JP2008546419A - 稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性遺伝子cyp81a6 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子工学の技術分野に属するものである。より詳しくは、本発明は、稲の中のベンタゾン(Bentazon)及びスルホニルウレア系(sulfonylurea)除草剤に耐性のある遺伝子の正確なマッピング、単離、及びクローニングに関する。さらに本発明は、前記の除草剤耐性遺伝子の助けを借りて他の重要な農学上の性質に関する遺伝子に対して部位特異的突然変異を行って、稲などの作物の重要な農学上の性質に対する改良、ハイブリッド種子を作る場合の自家交配混雑の回避及び部位(座位)特異的な遺伝子の操作などへの応用にも関する。
稲の雑種強勢を利用して、中国はハイブリット・イネの研究に成功して、稲の生産高を大幅に高めさせている。中国のは核細胞質相互作用雄性不稔(Nuclear Male Sterile)の三系法(Three-line-method)に基づく雑種強勢の利用の成功に続いて、大規模な二系法(Two-line-method)ハイブリット・イネの研究、開発及び普及を進めている。二系法の稲のハイブリッド種子は、光・温度感応性雄性不稔系統の育種(Breeding of PTGMS-Line)により生産されるものであるが、光・温度感応性雄性不稔系統の稔性は、環境温度の影響を受け易く、夏の異常低温が光・温度感応性雄性不稔系統の稔性を回復させることがある。これにより、二系法でハイブリッド種子の生産が低温に遭うと、収穫する種子が真のハイブリッド種子に偽のハイブリッド種子(即ち不稔系統の自家交配で実る種)が混じるという潜在的なリスクが存在している。一旦、このような母本の自家交配の混雑がおこると、これを有効に除去できなければ、種子生産または大面積での生産に重大な損失が引き起こされる。広西では1989年、湖南では1999年に、すべてこのような原因により大きな損失に見舞われた。
− 単離された稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える内在性遺伝子(以下「遺伝子CYP81A6」と称する)、その機能保存変体、機能の同等な生物活性の断片または誘導体を提供すること。
− 上述の単離された稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える内在性遺伝子のcDNA配列、その機能保存変体、機能の同等の生物活性の断片または誘導体を提供すること。
− ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子を提供すること。
− 遺伝子CYP81A6、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子または両方を含む機能同等物を含む組換えベクターを提供すること。
− 遺伝子CYP81A6、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子または両方を含む機能同等物によりコードされたポリペプチドを提供すること。
− 遺伝子CYP81A6、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子または両方を含む機能同等物または遺伝子CYP81A6または両方を含む機能同等物によりコードされたポリペプチドの遺伝子工学的な細胞を提供すること。
− ハイブリッド稲のハイブリッド種子生産の時にある自家交配混雑の防止方法を提供すること。
− 新たな部位特異的な遺伝子操作方法を提供すること。
− 植物の性質の改良する新たな方法を提供すること。
(1) 配列番号1に示す配列を有する、ヌクレオチド配列;
(2) 配列番号1の配列の第1949位から第4216位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体;
(3) 配列番号2に示す配列を有する、ヌクレオチド配列;
(4) 配列番号2の塩基の第54位から第1595位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体;
(5) 配列番号1または配列番号2に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
(1) 配列番号1に示す配列を有する、ヌクレオチド配列;
(2) 配列番号1の配列の第1949位から第4216位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体;
(3) 配列番号2に示す配列を有する、ヌクレオチド配列;
(4) 配列番号2の塩基の第54位から第1595位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体;
(5) 配列番号1または配列番号2に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
第一の修飾ターゲットとして、修飾後の選別マーカーとして機能し得るヌクレオチド配列を使用し、付加修飾ターゲットとして、生細胞のターゲット内在性遺伝子のキー塩基対を使用し、
異なる修飾ターゲット配列に向けて設計された二または複数のRNA・DNAキメラオリゴヌクレオチド分子(RCOs)を、パーティクルガン介在共導入技術によって、ターゲット受容細胞に共導入して、前記二または複数のターゲット部位に対して同時に部位特異的な修飾または変異を行い、
更に選別マーカーとするヌクレオチド配列の修飾表型(選別可能の表型)を利用してターゲット内在性遺伝子の修復または変異の後の遺伝子の型に対して関係の選択を行うこと
を特徴とする方法を提供する。
配列番号2: CYP81A6遺伝子の全長cDNA配列。
配列番号3: CYP81A6遺伝子によりコードされたアミノ酸配列。
1. 稲品種8077Sの中のベンタゾン感応性致死遺伝子belの精細なマッピング
1.1 マッピング集団
本実験に使用されるマッピング集団は、F2劣性単株からなる。構成する場合、先ず、遺伝子bel部位を含む低く育成されている64S戻し交配転育系統(「低育成64m」と略す)(野生型の低育成64Sは湖南国家ハイブリッド稲研究及び開発センターより提供)と野生型の93−11回復系統(江蘇里下河地区農科所より提供)とのハイブリッドによりF1を得て、次にF1の自家交配によりF2を計1000株得た。種子を播いてから、苗が3〜4枚の葉まで成長した場合、張集文及び武暁智氏(1999)のベンタゾンの薬塗りの鑑定方法により、濃度1250mg/Lのベンタゾン(江蘇剣ブランド農薬化工有限公司製の25%ベンタゾン水剤)でこのF2群のすべての単株に対して葉を一々に切って(葉先から1cmぐらい切る)、株ごとに3枚の葉に薬を塗った。その後、葉を処理する時のベンタゾン感応性反応により、劣性感応性致死ホモ接合体を231株本実験のマッピング集団に確定した。
McCouch氏ら(1988)のCTAB法を応用して、二つの親本93−11、低く育成64m及び231の感応性致死個体からそれぞれ葉総DNAを抽出した。DNAの抽出用試薬は全部上海生工生物工学技術サービス有限公司(以下「上海生工」と略す)から購入した。
SSR増幅反応の体系は下記の通りである。50ng鋳型DNA、1×PCR反応緩衝液、1.87mM Mg2+、0.2mM dNTP、酵素1.0u rTaq [宝生物工学(大連)有限公司、即ちTakara Biotech、以下「Takara」と略す]及びフォワードおよびリバース プライマー 各0.2μM。反応の総体積:20μl。反応の条件: 95℃ 3分間、次に35の循環(94℃、1分間、60℃、1分間、72℃)を行い、72℃に5分間、最後に、10℃に保存した。3.5%のゲロース糖脂質(上海生工)でPCR産物を単離し、EB(上海生工)で染色を実施し、UVP作像方式(ドイツ)で観察して写真を取った。
2.1 候補遺伝子の確定及び順序測定、分析
配列の分析によると、分子マーカー3aと7aとの間に推測の遺伝子(putative genes)が18あり、その中、連続して排列しているシトクロム遺伝子P450を4つ(GenBank登録番号がそれぞれAAK63940.1,AAK63920.1,AAK63922.1及びAAK63925.1である)含み、国際標準分類及び命名システムに正式にCYP81A5、CYP81A6、CYP81A7及びCYP81A8と命名された(http://drnelson.utmen. edu/cytochromep450.html)。これまでの研究により、稲の微粒体の中の遺伝子P450がベンタゾンの解毒作用(Haackら、1994)に関与した。それに、Deng及びHatzios(2003)らは稲の苗から分子量約60kDaまで純化されたP450タンパクを単離し、除草剤ベンスルフロンメチル(bensulfuron-methyl)の分解代謝の過程に非常に重要な役割があることを確認した。故に、ベンタゾンの感応性致死基因が遺伝子P450に関連する可能があると考えて、その四つの遺伝子P450のクラスターを候補遺伝子と確定した。
早くも1984年の時に、日本の学者のMoriはガンマ線照射誘導技術で農林8号を誘導してベンタゾンに感応性である致死変異体の農林8号m(Mori,1984)を得た。古典的な遺伝学の分析によると、この性質は一対の劣性遺伝子に制御されている。8077Sと農林8号mの中のベンタゾン感応性致死遺伝子と等位であるかどうかを検証するように、私たちは8077Sと農林8号mとのハイブリッドにより、F1ハイブリッド及び一つの800株のF2グループを得た。種をまいてから、苗が生9〜10枚の葉まで出てから、1250mg/L濃度のベンタゾンを8077S、農林8号m及びそれらのF1植株に散布した。一週間の後に、すべての植株が枯れて死亡した(図2)。これにより、二つの変異体の中のベンタゾン感応性致死遺伝子の間の相互の等位が証明された。同時に、800つのF2植株のグループに薬を散布した。その結果、処理されたすべての植株も枯れて死んだ。これはより一歩に二つの変異体の中のべンタゾン感応性致死遺伝子が一対の等位遺伝子であったことを証明した。区別するために、8077S及び農林8号mからのcyp81A6をそれぞれcyp81A6−1及びcyp81A6−2と命名した。
配列測定にある可能の誤差を防止するように、私たちはさらにPCR−RFLP分析法を利用して二つの変異体の中のcyp81A6−1及びcyp81A6−2の一塩基の変異部位に対する検査及び検証を行った。実験に、先ず分析ソフトウェアWEBCUTTER 2.0を利用してcyp81A6−1変異部位を含む一つの断片の野生型及び変異型配列に対する対比分析を行い、その変異の前後に変えられたまたは新たに生じた制限酵素の部位(Restriction Enzyme cutting site)を観察した結果、そんな部位を見つけなかった。故に、私たちはプライマー設計を通じてcyp81A6−1変異部位の上位置の付近の二つの異なる塩基G及びAを二つのCに変え、当プライマーを利用して拡充した当変位点を含んだ一断片のDNA配列を人工により新たなBgl I(GCCNNNNNGGC)酵素部位を導入させた。検査の結果により、野生型の稲の品種の中で、その拡充の産物に欠失していない塩基Gが余っているので、Bgl Iに酵素部位点と識別されられなく、当酵素で切ってから長さの251bpしか形成しなかった。けれども、その変異体中に、そのPCR産物が酵素Bgl Iに切られてから24bp及び227bpの二本の帯(図3)が形成できた。さらに当該PCR−RFLPプライマー利用してそれぞれ二つの親本93−11、低育成64m及びそのF2マッピング集団のDNA混合サンプル((46株/部))を5部拡充して、得た拡充産物がPCR産物専用試薬ケース(Takara)で純化されてから、酵素Bgl I(Takara)で切り、すべてのF2混合サンプルのバンドtypeが親本の低育成64mのそれと一致(図4)していたので、CYP81A6−1変異部位に対して人工で導入したBglI−PCR−RFLPマーカーが遺伝子CYP81A6と共に単離されたものと証明した。私たちは当マーカーをDP1(図1)と命名した。
候補遺伝子CYP81A6の全遺伝子配列はTakara社製の酵素LA Taq(商標)及びその試薬ケースを利用して一次性拡充を通じて得たものであり、使用した長い断片のPCRプライマー(フォワードプライマー: 5’−CAAACTTCCAACTTTCCCGTCACCTTCA CT−3’。リバースプライマー:5’−CCGCGGGTCACCGAGCAGAAAGCCC TTCCTCCCAAGTTAGAA−3’、上海生工で合成した)がインディカ米稲の遺伝子グループのデータベース(http://btn.genomics.org.cn/rice)に公布したDNA配列により、それぞれ当遺伝子の5’端の酵素BamHIの部位の前の124bpのところ及びその後の4145bpのところで設計して、それに、生粘性末端の発生、クローン及び連結に便利にするように、3’端のプライマーに酵素BstEIIの部位を加えた。この対のプライマーから拡充した4311bpの断片は長さがそれぞれ124bpのBamHI上流配列、1321bpのプロモーター配列、2321bpの遺伝子引導区にエクソン及びイントロンの加えられた配列、272bpの3’−UTR及びその後の遺伝子288bpグループ配列(その中、制限酵素(restriction endonuclease)7bpBstEIIの識別部位及び保護塩基5bpを含む)を含む。拡充の後に得た断片は先ず用バクテリオファージT4−DNA連結酵素でTAプラスミドベクター(Takara)につないで重複のある配列測定(Perkin Elmer AMI 377、上海基康)分析を行った。後に、エクソンの全部誤りのなく拡充されたクローンを選択して、酵素BamHI及びBstEII(Takara)でそれをTAプラスミドのベクターから切ってから、同じ双酵素で切られた遺伝形質転換ベクターpCAMBIA1301につないだ。次に、正しく断片を挿されたプラスミドを選択して、電子形質転換法でそれをアグロバクテリウムEHA105菌株に導入した。当菌株形質転換遺伝子グループ8077Sで生物学機能の相互補完検証を行い、得た耐性傷ふさがりが50mg/Lのハイグロマイシン(ABI、USA)で3度に選別してから、4.2μΜ/Lのベンスルフロンメチル(Bensulfonyluron- methyl,Sigma)選別(図6)を行い、それにより得た双耐傷ふさがりを含50mg/lのハイグロマイシンの再生培養基に置いて緑苗分化を行い、得た植株がPCR検証を経て、ベンタゾン(1250mg/l)を塗って鑑定した。結果により、すべての形質転換体がべンタゾンに対する耐性(図7にその中の一株の結果を示す)を回復した。私たちのクローンした遺伝子CYP81A6がベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の耐性遺伝子であったとこれらの結果は証明した。
遺伝子CYP81A6の構造上の特徴は翻訳開始コドンの前にある53bpの長さ(配列番号1に示す配列の第1896〜1948bp)の5’−UTR、2268bpの長さ(配列番号1示す配列の第1949〜4216bp)のコード領域及び終止コドンの後にある272bpの長さの(配列番号1示す配列の第4217〜4488bp)3’−UTRを含む。当遺伝子のコード領域は二つのエクソンからなり、真ん中に一つのイントロンを隔てている(図8)。二つのエクソンは長さがそれぞれ924bp(配列番号1に示す配列の1949〜2872bp)及び618bp(配列番号1に示す配列の3599〜4216bp)であり、イントロンは長さが726bp(配列番号1に示す配列の第2873〜3598bp)である。
栽培稲に広く当遺伝子Wx部位に分布している野生型の等位遺伝子Wxa及びWxbが二つある。その中、Wxaはインディカ米の稲の特徴であり、RNA及びタンパク質レベルでの発現活発性がWxbより10倍強い。その高量発現は高いアミラーゼ(amylase)を起こし、蒸したり、煮たりするご飯が硬くて、緊密ではなく、口当たりがおいしくない。Wxbは主にジャポニカ米の稲にあり、その低量発現がジャポニカ米の稲タイプのミラーゼの含有量を起こし、その米が蒸したり、煮たりされてから柔らかでり、おいしい。研究によれば、Wxa及びWxbの二つの等位遺伝子の発現の活発性にある差異は主に後者のリーダー区イントロンの5’スプライシング部位にG→Tの変異がある(程世軍ら、2001)。当変異はWxb前体mRNAの中のリーダー区イントロンの連結効率の低下を起こし、成熟のmRNA及び遺伝子コーディングのアミラーゼの合成酵素(granule-bound starch synthase,GBSS)の量の減少を起こし、最終にアミラーゼの合成量減少に発現する。
ジーン・ターゲッティング(gene targeting)修飾技術は理論において具体的なターゲット遺伝子部位に向けて精確に行う。既知のCYP81A5、CYP81A7及びCYP81A8などの遺伝子のコーディングは一類シトクロムP450のモノオキシゲナーゼ(monooxygenase)タンパクであるが、稲P450は厖大な遺伝子ファミリーであり、インディカ米稲だけでは454のメンバーがある。当遺伝子ファミリーはタンパクのレベルに存在する高度に保存しているヘム結合ドメインモティフ(F−X−X−G−X−R−X−C−X−G)であり、特にその中のシスティン(cystine)のコア残基は遺伝子P450の生物学機能の決定に対してきわめて重要であるので、理想的な変異ターゲットとしてもいい。
抗生物質耐性マーカー遺伝子、生物発光もしくは化学発光遺伝子、炭素源代謝キー酵素遺伝子、細菌、動物またはその他の植物からの耐除草剤遺伝子及びGUS遺伝子などのような外来選択マーカー遺伝子は共導入、整合及び発現の方法を通じてRCOs対ターゲット遺伝子の変異に選別作用を提供する。ここにハイグロマイシンリン酸転移酵素遺伝子を例にして説明する。機能未知のP450遺伝子に向けてRCOs分子(図14 RCO6)を一つ設計して、同時にハイグロマイシンリン酸転移酵素遺伝子を(hph)プラスミドベクターに構成して形質転換プラスミドpHPH(図15)を得た。次に公知のパーティクルバードメント(Tu et al、1998)を利用してプラスミドpHPH及びRCOs分子を共に受体の細胞に導入し、ハイグロマイシンリン酸転移酵素遺伝子の整合及び発現の発生したハイグロマイシン耐性を利用してP450遺伝子のRCO修飾変異体を選別した。次に、特異プライマーを利用して当変異体のターゲットDNA配列に対するPCR増幅及び配列測定検証を行い、得た稲P450修飾変異体を野生型のものと比べて、発現していた表型または生物化学型差異によりその関連した生物学機能を推測した。
クローンした稲の耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子のコーディング配列により、そのアンチセンスRNAまたはRNAi配列(配列番号1の第1939位から第2439位までのヌクレオチド配列を参照)を設計して、それをアクチン1のような稲の組成型発現のプロモーターとつなぎで、遺伝形質転換用のアグロバクテリウム二元ベクターpAANTI1(図16)を構成して、アグロバクテリウムに仲介された(Agrobacterium-mediated transformation)標準の形質転換ステップによりそれをMinghui63/Btのような野生型の品系に導入した。続いて、特異プライマーを利用して遺伝子組み換えのT0代の植株に対するPCR分析を行った。その結果により、すべての遺伝子組み換えの植株は対照プラスミドの拡充産物に一致していた断片を発現していて、外来のアンチセンスRNA断片にMinghui63受体の遺伝子グループ(図17)を導入していたと証明した。さらに、ベンタゾンを1250mg/L利用してそれらの遺伝子組み換えの植株の葉(株ごとに3枚の葉)に塗った。36時間の後に、それらの処理された葉は枯れて死んだ(図18)。稲の内在性Bel遺伝子の発現に対するアンチセンスRNA断片の抑制が有効的であったとその結果は証明した。
上述の有効的であったと証明されたアンチセンスRNA断片を稲の下生え及びOsg6BまたはRA39のような花粉特異発現プロモーターにつないでから、遺伝形質転換用のアグロバクテリウム二元ベクターpOANTI1(図19)を構成した。次に、アグロバクテリウムに仲介された標準の双遺伝子の共形質転換ステップによりそれをそれぞれ現在に稲の生産に大面積に利用していた光温度感応性不稔系統の低育成64Sに導入して、それを特異性により温度感応性不稔系統の内在性耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子の下生え細胞及び花粉粒の中での発現を抑制させて、大面積の稲田での中間試験及び純系育成を通じて新たな化学的に補充した除雄−温度感応性不稔系統に転換できる。そんな二系不稔系統がハイブリッド種子生産の過程に真夏の異常な低温に遭って育成可能の花粉が出てくる場合、スルホニルウレア系除草剤でそれを死なせて、防雑保純の目的に達させる。
耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤のCYP81A6遺伝子の全遺伝子の配列またはそのコーディング配列を35S、Ubi−1、アクチン1等及びnosターミネーター(terminator)などのような組成型の発現プロモーターにつないでから、アグロバクテリウム二元ベクターに構成して、現在常用のハイグロマイシン、カナマイシン耐性遺伝子またはGUS報告遺伝子などを替えた。当耐性遺伝子をベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に感応性である稲8077S細胞に導入して、得た形質転換陽性傷ふさがりがBSMの含んだ培養基で続いて成長できたが(図6左)、対照グループが当培養基で成長を停止し(図6右)、除草剤での耐性または陽性傷ふさがりの目的に達した。
耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤のCYP81A6遺伝子の全遺伝子配列またはそのコーディング配列を35S、Ubi−1、アクチン1等及びnosターミネーターなどのような組成型の発現プロモーターにつないでから、アグロバクテリウム二元ベクターに構成して、直接に形質転換及び選別に用いられ、得た分子分析及び表型鑑定検証の行われた遺伝子組み換え植株は大面積の中間試験及び純系育成を経て耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子組み換え系に転換できた。CYP81A6遺伝子の全遺伝子配列を感応性稲の8077Sに導入して、耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子組み換えの新たな株系(図7左)を得られた。
シトクロムP450のメンバーに保存の配列が4つあり、触媒作用に重要な作用を発揮したヘム結合ドメイン(heme-binding domain)、膜の結合に重要なN−末端疎水領域、タンパク質の正確な組立の担当するグリシン/プロラインリッチ(glycine/proline-rich)領域及びヘムの結合領域の上位にある150のアミノ酸のIへリックス(I helix)(Werch-Reichhart氏ら、2000)を含む。故に、それらの保存領域でプライマー(フォワードプライマー:5’−GCAGGAACAGAGACAACC−3’。リバースプライマー:5’−CACCTCCGCCTCCCCATC−3’)を設計して、稲以外のイネ科または豆科植物の遺伝子に対する拡充を行い、高度に相同する配列して、5’RACE及び3’RACE法により単離して相同配列の両端の配列の全部を得て、高度に相同した遺伝子を分離した。
Claims (26)
- 下記の(1)〜(5)からなる群より選択される何れかのヌクレオチド配列を含んでなる、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の耐性遺伝子:
(1) 配列番号1に示す配列を有する、ヌクレオチド配列;
(2) 配列番号1の配列の第1949位から第4216位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体;
(3) 配列番号2に示す配列を有する、ヌクレオチド配列;
(4) 配列番号2の塩基の第54位から第1595位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体;
(5) 配列番号1または配列番号2に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。 - 配列番号1または配列番号2に示すヌクレオチド配列を有する、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の耐性遺伝子。
- 下記の(1)〜(5)からなる群より選択される何れかのヌクレオチド配列を含んでなる、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性遺伝子によりコードされてなる、ポリペプチド:
(1) 配列番号1に示す配列を有する、ヌクレオチド配列;
(2) 配列番号1の配列の第1949位から第4216位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体;
(3) 配列番号2に示す配列を有する、ヌクレオチド配列;
(4) 配列番号2の塩基の第54位から第1595位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体;
(5) 配列番号1または配列番号2に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。 - 配列番号3に示すアミノ酸配列を有する、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性遺伝子によりによりコードされてなる、ポリペプチド。
- 請求項1または2に記載のヌクレオチド配列と、前記ヌクレオチド分子を転写または発現させるために必要な調節エレメントとを含んでなる、組換えベクター。
- 転写調節エレメントと作動的に連結している請求項1に記載のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項5に記載の組換えベクター。
- 転写もしくは発現に必要な調節エレメントが、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、MAR配列及び5’側の上流の調節配列を含む、請求項5に記載の組換えベクター。
- ベクターが発現ベクターである、請求項5に記載の組換えベクター。
- 請求項1または3に記載のポリペプチドを含んでなる、植物細胞。
- 前記細胞がカヤツリグサ科荒地植物の細胞または豆科植物以外のほぼ全ての広葉植物を含む、請求項9に記載の植物細胞。
- 除草剤耐性の選別マーカーとしての、請求項1に記載のヌクレオチド配列または請求項5〜8のいずれか一項に記載の組換えベクターの使用。
- 下記からなる群より選択されるいずれかのヌクレオチド配列を含んでなる、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤感応性遺伝子,
(1) 配列番号1に示すヌクレオチド配列から第2455位塩基Cまたは第4006位塩基Gを欠失することによって得られる、ヌクレオチド配列;
(2) 配列番号2に示すヌクレオチド配列から第560位塩基Cまたは第1385位塩基Gを欠失することによって得られる、ヌクレオチド配列;
(3) 前記(1)または(2)に記載のヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。 - 人工のアンチセンスRNAまたはRNAi断片を含んでなる組換え核酸分子であって、
前記アンチセンスRNAまたはRNAi断片が請求項1、2または12のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。 - 化学的に補充された除雄で温度感応性雄性不稔系統の育成における、請求項13に記載の組換え核酸分子の使用。
- 請求項12に記載のヌクレオチド配列と、前記ヌクレオチド配列の転写もしくは発現に必要な調節エレメントとを含んでなる、組換えベクター。
- 転写または発現のために必要な調節エレメントが、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、MAR配列または5’側の上流の調節配列を含む、請求項15に記載の組換えベクター。
- 請求項12に記載のヌクレオチド配列または請求項15もしくは16に記載の組換えベクターを含んでなる、植物細胞。
- ネガティブ選別マーカーとしての、請求項12に記載のヌクレオチド配列または請求項15もしくは16に記載の組換えベクターの使用。
- 生細胞内において遺伝子グループの二つまたは複数の部位におけるターゲット配列に対して、同時に部位特異的な共修飾を行う遺伝操作方法であって、
第一の修飾ターゲットとして、修飾後の選別マーカーとして機能し得るヌクレオチド配列を使用し、付加修飾ターゲットとして、生細胞のターゲット内在性遺伝子のキー塩基対を使用し、
異なる修飾ターゲット配列に向けて設計された二または複数のRNA・DNAキメラオリゴヌクレオチド分子(RCOs)を、パーティクルガン介在共導入技術によって、ターゲット受容細胞に共導入して、前記二または複数のターゲット部位に対して同時に部位特異的な修飾または変異を行い、
更に選別マーカーとするヌクレオチド配列の修飾表型(選別可能の表型)を利用してターゲット内在性遺伝子の修復または変異の後の遺伝子の型に対して関係の選択を行うことを特徴とする、方法。 - 選別マーカーとして使用されるヌクレオチド配列が、変異したまたは変異していない耐除草剤遺伝子、耐抗生物質マーカー遺伝子、生物発光もしくは化学発光遺伝子、炭素源代謝キー酵素遺伝子、細菌もしくはGUS遺伝子など由来のコード配列または調節配列を含む、請求項19に記載の遺伝操作方法。
- 選別マーカーとして使用されるヌクレオチド配列が、請求項1、2または12のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列である、請求項19に記載の遺伝操作方法。
- スクリーニング可能な表型が、RCOs分子と共導入する外来遺伝子の発現によっても提供され得る、請求項19に記載の遺伝操作方法。
- 付加修飾ターゲットが、機能未知の遺伝子である、請求項19に記載の遺伝操作方法。
- 付加修飾ターゲットが、機能既知の遺伝子である請求項19に記載の遺伝操作方法。
- 請求項1〜8、12、15〜16及び21〜24のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、ポリペプチド、組換えベクター、細胞、及び方法を利用する工程を含んでなる、遺伝子の生物学機能の調査方法。
- 請求項1〜8、12、15〜16及び21〜24のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、ポリペプチド、組換えベクター、細胞及び方法を利用するの工程を含んでなる、生物の形質を改良する方法。
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