CN114748507A

CN114748507A - 一种人毛囊间充质干细胞与cgf组合物及其制备方法、应用

Info

Publication number: CN114748507A
Application number: CN202210145909.0A
Authority: CN
Inventors: 陈锦阳
Original assignee: Zhejiang Healthfuture Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Healthfuture Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-02-17
Filing date: 2022-02-17
Publication date: 2022-07-15

Abstract

本发明公开了一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，所述组合物包括人毛囊间充质干细胞、CGF和生理盐水，所述人毛囊间充质干细胞和所述CGF的体积比为1:(1～5)。且DSC和CGF间的配比为1:3时，DSC细胞数小于1.5×10⁶个/ml，毛发再生速度最快，毛发再生效果最好，这可能是受CGF和DSC细胞的活性和释放影响。本发明组合物通过CGF促进人毛囊间充质干细胞的存活和生长，且将人毛囊间充质干细胞控制在较低浓度时亦能达到以下效果：一是脱发修复；二是激活休止期毛囊，修复正在萎缩的毛囊，防止脱发；三是巩固脱发修复，促进毛发生长。

Description

一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物、及其制备方法以及在生发中的应用。

背景技术

脱发，在当今已经成为一种普遍存在的“现代病”，脱发的原因各异，但都无一不给人们的生活带来极大的烦恼和不便。目前国内外用于治疗脱发的药品主要为西药，如米诺地尔，其经头皮吸收后可扩张头皮下血管，改善毛囊周围的微循环，减少毛囊周围炎症细胞浸润，从而使萎缩的毛囊增大并促进毛发的生长，使毳毛变成终毛；此外，非那雄胺是一种能抑制5α-还原酶的活性以阻止雄性激素合成的药物。但米诺地尔和非那雄胺主要是针对雄激素性脱发有较好的疗效，有一定局限性，且要长期用药，对人体会产生副作用。

人毛囊间充质干细胞(DSC)是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，与真皮乳头(DP)细胞相比，将DSC细胞移植到小鼠耳皮肤可诱发相对“更有序的毛囊分布”。由于毛囊源细胞来源于毛发，可以直接从人体自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对人完全无创，现已成为脱发治疗的焦点。Reynolds等人将DSC细胞分离移植于人体，发现DSC细胞移植后可观察到毛发生长，但是其生长速度较慢。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何充分发挥DSC细胞作用，使毛发尽快生长。

为解决上述问题，本发明提供了一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，并将其应用于促进毛发生长。

一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，所述组合物包括人毛囊间充质干细胞、CGF和生理盐水，所述人毛囊间充质干细胞和所述CGF的体积比为1:(1～5)。毛囊生长发育和毛发生长周期受多种因素控制，其中，生长因子起着重要的调控作用，生长因子缺少会引起毛发生长信号停止，毛发生长、再生停止等情况。CGF(Concentrate Growth Fact，浓缩生长因子)中富含有大量的生长因子，如参与毛发生长发育周期的生长因子：角朊细胞生长因子(KGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，等等。该组合物通过CGF促进人毛囊间充质干细胞的存活和生长，以达到以下效果：一是脱发修复；二是激活休止期毛囊，修复正在萎缩的毛囊，防止脱发；三是巩固脱发修复，促进毛发生长。

进一步地，所述人毛囊间充质干细胞的浓度为1.0×10⁵～1.5×10⁶个/ml。

进一步地，所述人毛囊间充质干细胞的浓度为1.0×10⁵～1.0×10⁶个/ml。

进一步地，所述人毛囊间充质干细胞的浓度为1.0×10⁵～5×10⁵个/ml。

进一步地，所述人毛囊间充质干细胞的浓度为2.5×10⁵～3.5×10⁵个/ml。

进一步地，所述人毛囊间充质干细胞是通过采用条件培养基培养获得，所述条件培养基组分包括12v/v％血清替代物、7.5ng/ml表皮细胞生长因子、7ng/ml间充质干细胞外泌体和DMEM-F12培养基。所述表皮细胞生长因子、所述间充质干细胞外泌体与所述人毛囊间充质干细胞同源，降低甚至避免排斥反应。其中，血清替代物为美国Pall公司生产的血清替代物Ultroser G。间充质干细胞外泌体携带特定miRNA，具有增强干细胞的生物学作用。因此通过在DMEM-F12培养基中添加血清替代物、表皮细胞生长因子和间充质干细胞外泌体，促进人毛囊间充质干细胞的增殖及迁移，快速增加人毛囊间充质干细胞数量，保证生存活性，避免多代培养数量增加活性降低，为其脱发修复应用奠定基础。

进一步地，所述组合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：获取毛囊根部，用生理盐水清洗后，继续用磷酸盐缓冲溶液冲洗，加入0.25％中性蛋白酶，37℃消化1h；

步骤(2)：酶消化后，接种于条件培养基中，培养条件为37℃、5％CO₂，每两天换液一次，待细胞密度为70％～80％时，即得到原代人毛囊间充质干细胞，再将原代人毛囊间充质干细胞进行扩增培养，得到人毛囊间充质干细胞；

步骤(3)：采集静脉血进行差速离心，所述差速离心的程序为：加速30s，速度达到2700rpm后离心2min，降到2400rpm后离心4min，再加速到2700rpm离心4min，3100rpm离心3min，最后减速30s停止，静置3min后取中间层的液体，得到CGF液体；

步骤(4)：将步骤(2)得到的人毛囊间充质干细胞与步骤(3)得到的CGF液体分别加入至生理盐水中，混合均匀后得到组合物。

进一步地，所述组合物用于促进生发。

进一步地，所述组合物通过采用水光针局部回输的方式进行应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，通过CGF中富含的各种生长因子促进人毛囊间充质干细胞的存活和生长，且将人毛囊间充质干细胞控制在较低浓度时亦能达到以下效果：一是脱发修复；二是激活休止期毛囊，修复正在萎缩的毛囊，防止脱发；三是巩固脱发修复，促进毛发生长。

附图说明

图1为实验组7的改善效果图及HE染色图；

图2为实验组10的改善效果图及HE染色图；

图3为对比组2的改善效果图及HE染色图。

具体实施方式

实施例1

本实施例中的应用于促进毛发生长的一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，通过以下制备方法获得：

本实施例中的组合物为包括人毛囊间充质干细胞、CGF和生理盐水的混合溶液。

其中，本实施例中的人毛囊间充质干细胞(DSC)和CGF的体积比为1:3。

其中，本实施例中的人毛囊间充质干细胞的浓度为2.5×10⁵个/ml。

实施例2～实施例5

本实施例中的应用于促进毛发生长的一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，与实施例1的区别在于如下：

其中，人毛囊间充质干细胞和CGF的体积比不同，各实施例组合物组分配比详见表1。其余设置与实施例1相同。

实施例6～实施例10

其中，人毛囊间充质干细胞的浓度不同，各实施例组合物组分配比详见表2。其余设置与实施例1相同。

对比例1

仅使用含有人毛囊间充质干细胞的生理盐水修复脱发。

对比例2

与实施例1的区别在于如下：

其中，人毛囊间充质干细胞的浓度不同，组合物组分配比详见表2。其余设置与实施例1相同。

动物实验

使用本发明的组合物对动物进行注射实验，选取13只裸鼠，随机分为13个小组，其中10个实验组、2个对比组和1个安慰组。第1组注射实施例1获得的组合物，第2组注射实施例2获得的组合物，依次类推设置至第12组，上述12组依次为实验组1、实验组2...实验组10，注射量为1毫升；第11组注射对比例1中的组合物，注射量为1毫升，为对比组1；第12组注射对比例2中的组合物，注射量为1毫升，为对比组2；第13组注射生理盐水，注射量为1毫升，为空白组。其中注射方式均为水光针局部回输。

实验组1～5、对比组1和空白组的组合物组分参数及修复结果见下表1：

表1实验组1～5、对比组1和空白组的组合物组分参数及修复结果数据汇总表

	实验组1	实验组2	实验组3	实验组4	实验组5	对比组1	空白组
								V(DSC):V(CGF)	1:3	1:1	1:2	1:4	1:5	0	0
DSC浓度/(个/ml)	2.5×10<sup>5</sup>	2.5×10<sup>5</sup>	2.5×10<sup>5</sup>	2.5×10<sup>5</sup>	2.5×10<sup>5</sup>	2.5×10<sup>5</sup>	0
								第1周毛发数量增加(％)	18	9	14	12	10	5	2
第2周毛发数量增加(％)	39	27	35	32	29	17	11
								第3周毛发数量增加(％)	65	55	63	61	57	30	25
第4周毛发数量增加(％)	92	83	89	87	86	43	36

实验组1、6～10和对比组2的组合物组分参数及修复结果见下表2：

表2实验组1、6～10和对比组2的组合物组分参数及修复结果数据汇总表

结果分析

如表1所示，通过对比组1和空白组的对比分析，可发现，注射DSC可促进裸鼠的毛发再生。通过实验组1～5和对比组1的对比分析，可发现，注射本发明组合物后的毛发再生速度快于单独注射DSC的毛发再生速度，这可能是CGF中富含的各种生长因子促进人毛囊间充质干细胞的存活和生长。通过实验组1～5的对比分析，可发现，DSC和CGF间的配比有最优值，当配比最优时，也就是1:3时，毛发再生速度最快，毛发再生效果最好，这可能是受CGF的活性和释放影响。

如表2所示，通过实验组1、实验组6～10和对比组2的对比分析，可发现，注射一定浓度本发明组合物后的毛发再生速度快于单独注射DSC的毛发再生速度，且DSC的浓度越低，毛发再生速度越快，毛发再生效果越好。实验组7中3×10⁵个/ml浓度剂量的DSC细胞的改善效果图及HE染色图如图1(上左效果局部图，上右效果放大图，下HE染色图)所示；实验组10中1.5×10⁶个/ml浓度剂量的DSC细胞的改善效果图及HE染色图如图2(上左效果局部图，上右效果放大图，下HE染色图)所示，对比组2中7.5×10⁶个/ml浓度剂量的DSC细胞的改善效果图及HE染色图如图3(左效果局部图，右HE染色图)所示，从上图中可发现，DSC的浓度越低，毛发再生速度越快，毛发再生效果越好，而中等剂量和较高剂量的DSC细胞中未观察到剂量依赖性的原因，可能是因为注入更多数量的DSC细胞会引起组织损伤或较差的组织环境，具体地，当被注射的DSC细胞数大于1.5×10⁶个/ml时，由于营养等因素会在原位大量死亡，释放的细胞碎片引起炎症因子反应，例如免疫细胞迁移，为残留在皮肤中的DSC细胞造成较差的环境，影响DSC细胞的活化和激活。

综上所述，本发明是基于CGF中富含的各种生长因子对毛发生长的调控作用，制备人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，使得该组合物通过CGF促进人毛囊间充质干细胞的存活和生长，达到脱发修复、防止脱发并促进毛发生长的效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，其特征在于，所述组合物包括人毛囊间充质干细胞、CGF和生理盐水，所述人毛囊间充质干细胞和所述CGF的体积比为1:(1～5)。

2.根据权利要求1所述的一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，其特征在于，所述人毛囊间充质干细胞的浓度为1.0×10⁵～1.5×10⁶个/ml。

3.根据权利要求1所述的一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，其特征在于，所述人毛囊间充质干细胞的浓度为1.0×10⁵～1.0×10⁶个/ml。

4.根据权利要求1所述的一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，其特征在于，所述人毛囊间充质干细胞的浓度为1.0×10⁵～5×10⁵个/ml。

5.根据权利要求1所述的一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，其特征在于，所述人毛囊间充质干细胞的浓度为2.5×10⁵～3.5×10⁵个/ml。

6.根据权利要求1所述的一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，其特征在于，所述人毛囊间充质干细胞是通过采用条件培养基培养获得，所述条件培养基组分包括12v/v％血清替代物、7.5ng/ml表皮细胞生长因子、7ng/ml间充质干细胞外泌体和DMEM-F12培养基。

7.根据权利要求6所述的一种人毛囊间充质干细胞与CGF组合物，其特征在于，所述表皮细胞生长因子、所述间充质干细胞外泌体与所述人毛囊间充质干细胞同源。

8.一种如权利要求1所述的人毛囊间充质干细胞与CGF组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.一种如权利要求1所述的人毛囊间充质干细胞与CGF组合物的应用，其特征在于，所述组合物用于促进生发。

10.一种如权利要求1所述的人毛囊间充质干细胞与CGF组合物的应用，其特征在于，所述组合物通过采用水光针局部回输的方式进行应用。