JP2009513157A5

JP2009513157A5 - 同期化した植物細胞培養による二次代謝産物の大量生産の安定化

Info

Publication number: JP2009513157A5
Application number: JP2008538791A
Authority: JP
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2011-02-03
Anticipated expiration: 2026-04-25

Description

冷凍保存剤で処理された培養細胞を液体窒素に浸漬して冷凍した。解凍のため、液体窒素で１０分以上維持した培養細胞を取り出して４０℃の水槽に入れて１〜２分間解凍した。細胞再成長のため、凍結保存細胞を０．５Mソルビトールが添加された半固型生長培地（表１）上に移し変え、３０分間室温で安定化した後、０．１Mソルビトールを含む半固型生長培地で２４時間、ソルビトールを含まない半固型生長培地で２４時間、引き継いでソルビトールを含まない新しい半固型生長培地で２４時間培養後、細胞生存率を観察した。

＜実施例１０＞パクリタキセル含量分析
回収したサンプルを細胞と培地で分離した後、夫々のパクリタキセルの含量を分析した。細胞は真空乾燥器（vacuum desicator,Sam Shin Glass,Korea)で完全に乾燥した後、質量を測定した。乾燥重量約１００ｍｇの細胞にメタノール（Sigma,USA)、メチレンクロライド（Sigma,USA）の混合液（1:1,v/v）４ｍｌを交ぜた後、室温で１時間ずつ３回にわたって超音波を利用して（ultrasonic cleaner,Branson,USA)抽出した。真空で完全に乾燥させて、また４ｍｌのメチレンクロライドを入れて数回分離した。分離した有機溶媒層は真空乾燥して、残った抽出物を１ｍｌのメタノールに再溶解した。溶解した抽出物を超音波で均質に撹拌し、遠心分離（8,000g×5分)を利用して固相物を取り除いた。

Claims

次の段階を含む、植物形成層由来細胞の分離方法：
（ａ）植物から形成層含有組織を取得する段階；
（ｂ）形成層含有組織を培地中で培養する段階；及び
（ｃ）形成層から細胞を分離する段階。
前記段階（ａ）の形成層含有組織が殺菌される、請求項１に記載の方法。
前記段階（ｃ）が、形成層以外の領域由来であり、そして無秩序な形態で増殖するカルス層から、形成層を分けた後に、細胞を分離することを含む、請求項１に記載の方法。
前記段階（ｂ）は、オーキシンを含む培地で培養することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記培地は、オーキシンを１〜３ｍｇ／Ｌで含む、請求項４に記載の方法。
前記植物はイチイ属であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
植物の形成層由来であり、そして脱分化を経験したことのない未分化状態（innately undifferentiated）である、分離細胞。
前記細胞が、次の特性の少なくとも１つを含む請求項７に記載の分離細胞：
（ａ）植物の脱分化したカルス由来細胞と比較して、懸濁培養において、多数の単細胞を含むか、又はより小さなサイズの細胞凝集体を含む；
（ｂ）多数の液胞（vacuole）を有する形態学的特徴を示す；
（ｃ）植物の脱分化したカルス由来細胞と比較して、より早く、そしてより長く生長することができる；及び
（ｄ）植物の脱分化したカルス由来細胞と比較して、生物反応器における剪断ストレス（shear stress）に対して低い感受性を有する。
前記細胞が、前記特性（ａ）〜（ｄ）の少なくとも２つを含む、請求項８に記載の分離細胞。
前記細胞が、前記特性（ａ）〜（ｄ）の少なくとも３つを含む、請求項８に記載の分離細胞。
前記細胞が、前記特性（ａ）〜（ｄ）を含む、請求項８に記載の分離細胞。
前記細胞が、請求項１に記載の方法により分離された、請求項７に記載の分離細胞。
前記細胞が、植物の組織から誘導された層から得られ、前記組織は植物の形成層を含み、そして前記層は、組織の形成層から増殖し、且つ植物起源のカルスを含まない、請求項７に記載の分離細胞。
前記植物はイチイ属であることを特徴とする、請求項７に記載の分離細胞。
前記イチイ属の形成層由来の分離細胞は、イチイ属の脱分化したカルス由来細胞と比較して、２７０〜７２０倍増加したパクリタキセル分泌能を有する、請求項１４に記載の分離細胞。
次の段階を含むことを特徴とする植物由来の生物学的有用物質の製造方法：
（ａ）請求項７〜１５のいずれか一項に記載の分離細胞を培養して有用物質を生成する段階；及び
（ｂ）前記生成した有用物質を回収する段階。
前記段階（ａ）の培養は前記分離細胞の培養に使われた培地を取り除いて、新しい培地を供給することを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
前記分離細胞は、イチイ属の形成層由来であり、有用物質はパクリタキセルであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
前記イチイ属の形成層由来の分離細胞は、ジャスモン酸メチル、フェニルアラニン及びキトサンからなる群より選ばれた少なくとも１つの物質をさらに含む培地で培養することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
請求項７〜１５のいずれか一項に記載の分離細胞を、凍結することを含む植物細胞株の保存方法。