JP2002517192A - 細胞におけるアポトーシスの誘発方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞、より具体的には、腫瘍細胞においてＣ１Ｄ遺伝子を過剰発現することにより、アポトーシスを誘発する方法に関する。これは、例えば、細胞に、対応する発現構築物を導入すること、または細胞の有するＣ１Ｄ遺伝子の発現の外因性の刺激により生じる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、細胞、特に腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘発方法に関する。

【０００２】 アポトーシスは、プログラムされた細胞死である。それは、正確な制御の支配
下にあり、アポトーシスを誘導又は阻害することができる。

【０００３】 公知のように、アポトーシスは、多数のいわゆるｄｅａｔｈレセプター、すな
わち、それらのリガンドの結合後、アポトーシスシグナル経路を誘導する、ＣＤ
９５、ＴＮＦ−ＲＩ、ＤＲ３、ＤＲ４又はＤＲ５などのｄｅａｔｈドメイン（Ｄ
Ｄ）含有レセプターにより誘導されうる。例えば、ＣＤ９５レセプターは、ＣＤ
９５リガンドの結合後に、アダプタータンパク質ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１と相互作
用し、その結果、ＤＩＳＣ「ｄｅａｔｈ誘導シグナル伝達複合体」でのプロテア
ーゼＦＬＩＣＥ／カスパーゼ−８の漸増及び活性化を誘導する。ＦＡＤＤ及びＦ
ＬＩＣＥのそれぞれは、ｄｅａｔｈエフェクタードメイン（ＤＥＤ）を含む。こ
れらのアポトーシスシグナル経路を介したアポトーシスの誘導は、例えば、細胞
毒素（細胞傷害性物質）の投与、照射、ウイルス、増殖因子の除去又は物理学的
な細胞損傷により外部から可能である。しかしながら、これらのアポトーシス誘
導の可能性は、いくらかの欠点を伴う。例えば、細胞増殖抑制剤などの細胞毒素
の投与、又は癌細胞の症例における照射は、耐性の発生と、加えて、アポトーシ
スが実際には誘導されるべきではない正常細胞のダメージとをもたらす。

【０００４】 それゆえに、アポトーシスの誘導を行ない、例えば、悪性の増殖と戦い、同時
に前記副作用を減少させる方法を提供することが本発明の目的である。

【０００５】 本発明によれば、これは、請求項に規定された主題により達成される。

【０００６】 本発明は、動物、具体的には、哺乳動物、より具体的には、ヒトにおいて、ア
ポトーシスの誘導に適したタンパク質があるという本発明者らの見識に基づく。
かかるタンパク質は、約１６ｋＤの大きさを有し、今までは、ＤＮＡ結合タンパ
ク質として特徴付けられていた〔ネールス（Ｎｅｈｌｓ）ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６，１１６０−１１６６頁（１９９８）〕。

【０００７】 本発明者らは、アポトーシスを誘導するのに適したタンパク質（以下、Ｃ１Ｄ
という）が、あらゆる細胞、腫瘍細胞にも存在し、そこで生物により予め決定さ
れた量で発現することを認識した。Ｃ１Ｄ遺伝子産物を過剰発現するときはいつ
でも、アポトーシスは、過剰発現細胞において誘導される。しかしながら、特に
腫瘍細胞においては、過剰発現により得られたアポトーシスが望ましい。この過
剰発現それ自体が腫瘍細胞を殺すことができる。さらに、化学療法又は照射など
の慣用の腫瘍療法によりもたらされたアポトーシスを促進することができた。さ
らにアポトーシスは、慣用の治療法により、既に耐性が発生していた腫瘍細胞に
おいて実施され得た。本発明者らは、さらに、アポトーシスが、Ｃ１Ｄ遺伝子を
過剰発現すること、すなわち、細胞Ｃ１Ｄ遺伝子産物の濃度を増やすことにより
誘導されうることを見出した。これは、例えば、Ｃ１Ｄ遺伝子を発現する発現構
築物を用いて細胞をトランスフェクトすることにより、又は内因性Ｃ１Ｄ遺伝子
の過剰発現を刺激することにより行なわれうる。

【０００８】 Ｃ１Ｄ遺伝子産物は、ｆｉｇ．１若しくは２の配列又はそれとは１若しくは数
個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含有する。「それとは１若しくは数個のア
ミノ酸が異なるアミノ酸配列」の文言は、Ｃ１Ｄ（関連）タンパク質をコードし
、そのＤＮＡ配列がｆｉｇ．１又はｆｉｇ．２のＤＮＡとハイブリダイズするも
のであるいかなるアミノ酸配列をも含む。「ハイブリダイズ」の文言に対して、
下記説明が参照される。

【０００９】 ＤＮＡ、具体的には、ｃＤＮＡの形態でＣ１Ｄをコードする核酸は、本発明の
方法を行なうのに特に好適である。（ａ）ｆｉｇ．１若しくは２のＤＮＡ又はそ
れとは１若しくは数個の塩基対が異なるＤＮＡであり、後者のＤＮＡがｆｉｇ．
１若しくは２のＤＮＡとハイブリダイズするものであるＤＮＡ、又は （ｂ）縮重遺伝コードを介して（ａ）のＤＮＡと関連するＤＮＡ を含有するＤＮＡが好ましい。

【００１０】 ｆｉｇ．１及び２のＣ１Ｄ ｃＤＮＡの配列データは、下記アクセッション番
号： マウスｃＤＮＡ： Ｘ９５５９１； ヒトｃＤＮＡ： Ｘ９５５９２ の下、遺伝子ライブラリーで入手可能である。

【００１１】 「１若しくは数個の塩基対が異なるＤＮＡ」の文言は、ｆｉｇ．１又は２のＤ
ＮＡとハイブリダイズする、Ｃ１Ｄ（関連）タンパク質をコードするいかなるＤ
ＮＡ配列をも含む。前記ＤＮＡは、１若しくは数個の塩基対の付加、欠失、置換
及び／又は逆位あるいは当該技術分野に公知の他の修飾、例えば、オルタナティ
ブスプライシングなどによりｆｉｇ．１又は２のＤＮＡと異なってもよい。本発
明によれば、「ＤＮＡ」の文言は、当該ＤＮＡの断片をも含む。「断片」の文言
は、元の核酸分子のセグメントを含み、当該断片によりコードされたタンパク質
は、Ｃ１Ｄのアポトーシス誘導性質をさらに含むであろう。また、これは、対立
遺伝子バリアントを含む。当業者は、核酸配列において前記修飾を生じる方法に
精通しており、かかる方法は、分子生物学の標準的な文献、例えばザンブルーク
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マ
ニュアル 第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２^nd ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド スプリング ハ
ーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド スプリング ハーバー ニューヨ
ーク（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ）（１９８９）に記載され
る。

【００１２】 また、当業者は、例えば、形態学、多中心クロマチン凝縮、典型的な膜変化及
び内因ＤＮＡ分解などにより特徴付けられるアポトーシス−典型的細胞死の検出
により、この方法で修飾された核酸配列によりコードされたタンパク質がいまだ
アポトーシスを誘導する生物学的活性を有するかどうか決定することもできる。

【００１３】 「．．．とハイブリダイズするＤＮＡ」の文言は、慣用の条件下、具体的には
ＤＮＡの融解点より２０℃下でｆｉｇ．１又は２のＤＮＡとハイブリダイズする
ＤＮＡをいう。これに関して、「ハイブリダイズ」の文言は、通常のハイブリダ
イズ条件、好ましくは５×ＳＳＰＥ、１％ ＳＤＳ、１×デンハート溶液が溶液
として用いられ、かつハイブリダイゼーション温度が３５℃〜７０℃の間、好ま
しくは６５℃であるハイブリダイゼーション条件をいう。ハイブリダイゼーショ
ンの後、３５℃〜７０℃の間、好ましくは６５℃で、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで
一度洗浄を行ない、ついで０．２×ＳＳＣで洗浄を行なう（ＳＳＰＥ、ＳＳＣ及
びデンハート溶液の定義について、上記ザンブルークらを参照のこと）。例えば
、上記ザンブルークらに記載されるようなストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件は、特に好ましい。

【００１４】 本発明の方法を行なうのに適したＣ１Ｄ遺伝子産物を生産するために、Ｃ１Ｄ
をコードするＤＮＡを、ベクター又は発現ベクター、例えば、ｐＢｌｕｅＳｃｒ
ｉｐｔ、ｐＱＥ８、ｐＵＣ又はｐＢｒ３２２誘導体などに挿入する。好ましい態
様において、本発明の核酸分子は、真核宿主細胞におけるその発現を可能にする
調節エレメントを有するベクターに機能的に連結される。かかるベクターは、前
記調節エレメントに加えて、例えば、プロモーター、典型的には、複製開始起点
及び形質転換宿主細胞の表現型選択を可能にする特定の遺伝子を含む。真核生物
における発現のための調節エレメントとしては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＶＳ４０
プロモーター、及びＣＭＶ又はＳＶ４０エンハンサーが挙げられる。好適なプロ
モーターのさらなる例示は、メタロチオネインＩ及びポリヘドリンプロモーター
である。

【００１５】 遺伝子治療目的のための好ましい態様において、Ｃ１Ｄ ＤＮＡを含むベクタ
ーは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス又はアデノ依存
パルボウイルス（ＡＡＶ）などである。レトロウイルスは、特に好ましい。好適
なレトロウイルスの例示は、ＭｏＭｕＬＶ、ＨａＭｕＳＶ、ＭｕＭＴＶ、ＲＳＶ
又はＧａＬＶである。遺伝子治療の目的のために、本発明の核酸分子を、コロイ
ド分散物の形態で標的細胞に送達することもできる。前記コロイド分散物は、例
えば、リポソーム又はリポプレックスを含有する〔マンニーノ（Ｍａｎｎｉｎｏ
）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（１９８８），６８２〕。

【００１６】 当該技術分野で公知の一般的な方法は、発現ベクター、及び特に遺伝子治療ベ
クターの構築のために用いられ得、前記核酸分子及び適切な制御配列を含む。こ
れらの方法は、例えば、上記ザンブルークらに記載のイン・ビトロ組換え技術、
合成方法及びイン・ビボ組換え方法を含む。したがって、当業者は、本発明のＤ
ＮＡをどのように発現ベクターに挿入するかを知っている。また、当業者は、こ
のＤＮＡを他のタンパク質又はペプチドと組み合わせて挿入でき、そのため、本
発明のＤＮＡを融合タンパク質の形態、例えば、他の部分がＧＦＰ〔エクオリア
ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質〕
である融合タンパク質の形態で発現させうるという事実にも精通する。

【００１７】 Ｃ１Ｄ遺伝子の発現のために、前記発現ベクターを宿主細胞に導入する。前記
宿主細胞は、培養物と生存生物との両方で、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細
胞を含む。動物細胞Ｌ、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ及びＨｅ
Ｌａが好ましい。前記ベクターを用いることにより、これらの宿主細胞を形質転
換し、生じた形質転換を検出し、本発明の核酸を発現させる方法は、当該技術分
野で公知である。

【００１８】 また、当業者は、形質転換細胞及びトランスフェクト細胞を培養できる条件を
知る。当業者は、本発明のＤＮＡにより発現されたタンパク質及び融合タンパク
質を単離し、精製する方法にも精通する。

【００１９】 本発明の方法を行なうために、Ｃ１Ｄ ＤＮＡを発現ベクター、特に遺伝子治
療ベクター及び細胞、好ましくは腫瘍細胞に好ましい態様で導入する。これは、
Ｃ１Ｄタンパク質の発現が生じる、細胞に内在するタンパク質に加えてアポトー
シスの誘導をもたらす場所である。当業者が精通する条件下でベクターを細胞に
導入する。イン・ビボ遺伝子治療に対して、「Ｋ．Ｗ．カルバー（Ｃｕｌｖｅｒ
）、ジーン セラピー，ア ハンドブック フォァ フィジシャンズ（Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ），
メアリー アン リバート インコーポレーティッド（Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉ
ｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９９４」及び「
Ｐ．Ｌ．チャン（Ｃｈａｎｇ），ソナティック ジーン セラピー（Ｓｏｎａｔ
ｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），シーアールシー プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓｓ），ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ），１９９５」が参照される。

【００２０】 他の好ましい態様において、細胞に内在するＣ１Ｄ遺伝子は、例えば、内因性
Ｃ１Ｄプロモーターの外因的な刺激により刺激され、発現を増加する。遺伝子の
５’隣接配列は、プロモーターと呼ばれ、転写因子と協同して遺伝子の発現をも
たらすＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始点として働く。多くの遺伝子、及びさらに
Ｃ１Ｄにおいて、この過程は、外因因子により誘導又は刺激されうる。遺伝子の
特異的発現をもたらす因子は、大変多く、かつ低分子無機物質（塩、金属イオン
）及び低分子有機物質〔ペプチド、核酸基礎単位（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）、生物起源のアミン、ステロイド）を介して
、物理的因子（光、熱、低温など）から高分子物質（血清、増殖因子、免疫刺激
因子）までの範囲にわたる。Ｃ１Ｄ遺伝子の特異的な刺激物質は、例えば、ＢＡ
Ｃ（微生物人工染色体）クローンなどに存在する５’隣接配列をレポーター遺伝
子、例えば、ＣＡＴ又はＥＧＦＰなどと組み合わせ、レポーター遺伝子発現及び
／又は外因因子によるその刺激について、任意にハイスループット法によりそれ
らを調べることにより認識される。

【００２１】 したがって、本願は、慣用のシグナル経路を介するのではなく、特定の遺伝子
の過剰発現を介してアポトーシスを誘導する可能性を最初に提供する。これは、
多くの疾患、特に、腫瘍性疾患に対し格別顕著でありうる。腫瘍細胞が、正常細
胞よりも、より感度よく、Ｃ１Ｄの過剰発現に応答するという事実は、特に有利
であることが証明された。したがって、正常細胞に対しては副作用がないが、腫
瘍細胞は、確実な細胞死をこうむる。

【００２２】 本発明を下記実施例により説明する。

【００２３】 実施例１：Ｃ１Ｄ遺伝子の発現によるアポトーシスの誘導 − ｐｃＤＮＡ ３−Ｃ１Ｄ発現構築物 Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター〔ＫＳ＋，ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）社〕にクローン化され、かつヒト又はマウスＣ１ＤをコードするｃＤＮＡ
をＰＣＲにより増幅した。これに関し、下記プライマー： ヒトｃＤＮＡに関し： プライマー フォワード： 5'-GGGGTACCATGGCAGGTGAAGAAATTAATGAAGACTAT プライマー リバース： 5'-GGGTCGACTTAACTTTTACTTTTTCCTTTATTGGCAAC （ｆｉｇｕｒｅ １の塩基１１８から塩基５４０のヌクレオチド配列の増幅をも
たらす） マウスｃＤＮＡに関し： プライマー フォワード： 5'-GGGGTACCATGGCAGGTGAAGAAATGAATGAAGATTAT プライマー リバース： 5'GGGTCGACGTGTTTGCTTTTCCCTTTATTAGCCACTTT （ｆｉｇｕｒｅ ２の塩基７８から塩基５００のヌクレオチド配列の増幅をもた
らす） を用いた。

【００２４】 これらのプライマーにより、ＡＴＧ開始コドンの前にＫｐｎ制限部位を導入し
、かつ終止コドンの前に（終止コドンを省くように）Ｓａｌ Ｉ制限部位を導入
した。クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社のＰＣＲキット（Ｋ１９０６−１）
により、製造者の説明書に従い、５０μｌ容量のキット成分： 水 ３８．８μｌ １０×緩衝液 ５μｌ 酢酸Ｍｇ ２．２μｌ プライマー フォワード １μｌ（１μＭ） プライマー リバース １μｌ（１０μＭ） Ｃ１Ｄテンプレート ５μｌ（５００ｎｇ） ５０× ｄＮＴＰ １μｌ キット ポリメラーゼ １μｌ 中、サイクルプログラム： １）最初の変性 ９４℃，１分 ２）変性 ９４℃，３０秒 ３）アニーリング伸長 ６８℃，３分 ４）最後の伸長 ６８℃，３分 ５）冷却 ４℃ ステップ２）／３）を３５回行なう で行なった。

【００２５】 Ｋｐｎ Ｉ／Ｓａｌ Ｉを用いた増幅バッチの制限消化の後、Ｂｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔベクター（Ｋｐｎ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ−前処理）に最初に再クローン化した
。Ｋｐｎ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉを用いてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターから断片を切
り出したのち、配列を、相応じて前処理したｐｃＤＮＡ ３ベクター〔インビト
ロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）社〕にクローン化することができた。

【００２６】 −ｐｃＤＮＡ ３−Ｃ１Ｄ−ＥＧＦＰ発現構築物 連続的なリーディングフレームを有するＣ１ＤとＧＦＰ〔エクオリア ビクト
リア（Ａｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質〕との間の
融合をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔレベルで実施した。この目的のために、前記ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−（Ｋｐｎ Ｉ）−Ｃ１Ｄ−（Ｓａｌ Ｉ）−プラスミドを
、Ｓａｌ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる消化により開環した。

【００２７】 ＥＧＦＰ〔クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社；ＥＧＦＰは、「エンハンス
ド緑色蛍光タンパク質」を意味し、クロンテック社により製造された、励起／発
光に関して改良された性質を有する変異体である〕をＰＣＲにより増幅した。こ
のＰＣＲにおいて、下記プライマー： プライマー フォワード： 5'-GGGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC プライマー リバース： 5'-CCAAGCTTTGGAATTCTAGAGTCGCGGCCGCTTTA を用い、５’末端にＳａｌ Ｉ部位及び３’末端にＨｉｎｄ ＩＩＩ部位（以下
、終止コドンという）を挿入した。ＰＣＲは、前記のように同様に行なった。

【００２８】 Ｓａｌ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを用いたＰＣＲ増幅産物の消化後、それらを
、調製したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−（Ｋｐｎ Ｉ）−Ｃ１Ｄ−（Ｓａｌ Ｉ）．
．．（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ）プラスミドに連結することができた。その後、融合カ
セット（Ｋｐｎ Ｉ）−Ｃ１Ｄ−ＥＧＦＰ−（ＮｏｔＩ）をＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔベクターから、対応する消化により切り出し、相応じて前処理したｐｃＤＮＡ
３ ベクター（Ｋｐｎ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ）に再クローン化した。

【００２９】 −腫瘍細胞におけるベクターのトランスフェクション 上記で得られた発現ベクターを、エールリッヒ腹水腫瘍の細胞におけるエレク
トロポレーション（ポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，７１６１−７１６５頁 （１９８４）又はリポフェ
クション（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ，キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社，ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）
，０２／９７，１９９７）により他から分離（ｓｅｐａｒａｔｅ）した。トラン
スフェクト（生細胞）を顕微鏡（蛍光光学システム）で観察し、撮影した（ｆｉ
ｇ．３）。

【００３０】 トランスフェクションの約１２時間後、細胞核において、２０−６０％が弱い
緑色蛍光を有する（示していない）。このことは、融合タンパク質が最初に穏や
かな発現をすることを言及する。形態学的観点から、なんら特徴を見出すことが
できない。ベクター構築物のトランスフェクションの約２４時間後、融合タンパ
ク質の凝集が個々の細胞内に生じた（ｆｉｇ．３左側）。また、これらの凝集は
、位相差写真において観察され得る（ｆｉｇ．４）。さらなる時間経過において
、これらの凝集は、より強くなり（ｆｉｇ．３左から右）、位相差写真（ｆｉｇ
．４）は、アポトーシスが行なわれた細胞の典型的な写真に対応する。

【００３１】 同時にトランスフェクトされた細胞の全部が、同時に前記写真の融合タンパク
質の過剰発現率を示したのではない。また、ｆｉｇ．３の左側などの細胞は、４
８−７２時間後でさえ観察されたが、他の細胞は、既にその終点に達していた（
ｆｉｇ．３，右側）。このことは、培地の細胞が、「部分的にずれた様式で」ア
ポトーシス過程に入ることを示す。十分に高いトランスフェクション率では、培
地の全細胞、すなわちトランスフェクトされなかったものまでも最終的な解析に
おいて死滅する。これは、直ちに開始トランスフェクション率に依存する。トラ
ンスフェクト細胞のアポトーシスにより、培地中の非トランスフェクト細胞に有
害な因子が放出され、かつそのうえ最後に、これらの非トランスフェクト細胞の
致死をもたらす（いわゆる「傍観者効果」）。

【００３２】 ＧＦＰ〔エクオリア ビクトリアの緑色蛍光タンパク質〕が、トランスフェク
ト細胞と非トランスフェクト細胞とを区別化すること又は過剰発現を可視化する
ことにのみ用いられたことに注意されたい。ＧＦＰ発現単独は、細胞形態学又は
細胞の生存能への影響がない。ＧＦＰ融合タンパク質は、基本的に、機能的遺伝
子産物に同等の機能的な性質（及びさらに細胞内分布）を有する。したがって、
図に示されたアポトーシスの過程は、Ｃ１Ｄ機能に基づく。示された形態学（及
び細胞数の減少）は、Ｃ１Ｄ配列のみを含む構築物による（例えば、前記ｐｃＤ
ＮＡ ３−Ｃ１Ｄ発現構築物による）対照実験においてもたらされた。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｆｉｇ．１は、ヒト由来のＣ１ＤのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。

【図２】 Ｆｉｇ．２は、マウス由来のＣ１ＤのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。

【図３】 ｆｉｇ．３は、エールリッヒ腹水腫瘍の細胞におけるＣ１Ｄの過剰発現により
誘発されるアポトーシス過程の時間経過を示す（蛍光顕微鏡；励起：４８０ｎｍ
；発光：５２０ｎｍ）。

【図４】 ｆｉｇ．４は、エールリッヒ腹水腫瘍の細胞におけるＣ１Ｄの過剰発現により
誘発されるアポトーシス過程において生じる形態学的特徴の例である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 シュタマー，ヘルマン ドイツ連邦共和国 ドッセンハイム デー −69221 リンゼンビュール ３ (72)発明者 ヴェルナー，ディーター ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー −69118 ノイアー ヴェーク 22 (72)発明者 ネールス，ペーター ドイツ連邦共和国 ミュンヒェン デー− 80339 ヴェステンシュトラーセ 125

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃ１Ｄ遺伝子の過剰発現により、細胞におけるアポトーシス
   を誘導する方法。
2. 【請求項２】 細胞が、腫瘍細胞である、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 Ｃ１Ｄ遺伝子産物が、ｆｉｇ．１若しくは２のアミノ酸配列
   及び／又はそれとは１若しくは数個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含有する
   ものであり、後者のアミノ酸配列のＤＮＡ配列がｆｉｇ．１又は２のＤＮＡにハ
   イブリダイズするものである、請求項１又は２記載の方法。
4. 【請求項４】 細胞を、 （ａ）ｆｉｇ．１若しくは２のＤＮＡ又はそれとは１若しくは数個の塩基対が異
   なるＤＮＡであり、後者のＤＮＡがｆｉｇ．１若しくは２のＤＮＡとハイブリダ
   イズするものであるＤＮＡ、又は （ｂ）縮重遺伝コードを介して（ａ）のＤＮＡと関連するＤＮＡ を含有した発現ベクターを用いてトランスフェクトする、請求項１〜３いずれか
   に記載の方法。
5. 【請求項５】 細胞に内因的に含まれるＣ１Ｄ遺伝子を刺激する、請求項１
   〜３いずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】 細胞外因子により、内因性のＣ１Ｄ遺伝子のプロモーターを
   刺激する、請求項５記載の方法。