、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、22-ケトステロール、20-ヒドロキシステロール、シグマステロール、22-ヒドロキシコレステロール、25 ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、7-デヒドロコレステリル、ジヒドロコレステロール、19-ヒドロキシコレステロール、5αコレスト-7-エン-3β-オール、7-ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、デヒドロエルゴステロール、およびそれらの誘導体からなる群から選択される;
スペーサー 1 およびスペーサー 2はそれぞれ独立に、非置換脂肪族;
XおよびYはそれぞれ独立に、非存在、-(C=O) -O-、- (C=O) -NH、- (C=O) -S-、-O-、-NH-、-S-、-CH=N-、-O- (O=C) -、-S- (O=C) -、-NH- (O=C) -、=CH-、-CH2-、=N-O-、 =N-NH-、=N-NH-(C=O)-、NH-SO2-、S(O) n-、S(O)2-NH-または-N=CH-; そして、
HET は、アミノ、置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または置換されていてもよいヘテロアリール]。
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-モルホリニル
または、
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-イミダゾリル。
さらに別の側面において、ステロールはコレステロールである。
L-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-HET
[式中:
Lは下記一般式による構造、
ステロールはコレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、22-ケトステロール、20-ヒドロキシステロール、シグマステロール、22-ヒドロキシコレステロール、25 ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、7-デヒドロコレステロール、ジヒドロコレステロール、19-ヒドロキシコレステロール、5αコレスト-7-エン-3β-オール、7-ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、デヒドロエルゴステロール、およびそれらの誘導体からなる群から選択される;
スペーサー 1およびスペーサー 2はそれぞれ独立に1-8 炭素原子を有する非置換脂肪族;
Xは非存在およびYは非存在、-(C=O)-O-; -(C=O)-NH-;-NH-(C=O)-O-; -O-; -NH-; -CH=N-; -O-(O=C)-; -S-; -(O=C)-; -NH-(O=C)-; -O-(O=C)-NH-、-N=CH- および/または -S-S-;そして、
HETは、アミノ、置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または置換されていてもよいヘテロアリール]。
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-モルホリニル
または、
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-イミダゾリル。
さらに別の側面において、ステロールはコレステロールである。
中性脂質は pH約 4 〜 9にて中性に荷電したままであるあらゆる脂質を含む。中性脂質としては、限定されないが、コレステロール、その他のステロールおよびその誘導体、リン脂質およびそれらの組合せおよびその他の中性脂質が挙げられる。リン脂質はリポソームを形成できるいずれかのリン脂質またはリン脂質の組合せを含む。それらには、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、レシチンおよびそれらのフラクション、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、プラスマロゲンおよびスフィンゴミエリンが含まれる。ホスファチジルコリンとしては、限定されないが、卵、ダイズまたはその他の植物源から得られるものまたは部分的または完全に合成のものまたは様々な脂質鎖長 および不飽和のもの、POPC、OPPC、天然または水添 ダイズ PC、天然または水添卵 PC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC およびそれらの誘導体が挙げられる。一つの態様において、ホスファチジルコリンはPOPC、非水添ダイズ PC および 非水添卵 PCである。ホスファチジルエタノールアミンとしては、限定されないが、DOPE、DMPE およびDPPE およびそれらの誘導体が挙げられる。ホスファチジルグリセロールとしては、限定されないが、DMPG、DLPG、DPPG、およびDSPGが挙げられる。ホスファチジン酸としては、限定されないが、DSPA、DMPA、DLPA および DPPAが挙げられる。
1. bcl-2遺伝子の調節領域
bcl-2 遺伝子はP1およびP2と称される2つのプロモーターを有する。ほとんどのbcl-2 mRNAがそこから転写されるP1は翻訳開始部位のおよそ 1.4 kb 上流に位置し、P2はP1の1.3 kb 下流である ( Seto、M. et al. EMBO J. 7、123-131 (1988)参照)。P1はGC-リッチであり、TATAボックスを欠き、多くの転写開始部位を有し、SP1 転写因子についての7つのコンセンサス結合部位を含む。P2は CCAAT ボックスおよびTATA ボックスを含み、2種類の転写開始部位を有する。複数のNF-KB 認識部位および1つのSV40 エンハンサー-様オクタマーモチーフがP2内に存在する(Heckman、C.A.、et al. Oncogene 21、3898-3908 (2002) を参照)(配列番号1254を参照)。ほとんどのヒトろ胞性リンパ腫はt(14;18) 染色体転座を含み、それは3’-bcl-2 遺伝子領域限界点に起因する(Tsujimoto、Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 84、1329-1331 (1987) を参照)。これらの転座は bcl-2 発現を免疫グロブリン重鎖 (IgH) 座位エンハンサーの制御下に置き、その結果、bcl-2 発現の上方制御が起こる。あるいは、IgH 座位またはいくつかのDLCL リンパ腫患者単離株においてみられる2種類の免疫グロブリン軽鎖 (IgL) 座位との融合に起因する5’-bcl-2 限界点 領域が存在する(Yonetani、N. et al. Jpn. J. Cancer Res. 92、933-940 (2001) を参照)。これら5’-bcl-2 限界点は翻訳開始部位の378〜2312 bp 上流に広がる領域に対して異なる異種患者単離株においてマッピングされている (配列番号1255-1266を参照)。限界点付近の領域はbcl-2 DNAiオリゴヌクレオチド設計について使用できる配列でありうる。
ある態様においてDNAi オリゴヌクレオチドは、二本鎖DNAのプラス鎖またはマイナス鎖のいずれかに相補的なDNA オリゴマーである。DNAi オリゴヌクレオチドは c-ki-ras、c-Ha-ras、c-myc、her-2、TGF-α、またはbcl-2遺伝子の調節領域にハイブリダイズしうる。本発明の目的のため、これら上流領域は、配列番号1 (her-2、またはc-erb-2について)、配列番号282 (c-ki-rasについて)、配列番号462 (c-Ha-rasについて)、配列番号936 (c-mycについて)、配列番号1081 (TGF-αについて) および配列番号1249 および1254 (bcl-2について)として規定される。ただし、DNAi オリゴヌクレオチドは 一本鎖核酸オリゴヌクレオチドまたはその誘導体であり、その配列は部分的にはオリゴヌクレオチドが間接的または直接的に同じまたは異なる遺伝子の発現、制御または産生に影響を与える遺伝子の最も長い非転写領域の部分に相補的であり、ここで最も長い非転写領域は転写開始部位が翻訳開始部位に非常に近くに位置している場合転写されない遺伝子の部分を含む。DNAi オリゴヌクレオチドはmRNAまたはプレ-mRNAとのみ塩基対形成し、RNA プロセシング および/または メッセンジャー翻訳を干渉するRNAiおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含まない。
ある態様において、癌遺伝子の調節領域内にある領域がDNAiオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための領域としてさらに規定される。ある態様において、これら領域は「ホットゾーン」と称される。
一つの側面において、DNAiオリゴヌクレオチドは生理条件下で以下の配列にハイブリダイズするあらゆるDNAiオリゴマーであり得る: 配列番号1、配列番号282、配列番号462、配列番号936、配列番号1081、配列番号1249 および/または 1254。別の側面において、DNAiオリゴヌクレオチドは、配列番号1、配列番号282、配列番号462、配列番号936、配列番号1081および配列番号1249における例示的なホットゾーンに生理条件下でハイブリダイズするあらゆるDNAiオリゴマーであり得る。DNAiオリゴマーの例としては、これらに限定されないが、配列番号2-281、283-461、463-935、937-1080、1082-1248、1250-1253 および 1267-1447 およびそれらの相補鎖のDNAiオリゴマーが挙げられる。別の側面において、DNAiオリゴヌクレオチドは配列番号 2-22、283-301、463-503、937-958、1082-1109、1250-1254 および1270-1447 およびそれらの相補鎖である。これらの側面の1つの態様において、DNAiオリゴヌクレオチドは15-35 塩基対の長さである。
[式中:
Bは核酸塩基を構成する;
Z* はヌクレオシド間結合および末端基から選択される;
Z は先行するヌクレオチド/ヌクレオシドのヌクレオシド間結合に対する結合および末端基から選択され、ただし、Zと Z*との一方のみが末端基であり得る;
Xおよび Yは独立に、-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-CH2- または-C(H)=、 CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2- または-CH2-C(H)=、-CH=CH- から選択される;
ただし、XおよびYは両方がOであることはない]。
オリゴヌクレオチド合成の既知のあらゆる方法を本発明の修飾DNAiオリゴマーの調製に用いることが出来る。ある態様において本発明の教示に従い、メチル化DNAiオリゴヌクレオチドを用いて、ヌクレオチド、dCが適宜5-メチル-dCに置換される。本発明の修飾または非修飾DNAi オリゴヌクレオチドはもっとも便宜にはいずれかの市販の自動核酸合成機を用いて調製される。それらは顧客の指示にしたがってオリゴヌクレオチドを注文合成する市販源から得ることが出来る。
1.説明
有利なことに、本発明の混合物の両性リポソーム製剤は、(1)低い毒性を示し; (2) 高濃度のDNAi オリゴマーを捕捉することができ、例えば、両性リポソームに会合するDNAi オリゴヌクレオチドの捕捉効率は少なくとも約 35%であり; (3)例えば、オリゴヌクレオチドおよび/またはその他の薬剤が標的組織または細胞に最終的に取り込まれるまでリポソーム中に安定に捕捉されるよう全身投与した場合、血流中で安定であり; (4) 動物への送達について、例えば、約 10 〜 100 mM またはそれ以下の脂質濃度について捕捉されたDNAi オリゴヌクレオチドの濃度を約 1〜4 mg/ml (例えば 約 2 mg/ml)に調整することにより最適化でき、かかる濃度は、200 μlの注入体積において10 mg/kgの投与量を提供する; および (5) 200 nmより小さい平均両性リポソームサイズ、例えば 約 100 nmにて産生でき、腫瘍への浸透が最大化できる。
本発明のDNAi-両性リポソームは当業者に知られたリポソームの調製およびサイズ調整のための標準的方法により調製できる。これらには、脂質フィルムおよび粉末の水和、溶媒注入および逆相蒸発が含まれる。しばしば、多重膜ベシクルは両親媒性脂質が水和すると自然に形成するが、小単層ベシクルの形成には通常、実質的なエネルギー入力を伴うプロセス、例えば、超音波処理、高圧均質化、エタノール中の脂質 溶液の捕捉すべきDNAi オリゴヌクレオチドを含む水相への注入、および/または所定の孔サイズのフィルターまたはメンブレンを通る押出が要求される。リポソームの調製および特徴決定の方法は、例えば、S. Vemuri et al. (Preparation and characterization of liposomes as therapeutic delivery systems: a review. Pharm Acta Helv. 1995、70(2):95-111.)に記載されている。
本発明の組成物は癌を治療するための動物、例えばヒトまたは細胞の処理に有用であり、例えばこれは腫瘍増殖の阻害または低下による。動物は非ヒト動物であってよく、マウス、ウマ、ネコ、イヌ、またはその他の動物が含まれ、あるいはヒトであってもよい。 一つの態様において、混合物を動物に 用量1 mg 〜100 mg/kg体重にて導入する。 別の態様において、両性リポソームは動物に1日1回以上または連続的に導入してもよい。
MoCholおよびHisCholの合成は米国特許出願2004/0131666 (WO 02/066490)に記載のものとした。その他の脂質は市販源から得られる。例えば、DOTAPおよびコレステロールはMerckから得られ、DMG-Succ は Chiroblock GmbHから得られ、CHEMSはSigma Chemical Companyから入手でき、DPPG、DOPE およびPOPCは GenzymeまたはLipoid GMBHから得られ、卵ホスファチジルコリンは Lipoid GMBHから入手できる。
リポソームの脂質組成ならびにその調製方法は腫瘍浸透を最大化するために、封入効率が約 35%以上となり、リポソームサイズが200 nm未満、最適には100-120 nm付近になるように選択する。動物への投与のために、DNAi オリゴヌクレオチド濃度は脂質濃度100 mM またはそれ以下にて好ましくは少なくとも 2 mg/mlである。これにより200 μlの注入体積において10 mg/kgの投与が可能となる。
2400 μmoleの脂質を48.8〜95.2 mgのDNAi オリゴヌクレオチドを含む10 mM NaOAc、150 mM NaCl (クエン酸を用いてpHを調整した)で40℃で30分間水和する。3回の凍結解凍工程の後、結果として得られた多重膜ベシクルを数回高圧ポンプを用いてポリカーボネートメンブレン (100 nm 孔サイズ)に通す。押出工程の直後、リポソーム懸濁液のpHはpH 7.5にシフトする。結果として得られた懸濁液をT865 (Sorvall Ultra Pro80) またはTLA 100.4ローター (Beckman Optima-MAX)を用いて25sで沈降させて非捕捉DNAi オリゴヌクレオチドを除き、バッファーをリン酸緩衝食塩水 (PBS)と交換する。
脂質フィルムを405 mgのDNAi オリゴヌクレオチドを含有するPBS で1時間40℃で最終脂質濃度 100 mMにて水和する。3回の凍結解凍工程の後、結果として得られたベシクルを押し出して100 〜800 nmの様々な孔サイズを有するポリカーボネートメンブレンスタックに通す。結果として得られた 懸濁液を25sで3回沈降させる(PBSはリン酸緩衝食塩水であり以下の処方を有する: 10.1 mM Na2PO4、1.76 mM KH2PO4、137 mM NaCl、2.68 mM KCl、pH 7.5)。
ベシクルを受動的または進行型搭載手順により調製し、脂質ベシクルの生産のための装置を用いて押し出す。
リポソームを改変エタノール注入方法により産生する。簡単に説明すると、脂質混合物 D (POPC/DOPE/MoChol/Chems 6:24:47:23) (133mM、55℃に加熱)を含む3 体積のエタノール、および、PNT2254またはPNT2254R 産生の場合2.71 mg/ml PNT100 (配列番号1251)またはPNT100-R (配列番号1288) あるいはPNT2253 産生の場合1.36 mg/ml PNT100を含む8 体積の20mM NaAc/300mM スクロース/pH 4を、米国特許 6843942号および米国特許出願 2004/0032037号に開示のような注入装置を用いて連続的に混合した。酸性混合物を32 体積の100mM NaCl / 136mM ホスファート / pH 9によるさらなる連続混合工程によりpH 7.5 とした。その結果得られたリポソーム懸濁液を 10倍濃縮し、PBS、pH 7.4に対して透析して未封入PNT100 またはPNT100-R および過剰のエタノールを洗い流した。
脂質比をリポソームの血清中の安定性およびDNAi オリゴヌクレオチドの最小の漏出の両方について最適化しうる。上記製剤は血清中で安定であり、オリゴヌクレオチドの最小の漏出を示しうる。
少なくとも 2 mg/mlの封入PNT-100 (配列番号1251)、40% より高い封入効率および200 nm未満の粒子サイズの規格を満たす3つの製剤(製剤 B、D、およびF、実施例 2参照) をヒトリンパ腫モデルにおいて試験した。リンパ腫細胞(WSU-DLCL2-Wayne State University Diffuse Large Cell Lymphoma)をDr. Ramzi Mohammad、Karmanos Cancer Institute、Wayne State Universityから得た。異種移植片をC17/SCIDマウスの皮下に移植した。移植の7日後、マウスの静脈内に10 mg/kgのPNT-100 (配列番号1251) 製剤および10 mg/kgのPNT-100R (配列番号1288) 製剤を注射した。注射は6匹のマウスに8日間毎日行った。腫瘍サイズを移植後30日まで測定した。すべての生存した動物は肉眼では毒性病状を示さなかった。
種々の製剤をPC-3 ヒト 前立腺癌モデルにおいて試験した。異種移植片を2 X 106 PC-3 細胞(ATCC CRL 1435) の ヌードマウスへの皮下注入により作成した。50-200 mm3の異種移植片を担持するマウスの静脈内に10 mg/kg の PNT-100 (配列番号1251)または PNT-100R (配列番号1288)を製剤B、DまたはFのいずれかにおいて1、2、および5日目に注射し、3 および4日目には7.5 mg/kg注射した。 結果はPNT-100による腫瘍増殖の低下を示す。PNT-100Rによっては腫瘍増殖は低下しなかった(図 7 および 8)。 N=5。
製剤 DにおけるPNT-100の毒性をカニクイザルにおいて調べた。2匹のこの霊長類を2時間PBS 対照、5 mg/kg PNT2254、25 mg/kg PNT2254の静脈内注入により処理し、1匹は 67 mg/kg PNT2254で処理した。各投与の間に1週間の「ウォッシュアウト」期間を設けた。肝臓酵素毒性分析、補体活性化、全体の挙動および生理測定値を各処理の前後に収集した。この研究の目的は最大許容用量閾値を確立し、PNT2254 脂質に対するCARPA 毒性応答がないことを確証することであった。CARPAは、極端な高血圧および死亡を導きうる非古典的補体経路活性化毒性応答に起因すると歴史的に知られている毒性応答である。霊長類はすべての用量に耐性で生存し、古典的補体活性化のみが検出され、非古典的 (生得的) 補体活性化は検出されなかった。肝臓酵素毒性分析はPNT2254に対する肝臓酵素応答のわずかな上昇を示した。
本発明をその詳細な説明によって記載してきたが、上記の記載は本発明を説明する目的であって範囲を限定する意図ではなく、発明の範囲は添付の請求の範囲によって規定されることを理解されたい。その他の側面、利点および修飾は請求の範囲の範囲内である。
Claims (90)
- 両性リポソームおよびDNAi オリゴヌクレオチドを含む混合物。
- 両性リポソームが 4〜8の等電点を有する請求項 1の混合物。
- 両性リポソームがpH 7.4で正味の負の電荷を有するかまたは中性であり、pH 4で正味の正の電荷を有する請求項 1または 2の混合物。
- 両性リポソームが両性脂質を含む脂質相から形成されている請求項 1、2または3の混合物。
- 脂質相が5 〜 30 mol% の両性脂質を含む請求項 4の混合物。
- 両性脂質が HistChol、HistDG、isoHistSuccDG、アシルカルノシンおよびHCCholからなる群から選択される請求項 4または5の混合物。
- 両性リポソームが、両性の性質を有する脂質成分の混合物を含む脂質相から形成されている請求項 1、2または3の混合物。
- 脂質成分の混合物がアニオン性またはカチオン性成分を含み、かかる成分の少なくとも1つが pH 応答性である請求項 7の混合物。
- 脂質成分の混合物が、(i) 安定なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質、(ii)荷電可能なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質、ならびに(iii) 安定なアニオン性脂質および荷電可能なカチオン性脂質からなる群から選択される請求項 8の混合物。
- 脂質成分がDOGSucc、POGSucc、DMGSucc、DPGSucc、DGSucc、DMPS、DPPS、DOPS、POPS、DMPG、DPPG、DOPG、POPG、DMPA、DPPA、DOPA、POPA、CHEMSおよび Cet-P からなる群から選択される1以上のアニオン性脂質を含む請求項 9の混合物。
- 脂質成分がDMGSucc、DOPA、CHEMSおよび Cet-Pからなる群から選択される1以上のアニオン性脂質を含む請求項 9または請求項 10の混合物。
- 脂質成分がDMTAP、DPTAP、DOTAP、DC-Chol、MoChol、HisChol、DPIM、CHIM、DORIE、DDAB、DAC-Chol、TC-Chol、DOTMA、DOGS、(C18)2Gly+N,N-ジオクタデシルアミド-グリシン、CTAP、CPyC、DODAP およびDOEPCからなる群から選択される1以上のカチオン性脂質を含む請求項 8 〜11のいずれかの混合物。
- 脂質成分がDOTAP、DC-Chol、MoCholおよびHisCholからなる群から選択される1以上のカチオン性脂質を含む請求項 8 〜11のいずれかの混合物。
- アニオン性脂質が CHEMS であり、カチオン性脂質がMoCholである、請求項 7の混合物。
- アニオン性脂質がCHEMSであり、カチオン性脂質がDOTAPである、請求項 7の混合物。
- アニオン性脂質がCet-P であり、カチオン性脂質が MoCholである、請求項 7の混合物。
- アニオン性脂質がDMGSucc であり、カチオン性脂質がMoCholである、請求項 7の混合物。
- 脂質相がさらに中性脂質を含む請求項 4 〜17のいずれかの混合物。
- 中性脂質がステロールおよびその誘導体を含む請求項 18の混合物。
- 中性脂質が中性リン脂質を含む請求項 18の混合物。
- 中性リン脂質がホスファチジルコリンを含む請求項 20の混合物。
- ホスファチジルコリンがPOPC、OPPC、天然または水添ダイズ PC、天然または水添卵 PC、DMPC、DPPCまたはDOPC およびそれらの誘導体からなる群から選択される請求項 21の混合物。
- ホスファチジルコリンが POPCである請求項 22の混合物。
- 中性リン脂質がホスファチジルコリンとホスホエタノールアミンとの混合物を含む請求項 20の混合物。
- ホスファチジルコリンがPOPC、OPPC、天然または水添ダイズ PC、天然または水添卵 PC、DMPC、DPPCまたはDOPC およびそれらの誘導体からなる群から選択され、ホスファチジルエタノールアミンがDOPE、DMPE、DPPEおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項 24の混合物。
- ホスファチジルコリンがPOPCであり、ホスファチジルエタノールアミンが DOPEである、請求項 25の混合物。
- 中性脂質がPOPCおよびコレステロールである請求項 18の混合物。
- 両性リポソームが DOPE、POPC、CHEMS および MoCholを含む請求項 24の混合物。
- 両性リポソームがPOPC、DOPE、MoCholおよび DMGSuccを含む請求項 24の混合物。
- 両性リポソームがPOPC、Chol、CHEMS およびDOTAPを含む請求項 27の混合物。
- 両性リポソームがPOPC、Chol、CetP およびMoCholを含む請求項 27の混合物。
- 両性リポソームを含む混合物であり、
両性リポソームが、
PNT-100 (配列番号1251);
両性の性質を有する脂質成分の混合物、
ここで、脂質成分の混合物がアニオン性およびカチオン性成分を含み、かかる成分の少なくとも1つが pH 応答性である、および、
中性脂質、
を含み、
中性脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンまたはステロールを含み、混合物が 30 〜 70 mole %の両性脂質および 30 〜 60 mole %の中性脂質を含む、混合物。 - カチオン性脂質が DMTAP、DPTAP、DPTAP、DOTAP、DC-Chol、TC-Chol、MoChol、HisChol、DPIM、CHIM、DORIE、DDAB、DAC-Chol、TC-Chol、DOTMA、DOGS、(C18)2Gly+N,N-ジオクタデシルアミド-グリシン、CTAB、CPyC、DODAP、DOEPC およびそれらの誘導体からなる群から選択され、アニオン性脂質がDOGSucc、POGSucc、DMGSucc、DPGSucc、DGSucc、DMPS、DPPS、DOPS、POPS、DMPG、DPPG、DOPG、POPG、DMPA、DPPA、DOPA、POPA、CHEMS、Cet-P およびそれらの誘導体からなる群から選択され、ここで、ホスファチジルコリンが POPC、OPPC、天然または水添ダイズ PC、天然または水添卵 PC、DMPC、DPPC または DOPC およびそれらの誘導体からなる群から選択され、ホスファチジルエタノールアミンが DOPE、DMPE、DPPE およびそれらの誘導体からなる群から選択され、ステロールがコレステロールまたはその誘導体である、請求項 32の混合物。
- カチオン性脂質がDOTAP、DC-Chol、MoChol および HisCholからなる群から選択され、アニオン性脂質がDMGSucc、DOPA、CHEMS および Cet-Pからなる群から選択される、請求項 32の混合物。
- カチオン性脂質が MoCholであり、アニオン性脂質が CHEMSである、請求項 32の混合物。
- 混合物が10 〜 60 mole%の MoCholおよび 10 〜 30 mole%の CHEMSを含む請求項 35の混合物。
- カチオン性脂質がDOTAPであり、アニオン性脂質が CHEMSである、請求項 32の混合物。
- 混合物が10 〜 30 mole%の CHEMSおよび 5 〜 40 mole%の DOTAPを含む請求項 37の混合物。
- カチオン性脂質が MoCholであり、アニオン性脂質が Cet-Pである、請求項 32の混合物。
- 混合物が 10 〜 60 mole%の MoChol および5 〜 30 mole%の Cet-Pを含む請求項 39の混合物。
- カチオン性脂質がMoCholであり、アニオン性脂質がDMGSuccである、請求項 32の混合物。
- 混合物が20 〜 60 mole%の MoCholおよび20 〜 60 mole%の DMGSuccを含む請求項 41の混合物。
- 中性脂質がPOPC およびDOPEを含む請求項 32の混合物。
- 混合物が 5 〜 40 mole%の POPCおよび20 〜 50 mole%の DOPEを含む請求項 44の混合物。
- 中性脂質がPOPCおよび Cholを含む請求項 32の混合物。
- 混合物が10 〜 50 mole%の POPCおよび30 〜 50 mole%の Cholを含む請求項 45の混合物。
- 両性リポソームが POPC、DOPE、MoChol および CHEMSを含む請求項 32の混合物。
- 混合物が 3〜20 mole%の POPC、10 〜 60 mole%の DOPE、10 〜 60 mole%の MoCholおよび10 〜 60 mole%の CHEMSを含む請求項 47の混合物。
- POPC/DOPE/MoChol/CHEMSのモル比が約 6/24/47/23である請求項 47の混合物。
- POPC/DOPE/MoChol/CHEMSのモル比が15/45/20/20である請求項 47の混合物。
- 両性リポソーム がPOPC、DOPE、DMGSucc およびMoCholを含む請求項 32の混合物。
- 混合物が3〜20 mole%の POPC、10 〜 40 mole%の DOPE、15 〜 60 mole%の DMGSuccおよび15 〜 60 mole%の MoCholを含む請求項 51の混合物。
- POPC/DOPE/DMGSucc/MoChol のモル比が約 6/24/23/47である請求項 52の混合物。
- POPC/DOPE/DMGSucc/MoChol のモル比が約 6/24/47/23である請求項 52の混合物。
- 両性リポソームが POPC、Chol、CHEMSおよびDOTAPを含む請求項 32の混合物。
- 混合物が10 〜 50 mole%の POPC、20 〜 60 mole%の Chol、10 〜 40 mole%の CHEMS および5 〜 20 mole%の DOTAPを含む請求項 55の混合物。
- POPC/Chol/CHEMS/DOTAPのモル比が約 30/40/20/10である請求項 56の混合物。
- 両性リポソームが POPC、Chol、Cet-P およびMoCholを含む請求項 32の混合物。
- 混合物が10 〜 40 mole%の POPC、20 〜 50 mole%の Chol、5 〜 30 mole%の Cet-Pおよび10 〜 40 mole%の MoCholを含む請求項 58の混合物。
- POPC/Chol/Cet-P/MoCholのモル比が約 35/35/10/20である請求項 59の混合物。
- 両性リポソームが50 〜500 nmのサイズを含む請求項1-60のいずれかの混合物。
- 両性リポソームが80 〜 300 nmのサイズを含む請求項 1-61のいずれかの混合物。
- 両性リポソームが90 〜 200 nmのサイズを含む請求項 1-61のいずれかの混合物。
- 両性リポソームが脂質濃度約 10 〜 100 mM またはそれ以下において少なくとも 2 mg/mlのDNAi オリゴヌクレオチド濃度を有する請求項 1-63のいずれかの混合物。
- DNAi オリゴヌクレオチドが配列番号1249のヌクレオチド500-2026またはその相補鎖に生理的条件下でハイブリダイズするDNAi オリゴマーを含む請求項 1-64のいずれかの混合物。
- DNAi オリゴヌクレオチドが配列番号1249のヌクレオチド500-1525またはその相補鎖に生理的条件下でハイブリダイズするDNAi オリゴマーを含む請求項 1-64のいずれかの混合物。
- DNAi オリゴヌクレオチドが配列番号1249のヌクレオチド800-1225またはその相補鎖に生理的条件下でハイブリダイズするDNAi オリゴマーを含む請求項 1-64のいずれかの混合物。
- DNAi オリゴヌクレオチドが配列番号1249 のヌクレオチド 900-1125またはその相補鎖に生理的条件下でハイブリダイズするDNAi オリゴマーを含む請求項 1-64のいずれかの混合物。
- DNAi オリゴヌクレオチドが配列番号1249のヌクレオチド950-1075またはその相補鎖に生理的条件下でハイブリダイズするDNAi オリゴマーを含む請求項 1-64のいずれかの混合物。
- DNAi オリゴヌクレオチドが配列番号1249のヌクレオチド970-1045またはその相補鎖に生理的条件下でハイブリダイズするDNAi オリゴマーを含む請求項 1-64のいずれかの混合物。
- DNAi オリゴヌクレオチドが配列番号1250、1251、1252、1253、1267-1447 およびそれらの相補鎖からなる群から選択されるDNAi オリゴマーを含む請求項 1-64のいずれかの混合物。
- DNAi オリゴヌクレオチドが配列番号1250、1251、1267、1268、1276、1277、1285、1286 およびそれらの相補鎖からなる群から選択されるDNAi オリゴマーを含む請求項 1-64のいずれかの混合物。
- DNAi オリゴヌクレオチドが配列番号1250、1251、1289-1358 およびそれらの相補鎖からなる群から選択されるDNAi オリゴマーを含む請求項 1-64のいずれかの混合物。
- DNAi オリゴヌクレオチドが配列番号1250 または1251を含む請求項 1-64のいずれかの混合物。
- 以下の工程を含む方法:
(a)請求項 1-64のいずれかの混合物およびbcl-2遺伝子を発現することが出来る細胞または動物を提供する工程、 および、
(b)混合物を細胞または動物に導入する工程。 - 組成物の導入の結果、細胞の増殖の低下、または細胞死の誘導が起こる、請求項 75の方法。
- 細胞が癌細胞である請求項 75の方法。
- 動物が非ヒト動物である請求項 75の方法。
- 動物がヒトである請求項 75の方法。
- 混合物が動物に0.01 mg 〜100 mg /kg体重の用量で導入される請求項 78の方法。
- 混合物が動物に1日1回以上導入される請求項 78の方法。
- 混合物が動物に連続的に導入される請求項 78の方法。
- 混合物が動物に、局所、肺、眼内、鼻腔内、非経口および医療機器からなる群から選択される1以上の投与経路により導入される請求項 78の方法。
- 細胞が細胞培養物である請求項 74の方法。
- 被験化合物を細胞または動物に導入する工程をさらに含む請求項 74の方法。
- 被験化合物が化学療法薬である請求項 85の方法。
- 動物が膵臓癌、結腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、卵巣癌および黒色腫からなる群から選択される癌を有する請求項 86の方法。
- 請求項 1〜74のいずれかの混合物を含む医薬組成物。
- 両性リポソームおよび配列番号1251または 1250を含むDNAi オリゴヌクレオチドを含む混合物であり、リポソームがPOPC、DOPE、MoChol および CHEMSをPOPC/DOPE/MoChol/CHEMSのモル比15/45/20/20にて含む混合物。
- 両性リポソームおよび配列番号1251または 1250を含むDNAi オリゴヌクレオチドを含む混合物であり、リポソームがPOPC、DOPE、MoChol および CHEMSをPOPC/DOPE/MoChol/CHEMSのモル比6/24/47/23にて含む混合物。
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