JP5709976B2 - 顕微鏡観察用培養装置およびその使用方法 - Google Patents

顕微鏡観察用培養装置およびその使用方法 Download PDF

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Description

本発明は、細胞等の試料を観察するのに適した顕微鏡観察用培養装置に関するものである。
この種の顕微鏡観察用培養装置として典型的なものは、特許文献1や図8に示されたものである。この顕微鏡観察用培養装置100は、収容ユニット103とその上面側開口を閉鎖する蓋体107とで構成されている。収容ユニット103内にはその内縁側に沿って水槽105が設けられ、それより内方が収容空間となっており、この収容空間に、培養液Aと細胞等の試料Bを入れた容器、例えばウェルプレートWを収容した状態で、顕微鏡ステージSに設置して使用するようになっている。
ところで、培養液Aに入った細胞等の試料Bを観察に適した条件下で保持するためには、温度についても一定、例えば37℃程度に維持する必要がある。そのため、従来は、収容ユニット103の下面側開口に、熱伝導性の高いアルミの薄板で形成された加温プレート109を載せ、その上にウェルプレートWを載せて下方から培養液Aを加温していた。
加温プレート109には、顕微鏡観察を妨げないよう、ウェルプレートWの場合には各ウェルwが相対する部分に穴111が開けられて透光部として利用されている。
而して、最近では、顕微鏡観察を高倍率で行うため、倒立型顕微鏡を利用した場合には対物レンズRを収容ユニット103の下面に従来よりも接近させる傾向があるが、上記したように加温プレート109が介装されていると、顕微鏡ステージSをX−Y方向に二次元移動させて、あるウェルwからその隣りのウェルwに観察対象を変更するときに、矢印に示すように、一旦対物レンズRを後退させてから、顕微鏡ステージSを移動させ、その後に対物レンズRを再び接近させる動作が必要であり、自動操作させるにしてもそのプログラミングが複雑化する。また、マルチウェル型になると個々のウェルwの大きさが小さくなり、最近では96個型も出ているが、そのようなものになると加温プレート109の縁が互いにかなり接近するため、対物レンズRの収容ユニット103の下面への接近自体もままならなくなる。
さらに、高倍率で鮮明に試料Bを観察するために、裸出した容器の下面と対物レンズRとの間を油または水で満たして対物レンズRを油浸または水浸レンズとする場合があるが、上記のように対物レンズRの後退・接近動作を繰り返したのでは、液玉が容易に崩れてしまう。
一方、加温プレート109に全ウェルwを囲むように1つの大きな穴をあけて、周りを囲んだ加温プレート109からの伝熱により各ウェルwを加温しようとすると、加温プレート109から各ウェルwまでの距離に差が出るため、ウェルwどうしの間に温度勾配が生じてしまう。また、一つのウェルwにおいてもその縁側と内側との間で温度勾配が生じてしまう。
特開2008−259430号公報
それ故、本発明は、培養液に入った細胞等の試料を一定の温度で維持しながら、高倍率による顕微鏡観察の効率的な実施を可能とする顕微鏡観察用培養装置と、その一例の使用方法を提供することを、その目的とする。
本発明は、上記課題を解決するものであり、請求の範囲第1項の発明は、培養液と試料が入った容器を収容する収容ユニットと、前記収容ユニットの上面側開口を閉鎖する蓋体とを備え、顕微鏡のステージに設置して前記試料を顕微鏡観察するのに用いる顕微鏡観察用培養装置において、前記収容ユニットにはウェルプレートを着脱自在に嵌め込める大きさの下面側開口があり、前記下面側開口を狭める加温プレートは備えられておらず、前記蓋体のうち観察範囲に対応する部分に設けられた透明面状トップヒーターと、細線状の検知部が前記収容ユニットの内方に入り込み、さらに収容された容器内に入り込んでそこに供給された培養液に浸されてその温度を直接測定する温度検知手段とを有し、前記温度検知手段からの温度情報に基づいて前記透明面状トップヒーターをフィードバック方式により温度制御することを特徴とする顕微鏡観察用培養装置である。
請求の範囲第2項の発明は、請求の範囲第1項に記載した顕微鏡観察用培養装置において、温度検出手段の検知部を収容ユニット内に長さ自在に導入させる導入手段を備えることを特徴とする顕微鏡観察用培養装置である。
請求の範囲第3項の発明は、請求の範囲第1項または第2項に記載した顕微鏡観察用培養装置において、専用の容器の蓋体を備えており、温度検知手段の検知部は前記蓋体に取り付けられた導入手段を介して容器内に導入されることを特徴とする顕微鏡観察用培養装置である。
請求の範囲第4項の発明は、請求の範囲第3項に記載した顕微鏡観察用培養装置において、容器の蓋体は透明ガラスで形成されていることを特徴とする顕微鏡観察用培養装置。
請求の範囲第5項の発明は、請求の範囲第1項から第4項のいずれかに記載した顕微鏡観察用培養装置の使用方法において、複数のセクションで区切られた容器、または複数の容器をユニット内に収容し、いずれか一つのセクションまたは容器に温度検知手段の検知部を入り込ませて温度検知用に使用し、その余りのセクションまたは容器を顕微鏡観察用に使用することを特徴とする使用方法である。
本発明の顕微鏡観察用培養装置によれば、培養液に入った細胞等の試料を一定の温度で維持しながら、高倍率による顕微鏡観察の効率的な実施を可能とする。
本発明の実施の形態に係る顕微鏡観察用培養装置の分解斜視図である。 図1の顕微鏡観察用培養装置の上方から見た斜視図である。 図1の顕微鏡観察用培養装置の下方から見た斜視図である。 図1の顕微鏡観察用培養装置の蓋体の断面図である。 図1の顕微鏡観察用培養装置の温度制御手段に係わる収容ユニット側の一部拡大斜視図である。 図1の顕微鏡観察用培養装置の温度制御手段に係わる容器側の一部拡大斜視図である。 図1の顕微鏡観察用培養装置を使用したときの対物レンズの動作説明図である。 従来の顕微鏡観察用培養装置を使用したときの対物レンズの動作説明図である。
本発明の実施の形態に係る顕微鏡観察用培養装置1を図1から図7にしたがって説明する。
顕微鏡観察用培養装置1は、収容ユニット3、蓋体53等によって構成されている。
先ず、収容ユニット3の構造について説明する。
図1において符号5はほぼ長方形の枠状に形成された本体部を示し、この本体部5には上面側開口7と下面側開口9とがそれぞれ形成されている。下面側開口9側には内方フランジ11が形成されており、下面側開口9は上面側開口7より小さくなっている。
本体部5の下面側開口9の縁にはアダプター13の側面が嵌り込んで固定されている。このアダプター13もほぼ長方形の枠状に形成されており、その下端側開口15側には内方フランジ17が形成されている。符号19は押えバネを示し、この押えバネ19の基端部がアダプター13の上端面の四カ所にそれぞれ連結されて、アダプター13内で回動自在になっている。このアダプター13は、ウェルプレートW用のものであり、ウェルプレートWが着脱自在に嵌め込まれると、上記した押えバネ19の弾性力により、アダプター13に安定的に固定される。
アダプター13の下端側は収容ユニット3から下方に突出しており、収容ユニット3との間に段差部21を形成している。
本体部5の内側面とアダプター13の外側面と本体部5の内方フランジ11の上面との間で画定される凹状の空間が水槽23としての機能を担わされている。
本体部5には、水供給用ホース25と、ガス供給用ホース27が取り付けられており、それぞれの先端は水槽23内に入り込み、ガス供給用ホース27の先端はその底面付近まで延びている。
これらの間には、温度検知手段29の細線状の熱電対型検知部31用に、収容部内導入手段としての検知部ホルダー33が設けられている。図5に示すように、この検知部ホルダー33のベースブロック35は本体部5の外側面に固定されており、このベースブロック35には一対のネジ穴37、37と、検知部31に対応した浅い溝39が形成されている。この溝39は本体部5の上端面に形成された溝41に連通しており、溝39、41が検知部31の本体部5内への導入経路となっている。
ベースブロック35に対応して押えブロック43が設けられており、この押えブロック43にもベースブロック35側の一対のネジ穴37、37に対応して一対の穴45、45が形成されている。
ベースブロック35の溝39から本体部5の溝41に跨って検知部31の適当な箇所を差込み、押えブロック43をその下面側突部がベースブロック35の溝39に嵌り込むように上側から合わせ、連通した穴45及びネジ穴37に押えネジ47を入れて締め付けることで、検知部31が本体部5に導入された状態で固定される。
上記した構造により、検知部31は溝39、41への差込み箇所を変えることで、本体部5内への導入長さを調整することができるようになっており、ウェルプレートWの所定のウェルw内に到達できるように十分な長さまで入り込ませることができる。
また、本体部5には、一対の灌流用ホース用の取付用ホルダー51も備えられており、灌流培養も可能となっている。
上記した構造の収容ユニット3に相対して、その上端側開口7を閉鎖するよう蓋体53が設けられている。
図4に示すように、この蓋体53はほぼ長方形を為しており、その枠体55が長方形の透明な透光部57を保持している。この透光部57には2枚の透明ガラス板59が隙間をあけて配置されており、下側の透明ガラス板59の上面には透明導電膜61が形成されている。この透明導電膜61に電気コード63を介して通電することにより発熱させて、透明面状トップヒーターとしての機能を担わせている。なお、2枚の透明ガラス板59、59との間に空気層が介在しているので、断熱効果が期待できる。
上記した蓋体53側の電気コード63と、温度検知手段29は、いずれもコントローラ65に接続されており、コントローラ65は温度検知手段29からの温度情報と目標温度に基づいてフィードバック方式により透明導電膜61への通電量を調整するようになっている。
なお、アダプター13に装着するウェルプレートWは蓋体有りでも蓋体無しでもよいが、この実施の形態で装着されるウェルプレートWは蓋体67有りになっており、温度検知手段29の検知部31を所定のウェルw内に導入させるために、この蓋体67にウェルプレート内導入手段が設けられている。
蓋体67は蛍光発色を抑えるため、透明ガラス製となっている。また、図6に示すように、蓋体67は箱状になっており、ウェルプレートWの外側面に形成された段差部に嵌込まれてウェルプレートWの上面開口を閉鎖するようになっている。この蓋体67の上壁部には一側壁部側に小さな矩形穴69が形成されており、露出した側壁部の上端面には一対のネジ穴71、71が形成されている。また、その間には検知部31に対応した浅い溝(図示省略)が形成されている。
矩形穴69に嵌り込む大きさで矩形状の押え板73が設けられており、この押え板73にも一対のネジ穴71、71に対応して一対のネジ穴75、75が形成されている。
上記した溝に検知部31を差込み、押え板73を矩形穴69に上側から嵌め込み、その上で、ネジ穴75、71に押えネジ77を締め付けることで、検知部31のウェルプレートW内へ導入された状態で固定される。
なお、検知部31は折り曲げ可能になっており、ウェルプレートW内で所定のウェルwまで延ばした後に、屈曲させてそのウェルwの底面近傍まで下ろすことができるようになっている。
この顕微鏡観察用培養装置1の使用方法について説明する。
収容ユニット3の本体部5には予めアダプター13を装着させてある。このアダプター13にダミー用のウェルプレートW(蓋体67で閉鎖済み)を嵌め込み、蓋体53で閉鎖して培養空間を画定した後に、ガス供給用ホース27から炭酸ガス(CO)を供給し、水供給用ホース25から水槽23へ水を供給すると共に、電気コード63を介して透明面状トップヒーターの透明導電膜61に通電し発熱させる。また、図示は省略しているが、水槽23の底部側にもヒーターが設置されており、このヒーターの加熱により水槽23内の水を蒸発させて培養空間内を所望の湿度にする。上記したガス供給用ホース27や水供給用ホース25やヒーターもコントローラ65下の制御下にあり、培養空間が一定のものに維持されることになる。
その状態で、収容ユニット3を顕微鏡ステージSに設置する。この際、収容ユニット3の本体部5の下面側の段差部21を顕微鏡ステージSの穴の縁に掛けて載せる。
一方で、顕微鏡観察用のウェルプレートWを用意しておく。各ウェルwには培養液Aや試料Bを予め入れておくが、ウェルプレートWの外縁側の一つのウェルwは温度検知の専用とし、培養液Aのみを入れておく。そして、この温度検知専用のウェルw内に温度検知手段29の検知部31の保護チューブから裸出した先端を差し入れその底面付近まで下ろして培養液Aに浸した状態とした上で、蓋体67でウェルプレートWの上面側開口を閉鎖すると共に、ウェルプレート内導入手段により検知部31を固定しておく。
ダミー用のウェルプレートWを用いての一定時間の予備運転が終了すると、収容ユニット3の蓋体53を開いてダミー用のウェルプレートWを取出し、顕微鏡観察用のウェルプレートWを嵌め込み、検知部ホルダー33を介して温度検知手段29の検知部31を固定した後に、蓋体53で収容ユニット3を再び閉鎖する。
これで、培養空間内のウェルプレートWの各ウェルwに入れられた試料入りの培養液が培養に適した所定の湿度、温度等の環境に保たれて、観察可能モードに入る。
顕微鏡観察は、顕微鏡ステージSを移動させながら複数のウェルw内に入った試料Bを並行的に観察する。
ウェルプレートW中各ウェルwが配置された部位は全面にわたって下方側が裸出しており、ウェルwどうしの間もそのまま裸出して面一になっている。そのため、対物レンズRを観察用にウェルwに最接近した状態のまま、顕微鏡ステージSをXY方向に移動することができる。
また、各ウェルw上に透明面状トップヒーターが等距離をおいて対向しているので、いずれのウェルw内に入った培養液Aや試料Bも均一に加温される。
さらに、培養液Aの直接の温度情報に基づいて透明面状トップヒーターを加温するので、微小な温度変動にも遅滞なく逐次追従できるようになっており、培養液A、さらにはその中に入った試料Bも常に目標とする加温温度に精度高く維持することができる。
以上、本発明の実施の形態について詳述してきたが、具体的構成は、これらの実施の形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲における設計の変更などがあっても発明に含まれる。
例えば、ウェルプレート等の容器は、本発明の顕微鏡観察用培養装置の専用のものでなく、別売りのものを組み合わせて使用すれば良いが、容器を蓋体で閉鎖したい場合には、その蓋体は上記の実施の形態で記載したようなものを使用すれば、温度検知手段の検知部を上手く容器内に導入することができる。
容器はウェルプレートに限らず、ディッシュなどでもよい。その場合には、例えば2つのディッシュを用い、一方のディッシュを温度検知の専用に使用することもできる。
なお、温度検知の専用のものを用意するのは、観察作業の際に障害になったり、検知部由来で汚染が発生するのを気にする場合であるが、検知部は滅菌可能であり、それらが気にならない場合には、検知部が差し込まれたウェル等にも試料を入れて顕微鏡観察に使用してもよい
本発明の顕微鏡観察用培養装置は、顕微鏡の附属品として利用できる。
1…顕微鏡観察用培養装置 3…収容ユニット 5…本体部
7…上面側開口 9…下面側開口 11…内方フランジ
13…アダプター 15…下端側開口 17…内方フランジ
19…押えバネ 21…段差部 23…水槽
25…水供給用ホース 27…ガス供給用ホース
29…温度検知手段 31…検知部 33…検知部ホルダー
35…ベースブロック 37…ネジ穴 39…溝 41…溝
43…押えブロック 45…ネジ穴 47…押えネジ
51…灌流用ホース用の取付用ホルダー 53…蓋体 55…枠体
57…透光部 59…透明ガラス板 61…透明導電膜
63…電気コード 65…コントローラ
67…(ウェルプレートの)蓋体 69…矩形穴 71…ネジ穴
73…押え板 75…ネジ穴 77…押えネジ
W…ウェルプレート w…ウェル A…培養液 B…試料
S…顕微鏡ステージ R…対物レンズ

Claims (5)

  1. 培養液と試料が入った容器を収容する収容ユニットと、前記収容ユニットの上面側開口を閉鎖する蓋体とを備え、顕微鏡のステージに設置して前記試料を顕微鏡観察するのに用いる顕微鏡観察用培養装置において、
    前記収容ユニットにはウェルプレートを着脱自在に嵌め込める大きさの下面側開口があり、前記下面側開口を狭める加温プレートは備えられておらず、
    前記蓋体のうち観察範囲に対応する部分に設けられた透明面状トップヒーターと、
    細線状の検知部が前記収容ユニットの内方に入り込み、さらに収容された容器内に入り込んでそこに供給された培養液に浸されてその温度を直接測定する温度検知手段とを有し、
    前記温度検知手段からの温度情報に基づいて前記透明面状トップヒーターをフィードバック方式により温度制御することを特徴とする顕微鏡観察用培養装置。
  2. 請求の範囲第1項に記載した顕微鏡観察用培養装置において、
    温度検出手段の検知部を収容ユニット内に長さ自在に導入させる導入手段を備えることを特徴とする顕微鏡観察用培養装置。
  3. 請求の範囲第1項または第2項に記載した顕微鏡観察用培養装置において、
    専用の容器の蓋体を備えており、
    温度検知手段の検知部は前記蓋体に取り付けられた導入手段を介して容器内に導入されることを特徴とする顕微鏡観察用培養装置。
  4. 請求の範囲第3項に記載した顕微鏡観察用培養装置において、
    容器の蓋体は透明ガラスで形成されていることを特徴とする顕微鏡観察用培養装置。
  5. 請求の範囲第1項から第4項のいずれかに記載した顕微鏡観察用培養装置の使用方法において、複数のセクションで区切られた容器、または複数の容器をユニット内に収容し、いずれか一つのセクションまたは容器に温度検知手段の検知部を入り込ませて温度検知用に使用し、その余りのセクションまたは容器を顕微鏡観察用に使用することを特徴とする使用方法。
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