CN115595299A - 间质干细胞培养物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种间质干细胞培养物及其制备方法。间质干细胞培养物的制备方法包括：将预定数量的间质干细胞种于含有第一培养基质的平面培养装置中；当间质干细胞增殖到目标数量时，将第一培养基质替换为第二培养基质，并在培养18至30小时之后移除第二培养基质；加入目标培养基质并培养48至72小时；重复收集目标培养基质；以及过滤及浓缩目标培养基质，得到间质干细胞培养物。

Description

间质干细胞培养物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养物，特别是涉及一种间质干细胞培养物及其制备方法。
背景技术
干细胞(stem cell)是具有分化能力与自我增生能力的未分化细胞，已被现代社会广泛研究用于再生医学中。其中，属于成体干细胞(adult stem cell)的间质干细胞(mesenchymal stem cell)为近年来被广泛研究的干细胞之一，其可以从人体中各组织分离出来(例如：脂肪、牙齿、脐带、毛囊等)，并应用于修复受伤组织、抗发炎、移植医学等。近年研究发现，由干细胞所分泌的蛋白质亦具有修复细胞功能的效果，因此，如何大量萃取出干细胞培养产物为本领域的一大发展方向。
干细胞培养可以分为二维培养与三维培养。传统二维培养的方式是让细胞贴附生长，因此可以直接吸取培养液，细胞活性也较为稳定，然而传统培养皿的培养液容量有限，并无法大量生产。三维培养系让细胞附着于载体上，并以悬浮方式培养，相较于二维培养具有更广的培养面积，可一次性收取大量的培养液。然而，三维培养会因为微载体的材质不同而影响细胞的附着效果，且三维培养需以旋转瓶或叶扇型发酵槽作为培养容器，在培养液旋转时会产生剪力，造成细胞压力或细胞损伤。在收取培养液时，也需要进一步将细胞先离心下来才能收取培养液。因此三维培养的仪器成本昂贵且人力作业时程漫长，产品质量也容易因细胞状况不佳而不稳定。
故，如何通过制备方式的改良以克服上述的缺陷，并提升干细胞培养产物的收取产量与稳定质量，已成为该项事业所欲解决的重要课题之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，针对现有技术的不足提供一种间质干细胞培养物及其制备方法，其可以获得稳定的产量与产品质量，且可以重复收取培养基质，达到有效利用。
为了解决上述的技术问题，本发明所采用的其中一技术方案是提供一种间质干细胞培养物的制备方法，其可包括至少下列步骤。步骤(a)，将一预定数量的间质干细胞种于含有一第一培养基质的一平面培养装置中，以进行细胞增殖。步骤(b)，当所述间质干细胞增殖到一目标数量时，将所述第一培养基质替换为一第二培养基质，并在培养18至30小时之后移除所述第二培养基质。步骤(c)，加入一目标培养基质并培养48至72小时。步骤(d)，收集所述目标培养基质。步骤(e)，重复步骤(c)至步骤(d)1至5次。步骤(f)，过滤及浓缩所述目标培养基质，得到一间质干细胞培养物。
优选地，所述间质干细胞的来源为毛囊或皮肤。
优选地，所述预定数量为1×107至5×107个细胞。
优选地，所述第一培养基质包含胎牛血清及抗生素，所述第二培养基质不包含胎牛血清及抗生素。
优选地，所述平面培养装置的细胞贴附表面积为6000至6500平方厘米。
优选地，所述平面培养装置包括10个培养平台，每一个所述平台的表面积为600至650平方厘米。
优选地，所述目标数量为6×107至1×108个细胞。
优选地，在步骤(f)中，所述间质干细胞培养物是先通过一滤膜，再通过一切向流过滤系统所得到的；其中，所述滤膜的孔径为0.22微米。
优选地，在步骤(f)中进一步包含：利用一切向流过滤系统搭配截留分子量为3至5kD的一中空纤维膜，浓缩过滤所述目标培养基质中的所述间质干细胞培养物，并将所述间质干细胞培养物置换于一蛋白质保存液中。
为了解决上述的技术问题，本发明所采用的另外一技术方案是提供一种间质干细胞培养物，其是由前述的制备方法所制得的。
优选地，所述间质干细胞培养物包含至少一种蛋白质，所述蛋白质选自于成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)、转化生长因子-β(transforming growth factorbeta，TGF-β)、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor 2，KGF-2)以及类胰岛素生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)所组成的群组。
本发明的其中一有益效果在于，本发明所提供的间质干细胞培养物及其制备方法，其能通过“将一预定数量的间质干细胞种于含有一第一培养基质的一平面培养装置中，以进行细胞增殖”、“加入一目标培养基质并培养48至72小时并收集所述目标培养基质”以及“过滤及浓缩所述目标培养基质，得到一间质干细胞培养物”的技术方案，以实现可以在同一制造批次中大量收取质量稳定的培养物，降低干细胞培养的成本与减少操作人员的负担。
为使能进一步了解本发明的特征及技术内容，请参阅以下有关本发明的详细说明与附图，然而所提供的附图仅用于提供参考与说明，并非用来对本发明加以限制。
附图说明
图1为本发明的间质干细胞培养物的制备方法的步骤的流程图。
具体实施方式
以下是通过特定的具体实施例来说明本发明所公开有关“间质干细胞培养物及其制备方法”的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容了解本发明的优点与效果。本发明可通过其他不同的具体实施例加以实行或应用，本说明书中的各项细节也可基于不同观点与应用，在不背离本发明的构思下进行各种修改与变更。另外，本发明的附图仅为简单示意说明，并非依实际尺寸的描绘，事先声明。以下的实施方式将进一步详细说明本发明的相关技术内容，但所公开的内容并非用以限制本发明的保护范围。另外，本文中所使用的术语“或”，应视实际情况可能包括相关联的列出项目中的任一个或者多个的组合。
参阅图1所示，本发明的实施例提供一种间质干细胞培养物的制备方法，其可包括步骤S100至S110。步骤S100，将一预定数量的间质干细胞种于含有一第一培养基质的一平面培养装置中，以进行细胞增殖。步骤S102，当所述间质干细胞增殖到一目标数量时，将所述第一培养基质替换为一第二培养基质，并在培养18至30小时之后移除所述第二培养基质。步骤S104，加入一目标培养基质并培养48至72小时。步骤S106，收集所述目标培养基质。步骤S108，重复步骤S104至步骤S106约1至5次。步骤S110，过滤及浓缩所述目标培养基质，得到一间质干细胞培养物。需要说明的是，本发明的制备方法是利用间质干细胞为贴附型细胞的特性，将间质干细胞培养于大面积的细胞培养装置中，以保持间质干细胞的细胞完整性。与发酵槽细胞培养相比，大面积的二维空间细胞培养可以降低细胞的损伤，减少细胞压力，作为干细胞分泌外泌素或生长因子的稳定生产环境，因此更易于维持批次间生产出的间质干细胞培养物质量稳定性。
步骤S100，将预定数量的间质干细胞种于含有第一培养基质的平面培养装置中，以进行细胞增殖。本发明的间质干细胞的来源可以为毛囊或皮肤，较佳为人类毛囊间质干细胞(human hair follicle-mesenchymal stem cells，hHF-MSC)。然而，本发明不以上述所举的例子为限。
于本实施例中，间质干细胞的预定数量可以是1×107至5×107个细胞，较佳为2×107至3×107个细胞。于本实施例中，间质干细胞的目标数量可以是6×107至1×108个细胞，较佳为7×107至9×107个细胞，值得注意的是，一般的二维细胞培养能乘载最大细胞数量较少(如10厘米细胞培养皿约8×105至1×106个细胞)，若要大量收取细胞培养物时，则需要多次收取与重复种植细胞之步骤，造成操作的时间过长与操作人员的负担。本发明的平面培养装置可以为多层共培养皿或多层平台培养装置，但不以此为限。平面培养装置所提供给间质干细胞贴附的表面积可为6000至6500平方厘米。详细而言，平面培养装置可进一步包括有10层表面积各为600至650平方厘米的培养平台，每一个培养平台为堆栈设置且相互连通。因此，于实际操作时，操作人员可以在同一个平面培养装置中有效率地培养大量的间质干细胞，借此缩短操作的时间并且可以确保细胞的状态一致，并可一次性收取大量培养液，有效降低多次收取所带来的污染风险。
于本实施例中，第一培养基质可以是高葡萄糖改良杜氏伊格尔培养基(highglucose Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM-HG)、改良杜氏伊格尔培养基/营养混合物F-12以1：1比例混合配方(Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient MixtureF-12Ham，DMEM/F12,1:1mixture)或是改良杜氏伊格尔培养基/营养混合物F-12以3：1比例混合配方(Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12Ham，DMEM/F12,3:1mixture)，再添加葡萄糖2.25g/L。值得注意的是，第一培养基质可以进一步包含胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)及/或抗生素，抗生素可以是青霉素/链霉素溶液(penicillin-streptomycin solution)，举例而言，第一培养基质可以是改良杜氏伊格尔培养基/营养混合物F-12以3：1比例混合配方，再添加葡萄糖2.25g/L、体积浓度为10％的胎牛血清以及1％的青霉素/链霉素溶液，但不以此为限。详细而言，表面积为6000平方厘米的平面培养装置中会添加1-2升的第一培养基质。
步骤S102，当间质干细胞增殖到目标数量时，将第一培养基质替换为第二培养基质，并在培养18至30小时之后移除第二培养基质。举例来说，从步骤S100到步骤S102可能需要约48小时至96小时；于实际应用时，可以每48小时可以替换一次新的第一培养基质，以确保间质干细胞的活性。当间质干细胞的细胞数量增殖到平面培养装置的70-90％的表面积时(较佳为80％)，即达到目标数量。目标数量约为6×107至1×108个细胞，较佳为7×107至9×107个细胞。
为了避免细胞所分泌的外泌体(exosomes)、生长因子(growth factors)受到胎牛血清或抗生素的干扰而影响后续最终产物的质量，须将第一培养基质中的胎牛血清及抗生素移除。于本实施例中，第二培养基质可以是高糖改良杜氏伊格尔培养基(high glucoseDulbecco’s modified Eagle medium，DMEM-HG)、改良杜氏伊格尔培养基/营养混合物F-12以1：1比例混合配方(Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12Ham，DMEM/F12,1:1mixture)或是改良杜氏伊格尔培养基/营养混合物F-12以3：1比例混合配方(Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12Ham，DMEM/F12,3:1mixture)，再添加葡萄糖2.25g/L。举例而言，第一培养基质可以是改良杜氏伊格尔培养基/营养混合物F-12以3：1比例混合配方，再添加葡萄糖2.25g/L。需要说明的是，第二培养基质并不包含胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)或抗生素。于本步骤中，以第二培养基质进行细胞培养的时间为18至30小时，较佳为24小时；借此，可确保间质干细胞能够代谢掉原本含有胎牛血清及/或抗生素的第一培养基质。
步骤S104，加入目标培养基质并培养48至72小时。于本实施例中，目标培养基质的成分可以与第二培养基质相同，也就是说，目标培养基质也不包含胎牛血清及/或抗生素。于此步骤，目的在于让间质干细胞分泌生长因子与外泌体于目标培养基质中，目标培养基质约为2升。因此，经过约48小至72时(较佳为48小时)以后，进入步骤S106，收集所述目标培养基质；以及，重复步骤S104至步骤S106约1至5次(即，步骤S108)，较佳为重复3-5次，可收取约10升的目标培养基质。依据步骤S104至步骤S108可知，本发明的制备方法可以在不需要离心细胞的状态下收集大量的目标培养基质，也就是说，在间质干细胞保持贴附以及生长状况良好的状态下即可以收集到大量的目标培养基质。
步骤110，过滤及浓缩所述目标培养基质，得到一间质干细胞培养物。于实际操作时，是使用0.22微米的滤膜过滤目标培养基质，以移除细胞碎片与杂质。接下来，在4至8℃的温度条件下，利用切向流过滤(tangential flow filtration,TFF)系统搭配截留分子量(molecular weight cutoff，MWCO)为3至5kD的中空纤维膜(hollow fiber filter)，浓缩过滤目标培养基质中的蛋白质，得到间质干细胞培养物。进一步而言，切向流过滤系统可以有效减少过滤处理时间以及降低间质干细胞培养物的损失，可提升间质干细胞培养物的浓度。在某一些实施例中，可以在浓缩的过程中进行储存液的置换，将目标培养基质中的间质干细胞培养物(包含有生长因子及蛋白质)转置于蛋白质保存液中，得到间质干细胞培养物。在本实施例中，蛋白保存液可以包含海藻糖(trehalose)、甘露醇(mannitol)、0.01％的聚山梨醇酯80(常称为
Figure BDA0003169400030000061
80)以及聚乙二醇(polyethylene glycol)。值得注意的是，储存蛋白质保存液中的间质干细胞培养物的保存效果更佳。
本发明的实施例也提供一种间质干细胞培养物，其是由前述的制备方法所制得的。间质干细胞培养物主要包含由间质干细胞所分泌的蛋白质，举例来说，间质干细胞培养物包含至少一种蛋白质，所述蛋白质选自于成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor，FGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)、角质细胞生长因子(keratinocytegrowth factor 2，KGF-2)以及类胰岛素生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)所组成的群组。然而，上述所举的例子只是其中一可行的实施例而并非用以限定本发明。
实施例的有益效果
本发明的其中一有益效果在于，本发明所提供的间质干细胞培养物及其制备方法，其能通过“将一预定数量的间质干细胞种于含有一第一培养基质的一平面培养装置中，以进行细胞增殖”、“加入一目标培养基质并培养48至72小时并收集所述目标培养基质”以及“过滤及浓缩所述目标培养基质，得到一间质干细胞培养物”的技术方案，以实现可以在同一制造批次中大量收取质量稳定的培养物，降低干细胞培养的成本与减少操作人员的负担。
更进一步来说，通过大面积平面共层培养细胞，可以让间质干细胞贴附生长，并不需要进一步离心才能获得培养基质，因此降低间质干细胞的细胞损伤。通过本发明的技术方案，操作人员可以有效节省操作的时间成本，并有效获取大批次产量的间质细胞培养物。
以上所公开的内容仅为本发明的优选可行实施例，并非因此局限本发明的权利要求书的保护范围，所以凡是运用本发明说明书及附图内容所做的等效技术变化，均包含于本发明的权利要求书的保护范围内。

Claims (11)

1.一种间质干细胞培养物的制备方法，其特征在于，所述间质干细胞培养物的制备方法包括：
(a)将一预定数量的间质干细胞种于含有一第一培养基质的一平面培养装置中，以进行细胞增殖；
(b)当所述间质干细胞增殖到一目标数量时，将所述第一培养基质替换为一第二培养基质，并在培养18至30小时之后移除所述第二培养基质；
(c)加入一目标培养基质并培养48至72小时；
(d)收集所述目标培养基质；
(e)重复步骤(c)至步骤(d)1至5次；以及
(f)过滤及浓缩所述目标培养基质，得到一间质干细胞培养物。
2.根据权利要求1所述的间质干细胞培养物的制备方法，其特征在于，所述间质干细胞的来源为毛囊或皮肤。
3.根据权利要求1所述的间质干细胞培养物的制备方法，其特征在于，所述预定数量为1×107至5×107个细胞。
4.根据权利要求1所述的间质干细胞培养物的制备方法，其特征在于，所述第一培养基质包含胎牛血清及抗生素，所述第二培养基质不包含胎牛血清及抗生素。
5.根据权利要求1所述的间质干细胞培养物的制备方法，其特征在于，所述平面培养装置的细胞贴附表面积为6000至6500平方厘米。
6.根据权利要求5所述的间质干细胞培养物的制备方法，其特征在于，所述平面培养装置包含10个培养平台，每一个所述平台的表面积为600至650平方厘米。
7.根据权利要求1所述的间质干细胞培养物的制备方法，其特征在于，所述目标数量为6×107至1×108个细胞。
8.根据权利要求1所述的间质干细胞培养物的制备方法，其特征在于，在所述步骤(f)中，所述间质干细胞培养物是先通过一滤膜，再通过一切向流过滤系统所得到的；其中，所述滤膜的孔径为0.22微米。
9.根据权利要求1所述的间质干细胞培养物的制备方法，其特征在于，在所述步骤(f)中进一步包含：利用一切向流过滤系统搭配截留分子量为3至5kD的一中空纤维膜，浓缩过滤所述目标培养基质中的所述间质干细胞培养物，并将所述间质干细胞培养物置换于一蛋白质保存液中。
10.一种间质干细胞培养物，其特征在于，所述间质干细胞培养物是由如权利要求1至9中任一项所述的制备方法所制得的。
11.根据权利要求10所述的间质干细胞培养物，其特征在于，所述间质干细胞培养物包含至少一种蛋白质，所述蛋白质选自于成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子-β、角质细胞生长因子以及类胰岛素生长因子所组成的群组。
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