KR101089205B1 - 인공피부 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인공피부 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인공피부는 무세포 진피 파우더, 콜라겐 및 환자유래 섬유아세포를 포함하는 진피층과; 상기 진피층 상에 형성되어 있으며 환자유래 각질형성세포를 포함하는 표피층을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면 허혈성 및 당뇨성 족부궤양, 욕창 등 만성 질환과 창상, 화상치유에 효과가 우수한 인공피부 및 그 제조방법이 제공된다.

Description

인공피부 및 그 제조방법{ARTIFICIAL SKIN AND MANUFACTURING METHOD OF THE SAME}
본 발명은 진피층과 표피층을 포함하는 인공피부 및 그 제조방법에 관한 것이다.
정상적인 피부조직의 항상성 및 기능유지를 위해서는, 혈관을 통한 충분한 산소와 영양분의 공급이 필수적이다. 피부조직에 상처가 발생한 경우에 상처치유는 육아조직 형성, 표피 재형성, 흉터 형성 등의 과정을 통하여 상처에 대해 신체가 반응하는 일련의 연속적인 과정으로 진행되는데, 이 과정에서 섬유아세포(Fibroblast) 가 근아세포(Myoblast)로 분화 되어 과도한 콜라겐을 분비해 상처의 급격한 수축을 야기한다.
이러한 수축은 일반적인 상처 환경에서는 무조건적으로 일어나는 반응인데, 이것이 심할 경우 비후성 반흔(hyperthropic scar)이나 켈로이드성 반흔(keloid scar) 이 나타날 수 있다.
비후성 반흔은 상처 범위 내에 국한되나, 켈로이드성 반흔은 정상 조직을 침범한다. 또한 상처 부의 색소 침착, 조직 구조의 변화 등을 야기하며 체온조절, 분 비물배출에 어려움을 주며 가려움증 등이 동반되기도 한다.
한편, 상처 치유시 중요한 혈액공급이 부족할 경우 궤양(ulcer)이 나타난다. 특히, 심장에서 가장 멀리 떨어져 있는 발은 가장 흔한 궤양 발생 부위이다. 만성 궤양의 원인은 당뇨병성 궤양(diabetic ulcer)과 허혈성 궤양(ischemic ulcer)으로 나눌 수 있다. 허혈성 궤양 중 정맥성 궤양이 가장 흔한 형태이고, 다음이 동맥성 궤양과 당뇨병성 신경장애에 의한 궤양이다.
상처치료의 방법에는 각 질환과 과정에 따라 치료방법이 다르며, 물리적인 수술이나 생물학적 제제등을 이용하는 방법들이 사용된다. 비후성 반흔에 대한 상처치료 방법은, 반흔이 작은 경우 절제 후 z-plasty나 W-plasty가 필요하고 큰 경우 트리암시놀론을 상처에 직접 주사해 비후성 조직을 녹이거나 콘투락투벡스 등의 흉터 완화 연고요법, 또는 시카케어 등의 흉터완화 시트치료제를 사용한다.
켈로이드성 반흔의 경우 체질적 또는 유전적으로 과도한 흉이 상처를 넘어서 생기는 형태로 완벽한 치료가 어려운 실정이다. 또한 치료 후에도 재발하거나 완벽한 재생이 힘들다.
궤양의 치료법은 일반적인 드레싱을 제외한 생물의약품으로 창상치료에 효과가 인정된 성장인자를 이용한 치료제가 많이 개발되었다. 대표적으로 상용화된 재조합 사람표피성장인자(recombinant human epidermal growth factor, 이하, 'rhEGF'라 약함)를 사용하는 방법을 들 수 있다. rhEGF는 각질형성세포의 증식을 도모하여 상처 부위의 상처치료 과정을 촉진하는데, 치료효과가 기존 치료법에 비해서는 우수한 것으로 알려져 있다. 하지만, 표피 재형성에 걸리는 시간이 길어 치 료과정 동안 이차 감염의 위험이 남아있고, 상처치유에 필요한 충분한 혈액 공급 문제를 근본적으로 해결할 수 없기 때문에, 효과적인 치료법이 될 수는 없다.
최근에는 VEGF, FGF 등의 신생혈관형성 성장인자의 유전자를 포함한 발현벡터를 생체에 투여하는 유전자 치료요법(gene therapy)이 전술한 EGF를 사용하는 방법을 대체하였으나(참조: Bauters CH et al., J. Vasc. Surg., 21:314, 한국공개특허 제2003-0043313호, Tsurumi Y et al., Circulation, 94:3281-3290, 1996), 이 방법 역시 아직까지는 안전성 문제와 성장인자가 효과적으로 작용할 수 있을 만큼 필요한 부위에 충분히 오랜 시간동안 남아 있을지 확실하지 않다는 점으로 인하여 인체에 활발하게 적용하기는 어렵다.
최근에는 조직배양 기술과 세포배양기술의 향상으로 세포와 조직을 이용하여 실제 생체조직과 유사하게 제조하여 여러 질환에 이용하는 조직공학 기법들이 이용된다. 화상이나 만성궤양 등에는 드레싱을 주로 하였으나, 다른 조직과 달리 피부 세포는 쉽게 채취가능하고 각질형성세포의 배양기법이 알려짐에 따라 세포를 피부치료에 이용하는 임상사례가 발표되어 왔다. 각질형성세포는 피부의 표피에 90% 이상 존재하는 세포로서 상처치유 기전에서 매우 중요하게 작용을 한다.
또한, 조직배양 기술과 계대배양법(serial subculture)의 향상으로 인해 4 ㎠ 크기의 작은 피부조직으로부터 얻은 각질형성세포가 1개월 내에 성인 피부 전체를 덮을 수 있을 만큼의 수로 증식하는 것이 가능할 정도로 발전하게 됨에 따라(참조: Boyce ST, J. Invest. Dermatol., 81:33s-40s, 1983), 자가피부를 사용하지 못할 정도로 심한 화상뿐만 아니라 만성 피부질환에 이식용 배양 표피층(cultured epidermal sheet graft)을 하나의 치료법으로서 이용하고 있다(참조: Donaldson DJ et al., J. Cell. Sci., 90:325-330, 1988; Green H et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76:5665-5670, 1979). 그러나 장시간의 배양기간, 변화가 심한 이식율, 낮은 부착도, 낮은 물리적 강도로 인한 취급의 어려움, 피부채취 부위의 추가적인 드레싱, 높은 가격 등의 단점들로 인하여 활발하게 이용되지는 않고 있다.
본 발명의 목적은 상처의 급격한 수축을 억제하며 감염의 위험이 없고 이식후 면역거부 반응을 최소화할 수 있으며, 상처부위의 혈액공급을 원활히 하여, 효과적인 유착 및 표피 재형성 기간의 단축을 기할 수 있는 인공피부와 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적은 인공피부에 있어서, 무세포 진피 파우더, 콜라겐 및 환자유래 섬유아세포를 포함하는 진피층과; 상기 진피층 상에 형성되어 있으며 환자유래 각질형성세포를 포함하는 표피층을 포함하는 것에 의해 달성된다.
콜라겐과 상기 환자유래 섬유아세포는 혼합되어 있을 수 있다.
상기 무세포 진피 파우더의 입자 크기는 50um-300um일 수 있다.
상기 본 발명의 목적은 인공피부의 제조방법에 있어서, 콜라겐, 환자의 피부로부터 배양한 섬유아세포 및 무세포 진피 파우더를 포함하는 진피층을 마련하는 단계; 상기 진피층을 1차 배양하는 단계; 상기 1차 배양된 진피층 상에 환자의 피 부로부터 배양한 각질형성세포를 가한 후 2차 배양하여 표피층을 형성하는 단계를 포함하는 것에 의해 달성된다.
상기 진피층을 마련하는 단계는, 상기 콜라겐 및 상기 섬유아세포를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계와; 상기 혼합물에 무세포 진피 파우더를 도입하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 1차 배양 및 제2차 배양은 30℃ 내지 36℃에서 1일 내지 5일간 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면 상처의 급격한 수축을 억제하며 감염의 위험이 없고 이식후 면역거부 반응을 최소화할 수 있으며, 상처부위의 혈액공급을 원활히 하여, 효과적인 유착 및 표피 재형성 기간의 단축을 기할 수 있는 인공피부와 그 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따른 인공피부는 진피층과 표피층으로 이루어진다.
진피층은 콜라겐, 환자 유래 섬유아세포 및 무세포진피 파우더를 포함하여 이루어져 있다. 이중, 콜라겐과 환자 유래 섬유아세포는 서로 혼합되어 있을 수 있다. 환자는 허혈성 및 당뇨성 족부궤양, 욕창 등 만성 질환과 창상, 화상환자일 수 있으며, 본 발명에 따른 인공피부를 이용한 처치를 필요한 모든 경우를 포함한다.
콜라겐은 결합조직(Connective tissue)의 구성물질로써 간엽에서 유래 되었으며 세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 에 다량으로 분포하고 있다. 콜라겐 은 다른 조직의 지지 및 뼈대 형성을 담당한다. 콜라겐은 인공피부를 환자에 적용하는 경우 이식을 용이하게 하며, 급격한 상처 크기 변화를 방지한다.
섬유아세포는 이러한 콜라겐의 생합성(biosynthesis)과 리모델링에 직접적으로 관여하는 세포이다. 섬유아세포는 콜라겐 매트릭스를 꿰뚫고 들어가서 섬유질과 뒤엉키며 이때 섬유아세포는 뚜렷한 신호전달체계와 세포이동을 나타낸다. 또한 섬유아세포는 표피세포와의 상호작용을 통해 안정적으로 구조형성 단백질을 생산하도록 하며, 이로 인해 실제 피부와 유사한 진피 표피연결부 (Dermal epidermal junction, DEJ) 구조를 형성한다. 섬유아세포는 환자에 적용시 성장인자를 분비하여 피부재생을 촉진시킨다.
무세포진피 파우더는 피부조직 내 진피층의 3차원적 구조를 손상시키지 않고 다양한 구조 단백질 및 성분들을 유지한 상태에서 면역반응의 대상인 세포성 항원과 표피만을 선별적으로 제거한 것이다. 무세포진피 파우더의 크기는 50㎛~300㎛를 사용하며, 무세포진피 파우더는 수화된 후 환자에게 적용될 수 있으며, 상처의 급격한 수축을 억제한다.
표피층은 환자유래 각질형성세포로 이루어져 있다. 환자 유래 각질형성세포는 환자에 적용시 분화되어 피부 재생을 촉진시킨다.
이상의 구성에서 비세포성 물질인 콜라겐은 거부반응을 일으키지 않는다. 섬유아세포와 각질형성세포는 거부반응을 일으킬 수 있으나, 본 발명에서는 환자유래 섬유아세포 및 환자유래 각질형성세포를 사용하기 때문에 거부반응이 없다. 무세포진피 파우더는 면역반응의 대상물질을 제거하였기 때문에 역시 거부반응이 없다. 따라서 본 발명에 따른 인공피부는 환자에 사용 시 거부반응을 일으키지 않는다.
이상 설명한 인공피부의 단면은 도 1과 같은 형태를 가질 수 있다.
도 2를 참조하여 본 발명에 따른 인공피부의 제조방법을 설명한다.
먼저 환자의 피부조직으로부터 표피조직과 진피조직을 분리한다(S10). 진피조직으로부터 섬유아세포를 얻어 배양하고 표피조직으로부터는 각질형성세포를 얻어 역시 배양한다(S20). 배양된 세포는 이후 사용시까지 냉동 보관될 수 있다.
진피조직에서 섬유아세포를 분리배양한다. 배양된 섬유아세포를 0.5×106/cm2 내지 2×106/cm2의 세포수를 포함하여 콜라겐과 혼합한다(S30). 이후 혼합물에 무세포진피 파우더를 가한다(S40). 이 과정은 무세포진피 파우더에 혼합물을 분주하여 수행될 수 있다. 이로써 진피층이 완성되며, 이후 진피층을 배양하는데, 배양은 30℃ 내지 36℃에서 3일 내지 7일간 수행될 수 있다(S50).
다음으로 진피상에 배양된 각질형성세포를 부착하여 표피층을 제조한다(S60). 각질형성세포는 1×106/cm2 내지 2×106/cm2의 수준으로 부착될 수 있다. 이로써 진피층과 표피층을 포함하는 인공피부가 완성되며, 이후 인공피부를 추가로 배양하는데, 이 때의 배양 역시 배양은 30℃ 내지 36℃에서 3일 내지 7일간 수행될 수 있다(S70).
이상의 설명에서 진피층, 표피층 및 인공피부의 용어는 배양 여부와 관계없이 사용하였으나, 각각에 있어 배양 전 후의 구성 및 특성은 다소 상이하다.
위 설명에서 진피층의 제조과정 중 콜라겐, 섬유아세포 및 무세포진피 파우 더의 위 설명에 한정되지 않고 다양하게 변화될 수 있다.
이하 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
인공피부의 제조
환자의 피부조직을 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 5x(Sigma, 미국), 가 포함된 DMEM 배지(Gibco BRL, 미국)에 보관하여 운반하였다. 무균작업대 안에서 75% EtOH 와 인산 완충용액(pH 7.4)으로 2 내지 3회 세척하였다.
세척한 조직을 0.05% 트립신(Hyclone, 미국), 0.02% EDTA(Sigma, 미국) 용액에 넣고 30℃ 내지 37℃의 CO2 배양기에서 2시간 배양하였다. 피부조직을 꺼내어 트립신 비활성화를 위해 잠시 동안 1% FBS (Gibco BRL, 미국) 에 담가 중화반응 시키고 멸균된 집게를 이용하여 표피조직과 진피조직을 분리시켰다.
섬유아세포를 얻기 위하여 분리된 진피조직을 T-25플라스크 배양 용기에 접종하고 배양액은 10% FBS (Gibco BRL, 미국) 와 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 1x(Sigma, 미국)가 함유된 DMEM 배지(Gibco BRL, 미국) 에 5ml 침지 후 30℃ 내지 37℃에서 배양하였다. 진피조직에서 섬유아세포가 뻗어 나와 배양 용기에 80% 이상 차게 되면 섬유아세포를 떼어 계대배양 및 냉동 보관한다.
각질형성세포를 얻기 위하여 피부조직 중 진피조직을 제거한 표피조직을 인산 완충용액(pH 7.4) 에 넣고 파이펫팅 하여 단일세포화 하였다. 현탁액을 세포 거 름망에 부은 뒤, 3000rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상등액을 제거하고 페니실린-스트렙토마이신 혼합액 1x(Sigma, 미국)가 함유된 KGM 배지(Gibco BRL, 미국) 에 5ml 침지 후 30℃ 내지 37℃의 5% CO2 배양조건에서 배양하였다. 배양 용기에 80% 이상 차게 되면 각질형성세포를 떼어 계대배양 및 냉동 보관한다.
두 번의 계대배양을 통해 자가 섬유아세포가 0.5x106/ml 내지 2x106/ml 만큼 증식하게 되면 단일섬유아세포 현탁액으로 분리하였다. 시판 콜라겐인 Matric-CSC(Bioland, Korea) 와 Hank's Balanced medium과 섬유아세포를 각각 7:1:2 의 비율로 섞은 뒤, 파우더형 무세포진피 20mg을 올린 6well 용 Insert 에 2ml 분주 한 다음, 30℃ 내지 37℃에서 3일간 배양시켰다.
이 후 두 번 계대 배양한 자가 각질형성세포를 섬유아세포와 파우더형 무세포진피 가 함유된 콜라겐 겔 위에 0.5-2x106/cm2 만큼 부착 한 뒤 DMEM 배지를 채우고 30℃ 내지 37℃에서 3일간 배양 하여 실시예 1에 따른 인공피부를 제조하였다.
추가로 실시예 1과 유사한 방법을 사용하되 진피층 중 콜라겐과 무세포진피 파우더의 구성을 달리하여 비교예 1 내지 3의 인공피부를 제조하였다.
실시예와 비교예 1 내지 3을 비교하면 다음 표 1과 같다.
<표 1>
실시예 비교예 1 비교예 2 비교예 3
콜라겐 콜라겐 피브린겔 피브린 겔
무세포진피 파우더 사용 안함 사용 안함 사용
인공피부의 치유효과 테스트
실험용 동물로 생후 6 내지 8주가 된 면역결핍 생쥐(athymic nude mouse, Balb/c-nu, SLC, 일본)를 이용하여, 무균작업대 안에서 25마리의 생쥐에 Zoletil(40mg/kg) 과 럼푼(40mg/kg) 을 복강주사 하여 마취시킨 다음, 생쥐의 등에 직경 8mm의 크기로 근육의 근막 부위까지 원형의 깊은 상처를 내었다.
상처부위를 바세린 거즈(Johnson and Johnson, New Brunswick, 미국), 마른 면 거즈로 드레싱을 하고, medipore (3M, 미국) 로 고정 하였다. 매일 드레싱 상태를 확인하면서 상처가 치유되는 과정을 관찰하였다.
상처 치유의 효과는 도 3 내지 도 5에 나타나 있다. 도 3 내지 도 5에 사용된 기호와 실시예 및 비교예와의 관계를 아래 표 2에 나타냈다. 비교예 4는 상처를 낸 뒤 도포를 하지 않은 경우이다.
<표 2>
실시예 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4
B A C D E
콜라겐 겔
무세포진피 파우더 사용		 콜라겐 겔
무세포진피 파우더 사용 안함		 피브린겔 사용
무세포진피 파우더 사용 안함		 피브린겔 사용
무세포진피 파우더 사용		 처치 없음
도 3을 보면 비교예 4(E)는 6일차부터 급격한 수축 현상을 보였으며 9일차에는 빠르게 창상부위가 폐쇄창(closed wound) 형태가 되었다. 상처가 수축만 되었을 뿐 완전한 창상치유는 이루어지지 않았다.
콜라겐을 사용한 실시예(B) 및 비교예 1(A)은 무세포진피의 유무에 관계없이 3일차 수분을 어느 정도 유지 하며 상처에 밀착하고 있으며, 9일차까지 서서히 분해되는 것을 알 수 있었다.
반면 피브린 겔을 사용한 비교예 2(C)와 비교예 3(D)의 경우 6일차 까지도 피브린겔이 분해되지 않고 남아 있었으며 특히 무세포 진피 파우더를 사용하지 않은 비교예 2(C) 의 경우 염증 반응이 나타났다.
도 3의 결과를 통해, 콜라겐이 서서히 분해되면서 인공피부를 상처에 밀착시킴을 알 수 있다.
도 4에서는 각 그룹간의 시간별 상처 수축 현상을 디지털 픽셀을 계수하여 비교하였다. 비교예 4(E)에서는 12일 차에 상처가 80%로 급속하게 수축하였다.
무세포진피를 사용하지 않은 비교예 1(A)과 비교예 2(C)는 6일차 까지 수축을 억제 하다가 급격히 수축이 진행되는 것을 확인하였다.
무세포 진피를 사용한 실시예(B) 및 비교예 2(C) 역시 6일차까지 수축이 억제 되었으나 피브린 겔을 사용한 비교예 3(D)의 경우 상처확장이 80% 이상 급격하게 이루어졌다. 반면 콜라겐을 사용한 실시예(B)는 서서히 실제 상처 넓이와 유사한 넓이로 수축함을 확인하였다.
도 4의 결과를 통해, 무세포 진피 파우더와 콜라겐이 급격한 상처확장 및 급격한 상처수축을 방지하여 흉터 없는 치료가 가능하게 함을 알 수 있다.
상처 치유능의 구조적인 확인을 위해 적용 12 일차에 각 동물모델을 희생시 키고 10% 포르말린에 고정하여 조직을 파라핀 블록을 만든 뒤. Section 한 조직에 헤마토자일렌과 에오신 (hematoxylin & eosin (H&E)) 염색을 실시한 결과를 도 5 에 나타내었다. 콜라겐을 사용한 실시예(B) 및 비교예 1(A)는 콜라겐이 분해되고 피딱지(clot)을 형성하고 있었으며 진피층에 섬유아세포에 의한 세포증식 및 구조형성이 활발하게 진행됨을 확인하였다.
또한 이 중에서도 무세포 진피가 함유된 실시예(B)의 경우 피딱지(clot)이 떨어지며 화살표와 같은 정상적인 재상피화가 빠르게 나타났다.
피브린을 사용한 비교예 2(C) 및 비교예 3(D)의 경우 피브린 겔이 분해되지 않고 형태가 대부분 남아 있었으며, 섬유아세포에 의한 세포증식이 미약하게 나타났다. 도포치료를 하지 않은 비교예 4(E)의 경우 육안판정과 마찬가지로 수축현상이 심하게 나타남이 확인되었으며, 자연치유의 일반적인 형태인 'V' 폼이 나타났다.
이상과 같이 본 발명에 따른 인공피부를 상처에 도포하면, 콜라겐에 의해 세포와 파우더형 무세포 진피가 고정된 상태에서 섬유아세포가 분비하는 ECM 구성물질 및 성장인자가 표피세포의 결합 및 분화, 진피층의 형성을 촉진한다. 그러므로 혈관신생 및 빠른 시간 내의 피부재생을 유도하고, 각질세포로부터 피부재생에 필요한 각종 단백질이 분비되어 피부형성을 촉진하므로 손상된 부위의 이차감염을 효과적으로 방지 한다. 결과적으로 혈성 및 당뇨성 족부궤양, 욕창 등 만성 질환과 광범위한 창상, 화상 등의 치료에 본 발명의 인공피부를 사용하면, 수축을 억제하고 치료효과를 증진 시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 인공피부 단면의 예시이고,
도 2는 본 발명에 따른 인공피부의 제조방법을 설명하기 위한 순서도이고,
도 3은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 상처 크기 변화를 설명하기 위한 사진이고,
도 4는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 상처 크기 변화를 설명하기 위한 그래프이고,
도 5는 본 발명의 실시예 및 비교예의 상처 치유 효능을 설명하기 위한 조직 사진이다.

Claims (6)

  1. 인공피부에 있어서,
    무세포 진피 파우더, 콜라겐 및 자가피부조직에서 유래된 하나의 공여부위에서 분리된 섬유아세포를 포함하는 진피층과;
    상기 진피층 상에 형성되어 있으며 자가피부조직에서 유래된 하나의 공여부위에서 분리된 각질형성세포를 포함하는 표피층을 포함하는 인공피부.
  2. 제 1항에 있어서,
    콜라겐과 상기 섬유아세포는 혼합되어 있는 것을 특징으로 하는 인공피부.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 무세포 진피 파우더의 입자 크기는 50um-300um인 것을 특징으로 하는 인공피부.
  4. 인공피부의 제조방법에 있어서,
    콜라겐, 자가피부조직에서 유래된 하나의 공여부위에서 분리하여 배양한 섬유아세포 및 무세포 진피 파우더를 포함하는 진피층을 마련하는 단계;
    상기 진피층을 1차 배양하는 단계;
    상기 1차 배양된 진피층 상에 자가피부조직에서 유래된 하나의 공여부위에서 분리하여 배양한 각질형성세포를 가한 후 2차 배양하여 표피층을 형성하는 단계를 포함하는 인공피부의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 진피층을 마련하는 단계는,
    상기 콜라겐 및 상기 섬유아세포를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계와;
    상기 혼합물에 무세포 진피 파우더를 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인공피부의 제조방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 1차 배양 및 제2차 배양은 30℃ 내지 36℃에서 1일 내지 5일간 수행되는 것을 특징으로 하는 인공피부의 제조방법.
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