CN114958733A - 一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114958733A
CN114958733A CN202110866460.2A CN202110866460A CN114958733A CN 114958733 A CN114958733 A CN 114958733A CN 202110866460 A CN202110866460 A CN 202110866460A CN 114958733 A CN114958733 A CN 114958733A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hair follicle
stem cells
mesenchymal stem
culture
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110866460.2A
Other languages
English (en)
Inventor
孙浩博
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Bobaiyue Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Bobaiyue Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Bobaiyue Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Bobaiyue Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110866460.2A priority Critical patent/CN114958733A/zh
Publication of CN114958733A publication Critical patent/CN114958733A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0666—Mesenchymal stem cells from hair follicles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1164—NK cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：获取自体毛囊组织块，并制作毛囊工程组织块；将制作的毛囊工程组织块置于细胞培养基中进行培养1‑2天，然后将培养之后的毛囊工程组织块与细胞培养基置于分离培养罐中进行细胞分离；对分离之后的毛囊工程组织细胞进行分选，获得间充质干细胞；然后对间充质干细胞进行诱导培养，使其形变得毛囊间充质干细胞，本发明通过建立毛囊工程组织块，然后对毛囊工程组织块进行培养，以获得毛囊间充质干细胞适应的生长环境，并通过分选提取优质的毛囊间充质干细胞，同时采用扩增培养液对获得的优质毛囊间充质干细胞进行扩增处理，从而得到大量的毛囊间充质干细胞，有利于实际的应用。

Description

一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法。
背景技术
现有生活中，间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建，当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应，间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中，由于它分化的组织类型十分广泛，因此临床应用价值不菲，而随着科学技术的进步，毛囊间充质干细胞也逐渐被发现，人毛囊间充质干细胞不仅具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞特性，同时具有来源丰富、获取方便和无伦理问题等优势，因此得到越来越多国内外学者的关注，已经成为再生医学研究和应用中重要的自体干细胞来源，同时毛囊是皮肤附属器之一，起源于胚胎发育时期表皮与间充质间相互作用，毛囊不断经历生长期、退行期和静止期，周而复始，形成毛囊周期，毛囊周期伴随人类一生，同时毛囊中含有多种干细胞，包括角肮干细胞、黑色素干细胞、神经脊干细胞和间充质干细胞，这些干细胞在时空上相互作用，共同维持毛囊的自我更新和毛囊周期正常运行，因此毛囊间充质干细胞在脱发方面也有较好的应用前景。
但是现有的技术中，毛囊的间充质干细胞或存在细胞数量少的问题，或存在有创的问题，或存在受身体健康情况限制的问题而无法实现自体间充质干细胞的应用，因此，寻找新的自体毛囊间充质干细胞并成功培养是非常必要的。
发明内容：
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，解决了背景技术中提到的问题。
为了解决上述问题，本发明提供了一种技术方案：
一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取自体毛囊组织块，并制作毛囊工程组织块；
S2、将制作的毛囊工程组织块置于细胞培养基中进行培养1-2天，然后将培养之后的毛囊工程组织块与细胞培养基置于分离培养罐中进行细胞分离；
S3、对分离之后的毛囊工程组织细胞进行分选，获得间充质干细胞；
S4、然后对间充质干细胞进行诱导培养，使其形变得毛囊间充质干细胞；
S5、最后对毛囊间充质干细胞进行扩增。
作为优选，所述步骤S1中获取自体毛囊组织块的具体操作为：提取3-5个完整的毛囊，然后采用无水乙醇对其进行清洗，清洗完成后采用组织剪将其剪切成碎块。
作为优选，所述步骤S1中制作毛囊工程组织块的具体操作为：
S11、将获取的自体毛囊组织块置于培养液A中，培养出毛囊组织细胞；
S12、然后选择生长状态良好的毛囊组织细胞，并将其经过细胞培养液的上清液进行诱导培养；
S13、将经过诱导培养之后的毛囊组织细胞置于培养皿中，并加入生理盐水与培养液B，同时采用旋转培养4-5天，待毛囊组织细胞适应培养液B，以300rpm离心弃去上清液，换培养液C培养24小时，获得毛囊工程组织块。
作为优选，所述步骤S11中的培养液A中含有0.4-0.9mM浓度的氯化钙，所述步骤S13中的培养液B为500ml的含有V/V为20％胎牛血清的商用DMEM培养液与35ng的纤维细胞生长因子bFGF的混合物，所述S13中的培养液C为500ml的无血清商用williamsE培养液与20ng的胰岛素样生长因子的混合物。
作为优选，所述步骤S2中的细胞培养基中含有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子，所述表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子的比例为1:2:2:3。
作为优选，所述步骤S3中对分离之后的毛囊工程组织细胞进行分选的具体操作步骤为：
S31、将毛囊工程组织细胞用超级顺磁性的MACS微型磁珠进行特异性标记；
S32、磁性标记完后，将分选柱安装在强磁场中；
S33、将这些细胞通过分选柱在重力的作用下流尽；
S34、分选柱里的基质形成一个高梯度磁场，被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。
作为优选，所述步骤S4中对间充质干细胞进行诱导培养的具体操作步骤为：将步骤S3中获得的间充质干细胞再次置于细胞培养基中进行培养融合，当融合度大于90％后，进行诱导培养，加入培养液A培养至细胞发生形变后，更换培养液C进行培养，得间充质干细胞。
作为优选，所述步骤S5中对毛囊间充质干细胞进行扩增的具体操作步骤为：将毛囊间充质干细胞置于培养液D中进行培养。
作为优选，所述培养液D是由DMEM基础培养基、NK细胞外泌体与12mmol/L的谷氨酰胺组成的。
本发明的有益效果是：本发明通过建立毛囊工程组织块，然后对毛囊工程组织块进行培养，以获得毛囊间充质干细胞适应的生长环境，并通过分选提取优质的毛囊间充质干细胞，同时采用扩增培养液对获得的优质毛囊间充质干细胞进行扩增处理，从而得到大量的毛囊间充质干细胞，有利于实际的应用。
附图说明：
为了易于说明，本发明由下述的具体实施及附图作以详细描述。
图1是本发明自体毛囊间充质干细胞的制备方法流程图
具体实施方式：
如图1所示，本具体实施方式采用以下技术方案：
实施例：
一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取自体毛囊组织块，并制作毛囊工程组织块；
S2、将制作的毛囊工程组织块置于细胞培养基中进行培养1-2天，然后将培养之后的毛囊工程组织块与细胞培养基置于分离培养罐中进行细胞分离；
S3、对分离之后的毛囊工程组织细胞进行分选，获得间充质干细胞；
S4、然后对间充质干细胞进行诱导培养，使其形变得毛囊间充质干细胞；
S5、最后对毛囊间充质干细胞进行扩增。
其中，所述步骤S1中获取自体毛囊组织块的具体操作为：提取3-5个完整的毛囊，然后采用无水乙醇对其进行清洗，清洗完成后采用组织剪将其剪切成碎块。
其中，所述步骤S1中制作毛囊工程组织块的具体操作为：
S11、将获取的自体毛囊组织块置于培养液A中，培养出毛囊组织细胞；
S12、然后选择生长状态良好的毛囊组织细胞，并将其经过细胞培养液的上清液进行诱导培养；
S13、将经过诱导培养之后的毛囊组织细胞置于培养皿中，并加入生理盐水与培养液B，同时采用旋转培养4-5天，待毛囊组织细胞适应培养液B，以300rpm离心弃去上清液，换培养液C培养24小时，获得毛囊工程组织块。
其中，所述步骤S11中的培养液A中含有0.4-0.9mM浓度的氯化钙，所述步骤S13中的培养液B为500ml的含有V/V为20％胎牛血清的商用DMEM培养液与35ng的纤维细胞生长因子bFGF的混合物，所述S13中的培养液C为500ml的无血清商用williamsE培养液与20ng的胰岛素样生长因子的混合物。
其中，所述步骤S2中的细胞培养基中含有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子，所述表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子的比例为1:2:2:3。
其中，所述步骤S3中对分离之后的毛囊工程组织细胞进行分选的具体操作步骤为：
S31、将毛囊工程组织细胞用超级顺磁性的MACS微型磁珠进行特异性标记；
S32、磁性标记完后，将分选柱安装在强磁场中；
S33、将这些细胞通过分选柱在重力的作用下流尽；
S34、分选柱里的基质形成一个高梯度磁场，被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。
其中，所述步骤S4中对间充质干细胞进行诱导培养的具体操作步骤为：将步骤S3中获得的间充质干细胞再次置于细胞培养基中进行培养融合，当融合度大于90％后，进行诱导培养，加入培养液A培养至细胞发生形变后，更换培养液C进行培养，得间充质干细胞。
其中，所述步骤S5中对毛囊间充质干细胞进行扩增的具体操作步骤为：将毛囊间充质干细胞置于培养液D中进行培养。
其中，所述培养液D是由DMEM基础培养基、NK细胞外泌体与12mmol/L的谷氨酰胺组成的。
具体的：在进行实际的操作时，首先获取自体毛囊组织块，提取3-5个完整的毛囊，然后采用无水乙醇对其进行清洗，清洗完成后采用组织剪将其剪切成碎块，然后制作毛囊工程组织块，将获取的自体毛囊组织块置于培养液A中，培养出毛囊组织细胞，然后选择生长状态良好的毛囊组织细胞，并将其经过细胞培养液的上清液进行诱导培养，将经过诱导培养之后的毛囊组织细胞置于培养皿中，并加入生理盐水与培养液B，同时采用旋转培养4-5天，待毛囊组织细胞适应培养液B，以300rpm离心弃去上清液，换培养液C培养24小时，获得毛囊工程组织块，其中，培养液A中含有0.4-0.9mM浓度的氯化钙，培养液B为500ml的含有V/V为20％胎牛血清的商用DMEM培养液与35ng的纤维细胞生长因子bFGF的混合物，培养液C为500ml的无血清商用williamsE培养液与20ng的胰岛素样生长因子的混合物；
将制作的毛囊工程组织块置于细胞培养基中进行培养1-2天，然后将培养之后的毛囊工程组织块与细胞培养基置于分离培养罐中进行细胞分离，细胞培养基中含有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子，其中，表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子的比例为1:2:2:3；
对分离之后的毛囊工程组织细胞进行分选，获得间充质干细胞，具体步骤为：将毛囊工程组织细胞用超级顺磁性的MACS微型磁珠进行特异性标记，磁性标记完后，将分选柱安装在强磁场中，将这些细胞通过分选柱在重力的作用下流尽，分选柱里的基质形成一个高梯度磁场，被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出，当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，可以获得标记和未标记的两个细胞组份；
然后对间充质干细胞进行诱导培养，将上述步骤中获得的间充质干细胞再次置于细胞培养基中进行培养融合，当融合度大于90％后，进行诱导培养，加入培养液A培养至细胞发生形变后，更换培养液C进行培养，使其形变得毛囊间充质干细胞；
最后对毛囊间充质干细胞进行扩增，将毛囊间充质干细胞置于培养液D中进行培养，培养液D是由DMEM基础培养基、NK细胞外泌体与12mmol/L的谷氨酰胺组成的。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“同轴”、“底部”、“一端”、“顶部”、“中部”、“另一端”、“上”、“一侧”、“顶部”、“内”、“前部”、“中央”、“两端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量，由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”、“第四”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置”、“连接”、“固定”、“旋接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、获取自体毛囊组织块，并制作毛囊工程组织块；
S2、将制作的毛囊工程组织块置于细胞培养基中进行培养1-2天，然后将培养之后的毛囊工程组织块与细胞培养基置于分离培养罐中进行细胞分离；
S3、对分离之后的毛囊工程组织细胞进行分选，获得间充质干细胞；
S4、然后对间充质干细胞进行诱导培养，使其形变得毛囊间充质干细胞；
S5、最后对毛囊间充质干细胞进行扩增。
2.根据权利要求1所述的一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中获取自体毛囊组织块的具体操作为：提取3-5个完整的毛囊，然后采用无水乙醇对其进行清洗，清洗完成后采用组织剪将其剪切成碎块。
3.根据权利要求1所述的一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中制作毛囊工程组织块的具体操作为：
S11、将获取的自体毛囊组织块置于培养液A中，培养出毛囊组织细胞；
S12、然后选择生长状态良好的毛囊组织细胞，并将其经过细胞培养液的上清液进行诱导培养；
S13、将经过诱导培养之后的毛囊组织细胞置于培养皿中，并加入生理盐水与培养液B，同时采用旋转培养4-5天，待毛囊组织细胞适应培养液B，以300rpm离心弃去上清液，换培养液C培养24小时，获得毛囊工程组织块。
4.根据权利要求3所述的一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中的培养液A中含有0.4-0.9mM浓度的氯化钙，所述步骤S13中的培养液B为500ml的含有V/V为20％胎牛血清的商用DMEM培养液与35ng的纤维细胞生长因子bFGF的混合物，所述S13中的培养液C为500ml的无血清商用williamsE培养液与20ng的胰岛素样生长因子的混合物。
5.根据权利要求1所述的一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的细胞培养基中含有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子，所述表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子的比例为1:2:2:3。
6.根据权利要求1所述的一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中对分离之后的毛囊工程组织细胞进行分选的具体操作步骤为：
S31、将毛囊工程组织细胞用超级顺磁性的MACS微型磁珠进行特异性标记；
S32、磁性标记完后，将分选柱安装在强磁场中；
S33、将这些细胞通过分选柱在重力的作用下流尽；
S34、分选柱里的基质形成一个高梯度磁场，被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。
7.根据权利要求1所述的一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中对间充质干细胞进行诱导培养的具体操作步骤为：将步骤S3中获得的间充质干细胞再次置于细胞培养基中进行培养融合，当融合度大于90％后，进行诱导培养，加入培养液A培养至细胞发生形变后，更换培养液C进行培养，得间充质干细胞。
8.根据权利要求1所述的一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中对毛囊间充质干细胞进行扩增的具体操作步骤为：将毛囊间充质干细胞置于培养液D中进行培养。
9.根据权利要求8所述的一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述培养液D是由DMEM基础培养基、NK细胞外泌体与12mmol/L的谷氨酰胺组成的。
CN202110866460.2A 2021-07-29 2021-07-29 一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法 Pending CN114958733A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110866460.2A CN114958733A (zh) 2021-07-29 2021-07-29 一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110866460.2A CN114958733A (zh) 2021-07-29 2021-07-29 一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114958733A true CN114958733A (zh) 2022-08-30

Family

ID=82973221

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110866460.2A Pending CN114958733A (zh) 2021-07-29 2021-07-29 一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114958733A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050272147A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods for ex vivo propagation of somatic hair follicle stem cells
CN1834253A (zh) * 2006-03-30 2006-09-20 中国人民解放军第二军医大学 人早胚来源的表皮或毛囊干细胞的制备及应用
WO2008004819A1 (en) * 2006-07-05 2008-01-10 Seoul National University Industry Foundation Method for isolation of a hair follicle stem cell and a composition for hair reproduction
CN101775366A (zh) * 2010-02-05 2010-07-14 中国人民解放军第四军医大学 一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法
CN107201341A (zh) * 2017-07-12 2017-09-26 广州润虹医药科技股份有限公司 一种毛囊干细胞的制备方法
CN110964689A (zh) * 2019-11-27 2020-04-07 浙江卫未生物医药科技有限公司 恢复毛囊源细胞干性或增殖能力的方法
CN112063582A (zh) * 2020-08-20 2020-12-11 吉林省银丰生物工程技术有限公司 一种毛囊间充质干细胞的培养方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050272147A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods for ex vivo propagation of somatic hair follicle stem cells
CN1834253A (zh) * 2006-03-30 2006-09-20 中国人民解放军第二军医大学 人早胚来源的表皮或毛囊干细胞的制备及应用
WO2008004819A1 (en) * 2006-07-05 2008-01-10 Seoul National University Industry Foundation Method for isolation of a hair follicle stem cell and a composition for hair reproduction
CN101775366A (zh) * 2010-02-05 2010-07-14 中国人民解放军第四军医大学 一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法
CN107201341A (zh) * 2017-07-12 2017-09-26 广州润虹医药科技股份有限公司 一种毛囊干细胞的制备方法
CN110964689A (zh) * 2019-11-27 2020-04-07 浙江卫未生物医药科技有限公司 恢复毛囊源细胞干性或增殖能力的方法
CN112063582A (zh) * 2020-08-20 2020-12-11 吉林省银丰生物工程技术有限公司 一种毛囊间充质干细胞的培养方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERHAN MUNEEB等: "Hair growth control by innate immunocytes: Perifollicular macrophages revisited", EXPERIMENTAL DERMATOLOGY *
南韦肖;张海华;司华哲;李光玉;: "哺乳动物毛囊体外培养的研究进展", 饲料研究 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102491558B1 (ko) 세포 배양 배지를 사용한 제대 양막(umbilical cord amniotic membrane)으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법
EP1845154A1 (en) Multipotent stem cells derived from placenta tissue and cellular therapeutic agents comprising the same
KR20100065338A (ko) 인간 또는 동물 배아에서 중간엽 줄기세포를 추출 및 그 분비물을 추출하는 방법
CN101483998A (zh) 收集和使用胎盘脐血干细胞的方法
EP2374485A1 (en) New dermal substitute and therapeutical application thereof
CN113564111B (zh) 一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法
Benda et al. Urine as a source of stem cells
CN113980894A (zh) 制备骨髓浓缩细胞的方法及其用于治疗卵巢早衰的用途
KR20200143399A (ko) 중간엽 줄기 세포의 창상 치유 특성을 유도 또는 개선시키는 방법
CN114177203A (zh) 脐带血浓缩细胞治疗卵巢早衰的细胞治疗剂
US20200149005A1 (en) The method of autologous primary hair follicles preparation in 3d culture
CN110839614B (zh) 一种自体脐带间充质干细胞冻存液及其制备和冻存方法
CN114958733A (zh) 一种自体毛囊间充质干细胞的制备方法
Liu et al. Mesenchymal Stem Cell Preparation and Transfection‐free Ferumoxytol Labeling for MRI Cell Tracking
WO2023217130A1 (zh) 包含骨骼肌前体样细胞的生物制剂及其制备方法和应用
CN108660108A (zh) 一种可增强脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法
CN113073078B (zh) 脐带来源间充质干细胞制备的通用型血小板制剂及方法
CN107384862B (zh) MSCs来源的雪旺细胞的制备方法及试剂盒
WO2012034348A1 (zh) 逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液、方法及用途
CN111849904B (zh) 神经母细胞瘤类器官的培养基、培养方法及移植体
CN115595299A (zh) 间质干细胞培养物及其制备方法
JP2022518159A (ja) ヒト脂肪組織幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの増幅方法
CN110878287A (zh) 一种过表达tat-kgf的干细胞上清液制备方法及其应用
CN116396930B (zh) 间充质干细胞无血清培养基及其应用
CN113943700B (zh) 一种牛血清外泌体用于干细胞培养的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination