JP2009509526A - 毛嚢幹細胞の分離、増殖及び分化方法及び禿頭の治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明によって得られた毛嚢由来幹細胞は、成人の自己性成体幹細胞に分類され、自己複製能及び成体の毛嚢細胞に分化する能力を有し、かつ発毛能力を有し、脱毛の新規な細胞治療剤として利用することができる。また、本発明は、従来の技術に比べて収率に優れた毛嚢細胞の培養及び毛嚢幹細胞の同定法を提供する。
Description
本発明の目的は、毛嚢含有頭皮由来の組織を培養して毛嚢幹細胞を分離する方法を提供することにある。
(1)頭皮細胞の培養
外科毛髪移植手術を受けた患者から回収した皮下組織を含んだ後頭部の頭皮のうち、外科手術後の残余物である頭皮由来組織を取得した。取得した毛嚢を含んだ頭皮を10体積%(0.1ml/ml)のウシ胎仔血清、ノルモシン(100μg/ml)、ペニシリン100unit、ストレプトマイシン(0.1mg/ml)、ネオマイシン(0.25μg/ml)の含まれたDMEM培地に入れた。前記摘出された頭皮を滅菌されたフォーセップで取り出して、ペトリ皿上に乗せ、ブレードをスカルペルに挟んで頭皮組織を細く切った。切開後にはアキュマックス(accumax; Chemicon cat# SCR006)及びディスパーゼの含まれたDMEM培地(0.1ml/ml(10体積%)のウシ胎仔血清、ペニシリン100unit、ストレプトマイシン(0.1mg/ml)、ネオマイシン(0.25μg/ml)、ノルモシン(100μg/ml)にアキュマックス(accumax; Chemicon cat# SCR006)2体積%(0.02ml/ml)及びディスパーゼ0.4mg/mlの含まれた培地)にペトリ皿にある切開された組織を入れてフラスコに移した。フラスコに入った組織を130m/min、37℃で30分間重力対流培養器で1次化学的分解作業を行った。
すべての細胞を回収した。
初期培養後、3日が経過した細胞にトリプシンで処理した後、その細胞を回収して4個の6−ウェルプレートに、各ウェル当り1×104個の細胞を接種した。その後、この細胞を培養してから1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日後にそれぞれ3個のウェルの細胞数をそれぞれ計算した後、各日付別に平均及び標準偏差値を求め、その成長曲線を図4に示した。
市販のMACS(Magnetic Cell Sorting) (Miltenyi Biotec Inc.)を利用してCD34陽性細胞を分離した。MACSを利用したCD34陽性細胞を分離する方法を図5に示した。
MACS通過前の総細胞数
前記の幹細胞分離方法で獲得したCD34陽性細胞の免疫学的特性を調べるために、FACS(fluorescence activated cell sorting)分析を実施し、その結果を図7に示した。本実施例で免疫表現型の解析対象とした抗原は、CD34陽性(B)、CD44陽性(C)、CD45陽性(D)、CD133陽性(E)、CD29陽性(F)から選択される何れか一つまたは複数の免疫学的特性を表した。前記実施例1の3)で同定した細胞を1×105個用意して、2%のFBSを含むPBS溶液で洗浄し、各抗原に対する抗体と室温で反応させた。抗原の発現の有無は、フローサイトメトリー(Flow Cytometry)を利用して確認した。
(1)毛嚢幹細胞の投与及びマウスの観察
1×105個のCD34陽性細胞を入れた注射器を氷に入れた後、ヌードマウスに皮下注射で投与する。細胞が投与されたマウスの状態と比較するために、対照群として細胞投与されない動物の写真を撮影した。試験に使用した動物は次の通りである。
(2)性別及び入手時の週齢:めす、6週齢
(3)供給源:株式会社オリエント
(4)入手動物数:めす25匹
(5)検疫及び順化期間:実験室に順化させる期間を約1週間とし、その期間中に一般の症状を観察して健康な動物のみを試験に提供した。
(6)使用動物数:めす20匹
(7)試験時の週齢:めす7週齢
(8)群分離法:無作為法
(9)飼育条件
−環境条件:本試験は、温度22±3℃、相対湿度50±10%、換気回数10〜12回/hr、照明時間12時間(07:00〜19:00)、照度150〜200luxに設定されたソウル大学校の獣医科大学実験室(85洞727号)内のHEPAフィルターの装着されたMI rackで実施した。
−飼育箱、飼育密度及び飼育箱の識別
順化期間及び試験期間中にポリカーボネートMIケージ(26×42×18cm、ミョンジン機械製)で5匹を飼育箱で飼育した。飼育箱には、試験番号、動物番号及び投与量を書き込んだタグ(tag)を付けた。
−飼料及び飮水の給与
順化期間に飼料は、高圧蒸気滅菌された実験動物用固形飼料((株)ピュリナ)を自由摂取させ、飮水は、高圧蒸気滅菌された上水道を自由摂取させた。
各群のヌードマウスの頭皮部分を切開して、その切片を10%のホルマリン溶液に固定させた後、パラフィン包埋して0.2umに切片化した後、スライド上でヘマトキシリン(hematoxylin)及びエオシン(eosin)の染色法を利用して組織標本を作って比較した。
前記HE染色法と同様に、各群のヌードマウスの頭皮部分を切開して、4%のリン酸パラホルムアルデヒド溶液に1.5%のスクロース溶液を混合した固定液で各個体の頭皮組織を固定した。30%のリン酸スクロース溶液に頭皮組織が沈むまで4℃で放置した後、各組織をパラフィン包埋して、組織切片器を利用して5μmの厚さに頭皮切片を製作した後、予め用意したプレハイダイゼーション溶液(50%のフォルムアミド、4X SSC, 50mM DDT, 4X Denhart’s soln, ‘X TED, 100μg/ml denatured salmon sperm DNA, 250μg/ml yeast RNA)で42℃で1時間反応させた。DIGラベルされたDNA(100ng/ml)を入れ、プレハイダイゼーション溶液を24時間反応させて、DIGラベルされたヒト特異DNAプローブをヌードマウスの頭皮細胞mRNAに結合させた。大腿部の組織を2X、1X、0.5XSSC溶液にそれぞれ10分間2回ずつ洗浄した後、スライドガラスに固定させて室温で2時間乾燥させた。
Claims (10)
- 次の段階を含む毛嚢幹細胞の分離方法:
(a)毛嚢含有頭皮由来の組織を細切した後に化学的に分解する段階;
(b)前記化学的に分解された組織を回収した後、血清1〜30体積%を含む培地で培養する段階;
(c)前記組織が培養器に付着されれば、培地を無血清培地に交換した後に再培養する段階;及び
(d)前記再培養された組織から培養増殖された頭皮細胞を回収した後、回収した細胞から、
CD34陽性の免疫学的特性を有する毛嚢幹細胞を分離する段階。 - 前記(a)段階の化学的な分解は、(I)DNA分解酵素(DNase)及びタンパク質分解酵素(protease)を含むタンパク質複合体、及びディスパーゼ(dispase)を含む培地で1次分解する段階;及び(II)コラゲナーゼの含まれた培地で2次分解する段階を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記(b)段階の1〜30体積%の血清含有培地が、M199培地とF12培地を1:1の体積比で混合したM199/F12培地に、インシュリン0.1〜1.0μg/ml、トランスフェリン0.1〜1.0μg/ml、ペニシリン50〜150unit、ストレプトマイシン0.05〜0.15mg/ml、ネオマイシン0.1〜0.5μg/ml、rEGF(Epidermal Growth Factor)1〜100ng/ml、bFGF(BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR)1〜100ng/ml、ノルモシン10〜200μg/ml、ウシ胎仔血清0.01〜0.3ml/ml(1〜30体積%)、N−アセチル−L−システイン0.1〜10mMが添加されたものであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記(c)段階の無血清培地は、ノルモシンを含んでいない無血清培地であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記(c)段階はノルモシンを含む無血清培地で培養した後、ノルモシンを含んでいない無血清培地で培養することを含む請求項1に記載の方法。
- 前記ノルモシンを含んでいない無血清培地は、アスコルビン酸0.1〜10mMを含む無血清ケラチノサイト用培地であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記ノルモシンを含む無血清培地は、M199培地とF12培地を1:1の体積比で混合したM199/F12培地に、インシュリン0.1〜1.0μg/ml、トランスフェリン0.1〜1.0μg/ml、ペニシリン50〜150unit、ストレプトマイシン0.05〜0.15mg/ml、ネオマイシン0.1〜0.5μg/ml、rEGF(Epidermal Growth Factor)1〜100ng/ml、bFGF(BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR)1〜100ng/ml、ノルモシン10〜200μg/ml、N−アセチル−L−システイン0.1〜10mMを添加した培地で培養する段階を更に含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記分離される毛嚢幹細胞の免疫表現型抗原はCD44、CD45、CD133及びCD29から選択される一つ以上の免疫学的特性を表すことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法によって分離されたCD34陽性毛嚢幹細胞を有効成分として含む発毛誘導用組成物。
- 前記毛嚢幹細胞は1×103〜1×1012細胞の量で投与されることを特徴とする発毛誘導用組成物。
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