JP2003535593A - 調節された遺伝子発現のためのプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、種々のプロモーターに関連する調節領域を含む、核酸配列、ベクターおよび宿主細胞を提供する。このプロモーターとしては、サイクリンＤ１プロモーター、ＣＤ４０Ｌプロモーター、３つのＨＢＶプロモーター（コアプロモーター、ｐｒｅ−Ｓ１プロモーター、およびＨＢＶ Ｘプロモーター）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）プロモーター、アンドロゲンレセプタープロモーター、Ｉ Ｉｅｒ２プロモーター、およびβ−ラクタマーゼプロモーターが挙げられる。本発明はさらに、このようなプロモーターの調節領域を含む遺伝子発現を調節する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、種々のプロモーター内の調節配列、ならびに異種核酸構築物、ベク
ターおよびこのような配列を使用する形質転換方法に関連する。本発明は、改変
されたプロモーターおよび調節された遺伝子発現におけるこれらの使用にさらに
関連する。

【０００２】

【数１】 （発明の背景） 原核生物および真核生物における遺伝子発現は、高度に調節されたプロセスで
ある。「正常な」または「健常な」遺伝子の不適切な発現（過剰発現または過小
発現）は、多数の疾患および疾患プロセスに関連する。同様に、変異遺伝子の発
現はまた、多数の疾患に関連する。これらの遺伝子の発現を制御することは、疾
患を処置し得る方法のうちの１つである。

【０００３】 全ての遺伝子は、転写開始部位から上流および下流の転写調節配列を含む。転
写因子は、転写調節配列を認識しそして転写調節配列に結合し、そしてこの遺伝
子から転写されたメッセージの生成を制御する。遺伝子発現の調節に関与する転
写調節核酸配列としては、プロモーター、エンハンサー、および転写因子または
転写調節タンパク質が結合する調節配列（これらは、転写の開始に必要である）
が挙げられる。転写調節配列は、転写開始部位のちょうど上流に最も頻繁に見出
されるが、これらはまた、はるかさらに上流、または遺伝子の３’側、または遺
伝子を構成するイントロンおよびエキソン内に見出され得る。

【０００４】 プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の一般に１〜約１００または２００塩
基対上流のＤＮＡ配列中の領域であり、そして代表的に１つ以上の転写因子結合
部位を含むかまたはこれに隣接する。エンハンサーは、その制御下で遺伝子の転
写を増加させるように一般に機能するＤＮＡ配列中の領域である。エンハンサー
は、転写開始部位の上流および／または下流に見出される。エンハンサーは、転
写開始部位から数百またはまさに数千塩基対離れて位置し得る。転写因子は、転
写を調節するためにプロモーターおよびエンハンサーに結合する。

【０００５】 多数の転写調節配列の配列は、当該分野で公知であり、これらのいくつかは、
ＩＳＲＥＣ（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の生命情報科学グループのメンバーに
よって開発および維持されている「真核生物プロモーターデータベース（Ｅｕｋ
ａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ）」（これは、インター
ネット上で利用可能である）において見出され得る。しかし、所定のプロモータ
ーまたはエンハンサー内に見出される特定の配列の機能の完全な分析が存在しな
いので、特定の配列が遺伝子転写を調節する際に重要であるか否かを決定するこ
とは不可能である。一旦転写調節配列が同定されると、これらは、内因性遺伝子
の発現を調節するために利用され得、そして導入遺伝子の調節された発現におけ
る使用のための異種核酸構築物に組み込まれ得る。従って、遺伝子の転写調節領
域を同定および特徴付けることは興味深い。特に興味深いのは、種々の疾患状態
に関連する遺伝子の調節領域であり、これらの例は、以下に記載される。

【０００６】 哺乳動物サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１、ＰＲＡＤ１またはＢＣＬ１とも命名さ
れている）は、乳癌、結腸癌および膵臓癌を含むがこれらに限定されない多数の
癌に対する適用を有し、そして正常な成熟動物細胞の細胞周期のＧ_１／Ｓチェッ
クポイントを調節する際に重要な役割を果たす（Ｓｈｅｒｒ，１９９６を参照の
こと）。

【０００７】 ＣＤ４０Ｌリガンド（ＣＤ４０Ｌ）（ｇｐ３９、ＣＤ１５４、ＴＲＡＰまたは
Ｔ−ＢＡＭとも称される）は、ＣＤ４０と相互作用することによってＴ細胞依存
体液性免疫応答において重要な役割を果たす。ＣＤ４０は、Ｔ細胞活性化および
Ｔ細胞レセプターによる抗原−ＭＨＣ複合体の認識に必要なシグナルを提供する
。

【０００８】 ヒトにおけるウイルス誘導性Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）は、世界中で３億人に感染し
ていると推定されており、少数であるが有意な数の感染個体が重篤な病理的結果
（慢性肝不全、肝硬変、および肝細胞癌を含む）を発症している。従って、ウイ
ルス複製に関与するＨＢＶ特異的プロモーターは、ＨＢＶ疾患の治療、および肝
細胞に特異的である調節された遺伝子発現の両方に関連している。

【０００９】 バンコマイシン耐性酵素ＶａｎＨは、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に
よる感染および定着の発生率における最近観察された増加に関連している。従っ
て、ＶａｎＨの調節された発現は、ＶＲＥの処置に適切である。

【００１０】 前立腺癌は、米国の男性において最も頻繁に診断される癌である。転移性前立
腺癌のための現在の処置は、外科的または化学的手段を使用して、アンドロゲン
レセプター（ＡＲ）を標的化する工程を包含する。アンドロゲンレセプターの調
節された発現は、前立腺癌の処置に適切である。

【００１１】 Ｈｅｒ２（ヒト上皮増殖因子レセプター２；ｃ−ｅｒｂＢ２、ｎｅｕ）は、乳
癌細胞、卵巣癌細胞および種々の他の癌細胞によって過剰発現されるチロシンキ
ナーゼ増殖因子レセプターである。従って、Ｈｅｒ−２の調節された発現は、こ
のような過剰発現の調節に適切である。

【００１２】 β−ラクタマーゼ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉに対してアンピシリン耐性を与える
。従って、β−ラクタマーゼの調節された発現は、このような抗生物質耐性の改
変に適切である。

【００１３】 本発明は、このような配列の機能的特徴付けと共に、種々の疾患状態に関連す
る遺伝子の転写調節領域の配列を提供する。

【００１４】 （発明の要旨） 本発明は、ネイティブな遺伝子プロモーターの調節配列中の内因性調節部位の
特徴づけおよび調節された遺伝子配列におけるこれらの使用に関する。

【００１５】 １つの局面において、本発明は、調節配列を含むサイクリンＤ１プロモーター
に作動可能に連結された遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付けられるサ
イクリンＤ１プロモーターの調節領域を含む単離された核酸配列を提供する。例
示的な配列は、配列番号５、配列番号６および配列番号８として示される。

【００１６】 別の局面において、本発明は、調節配列を含むＣＤ４０Ｌプロモーターに作動
可能に連結された遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付けられるＣＤ４０
Ｌプロモーターの調節領域を含む単離された核酸配列を提供する。例示的な配列
は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５として示さ
れる。

【００１７】 さらなる局面において、本発明は、調節配列を含むＨＢＶコア、ｐｒｅＳ１ま
たはＸプロモーターに連結された遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付け
られるＨＢＶプロモーターの調節領域を含む単離された核酸配列を提供する。例
示的な配列は、配列番号２０および配列番号２１（コアプロモーター）；配列番
号２３または配列番号２４（ｐｒｅＳ１プロモーター）；ならびに配列番号２６
、配列番号２７および配列番号２８（ＨＢＶ Ｘプロモーター）として示される
。

【００１８】 本発明はまた、調節配列を含むＶＲＥプロモーターに作動可能に連結された遺
伝子の発現を調節する能力によって特徴付けられるバンコマイシン耐性腸球菌（
ＶＲＥ）プロモーターの調節領域を含む単離された核酸配列を提供する。例示的
な配列は、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４として示される。
本発明は、調節配列を含むアンドロゲンレセプター（ＡＲ）プロモーターに作動
可能に連結された遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付けられるＡＲプロ
モーターの調節領域を含む単離された核酸分子をさらに提供する。例示的な配列
は、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６として示される。

【００１９】 別の局面において、本発明は、調節配列を含むＨＥＲ２プロモーターに作動可
能に連結された遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付けられるＨＥＲ２プ
ロモーターの調節領域を含む単離された核酸配列を提供する。例示的な配列は、
配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２として示される。

【００２０】 本発明はさらに、調節配列を含むβ−ラクタマーゼ（Ｂｌａ）プロモーターに
作動可能に連結された遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付けられるアン
ドロゲンレセプターＢｌａプロモーターの調節領域を含む単離された核酸配列を
提供する。例示的な配列は、配列番号７７または配列番号７８として示される。

【００２１】 関連した局面において、本発明は、以下のいずれか１つのプロモーター調節核
酸配列を含むベクターを提供する：上記のようなサイクリンＤ１プロモーター、
ＣＤ４０Ｌプロモーター、３つのＨＢＶプロモター（コア、ｐｒｅ−Ｓ１および
ＨＢＶ−Ｘ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）プロモーター、アンドロゲ
ンレセプタープロモーター、Ｈｅｒ２プロモーター、およびβ−ラクタマーゼプ
ロモーター。

【００２２】 ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されるプロモーター調節配列、お
よびベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列；ならびに
遺伝子産物をコードする導入遺伝子（例えば、レポーター遺伝子）を含む発現ベ
クターであり得る。

【００２３】 このようなベクターを含む宿主細胞（例えば、原核生物細胞、真核生物細胞、
または哺乳動物細胞）もまた、本発明によって提供される。このようなベクター
で形質転換された宿主細胞は、例えば、プロモーター調節配列と相互作用する細
胞性因子またはＤＮＡ結合化合物に細胞を曝露することによって、導入遺伝子の
発現を調節するためおよびその発現を検出するための方法において使用され得る
。

【００２４】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．定義） 本明細書中において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、代表的
なポリヌクレオチドに水素結合し得る塩基を支持する骨格を有するポリマー分子
であって、ここで、このポリマーの骨格は、このような水素結合を、このポリマ
ー分子と代表的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡ）との間で配列特異
的な形式で可能にする様式で、これらの塩基を提示する、ポリマー分子をいう。
このような塩基は、代表的に、アデノシン、グアノシン、シトシン、チミジン、
ウラシルおよびイノシンである。ポリマー分子としては、二本鎖および一本鎖の
リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が挙げられ、そしてメチ
ルホスホン酸結合のような骨格改変を有するポリマーを含み得る。

【００２５】 本明細書中において使用される場合、核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る
か、あるいは二本鎖配列と一本鎖配列との両方の部分を含み得る。一本鎖という
表現はまた、他方の鎖の配列を定義し、従ってまた、この配列の相補体を含む。

【００２６】 本明細書中において使用される場合、用語「組換え核酸」とは、天然には通常
見出されない形態での核酸の操作によって、一般的にもともとインビトロで形成
された核酸をいう。

【００２７】 「異種核酸構築物」は、この核酸が発現される細胞に対してネイティブではな
い配列部分を有する。制御配列／コード配列の組み合わせに関して、異種とは、
天然には一緒には見出されない、制御配列（すなわち、プロモーターまたはエン
ハンサー）とコード配列または遺伝子との組み合わせをいう。換言すれば、この
プロモーターは、同じ遺伝子の発現を、異種核酸構築物中および天然で調節しな
い。一般に、異種核酸配列は、その細胞に対して内因性でも、これらの配列が存
在するゲノムの一部でもなく、そしてトランスフェクション、マイクロインジェ
クション、エレクトロポレーションなどによって、細胞に添加されている。この
ような異種核酸構築物はまた、本明細書中において、「発現カセット」と称され
得る。

【００２８】 本明細書中において使用される場合、用語「配列同一性」とは、配列アライメ
ントプログラムを使用して整列された場合の、２つ以上の配列間での核酸配列ま
たはアミノ酸配列の同一性を意味する。ＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｓおよび他の公共のデータベースにおける核酸配列に対する所定の核酸配列
の％同一性を評価する場合には、配列の検索は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＮプロ
グラムを使用して実施される。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公共のデータベースにおけるアミ
ノ酸配列に対する全てのリーディングフレームに翻訳された核酸配列を検索する
ために好ましい。ＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＸとの両方は、１１．０のオープン
ギャップペナルティーおよび１．０伸長ギャップペナルティーのデフォルトパラ
メータを使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ−６２行列を利用して、実施される［Ａｌ
ｔｓｃｈｕｌら、１９９７を参照のこと］。

【００２９】 用語「％相同性」は、本明細書中において「％同一性」と互換可能に使用され
、そして２つの配列間の同一性のレベルをいう。すなわち、７０％相同性とは、
規定されたアルゴリズムによって決定される場合に７０％の配列同一性と同じこ
とを意味し、従って、所定の配列のホモログは、この所定の配列の長さにわたっ
て、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは約８５％、なお
より好ましくは約９０％の配列同一性を有する。

【００３０】 ２つ以上の配列間の「％同一性」を決定するための、選択された配列の好まし
い整列は、デフォルトパラメータ（１０．０のオープンギャップペナルティー、
０．１の伸長ギャップペナルティー、およびＢＬＯＳＵＭ ３０類似性行列を含
む）で作動されるＭａｃＶｅｃｔｏｒ第６．５版におけるＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプ
ログラムを使用して、実施される。

【００３１】 核酸配列は、この核酸配列と参照配列とが、中程度〜高度にストリンジェント
なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下で互いに特異的にハイブリダイズ
する場合に、参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ」するよう構築される。
例示的な条件としては、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ ＺｅｔａＰｒｏｂｅマニュ
アル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に記載されるよう
なハイブリダイゼーション条件が挙げられる。例えば、ハイブリダイゼーション
は、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４および７％ＳＤＳ中におい
て６０℃で実施され、続いて１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＰＯ_４、５％Ｓ
ＤＳ、および１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１％ＳＤＳ中において
洗浄される。ハイブリダイゼーション条件は、さらに、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭら
、１９９３に記載されている。

【００３２】 本明細書中において使用される場合、用語「ベクター」とは、異なる宿主細胞
間での移送のために設計された、核酸構築物をいう。「発現ベクター」とは、異
種ＤＮＡフラグメントを、外来細胞において組み込み、そして発現する能力を有
するベクターをいう。多くの原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクター
が、市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内であ
る。

【００３３】 本明細書中において使用される場合、用語「プラスミド」とは、ベクターとし
て使用され、そして多くの細菌およびいくらかの真核生物において、染色体外自
己複製遺伝エレメントを形成する、環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物をいう。

【００３４】 本明細書中において使用される場合、用語「遺伝子」とは、ポリペプチドの産
生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、これは、コード領域に先行する領域
および後続する領域を、含んでも含まなくてもよい。例えば、５’非翻訳（５’
ＵＴＲ）配列または「リーダー」配列および３’ＵＴＲ配列または「トレーラー
」配列、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロ
ン）は、遺伝子と示されるＤＮＡセグメントに含まれても含まれなくてもよい。

【００３５】 本明細書中において使用される場合、用語「導入遺伝子」とは、異種核酸構築
物、発現カセットまたはベクターの、ポリペプチドに対するコード配列を含む部
分をいい、ここで、この遺伝子は、他の成分（すなわち、天然には通常は会合し
ないプロモーター）と会合している。

【００３６】 本明細書中において使用される場合、用語「ＤＮＡ応答エレメント」は、用語
「調節プロモーター配列」と互換可能に使用され得、そして化合物結合配列と同
じであり得るか、重なり得るか、または隣接し得る、転写調節タンパク質に対す
るＤＮＡ結合部位または配列をいう。

【００３７】 本明細書中において使用される場合、用語「化合物結合配列」、「化合物結合
部位」、「リガンド結合配列」、および「リガンド結合部位」は、互換可能に使
用され、そして化合物、リガンド、または分子が相互作用してそのＤＮＡ結合部
位（またはＤＮＡ応答エレメント）に対する転写調節タンパク質の改変された結
合を生じる、ＤＮＡ配列の部分をいう。いくつかの場合において、この化合物、
リガンド、または分子はまた、化合物または誘発因子と指定され得る。「化合物
結合配列」またはその等価物は、転写調節タンパク質のためのＤＮＡ応答エレメ
ントの近隣に存在し、そして転写調節タンパク質のためのＤＮＡ結合部位に隣接
（ａｄｊａｃｅｎｔ）（すなわち、隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ））し得るか、重な
り得るか、またはこの部位と同じであり得る。

【００３８】 本明細書中において使用される場合、用語「プロモーター」とは、ＤＮＡに作
動可能に連結する遺伝子の転写を指向するよう機能する、ＤＮＡの配列をいう。
プロモーターは、所定の遺伝子産物の発現に関与する制御配列（「転写調節配列
および翻訳調節配列」ともまた称される）を含んでも含まなくてもよい。一般に
、転写調節配列および翻訳調節配列としては、プロモーター配列（転写調節タン
パク質のためのＤＮＡ応答エレメントを含む）、リボソーム結合部位、転写開始
配列および転写終止配列、翻訳開始配列および翻訳終止配列、ならびにエンハン
サー配列またはアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。プ
ロモーターは、それが見出される細胞に対して天然であっても非天然であっても
よい。

【００３９】 本明細書中において使用される場合、用語「調節可能（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌ
ｅ）プロモーター」、「誘導（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プロモーター」および「切
替可能（ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ）プロモーター」は、互換可能に使用され、そし
てシス作用因子またはトランス作用因子によって活性が影響を受ける、任意のプ
ロモーターをいう。

【００４０】 真核生物遺伝子制御領域は、プロモーターおよび調節ＤＮＡ配列（この配列に
、転写調節タンパク質が結合する）からなる。本明細書中において使用される場
合、用語「調節プロモーター配列」とは、一般に、遺伝子の制御領域内の配列で
あって、この配列に転写調節タンパク質が結合し、転写の活性化または抑制を生
じる、配列をいう。このような調節プロモーター配列のネイティブな形態は、一
般に、遺伝子制御領域のプロモーターエレメントに対して５’側に位置する。

【００４１】 本明細書中において使用される場合、用語「転写調節タンパク質」、「転写調
節因子」および「転写因子」は、用語「ＤＮＡ結合タンパク質」と互換可能に使
用され得、そしてＤＮＡ応答エレメントに結合し、これによって会合した遺伝子
の発現を転写的に調節する、細胞質タンパク質または核タンパク質をいう。転写
調節タンパク質は、一般に、ＤＮＡ応答エレメントに直接結合するが、いくつか
の場合においては、ＤＮＡへの結合は、別のタンパク質への結合によって間接的
であり得、このタンパク質が次に、ＤＮＡ応答エレメントに結合するか、または
ＤＮＡ応答エレメントに結合される。

【００４２】 本明細書中において使用される場合、用語「作動可能に連結される」とは、組
換えＤＮＡ構築物またはベクターに関して、組換えＤＮＡ構築物またはベクター
のヌクレオチド成分が、この組換えＤＮＡ構築物またはベクターの別のヌクレオ
チド成分と機能的関係にあることを意味する。例えば、プロモーターまたはエン
ハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合には、そのコード配列
に作動可能に連結されている；あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を容
易にするよう位置する場合には、コード配列に作動可能に連結されている。一般
に、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接していること
、および二次リーダーの場合には、隣接しておりかつ読み取り段階にあることを
意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。

【００４３】 本明細書中において使用される場合、用語「発現」とは、所定のＤＮＡ配列に
含まれる情報に基づいてポリペプチドが産生されるプロセスをいう。このプロセ
スは、転写と翻訳との両方を含む。

【００４４】 本明細書中において使用される場合、用語「調節された発現」とは、所定の遺
伝子産物の量の増加または減少を代表し得る、転写および翻訳の変化をいう。

【００４５】 宿主細胞は、外因性または異種のＤＮＡがこの宿主細胞に導入された場合に、
このＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換は、その細胞の染色体Ｄ
ＮＡへの組み込み（共有結合的な取り込み）を生じても生じなくてもよい。例え
ば、酵母細胞または哺乳動物細胞のような真核生物細胞においては、形質転換さ
れたＤＮＡは、プラスミドのようなエピソームエレメントに維持され得る。

【００４６】 本明細書中において使用される場合、用語「安定に形質転換された」、「安定
にトランスフェクトされた」、および「トランスジェニック」とは、天然ではな
い（異種の）核酸配列がゲノムに組み込まれた細胞をいう。安定な形質転換は、
トランスフェクトするＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローン
の樹立によって、実証される。

【００４７】 いくつかの場合において、「形質転換」は、安定ではない。すなわち、一時的
である。一時的な形質転換の場合には、外因性または異種のＤＮＡは、発現され
るが、導入された配列がゲノムに組み込まれない。

【００４８】 本明細書中において使用される場合、用語「同時形質転換された」とは、２つ
以上の組換えＤＮＡ構築物またはベクターが、同一の細胞に導入されるプロセス
をいう。「同時形質転換された」とはまた、２つ以上の組換えＤＮＡ構築物また
はベクターが導入された細胞をいい得る。

【００４９】 本明細書中において使用される場合、用語「配列優先的結合」とは、他のもの
と比較して特定のＤＮＡ配列への結合に対する優先を示す様式での、ＤＮＡへの
分子の結合をいう。

【００５０】 本明細書中において使用される場合、用語「配列特異的結合」とは、特定のＤ
ＮＡ配列に対する強い結合優先を示す様式での、ＤＮＡへの分子の結合をいう。

【００５１】 本明細書中において使用される場合、用語「配列依存性結合」とは、標的ヌク
レオチド配列に依存する様式での、ＤＮＡへの分子の結合をいう。このような結
合は、「配列優先的」または「配列特異的」であり得る。

【００５２】 本明細書中で使用する場合、用語「結合を阻害する」とは、転写調節タンパク
質のそのＤＮＡ応答エレメントへの結合に対する所定の濃度の特定の化合物の効
果に関して、同じ濃度の特定の化合物の非存在下における結合の量と比較した、
転写調節タンパク質のそのＤＮＡ応答エレメントへの結合の量の減少をいい、そ
して結合の減少および結合の完全な阻害の両方を含む。

【００５３】 本明細書中で使用する場合、用語「化合物」、「分子」、「リガンド」および
「誘発因子」は、交換可能に使用され、そして転写調節タンパク質のＤＮＡ結合
部位に近接（すなわち、隣接）するか、またはこれと重複するか、またはこれと
同じである配列のＤＮＡに対する配列優先的結合または配列特異的結合によって
特徴付けられる分子またはリガンドをいう。

【００５４】 本明細書中で使用する場合、用語「調節する」および「改変する」は、交換可
能に使用され、そして生物学的活性の変化をいう。調節とは、生物学的活性、結
合特性、または分子の任意の他の生物学的特性、機能的特性もしくは免疫学的特
性の増加または減少をいう。

【００５５】 本明細書中で使用する場合、用語「遺伝子発現を調節する」とは、本発明のプ
ロモーターに関して、プロモーターが、このプロモーターに作動可能に連結され
た遺伝子の発現を増加または減少する能力を有し、そしてこの遺伝子の発現レベ
ルを調節するために使用され得ることを意味する。

【００５６】 本明細書中で使用する場合、用語「ネイティブ」、「天然の」および「野生型
」とは、特定の核酸配列、特性または表現型に関して、この核酸配列、特性また
は表現型が天然で見出される形態をいう。

【００５７】 本明細書中で使用する場合、用語「上記細胞の暴露」とは、本発明の調節プロ
モーター配列を含む細胞と相互作用し得る細胞因子または化合物に関して、外部
暴露および内部暴露の両方をいう。細胞因子への暴露の場合、この因子は、ネイ
ティブ（内因性）であるか、または外因的に提供され得る。

【００５８】 （ＩＩ．本発明のプロモーターを使用する調節された遺伝子発現） 本発明のプロモーターエレメントは、遺伝子（ネイティブおよび異種の両方）
の調節された発現における有用性を見出す。

【００５９】 このような調節された遺伝子発現を達成するために、目的のプロモーターの調
節成分が、同定および特徴付けされるべきである。

【００６０】 これは、遺伝子転写の制御に関与するプロモーター成分の配列を同定および特
徴付けすること、ならびにこのプロモーターを使用して、このような構造的（配
列）成分を遺伝子発現の機能的分析と関連付けることの組み合わせによって、達
成される。

【００６１】 一般に、特定のＤＮＡ配列が遺伝子発現の調節に関与するか否かを決定するた
めに、推定調節配列が選択され、そして異種核酸構築物中のレポーター配列に作
動可能に連結され、これは次いで、細胞に導入され、次いでレポーターの活性が
決定される。例えば、ルシフェラーゼ（基質のルシフェリンおよびＡＴＰの存在
下で光子を放射する、本来ホタルから単離される遺伝子）の発現を、ルミノメー
ターを使用して容易にモニタリングし得る。

【００６２】 このように調節された遺伝子発現の１つの適用において、転写調節タンパク質
に対するＤＮＡ応答エレメントの付近に位置する化合物結合配列は、プロモータ
ー構築物に組み込まれ、そして所定のプロモーターの制御下で遺伝子の発現を調
節するために使用される。この化合物結合配列は、ネイティブであるかまたは導
入され得る。

【００６３】 別の例示的な実施形態において、転写調節タンパク質に対するＤＮＡ応答エレ
メントの付近（すなわち、これに直接的であるか、隣接しているか、または重複
している）の化合物の結合は、このＤＮＡ応答エレメントに作動可能に連結した
ネイティブの遺伝子の転写を調節するための手提供する。

【００６４】 プロモーターの調節領域を同定および特徴付けすること、ならびにこの情報を
使用して、所定の転写調節タンパク質に対するＤＮＡ応答エレメントの付近に１
つ以上の化合物結合配列を有する構築物を設計することにより、細胞におけるネ
イティブの遺伝子の発現をインビボで調節するための手段が提供される。このよ
うな場合、この化合物を細胞に提供すること、およびプロモーターの調節領域内
の化合物結合配列にこの化合物を結合することにより、このプロモーターの制御
下におけるネイティブの遺伝子の発現が調節される。

【００６５】 別の代表的な実施形態において、転写調節タンパク質に対するＤＮＡ応答エレ
メントの付近（すなわち、これに直接的であるか、隣接しているか、または重複
している）における化合物の結合は、このエレメントに作動可能に連結した導入
遺伝子の転写を調節するための手段を提供する。転写調節タンパク質のそのＤＮ
Ａ応答エレメントに対する結合を調節する任意のＤＮＡ結合化合物は、本発明に
基づくプロモーターの制御下において、導入遺伝子の発現を調節するために利用
され得る。転写調節タンパク質に対するＤＮＡ応答エレメントの付近におけるネ
イティブの化合物結合配列または導入された化合物結合配列の存在により、プロ
モーター（ここでこのプロモーターは、ＤＮＡ応答エレメントを含む）に作動可
能に連結された遺伝子の発現を調節するのに有効な化合物の広範な選択が可能と
なる。

【００６６】 本発明のプロモーターが最小プロモーターエレメントおよび導入されたＤＮＡ
応答エレメントを含み得るか、またはこのプロモーター自体が、ＤＮＡ応答エレ
メントを含み得ることが理解される。一般的に、ＤＮＡ応答エレメントまたは調
節プロモーター配列とは、転写調節タンパク質が結合する配列をいい、そしてプ
ロモーターの一部とみなされてもみなされなくてもよい。

【００６７】 いくつかの場合において、ＤＮＡ応答エレメント付近の核酸配列は、ＤＮＡ結
合化合物に好ましいかまたは特異的な結合部位である配列を含む。

【００６８】 別の場合において、このＤＮＡ応答エレメント付近のプロモーター配列は、Ｄ
ＮＡ結合化合物に好ましい１つ以上の結合配列を含み、その結果、調節可能なプ
ロモーター構築物を生成するように改変される。

【００６９】 例えば、このプロモーターは、ＤＮＡ応答エレメントの付近に１つ以上の化合
物結合配列を含み得、これはネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）ダイマー、「
２１ｘ」に好ましい結合配列である８〜２０ｂｐまたはそれ以上の「ＡＴリッチ
」配列により例示される。

【００７０】 転写調節タンパク質／ＤＮＡ応答エレメント／化合物結合配列と、この化合物
結合配列に優先的または特異的に結合する化合物との組み合わせは、本明細書中
に記載されるプロモーターのいずれかの制御下で導入遺伝子の発現を調節するた
めに有用であり得る。しかし、いくつかの場合において、この転写調節タンパク
質／ＤＮＡ応答エレメント／化合物結合配列の組み合わせ、およびこの化合物結
合配列に優先的または特異的に結合する化合物は、所定のプロモーターに対して
特異的である。

【００７１】 特定のプロモーターの制御下における導入遺伝子の発現を調節する際に使用す
るための化合物は、一般に、所定のプロモーターの制御下における導入遺伝子の
発現を調節する能力に基づいて、予め選択される。

【００７２】 代表的な予備スクリーニングアッセイとしては、ＤＮＡ結合アッセイ；タンパ
ク質置換アッセイ；ＤＮＡフットプリンティングなどが挙げられるが、これらに
限定されない。本明細書中に記載されるように、このようなアッセイは、当該分
野で公知の様々な技術を使用して実施され得る。

【００７３】 一実施形態において、遺伝子の発現を調節する際に使用するための化合物は、
ＤＮＡ結合および転写調節タンパク質置換について予め選択される。代表的な予
備スクリーニングアッセイとしては、様々な形態のＭｅｒｌｉｎ^ＴＭアッセイ（
例えば、共有に係る米国特許第５，３０６，６１９号、同第５，６９３，４６３
号、同第５，７１６，７８０号、同第５，７２６，０１４号、同第５，７４４，
１３１号、同第５，７３８，９９０号、同第５，５７８，４４４号、同第５，８
６９，２４１号（本明細書中で参考として明確に援用される））が挙げられる。

【００７４】 別の実施形態において、化合物は、核酸リガンド相互作用アッセイ（例えば、
ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／１５８４８に記載されるアッセイ）、または当業者に
公知の別の核酸結合アッセイで予め選択される。

【００７５】 （ＩＩＩ．プロモーターの単離および特徴付け） 本明細書中で記載されるプロモーターを、当該分野で一般に公知の方法（既知
の遺伝子のコード配列から上流をウオーキングして調節配列を同定すること、リ
ンカースキャナー変異により以前に同定されたプロモーター配列を分析および特
徴付けすること、ならびに部位特異的突然変異が挙げられるが、これらに限定さ
れない）を使用して単離および特徴付けした。

【００７６】 いくつかの場合において、プロモーター配列は、既知のコード配列または他の
配列に基づいて設計されたプライマーを使用して、ＰＣＲアクセス可能ゲノムラ
イブラリー（例えば、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈを使用する
）において上流をウオーキングすることによって、得られる。続く上流のウオー
キングを使用して、調節配列を同定するために、５’末端で伸長したより長いＤ
ＮＡ配列を生成する。第１のウオーキングから得られた配列を使用して、第２の
上流ウオーキングなどのためのプライマーを設計する。

【００７７】 他の場合において、本明細書中で記載される調節配列に対する特定のプロモー
ターの全配列は、当該分野で公知であった。しかし、このような場合において、
このプロモーターの特徴付けは、本発明以前には知られていなかった。言い換え
ると、本発明は、プロモーター活性に対して重要な配列の同定および特徴付けを
示す。

【００７８】 いくつかの場合において、プロモーター配列の１つ以上の領域に変異を導入し
、この変異したプロモーターの活性プロフィールを評価することによって、一連
のプロモーターを構築した。

【００７９】 （ＩＶ．プロモーター活性のスクリーニング） プロモーター活性を評価するための代表的なアッセイとしては、プロモーター
のＤＮＡ応答エレメントに対する転写調節タンパク質の結合の検出のために有用
なＤＮＡ結合アッセイ；タンパク質置換アッセイ（例えば、ゲル移動度シフトア
ッセイ競合結合アッセイおよびＤＮＡフットプリンティング）などが挙げられる
が、これらに限定されない。このようなアッセイは、当該分野で公知の様々な技
術を使用して実施され得る。

【００８０】 ゲル移動度シフトアッセイを使用して、ＤＮＡのみと比較したＤＮＡ／タンパ
ク質複合体のサイズの変化（および対応するゲル上の移動度）に基づいて、所定
のプロモーター内のＤＮＡ応答エレメントに対する転写調節タンパク質の結合に
対する化合物の効果を決定し得る。

【００８１】 ＤＮＡフットプリンティングを使用して、ヌクレアーゼ分解に対するプロモー
ター／転写調節タンパク質複合体の安定性に基づいて、転写調節タンパク質に対
する所定のプロモーターのＤＮＡ応答エレメントを特徴付けし得る。このアプロ
ーチの主な用途は、ＤＮＡフットプリンティング（特定の転写調節タンパク質が
結合するＤＮＡ配列を同定するために使用される方法）のためであった。ＤＮＡ
フットプリンティングのための様々な技術が、当該分野で公知である。

【００８２】 （競合ハイブリダイゼーション−安定化結合アッセイ（ＨＳＡ）） 本発明のプロモーターにおける重要な配列に対する化合物の優先的な結合は、
競合ハイブリダイゼーション−安定化結合アッセイ（ＨＳＡ）を使用して試験さ
れている。ＨＳＡにおいて、目的のヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド二
重鎖で表され、そしてこの二重鎖は、特定の程度の親和性で試験化合物に結合す
ることが知られているインジケーターオリゴヌクレオチド二重鎖と競合するその
能力について試験される。このインジケーターは、ＡＴ塩基中に豊富に存在し得
、そして蛍光プローブまたはクエンチャー部分のいずれかで、この２の鎖の各々
が標識され得る。化合物がこのインジケーターに結合することによって、二重鎖
の形成が安定化され、蛍光がクエンチされ得る。この化合物が、インジケーター
より試験配列（コンペティター）に好ましい場合、この化合物はこのインジケー
ター二重鎖を安定化するためにそれほど有効ではなく、従って、クエンチは減少
される。従って、より大きな蛍光シグナルは、インジケーターと比較して試験化
合物に対して優先的なより高い程度の結合を意味する。

【００８３】 サイクリンＤ１プロモーターに関連する１つの実施形態において、ハイブリダ
イゼーション安定化アッセイは、結合のための指示薬として１２ｂｐのＤＮＡ二
重鎖を使用し、ここで、この二重鎖の一方の鎖（ＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴ）を
フルオレセインで５’標識し、そしてその相補鎖を、ダブシルクエンチング分子
（ＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＧ−３’）で５’標識する。この二本鎖を、ＤＮＡ結
合分子（このＤＮＡ結合分子は、二重鎖形態を安定化させ得る）と共に混合する
場合、このフルオレセイン由来のシグナルは、この相補鎖上のダブシルによって
クエンチされる。次いで、種々の冷却した競合二重鎖を、この二重鎖がＤＮＡ結
合化合物に対して好ましい結合部位を提供するかどうかを調べるために添加し得
る。この競合ＤＮＡが、ＤＮＡ結合分子と結合する場合、このＤＮＡ結合分子は
、指示薬二重鎖とは別個に滴定され、この指示薬二重鎖を不安定化し、そしてこ
の鎖が分離する場合、クエンチングが減り、蛍光が増大する。 （プロモーターウォーク（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｗａｌｋ）分析） 代表的に、完全なプロモーター配列は、ＨＳＡ中の競合物として１５個のヌク
レオチドのブロック中に存在する。全プロモーターをカバーするために、１５マ
ーのストレッチは、オーバーラップ様式でブロックされ、その結果、隣接するブ
ロックは、２個のヌクレオチドで異なる。ＨＳＡ中のフルオレセインの増加は、
結合し易さを意味する。 （ＲＮａｓｅ保護） ＲＮＡ転写における改変されたＤＮＡ配列の効果は、ｍＲＮＡレベルをモニタ
ーするために、ＲＮａｓｅ保護またはノーザン分析のいずれかを含む、アッセイ
を直接的に使用して、測定し得る。ＲＮａｓｅ保護は、標識したプローブを用い
てヌクレアーゼ耐性ハイブリットを形成する能力に基づいてＲＮＡをクエンチン
グする方法である。ＲＮＡがより多いほど、より多くのプローブが保護される。
このプローブの一部のみが、目的のＲＮＡにハイブリダイズする場合（すなわち
、このプローブが、目的のＲＮＡに対して相同性でない５’領域または３’領域
を有する場合）、このプローブの一部のみが、保護される。保護されたプローブ
およびインタクトなプローブは、ゲル電気泳動に供される場合、異なる速度で移
動する。独特なサイズおよび予測可能なサイズのフラグメントの保護は、特異性
を示す。このプローブは、ＲＮＡプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかであ
り得る。 （リンカースキャニング変異誘発） リンカースキャニング変異誘発は、ＤＮＡの短い配列（すなわち、公知のプロ
モーターに対する５’配列）が、通常、ＰＣＲに基づく変異誘発アプローチを使
用して、１以上の制限部位を含むＤＮＡで置換される手順である。 （レセプター構築物） レセプター構築物は、プロモーター活性およびプロモーターによる調節された
トランスジーンの発現を確認するために、一般に、細胞に基づくインビトロアッ
セイにおいて使用される。

【００８４】 １実施形態において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、インビトロにおい
て、細胞培養中での調節可能な遺伝子発現を評価するために使用される。しかし
、当業者に公知の任意のレセプター遺伝子もまた使用される。選択されたレポー
ター遺伝子の発現は、複数の改変された調節配列を迅速に評価するために、容易
に検出され、かつ定量されることが好ましい。このようなレポーター構築物は、
所定のプロモーターによって（例えば、ＤＮＡ結合化合物で標的することによっ
て）、遺伝子発現を調節する能力を評価するための手段を提供する。一旦、遺伝
子発現を調節するための所定のプロモーターの能力が、レポーター構築物を使用
する細胞に基づくアッセイにおいて示された場合、この遺伝子構築物は、レポー
ター遺伝子の代わりに、目的のトランスジーン（例えば、治療用遺伝子、組換え
タンパク質コード遺伝子または薬物耐性遺伝子）を含むように、容易に改変され
得る。このような改変は、当業者によって慣用的に使用される技術を使用して達
成され得る。 （Ｖ．サイクリンＤ１プロモーター） サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）は、多くの癌において過剰に発現される調節タ
ンパク質である。サイクリンＤ１は、このサイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４お
よびＣＤＫ６に結合し、そしてこれらを調節することによって作用する。ＣＣＮ
Ｄ１遺伝子の発現は、静止細胞（Ｇ_０）中で低いが、細胞が増殖因子に対して応
答し、細胞周期に入る場合に、活性なサイクリンＤ１−ＣＤＫ４／ＣＤＫ６複合
体の増加を誘導する。

【００８５】 適切な増殖シグナルとは無関係で、増殖阻害シグナル（例えば、接触阻害シグ
ナル）に対して応答しない、迅速な細胞周期は、癌細胞の特徴である。染色体の
逆位、転座または増幅中のサイクリンＤ１の不適切な発現は、種々の腫瘍細胞に
おいて特徴付けられている（Ｈａｌｌら、１９９６；Ｓｈｅｒｒ、１９９６）。
サイクリンＤ１遺伝子の過剰発現はまた、サイクリンＤ１遺伝子全体の染色体再
配列または増幅なしで、多くの腫瘍において見られる。実際に、サイクリンＤ１
の過剰発現は、原発性乳癌の５０％、大腸細胞の腺癌の３０％（Ｈａｌｌら、１
９９６）、家族性腺腫様ポリープ症（Ｚｈａｎｇら、１９９７）、ならびに多く
の場合の脾臓癌（Ｇａｎｓａｕｇｅら、１９９７）において見られる。

【００８６】 さらに、哺乳動物の上皮において、サイクリンＤ１遺伝子を発現するトランス
ジェニックマウスは、乳房過形成を示し、そして乳房腺癌を発生する（Ｗａｎｇ
ら、１９９４）。培養細胞中のサイクリンＤ１の過剰発現は、ｐＲＢ網膜芽細胞
腫タンパク質の早期リン酸化反応において生じ（Ｓｈｅｒｒ、１９９３）、Ｇ１
期を短くし、これらの細胞増殖因子と無関係にする（Ｊｉａｎｇら、１９９３；
Ｑｕｅｌｌｅら、１９９３；Ｒｅｓｎｉｔｚｋｙら、１９９４）。ヌードマウス
に注射した場合、これらの細胞は腫瘍を産生する（Ｊｉａｎｇら、１９９３）。

【００８７】 サイクリンＤ１の不適切な発現と腫瘍形成との間の関係は、サイクリンＤ１が
治療介在のための良好な標的であることを示す。サイクリンＤ１アンチセンス分
子は、培地中でサイクリンＤ１を過剰発現するヒトの食道、結腸および膵臓の癌
細胞の腫瘍性表現型、ならびにマウスにおけるこれらの細胞の腫瘍を産生する能
力を減少させることが示されている（Ｚｈｏｕら、１９９５；Ａｒｂｅｒら、１
９９７；Ｋｏｒｎｍａｎｎら、１９９８）。これらの研究において、アンチセン
ス技術を、サイクリンＤ１ ｍＲＮＡを特異的に阻害するために使用した。

【００８８】 従って、サイクリンＤ１の調節された発現は、癌および他の治療における有用
性を見出す。本発明は、サイクリンＤ１プロモーターの制御下にある場合、遺伝
子発現の調節に関与する、サイクリンＤ１プロモーター内のＤＮＡ応答性エレメ
ントの、ＣＣＮＤ１プロモーター分析および同定に基づく。

【００８９】 ヒトＣＣＮＤ１遺伝子は、以前に、クローニングされ、そして配列決定されて
いる（Ｍｏｔｏｋｕｒａら、１９９１；Ｗｉｔｈｅｒｓら、１９９１；Ｘｉｏｎ
ｇら、１９９１）。ＣＣＮＤ１遺伝子の上流プロモーター配列はまた、クローニ
ングされ、そして配列決定さている（Ｈｅｒｂｅｒら、１９９４ａ、１９９４ｂ
；Ｐｈｉｌｉｐｐら、１９９４）。ＣＣＮＤ１プロモーター配列は、ＧｅｎＢａ
ｎｋのＬｏｃｕｓ ＨＵＭＰＲＤＡ１Ａ（Ｍｏｔｏｋｕｒａら、１９９３）にお
いて見出され得る。

【００９０】 潜在的なＳｐ１部位、Ｅ２Ｆ部位、ＣＲＥ部位、Ｏｃｔ１部位、Ｍｙｃ／Ｍａ
ｘ部位、ＡＰ−１部位、Ｅｇｒ部位、ＮＦκＢ部位、ＳＴＡＴ５部位、Ｅｔｓ部
位、ＰＲＡＤおよびＴＣＦ／ＬＥＦ部位は、以前に、サイクリンＤ１プロモータ
ーにおいて同定されている（Ｍｏｔｏｋｕｒａら、１９９３；Ｈｅｒｂｅｒら、
１９９４；Ｐｈｉｌｉｐｐら、１９９４；Ｈｉｎｚら、１９９９；Ｍａｔｓｕｍ
ｕｒａら、１９９９；Ｓｈｔｕｔｍａｎら、１９９９；およびＴｅｔｓｕら、１
９９９）。これらの部位のいくつかは、種々の細胞株において、サイクリンＤ１
調節の役割を果たすことが示されている（Ｐｈｉｌｉｐｐら、１９９４；Ａｌｂ
ａｎｅｓｅら、１９９５；Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９６；Ｙａｎら、１９９７
；Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９８；Ｂｅｉｅｒら、１９９９；Ｈｉｎｚら、１９
９９；Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、１９９９；Ｓｈｔｕｔｍａｎら、１９９９；およ
びＴｅｔｓｕら、１９９９）。

【００９１】 ＣＣＮＤ１プロモーターのＣＲＥ領域（ヌクレオチド−５２〜−４５）は、以
前に、種々の細胞型においてサイクリンＤ１発現に重要であるとして同定されて
いる（Ｂｅｉｅｒら、１９９９；Ｔｅｔｓｕら、１９９９；Ｐｈｉｌｌｉｐら、
１９９４；Ｌｅｅら、１９９９）。特に、ＣＲＥプロモーターエレメントは、Ｍ
ＣＦ７細胞においてサイクリンＤ１遺伝子の基本的な発現に必要とされることが
示されている。

【００９２】 先行技術は、サイクリンＤ１プロモーターのいくらかの分析を含むが、この先
行技術は、サイクリンＤ１プロモーターを使用する調節された遺伝子発現のため
の適切な標的を示さない。本発明の１局面は、調節のための標的として同定され
た特定の配列に基づいて、遺伝子を過剰発現する癌細胞におけるサイクリンＤ１
発現を調節することに関する。

【００９３】 サイクリンＤ１プロモーターの転写因子結合部位の分析を、サイクリンＤ１プ
ロモーターに作動可能に連結する遺伝子の発現を調節するために使用され得る、
サイクリンＤ１プロモーターの一部を同定するために実施した。広範なプロモー
ター分析を、サイクリンＤ１を過剰発現する種々の異なる癌細胞株において実施
し、そして重要な転写因子結合部位を、実施例１に詳述されるように同定した。

【００９４】 ヒトのサイクリンＤ１プロモーターの１９００ｂｐフラグメントを、遺伝子Ｄ
ＮＡから増幅し、そしてベクターｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサ
ブクローニングし、レセプター構築物を形成した。一連の改変されたプロモータ
ーを作製し、そしてプロモーター活性を、全長（−１７４５）サイクリンＤ１プ
ロモーター（図４）の活性と比較し、続いて、このプロモーターの重要な制御領
域を同定するために、サイクリンＤ１を過剰発現する非同期型ＭＣＦ７ヒト乳癌
細胞にトランスフェクトした。いくつかの構築物を、別のサイクリンＤ１を過剰
発現する乳癌細胞株（ＺＲ７５）；正常なサイクリンＤ１を過剰発現する乳癌細
胞株（ＨＭＥＣ）；サイクリンＤ１過剰発現する結腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）
；および過剰発現する膵臓癌細胞株（ＰＡＮＣ−１）においてさらに評価した。

【００９５】 種々の改変されたプロモーター構築物は、５’欠失、ＡＰ１部位、ＣＲＥ部位
、Ｅ２Ｆ部位、ＳＰ１部位およびＯｃｔ１部位の部位特異的変異誘発を含み、そ
して近位プロモーターのリンカースキャニング変異誘発を使用して調製される変
異体は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ変異誘発系を使用して産生される。

【００９６】 本明細書中において提供される結果は、配列番号５、配列番号６、配列番号８
および配列番号９として示される調節配列が、調節配列の１以上を含むサイクリ
ンＤ１プロモーターに作動可能に連結する、自己遺伝子または異種遺伝子の発現
の調節における有用性を見出すことを示す。 （ＶＩ．ＣＤ４０ リガンド（ＣＤ４０Ｌ）） ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ４０Ｌ（これはまた、ｇｐ３９、ＣＤ１５４、Ｔ
ＲＡＰまたはＴ−ＢＡＭと呼ばれる）は、Ｔ細胞依存性体液性免疫応答において
重要な役割を果たす。ＣＤ４０Ｌは、抗原提示細胞の表面上で発現される、ＣＤ
４０と相互作用する（ＡＰＣ：Ｏｃｈｓら、１９９４；Ｆｏｙら、１９９６；Ｇ
ｒｅｗａｌら、１９９６）。抗原提示細胞は、抗原を処理し、そして主要組織適
合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と組み合わさり、その細胞表面上に抗原を提示す
る。これは、Ｔ細胞の活性化およびＴ細胞レセプターによる抗ＭＨＣ複合体の認
識に必要な１つのシグナルを提供し、これは、活性化されたＣＤ４＋ヘルパーＴ
細胞上の膜結合サイトカインＣＤ４０Ｌの一過性発現を誘発する。ＣＤ４０とＣ
Ｄ４０Ｌとの間の相互作用は、Ｂ細胞の活性化およびアイソタイプスイッチング
に必要である。ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合は、同時刺激分子であるＢ７．１
（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）のＡＰＣ上での発現を誘導し、次いで
、Ｔ細胞上のＣＤ２８に結合し、Ｔ細胞の活性化に必要な第二の同時刺激シグナ
ルを提供する。この第二のシグナル非存在下で、抗原−ＭＨＣによるＴ細胞の係
合は、Ｔ細胞アネルギーを産生する。ＣＤ４０Ｌ遺伝子におけるヒトの遺伝子の
欠損は、過剰ＩｇＭ症候群と呼ばれる、Ｘ連結免疫欠損障害を引き起こす（Ａｌ
ｌｅｎら、１９９３；Ａｒｕｆｆｏら、１９９３；ＤｉＳａｎｔｏら、１９９３
；Ｋｏｒｔｈａｕｅｒら、１９９３）。ＣＤ４０Ｌを発現しないか、ＣＤ４０Ｌ
を発現するかのいずれの個体も、ＣＤ４０に結合し得ず、有意に減少したＴ細胞
依存性体液性免疫応答およびアイソタイプクラススイッチングの欠損を生じる。

【００９７】 従って、ＣＤ４０Ｌプロモーターの標的化は、以下を含むが、これらに限定さ
れない複数の自己免疫障害に対して関連性を有する：多発性硬化症（ＭＳ）、全
身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）および慢性関
節リウマチ（例えば、Ｂｕｈｌｍａｎｎら、１９９６；Ｂｉａｎｃｏｎｅら、１
９９９）。さらに、ＣＤ４０Ｌ発現の阻害は、長期の移植耐性に寄与し得るとい
う証拠が存在する（Ｌａｒｓｅｎら、１９９６；Ｋｉｒｋら、１９９７；Ｈａｎ
ｃｏｃｋら、１９９８；Ｎｉｉｍｉら、１９９８）。さらに、特定のモノクロー
ナル抗体でＣＤ４０Ｌを標的化することは、アデノウイルスベクターに基づく遺
伝子治療の有効性を増加させることが示されている（Ｙａｎｇら、１９９６；Ｋ
ａｙら、１９９７）。

【００９８】 ヒトＣＤ４０Ｌ遺伝子は、クローニングされる（Ｇｒａｆら、１９９２；Ｈｏ
ｌｌｅｎｂａｕｇｈら、１９９２；Ｓｐｒｉｇｇｓら、１９９２；Ｇａｕｃｈａ
ｔら、１９９３；Ｓｈｉｍａｄｚｕ、１９９５）。ＣＤ４０Ｌプロモーター配列
は、配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ３１７９３）の分析によって同定されるよ
うに、以下のいくつかの潜在的な転写因子結合部位を含む：ＡＰ−１（１５７０
〜１５７７；１８６７〜１９３８）、ＧＭＣＳＦ（１０４０〜０１４５；１３４
３〜１３５０；１６８９〜１６９６；１８４０〜１８６２）、αＩＲＥ（１２９
１〜１２９５；１３５９〜１３６６；１３９７〜１４０４；１５８９〜１５９３
；１７０１〜１７０５；および１８０３〜１８０７）、ＴＣＦ１（１６０３〜１
６０６；１７３１〜１３６）、ＧＡＴＡ−１（１６４３〜１６４７）、ＣＲＥ２
（１２０９〜１２１６）、γＩＮＦ２（１１８８〜１１９５）、ＮＦ−ＩＬ６（
８１５〜８１９）ならびにＮＦκＢ（７３７−７４３）。

【００９９】 ＣＤ４０Ｌプロモーターを特徴付けするために、全長ヒトＣＤ４０Ｌプロモー
ター（−１８６０〜＋４９）（配列番号１）を、実施例２において詳述されるよ
うに、ＰＣＲで増幅し、そしてホタルのルシフェラーゼレセプタープラスミドｐ
ＧＬ３−ｂａｓｉｃにクローニングした。一連の５’ＣＤ４０Ｌプロモーター欠
損および特異的変異を調製し、ＰＣＲで増幅し、そして全てのクローンの確実性
を、５’欠損構築物のＤＮＡ配列決定および全長（−１８６０）ＣＤ４０Ｌプロ
モーターの構築物と比較したプロモーター活性、続いて、正常に拡張されたＴ細
胞へのトランスフェクションおよびＰＭＡおよびイオノマイシンとの活性化によ
って確認した（実施例２）。

【０１００】 これらの結果は、ＣＤ４０Ｌプロモーターの少なくとも４つの領域が、活性化
されたＴ細胞（ヌクレオチド−３０６位付近の部位を含む）での発現に重要であ
ることを示し、この特異的な変異は、この部位でのＣＤ４０Ｌプロモーター活性
因子結合の４倍のダウンレギュレーションを生じた（実施例２を参照のこと）。

【０１０１】 ＣＤ４０Ｌ発現を制御するのに役割を果たす第二のプロモーター領域は、ヌク
レオチド−２３０と−２１１との間の配列（配列番号１３）であり、これは、プ
ロモーター活性の６．７倍の減少を生じる領域の欠損に基づく。

【０１０２】 活性化した正常のヒトＴ細胞のＣＤ４０プロモーター発現に重要な第３領域は
、−２３０と−１９６との間（配列番号１４）に見出され、これは、ＣＤ４０Ｌ
プロモーターイ活性の６．７倍のダウンレギュレーションを生じる、−２３０〜
−２１１領域の欠損、およびプロモーター活性の２．５〜４倍のダウンレギュレ
ーションを生じる、−２２０〜−２１５、−２１４〜−２０９、−２０８〜−２
０３、または−２０２〜−１９７の部位特異的変異に基づく。ＡＴ細胞特異的因
子、配列特異的因子は、インビボフットプリント分析結果に基づき−２０６〜−
２０１領域において結合することが示された。

【０１０３】 活性化した通常のヒトＴ細胞での発現に重要であるとしてＣＤ４０Ｌプロモー
ターで同定された第４領域は、欠失変異体の発現レベルに基づく−７７と−４０
の間（配列番号１５）に見出され、ここで、−７２〜−４９または−６１〜−４
０の内部欠失が、それぞれ２５倍または４０倍のダウンレギュレーションで得ら
れた。さらに、−４８と−５４との間に位置する以前に同定されなかった部位を
伴う、組成物ＡＰ−１／−６６ＮＦ−ＡＦ部位の特定の変異は、−４８〜−５４
部位を介した転写性活性への寄与を示す。

【０１０４】 いくつかのＣＤ４０Ｌプロモーター領域が、実施例２においてさらに議論され
るような、１以上の転写性因子と結合し得る。本明細書中に記載されるＣＤ４０
Ｌプロモーターの調節領域に対するＤＮＡ結合化合物の標的化は、転写性因子−
ＤＮＡ相互作用の調節を介して、ＣＤ４０Ｌプロモーター−媒介転写を阻害する
手段を提供することがさらに理解される。

【０１０５】 本明細書中で提供される結果は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４
および配列番号１５として示される調節配列が、１以上の調節配列を含むＣＤ４
０Ｌプロモーターに作動可能に連結された、自己遺伝子または異種遺伝子の発現
を調節する有用性を見出すことを示す。

【０１０６】 （ＶＩＩ．Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）） ヒトにおいてＢ型肝炎を誘導するウイルスは、ＨＢＶに感染することによって
引き起こされ、世界中で３億人が感染していると推定される。感染した個体の、
小さいが有意な一部は、重篤な病的結果（慢性肝不全、肝硬変、および肝細胞癌
が挙げられる）を発生し、ＨＢＶ感染によって、世界中で１年あたり１００万人
が死亡する。

【０１０７】 ワクチン接種は、効果的な予防的手段であるが、疾患についての治療法は存在
せず、そして現在では、急性Ｂ型肝炎に特異的な効果的な処置は存在しない。現
在、慢性Ｂ型肝炎は、インターフェロン（すなわち、インターフェロン−α）お
よびヌクレオシドアナログ（すなわち、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）「
３ＴＣ」）で処置される。

【０１０８】 ＨＢＶは、１９７０年代に最初にクローン化された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１
９７４；Ｓａｔｔｌｅｒら、１９７９；Ｓｕｍｍｅｒｓら、１９７５）。ヒト肝
臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ６）は、ＨＢＶを細胞ゲノム中に安定に組
み込ませる。これらの細胞は、ＨＢＶ複製を補助し、そしてウイルス様粒子を、
組織培養培地中に放出する。例えば、Ｓｅｅ ＭＡら、１９８７；Ｌａｎｄｅｒ
ら、１９９７；Ｓｕｄｏら、１９９６を参照のこと。

【０１０９】 ＨＢＶは、３．２ｋｂの、弛緩した、環状の、部分的に二重鎖のＤＮＡ種から
なるゲノムを有する、ＤＮＡウイルスである。ゲノムにおけるあらゆるヌクレオ
チドは、コード領域中にあり、そして配列の半分より多くの配列は、１つよりも
多くのオープンリーディングフレームにおいて翻訳される。いくつかのプロモー
ターが同定され、これは、（ａ）プレコアタンパク質、コアタンパク質およびポ
リメラーゼ（コアプロモーター）；（ｂ）ラージ（ｌａｒｇｅ）Ｓ表面タンパク
質（ｐｒｅ−Ｓ１プロモーター）；（ｃ）ミディアム（ｍｅｄｉｕｍ）およびス
モール（ｓｍａｌｌ）Ｓ表面タンパク質（Ｓプロモーター）；ならびに（ｄ）Ｘ
タンパク質（Ｘプロモーター）の発現を駆動する。コアタンパク質は、ウイルス
ゲノムおよびポリメラーゼをカプセル化し、種々のＳ表面タンパク質は、タンパ
ク質コーティングを作製し、そしてＸタンパク質の機能は未だ決定されていない
。

【０１１０】 コアプロモーター（これは、メッセンジャー転写物のゲノムサイズよりも２倍
大きなサイズの転写に関する）特徴付けは、記載されている（総説については、
Ｇａｎｅｍ Ｄ．ＦＩＥＬＤ ＶＩＲＯＬＯＧＹ 第３版、１９９６、ならびに
Ｋａｎｎ Ｍ．およびＧｅｒｌｉｃｈ Ｗ．，Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
，第２版を参照のこと）。これらのｍＲＮＡの１つ、すなわちプレゲノム転写物
（ｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）は、コア構造タンパク質およ
びウイルスポリメラーゼ、ならびにネガティブ鎖ウイルスＤＮＡの複製のための
テンプレートの両方をコードする。他の３．５ｋｂ ｍＲＮＡ、すなわちプレコ
アメッセージは、可溶性ウイルスｅ抗原に翻訳および改変される。肝細胞核因子
（Ｃ／ＥＢＰ、およびＳｐ１）のための結合部位は、コアプロモーター領域にお
いて以前に記載されている（Ｇａｎｅｍ Ｄ． ＦＩＥＬＤ ＶＩＲＯＬＯＧＹ
、第３版、１９９６、ならびにＫａｎｎ Ｍ．およびＧｅｒｌｉｃｈ Ｗ． Ｖ
ｉｒａｌ ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ，第２版において総説される）。肝細胞核因子（
ＨＮＦ３およびＨＮＦ４）は、ＨＢＶの肝臓向性のために重要であると考えられ
ている。さらなる転写因子結合部位（例えば、Ｃ／ＥＢＰおよびＳｐ１）が、記
載されている。

【０１１１】 ３つのＨＢＶプロモーターの特徴付けが、本明細書中に提供される；コアプロ
モーター（配列番号１６、図１Ａ）、ｐｒｅ−Ｓ１プロモーター（配列番号２２
、図１Ｂ）およびＨＢＶ−Ｘプロモーター（配列番号２５、図３）。

【０１１２】 本明細書中に記載されるＨＢＶプロモーターは、肝臓細胞に特異的である調節
された遺伝子発現において有用性を見出す。

【０１１３】 ＨＢＶコアプロモーター、ｐｒｅＳ１プロモーターおよびＸプロモーターの種
々の配列成分の改変の効果の分析を、ＨＢＶコアプロモーター、ｐｒｅＳ１プロ
モーターおよびＸプロモーターのそれぞれに作動可能に連結される遺伝子の発現
を調節するために使用され得るプロモーターの一部を同定するために、実施例３
において詳述されるように行った。

【０１１４】 野生型のコア、ＸおよびｐｒｅＳ１プロモーター構築物、ならびにそれらの種
々の改変体のルシフェラーゼレセプター活性を、肝臓起源の細胞株（例えば、Ｈ
ｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、２２．１．５、およびＨｅｐＡＤ３８）における一過性ト
ランスフェクション実験によって評価した。

【０１１５】 （ＨＢＶコアプロモーター） 目的の３つの領域を、ＨＢＶコアプロモーターのリンカースキャニング分析（
ｌｉｎｋｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）において同定した。ＴＡ
ＴＡボックス、ＨＮＦ４（配列番号１８）および近位ＨＮＦ３（配列番号１７）
の部位を、コアプロモーター活性の最も重要な制御エレメントとして同定した。
実施例３においてさらに記載されるように、ＨＢＶコアプロモーターの３つの領
域（ドメイン５、ドメイン８／９およびドメイン１３）は、文献において報告さ
れるｃｉｓ−エレメント（それぞれ、ＨＮＦ−４／ＨＮＦ−３、ＨＮＦ−３／Ｓ
ｐ１、およびＴＡＴＡボックス）の近くにあるようである。表９において示され
る発現研究の結果は、ドメイン８（配列番号１９）；ドメイン８／９−１（配列
番号２０）；およびドメイン１３（配列番号２１）が、転写活性に関係があり、
そしてこれらの配列が、配列番号２０および／もしくは配列番号２１を含むＨＢ
Ｖコアプロモーターに作動可能に連結される、自系遺伝子または異種遺伝子の発
現の調節において、有用性を見出すことを示唆する。

【０１１６】 （ｐｒｅＳ１プロモーター） ルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ上流に位置するｐｒｅＳ１プロモータ
ーと共に、ＨＢＶゲノムの全長コピーを使用して、このルシフェラーゼレポータ
ー構築物を産生し、そして部位特異的な変異誘発を実行して、既知の転写因子結
合部位およびリンカースキャナ変異体において、４つの変異体を産生した。変異
誘発された構築物を、上記のようにＨｅｐ３ＡＤ３８に一過性にトランスフェク
トし、そしてプロモーター活性について試験した。実施例３において詳述される
ように、既知の転写因子結合部位（ＨＮＦ１と称される）を、ｐｒｅＳ１プロモ
ーター活性に対して重要であると見出した。

【０１１７】 本明細書中に提供される結果は、配列番号２３および配列番号２４として示さ
れる調節配列が、１つまたは両方の調節配列を含むＨＢＶ ｐｒｅＳ１プロモー
ターに作動可能に連結された自系遺伝子もしくは異種遺伝子の発現の調節におい
て有用性を見出すことを示す。

【０１１８】 （ＨＢＶ Ｘプロモーター） ＨＢＶ Ｘプロモーターを、コアプロモーターについて記載されるものに類似
する、欠失およびリンカースキャニング実験によって分析した。

【０１１９】 ルシフェラーゼレポーター構築物を、レポーターコード配列のすぐ上流に位置
するＨＢＶゲノムおよびＨＢＶ Ｘプロモーターの全長コピーと共に構築した。
プロモーター構築物を、ＨＢＶ Ｘプロモーターまたは既知の転写因子結合部位
において、２１塩基対変異の連続的なブロックを用いて調製した。実施例３にお
いて詳述されるように、変異体構築物を、肝臓癌誘導ＨｅｐＧ２にトランスフェ
クトし、そしてＨｅｐＧ２細胞株をＨＢＶ：２２．１．５およびＨｅｐＡＤ３８
で安定にトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を
分析して、ＨＢＶプロモーター活性を決定した。ドメイン３、４、および６にお
ける変異、ならびに二重の変異（ドメイン３および６、ならびにドメイン４およ
び６）は、活性において最も大きい減少を生じた。さらなるＨＢＶ−Ｘプロモー
ターレポーター構築物を、種々の既知の転写因子結合部位における変異を用いて
作製し、そしてルシフェラーゼレポーター活性について評価して、ドメイン１８
および１９がまた、ＨＢＶ Ｘプロモーターの活性のために重要であることを示
唆した。

【０１２０】 本明細書中に提供される結果は、配列番号２６、配列番号２７、および配列番
号２８として示される調節配列が、１つ以上の調節配列を含むＨＢＶ Ｘプロモ
ーターに作動可能に連結された自系遺伝子もしくは異種遺伝子の発現の調節にお
いて有用性を見出すことを示す。

【０１２１】 （ＶＩＩＩ． バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）） 最近、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の感染および集落形成の発生率の
急激な増加が報告されている。観察された耐性は、（１）ほとんどのＶＲＥがま
た、このような感染を処置するために以前に使用された薬物（すなわち、ペニシ
リンおよびアミノグリコシド（ＣＤＣ、１９９３；Ｈａｎｄｗｅｒｇｅｒら、１
９９３））に対して耐性であるため、ＶＲＥ感染についての効果的な抗菌治療が
不十分であること；ならびに（２）ＶＲＥにおいて存在するバンコマイシン耐性
遺伝子が、他のグラム陽性微生物に転移するという可能性、に起因して関心が持
たれる。

【０１２２】 腸球菌は、消化管および女性の泌尿生殖器管の正常な微生物叢の一部であり得
るが、最近の研究は、腸球菌は、病院の設定において直接伝染され得ることが示
されている（例えば、Ｂｏｙｃｅら、１９９４を参照のこと）。腸球菌は、院内
感染の原因として認識され、そしていくつかの株は、複数の抗菌剤に対して耐性
である。最も一般的な腸球菌に関連するほとんどの院内感染は、尿路感染、手術
後感染、および菌血症である（Ｍｕｒｒａｙ、１９９０；Ｍｏｅｌｌｅｒｉｎｇ
ＲＣ Ｊｒ．、１９９２；Ｓｃｈａｂｅｒｇら、１９９１）。

【０１２３】 バンコマイシンは、１９７０年代後半から、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ感染を
処置するために広範に使用されている。最近、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲ
Ｅ）の感染および集落形成の発生率の迅速な増加が報告されている。

【０１２４】 バンコマイシン耐性および他のグリコペプチド抗体に対する耐性は、Ｄ−ラク
トース（これは、バンコマイシンのような抗生物質に対して低い親和性を有する
）で終結する改変された細胞壁前駆体の合成と関連している。

【０１２５】 代表的には、グラム陽性細菌の細胞壁合成は、ペプチドグリカン形成のプロセ
スの一部としてのアセンブリ、膜輸送、細胞壁への組み込みおよびペンタペプチ
ド前駆体分子の架橋を含む。ペプチジル−Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａ前駆体との複
合体を形成し、それによってトランスグリコシラーゼおよびペプチドグリカンへ
の組み込みにより前駆体輸送を阻害し、そして細菌細胞壁を弱めることによって
、バンコマイシンは、機能する。Ａ型高レベルバンコマイシン耐性は、Ｃ末端Ｄ
−ａｌａをＤ−ｌａｃに置き換えるオペロンによって達成され、その結果、バン
コマイシン結合が阻害される（Ｗａｌｓｈ Ｃ、１９９９）。

【０１２６】 オペロンは、センサータンパク質、ＶａｎＳおよび細胞質応答調節因子、Ｖａ
ｎＲからなる２成分調節系によって制御される。

【０１２７】 ＶａｎＳは、ヒスチジン残基（Ｈ１６４）において自己リン酸化を起こす２ド
メイン膜貫通シグナル伝達キナーゼである。ＡＴＰの存在下でホスホ−ＶａｎＳ
は、ＶａｎＲ（２）上のアスパラギン酸残基にホスホトランスファーを起こし得
る。ホスホ−ＶａｎＲが高い効率でＰｖａｎＨに結合し、そしてバンコマイシン
耐性に必要な遺伝子の転写を増加することが研究によって示された（Ｈａｌｄｉ
ｍａｎｎら、１９９７；Ｈｏｌｍａｎら、１９９４）。

【０１２８】 高レベル誘導性のバンコマイシンおよびテイコプラニン耐性に必要な遺伝子を
生じるポリシストロンメッセージは、ｖａｎＨ、Ａ、Ｘ、ＹおよびＺからなる。
バンコマイシン耐性酵素ＶａｎＨは、ピルベートをＤ−ラクテートに立体特異的
に還元するα−ケト酸であり、これは、バンコマイシン標的ジペプチドＤ−アラ
ニン−Ｄ−アラニンを置換する細菌細胞壁の一体化部分を形成する（（Ｓｔｏｌ
ｌら、１９９８；Ｍａｒｓｈａｌら、１９９９）。

【０１２９】 本発明は、ＶａｎＨプロモーター内に適切に配置されるＤＮＡ結合分子が、ホ
スホ−ＶａｎＲを置換し、そして誘導性耐性遺伝子の転写をシャットダウンし、
従って、細菌をもう一度バンコマイシンに対して感受性にする。この機構は本発
明の一部ではないが、耐性遺伝子の転写をシャットダウンすることは、他の２つ
の成分調節系の応答調節因子とＰ_ｖａｎＨとの間の潜在的なクロストークに起因
する２成分調節系のシャットダウンに好ましい（Ｓｉｌｖａら、１９９８）。

【０１３０】 従って、ｖａｎＨプロモーターの発現を調節することが、感染性疾患の処置に
対する適用を有する。

【０１３１】 ＶＲＥの９個のＡ型株由来のｖａｎＨプロモーターのＤＮＡ配列決定は、公開
されたＡ型調節領域（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ９７２９７）と高い程度の配列
同一性を示した。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓ種における増殖お
よび維持を可能にする、バックグラウンドにおけるルシフェラーゼの上流にＶＲ
Ｅプロモーター配列を含む、改変されたｐＡＭ４０１プラスミド（ＡＴＣＣ）を
、設計した（実施例４を参照のこと）。

【０１３２】 ＶＲＥプロモーター領域の部位特異的変異誘発は、コンセンサスプロモーター
配列の短い８〜１０ｂｐ領域（リン酸化ＶａｎＲフットプリント内の−３５コン
センサス結合部位を含む）を系統的に変えることによって行った（Ａｒｔｈｕｒ
ら、１９９２）。さらに、Ｍ２−Ｍ２１と称される２０リンカースキャニング変
異体を作製し、そしてルシフェラーゼの上流にＶＲＥプロモーター配列を含む核
酸構築物を、ｐＲＬＵＣ親ベクターにサブクローン化し、そしてＥ．ｃｏｌｉに
形質転換した。

【０１３３】 各リンカースキャナープロモーター変異体を活性について試験し、上方制御お
よび下方制御が観測された。最も大きな減少は、野生型活性の０％であり、そし
て最も大きな増加は、野生型活性の１７３７％であった。リン酸化ＶａｎＲ（Ｍ
２−Ｍ８）によってフットプリントされたことが報告された領域内の全ての変異
体が、減少した活性を示した。増加した活性は、−３０〜＋２０にわたる変異体
において観測され、これは、この領域におけるレプレッサ結合部位の可能性を示
唆する。変異体Ｍ８およびＭ９は、試験された変異体の最も高いルシフェラーゼ
活性を一貫して生じることを示した（実施例４）。

【０１３４】 本明細書中に記載される結果は、配列番号３２、配列番号３３および配列番号
３４として提示される調節配列が、１つ以上の調節配列を含むＶＲＥプロモータ
ーに作動可能に連結される自己遺伝子または異種遺伝子の発現を調節する際に有
用性を見出すことを示す。

【０１３５】 （ＩＸ．アンドロゲンレセプター） 前立腺癌は、米国における男性において最も頻繁に診断される癌である。癌は
、初期に診断された場合、処置可能であるが、しかし、一旦、癌が転移すると、
実質的に全ての患者が１２〜１８か月で死亡する。転移性前立腺癌の現在の処置
は、外科的手段または化学的手段を使用してアンドロゲンレセプター（ＡＲ）を
標的化する工程を包含する。アンドロゲンレセプター（ＡＲ）は、アンドロゲン
（例えば、テストステロンまたはジヒドロテストステロン（ＤＴＨ））に結合す
る場合、遺伝子発現を直接調節し、そして前立腺維持に必要とされる。一旦、ア
ンドロゲンが除去されると、前立腺においてＡＲによって調節される遺伝子は、
オンにまたはオフにされ、プログラムされた細胞死またはアポトーシスを生じる
。

【０１３６】 ヌクレオチド−６０００〜＋１１００からのアンドロゲンレセプタープロモー
ターは、プライマー設計のためにＧｅｎＢａｎｋ配列を使用して、ＰＣＲによっ
てゲノムＤＮＡからクローン化された。増幅されたプロモーター配列を、引き続
く一過性のトランスフェクションおよびルシフェラーゼ発現の評価のために、ｐ
ＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローン化した。大きな一連の欠
失構築物を作製し、実施例５に詳細に記載されるように、一過性トランスフェク
ションに続いて試験した。

【０１３７】 種々の構築物の一過性トランスフェクションに続いて、ＡＲ＋細胞株、ＬＮＣ
ａＰにおいて、ルシフェラーゼ発現アッセイの結果は、ヌクレオチド−２０００
と−２００との間のレプレッサ結合部位、およびヌクレオチド−１５０〜−１０
０（ホモプリンストレッチ）、−１００〜−５０（ＳＰ１部位）、および−５０
〜＋１（ヘリックスループヘリックス結合部位）の複数のアクチベーター部位の
存在を示す。

【０１３８】 より詳細には、この結果は、（１）ホモプリン領域の５’領域が、−１５０〜
−１００の活性の全てを表し；（２）下流ヘリックス−ループ−ヘリックス配列
の３’領域は、別の２倍の活性を含み；そして（３）下流ヘリックス−ターン−
ヘリックス部位は、１．５倍の活性を含むことを示唆する。

【０１３９】 本発明は、ＡＲプロモーターの調節配列の同定を表し、この調節配列の例は、
各々、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６として与えられている。
配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６に提示される調節配列は、１つ
以上の調節配列を含むＡＲプロモーターに作動可能に連結された自己遺伝子また
は異種遺伝子の発現を調節する際に有用性を見出す。

【０１４０】 （Ｘ．Ｈｅｒ２） Ｈｅｒ２（ヒト上皮増殖因子レセプター２；ｃ−ｅｒｂＢ２、ｎｅｕ）は、乳
癌のサブクラスの転移増殖に関係するチロシンキナーゼ増殖因子レセプターであ
る。Ｈｅｒ２過剰発現は、乳癌を有する３０％までの患者において生じ、より迅
速な疾患の進行およびより短い生存によって特徴付けられる疾患の特に攻撃的な
形態と関連する。Ｈｅｒ２は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、ならびに種々の他の癌細
胞において過剰発現され得る。従って、Ｈｅｒ−２の調節発現は、このような過
剰発現を調節するのに有用である。

【０１４１】 ヒトＨｅｒ２プロモーターの２０００ｂｐフラグメントは、以下のオリゴヌク
レオチドを使用してゲノムＤＮＡから増幅されるＰＣＲであった。この精製され
たフラグメントは、乳癌細胞株ＭＣＦ−７（低Ｈｅｒ２発現）および２Ｒ７５−
１（高Ｈｅｒ２発現）における一過性トランスフェクションルシフェラーゼ発現
アッセイにおいて使用するために、ベクターｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）にＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位で、サブクローン化された。

【０１４２】 実施例６において詳細に記載される研究の結果は、Ｈｅｒ２プロモーターの重
要な調節部位がヌクレオチド−１２５と−５０との間にあることを示す。さらに
詳細には、Ｈｅｒ２の調節発現のための目的の配列は、−２３〜−１９の推定Ｔ
ＡＴＡボックスの下流のレプレッサ配列（配列番号７０）；アクチベーターおよ
びレプレッサ成分の両方を含む複合調節領域（配列番号７１）；推定ＴＡＴＡボ
ックス／ｅｔｓ部位（配列番号７２）である。

【０１４３】 配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２として本明細書中に提示され
る調節配列は、１つ以上の調節配列を含むＨｅｒ２プロモーターに作動可能に連
結される自己遺伝子または異種遺伝子の発現を調節する際の有用性を見出す。

【０１４４】 （ＸＩ．β−ラクタマーゼ（Ｂｉａ）プロモーター） β−ラクタム抗体の広範な使用は、このような処置に対して有意な細菌耐性を
生じた。この耐性は、一般的に、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方に
おいて、ラクタマーゼによって媒介される。より詳細には、β−ラクタマーゼ遺
伝子は、多くの型の細菌（Ｅ．ｃｏｌｉを含む）にアンピシリン耐性を与える。
最近、このような抗体耐性を克服することを指向した治療的アプローチが開発さ
れ、このアプローチは、β−ラクタマーゼインヒビターと組み合わせた、β−ラ
クタム抗生物質の送達を含む。

【０１４５】 βラクタマーゼ遺伝子の調節発現は、このような抗体耐性を改変するための別
の手段を提供する。βラクタマーゼ遺伝子のどの領域がβラクタマーゼ発現を調
節するために使用され得るかを決定するために、ルシフェラーゼ遺伝子の上流の
β−ラクタマーゼプロモーター配列を含むルシフェラーゼレセプター構築物が調
製された。

【０１４６】 天然のβラクタマーゼＰ３ ｂｌａプロモーターのプロモーター変異体は、ｂ
ｌａプロモーター配列（ヌクレオチド−１０１〜＋４３）の塩基対全体を体系的
に変化させることによって作製された。

【０１４７】 ルシフェラーゼ活性を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ複製物から調製され
た溶解物において測定した。有意に減少したルシフェラーゼ活性を示す変異体と
しては、−３５領域（−４１〜−３０、Ｍ６）；−１０領域（−１７〜−６、Ｍ
８）；開始部位（−５〜＋７、Ｍ９）；および＋２０〜＋３１（Ｍ１１）におい
て変異を有するものが挙げられる。これらの構築物のルシフェラーゼ活性は、実
施例７にさらに記載されるように、それぞれ、野生型の２４％、２９％、１５％
および２％に減少した。

【０１４８】 ｂｌａプロモーターリンカースキャナー変異体構築物を、ｂｉａプロモーター
全体のうちの異なる位置に６または１２塩基対の変異を誘導することによって作
製された。変異体のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーター活性を測定し、そ
して野生型ｐＢｌａ−Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ構築物の活性と比較された
。

【０１４９】 配列番号７７および配列番号７８として本明細書中に提示される調節配列は、
１つ以上の調節配列を含むβラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーターに作動可能に
連結される自己遺伝子または異種遺伝子の発現を調節する際に有用性を見出す。

【０１５０】 （ＸＩＩ．有用性／適用） 本発明は、種々のプロモーターの単離、そのプロモーターの特徴付け、および
特にプロモーターの調節エレメントの特徴付けに関する。本明細書中に記載され
るプロモーターは、調節された遺伝子発現において有用性を見出し、そして天然
の細胞性因子（例えば、転写調節タンパク質）との相互作用によって、または外
因的に提供される細胞性因子または化合物との相互作用によって機能し得る。

【０１５１】 プロモーターは、最小の長さのプロモーターまたは全長の長さのプロモーター
であり得る。本明細書中に記載されるプロモーター配列が、最小のプロモターエ
レメントを単独で、または所与の遺伝子産物の発現に関係する制御配列（「転写
および翻訳調節配列」とも呼ばれる）とともに含むことが理解される。一般的に
、転写および翻訳調節配列としては、限定しないが、プロモーター配列自身、転
写調節タンパク質に対するＤＮＡ応答エレメント、リボソーム結合部位、転写開
始および終止配列、翻訳開始および終止配列、ならびにエンハンサー配列または
アクチベーター配列が挙げられる。

【０１５２】 転写調節タンパク質の、その対応するＤＮＡ応答エレメントへの結合は、この
プロモーターに作動可能に連結したプロモーターの制御下で、遺伝子の発現を調
節するように働く。このような結合および調節に重要な配列の同定は、転写を制
御することによってこのプロモーターの制御下で遺伝子の発現を制御するための
フレームワークを提供する。

【０１５３】 従って、本明細書中に記載されるプロモーター調節配列は、関連するプロモー
ターに作動可能に連結した遺伝子の発現を調節するために使用され得る。このよ
うなプロモーター調節配列は、異種核酸構築物の設計および構築において、そし
てネイティブの遺伝子の調節された発現において、有用性が見出される。

【０１５４】 本明細書中に記載されるプロモーター調節配列はまた、このプロモーターに作
動可能に連結した遺伝子の発現を調節するためのＤＮＡ結合化合物と共に使用さ
れ得る。

【０１５５】 いくつかの場合、所定のプロモーターは、自然の要因によって調節され得る。
例えば、他の組織における発現に影響することなく、特定の組織における遺伝子
の発現を促進する、細胞型特異的プロモーター、発生的に調節されたプロモータ
ー、または疾患特異的プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現は、本
明細書中に記載の配列を使用して調節され得る。

【０１５６】 より詳細には、サイクリンＤ１プロモーターの制御下で遺伝子の発現を調節す
る能力は、種々の癌（乳癌、結腸癌および膵臓癌が挙げられるがこれらに限定さ
れない）を処置するための用途を有する。

【０１５７】 ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの間の相互作用は、Ｂ細胞活性化およびアイソタイプ
の切り替えに必要である。従って、ＣＤ４０Ｌ遺伝子プロモーターの活性の調節
は、種々の免疫学的障害（例えば、自己免疫疾患）の処置における有用性を見出
す。

【０１５８】 ＨＢＶ特異的コア、ｐｒｅ−ＳおよびＸプロモーターの制御下で調節された遺
伝子の発現は、ＨＢＶ疾患の治療において、そして肝細胞特異的遺伝子の発現の
調節において、有用性を見出す。

【０１５９】 抗生物質であるバンコマイシン（これは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ感染を処
置するために使用される）に対する耐性は、バンコマイシン耐性酵素であるＶａ
ｎＨと関連する。従って、ｖａｎＨ遺伝子プロモーターの調節された発現は、Ｅ
ｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ感染の処置における有用性を見出す。

【０１６０】 アンドロゲンレセプター（ＡＲ）が、前立腺癌の処置のための多数の治療スト
ラテジーの現在の標的であることを考慮すると、アンドロゲンレセプター遺伝子
プロモーターの調節された発現は、前立腺癌の処置における有用性を見出す。

【０１６１】 Ｈｅｒ２は、乳癌ならびに種々の他の型の癌のサブクラスの転移性増殖に関連
するチロシンキナーゼ増殖因子レセプターである。従って、Ｈｅｒ２遺伝子プロ
モーターの調節された発現は、癌の処置についての有用性を有する。

【０１６２】 β−ラクタマーゼ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにアンピシリン耐性を与える。従っ
て、β−ラクタマーゼ遺伝子プロモーターの調節された発現は、このような抗生
物質耐性の調節に関連する。

【０１６３】 従って、本明細書中に記載されるプロモーター調節配列の配列情報および機能
的特徴付けは、種々の有用な用途において、内因性遺伝子および導入遺伝子（そ
れぞれ、自系遺伝子および異種遺伝子）の転写を調節するために使用され得る。

【０１６４】 本発明は、特定の方法および実施形態を参照して記載されるが、本発明から逸
脱することなく、種々の改変および変更がなされ得ることが理解される。

【０１６５】 （方法および材料） （ルシフェラーゼアッセイ）細胞を、ＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、１ｍｌのＰ
ＢＳ中に収集し、ペレット化し、そして室温で、１００μｌの受動的溶解緩衝液
（Ｐｒｏｍｅｇａ）で１５〜２０分間溶解した。この細胞溶解物を、５分間遠心
分離し、次いで１０μｌの溶解物を、１００ｍｌのルシフェラーゼアッセイ試薬
（Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加する。アッセイを、照度計（ＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｔｈｏ
ｌｄ）で行った。ルシフェラーゼ活性を、光単位の割合として示す。収集の際の
トランスフェクション効率およびバリエーションについての補正を、ＳＶ４０
ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＰＲＬ−ＳＶ４０）またはプ
ロモーターなしのｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子（ＰＲＬ−Ｎｕｌｌ）の
同時トランスフェクト、および同じＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ（
Ｐｒｏｍｅｇａ）においてｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部コントロールの活
性を決定することによって行った。ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性での標準
化後、相対的ルシフェラーゼ活性を得、そして三連のウェルから平均および標準
偏差を算出した。一般に、トランスフェクションを、少なくとも２つの独立した
実験で繰り返し、そして再現した。

【０１６６】 （実施例１） （サイクリンＤ１プロモーター分析） −１７４５〜＋１５５（図４、配列番号１）の全長ヒトサイクリンＤ１プロモ
ーターを、ＰＣＲ増幅し、そしてホタルルシフェラーゼレポータープラスミドｐ
ＧＬ３ベーシックにクローニングした。一連のサイクリンＤ１ ５’プロモータ
ー欠失を同様に構築し、そしてｐＧＬ３ベーシックにクローニングした。変異体
プロモーター構築物を、ＭＣＦ７細胞、第２サイクリンＤ１過剰発現乳癌細胞株
（ＺＲ７５）；正常にサイクリンＤ１を発現する胸部細胞株（ＨＭＥＣ）；サイ
クリンＤ１過剰発現結腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）；およびサイクリンＤ１過剰
発現膵臓癌細胞株（ＰＡＮＣ−１）においてアッセイした。

【０１６７】 （プラスミドの構築） ヒトサイクリンＤ１プロモーターの１９００ｂｐのフラグメントを、以下のオ
リゴヌクレオチドを使用して、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した：５’−ＧＣＡ ＣＧＣ ＧＴＧ ＣＴＡ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＣＣ ＣＴＴ ＧＴ−
３’（配列番号２）および５’−ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＡＧＣ ＴＴＴ Ｇ
ＧＧ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＣＴ ＧＧＧ ＣＡ−３’（配列番号３）。この精製
したフラグメント（配列番号１）（これは、サイクリンＤ１プロモーターの転写
開始部位に対してヌクレオチド−１７４５〜＋１５５で表される）を、ＭｌｕＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩ部位でベクターｐＧＬ３ベーシック（Ｐｒｏｍｅｇａ）に
サブクローニングして、レポーター−１７４５Ｄ１／ＬＵＣを形成した。一連の
５’欠失物を、５’−ＧＣＡ ＣＧＣ ＧＴＧ ＣＴＡ ＧＣＴ ＧＧＡ ＧＣ
Ｃ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＧＧ ＣＴＧ Ｔ−３’（配列番号４）として示される
配列を有するＰＣＲプライマーを使用して、以下のようにネイティブプロモータ
ープラスミドのポリメラーゼ連鎖反応を使用してクローニングした：−１５９０
まで５’欠失、−１４４０まで５’欠失、−６９０まで５’欠失、−５４５まで
５’欠失、−３９０まで５’欠失、−２４５まで５’欠失、および−９０まで５
’欠失。

【０１６８】 ５’欠失構築物についてのプロモーター活性を、非同期型ＭＣＦ７ヒト乳癌細
胞（これは、サイクリンＤ１を過剰発現する）へのトランスフェクション後の全
長（−１７４５）サイクリンＤ１プロモーターと比較した。全長プロモーター（
−１７４５）の状況における−１７４５と−２４５との間のサイクリンＤ１プロ
モーター領域の欠失は、ＭＣＦ７細胞における基礎的なプロモーター活性に対し
てほとんど影響を有さなかった。

【０１６９】 ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ変異誘発システムおよび親の−１７４５Ｄ１／ＬＵＣ
プラスミドを用いて、ＡＰ１、ＣＲＥ、Ｅ２Ｆ、ＳＰ１、およびＯｃｔ１の部位
の部位特異的突然変異誘発、ならびに近位のプロモーターのリンカースキャニン
グ変異誘発を行った。制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって、これらの構
築物の完全性を確認した。

【０１７０】 Ｅ２Ｆ部位の変異｛Ｍｏｔｏｋｕｒａ＆Ａｒｎｏｌｄ、１９９３｝によって、
野生型の活性の６３％を保持する構築物が生じた。ＣＲＥエレメントの変異によ
って、野生型活性の３２％を保持する構築物が生じた。このことは、ＭＣＦ７細
胞における基礎的なサイクリンＤ１発現に対してＣＲＥエレメントが重要である
ことを示す。

【０１７１】

【化１】 ＭＣＦ７細胞に加えて、変異プロモーター構築物を、別のサイクリンＤ１過剰
発現乳癌細胞株であるＺＲ７５で；サイクリンＤ１を正常に発現する乳房細胞株
であるＨＭＥＣで；サイクリンＤ１過剰発現結腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６で
；そして、過剰発現する膵臓癌細胞株であるＰＡＮＣ−１で；アッセイした。−
１７４５の野生型、−１０欠失、またはサイクリンＤ１プロモーターの種々の部
位特異的変異体を、プロモーターのないホタルルシフェラーゼプラスミド（ｐＧ
Ｌ３−ベーシック）に挿入し、そしてＳＶ４０プロモーター駆動Ｒｅｎｉｌｌａ
ルシフェラーゼコントロールプラスミドとともに種々の細胞に同時トランスフェ
クトした。各構築物に関するホタルルシフェラーゼ活性を、Ｒｅｎｉｌｌａルシ
フェラーゼ活性に対して正規化した。そしてこの活性を全長野生型プロモーター
（−１７４５）の活性に対して示す。

【０１７２】 （組織培養） ヒト乳房癌腫細胞株ＭＣＦ７およびＺＲ７５を、１０％ウシ胎仔血清、１０μ
ｇ／ｍｌウシインスリンおよび抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を
含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持した。ヒト結腸癌腫細胞株ＨＣＴ１１６
を、１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＭｃ
Ｃｏｙ’ｓ培地中で維持した。ヒト膵臓細胞株ＰＡＮＣ−１を、１０％ウシ胎仔
血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中
で維持した。ヒト哺乳動物上皮細胞（ＨＭＥＣ）を、ウシ下垂体抽出物（５０μ
ｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（５００ｎｇ／ｍｌ）、ｈＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）、およびインスリン（５μｇ／ｍｌ）を補充した、上皮増殖培地中で維持し
た。全ての株は、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。ＭＣＦ７、ＺＲ７５、ＨＣＴ
１１６、およびＰＡＮＣ−１細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。ＨＭＥＣ細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｒｐから購入した。

【０１７３】 （一過性トランスフェクション） ６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中で、三連で、Ｌｉｐｏ
ｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、細
胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間前に、各
ウェルに等しい数の細胞（３×１０^５／ウェル）を播種した。トランスフェクシ
ョン前に、細胞を８００μｌの新鮮培地（５％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレ
プトマイシンを含有するＯｐｔｉＭＥＭ）中で平衡化した。２００μｌのトラン
スフェクト緩衝液中で、種々の異なるサイクリンＤ１プロモーター構築物を含有
する５μｇのレポータープラスミドを用いて、細胞をトランスフェクトした。ト
ランスフェクション溶液を用いて４時間インキュベーションした後、５％ＦＢＳ
およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有する４ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭを細
胞に供給した。トランスフェクション後４８時間で、細胞ウイルスを回収した。

【０１７４】 （サイクリンＤ１プロモーターエレメントの分析） 以下の表１および２は、ＭＣＦ７細胞におけるサイクリンＤ１プロモーターの
欠失分析研究の結果のまとめを示す。サイクリンＤ１プロモーターの種々の５’
欠失体または部位特異的変異体を、プロモーターのないホタルルシフェラーゼプ
ラスミド（ｐＧＬ３−ベーシック）に挿入し、そして、ＳＶ４０プロモーター駆
動Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼコントロールプラスミドとともに、サイクリン
Ｄ１を過剰発現する、ＭＣＦ７細胞ヒト乳房癌腫細胞（Ｂｕｃｋｌｅｙ、１９９
３）中に同時トランスフェクトした。各構築物の長さを、転写開始部位（＋１）
に対して示す。各構築物についてのホタルルシフェラーゼ活性を、Ｒｅｎｉｌｌ
ａルシフェラーゼ活性に対して正規化した。そしてこの活性を全長野生型プロモ
ーター（−１７４５）の活性に対して示す。このデータを、三連で行った２つの
独立したトランスフェクションの最小値とともに平均±ＳＥＭとして示す。全長
プロモーター（−１７４５）の状況における−１７４５と−２４５との間のサイ
クリンＤ１プロモーター領域の欠失は、いくつかの可能性のある転写因子結合部
位が、その領域で以前に同定されているにもかかわらず、ＭＣＦ７細胞における
基礎的なプロモーター活性に対してほとんど影響を有さなかった。

【０１７５】 −３０〜−２１領域の変異と組み合わせてＣＲＥの変異を含むサイクリンＤ１
プロモーター構築物は、試験した全ての細胞株において、プロモーター活性の重
度の障害を生じた。以下で記載したように実行したインビボフットプリント実験
法によって、ＨＣＴ１１６細胞においてＣＲＥおよび−３０部位の両方に結合す
る因子が実証される。

【０１７６】 試験された全ての細胞株において、ＣＲＥｂａｍおよびＣＲＥ４Ｃ５Ｇとして
設計された構築物中のＣＲＥの変異は、基礎的なプロモーター活性をかなり減少
させたが、最も強力な効果は、ＭＣＦ７細胞において見られた。対応する野生型
の配列を、配列番号７として示す。

【０１７７】 −３０〜−２１部位の変異は、いくつかの細胞株において基礎的なサイクリン
Ｄ１プロモーター活性を減少させたが、他では減少させなかった。しかし、試験
した全ての細胞株において、ＣＲＥ（構築物ＣＲＥ４Ｃ／−３１−２１）の変異
と組み合わせた−３０〜−２１部位の変異は、基礎的なプロモーター活性をかな
り、かつ、いずれかの部位単独の変異が減少させるよりも高い程度に減少させた
（表１）。これは、ＣＲＥおよび−３０〜−２１部位の両方が、試験された全て
の過剰発現癌細胞株ならびに正常レベルのサイクリンＤ１を発現するＨＭＥＣ細
胞において、基礎的なサイクリンＤ１プロモーター活性の転写調節に関与するこ
とを示唆する。サイクリンＤ１プロモーターの種々の他の領域における変異の効
果を、以下の表２に要約する。

【０１７８】 （表１．サイクリンＤ１プロモーター構築物のレポーター活性）

【０１７９】

【表１】 （表２．サイクリンＤ１プロモーター構築物のレポーター活性）

【０１８０】

【表２】 ＡＰ１、ＣＲＥ、Ｅ２Ｆ、ＳＰ１およびＯｃｔ１部位の部位特異的変異誘発、
ならびに近位プロモーターのリンカー−スキャニング変異誘発を、プロモーター
活性に対する効果を決定するために実行した。これらの結果は、Ｅ２Ｆ部位の変
異（Ｍｏｔｏｋｕｒａら、１９９３）が、中程度に減少した活性を生じたことを
示すが、ＣＲＥエレメントの変異は、これがＭＣＦ７細胞における基礎的なサイ
クリンＤ１発現に重要であることを示した。

【０１８１】 ＣＣＮＤ１プロモーターの完全な分析は、−５２でのＣＲＥ部位が、ＨＣＴ１
１６結腸癌細胞、ＰＡＮＣ−１膵臓癌細胞、ＭＣＦ７およびＺＲ７５乳癌細胞な
らびにサイクリンＤ１を正常に発現するＨＭＥＣ乳房細胞におけるサイクリンＤ
１の発現のために重要な部位であることを示す。以下の表３および４のサイクリ
ンＤ１において示されるように、塩基−３０〜−２１の変異は、基礎的なプロモ
ーター活性を３３％に減少させ、ＭＣＦ７細胞におけるサイクリンＤ１発現のた
めの、別の重要かつ新規な活性化部位を明らかにした。塩基＋１〜＋９または＋
１０〜＋１９の変異もまた、基礎的なプロモーター活性を、それぞれ、３７％お
よび６２％に減少させた。ＣＥＲ（配列番号７）および−３０〜−２１部位（配
列番号５）における変異を含む二重変異は、構築され、そしてＭＣＦ７細胞にト
ランスフェクトされ、試験された全ての細胞株において保持される全長の野生型
プロモーターの、わずか１１％の活性を生じた。＋１〜＋９部位（配列番号８）
と組み合わせたＣＲＥの二重変異は、活性を１４％に減少させた。

【０１８２】 （表３．サイクリンＤ１プロモーター構築物のレポーター活性）

【０１８３】

【表３】 （表４．サイクリンＤ１プロモーター構築物のレポーター活性）

【０１８４】

【表４】 近位プロモーター領域をより詳細に試験するため、一連の部位特異的変異を、
ｐＧＬ３ ｂａｓｉｃの全長プロモーター（−１７４５）に関して、−６２〜＋
２０の１０ｂｐセグメントで作製した。ルシフェラーゼ活性を、ＭＣＦ７細胞へ
のトランスフェクション後に評価した。表５に示される結果は、ＣＲＥの直ぐ５
’側の１０ｂｐ（構築物５’ＣＲＥｍ）、または塩基−２０〜−１１の１０ｂｐ
のいずれかの変異が、プロモーター活性を増大させたことを示し、これは、これ
らの領域中のネガティブな転写調節部位の存在を示唆する。−３０〜−２１プロ
モーター領域の部位特異的変異誘発を実行し、そして構築物をＭＣＦ７細胞にお
いてアッセイした。アッセイの結果は、−３０と−２４との間の塩基（ＧＡＧＴ
ＴＴＴ、ヌクレオチド配列番号６）が、この部位からの転写活性化に最も重要で
あることを示す。

【０１８５】 （表５．サイクリンＤ１プロモーター構築物のレポーター活性）

【０１８６】

【表５】 転写活性化のために重要な配列の同定は、このプロモーターの調節配列を使用
して、腫瘍細胞における内因性サイクリンＤ１の発現を特異的に調節することが
可能であることを示唆する。

【０１８７】 （インビボのフットプリント法） サイクリンＤ１プロモーターのインビボのフットプリント法を、Ｍｕｅｌｌｅ
ｒ ＰＲおよびＷｏｌｄ Ｂ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６（４９３１）：７８０−
７８６、１９８９に記載のように実行した。ＣＲＥおよび−３０〜−２１領域内
に結合する転写因子を、硫酸ジメチル（ＤＭＳ）またはＵＶ光をＨＣＴ１１６細
胞において使用するインビボのフットプリント法によって評価した。これらの研
究の結果は、ＣＲＥが、ＣＲＥ結合タンパク質（ＣＲＥＢ）に対する作用の様式
と一致して、血清飢餓細胞および血清刺激細胞の両方において保護されることを
示す（例えば、ＫＷＯＫ、１９９４を参照のこと）。これらの結果はまた、タン
パク質がＨＣＴ１１６細胞において−３０〜−２１領域に結合しており、そして
この部位が血清飢餓細胞および血清刺激細胞の両方において保護されていること
を示す。−３０〜−２１領域における結合を担う因子の同定は、決定されるべき
ままである。

【０１８８】 （実施例２） （ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）プロモーターエレメントの同定） −１８６０〜＋４９の全長ヒトＣＤ４０Ｌプロモーター（配列番号９）を、Ｐ
ＣＲ増幅し、そしてホタルルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３−ｂａ
ｓｉｃ中にクローニングした。ＣＤ４０Ｌプロモーター領域の１９２０ｂｐのエ
レメント（−１８６０〜＋４９、図５Ａ〜Ｃ）を、サブクローニングを容易にす
るために５’ＸｈｏＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する以下のプライ
マーを使用して、ゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅した。 ＴＴＡ ＴＧＡ ＴＡＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＧＧ ＡＧＡ ＧＣＡ ＴＴＣ
ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＴＧ（配列番号１０）；および ＴＧＡ ＡＴＣ ＡＣＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＴＴ ＣＴＧ
ＧＣＡ ＧＡＧ ＡＡＧ（配列番号１１）。

【０１８９】 全ての５’欠失を、３’ＨｉｎｄＩＩＩおよび独自の５’ＸｈｏＩ配列を含む
プライマーを使用して、同じ様式で生成した。内部欠失変異体および部位特異的
変異体を、製造業者の推奨により、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して作製した。変異構築物を、新たに
改変された部位の制限消化によって予めスクリーニングし、そして配列決定によ
って確認した。変異構築物を、Ｑｉａｇｅｎの内毒素を含まない単離システムを
使用して精製した。

【０１９０】 （ＰＢＭＣの調製） 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離によ
ってバフィーコートから精製し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＤｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０培
地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１５％ ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中に５×１
０^６細胞／ｍｌで再懸濁し、そして２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲ
Ｌ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および１０
％ ＩＬ−２（Ｈｅｍａｇｅｎ Ｄｉａｇｎｏｃｔｉｃｓ）を補充し、次いで、
１ウェル当たり２ｍｌで１２ウェルのプレートにプレートした。次いで、ＰＢＭ
Ｃを、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌでＴＳＳＴ−１（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）を用いて刺激した。細胞を、３〜３．８×１０^６細胞／ｍｌで培養し
、１週間培養し、次いで、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離に供し、そし
て３×１０^６細胞／ｍｌで、１ウェル当たり３ｍｌで１２ウェルのプレートにプ
レートした。末梢血ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、２週目または３週目に、製造業者のプロ
トコール（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ）に従ってＣＤ８^＋磁性微小ビーズを
用いる枯渇によって単離した。涸渇後、末梢血ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、照射した異質
遺伝子型の全末梢血単核細胞およびＴＳＳＴ−１を用いて刺激した。約１週間後
、細胞を再び刺激し、そして２０時間後にトランスフェクトした。

【０１９１】 ＰＢＭＣを、完全倍地中に２×１０^７細胞／ｍｌで再懸濁し、２５０μｌの細
胞懸濁物を、２５０ボルトかつ９６０マイクロファラッドでＧｅｎｅ Ｐｕｌｓ
ｅｒ １１（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、２５μｇのレポーター構築物および０
．２５μｇのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを発現する共レポーター（ｃｏ−ｒ
ｅｐｏｒｔｅｒ）（ｐＲＬＳＶ４０；Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてトランスフェク
トした。エレクトロポレーションした細胞をプレートし、３７℃で２時間休ませ
、次いで、（最終濃度２５ｎｇ／ｍｌで）ＰＭＡおよび（最終濃度１．５μＭで
）イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて活性化した。活性化の９時間後、細胞
を収集し、リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄し、レポーター溶解緩衝液（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）５０μｌ中で溶解させ、そして各溶解物の２０μｌを、Ｐｒｏｍｅ
ｇａのＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙ
ｓｔｅｍを使用して、製造業者の指示に従って、ＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ
Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７照度計で発光について評価した。

【０１９２】 （ＣＤ４０Ｌプロモーターエレメントの分析） 一連の５’ＣＤ４０Ｌプロモーター欠失を、ＰＣＲ増幅し、そしてホタルルシ
フェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ中にクローニングし、全
てのクローンについての信頼度を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。５’欠失
構築物についてのプロモーター活性を、正常に増殖するＴ細胞へのトランスフェ
クションならびにＰＭＡおよびイオノマイシンを用いた活性化の後に、全長（−
１８６０）ＣＤ４０Ｌプロモーターの活性と比較した。

【０１９３】 以下の表６は、活性化されたＴ細胞中の種々の欠失変異体のプロモーター活性
を示し、これらのうちのいくつかは、Ｓｈｉｍａｄｚｕら、１９９５に記載され
るような、既知の転写因子コンセンサス部位（潜在的なＮＦ−ＡＴおよびＧＡＴ
Ａ−３結合部位を含む）に影響する。

【０１９４】 （表６．５’欠失を有するＣＤ４０Ｌプロモーターの活性）

【０１９５】

【表６】 この結果は、（１）−１８６０と−５２３との間のＣＤ４０Ｌプロモーター領
域の欠失は、プロモーター活性にほとんど、または全く影響を与えなかったこと
；（２）−４２７までのＣＤ４０Ｌプロモーターの欠失は、わずかに上昇したプ
ロモーター活性を生じ、このことは、この領域が、陰性の調節エレメントを含み
得ること示唆すること：および（３）−２８０まで、さらに−２４８まで、なお
さらに−６０まで、そしてなおさらに−２６までのプロモーターの欠失は、る野
生型プロモーターに関連する活性を減少し、このことは、−４２７と−２８０と
の間の、−２８０と−２４８との間の、−８７と−６０との間の、および−８７
と−２６との間のアクチベーター部位の存在を示唆する。

【０１９６】 一連の内部欠失を、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃにおける全長−１８６０プロモータ
ーの状況において作製して、大きなプロモーター領域の欠失が、陽性調節エレメ
ントと陰性調節エレメントの両方を除去し、それによって共同的な効果を生じる
可能性を示す。種々の欠失したＣＤ４０Ｌプロモーター配列を、プロモーターの
ないホタルルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ）にク
ローニングして、そしてＳＶ４０に駆動されるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ制
御プラスミド（ｐＲＬＳＶ４０）と共に増殖したＴ細胞に同時トランスフェクト
した。各構築物についてのホタルルシフェラーゼ活性を、Ｒｅｎｉｌｌａルシフ
ェラーゼ活性に対して正規化し、そして転写開始部位に関連が示される各５’欠
失構築物の長さえい有する全長プロモーター（−１８６０）の活性に関して報告
した。全ての内部欠失クローンを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。次いで、
内部欠失プロモーター構築物を、Ｔ細胞の拡大された培養物にトランスフェクト
し、そして活性を、ＰＭＡおよびイオノマイシンでの活性化後の−１８６０プロ
モーター構築物の活性と比較した。３連で行なった最低２回の独立したトランス
フェクションに対する、平均＋／−平均標準誤差として示される結果を、以下の
表７に提供する。

【０１９７】 （表７．ＣＤ４０Ｌおよびプロモーター活性の内部欠失）

【０１９８】

【表７】 減少したプロモーター活性を生じる内部欠失は、以下を含む：（１）−４０６
〜−３０１領域、野生型に関して活性において３分の１の減少；（２）−３２０
〜−２９１領域、野生型に関して活性において３分の１の減少；（３）−３００
〜−２８１領域、野生型に関して活性において２分の１の減少；（４）−２８０
〜−２２３１領域、野生型に関して活性において３分の１の減少；（５）−２３
０〜−２１１領域、野生型に関して活性において６〜７分の１の減少；（６）−
６６ ＮＦ−ＡＴ部位（欠失−８７〜−６８）の直ぐ上流の配列野生型に関して
活性において４分の１の減少、；（７）−７２〜−４９領域、野生型に関して活
性において２５分の１の減少；（８）−６１〜−４０領域、野生型に関して活性
において４０分の１の減少；および（９）＋９〜＋２９領域（転写開始部位の下
流）、野生型に関して活性の１４％の減少。

【０１９９】 さらに、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃにおける全長ＣＤ４０Ｌプロモーター（−１８
６０〜＋４９）状況内で構築された種々の部位特異的な変異体を、ｐＲＬＳＶ４
０制御プラスミドと共に正常な拡大したＴ細胞に同時トランスフェクトした。各
構築物に対するホタルルシフェラーゼ活性を、全長野生型プロモーターのＲｅｎ
ｉｌｌａルシフェラーゼ活性に関して、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に対
して正規化した（表８）。この表において、既知の転写因子結合部位の位置が示
され、そして３連で行なった最低２回の独立したトランスフェクションに対する
、平均＋／−平均の標準誤差として示されるデータの転写開始部位（＋１）に関
して番号をつけた。

【０２００】 （表８．部位特異的変異およびプロモーター活性）

【０２０１】

【表８】 この結果は、ＣＤ４０Ｌプロモーターの少なくとも４領域が、ルシフェラーゼ
レポーター発現のレベルおよびＤＮＡフットプリンティング研究によって示され
るように、活性化Ｔ細胞における発現に重要であることを示す。これらの結果に
よって活性化Ｔ細胞における発現に重要である示唆されるＣＤ４０Ｌのプロモー
ターの領域の領域は、以下を含む：（１）ヌクレオチド−３０６の近傍の部位（
配列番号１２）、これらの特異的な変異は、ＣＤ４０Ｌプロモーター活性の４分
の１の下方制御を生じる；（２）−２３０〜−２１１領域（配列番号１３）の欠
失に基く、−２３０と−１９６との間の領域（配列番号１４）、これは、ＣＤ４
０Ｌプロモーター活性の６〜７分の１の下方制御を生じ、そして−２２０〜−２
１４、−２１４〜−２０８、−２０８〜−２０２、または−２０２〜−１９７の
部位特異的な変異は、プロモーター活性の２．５〜４分の１の下方制御を生じた
；および（３）欠失変異の発現レベルに基づく、−７７と−４０との間の領域（
配列番号１５）、ここで、−７２〜−４９または−６１〜−４０の内部欠失は、
それぞれ、２５分の１または４０分の１の下方制御を生じた。さらに、−４８と
−５４との間に位置する以前同定されていない部位との、複合性のＡＰ−１／−
６６ ＮＦ−ＡＴ部位における特異的な変異は、−４８〜−５４部位を介する転
写の活性化に対する寄与を示す（表７および表８を参照のこと）。

【０２０２】 いくつかのＣＤ４０Ｌプロモーター領域は、ＣＤ４０Ｌプロモーターの調節領
域に１より多い転写因子に結合し、そしてＤＮＡ結合化合物を上記のＣＤ４０Ｌ
プロモーターの調節領域に標的化し、転写因子ＤＮＡ相互作用の調節を介して、
ＣＤ４０Ｌプロモーター媒介転写を阻害するための手段を提供する、上記される
。

【０２０３】 （実施例３） （Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）） 直線化単位長（ｕｎｉｔ−ｌｅｎｇｔｈ）ＨＢＶゲノムフラグメントを、コア
ｐｒｅＳ１またはＸプロモーターのいずれかが極度の３’末端に存在するように
、ウイルスゲノム配列の１．３コピーを含むＨＢＶプラスミドから調製した。こ
のフラグメントは、定方向にレポーター構築物をクローニングした場合、発現を
駆動するために、レポーターコード配列のすぐ上流にプロモーターエレメントを
置換した。これらの野生型コアＸおよびｐｒｅＳ１プロモーター構築物のルシフ
ェラーゼレポーター活性を、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、２２．１．５およびＨｅｐ
ＡＤ３８のような肝臓起源の細胞株における一過性のトランスフェクション実験
によって評価した。部位特異的変異またはリンカースキャナー変異によって調製
される、次の変異プロモーター構築物は、当該分野に公知の突然変異誘発方法を
使用してこれらの野生型クローンから調製した。

【０２０４】 （ＨＢＶコアプロモーター） ルシフェラーゼレポーター構築物を、直ぐ上流に位置し、そしてレポーターの
発現を駆動するコアプロモーターを有する、ＨＢＶプロモーターの直線化全長コ
ピーを用いて構築した。標的化された配列変異の１５ヌクレオチドのブロックを
含む変異原性のプライマーを、Ｍｏｒｐｈ^ＴＭ（５’プライム〜３’プライム、
Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）突然変異誘発プロトコルまたはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^{Ｔ Ｍ} （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）突然変異誘発プロトコル
のいずれかを使用して一連のリンカースキャナー変異プロモーターレポーターク
ローンを産生するように設計した。

【０２０５】 突然変異誘発に対して抵抗性であることが見出されたプロモーターの標的化セ
グメントを、７〜８個のヌクレオチドからなる変異のより小さなブロックにさら
に細分した。この一連のリンカースキャナークローンは、コアプロモーターセグ
メントの完全長にわたった。変異原性プライマーをまた、使用して、肝細胞核因
子部位、ＨＮＦ３およびＨＮＦ４を含む、既知の転写因子結合部位の部位特異的
変異構築物を構築した。

【０２０６】 コアプロモーターにおける潜在的に重要な調節エレメントを決定するために、
リンカースキャナー分析を、構築された一連の全身性の変異クローンを使用して
実施した。各リンカースキャナー変異構築物を、肝臓細胞由来の細胞株ＨｅｐＧ
２およびＨｕＨ７におけるルシフェラーゼレポーター活性に基づいて、一過性の
トランスフェクション実験のプロモーター活性について評価した。ＨＢＶの安定
にトランスフェクトされた細胞株２２．１．５およびＨｅｐＡＤ３８をまた、リ
ンカースキャナー分析に使用した。野生型に関して相対的なルシフェラーゼレポ
ーター活性の増大または減少は、遺伝子転写の制御に重要な潜在的な制御エレメ
ントの存在を示す。

【０２０７】 目的の３つの領域を、リンカースキャナー分析によって同定した。ドメイン５
、ドメイン８／９およびドメイン１３における変異は、プロモーター活性の４〜
１０分の１の減少を生じた（表９）。全ての３領域は、文献に以前報告されたｃ
ｉｓ−エレメントと整列する。ドメイン５は、ＨＮＦ４転写因子結合部位に対応
する配列（ＡＧＧＡＣＴＣＴＴＧＧＡ 配列番号１８）を含む。ドメイン８／９
は、ＨＮＦ３転写因子結合部位に対応する配列（近位、ＨＮＦ３−２、ＧＡＣＴ
ＧＴＴＴＧＴＴＴ、配列番号１７）を含む。これらのタンパク質因子部位の両方
は、ＨＢＶコアプロモーターについての重要な活性化エレメントとして記載され
る。ドメイン１３変異は、プロモーターのＴＡＴＡボックス配列（ＣＡＴＡＡＡ
）を消滅する。第２のＨＮＦ３部位（ＨＮＦ３−１、ドメイン６）は、ドメイン
８／９に位置する部位に上流に存在することが報告された。しかし、遠位のＨＮ
Ｆ３部位の変異は、プロモーター活性における悪影響を全く示さなかった。

【０２０８】 （表９ ＨＢＶコアプロモーターのリンカースキャナ変異クローンのレポータ
ー分析）

【０２０９】

【表９】 表１０において示されるように、いくつかのさらなる領域の変異は、プロモー
ター活性において、４分の１よりも大きい減少を示した。これらの領域（ドメイ
ン５；ドメイン８／９（ＨＮＦ３転写因子結合部位）；およびドメイン１３（Ｃ
ＡＴＡＡＡボックス））は、文献において報告されたｃｉｓ−エレメント（それ
ぞれ、ＨＮＦ−４／ＨＮＦ−３、ＨＮＦ−３／Ｓｐ１、およびＴＡＴＡボックス
）と整列するようであり、近位ＨＮＦ−３部位が１つの重要なエレメントとして
示された。表９において示される発現研究の結果は、ドメイン８（配列番号１９
）；ドメイン８／９−１（配列番号２０）；およびドメイン１３（配列番号２１
）は、転写活性化に関連することを示唆する。

【０２１０】 （表１０ ＨＢＶコアプロモーターのＨＮＦ３およびＨＮＦ４部位の部位指向
性変異のレポーター分析）

【０２１１】

【表１０】 ＴＡＴＡボックスおよびＨＮＦ４、ならびにコアプロモーター活性のために最
も重要な制御エレメントとしての近位ＨＮＦ３部位の同定に続いて、ＴＡＴＡ結
合タンパク質（ＴＢＰ）およびＨＮＦ転写因子の結合の結果としての転写活性化
を、さらに研究した。結合するこれらのタンパク質因子の欠損は、プロモーター
の下方調節を生じることが理解される。

【０２１２】 低分子ＤＮＡ結合化合物を、共有に係るＵＳＳＮ ０９／５１８，２９７（２
０００年３月３日出願）においてさらに記載されるように、その同族のヌクレオ
チド結合配列に結合するタンパク質因子の干渉および／または置換のいずれかに
よって、野生型ＨＢＶコアプロモーターおよび操作されたＨＢＶコアプロモータ
ーからの転写レベルを変更するこの化合物の能力を試験するために、利用した。
この結果は、プロモーター中の化合物の結合部位を、操作し、それによって、こ
のプロモーターに作動可能に連結されたコード配列の遺伝子発現を調節する手段
として役立てることを示唆する。

【０２１３】 （ｐｒｅＳ１プロモーター） ルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ上流に
位置するｐｒｅＳ１プロモーターと共に、ＨＢＶゲノムの全長コピーを含む、こ
のルシフェラーゼレポーター構築物を、作製する。野生型ルシフェラーゼレポー
タークローン（ＰｒｅＳｐＬｕｃ）をテンプレートとして使用して、部位指向性
変異誘発を、Ｍｏｒｐｈ^ＴＭ（５’Ｐｒｉｍｅ→３’Ｐｒｉｍｅ、Ｂｏｕｌｄｅ
ｒ，ＣＯ）方法を使用して実行し、既知の転写因子結合部位中に４つの変異体、
および８つの１５ｂｐリンカースキャナ（ｌｉｎｋｅｒ ｓｃａｎｎｅｒ）変異
体を生成した。この変異誘発した構築物を、Ｈｅｐ３ＡＤ３８に一過性にトラン
スフェクトし、そして上記のように、プロモーター活性を試験した。表１１は、
変異分析およびルシフェラーゼ発現を駆動する変異されたプロモーターの能力の
結果を示す。

【０２１４】

【表１１】 公知の転写因子結合部位の中で、ＨＮＦ１部位は、ＨＮＦ１変異体の活性によ
って確証が得られる（１６分の１に活性が低下）ように、ＰｒｅＳ１プロモータ
ー活性に対して最も重要であるようである。ドメイン２部位（配列番号２３）は
、ＨＮＦ１部位とオーバーラップし、そしてドメイン２変異体は、１３分の１に
活性が低下した。ドメイン６変異体は、３分の１に活性が低下したことを示した
が、これは、ドメイン６部位（配列番号２４）がまた、転写活性化に関与してい
ることを示唆する。ＨＮＦ３結合部位、Ｓｐ１結合部位、およびＴＢＰ結合部位
の変異は、レポーター活性が２分の１〜３分の１に低下することを生じた。ＨＮ
Ｆ１部位およびＴＢＰ部位で２重の変異を有する構築物においては、さらなるレ
ポーター活性の低下は存在しなかった。対照的に、ＨＮＦ３またはＴＢＰのいず
れかでの、Ｓｐ１の２重変異体において、ＨＮＦ３単独の変異、Ｓｐ１単独の変
異またはＴＢＰ単独の変異の構築物において観察されたレポーター活性に対して
さらなる減少が存在した。

【０２１５】 このＨＮＦ１部位をさらにマップするために、１ｂｐのオーバーラップを伴っ
た４つの連続した４ｂｐの変異体を構築し、ルシフェラーゼレポーター構築物中
のプロモーター活性について試験した（表１２）。

【０２１６】

【表１２】 このＨＮＦ１結合部位にわたる一連の点変異を実施し、この変異体を一過性の
トランスフェクションに続いてのルシフェラーゼ発現について試験した。７つの
変異体のうち４つの変異体は、以下の表１３に示されるように、野生型の活性の
うち１４〜４２％を保持した。

【０２１７】

【表１３】 ＤＮＡ結合特性を有するリガンドの特徴づけのための蛍光に基づくアッセイを
実行し、この結果を、図２に示す。ハイブリダイゼーション安定化アッセイ（Ｈ
ＳＡ）を、５’蛍光標識１本鎖ＤＮＡおよびＤＮＡの３’Ｄａｂｓｙｌ標識相補
鎖を使用して、実行した。このオリゴヌクレオチドを、リガンドが結合してこの
２本の鎖が２重鎖化し蛍光シグナルを消光するまで、室温において１本鎖を保持
するように設計した。次いで、このリガンドの直接の結合は、より好ましい配列
２重鎖の存在によって、非消光化され得る。２重鎖が、特定のリガンドに対して
優先的な部位を有さない場合、このシグナルは消光されたままである。図２は、
６つの異なる２重鎖を、ＤＮＡ結合特性を有するリガンドの特徴付けのための蛍
光に基づくアッセイを使用して、特定のリガンドに対して試験した研究の結果を
示す。ハイブリダイゼーション安定化アッセイ（ＨＳＡ）を、５’蛍光標識１本
鎖ＤＮＡおよびＤＮＡの３’Ｄａｂｓｙｌ標識相補鎖を使用して、実施した。こ
のオリゴヌクレオチドを、リガンドが結合してこの２本の鎖が２重鎖化し蛍光シ
グナルを消光するまで、室温において１本鎖を保持するように設計した。次いで
、このリガンドの直接結合は、より好ましい配列２重鎖の存在によって、非消光
化され得る。２重鎖が、特定のリガンドに対して優先的な部位を有さない場合、
このシグナルは消光されたままである。図２は、６つの異なる２重鎖を、特定の
リガンドに対して試験した研究の結果を示す。この研究において、蛍光およびｄ
ａｂｓｙｌで、２５ｎＭおよび３５ｎＭにて標識したオリゴを、７５ｎＭの２１
Ｘリガンドで、２重鎖化した。次いで、種々の他の２重鎖を、０〜６００ｎＭで
添加し、このリガンドの配列の結合傾向を決定した。反応物は、２２５μｌの１
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
中であり、そして室温で一晩平衡化した。

【０２１８】 最も大きい蛍光の回復を可能にする配列は、このリガンドに対して好ましい配
列であると考えられる。２１Ｘに対する結合の傾向について観察された順番は、
以下であった：ＨＮＦ１−２１Ｘ＞ＴＢＰ野生型＞ＨＮＦ１野生型＞ＨＮＦ３野
生型＞ＴＢＰ変異体＞ＨＮＦ１変異体（図２）。これらの結果は、ＴＢＰ変異体
オリゴおよびＨＮＦ１変異体オリゴの両方において、Ａ／Ｔ塩基の大多数がＧ／
Ｃ塩基に変化している事実と一貫性がある。

【０２１９】 （ＨＢＶ Ｘプロモーター） ＨＢＶ Ｘプロモーターを、コアプロモーターについて記載された欠失実験お
よびリンカースキャニング実験に類似の欠失実験およびリンカースキャニング実
験によって分析した。

【０２２０】 ルシフェラーゼレポーター構築物を、レポーターコード配列の直ぐ上流に位置
するＨＢＶゲノムおよびＨＢＶ Ｘプロモーター（図３）の全長コピーを用いて
構築した。プロモーター構築物を、ＨＢＶ Ｘプロモーターまたは既知の転写因
子結合部位由来の２１塩基対の変異した配列の連続したブロックを用いて調製し
た。

【０２２１】 変異体構築物を、肝腫瘍由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＨｅｐＧ２、ならびにＨＢＶ
：２２．１．５およびＨｅｐＡＤ３８で安定にトランスフェクトした細胞株）中
に、トランスフェクトし、そしてルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を、Ｈ
ＢＶプロモーター活性を決定するために分析した。表１４に示されるように、ド
メイン３、ドメイン４、およびドメイン６における変異によって、３つの異なる
細胞株において試験した場合に、２８〜５１％の野生型活性を生じた。

【０２２２】

【表１４】 ドメイン３からドメイン６についての野生型配列は、以下の通りである：

【０２２３】

【化２】 。

【０２２４】 ＨｅｐＡＤ３８細胞株にて評価した場合、２つの２重変異体（ドメイン３とド
メイン６、およびドメイン４とドメイン６）によって、野生型コントロールと比
較して、活性の７分の１〜９分の１への低下が生じた（表１５）。

【０２２５】

【表１５】 さらなるＨＢＶ−Ｘプロモーターレポーター構築物を、様々な既知の転写因子
結合部位における変異で作製し（Ｇｕｓｔｉｎ Ｋら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９
３，６５３−６６０，１９９３；Ｇｕｏ Ｗら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１；
Ｎａｋａｍｕｒａ Ｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１，５３３−５４０，１９９
２）、そしてルシフェラーゼレポーター活性について評価した。この研究の結果
（表１６で提供される）によって、ＥＦ−Ｃ因子結合部位およびＥ因子結合部位
が、ＨＢＶ Ｘプロモーターの活性について、重要であること示唆される。

【０２２６】

【表１６】 全てのＨＢＶ−Ｘプロモーターレポーター構築物が、ＨＢＶゲノム全体を含ん
だ場合を考慮して、他のＨＢＶプロモーターから読み出された可能性を排除する
ために、２つのさらなる構築物を作製した：Ｘエンハンサー／プロモーターレポ
ーター（ＸｐＬｕｃ２００，表１７）、およびＸエンハンサー／プロモーターレ
ポーターを有さないＨＢＶゲノム全体（Ｘｐ（−）Ｌｕｃ３０００，表１７）。
ＸｐＬｕｃ２００構築物を、順方向プライマーおよび逆方向プライマー（それぞ
れ、配列番号２９および配列番号３０である）を用いて、ドメイン３、ドメイン
４、およびドメイン１８の各々由来のクローンを増幅することによって作製し、
その後ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃベクター中にクローニングした。「Ｘｐ（−）Ｌｕｃ
３０００」構築物を、野生型構築物ＸｐＬｕｃ（２９−１−５）をＭｏｒｐｈ^{Ｔ Ｍ} 法による部位特異的変異誘発に供することによって作製した。全ての「ＸｐＬ
ｕｃ２００」構築物（３．６、４．９、１８．１３、および２９−１−５）は、
各全長構築物の活性と比較して１．５〜２倍のプロモーター活性を提示したが、
このＸｐ（−）Ｌｕｃ３０００構築物（２９−１−５（−Ｘｐ））は、プロモー
ター活性を示さなかった。これらの結果は、表１４および表１６に提示されたレ
ポーター活性は、ＨＢＶ Ｘプロモーター単独に対する効果を反映しており、上
流のＨＢＶプロモーター（Ｓｐ、ｐｒｅＳｐ、またはＣｐ）に起因していないと
いう結論を支持する。

【０２２７】

【表１７】 （実施例４） （バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）） 改変したｐＡＭ４０１プラスミド（ＡＴＣＣ）を、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔ
ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種における増殖および維持を可能にするバックグラウンドに
おけるルシフェラーゼ遺伝子の上流のＶＲＥプロモーター配列を含むように設計
した。ｖａｎＨプロモーター（配列番号３１）を、ＶＲＥ株ＣＳＵＣ４（これに
、付加されたＮｃｏＩ部位およびＳａｌＩ部位を有する）からＰＣＲ増幅した。
ｐＡＭ４０１プラスミドをＸｂａＩおよびＳａｌＩを使用して切断し、そしてＸ
ｂａＩ〜Ｎｃｏｌを切断し、そしてｖａｎＨプロモーターをこの構築物に組み込
むことによって、ｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から単離した蛍ルシ
フェラーゼ遺伝子に三重連結した。

【０２２８】 形質転換体を、ＰＣＲ増幅に続いて制限分析によってスクリーニングし、そし
て得られたプラスミドを、Ｌ−スレオニン処理Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ株ＣＳ
ＵＣ−４にエレクトロポレートした。

【０２２９】 ＶＲＥプロモーター領域の部位特異的変異誘発を、コンセンサスプロモーター
配列の短い８〜１０ｂｐ領域（リン酸化ＶａｎＲフットプリント内の−３５コン
センサス結合部位を含む）を、系統的に変更することによって実施した（Ａｒｔ
ｈｕｒら、１９９２）。

【０２３０】 Ｍ２−Ｍ２１と称される２０のリンカースキャニング変異体を作製し、そして
核酸構築物（ルシフェラーゼ遺伝子の上流のＶＲＥプロモーター配列を含む）を
、ｐＲＬＵＣ親ベクターにサブクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉに形質転換
した。図７は、ｖａｎＨプロモーター変異体Ｍ２−Ｍ２１の配列を示し、ここで
、この図に示される元々のｖａｎＨプロモーター配列の１０ヌクレオチドの各群
を、変異体配列と置き換えた。例えば、Ｍ２において、ＣＣＣＧＧＧＧＧＧＣ配
列を、野生型ＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡ配列の代わりに挿入した。変異の位置および
対応するルシフェラーゼ活性を、表１８に示す。

【０２３１】 選択されたプロモーター変異体のルシフェラーゼ発現を、発現に対する改変プ
ロモーターエレメントの効果がこれらの株の間で一致するか否かを確認するため
に、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓの３つの臨床株において分析した。ＣＳＵＣ−４
（アッセイされた最初の株）、ＵＣＤ−３およびＵＬ−１７８を、分析において
使用した。このＭ９クローンは、一貫して、試験された変異体の最も高いルシフ
ェラーゼ活性を生じた。他の変異体の間で、Ｍ８もまた、誘導に対する一貫した
効果を有した。（表１８を参照のこと）。

【０２３２】 （表１８．ｖａｎＨプロモーター変異体およびレポーター活性）

【０２３３】

【表１８】 各リンカースキャナープロモーター変異体を活性について試験し、アップレギ
ュレーションおよびダウンレギュレーションの両方が観測された。最も大きな減
少は野生型活性の０％までであり、そして最も大きな増加は、野生型活性の１７
３７％であった。リン酸化ＶａｎＲ（Ｍ２−Ｍ８）によってフットプリントされ
ることが報告された領域の全ての変異体は、減少した活性を示した。増加した活
性を、ヌクレオチド−３０〜＋２０に広がる変異体（Ｍ９−Ｍ１３）において観
察し、このことは、この領域のレプレッサー結合部位の可能性を示唆する。特に
興味深いのは、Ｍ６（配列番号３２）およびＭ８（配列番号３３）に対応する推
定アクチベーター配列、ならびにＭ１２（配列番号３４）に対応する推定レプレ
ッサー配列である。

【０２３４】 （実施例５） （アンドロゲンレセプター） ヌクレオチド−６０００〜＋１１００からのアンドロゲンレセプタープロモー
ター（図８Ａ−Ｃ、配列番号３５）を、ＧｅｎＢａｎｋ配列を使用するＰＣＲに
よってゲノムＤＮＡからクローニングし、そして後の一過的なトランスフェクシ
ョンのためにｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした
。

【０２３５】 大きな一連の欠失構築物を、一過的なトランスフェクションの後に、アンドロ
ゲン依存性前立腺細胞株（ＬＮＣａＰ）において作製しそして試験した。

【０２３６】 欠失構築物を、以下のＰＣＲプライマー対を使用して、作製した：−６０００
＋１構築物については、（配列番号３６）および（配列番号３７）；−４０００
＋１構築物については、（配列番号３８）および（配列番号３９）；−２０００
＋１構築物については、（配列番号４０）および（配列番号４１）；−２０００
＋１１００構築物については、（配列番号４２）および（配列番号４３）；−２
００＋１構築物については、（配列番号４４）および（配列番号４５）；−２０
０＋１００構築物については、（配列番号４６）および（配列番号４７）；−４
００＋１構築物については、（配列番号４８）および（配列番号４９）；−３０
０＋１構築物については、（配列番号５０）および（配列番号５１）；−１５０
＋１構築物については、（配列番号５２）および（配列番号５３）；−１００＋
１構築物については、（配列番号５４）および（配列番号５５）；−５０＋１構
築物については、（配列番号５６）および（配列番号５７）；−２００＋１２５
構築物については、（配列番号５８）および（配列番号５９）；−２００＋７１
構築物については、（配列番号６０）および（配列番号６１）；ならびに−２０
０＋５０構築物については、（配列番号６２）および（配列番号６３）。

【０２３７】 以下の欠失構築物を、ルシフェラーゼ活性について試験し、これらの結果を、
括弧の中に、−２００＋１コントロールの％として表した：−６０００＋１（３
８％），−４０００＋１（３１％），−２０００＋１（４５％），−４００＋１
（９３％），−３００＋１（１００％），−２００＋１（１００％），−１５０
＋１（１０９％），−１００＋１（６２％），−５０＋１（２８％），−２００
０＋１１００（１００％），−２００＋１１００（４５９％），＋１＋１１００
（１１４％），−２００＋２００（５６２％），−２００＋１５０（４７４％）
，−２００＋１２５（３１４％），−２００＋１００（１６８％），−２００＋
７１（１５３％），−２００＋５０（８７％）および基本的なプロモーター構築
物（５％）。

【０２３８】 ＡＲ＋細胞株ＬＮＣａＰにおける一過的なトランスフェクションアッセイにお
ける結果は、レプレッサー、ならびにヌクレオチド−１５０〜−１００（ヘモプ
リンストレッチ）、−１００〜−５０（ＳＰ１部位）、および−５０〜＋１（へ
リックス−ループ−へリックス結合部位）の複数のアクチベーター部位を示す。

【０２３９】 これらの結果は、以下を示す：（１）未翻訳領域（ＵＴＲ）（＋１〜＋１１０
０）は、最適な活性のための２つの重要な領域（＋１２５と＋１００との間の部
位および＋７１と＋５０との間の部位）を含む；（２）レプレッサー部位が、−
２０００と−４００との間に存在し得る；そして（３）近接プロモーター領域の
活性が、−１５０と−１００との間の配列に由来し（約２倍）、そして−１００
と−５０との間の配列に由来し（さらに２〜３倍）、そして−５０〜＋１の配列
に由来する（さらに、４〜５倍）。

【０２４０】 以下のようなさらなる部位特異的変異体を、作製した：デルタＨＰ（ホモプリ
ンストレッチの４０ｂｐの内部欠失）、デルタＨＰ（５’）、デルタＨＰ（３’
）、ＨＬＨ−ｕｓ、ＳＰＩ、ＨＬＨ−ｄｓ、ＨＬＨ−ｄｓの３’１０ｂｐ（ＨＬ
Ｈ−３）、ＨＬＨ−ｄｓの５’１０ｂｐ（ＨＬＨ−５）、ならびにデルタＨＰお
よびＨＬＨ−ｄｓの二重変異体（デルタＨＰ／ＨＬＨ−ｄｓ）（全て、２００＋
１構築物に関係する）。ＬＮＣａＰ細胞における一過的なトランスフェクション
研究の結果（−２００＋１コントロールの％として表現される）を、表１９に示
す。

【０２４１】 （表１９．プロモーター構築物のルシフェラーゼ活性）

【０２４２】

【表１９】 これらの結果は、以下を示唆する：（１）ホモプリン領域の５’部分は、−１
５０〜−１００の活性の全てを表す；（２）下流へリックス−ループ−へリック
ス配列の３’領域は、さらに２倍の活性を含む；そして（３）下流へリックス−
ターン−へリックス部位は、１．５倍の活性を含む。

【０２４３】 特に興味深いのは、ＨＬＨ−ｄｓおよびＨＬＨ−３欠失変異体ならびに５’Ｈ
Ｐ変異体であり、これらは、アクチベーター部位の存在を示すルシフェラーゼ活
性の有意な減少を生じた。これらの変異体についての対応する野生型配列を、各
々、配列番号６４、配列番号６５および配列番号６６として表す。

【０２４４】 （実施例６） （Ｈｅｒ２） ヒトＨｅｒ２プロモーターの２０００−ｂｐフラグメント（図９、配列番号６
７）を、以下のオリゴヌクレオチドを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した：
５’−ＧＣＡＣＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＴＡ−
３’（配列番号６８）および ５’−ＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＧＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧ
ＧＧ−３’（配列番号６９）。

【０２４５】 この精製したフラグメントを、乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２低発現）およ
びＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＨＥＲ２高発現）における一時的なトランスフェクシ
ョンアッセイにおいて使用するために、ベクターｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）のＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。

【０２４６】 さらに、いくつかの欠失構築物を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ中にクローニングさ
れた２ｋｂプロモーターフラグメントを含むＨｅｒ２ルシフェラーゼレポーター
において作製した。このレポーターを、ＭＣＦ７およびＺＲ７５細胞株に一時的
にトランスフェクトした。表２０は、下線で示される改変された配列部分を有す
る各プロモーター構築物についてのレポーター活性を示す。これらの結果は、Ｈ
ｅｒ２プロモーターについての重要な調節部位がヌクレオチド−１２５と−５０
との間に存在することを示す。

【０２４７】

【表２０】 重要な部位をさらに描写するために、一連のリンカースキャナーＨｅｒ２ルシ
フェラーゼレポーター変異体を、ヌクレオチド−１３０〜−５５から作製した。
１００８５、９０７５、８０６５、および７０５５と命名したこれらの構築物（
変異した塩基を示す；例えば、１００８５は−１００〜−８５の塩基が変異した
ことを示す）をＺＲ７５およびＭＣＦ７細胞における一時的なトランスフェクシ
ョンにおいて試験した。この結果を野生型プロモーターに対する％活性として表
２３に示した。

【０２４８】 この結果は、−９０〜−７５の領域がＨｅｒ２プロモーターの活性に重要であ
ることをはっきりと意味する。

【０２４９】 Ｈｅｒ２プロモーターの種々の領域において変異を作製した。この領域として
、周囲のＡＴリッチ領域が挙げられ、推定ＴＡＴＡボックス（ＴＢ「ＴＡＴＡＡ
ＧＡ」）、推定ＴＡＴＡボックス

【０２５０】

【化３】 、推定ＴＡＴＡボックスの下流のＡＴストレッチ

【０２５１】

【化４】 、推定ｅｔｓ部位（ＥＰ）、周囲のＡＴリッチ領域の二重変異が挙げられ、そし
て推定ＴＡＴＡボックス

【０２５２】

【化５】 および推定ｅｔｓ部位（ＴＢＥＰ、「ＧＡＧＧＡＡ」）ならびに−２１５までの
欠失が挙げられる。配列の変異は下線で示される。

【０２５３】 ルシフェラーゼレポーター構築物を、レポーターコード配列のすぐ上流の種々
のＨｅｒ２プロモーター配列を用いて調製した。このレポーターを、ＭＣＦ７お
よびＺＲ７５細胞に一時的にトランスフェクトした。得られたルシフェラーゼ発
現を野生型の％として報告した（表２１）。

【０２５４】

【表２１】 これらのデータは、ヌクレオチド−２１５の上流の配列が調節のために重要で
ないことを示唆する。表２１に示されるように、ＴＡＴＡボックスまたはｅｔｓ
部位の変異は、転写における穏やかな減少を引き起こす。このことは、レポータ
ー部位が、ＴＡＴＡボックスのすぐ下流に存在することを示唆する。推定ＴＡＴ
Ａボックスおよび推定ｅｔｓ部位付近の配列を以下に示す。

【０２５５】

【化６】 さらなる欠失構築物−５０を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ中にクローニングされた
２ｋｂプロモーターフラグメントを含むＨｅｒ２レポーターにおいて作製し、そ
して−２１５欠失と比較した。このレポーターを、ＭＣＦ７およびＺＲ７５細胞
株に一時的にトランスフェクトした。これらの結果は、Ｈｅｒ２プロモーターに
ついての重要な調節部位が−２１５〜−５０領域に存在することを示す。

【０２５６】 いくつかのさらなる欠失構築物を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ中にクローニングさ
れた２ｋｂプロモーターフラグメントを含むＨｅｒ２ルシフェラーゼレポーター
において作製した。このレポーターを、ＭＣＦ７およびＺＲ７５細胞株に一時的
にトランスフェクトした。表２２に示される結果（野生型ルシフェラーゼ活性％
として表わされる）は、−１２５と−５０との間のＨｅｒ２プロモーターの領域
が重要な調節部位を含むことを示す。

【０２５７】

【表２２】 ＺＲ−７５およびＭＣＦ−７細胞において重要であることが同定された配列が
また、他の乳癌細胞株においても重要であるか否かを決定するために、さらなる
実験を実施した。ＺＲ−７５またはＭＣＦ−７細胞のいずれよりも高レベルでＨ
ｅｒ２を過剰発現する２つの細胞株ＳＫＢＲ−３（ＳＫ）およびＢＴ−４７４（
ＢＴ）を選択した。３つの一時的なトランスフェクション体からのデータの要約
を、ＺＲ−７５細胞（ＺＲ）において平行して実施した研究の結果と合わせて、
以下の表２３に示す。

【０２５８】

【表２３】 ３つの細胞株におけるルシフェラーゼ発現アッセイの比較される結果は、以下
のことを示唆する：（１）Ｈｅｒ２プロモーターは、ＢＴ−４７４細胞において
よりもＳＫＢＲ−３細胞において４〜５倍強く、そしてＺＲ７５−１細胞におい
てよりも３〜４倍強い；（２）ＴＡＴＡ−Ｂａｍ変異は、他の２つの細胞株にお
いてよりもＳＫＢＲ−３細胞においてより小さいアップレギュレーションを生じ
る；（３）ＣＣＡＡＴボックスは、ＺＲ７５−１（１／２倍低下）またはＢＴ−
４７４（１／２倍未満の低下）細胞のいずれにおいてよりもＳＫＢＲ−３（１／
４〜１／５倍減少）においてより重要である；そして（４）ＣＣＡＡＴボックス
はＨｅｒ２の調節に適切な標的であり得る。

【０２５９】 上記で提供される結果に基づき、Ｈｅｒ２の調節された発現のための目的の配
列は、−２３〜−１９の推定ＴＡＴＡボックスの下流のレプレッサー配列「ＧＡ
ＡＴＧＡＡＧＴＴ」（配列番号７０）；アクチベーター要素およびレプレッサー
要素の両方を有する複合調節領域「ＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＡＴＣ」（配列番
号７１）、およびＴＡＴＡボックス／ｅｔｓ部位「ＧＡＧＧＡＡＧＧＴＡＴＡＡ
」（配列番号７２）（ここで、ｅｔｓ配列は「ＧＡＧＧＡＡＧ」であり、そして
ＴＡＴＡボックス配列は「ＴＡＴＡＡ」である）である。

【０２６０】 （実施例７） （β−ラクタマーゼ（Ｂｌａ）プロモーター） 以下に示す天然のβ−ラクタマーゼプロモーターＰ３（配列番号７３）は、β
−ラクタマーゼ（ｂｌａ）のコード配列付近に存在し、ＡＴＧ翻訳開始コドンに
対して３５塩基５’側で転写を開始する。Ｐ３プロモーターは、−１０領域にＰ
ｒｉｂｎｏｗボックス（ＧＡＣＡＡＴＡ）を、そして−３５にコンセンサス配列
（ＴＴＣＡＡＡ）を含む。−３５、−１０、開始部位、およびリボソーム結合部
位を、それぞれ、５’から３’の順で、以下に下線として示す。

【０２６１】

【化７】 （天然のβ−ラクタマーゼプロモーターＰ３、配列番号７３） Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼプロモーター構築物を、ｐＡＣＹＣ１７７ベク
ター中に調製し、ここで、野生型β−ラクタマーゼプロモーターで駆動されるＲ
ｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ構築物を、ｐＢｌａ−ｒｌｕｃと称した。コントロ
ールのプロモーターがない構築物を、ｐＮｕｌｌ−ｒｌｕｃと称し、そしてルシ
フェラーゼネガティブ構築物を、ｐＢｌａ−ｂｌａと称した。

【０２６２】 天然のＰ３ｂｌａプロモーターのＢｌａプロモーター変異体（「Ｍ＃」と称す
る）を、全ｂｌａプロモーター配列の塩基対（ヌクレオチド−１０１から＋４３
）を合成的に変更することによって作製した。一般的に、変異体を、Ｑｕｉｃｋ
Ｃｈａｎｇｅによって全Ｂｌａプロモーターの異なる位置において６〜１２塩
基対の変異を導入することによって、プリンをピリミジンと置換すること（逆も
また同じ）によって、および配列に制限部位を導入することによって、作製した
。

【０２６３】 種々のＢｌａ変異体のルシフェラーゼ活性を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕ
ｅ複製から調製した溶解物中で測定し、そして野生型ｐＢｌａ−ｒｌｕｃの活性
と比較した。有意に減少したルシフェラーゼ活性を示した変異体としては、−３
５領域（−４１〜−３０、Ｍ６）；−１０領域（−１７〜−６、Ｍ８）；開始部
位（−５〜＋７、Ｍ９）；および＋２０〜＋３１（Ｍ１１）が挙げられ、これら
は、それぞれ、以下の表２４に示すように野生型の２４％、２９％、１５％、お
よび２％に低下したルシフェラーゼ活性を示した。

【０２６４】 （表２４．Ｂｌａプロモーター変異体の配列およびルシフェラーゼプロモータ
ー活性）

【０２６５】

【表２４】 変異体Ｍ６（−４１〜−３０；配列番号７５）および変異体Ｍ２１（−３５〜
−３０）のルシフェラーゼ活性によって、それぞれ２４％および２８％へのルシ
フェラーゼ活性における低下によって示されるように、−３５領域がプロモータ
ー活性に重要であることが明らかになった。変異体Ｍ８（−１７〜−６；配列番
号７６）および変異体Ｍ３０（−８〜−３）のルシフェラーゼ活性によって、２
９％または２４％へのルシフェラーゼ活性の低下によって示されるように、−１
０ｐｒｉｂｎｏｗボックス領域もまた、重要であることが明らかになった。ルシ
フェラーゼ活性に重要な２つのさらなる領域は、それぞれ、１５％および２％へ
のルシフェラーゼ活性の低下によって示されるように、開始領域（Ｍ９；配列番
号７７）およびリボソーム結合部位領域（Ｍ１１；配列番号７８）である。

【０２６６】 改変ＢｌａＭＴプロモーターの−１０１〜＋３５領域の配列（配列番号７４）
を以下に示し、小文字は、天然のＰ３ Ｂｌａプロモーター配列に対する変異を
示す。

【０２６７】

【化８】 （改変ＢｌａＭＴプロモーター、配列番号７４）。

【０２６８】 （表２５．ｐＢｌａＭＴおよび変異ｐＢｌａＭＴ構築物の配列）

【０２６９】

【表２５】 表２５は、種々の変異ＢｌａＭＴプロモーター構築物の位置および配列を示す
。小文字は、ｐＢｌａＭＴ配列に対する変異を示し、下線は、潜在的な化合物結
合部位の位置を示す。共有に係るＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／５２１７９に詳述
されるように、種々のｐＢｌａＭＴ変異体構築物（例えば、ｐＢｌａＭＴ、ｐＢ
ｌａＭＴ（＋１）、ｐＢｌａＭＴ（−３５）およびｐＢｌａＭＴ（−１０））中
の開始部位の直ぐ下流の配列がＤＮＡ結合化合物によって標的化された場合、各
プロモーターの活性がアップレギュレートされた。

【０２７０】 本明細書中に示すデータは、種々のプロモーターの調節領域の分析を提供し、
そして一旦プロモーターの調節領域が同定されると、この調節領域が、調節領域
に作動可能に連結したコード配列の調節された発現をもたらすために、細胞因子
（ネイティブに提供されるか、または外因的に提供される）および化合物の両方
によって標的化され得ることを示す。

【０２７１】 （表２６．配列表）

【０２７２】

【表２６】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、ＨＢＶコアプロモーターの配列を示す。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、図に示される配列位置で下線を引いて示される種々のＤＮＡ応答エ
レメント（ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、Ｓｐ１およびＴＢＰ）の配列を有するＨＢＶ
ｐｒｅ−Ｓ１プロモーター領域の配列を示す。

【図２】 図２は、図に示される、ＨＮＦ３−ｗｔ、ＴＢＰ−ｗｔ、ＴＢＰ−ｍｕｔ、Ｈ
ＮＦ−１−ｗｔ、ＨＮＦ１−ｍおよびＨＮＦ１−２１ｘ配列についての、試験化
合物のネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）二量体（２１ｘ）の結合優先度を示
す、種々のＨＢＶ ｐｒｅＳ１プロモーター構築物とのハイブリダイゼーション
安定化アッセイ（ＨＳＡ）の結果を示す。

【図３】 図３は、図に下線を引いて示される、種々のＤＮＡ応答エレメント（ＮＦ１、
２ｃ、ＥＦ−Ｃ、ＮＦ−１およびＸ−ＰＢＰ）の配列を有するＨＢＶ Ｘプロモ
ーター領域の配列を示す。

【図４】 図４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ０９０５４のヌクレオチド３１６〜２１６
１に対応する、−１７４５〜＋１５５の野生型サイクリンＤ１プロモーターの配
列を示す。

【図５】 図５Ａ〜Ｃは、ヌクレオチド１〜２３９５の番号が付けられた全長ヒトＣＤ４
０Ｌ配列の配列を示し、ここで、ヌクレオチド１０〜１９１９は、−１８６０〜
＋４９として同定されるヒトＣＤ４０Ｌプロモーター配列に対応する。

【図６】 図６は、野生型ｖａｎＨプロモーターの配列を示す。

【図７】 図７は、ｖａｎＨプロモーター変異体Ｍ２〜Ｍ２１の配列を示し、ここで、図
に示される本来のｖａｎＨプロモーター配列中の１０ヌクレオチドの各群は、変
異配列で置換された（例えば、Ｍ２において、ＣＣＣＧＧＧＧＧＧＣ配列が、野
生型ＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡ配列の代わりに挿入された）。

【図８】 図８Ａ〜Ｃは、−６０００〜＋１１００の野生型アンドロゲンレセプタープロ
モーターの配列を示す。

【図９】 図９は、野生型Ｈｅｒ２プロモーターの配列を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スタール， ダグラス ビー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94040， マウンテン ビュー， ボニタ アベニ ュー 1197 (72)発明者 タム， アルバート ダブリュー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94122， サン フランシスコ， 10ティーエイチ アベニュー 1871 (72)発明者 ローランス， メガン イー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94110， サン フランシスコ， ショットウェル ストリート 1020 (72)発明者 ミシェロッティ， エミル エフ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404， フォスター シティ， マーリン アベ ニュー 1181 (72)発明者 ベリガン， マーク ディー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94037， モンタラ， ピー．オー． ボックス 370532 (72)発明者 ラター， デレック アール． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94541， ハイワード， イースト アベニュー 1945 (72)発明者 トーマス， リタ エル． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94062， ウッドサイド， ハイ ロード 1050 (72)発明者 コンパチス， アナ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94587， ユニオン シティ， アルバラド ブー ルバード 4469 (72)発明者 シェパード， リアナ ティー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94065， レッドウッド シティ， カディズ サ ークル 34 (72)発明者 リム， ムーン ヤング アメリカ合衆国 カリフォルニア 94065， レッドウッド シティ， リド サーク ル 10 (72)発明者 ブルース， トーマス ダブリュー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92009， カールスバッド， シィアーウォーター ズ ドライブ 6880 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA02 EA04 GA14 HA17 4B063 QA01 QA05 QA19 QQ08 QQ22 QR57 QS36 QX02 4B065 AA01X AA90X AA93X AA96X AB01 BA03 BB02 BB12 BB37 CA44

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サイクリンＤ１プロモーターについての単離された核酸調節
   配列であって、該調節配列が、該調節配列を含むサイクリンＤ１プロモーターに
   作動可能に連結されている遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付けられる
   、核酸調節配列。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の調節プロモーター配列であって、ここで、
   該配列が、配列番号５、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択され
   る、調節プロモーター配列。
3. 【請求項３】 ＣＤ４０Ｌプロモーターについての単離された核酸調節配列
   であって、該調節配列が、該調節配列を含むＣＤ４０Ｌプロモーターに作動可能
   に連結されている遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付けられる、核酸調
   節配列。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の調節プロモーター配列であって、ここで、
   該配列が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５か
   らなる群から選択される、調節プロモーター配列。
5. 【請求項５】 ＨＢＶプロモーターについての単離された核酸調節配列であ
   って、該調節配列が、該調節配列を含むＨＢＶプロモーターに作動可能に連結さ
   れている遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付けられる、核酸調節配列。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の調節プロモーター配列であって、ここで、
   前記ＨＢＶプロモーターが、コアプロモーター、ｐｒｅＳ１プロモーター、また
   はＸプロモーターである、調節プロモーター配列。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の調節プロモーター配列であって、ここで、
   該配列が、配列番号２０または配列番号２１として示されるＨＢＶコアプロモー
   ター配列である、調節プロモーター配列。
8. 【請求項８】 請求項６に記載の調節プロモーター配列であって、ここで、
   該配列が、配列番号２３または配列番号２４として示されるＨＢＶ ｐｒｅＳ１
   プロモーター配列である、調節プロモーター配列。
9. 【請求項９】 請求項６に記載の調節プロモーター配列であって、ここで、
   該配列が、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択
   されるＨＢＶ Ｘプロモーター配列である、調節プロモーター配列。
10. 【請求項１０】 バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）プロモーターについ
    ての単離された核酸調節配列であって、該調節配列が、該調節配列を含むＶＲＥ
    プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子の発現を調節する能力によって
    特徴付けられる、核酸調節配列。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の調節プロモーター配列であって、ここ
    で、該配列が、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４からなる群か
    ら選択される、調節プロモーター配列。
12. 【請求項１２】 アンドロゲンレセプター（ＡＲ）プロモーターについての
    単離された核酸調節配列であって、該調節配列が、該調節配列を含むＡＲプロモ
    ーターに作動可能に連結されている遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付
    けられる、核酸調節配列。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の調節プロモーター配列であって、ここ
    で、該配列が、配列番号６４、配列番号６５、および配列番号６６からなる群か
    ら選択される、調節プロモーター配列。
14. 【請求項１４】 ＨＥＲ２プロモーターについての単離された核酸調節配列
    であって、該調節配列が、該調節配列を含むＨＥＲ２プロモーターに作動可能に
    連結されている遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付けられる、核酸調節
    配列。
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の調節プロモーター配列であって、ここ
    で、該配列が、配列番号７０、配列番号７１、および配列番号７２からなる群か
    ら選択される、調節プロモーター配列。
16. 【請求項１６】 β−ラクタマーゼ（Ｂｌａ）プロモーターについての単離
    された核酸調節配列であって、該調節配列が、該調節配列を含むＢｌａプロモー
    ターに作動可能に連結されている遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付け
    られる、核酸調節配列。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の調節プロモーター配列であって、ここ
    で、該配列が、配列番号７７または配列番号７８として示されるＢｌａプロモー
    ター配列である、調節プロモーター配列。
18. 【請求項１８】 請求項２、４、７、８、９、１１、１３、１５、および１
    ７のいずれか１項のプロモーター調節核酸配列を含む、ベクター。
19. 【請求項１９】 請求項１８に記載のベクターであって、該ベクターが、 （ｉ）該ベクターで形質転換されている宿主細胞によって認識されるプロモータ
    ーおよび制御配列に作動可能に連結されている、前記プロモーター調節核酸配列
    ；ならびに （ｉｉ）自系遺伝子産物または異種遺伝子産物をコードする導入遺伝子 を含む発現ベクターである、ベクター。
20. 【請求項２０】 前記導入遺伝子が、レポーター遺伝子である、請求項１９
    に記載のベクター。
21. 【請求項２１】 請求項２０のベクターを含む、宿主細胞。
22. 【請求項２２】 前記宿主細胞が、原核生物細胞である、請求項２１に記載
    の宿主細胞。
23. 【請求項２３】 前記宿主細胞が、真核生物細胞である、請求項２１に記載
    の宿主細胞。
24. 【請求項２４】 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２１に記載
    の宿主細胞。
25. 【請求項２５】 細胞中で遺伝子発現を調節する方法であって、該方法は、
    （ｉ）請求項１９に記載の発現ベクターを細胞中に導入する工程、 （ｉｉ）前記プロモーター調節配列を、細胞因子またはＤＮＡ結合化合物に曝露
    し、前記導入遺伝子の調節された発現を生じる工程；および （ｉｉｉ）該導入遺伝子の発現を検出する工程 を包含する、方法。