JP2009271250A

JP2009271250A - 顕微鏡装置

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Publication number: JP2009271250A
Application number: JP2008120518A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Ogiwara; 康史荻原
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2008-05-02
Filing date: 2008-05-02
Publication date: 2009-11-19

Abstract

【課題】培養容器内の試料に対して培養環境を変化させることなく培地等の供給が可能な顕微鏡装置を提供する。
【解決手段】上面に開口を有し底面に光透過領域を備えた中空の本体１５と、光透過領域を備え本体１５の開口を気密に覆う蓋体１６と、本体１５内へ液体を供給するための第１のノズル２５と、本体１５内から液体を排出するための第２のノズル２０とを有する培養容器４と、本体１５内へ供給される液体を貯留する複数の貯留容器３１，３２と、複数の貯留容器３１，３２と第１のノズル２５とを接続する接続手段２８，３６，３９，４０，４１と、培養容器４で培養された試料１０を観察するための顕微鏡２と、培養容器４、複数の貯留容器３１，３２、接続手段２８，３６，３９，４０，４１、及び顕微鏡２を収納する筐体９と、筐体９内の温度を制御する温度制御装置と、を有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡装置に関する。

従来、顕微鏡によって細胞等の生体試料を数分から数時間、或いは数日と観察し、その変化を解析することで生体反応を解明しようとする研究が行われている。そしてこのような研究においては、観察途中に生体試料に薬液を注入し、薬液注入前後の生体試料の挙動を比較することで、薬液が生体試料に与える効果を調べることも行われている。
したがって、斯かる研究で用いられる顕微鏡には、ステージ上で生体試料を培養しながら観察を行い、さらに培地や薬液の注入及び排出が可能であることが求められるため、これを実現する顕微鏡用の培養容器が提案されている（例えば、特許文献１を参照。）。
そして、注入する培地や薬液は温度管理が必要であり、培地や薬液を貯留する貯留容器を温度制御されたウォータバスに入れておき、この温度制御された培地や薬液を使用することがある。
特開２００４−１４１１４３号公報

しかしながら、上述のような従来の培養容器を備えた顕微鏡において、培地や薬液を貯留する貯留容器は、生体試料の培養条件等を考慮した温度管理がなされていない。また、ウォータバスを使用する場合には、ウォータバスを設置する場所が必要であることに加え、ウォータバスから顕微鏡へ至る途中の温度管理がなされていないため十分な温度制御を行うことができない。したがって、以上のような貯留容器に貯留された培地や薬液を生体試料に供給することで、培養容器内の培養環境が変化してしまうという問題があった。

そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、培養容器内の試料に対して培養環境を変化させることなく培地等の供給が可能な顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために本発明は、
上面に開口を有し底面に光透過領域を備えた中空の本体と、光透過領域を備え前記本体の開口を気密に覆う蓋体と、前記本体内へ液体を供給するための第１のノズルと、前記本体内から液体を排出するための第２のノズルとを有する培養容器と、
前記本体内へ供給される液体を貯留する複数の貯留容器と、
前記複数の貯留容器と前記第１のノズルとを接続する接続手段と、
前記培養容器で培養された試料を観察するための顕微鏡と、
前記培養容器、前記複数の貯留容器、前記接続手段、及び前記顕微鏡を収納する筐体と、
前記筐体内の温度を制御する温度制御装置と、
を有することを特徴とする顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、培養容器内の試料に対して培養環境を変化させることなく培地等の供給が可能な顕微鏡装置を提供することができる。

以下、本発明の各実施形態に係る顕微鏡装置を添付図面に基づいて詳細に説明する。
（第１実施形態）
はじめに、本実施形態に係る顕微鏡装置の全体的な構成を簡単に説明する。
図１は、本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置の概略の側面図である。また図２は、本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置における培養容器の概略の正面図である。そして図３は、本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置における培養容器の概略の上面図である。
図１から図３に示すように、本実施形態に係る顕微鏡装置１は、顕微鏡本体２、顕微鏡本体２に備えられたステージ３、ステージ３上に設置された後述する培養容器４、ステージ３の上方に配置された透過照明装置５、ステージ３の下方に配置された対物レンズ６、顕微鏡本体２の側方に配置された落射照明装置７、顕微鏡本体２の正面側側方に設けられた接眼レンズ８を有する。

また本顕微鏡装置１は、透過照明装置５、落射照明装置７、不図示の撮像装置、及び接眼レンズ８を除いて、例えば透明なプラスチック製の保温ケース９で覆われており、外気と隔離されている。なお、保温ケース９の外部には、保温ケース９内の温度を調整するための不図示の温度制御装置、培養容器内の湿度や温度を調整するための不図示の空調装置、及び後述する不図示の空圧装置も備えられている。また、透過照明装置５は、保温ケース９の中に収納させてもよく、この場合には保温ケース９内の温度制御の観点から高温になり難いＬＥＤ光源を用いることが好ましい。
斯かる構成の本実施形態に係る顕微鏡装置１において、透過照明装置５から発せられた照明光は、ステージ３上の培養容器４内で培養されている試料１０に照射される。これにより試料１０から発せられた光は、対物レンズ６を経て、顕微鏡本体２内の不図示の光学系によって不図示の撮像装置と接眼レンズ８へ導かれる。これにより、不図示の撮像装置では試料１０の画像が撮影され、さらに本顕微鏡装置１の使用者は接眼レンズ８を介して試料１０の像を双眼で観察することができる。なお、本実施形態に係る顕微鏡装置１では、落射照明装置７によって試料１０を照明して観察を行うことも可能である。

次に、本実施形態に係る顕微鏡装置１における培養容器４の構成を説明する。
図４は、本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置における培養容器の概略の正面側断面図である。図５は、本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置における培養容器の概略の側面側断面図である。図６は、本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置における培養容器の概略の上面図である。
培養容器４は、ステージ３上において気密な培養空間を形成して生細胞や微生物等の生体試料を培養しながら顕微鏡観察を行い、さらに培地や薬液の注入及び排出を可能とするものであり、図４から図５に示すように、上面が開放された中空で箱状の容器本体１５と、容器本体１５の上面を覆う方形の蓋体１６とを有する。また、容器本体１５の底面には試料１０及び液状の培地１１が注入されたシャーレ１７が着脱自在に設置されている。

本実施形態におけるシャーレ１７は、ガラス（或いは樹脂等の光透過性材料）からなる上面が開放された中空で円柱状のものが使用されており、試料１０はシャーレ１７の底面に付着している。
蓋体１６は、図６に示すように容器本体１５に対して連結軸１８を回動中心として回動自在に連結されている。また、蓋体１６におけるシャーレ１７と対向する位置には円形の開口が形成されており、ガラス（或いは、樹脂等の光透過部材）が気密に嵌合されている。

容器本体１５は、前述のように上面が開放された中空で箱状の部材であって、四方の側壁の上端面には蓋体１６と密着して容器本体１５内を気密にするＯ−リング１９が備えられている。また、前述の蓋体１６と同様、容器本体１５の底面におけるシャーレ１７と対向する位置には円形の開口が形成されており、ガラス（或いは、樹脂等の光透過部材）が気密に嵌合されている。
容器本体１５の側壁には、該側壁を貫通する排出ノズル２０とこれを支持するノズル支持部２１が設けられている。ノズル支持部２１は、Ｏ−リング２２を備えておりこれによって排出ノズル２０を貫通方向へ摺動及び回動自在でかつ気密に支持している。また排出ノズル２０は、先端が下方へ屈曲してシャーレ１７の底面付近（底面に付着した試料１０を吸引しない位置）まで延在しており、容器本体１５の外部へ露出したもう一方の先端は排出ノズルチューブ２３の一端に接続されている。そして排出ノズルチューブ２３の他端は保温ケース９の外部に備えられた不図示の空圧装置に接続されている。斯かる構成の下、空圧装置の吸引力によって排出ノズル２０よりシャーレ１７内の培地１１を吸引して排出することが可能となる。なお、本実施形態では空圧装置としてペリスターポンプを採用しているが、これに限られず手動のシリンジ等を採用してもよい。

また、容器本体１５における排出ノズル２０を備えた側壁と対向する側壁には、該側壁を貫通する注入ノズル２５とこれを支持するノズル支持部２６が設けられている。注入ノズル２５は排出ノズル２０と同様、ノズル支持部２６にＯ−リング２７を介して摺動及び回動自在でかつ気密に支持されている。また注入ノズル２５は、先端が下方へ屈曲してシャーレ１７内の培地１１に浸からない長さで延在しており、容器本体１５の外部へ露出したもう一方の先端は注入ノズルチューブ２８に接続されている。
さらに、斯かる注入ノズル２５を備えた側壁の端部には、液状の培地や薬液入りの培地等を貯留する第１貯留容器３１及び第２貯留容器３２を保持した貯留容器保持部３０が固設されている。

第１貯留容器３１は、図５に示すように、上面が開放された中空で円柱状のボトル３３と、ボトル３３内部を気密にするキャップ３４とを有してなる。キャップ３４には、ボトル３３に貯留された培地３５に先端が浸かるように配置された送出管３６と、先端が培地３５の液面よりも上側に位置するように配置された加圧管３７とが気密に貫通している。加圧管３７におけるキャップ３４外部の先端は、保温ケース９の外部に備えられた不図示の空圧装置に接続された加圧チューブ３８に接続されている。これに対し、送出管３６におけるキャップ３４外部の先端は、送出チューブ３９の一端に接続されており、さらに送出チューブ３９の他端はボトル３３側への液体の流入を禁止する逆止弁４０を介してＴ字型の合流管４１に接続されている。この合流管４１は前述の注入ノズルチューブ２８と接続されている。なお、本実施形態では逆止弁４０を採用しているが、これに限られず液体の流通を制御するその他の流通制御手段（例えば、電磁弁等）を採用してもよい。

斯かる構成により、不図示の空圧装置からの空気は、加圧チューブ３８、加圧管３７を順に経て第１貯留容器３１に導入される。これによって第１貯留容器３１内に貯留されている培地３５は、液面が加圧されて送出管３６へ押し出され、送出チューブ３９、逆止弁４０、合流管４１、注入ノズルチューブ２８を順に経て、注入ノズル２５からシャーレ１７へ注がれることとなる（以下、加圧チューブ３８から注入ノズル２５までを「搬送経路」と称する。）。
ここで、空圧装置は保温ケース９の外部に配置されており、該空圧装置から供給される空気の温度は特に管理されていないが、当該空気が第１貯留容器３１に導入された際に、貯留された培地３５の液面での当該空気との熱交換量は極めて小さいため、培地３５の温度変化を引き起こしてしまうことはない。また、合流管４１を進行する培地３５は、合流管４１に接続された第２貯留容器３２側の逆止弁４０にも進行することとなるが、当該第２貯留容器３２側の逆止弁４０によってその進行が禁止されるため、第２貯留容器３２側へ流入してしまうことがない。
なお、第２貯留容器３２の構成は、上記第１貯留容器３１と同様であるため、同じ符号を付して説明を省略する。

また、図６に示すように容器本体１５における排出ノズル２０を備えた側壁と隣り合う側壁には、上述した不図示の空調装置と接続された調整空気導入チューブ４５及び排出チューブ４６が接続されている。なお、本実施形態における空調装置は、温度、湿度、成分等を調整した調整空気（例えば、３７℃で９５％程度に加湿されたＣＯ_２５％空気）を培養容器４へ供給するものである。これにより、空調装置が調整空気導入チューブ４５を介して容器本体１５内に調整空気を導入、及び排出チューブ４６を介して容器本体１５内の空気を排出することで、培地１１の乾燥を防ぎながら試料１０に好適な培養環境を培養容器４内に実現し維持することができる。

なお、本実施形態における不図示の温度制御装置は、ヒータ（或いはクーラ）と温度センサとファンを備えてなり、保温ケース９内へ温風（或いは冷風）を供給して循環させることで保温ケース９内を一定の温度（例えば、３７℃）に維持するものである。これにより、第１貯留容器３１や第２貯留容器３２に貯留された培地３５、及び各搬送経路を流通する培地３５は、培養容器４内の温度と略同じ温度で維持することができる。このため、第１貯留容器３１や第２貯留容器３２に貯留された培地３５がシャーレ１７内に注入されても、培養容器４内に維持されている試料１０の培養環境に悪影響を及ぼすことがない。

以上に述べた培養容器４の構成により、該培養容器４内における試料１０の培養環境を常に一定に維持することが可能であり、排出ノズル２０によってシャーレ１７内の培地１１を排出し、適宜、第１貯留容器３１の培地３５を注入ノズル２５から注入したり、或いは第２貯留容器３２の培地３５を注入ノズル２５から注入することができる。
なお、本培養容器４においてシャーレ１７に替えて別のシャーレを設置する場合には、蓋体１６を連結軸１８を中心に回動させて退避させる。そして、排出ノズル２０及び注入ノズル２５を回動させて各々の屈曲した先端を水平に維持しながら外側へ向かって摺動させシャーレ１７上方から退避させることで、シャーレ１７の取り外し及び別のシャーレの設置が可能となる。

次に、以上に述べた構成の本実施形態に係る顕微鏡装置１によって実現される試料１０の効果的な観察について、その手順を説明する。
本観察の前提として、シャーレ１７は通常の培地で満たされており、シャーレ１７底面には試料１０が付着して培養されている。また、第１貯留容器３１にはシャーレ１７内の培地と同様の培地が貯留されており、第２貯留容器３２には前記培地に薬液を混合した薬液入り培地が貯留されている。
手順１：上記前提の状態において試料１０の観察を行う。なおこの観察は、一定時間毎に試料１０の画像を撮影する所謂タイムラプス撮影を行い、撮影した画像を連続再生して試料１０の挙動を確認することで行われる。このことは、後記手順４及び手順９においても同様である。
手順２：観察に不要な培地を取り除くために、シャーレ１７内の培地を排出ノズル２０より吸引して排出する。このとき、シャーレ１７の底面には試料１０が残留する。

手順３：薬液に対する試料１０の挙動を観察するために、第２貯留容器３２の薬液入り培地を注入ノズル２５よりシャーレ１７内へ注入する。なお、第２貯留容器３２及び薬液入り培地の搬送経路は、上述のように保温ケース９内で培養容器４内部と同様の温度に維持されているため、薬液入り培地の注入前後で培養容器４内部の温度が変化することはない。
手順４：試料１０の観察を行い、試料１０に上記手順１の観察結果と異なる現象が生じているか否かを確認する。
手順５：薬液に対する試料１０の挙動の観察が終了したら、再び試料１０の培養環境を復元するために、シャーレ１７内の薬液入り培地を排出ノズル２０より吸引して排出する。このとき、上記手順２と同様、シャーレ１７の底面には試料１０が残留する。
手順６：第１貯留容器３１の培地を注入ノズル２５よりシャーレ１７内へ注入する。なお、上記手順３と同様に、培地の注入前後で培養容器４内部の温度が変化することはない。また、上記手順５において、シャーレ１７内の薬液入り培地を完全に取り除けない場合には、上記手順５と本手順６を複数回繰り返して実施することが好ましく、以下の手順７，８はこれに伴う操作を説明するものである。

手順７：シャーレ１７内の低濃度の薬液入り培地を排出ノズル２０より吸引して排出する。
手順８：第１貯留容器３１の培地を注入ノズル２５よりシャーレ１７内へ注入する。これにより、シャーレ１７内には上記手順７において残留した低濃度の薬液入り培地と本手順８において注入した培地とが混合されて、結果的に非常に低濃度の薬液入り培地が満たされることとなる。なお、上記手順７と本手順８を複数回実施することで、薬液入り培地の薬液の濃度を略ゼロにすることができる。
手順９：試料１０の観察を行う。ここで、上記手順４（シャーレ１７内を薬液入り培地で満たした場合）の観察時に、試料１０に上記手順１の観察結果と異なる現象が生じ、さらに本手順９（シャーレ１７内を薬液濃度が略ゼロの培地で満たした場合）の観察時に、前記現象が生じないことが確認されれば、この現象は薬液によって生じたものである可能性が非常に高いと判断することができる。

以上の観察によれば、本実施形態に係る顕微鏡装置１により、シャーレ１７内に薬液が存在しない状態から、薬液が存在する状態、薬液が存在する状態へと観察条件を連続的に変化させて試料１０の挙動を観察することで、薬液による効果を高い精度で確認するという操作が、培地や薬液入り培地の温度調整を行うことなく、かつ培地と薬液入り培地の交換作業を迅速に行うことが可能となる。これは観察中、培地や薬液入り培地の注入及び排出は保温ケース９の外部から操作できるため、保温ケース９を開けたり、培養容器４の蓋体１６を開ける必要がないため、保温ケース９内の温度、及び培養容器４内の試料１０の培養環境が変化してしまうことがないことに起因するものである。

以上の第１実施形態によれば、上述のように第１貯留容器３１、第２貯留容器３２、及びそれぞれの搬送経路を保温ケース９内に配置して培養容器４内と略同じ温度に維持することで、培養容器４内の試料１０に対して培養環境を変化させることなく培地や薬液入り培地の供給が可能な顕微鏡装置１を実現することができる。
また、本実施形態における第１貯留容器３１及び第２貯留容器３２は、上述のように培養容器４に固設された貯留容器保持部３０によって培養容器４の近傍に一体的に保持されているため、上述した不図示の温度制御装置による温度管理が容易であり、培養容器４の交換の際には該培養容器４と一体的に取り扱うことが可能であるという利点も備えている。例えば、一体的に保持されている培養容器４と貯留容器保持部３０に試料や培地、薬液入り培地を入れ、培養装置に保管しておけば、温度制御を殆ど行うことなく、顕微鏡への設置を行うことが可能となる。

（第２実施形態）
以下、本実施形態に係る顕微鏡装置について、上記第１実施形態と同様の部分については同じ符号を付して説明を省略し、異なる部分について詳細に説明する。
図７は、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置の概略の側面図である。
図７に示すように、本実施形態に係る顕微鏡装置５０は、顕微鏡本体２、温度制御装置５１、空調装置５２、撮像装置６２、及び筐体６０が一体化されている培養顕微鏡装置である。なお、筐体６０の上面には、培養容器４へのアクセスを便利にする開閉可能なスライドドア６０ａが備えられている。

なお、本顕微鏡装置５０における温度制御装置５１は、ヒータ５２、送風用のファン５３、及びステージ３付近に配置された不図示の温度センサからなり、ヒータ５２で温められた空気は送風通路５４を進行して培養容器４付近へ直接搬送される。
空調装置５９は、ヒータ５５、温度センサ５５ａ、これらによって培養に適した温度に保たれる蒸留水が貯留された容器５６、及び筐体６０の外部に配置されており所定の空気を当該容器５６へ供給する不図示の空気供給手段からなる。斯かる空調装置５２により、例えば、空気供給手段からＣＯ_２５％空気を供給して容器５６の蒸留水でバブリングすることで、３７℃で９５％程度に加湿されたＣＯ_２５％空気を調整空気として生成することができる。

また不図示の落射照明装置は、筐体６０の側方外部に配置されており、該落射照明装置からの照明光は光ファイバ５７を経由して筐体６０内へ導かれ、顕微鏡本体２内の光学系５８と対物レンズ６を順に介してステージ３の下側から培養容器４内の試料１０に照射される。なお、図７には不図示であるが、筐体６０内であり培養容器４の上方に透過照明装置を備えていてもよく、筐体６０内の温度が上昇し難いＬＥＤ光源とすることが好ましい。
撮像装置６２は、保温ケース６０内において熱の影響を回避するべく断熱部材６１によって顕微鏡本体２と隔離されている。
以上の第２実施形態によれば、上記第１実施形態と同様の効果を奏する顕微鏡装置１を実現することが可能であり、試料１０のより確度の高い観察を行うことができる。

なお、上記各実施形態では、いずれも２つの貯留容器３１，３２を備えた顕微鏡装置１，５０を示しているが、貯留容器の数はこれに限られず、３つ以上備える構成としてもよい。例えば、３つの貯留容器を備えた顕微鏡装置を構成し、各貯留容器に培地のみ、第１の薬液入り培地、第２の薬液入り培地を貯留すれば、連続して２種類の薬液の効果を調べることが可能となる。
また、上記各実施形態では、上述のように各貯留容器３１，３２は好ましい配置場所である培養容器４の近傍に備えられている。しかしながらこれに限られず、各貯留容器３１，３２とその搬送経路が保温ケース９、筐体６０内に配置されていればよい。

本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置の概略の側面図である。本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置における培養容器の概略の正面図である。本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置における培養容器の概略の上面図である。本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置における培養容器の概略の正面側断面図である。本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置における培養容器の概略の側面側断面図である。本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置における培養容器の概略の上面図である。本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置の概略の側面図である。

符号の説明

１，５０顕微鏡装置
２顕微鏡本体
４培養容器
７落射照明装置
９，６０保温ケース
１５培養容器本体
１６蓋体
１７シャーレ
２０排出ノズル
２５注入ノズル
３１第１貯留容器
３２第２貯留容器
４０逆止弁
４１合流管
５２温度制御装置
５９空調装置
６２撮像装置

Claims

上面に開口を有し底面に光透過領域を備えた中空の本体と、光透過領域を備え前記本体の開口を気密に覆う蓋体と、前記本体内へ液体を供給するための第１のノズルと、前記本体内から液体を排出するための第２のノズルとを有する培養容器と、
前記本体内へ供給される液体を貯留する複数の貯留容器と、
前記複数の貯留容器と前記第１のノズルとを接続する接続手段と、
前記培養容器で培養された試料を観察するための顕微鏡と、
前記培養容器、前記複数の貯留容器、前記接続手段、及び前記顕微鏡を収納する筐体と、
前記筐体内の温度を制御する温度制御装置と、
を有することを特徴とする顕微鏡装置。
前記接続手段は、前記複数の貯留容器からそれぞれ液体を送出する複数の送出管と、前記複数の送出管を合流して前記第１のノズルと接続する合流管と、を有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記接続手段は、前記複数の送出管と前記合流管との間に、液体の流通を制御する流通制御部を有することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置。
前記接続手段における前記流通制御部として、液体の逆流を禁止する逆止弁を有することを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡装置。
前記温度制御装置は、前記筐体内の温度を前記培養容器内の温度と略同じ温度に維持することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。