JP2009149661A - 抗her2抗体改変体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アラニンスキャニングによって抗原結合に必須であることが決定された特定のヒト化抗HER2抗体hu4D5−8のアミノ酸、およびアラニンスキャニングによって抗原結合に比較的重要でないことが見出された他のアミノ酸(置換されて、HER2に対する高い親和性を有する改変体を作製し得る)。
【選択図】なし
Description
(発明の分野)
本発明は、新規の抗体改変体、特に抗HER2抗体改変体に関する。
レセプターチロシンキナーゼのErbBファミリーのメンバーは、細胞増殖、細胞分化、および細胞生存の重要なメディエータである。レセプターファミリーとしては、4つの異なったメンバー(上皮成長因子レセプター(EGFRまたはErbB1)、HER2(ErbB2またはp185neu)、HER3(ErbB3)およびHER4(ErbB4またはtyro2)を含む)が挙げられる。
本発明は、アラニンスキャニングによって抗原結合に必須であることが決定された特定のヒト化抗HER2抗体hu4D5−8のアミノ酸、およびアラニンスキャニングによって抗原結合に比較的重要でないことが見出された他のアミノ酸(置換されて、HER2に対する高い親和性を有する改変体を作製し得る)の発見に基づく。潜在的な変異の好ましい位置は、図2において示される。従って、特定の改変体が本明細書中で詳細に考察されるが、図2中で示される1つ以上の位置で置換を有する他の改変体もまた、本発明によって企図され、そして包含される。したがって、本発明は、以下をも提供する。
(1)抗体軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドであって、該可変ドメインは、配列番号1の超可変領域を含み、ここで、Kabat番号付けシステムに従って番号付けられた、Q27(VL);D28(VL)、N30(VL)、T31(VL)、A32(VL)、Y49(VL)、F53(VL)、Y55(VL)、R66(VL)、H91(VL)、Y92(VL)、およびT94(VL)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、ポリペプチド。
(2)配列番号1の前記超可変領域が、N30(VL)、F53(VL)、Y55(VL)、H91(VL)、Y92(VL)、およびT94(VL)からなる群から選択される1つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む、項目1に記載のポリペプチド。
(3)配列番号1の前記超可変領域が、D28(VL)Q;D28(VL)G;N30(VL)S;T31(VL)S;A32(VL)G;Y49(VL)W、Y49(VL)D、Y49(VL)V;F53(VL)W、F53(VL)V、F53(VL)Q、Y55(VL)W、R66(VL)N、H91(VL)F、H91(VL)Y、Y92(VL)W、およびT94(VL)Sからなる群から選択される1つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む、項目1に記載のポリペプチド。
(4)配列番号1の前記超可変領域が、D28(VL)Q;D28(VL)G;N30(VL)S;T31(VL)S;A32(VL)G;Y49(VL)W、Y49(VL)D、Y49(VL)V;F53(VL)W、F53(VL)V、F53(VL)Q、Y55(VL)W、R66(VL)N、H91(VL)F、H91(VL)Y、およびY92(VL)Wからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目3に記載のポリペプチド。
(5)配列番号1の前記超可変領域が、Y49(VL)D、F53(VL)W、およびY55(VL)Wからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目4に記載のポリペプチド。
(6)2つまたは3つの前記アミノ酸置換を含む、項目5に記載のポリペプチド。
(7)前記アミノ酸置換の3つ全てを含む、項目6に記載のポリペプチド。
(8)配列番号1の前記超可変領域が、N30(VL)S、F53(VL)W、Y55(VL)W、H91(VL)F、Y92(VL)WおよびT94(VL)Sからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目3に記載のポリペプチド。
(9)N30(VL)はSと置換され、H91(VL)はFと置換され、そしてY92(VL)はWと置換される、項目8に記載のポリペプチド。
(10)抗体である、項目1、項目4および項目5のうちいずれか1項に記載のポリペプチド。
(11)ヒト化抗体である、項目10に記載のポリペプチド。
(12)ヒト抗体である、項目10に記載のポリペプチド。
(13)Fvフラグメント、Fabフラグメント、Fab’ フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである、項目10に記載のポリペプチド。
(14)抗体重鎖可変ドメインを含むポリペプチドであって、該可変ドメインは、配列番号2の超可変領域を含み、ここで、Kabat番号付けシステムに従って番号付けられた、W95(VH)、D98(VH)、F100(VH)、Y100a(VH)、およびY102(VH)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、ポリペプチド。
(15)配列番号2の前記超可変領域が、W95(VH)Y、D98(VH)W、D98(VH)R、D98(VH)K、D98(VH)H、F100(VH)P、Fl00(VH)L、F100(VH)M、Y100a(VH)F、Y102(VH)V、Y102(VH)K、およびY102(VH)Lからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目14に記載のポリペプチド。
(16)配列番号2の前記超可変領域が、D98(VH)W、Y100a(VH)F、およびY102(VH)Vからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目15に記載のポリペプチド。
(17)配列番号2の前記超可変領域が、F100(VH)PおよびY102(VH)Kからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目15に記載のポリペプチド。
(18)アミノ酸置換F100(VH)PおよびY102(VH)Kを含む、項目17に記載のポリペプチド。
(19)配列番号2の前記超可変領域が、F100(VH)PおよびY102(VH)Lからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目15に記載のポリペプチド。
(20)F100(VH)PおよびY102(VH)Lのアミノ酸置換を含む、項目19に記載のポリペプチド。
(21)抗体である、項目14および項目17〜20のうちいずれか1項に記載のポリペプチド。
(22)ヒト化抗体である、項目21に記載のポリペプチド。
(23)ヒト抗体である、項目21に記載のポリペプチド。
(24)Fvフラグメント、Fabフラグメント、Fab’ フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである、項目21に記載のポリペプチド。
(25)HER2の細胞外ドメインに結合可能な抗体であって、該抗体は、配列番号1の前記超可変領域を含み、ここで、Kabat番号付けシステムに従って番号付けられた、Q27(VL)、D28(VL)、N30(VL)、T31(VL)、A32(VL)、Y49(VL)、F53(VL)、Y55(VL)、R66(VL)、H91(VL)、Y92(VL)、およびT94(VL)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、抗体。
(26)Kabat番号付けシステムに従って番号付けられた、N30(VL)、F53(VL)、Y55(VL)、H91(VL)、Y92(VL)、およびT94(VL)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、項目25に記載の抗体。
(27)配列番号1の前記超可変領域が、D28(VL)Q;D28(VL)G;N30(VL)S;T31(VL)S;A32(VL)G;Y49(VL)W、Y49(VL)D、Y49(VL)V;F53(VL)W、F53(VL)V、F53(VL)Q、Y55(VL)W、R66(VL)N、H91(VL)F、H91(VL)Y、Y92(VL)W、およびT94(VL)Sからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目25に記載の抗体。
(28)配列番号1の前記超可変領域が、D28(VL)Q;D28(VL)G;N30(VL)S;T31(VL)S;A32(VL)G;Y49(VL)W、Y49(VL)D、Y49(VL)V;F53(VL)W、F53(VL)V、F53(VL)Q、Y55(VL)W、R66(VL)N、H91(VL)F、H91(VL)Y、およびY92(VL)Wからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目27に記載の抗体。
(29)配列番号1の前記超可変領域が、Y49(VL)D、F53(VL)W、およびY55(VL)Wからなる群から選択される1つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む、項目28に記載の抗体。
(30)2つまたは3つの前記アミノ酸置換を含む、項目29に記載の抗体。
(31)前記アミノ酸置換の3つ全てを含む、項目30に記載の抗体。
(32)配列番号1の前記超可変領域が、N30(VL)S、F53(VL)W、Y55(VL)W、H91(VL)F、Y92(VL)W、T94(VL)Sからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目26に記載の抗体。
(33)N30(VL)はSで置換され、H91(VL)はFで置換され、そしてY92(VL)はWで置換される、項目32に記載の抗体。
(34)ヒト化抗体である、項目25または項目29に記載の抗体。
(35)ヒト抗体である、項目25または項目29に記載の抗体。
(36)Fvフラグメント、Fabフラグメント、Fab’ フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである、項目25または項目29に記載の抗体。
(37)HER2の細胞外ドメインに結合可能な抗体であって、該抗体は、配列番号2の超可変領域を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、ここで、Kabat番号付けシステムに従って番号付けられた、W95(VH)、D98(VH)、F100(VH)、Yl00a(VH)、およびY102(VH)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、抗体。
(38)配列番号2の前記超可変領域が、W95(VH)Y、D98(VH)W、D98(VH)R、D98(VH)K、D98(VH)H、F100(VH)P,F100(VH)L、F100(VH)M、100a(VH)F、Y102(VH)V、Y102(VH)K、およびY102(VH)Lからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目37に記載の抗体。
(39)配列番号2の前記超可変領域が、D98(VH)W、Y100a(VH)F、およびY102(VH)Vからなる群から選択される1つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む、項目38に記載の抗体。
(40)配列番号2の前記超可変領域が、F100(VH)PおよびY102(VH)Kからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目38に記載の抗体。
(41)アミノ酸置換F100(VH)PおよびY102(VH)Kを含む、項目40に記載のポリペプチド。
(42)ヒト化抗体である、項目20に記載の抗体。
(43)ヒト抗体である、項目37または項目40に記載の抗体。
(44)Fvフラグメント、Fabフラグメント、Fab’ フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである、項目37または項目40に記載の抗体。
(45)HER2の細胞外ドメインに結合可能な抗体であって、該抗体は、配列番号1および配列番号2の前記超可変領域を含み、ここで、Kabat番号付けシステムに従って番号付けられた、D28(VL)、N30(VL)、T31(VL)、A32(VL)、Y49(VL)、F53(VL)、Y55(VL)、R66(VL)、H91(VL)、Y92(VL)、T94(VL)、W95(VH)、D98(VH)、F100(VH);Y100a(VH)、およびY102(VH)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、抗体。
(46)配列番号1および配列番号2の前記超可変領域が、N30(VL)S、F53(VL)W、Y55(VL)W、H91(VL)F、Y92(VL)W、T94(VL)S、D98(VH)W、Y100a(VH)F、およびY102(VH)Vからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目45に記載の抗体。
(47)N30(VL)はSで置換され、H91(VL)はFで置換され、Y92(VL)はWで置換され、T94(VL)はSで置換され、D98(VH)はWで置換され、Y100a(VH)はFで置換され、そしてY102(VH)はVで置換される、項目46に記載の抗体。
(48)D98(VH)はWで置換される、項目46に記載の抗体。
(49)配列番号1および配列番号2の前記超可変領域が、D28(VL)Q;D28(VL)G;N30(VL)S;T31(VL)S;A32(VL)G;Y49(VL)W、Y49(VL)D、Y49(VL)V;F53(VL)W、F53(VL)V、F53(VL)Q、Y55(VL)W、R66(VL)N、H91(VL)F、H91(VL)Y、Y92(VL)W、T94(VL)S、W95(VH)Y、D98(VH)W、D98(VH)R、D98(VH)K、D98(VH)H、F100(VH)P、F100(VH)L、F100(VH)M、Y100a(VH)F、Y102(VH)V、Y102(VH)K、およびY102(VH)Lからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目45に記載の抗体。
(50)配列番号1および配列番号2の前記超可変領域が、Y49(VL)D、F53(VL)W、Y55(VL)W、D98(VH)W、F100(VH)P、およびY102(VH)Lからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目45に記載の抗体。
(51)配列番号1および配列番号2の前記超可変領域が、以下の置換:Y49(VL)D、F53(VL)W、Y55(VL)W、F100(VH)P、およびY102(VH)Lを含む、項目50に記載の抗体。
(52)配列番号2の前記超可変領域が、置換D98(VH)Wをさらに含む、項目51に記載の抗体。
(53)配列番号1および配列番号2の前記超可変領域が、以下の置換:Y49(VL)D、F53(VL)W、Y55(VL)W、F100(VH)P、およびY102(VH)Kを含む、項目50に記載の抗体。
(54)配列番号2の前記超可変領域が、置換D98(VH)Wをさらに含む、項目53に記載の抗体。
(55)項目45に記載の抗体であって、ここで、HER2細胞外ドメインに対する前記抗体の結合親和性は、該HER2細胞外ドメインに対するヒト化モノクロ−ナル抗体4D5−8の結合親和性より少なくとも約3倍高い、抗体。
(56)ヒト化抗体である、項目45、項目51または項目53に記載の抗体。
(57)ヒト抗体である、項目45、項目51または項目53に記載の抗体。
(58)Fvフラグメント、Fabフラグメント、Fab’ フラグメントおよびF(ab’)2フラグメントからなる群から選択される抗体フラグメントである、項目45、項目51または項目53に記載の抗体。
(59)HER2の細胞外ドメインに結合可能な抗体であって、該抗体は、配列番号1の軽鎖可変ドメインを含み、ここで、Kabat番号付けシステムに従って番号付けられた、Q27(VL)、N30(VL)、Y49(VL)、F53(VL)、Y55(VL)、H91(VL)、Y92(VL)、およびT94(VL)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸が、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換される、抗体。
(60)配列番号1の前記軽鎖可変ドメインが、N30(VL)S、Y49(VL)F、Y49(VL)W、F53(VL)W、Y55(VL)W、H91(VL)F、Y92(VL)W、およびT94(VL)Sからなる群から選択される1つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含む、項目59に記載の抗体。
(61)N30(VL)はSで置換され、H91(VL)はFで置換され、そしてY92(VL)はWで置換される、項目60に記載の抗体。
(62)Kabat番号付けシステムに従って番号付けられた、N30(VL)S、Y49(VL)F、Y49(VL)W、F53(VL)W、Y55(VL)W、H91(VL)F、Y92(VL)W、T94(VL)S、F100(VL)W、D98(VH)W、Y100a(VH)F、およびY102(VH)Vからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗HER2抗体4D5−8。
(63)Y49(VL)D、F53(VL)W、Y55(VL)W、F100(VH)P、Y102(VH)KおよびY102(VH)Lからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗HER2抗体4D5−8。
(64)アミノ酸置換D98(VH)Wをさらに含む、項目63に記載の抗体。
(65)Y49(VL)D、F53(VL)WおよびY55(VL)Wからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目62に記載の抗体。
(66)F100(VH)P、Y102(VH)KおよびY102(VH)Lからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む、項目62に記載の抗体。
(67)以下のアミノ酸置換:Y49(VL)D、F53(VL)W、Y55(VL)W、F100(VH)P、およびY102(VH)Kを含む、項目64に記載の抗体。
(68)以下のアミノ酸置換:Y49(VL)D、F53(VL)W、Y55(VL)W、F100(VH)P、およびY102(VH)Lを含む、項目64に記載の抗体。
(69)容器、そこに含まれる組成物、および該組成物がHER2の過剰発現によって特徴付けられる癌を処置するために使用され得ることを示すパッケ−ジ挿入物またはラベルを含む製品であって、該組成物は、項目60または項目61に記載の抗体を含有する、製品。
(70)前記癌が乳癌である、項目69に記載の製品。
(71)HER2に結合する親抗体の抗体改変体であって、その重鎖可変ドメインの98位にアミノ酸置換を含み、そしてここで、該抗体改変体のHER2に対する結合親和性は、該親抗体のHER2に対する結合親和性より高い、抗体改変体。
(72)前記98位のアミノ酸がWと置換される、項目71に記載の抗体改変体。
(73)前記親抗体がヒト化抗体である、項目70に記載の抗体改変体。
(74)ヒト化抗HER2抗体の高親和性改変体を単離する方法であって、該方法は、以下:
(a)配列番号1および配列番号2の超可変領域内において、Q27(VL)、D28(VL)、N30(VL)、T31(VL)、A32(VL)、Y49(VL)、F53(VL),Y55(VL)、R66(VL)、H91(VL)、Y92(VL)、T94(VL)、W95(VH)、D98(VH)、F100(VH)、Y100a(VH)、およびY102(VH)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸における置換により抗HER2改変体を産生する工程であって、ここで、番号付けはKabat番号付けシステムに従う、工程;
(b)(a)において産生された該改変体のHER2細胞外ドメインに対する結合親和性を測定する工程;ならびに
(c)高親和性改変体を選択する工程
を包含する、方法。
(a)配列番号1および配列番号2の超可変領域内において、Q27(VL)、D28(VL)、N30(VL)、T31(VL)、A32(VL)、Y49(VL)、F53(VL),Y55(VL)、R66(VL)、H91(VL)、Y92(VL)、T94(VL)、W95(VH)、D98(VH)、F100(VH)、Y100a(VH)、およびY102(VH)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸における置換により抗HER2改変体を産生する工程であって、ここで、番号付けはKabat番号付けシステムに従う、工程;
(b)(a)において産生されたこの改変体のHER2細胞外ドメインに対する結合親和性を測定する工程;ならびに
(c)高親和性改変体を選択する工程
を、包含する。
本発明は、親抗体と等しいか親抗体より高いHER2結合親和性を有するヒト化抗HER2抗体、hu4D5−8の改変体の同定に基づく。これらの改変体は、一組のFabライブラリーから同定された。このFabライブラリーにおいて、軽鎖可変ドメインおよび/または重鎖可変ドメインの中に19の位置が20個全てのアミノ酸で置換された。これらの位置は、hu4D5−8可変領域のアラニンスキャニング変異に一部基づく置換について選択された。hu4D5−8抗体の高親和性HER2結合部位の範囲内の配列可変性を、一価のディスプレイFab−ファージライブラリーの構築、HER2結合クローンの選択、および、高レベルの全体の可変性(最小の同種で、すなわち、同一クローンの出現)が観察される選択過程における一点における、各ライブラリープールからの大量サンプル(50〜70クローン)の配列決定によって試験した。可溶性Fabフラグメントの結合親和性もまた、試験した。1つの変異体、D98(VH)Wが、野生型hu4D5−8
Fabに対し3倍の改善された結合親和性を有することが見出された。
他に規定されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。Singletonら,Dictionary of Microbiology and Molecular
Biology 第2版,J.Wiley & Sons(New York,NY 1994)。当業者は、本明細書中で記載されるものと類似するかまたは等価の多くの方法および材料が、本発明の実施において使用され得ることを理解する。実際、本発明は、記載される方法および材料には決して限定されない。本発明の目的について、以下の用語を以下に定義する。
of Health,Bethesda,MD.(1991))および/または「超可変ループ」由来の残基(すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基26〜32、50〜52および91〜96ならびに重鎖可変ドメインにおける26〜32、53〜55、および96〜101;ChothiaおよびLesk J.Mol.Biol.196:901−917(1987))を含む。両方の場合において、可変ドメイン残基は、以下でさらに詳しく考察されるように、Kabatら(前出)に従って番号付けられる。「フレームワーク」残基すなわち「FR」残基は、本明細書中で定義されるこれらの超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。
本発明は、抗体改変体に関し、好ましくは抗HER2抗体改変体に関する。本発明の抗体は、多くの異なった形態をとり得る。例えば、抗体は、インタクトな抗体(例えば、IgG1抗体、抗体フラグメント(例えばFab)、二種特異性抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。
ヒト化抗体(特にヒト化抗HER2抗体)を産生するための方法が、公知である。例えば、hu4D5−8として知られるヒト化抗HER2抗体の産生は、以下の実施例および米国特許第5,821,337号(本明細書中で特に参考として援用される)において記載される。
10463の受託番号を与えられた。
9(3):1165−72(1989))。IgG形態のhu4D5−8(ハーセプチンR;トラスツズマブ(trastuzumab))は、乳癌の処置において、治療として使用される(McKeage,K.およびPerry,C.M.(Drugs 62(1):209−43 (2002))によって総説される)。
Health Service、National Institute of Health,Bethesda,MD(1991)に記載される可変ドメイン番号付けシステムを利用する)からなる群から選択される位置におけるフレームワーク領域(FR)置換をさらに含み得る。一つの実施形態において、ヒト化抗体は、R66(VL)位、A71(VH)位、T73(VH)位、A78(VH)位およびS93(VH)位のうちの2箇所または全ての箇所におけるFR置換を含む。
ヒト化の代替として、ヒト抗体が生成され得る。例えば、トランスジェニック動物(例えば、マウス)であって、免疫の際に内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の充分なレパートリーを生成し得るものを作製することが今や可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合部(JH)遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全阻害を生じることが記載されている。そのような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子のアレイの移入は、抗原攻撃(challenge)に際しヒト抗体の産生を生じる。例えば、以下を参照のこと:Jakobovitsら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovitsら,Nature,362:255−258(1993);Bruggermannら,Year in Immuno.,7:33(1993);ならびに米国特許第5,591,669号、同第5,589,369号および同第5,545,807号。
種々の軽鎖および/または重鎖可変ドメインを含む抗体フラグメントが、本明細書中で記載される。種々の技術が、抗体フラグメントの産生のために開発されてきた。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質消化を介して誘導された(例えば、以下を参照のこと:Morimotoら,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117(1992);およびBrennanら,Science,229:81(1985))。
二重特異性抗体は、本明細書中で記載される抗HER2抗体改変体の結合部位を含むことが、企図される。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープについての結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ErbB2タンパク質の2つの異なるエピトープに結合し得る。他のそのような抗体は、ErbB2結合部位と、EGFR、ErbB3および/またはErbB4についての結合部位とを組合せ得る。あるいは、抗ErbB2アームは、T細胞レセプター分子(例えば、CD2もしくはCD3)またはIgGについてのFcレセプター(FcγR)(例えば、FcγRI(例えば、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII (CD16)))のような白血球上のトリガー分子に結合するアームと組み合わされて、細胞防御機構をErbB2発現細胞へと集中させ得る。二重特異性抗体はまた、ErbB2を発現する細胞に対して細胞傷害性因子を局在化させるために使用され得る。WO 96/16673は、二重特異性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体を記載し、そして米国特許第5,837,234号は、二重特異性抗ErbB2/抗FcγRI抗体を開示する。二重特異性抗ErbB2/Fcα抗体は、WO 98/02463に示されている。米国特許第5,821,337号は、二重特異性抗ErbB2/抗CD3抗体を教示する。
的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の分解性活性をトリガーし得る。
抗体のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが好ましくあり得る。アミノ酸配列改変体は、適切なヌクレオチド変化を抗体改変体をコードする核酸に導入することによるか、またはペプチド合成により調製される。そのような改変としては、例えば、抗体改変体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および/または挿入ならびに/あるいは置換を包含する。欠失、挿入および置換の任意の組合せは、その最終構築物が所望の特性を有する場合に、最終構築物に達するように作製される。そのアミノ酸変化はまた、抗体改変体の翻訳後プロセシングを変更し得る(例えば、グリコシル化部位の数または位置の変化)。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu; (4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖方向に影響を与える残基:gly、pro;および
(6)芳香族性:trp、tyr、phe。
親和性成熟は、親抗体と比較して改善された親和性を有する抗体を生成し得る。天然に存在する抗体の配列多様性は、選択された多様な遺伝子セグメントの組換えを有するB細胞において生じ、この遺伝子セグメントは、不正確な切断事象、ヌクレオチド挿入、二次遺伝子再編成によって免疫グロブリン応答の成熟の間に続く二次遺伝子再編成、および点変異を有する。これらの変更は、親和性および特異性の高い抗体を産生するB細胞クローンの選択を介した免疫応答の特異性および有効性を増強するのに寄与する。
S.およびChiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564−571(1993)を参照のこと。
Mol Biol 87:249−64(1998)によって記載されるように、ファージミドおよびヘルパーファージの使用によって達成され得る。好ましいファージは、M13であり、そしてディスプレイは、好ましくは、被膜タンパク質3との融合タンパク質である(Lowmanら(前出)によって記載される)。
改変体抗体を生成した後に、所望する場合、特定の生物学的特徴を有する抗体をさらに選択し得る。
A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されるようなアッセイ)が実施され得る。あるいは、またはさらに、エピトープマッピングが、当該分野で公知の方法によって実施され得る。
本発明はまた、細胞障害性薬剤(例えば、化学治療剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物または動物の起源由来の酵素学的に活性な毒素あるいはそのフラグメント、または放射活性同位体(すなわち、放射性結合体))と結合した抗体を含む免疫結合体に関する。
イミジルスベリン酸)、アルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス−アジド化合物(例えば、ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス−ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン2,6−ジイソシアネート)、およびビス−活性フッ素化合物(例えば、1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン)を使用して行なわれ得る。例えば、リシン免疫毒素は、Viettaら、Science 238:1098(1987)に記載されるように、調製され得る。炭素14標識した1−イソチオシアネートベンジル−3−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(MX−DTPA)は、抗体への放射性ヌクレオチドの結合体化についての例示的なキレート剤である。WO94/11026を参照のこと。
本発明に従って使用される抗体改変体の治療的処方物は、凍結乾燥形態または水溶液として、所望の程度の純度を有すると抗体と必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤とともに混合されることによって、調製される(Remington’s Pharmaceutical Sciences 第16版、Osol,A.編(1980))。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して毒性はなく、そして例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質;例えば、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸;単糖、二糖、および他の炭水化物(グルコース、マンノース、または デキストリンを含む);例えば、EDTAなどのキレート剤;例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖;例えば、ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属複合体(例えば、亜鉛−タンパク質複合体);ならびに/またはTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性物質が挙げられる。好ましい凍結乾燥された抗ErbB2抗体処方物は、WO97/04801に記載され、本明細書中に参考として明確に援用される。
スコア0 染色は全く見られないかまたは膜染色が、10%未満の腫瘍細胞で見出される。
スコア1+ かすかな/かろうじて認知できる膜染色が、10%を越える腫瘍細胞で検出される。その細胞は、それらの膜の一部のみが染色されている。
スコア2+ 弱から中程度の完全な膜染色が、10%を越える腫瘍細胞で検出される。
スコア3+ 中程度から強い完全な膜染色が、10%を越える腫瘍細胞で見出される。
本発明の別の実施形態では、上記の障害の処置に有用な物質を含む製造品が、提供される。この製造品は、容器上にあるかまたはその容器に付随するラベルまたはパッケージ挿入物を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。これらの容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の物質から形成され得る。その容器は、状態の処置に効果的な組成物を保持し、そして滅菌アクセスポート(例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下組織注射針によって貫通し得るストッパーを有するバイアルであり得る)を有し得る。その組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本発明に教示従った、抗体改変体である。1つの実施形態において、その容器は、本明細書において記載の抗体改変体を含有する10mLの溶液を含む10ccバイアルである。
(抗ErbB2モノクローナル抗体4D5の生成、特徴付けおよびヒト化)
ErbB2の細胞外ドメインに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体4D5を、Fendlyら、Cancer Res 50:1550−1558(1990)に記載されるように、生成した。手短には、Hudziakら、Mol Cell Biol 9(3):1165〜72(1989)に記載されるように生成したNIH3T3/HER2−3400細胞(約1×105ErbB2分子/細胞を発現する)は、25mM EDTAを含むリン酸緩衝化食塩水(PBS)を用いて収集し、BALB/cマウスを免疫化するために使用した。マウスに、0、2、5および7週間で、0.5ml PBS中の107細胞の腹腔内注入を付与した。32P 標識したErbB2で免疫沈降する抗血清を有するマウスは、9および13週で、小麦胚芽凝集素(WGA)セファロースで精製したErbB2膜抽出物の腹腔 内注入を付与した。続いて、0.1mlのErbB2調製物の静脈内注入を行い、脾細胞を、マウス骨髄腫株X63−Ag8.653と融合した。ハイブリドー マ上清を、ELISAおよび放射性免疫沈降によるErbB2結合についてスクリーニングした。
モノクローナル抗体4D5によって結合されるErbB2エピトープを、競合的結合分析(Fendlyら、Cancer Res 50:1550−1558(1990))によって決定した。交差ブロック研究を、蛍光を定量するためにPANDEXTMスクリーンマシンを使用して、インタクトな細胞の直接の蛍光によって、行なった。これらのモノクローナル抗体を、確立された手順(Wofsy ら、Selected Methods in Cellular Immumology,p.287,MishelおよびSchiigi(編)SanFrancisco:W.J.Freeman Co.(1980))を使用して、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)と結合された。NIH 3T3/HER2−3400細胞のコンフルエントな単層をトリプシン処理し、1回洗浄し、そして0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.1%NaN3を含むコールドなPBS中で、1.75×106細胞/mlの濃度に再懸濁した。最終濃度1%のラテックス粒子(IDC,Portland,OR)を、PANDEXTMプレート膜の塊状化を減少させるために加えた。細胞懸濁液20μl、および精製されたモノクローナル抗体(100μg/ml〜0.1μg/ml)20μlを、PANDEXTMプレートウェルに加え、そして氷上30分間インキュベートした。20μl中の所定のFITC標識のモノクローナル抗体の希釈液を、それぞれのウェルに加え、30分間インキュベートし、洗浄し、そしてその蛍光を、PANDEXTMに よって定量した。モノクローナル抗体を、無関係のモノクローナル抗体のコントロールと比較して、それぞれの抗体が50%以上他の抗体の結合をブロックすれば、エピトープを共有すると見なした。この実施例では、モノクローナル抗体4D5に、それぞれエピトープI(ErbB2細胞外ドメイン(残基約22〜約645(端の残基を含む))中の、アミノ酸残基約590〜約625に由来する)を割り当てた。
モノクローナル抗体4D5の増殖阻害特徴を、乳癌細胞株SK−BR−3(Hudziakら、Molec.Cell. Biol.9(3):1165−1172(1989)を参照のこと)を使用して評価した。手短には、SK−BR−3細胞を、0.25%(vol/vol)トリプシンを使用して剥離し、そして1ml当り4×105細胞の密度で、完全培地に懸濁した。100μl(4×104細胞)のアリコートを、96ウェル微量希釈溶液プレートにプレートし、それらの細胞を接着させ、そして培地のみ100μlまたはモノクローナル抗体(最終濃度5μg/ml)を含む培地100μlを、次いで、加えた。Sugarmanら、Science 230:943−945(1985)に記載されるように、72時間後、プレートを、2回PBS(pH7.5)で洗浄し、クリスタルバイオレット(メタノール中0.5%)で染色し、相対的な細胞増殖を分析した。モノクローナル抗体4D5は、SK−BR−3相対的細胞増殖を約56%阻害した。
256:1205−1210(1992);Sliwkowskiら、J.Biol.Chem.269:14661 −14665(1994))反射デンシトメトリー(reflectance densitometry)によって定量した。
マウスモノクローナル抗体4D5を、米国特許第5,821,337号(これは、その全体が参考として本明細書中で明示的に援用される)に記載の、新規の「遺伝子変換変異」ストラテジーを利用してヒト化した。以下の実験で使用されるヒト化モノクローナル抗体4D5は、その特許の中でhu4D5−8として示される抗体改変体である。Hu4D5−8は、軽鎖可変ドメイン(VL)(配列番号1)および重鎖可変ドメイン(VH)(配列番号2)を含む。この配列番号1の軽鎖可変ドメインは、以下の3つの超可変領域である:VL−超可変領域1(アミノ酸RASQDVNTAVA(配列番号19)を含む);VL−超可変領域2(アミノ酸SASFLYS(配列番号20)を含む);VL−超可変領域3(アミノ酸QQHYTTPPT(配列番号21)を含む)。同様に、配列番号2の重鎖可変ドメインも、以下の3つの超可変領域である:VH−超可変領域1(アミノ酸GFNIKDTYIH(配列番号22)を含む);VH−超可変領域2(アミノ酸RIYPTNGYTRYADSVKG(配列番号23)を含む);VH−超可変領域3(アミノ酸WGGDGFYAMDY(配列番号24)を含む)。
(HU4D5−8改変体)
多くの場合、抗体の認識は、抗原結合部位の中央に接触する超可変領域の残基の一部に関与する(Schierら、J Mol Biol 263(4):551−67(1996)を参照のこと)。これは、hu4D5として公知のヒト化抗体による腫瘍抗原HER2の認識における場合である。ファージディスプレイは、結合部位の全体的な改変体の調査を可能にし、親和性を改善するためにさらなる置換がなされ得る位置を明らかにした。hu4D5−8の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、CDR残基と共に図1Aおよび図1Bにそれぞれ示した。
ファージライブラリーの設計は、アラニンスキャニング研究に由来する4個の重要な残基に集中した(Kelley,R.F.およびO’Connell,M.P.、Biochemistry 32(27):6828−35(1993))。これらは、軽鎖(VL)の可変的ドメインと重鎖(VH)の可変的ドメインの両方(H91(VL)、R50(VH)、W95(VH)、およびY100a(VH))(Kelley,R.F.およびO’Connell,M.P.、Biochemistry 32(27):6828−35(1993))において、CDR残基を含む。VL:VH界面に対して近接した、抗原結合部位の中央に近く、hu4D5−8の結晶構造の検査に基づいて(Eigenbrotら、J Mol Biol 229(4)969−95(1993))、付加的に表面露出した残基もまた、置換のために選択される。主鎖構造または標準的な構造に対する重要性が公知の残基(Chothiaら、Nature 342(6252):877−83(1989))は、ライブラリーから除外した。すべての改変体の十分な表現を達成するために、標的位置を、5つのライブラリーに分割し、その各々が表面位置の小さいクラスタからなり、各々に標的とした残基がわずか7個であるように分割した。各ライブラリー(CDR−H3中の5個の残基を標的とするライブラリーを除く)は、VLとVHの両方に由来する残基の変異を可能とした(図2)。いくつかの残基は、状況の影響を試験し、他の近位位置での共変動を可能にするために、1つより多くのライブラリーにおいて発現させた。
hu4D5−8の合計19残基を、20のすべてのアミノ酸をコードする変性NNSコドン(N=A,G,TまたはC;S=GまたはC)での部位特異的変異誘発を使用して、無作為化した。部位特異的変異誘発を、以下のデオキシオリゴヌクレオチドを使用して実施した:
hu4D5−8ファージミド(564/11)は、Fab(Kelleyら、Biochemistry 31(24):5434−41(1992))の軽鎖および重鎖を融合することにより、M13ファージ被膜タンパク質の1つをコードするg3の短縮形態になるように作製した。
Mol Biol 87:249−64(1998))に記載されるように構築した。各々のライブラリーに関して、鋳型は、アミノ酸が突然変異されるべき位置に導入された終止コドン(TAA)を含む、ファージミド564/11の改変版であった。各々のライブラリーに対して、異なる終止用テンプレートを作製した。終止用テンプレートおよび前の節に記載した変異原性オリゴを、標準的Kunkel突然変異誘発(Kunkelら、Methods Enzymol 204:125−39(1991))において使用した。終止用テンプレートに対する変異原性オリゴのアニーリングは、終止コドンを修復し、そして所望の突然変異を誘導した。すべてのライブラリーが1010の次数にあり、理論的な多様性の10倍〜1000倍以上で良好であった。このことは、各々のライブラリーにおいて、すべての改変体の複製物が少なくとも1つ存在することを保証した。
ファージを、E.coli中で増幅し、そしてHER2−ECDの濃度減少を利用して、10nMで開始し、各ラウンドで10倍減少する徐々にストリンジェントなラウンドの抗原結合選択に供した。
ファージを、細胞培養上澄み液から直接に、配列決定した。ファージについての標準的なPCR反応で、Fabの軽鎖および重鎖を増幅した。M13の一般的な順方向および逆方向のプライマー配列は、PCRプライマーに含まれるため、生成物は標準的なプライマーで容易に配列決定し得た。得られた配列を、最初に、以前に記載されたようにSGcount(Weissら、Proc Natl Acad Sci U S A 97(16)、8950−4(2000))で分析した。配列が不確定なクローンは、分析から除外した。次いで、残った配列を、(1)同種の除去、(2)NNSコドンの使用の結果である任意のコドンの偏りに対する標準化、および(3)異なるライブラリー由来の結果を直接に比較し得るための、配列総数に対する標準化、によりフィルターをかけた。各々のライブラリーに関して分析したクローン数は、以下の通りであった:ライブラリー1から71個、ライブラリー2から82個、ライブラリー3から71個、ライブラリー4から74個、およびライブラリー5から57個。
hu4D5−8結合部位中の配列の可変性を系統的にマッピングするために、配列データからWu−Kabat可変性係数を計算した。可変性(Vs)は、所定の位置での種々のアミノ酸の数を、所定の位置での最も一般的なアミノ酸の頻度で除算した数である(Wu,T.T.およびKabat,E.A.、J Exp Med 132(2)、211−50(1970))。
アラニンスキャニングは、WT残基をアラニンで置換し、そして一般的に機能の損失を測定する。これらの実験で使用されたファージライブラリーに関する目標は、無作為な置換および抗原結合性選択を通じて機能を維持することであった。抗体の結晶構造(図7)の状況下における、hu4D5−8のAlaスキャニング性マップ(Kelley,R.F.およびO’Connell,M.P.、Biochemistry 32(27):6828−35(1993))でのVSパラメーター(図5)を使用して、配列の変異度を比較した。2つのマップは、いくつかの共通の特徴および異なる特徴を示した。
脂肪族側鎖は、本明細書で試験されたライブラリーでは特異的に標的化されなかった。おそらく驚くことではないが、疎水的置換は、任意の所定の部位で支配し得なかった。しかし、この変異されたクローンの中に、低レベルを示す大多数の疎水的残基が存在した。もちろん、最も高い発生率は、R58(VH)で置換されたLeuについてたったの23%しかなかった。
(Hu4D5−8改変体Fab構築物)
実施例2において考察されたアッセイは、すべての試験されたクローンが抗原に対する高親和性(ナノモル〜ナノモル以下)結合親和性を保持したことを、定性的に上で実証した。これらのアッセイに加えて、可溶性Fabフラグメントの結合親和性もまた、試験した。
可溶性Fabフラグメントの文脈において点変異を使用する8個のクローン(非野生型残基の高頻度での発生および可変性供給源の範囲を表す)は、選択された置換がhu4D5−8 Fabと比較していかにHER2結合に影響するかを決定するために選択されおよび試験される。
Fab−発現プラスミドpAK19に対する変異を、QuikChange(登録商標)変異導入(Stratagene,La Jolla,CA)を用いて以前に記載されたように導入した(Carterら,Proc Natl Acad Sci U S A 89(10):4285−9(1992b))。Hu4D5−8 Fab変異体をE.coliにおける分泌により過剰発現させ(Carterら,Biotechnology (N Y)10(2):163−7(1992a))、そしてタンパク質−Gアフィニティーカラムを使用して精製した(Kelleyら,Biochemistry 31(24):5434−41(1992))。各々の変異体の濃度を、分光光度的に決定し、そして定量的アミノ酸分析により決定した;これらの2つの方法は、5〜12%以内で一致した。
表面プラズモン共鳴(SPR)を、固定化されたHER2−ECDレセプターへの過剰発現されたFabの結合反応動態学を測定するために使用した。BIAcore−2000またはBIAcore−3000実時間反応動態学相互作用分析システム(Biacore Inc.,Piscataway,NJ)を、hu4D5−8 Fab変異体の会合定数(kon)および解離定数(koff)(Karlssonら,J Immunol Methods 145(1−2):229−40(1991))を決定するために使用した。B1バイオセンサーチップ(Biacore,Inc.)を、製造者の指示に従って活性化させ、そして10mMの酢酸ナトリウム(pH 4.8)中で86〜500RU(応答ユニット)のHER2−ECDで固定化した。未反応の群を、1Mのエタノールアミンでブロックした。hu4D5−8 変異体の固定化されたHER2−ECDへの結合の反応動態学は、泳動緩衝液(PBS、0.05% Tween、0.01% アジ化ナトリウム)中の100nM Fabで始まる一連の2倍希釈により、20μl/分の流速で測定した。結合測定を、19℃、25℃、31℃および37℃で、4つの異なる濃度の固定化HER2−ECDで記録した。データは、会合定数(kon)と解離定数(koff)との比を計算するBIAcore評価ソフトウエアバージョン3を使用して、1:1ラングミュア結合モデルに適合させた。平衡定数(KD)を、koff/konから計算した。野生型hu4D5−8と比較した自由エネルギー差異を、記載されるように計算した(Wells,J.A.,Biochemistry 29(37),8509−17(1990)):ΔΔG=−RT ln(KD (変異体)/KD (野生型))。
変異型FabがHER2−ECDに生理学的温度(37℃)で結合するための反応動態学データが、図4に示される。このFab変異体は、一般に非常に近い会合比定数および解離比定数(konおよびkoff)を有した。結果として、変異体の大部分はhu4D5−8 Fabと類似のKDを有した。1つの変異体Y100a(VH)Fは、KD上で4倍の負の効果を有した。二つの変異体は、改善されたKDを有し、37℃で、多重変異体M.7、(N30(VL)S+H91(VL)F+Y92(VL)W+T94(VL)S+D98(VH)W+Y100a(VH)F+Y102(VH)V)は、1.5倍、そして単一変異体D98(VH)Wは、約3倍であった(図4)。
ヒト化4D5のさらなる高親和性改変体を検索するために、先の実施例において記載される4D5改変体の5つのライブラリー(Gerstnerら,J.Mol.Biol.321,851−862(2002)もまた参照のこと)を、結合標的として、固定化HER2での結合選択のために使用した。
前述の表2において、位置は、Kabatの番号付けの系(Kabatら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))に従って示す。縮重コドンを、IUPACコード(R=A/G、Y=C/T、D=A/G/T、K=G/T、S=G/C、W=G/T、N=A/G/C/T)を用いて示す。
選択された代表的クローンを、競合的ファージ−ELISAアッセイ(Lowman,1998)においてさらに特徴付けするために選択した。いくつかの改変体は、野生型4D5 Fabと比較すると、HER2−ECDに対して改善された結合を有するように見えた(表6)。野生型4D5の比較的高い親和性に起因して、このアッセイは、4D5の親和性成熟バージョンの信頼できる尺度を提供しない(Gerstnerら,2002);しかし、本発明者らはこのアッセイを用いて、さらなる分析のためにクローンを順位付けした。
Fab改変体の平衡結合親和性(Kd)を決定するために、可溶性FabフラグメントをE.coliにおいて生成し、固定化HER2−ECDを37℃で用いて、BIAcore結合アッセイ(Gerstnerら,2002)において試験した。Fab濃度を、定量的アミノ酸分析によって決定した。動力学的測定の結果を、表8にまとめる。
(表面プラズモン共鳴アッセイ(BIAcore)を使用する、選択した4d5 Fab改変体の結合速度論および結合親和性)
(速度論分析によって同定された親和性が改善した4d5改変体の点変異。WTと異なる残基が、太字で示される。WTと同一の残基が、(−)で示される)
(選択された変異の組み合わせによって生成された4D5改変体)
変異は、個別に作用し得るか、または同じ4d5ファージ選択体において見出される他の変異と組み合わせて作用し得るので、本発明者らは、最高の親和性改変体(以前に記載されたD98W(VH)を含む)からの変異の組み合わせを試験することに興味を抱いた。一組の改変体を、「DWW」(すなわち、VL変異D49D/F53W/Y55W)単独、ならびに「DWW」および「PL」または「PK」(すなわち、VH変異F100P/Y102KまたはF100P/Y102L)とVH変異D98Wとの組み合わせの寄与を試験するために設計した(表10)。
(4d5の組み合わせ改変体)
(選択された4d5−ファージ改変体からの変異を組み合わせる4d5改変体の速度論分析(BIAcore)からの結合親和性)
以下のハイブリドーマ細胞株は、American Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110−2209、USA(ATCC)に寄託された。
4D5 ATCC CRL 10463 1990年5月24日。
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