JP2008545651A - トール様受容体に関連する自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、関連病態と関連した非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び／又は樹状細胞におけるトール様受容体３（ＴＬＲ３）及びトール様受容体４（ＴＬＲ４）の過剰発現並びに／又はＴＬＲ３／ＴＬＲ４シグナル伝達に関連する自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の治療に関する。本発明はまた、関連病態と関連した非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び／又は樹状細胞におけるトール様受容体３（ＴＬＲ３）及びトール様受容体４（ＴＬＲ４）並びに／又はＴＬＲ３／ＴＬＲ４シグナル伝達に関連する自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療のためのフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体、及び互変異性環状チオンの使用に関する。本発明はまた、関連病態と関連した非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び／又は樹状細胞における異常なトール様受容体３及びトール様受容体４並びに／又はＴＬＲ３／ＴＬＲ４シグナル伝達に関連する疾患又は状態を有する被験体の治療に関する。本発明はまた、ＴＬＲの過剰発現及びシグナル伝達に関連する自己免疫性炎症性病変並びにケモカイン及びサイトカイン媒介性疾患の治療に関する。本発明はまた、トール様受容体の過剰発現又はシグナル伝達に関連するＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ／ＩＳＲＥ／ＩＲＦ−１経路を阻害することができる薬学的処方物に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、関連病態と関連した非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び／又は樹状細胞におけるトール様受容体３（ＴＬＲ３）及びトール様受容体４（ＴＬＲ４）の過剰発現並びに／又はＴＬＲ３／ＴＬＲ４シグナル伝達に関連する自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の治療に関する。本発明はまた、関連病態と関連した非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び／又は樹状細胞におけるトール様受容体３（ＴＬＲ３）及びトール様受容体４（ＴＬＲ４）並びに／又はＴＬＲ３／ＴＬＲ４シグナル伝達に関連する自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療のためのフェニルメチマゾール、メチマゾール（ＭＭＩ）誘導体、及び互変異性環状チオンの使用に関する。本発明はまた、関連病態と関連した非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び／又は樹状細胞における異常なトール様受容体３（ＴＬＲ３）及びトール様受容体４（ＴＬＲ４）並びに／又はＴＬＲ３／ＴＬＲ４シグナル伝達に関連する疾患又は病態を有する被験体の治療に関する。本発明はまた、関連病態と関連した非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び／又は樹状細胞におけるＩ型インターフェロンの活性化を含む異常なトール様受容体の発現又はシグナル伝達に関連する疾患又は病態を有する被験体の治療に関する。

本出願は、２００５年５月１７日に出願された米国特許出願第１１／１３０，９２２号（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）の優先権を主張する。

Ａ．先天性免疫及び適応性免疫
現在、自己免疫疾患は、（ｉ）自己抗原に対する液性応答又は自己抗体の応答、例えばＴＳＨ受容体に対する抗体を伴うグレーブス病の原発性甲状腺機能亢進症、又は（ｉｉ）免疫細胞が、自己抗原を誘導する非免疫細胞を破壊する細胞応答、例えば甲状腺細胞（橋本甲状腺炎）又は膵臓β島細胞（１型糖尿病）（I. Roitt, Essential Immunology, 7th ed., 312-346 (1991)）によって臨床的に定義されている。多くの自己免疫疾患は実際はこの両方の現象の組合せであり（I. Roitt, Essential Immunology, 7th ed., 312-346 (1991)）、したがって、橋本甲状腺炎及び１型糖尿病も、抗甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）又は抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）／島細胞という自己抗体を有している。さらに、自己免疫疾患は接着分子、例えば血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）及び血管系への変性白血球接着、例えば結腸炎、全身性ループス、全身性硬化症、及び糖尿病の血管合併症の増大を含む重要な炎症成分を有していることが多い（I. Roitt, Essential Immunology, 7th ed., 312-346 (1991)、S. A. Jimenez, et al., Ann Intern Med, 140:37-50 (2004)）。

近年の研究は、先天性免疫のトール様受容体（ＴＬＲ）のシグナル伝達経路と体液性で細胞性の自己免疫を特徴とする、より緩やかにより慎重に適応された免疫系との間の厄介な繋がりを実証している（K. S. Michelsen, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:10679-84 (2004)、G. Pasterkamp, et al., Eur J Clin Invest, 34:328-34 (2004)、K. Takeda, et al., Annu Rev Immunol, 21 :335-76 (2003)、K. Takeda, et al., Cell Microbiol, 5:143-53 (2003)、R. J. Ulevitch, J Infect Dis, 187 Suppl 2:S351-5 (2003)、L. Steinman, Science, 305:212-6 (2004)、L. D. Kohn, et al., Research Ohio, In press, (2005)、N. Harii, et al., Mol Endocrinol, 19:1231-50 (2005)、D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111:225-33 (2004)、L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004)、H. Oshiumi, et al., Nat Immunol, 4:161-7 (2003)、M. Yamamoto, et al., J Immunol, 169:6668-72 (2002)、M. Miettinen, et al., Genes Immun, 2:349-55 (2001)、L. Alexopoulou, et al., Nature, 413:732-8 (2001)、G. Andonegui, et al., J Clin Invest, 111:1011-1020 (2003)、C. Fiocchi, Gastroenterology, 115:182-205 (1998)、E. Cario, et al., Infect Immun, 68:7010-7 (2000)）。先天性免疫は、細菌性因子又はウイルス性因子を含む（これらに限定されない）環境障害と闘うように迅速に機能する防御免疫細胞応答である。適応免疫はより緩やかな応答であり、これはナイーブＴ白血球のＴヘルパー１（Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞型への分化及び活性化を伴う（I. Roitt, Essential Immunology, 7th ed., 312-346, (1991)）。Ｔｈ１細胞が主に細胞性免疫を促進する一方で、Ｔｈ２細胞は主に体液性免疫を促進する。最初は、宿主の防御システムであるが、ＴＬＲ経路から放出される先天性免疫シグナルの病理発現はここでは、自己免疫炎症疾患を発症することに関係がある。

自己免疫炎症内分泌疾患又は自己免疫炎症非内分泌疾患の治療は、疾患の症状を治療することが主な目的である。大部分において、潜在的な遺伝的感受性は、定義が不十分であり、多様であり、疾患特異性がないことが多く、主として容易には治療が受けられない。自己免疫炎症疾患を治療するのに使用される免疫抑制剤は、主として免疫細胞応答又は免疫抑制剤が産出するサイトカインを標的とする。免疫抑制剤は、寛解（グレーブス病におけるメチマゾール）、毒性（１型糖尿病のためのシクロスポリン)、又は単純緩和（結腸炎又は全身性エリテマトーデスのための抗炎症性副腎皮質ステロイド）を誘発する際に部分的にのみ効果的である。自己免疫炎症疾患におけるＴＬＲの関与は、診断及び治療を再調整する必要がある可能性を増大させる（K. S. Michelsen, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:10679-84 (2004)、G. Pasterkamp, et al., Eur J Clin Invest, 34:328-34 (2004)、L. D. Kohn, et al., Research Ohio, In press, (2005)、N. Harii, et al., Mol Endocrinol, 19:1231-50 (2005)、D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111 :225-33 (2004)、L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004)、H. Oshiumi, et al., Nat Immunol, 4:161-7 (2003)、M. Yamamoto, et al., J Immunol, 169:6668-72 (2002)、M. Miettinen, et al., Genes Immun, 2:349-55 (2001)、L. Alexopoulou, et al., Nature, 413:732-8 (2001)、G. Andonegui, et al., J Clin Invest, 111:1011-1020 (2003)、C. Fiocchi, Gastroenterology, 115:182-205 (1998)、E. Cario, et al., Infect Immun, 68:7010-7 (2000)）。

したがって、多くの自己免疫炎症疾患が環境要因（例えば喫煙又はウイルス感染）によって誘導又は悪化したという本発明者らの知見にもかかわらず、この誘導シグナルプロセスを作用させる細部はほとんど知られておらず、またこの誘導シグナルプロセスを阻止する治療も存在していなかった（I. Roitt, Essential Immunology, 7th ed., 312-346, (1991)、J. George, et al., Scand J Immunol, 45:1-6 (1997)、C. Nagata, et al., Int J Dermatol, 34:333-7 (1995)）。

したがって、適応（体液性又は細胞媒介性）免疫が応じる先天性免疫のＴＬＲ及びＴＬＲシグナル機構の近年の記載により、新規の薬物群並びに新規の診断パラダイムを開発する機会が得られた（L. D. Kohn, et al., Research Ohio, In press, (2005)、N. Harii, et al., Mol Endocrinol, 19:1231-50 (2005)、D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111:225-33 (2004)、L. D. Kohn, et al., 米国特許出願第１０／８０１，９８６号(2004)、L. D. Kohn, et al.,米国特許出願第１０／９１２，９４８号(2004))。

自己免疫／炎症疾患の生来の免疫誘導事象を攻撃誘発することによって、誘導後又は疾患発症の潜伏期の間、危険性があり、且つ治療を開始させたヒトにおける、誘導シグナル事象又は環境障害の早期同定が、治療をより効果的にし、細胞破壊を防ぐか又は遅らせ、長期間にわたる炎症性合併症を回避し、生活の質を高め、関連の医療費を抑えることが可能になる。アテローム性動脈硬化プロセス及び心血管疾患、すなわち２型糖尿病及び１型糖尿病の血管合併症が、ＴＬＲと病理学的な先天性免疫応答とを伴う類似の機構を示すという証拠が増えてきているので、これらは現在、後期現象と考えられているにもかかわらず、同じ治療パラダイムから恩恵を受けることもできる（K. S. Michelsen, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:10679-84 (2004)、G. Pasterkamp, et al., Eur J Clin Invest, 34:328-34 (2004)、H. M. Dansky, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 21:1662-7 (2001)、P. E. Szmitko, et al., Circulation, 108:2041-8 (2003)、P. E. Szmitko, et al., Circulation, 108:1917-23 (2003)、M. I. Cybulsky, et al., Can J Cardiol, 20 Suppl B:24B-8B (2004)、P. M. Ridker, et al., Circulation, 109:IV6-19,(2004)）。このような方法は重要であると考えられるが、存在しない。

Ｂ．トール様受容体及びシグナル伝達
２０世紀の終わりに、トール様受容体（ＴＬＲ）が、免疫応答に関与する遺伝子の発現を誘導するのに必須であることが示された。それらの記載から、ＴＬＲ及び先天性の免疫系が、抗原特異的な後天性（acquired）免疫の発現において必須の工程であるという本発明者らの理解が急速に進んだ。近年、幾つかのグループによってこのことが再検討されており（K. Takeda, et al., Int Immunol, 17:1-14 (2005)、B. Beutler, Nature, 430:257-63 (2004)、K. S. Michelsen, et al., J Immunol, 173:5901-7 (2004)）、以下の物質は１つのものに大きく由来するが（K. Takeda, et al., Int Immunol, 17:1-14 (2005)）、全てに共通であり（B. Beutler, Nature, 430:257-63 (2004)、K. S. Michelsen, et al., J Immunol, 173:5901-7 (2004)）、急速に発展した領域における現在の考え方のみを表している。

ＴＬＲファミリー： 哺乳類ＴＬＲは、ヒトとマウスの間で保存されるＴＬＲ１〜９等の少なくとも１０個の機能的成員から成る巨大なファミリーを含む。ＴＬＲの細胞質部分は、ＩＬ−１受容体ファミリーの細胞質部分と類似性が高く、トール／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）ドメインと呼ばれる。この類似性にもかかわらず、ＴＬＲの細胞外部分は、構造的に関連しない。ＩＬ−１受容体は免疫グロブリン様ドメインを保有するのに対し、ＴＬＲは細胞外ドメイン中にロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）を保有する。ＴＬＲは、病原体（細菌、真菌、原生動物、及びウイルスが含まれる）に由来するか、その細胞侵入に由来するか、又は細胞傷害を引き起こす有害な環境刺激の影響に起因する特定のシグネチャー（signature）分子の認識において重要な役割を果たす。

トール様受容体１、２、及び６（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、及びＴＬＲ６）： ＴＬＲ２は、種々の病原体（例えば、グラム陽性細菌、マイコバクテリア、クルーズトリパノソーマ、真菌、及びトレポネーマ）由来の種々のリポタンパク質／リポペプチドを認識する(K. Takeda, et al., Annu Rev Immunol, 21:335-76 (2003))。さらに、ＴＬＲ２は、レプトスピラ・インターロガンス、ジンジバリス菌、及びピロリ菌等の非腸内細菌由来のＬＰＳ調製物を認識することが報告されている。これらのＬＰＳは、脂質Ａ成分中のアシル鎖数においてＴＬＲ４によって認識されるグラム陰性細菌の典型的なＬＰＳと構造的に異なり、これはおそらくは特異的標識を与え、したがって、ジンジバリス菌由来のＬＰＳはＴＬＲ４を不十分にしか活性化しない(M. Hashimoto, et al., Int Immunol, 16:1431-7 (2004))。

ＴＬＲ２が広範な微生物成分を認識する理由について説明することができる２つの説明が提案されている。第１の説明は、ＴＬＲ２がＴＬＲ１及びＴＬＲ６（共にＴＬＲ２と構造的に関連している）等の他のＴＬＲと異好性二量体を形成することである。第２の説明は、デクチン−１（真菌細胞壁成分であるβ−グルカンのレクチンファミリー受容体）等の異なる受容体型との相互作用を含む(B. N. Gantner, et al., J Exp Med, 197:1107-17 (2003))。したがって、ＴＬＲ２は、ＴＬＲと構造的に関連するか又は関連しない幾つかのタンパク質との機能的協力によって広範な細菌生成物を認識する。

トール様受容体３（ＴＬＲ３）： 非応答細胞におけるヒトＴＬＲ３の発現により、ｄｓＲＮＡに応答してＮＦ−κＢの活性化が増強される。さらに、ＴＬＲ３欠損マウスは、ほとんどのウイルスによってその複製中に産生され、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）の合成を誘導するｄｓＲＮＡに対するそれらの応答を損なう(L. Alexopoulou, et al., Nature, 413:732-8 (2001))。Ｉ型ＩＦＮは、細胞における抗ウイルス活性及び免疫刺激活性を誘導する。したがって、ＴＬＲ３は、ｄｓＲＮＡの認識並びにウイルス及びウイルスに対する抗ウイルス遺伝子応答に関与する。

トール様受容体４（ＴＬＲ４）： ＴＬＲ４は、ＬＰＳ認識に不可欠な受容体である(A. Poltorak, et al., Science, 282:2085-8 (1998)、K. Hoshino, et al., J Immunol, 162:3749-52 (1999))。さらに、ＴＬＲ４は、内因性リガンド（熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０及びＨＳＰ７０）、フィブロネクチンのドメインＡ、並びにヒアルロン酸のオリゴサッカリド、ヘパリン硫酸、及びフィブリノゲン等）の認識に関与する。しかし、これらの内因性リガンドは、ＴＬＲ４を活性化するために非常に高濃度にする必要があり、ＬＰＳによる汚染が疑われる。

トール様受容体５（ＴＬＲ５）： ＣＨＯ細胞におけるヒトＴＬＲ５の発現は、フラジェリン（細菌鞭毛の単量体構成要素）に対する応答を付与する(F. Hayashi, et al., Nature, 410:1099-103 (2001))。ＴＬＲ５は、上皮下区画の腸上皮細胞及び腸内皮細胞の基底外側に発現する。さらに、フラジェリンは肺上皮細胞を活性化して炎症性サイトカイン産生を誘導し、ＴＬＲ５中の終始コドン多型は有鞭毛細菌であるレジオネラ・ニューモフィラが引き起こす肺炎に対する感受性に関連している。これらの所見は、哺乳類細胞の粘膜表面での微生物認識におけるＴＬＲ５の重要な役割を示す。

トール様受容体７及び８（ＴＬＲ７及びＴＬＲ８）： ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、構造的に非常に保存されたタンパク質であり、ヒト免疫不全ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、及びインフルエンザウイルス等のウイルス由来のグアノシン又はウリジンが豊富な一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を認識する(F. Heil, et al., Science, 303:1526-9 (2004)、S. S. Diebold, et al., Science, 303:1529-31 (2004) 、J. M. Lund, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101 :5598-603 (2004))。ｓｓＲＮＡは宿主に豊富であるが、通常、宿主由来ｓｓＲＮＡは、ＴＬＲ７又はＴＬＲ８によって検出されない。これは、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８がエンドソーム中に発現し、宿主由来ｓｓＲＮＡがエンドソームに送達されないという事実に起因し得る（以下を参照のこと）。

トール様受容体９（ＴＬＲ９）： ＴＬＲ９は、ＣｐＧＤＮＡの受容体である(H. Hemmi, et al., Nature, 408:740-5 (2000))。細菌及びウイルスのＤＮＡは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含み、このモチーフは、その免疫刺激活性を付与する。脊椎動物では、ＣｐＧモチーフの頻度は非常に減少し、ＣｐＧモチーフのシトシン残基が非常にメチル化され、それにより、免疫刺激活性が破棄される。構造的に、以下の少なくとも２つのＣｐＧ ＤＮＡ型が存在する。Ｂ／Ｋ型ＣｐＧＤＮＡは、ＩＬ−１２及びＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインの強い誘導因子であり、Ａ／Ｄ型ＣｐＧＤＮＡは、形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）からのＩＦＮ−α産生を誘導する能力がより高い。細菌及びウイルスのＣｐＧＤＮＡの認識に加えて、ＴＬＲ９は自己免疫障害の発症に関与する。したがって、ＴＬＲ９は、グレーブスの自己免疫性甲状腺機能亢進症において重要であり、自己反応性Ｂ細胞によるリウマトイド因子の産生を媒介し得る(G. A. Viglianti, et al., Immunity, 19:837-47 (2003))。同様に、Ｆｃ受容体による内在化は、ＩｇＧ及びクロマチンを含む免疫複合体によるＩＦＮ−αのＴＬＲ９媒介性ＰＤＣ誘導を引き起こする可能性があり、これは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の発症に関与する(M. W. Boule, et al., J Exp Med, 199:1631-40 (2004))。したがって、ＴＬＲ９は、クロマチン構造の認識によって幾つかの自己免疫疾患の発症に関与するようである。関節リウマチ及びＳＬＥの治療のために臨床的に使用されるクロロキンは、現在、小胞中での酸性化の中和によるエンドソームのｐＨ依存性成熟の阻害によってＴＬＲ９依存性シグナル伝達を遮断すると推測されている(H. Hacker, et al., Embo J, 17:6230-40 (1998))。

トール様受容体１１（ＴＬＲ１１）： ごく最近同定されたＴＬＲ１１は、膀胱上皮細胞中で発現し、マウスにおける尿路病原性細菌による感染に対する耐性を媒介することが示されている(D. Zhang, et al., Science, 303:1522-6 (2004))。

幾つかのＴＬＲの細胞内局在化： 各ＴＬＲは、細胞内に異なって分布する。ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、及びＴＬＲ４は、細胞表面上に発現する。対照的に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９は、エンドソーム等の細胞内区画中に発現することが示されている。それらのリガンドのＴＬＲ３、ＴＬＲ７、又はＴＬＲ９媒介性認識は、エンドソームの成熟及びプロセシングが必要であることが示されている。したがって、例えば、ＴＬＲ９は、ＣｐＧＤＮＡの非特異的取り込みの際に小胞体から補充される(H. Hacker, et al., Embo J, 17:6230-40 (1998)、E. Latz, et al., Nat Immunol, 5:190-8 (2004)、C. A. Leifer, et al., J Immunol, 173:1179-83 (2004))。抗原提示細胞、マクロファージ、単球、又は樹状細胞になるいずれかの非免疫細胞が食作用によって細菌を貪食する場合、これらは細菌を分解し、ファゴソーム−リソソーム又はエンドソーム−リソソーム中にＣｐＧＤＮＡを放出し、ＴＬＲ９と相互作用することができる。

同様に、別の例として、受容体媒介性エンドサイトーシスによってウイルスが細胞に侵入する場合、ウイルスの内容物は、ウイルスの膜とエンドソームの膜との融合によって細胞質に曝露される。これにより、ファゴソーム／リソソーム区画又はエンドソーム／リソソーム区画中でＴＬＲリガンド（ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、及びＣｐＧＤＮＡ等）がＴＬＲ９に曝露される。

微生物のＴＬＲ非依存性認識（ウイルスによる新規の（De novo）ｄｓＲＮＡトランスフェクション又はＲＮＡ／ＤＮＡ導入）は、それでもなおＴＬＲシグナル伝達経路を活性化することができる。ＴＬＲ３がウイルス由来ｄｓＲＮＡの認識に関連するにもかかわらず、ＴＬＲ３欠損マウスで認められた障害は部分的でしかない(L. Alexopoulou, et al., Nature, 413 :732-8 (2001)、M. Yamamoto, et al., Science, 301:640-3 (2003))。したがって、樹状細胞の細胞質へのｄｓＲＮＡの導入により、ＴＬＲ３と無関係にＩ型ＩＦＮが誘導される(S. S. Diebold, et al., Nature, 424:324-8 (2003))。ＰＫＲがｄｓＲＮＡ認識に関与するにもかかわらず、ＰＫＲがｄｓＲＮＡ誘導性Ｉ型ＩＦＮ発現で重要な役割を果たす場合、以前として議論の余地がある(E. J. Smith, et al., J Biol Chem, 276:8951- 7 (2001))。

最近、ＴＬＲ３非依存性ｄｓＲＮＡ認識を媒介する１つの重要な分子は、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）であることが示された。ＲＩＧ−１は、ＩＲＦ−３依存性プロモーターのｄｓＲＮＡ依存性活性化を増大させるカスパーゼ動員ドメインを含むＤＥｘＤ／ＨボックスＲＮＡヘリカーゼをコードする。

タンパク質のヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン（ＮＯＤ）ファミリーはまた、細胞内細菌のＴＬＲ非依存性認識において重要な役割を果たす。

ＮＯＤ１は、カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）、ＮＯＤドメイン、及びＣ末端ＬＲＲドメインを含む。ＮＯＤ１の発現により、細胞がＴＬＲ２によって認識されるペプチドグリカン（ＰＧＮ）に応答することができる(O. Takeuchi, et al., Immunity, 11 :443-51, (1999))。ｃ−Ｄ−グルタミル−メソジアミノピメリン酸（ｉＥ−ＤＡＰ）は、必要とされる最小のＰＧＮ構造である。ＮＯＤ２はＮＯＤ１と構造類似性を示すが、２つのＣＡＲＤドメインを保有し、ＮＯＤ２によって認識される不可欠な構造はＰＧＮ由来のムラミルジペプチドＭｕｒＮＡｃ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ（ＭＤＰ）である。ＭＤＰは、ほとんど全ての細菌で見出されるのに対し、ｉＥ−ＤＡＰはグラム陰性細菌に限定される。

ＮＯＤ２遺伝子の変異は、クローン病に関連し(Y. Ogura, et al., Nature, 411 :603-6 (2001)、J. P. Hugot, et al., Nature, 411 :599-603 (2001))、この変異により、ＮＦ−κＢ活性化が増強され、クローン病患者におけるＮＦ−κＢ活性及びＴｈ１応答の増強に寄与し得ることが示されている(T. Watanabe, et al., Nat Immunol, 5:800-8 (2004))。ＮＯＤ２変異はまた、ＮＦ−κＢ活性を増加させ、ブロー症候群（肉芽腫性関節炎、ブドウ膜炎、及び皮膚発疹によって特徴付けられる疾患）に関連する(C. Miceli-Richard, et al., Nat Genet, 29:19-20 (2001))。

Ｒｉｐ２／ＲＩＣＫ（セリン／トレオニンキナーゼ）は、そのＣ末端部分にＣＡＲＤドメインを有し、且つＲｉｐ（ＴＮＦ受容体によるＮＦ−κＢ活性化に不可欠な因子）と配列が類似したＮ末端触媒ドメインを有する。ＮＯＤ及びＲｉｐ２／ＲＩＣＫは、それらの各ＣＡＲＤドメインを介して相互作用し、Ｒｉｐ２／ＲＩＣＫの中心領域へのＩＫＫ複合体の動員を誘導する。次いで、これにより、ＮＦ−κＢが活性化される。

ＴＬＲシグナル伝達経路−ＭｙＤ８８経路及びＮＦ−κＢ／ＭＡＰキナーゼ
シグナル： ＴＩＲドメインの下流にあるシグナル伝達経路において、ＴＩＲドメイン含有アダプターＭｙＤ８８が、全てのＴＬＲを介するＴＮＦ−α及びＩＬ−１２等の炎症性サイトカインの誘導に必須であることが最初に示された（F. Hayashi, et al., Nature, 410:1099-103 (2001)、H. Hemmi, et al., Nat Immunol, 3:196-200 (2002)、O. Takeuchi, et al., Int Immunol, 12:113- 7, (2000)、T. Kawai, et al., Immunity 11:115-22, (1999)、M. Schnare, et al., Curr Biol, 10:1139-42 (2000)、H. Hacker, et al., J Exp Med, 192:595-600 (2000)）。しかし、特異的なＴＬＲの活性化により、わずかに異なるパターンの遺伝子発現プロファイルが得られた。例えば、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４シグナル伝達経路の活性化により、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）が誘導されるが、ＴＬＲ２媒介性経路及びＴＬＲ５媒介性経路の活性化では誘導されなかった（V. Toshchakov, et al., J Endotoxin Res, 9:169-75 (2003)、K. Hoshino, et al., Int Immunol, 14:1225-31 (2002)、S. Doyle, et al, Immunity, 17:251-63 (2002)）。ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９シグナル伝達経路により、ＴＬＲ３／４媒介性の誘導とは異なる機構を介して、Ｉ型ＩＦＮも誘導された（H. Hemmi, et al., J Immunol, 170:3059-64 (2003)、T. Ito, et al., J Exp Med, 195:1507-12 (2002)）。したがって、個々のＴＬＲシグナル伝達経路は一致していないが、ＭｙＤ８８は全てのＴＬＲに共通である。したがって、ＭｙＤ８８依存性経路及びＭｙＤ８８非依存性経路が存在することが明らかになっている。

ＭｙＤ８８依存性経路は、ＩＬ−１受容体によるシグナル伝達と類似している。一般的に認識されているように、Ｃ末端ＴＩＲドメインと、Ｎ末端致死ドメインとを有するＭｙＤ８８は、ＴＬＲのＴＩＲドメインに関連している。刺激時に、ＭｙＤ８８は両方の分子の致死ドメインの相互作用を介在した、ＴＬＲに対するＩＲＡＫ−４を用い、ＩＲＡＫ−１のＩＲＡＫ−４媒介性のリン酸化を促進する。それから、活性化したＩＲＡＫ−１はＴＲＡＦ６に関連し、これにより２つの異なるシグナル伝達経路が活性化される。１つの経路により、ＭＡＰキナーゼの活性化を介して、ＡＰ−１転写因子が活性化される。もう１つの経路はＴＡＫ１／ＴＡＢ複合体を活性化させ、これはＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体の活性を高める。活性化すると、ＩＫＫ複合体はリン酸化又はその後のＩκＢの分解を誘導し、これにより、転写因子ＮＦ−κＢが核転座される。ＭｙＤ８８依存性経路は、全てのＴＬＲによる炎症性サイトカイン産生に重要な役割を果たすと共に、必須のものである。したがって、ＭｙＤ８８欠損マウスは、全てのＴＬＲリガンドに応じて、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ４０等の炎症性サイトカインの産生を示さない（F. Hayashi, et al., Nature, 410:1099-103, (2001)、H. Hemmi, et al., Nat Immunol, 3:196-200 (2002)、O. Takeuchi, et al., Int Immunol, 12:113-7 (2000)、T. Kawai, et al., Immunity, 11:115-22 (1999)、M. Schnare, et al., Curr Biol, 10:1139-42 (2000)、H. Hacker, et al., J Exp Med, 192:595-600 (2000)）。

ＭｙＤ８８関連のＴＩＲドメイン含有分子： ＴＩＲＡＰ（ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質）／Ｍａｌ（ＭｙＤ８８アダプター様）（T. Horng, et al., Nat Immunol, 2:835-41 (2001)、K. A. Fitzgerald, et al., Nature, 413:78-83 (2001)）は、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４によるＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路に必須であることが示されている。したがって、ＴＩＲＡＰ／Ｍａｌ欠損マクロファージは、ＴＬＲ４及びＴＬＲ２リガンドに応じて、損なわれた炎症性サイトカイン産生を示すが（T. Horng, et al., Nature, 420:329-33 (2002)、M. Yamamoto, et al., Nature, 420:324-9 (2002)）、これらのＴＬＲ３、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９リガンドに対する応答では損なわれない。

ＭｙＤ８８非依存性／ＴＲＩＦ依存性経路及びＩＲＦ−３／１型ＩＦＮシグナル伝達： 炎症性サイトカインのＴＬＲ４リガンド誘導性の産生はＭｙＤ８８欠損マクロファージでは観察されないが、ＮＦ−κＢの活性化は、動態の遅延と共に観察される（T. Kawai, et al., J Immunol, 167:5887-94 (2001)）。したがって、ＭｙＤ８８非依存性成分が存在する。

ＴＬＲ３媒介性シグナル伝達経路及びＴＬＲ４媒介性シグナル伝達経路において、ＩＲＦ−３の活性化及びＩＦＮ−βの誘導が、ＭｙＤ８８非依存性様式で観察される。ＴＩＲドメイン含有アダプターＴＲＩＦは、ＭｙＤ８８非依存性経路に必須であるが、ＴＬＲ３ではなくＴＬＲ４の場合、ＴＩＲドメイン含有アダプターＴＲＡＭは、ＴＲＡＭ欠損マウスで明らかなように、又はＲＮＡｉ媒介性ノックダウンによる、ＩＲＦ−３のＴＲＩＦ非依存性の活性化及びＩＦＮ−β誘導性遺伝子経路及びＩＦＮ誘導性遺伝子経路の誘導にも関与する（K. A. Fitzgerald, et al, J Exp Med, 198:1043-55 (2003)、M. Yamamoto, et al., Nat Immunol, 4:1144-50 (2003)、H. Oshiumi, et al., J Biol Chem, 278:49751-62 (2003)）。

非標準のＩＫＫ、ＩＫＫｉ／ＩＫＫｅ及びＴＢＫ１は、ＴＲＩＦの下流にあるＩＲＦ−３の活性化、並びにＭｙＤ８８非依存性様式における後期のＮＦ−κＢの活性化を介在する（T. Kawai, et al., J Immunol, 167:5887-94 (2001)）。ＩＲＦ−３の活性化により、ＩＦＮ−βが産生される。次に、ＩＦＮ−βはＳｔａｔ１を活性化し、幾つかのＩＦＮ誘導性遺伝子を誘導する（V. Toshchakov, et al., J Endotoxin Res, 9:169-75 (2003)、K. Hoshino, et al., Int Immunol, 14:1225-31 (2002)、S. Doyle, et al., Immunit, 17:251-63, (2002)）。ＴＲＩＦの生理学的役割は、ＴＲＩＦ欠損マウス又はＴＲＩＦ突然変異マウスの発生によって明らかにされ、このマウスはＩＲＦ−３の活性を示さず、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４リガンドに応じた、ＩＦＮ−β誘導性遺伝子及びＩＦＮ誘導性遺伝子の発現を損ねている（S. S. Diebold, et al., Nature, 424:324-8 (2003)）。

ＴＲＩＦ欠損マウス及びＴＲＡＭ欠損マウスにおいて、ＴＬＲ２、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ９リガンドによって誘導される炎症性サイトカインの産生、並びにＩＲＡＫ−１のＴＬＲ４リガンド誘導性のリン酸化が観察された（S. S. Diebold, et al., Nature, 424:324-8 (2003)、M. Yamamoto, et al., Nat Immunol, 4:1144-50 (2003)）。これらの所見は、ＭｙＤ８８依存性経路がこれらのマウスで損なわれていないことを示している。しかし、ＴＬＲ４リガンド誘導性の炎症性サイトカイン産生はまた、ＴＲＩＦ欠損マウス及びＴＲＡＭ欠損マウスでは観察されなかった。したがって、ＭｙＤ８８依存性成分及びＭｙＤ８８非依存性／ＴＲＩＦ依存性成分の両方の活性化が、ＴＬＲ３／４誘導性の炎症性サイトカイン産生に必要であると考えられる。

ＩＲＦ−３活性化を介在するのに重要な分子は、非標準のＩＫＫ、ＴＢＫ１、及びＩＫＫｉ／ＩＫＫｅであることが示されている。したがって、ＩＫＫｂではなく、ＴＢＫ１又はＩＫＫｉ／ＩＫＫｅの導入により、ＩＲＦ−３のリン酸化及び核転座が行われた。また、ＴＢＫ１又はＩＫＫｉ／ＩＫＫｅ発現のＲＮＡｉ媒介性の阻害により、ウイルス及びｄｓＲＮＡに応じて、ＩＦＮ−βの誘導が損なわれた（S. Sharma, et al., Science, 300:1148-51, (2003)）。

ＴＬＲ３によるＩＲＦ−３及びＮＦ−κＢ経路の両方のＭｙＤ８８非依存性のＴＬＲシグナル伝達機構： ＴＲＩＦのＴＩＲドメインが、この分子の中間部分に位置しており、Ｎ末端部分及びＣ末端部分に隣接している（flanked）。ＴＲＩＦのＮ末端部分及びＣ末端部分が、ＮＦ−κＢ依存性プロモーターの活性化を介在する一方、Ｎ末端部分のみがＩＦＮ−βプロモーターの活性化に関与している（M. Yamamoto, et al., J Immunol, 169:6668-72 (2002)）。したがって、ＴＲＩＦのＮ末端部分は、ＩＫＫｉ／ＩＫＫｅ及びＴＢＫ１に関連していることが示され、これはＩＲＦ−３依存性ＩＦＮ−β誘導を介在する（K. A. Fitzgerald, et al., Nat Immunol, 4:491-6 (2003)、S. Sato, et al., J Immunol, 171:4304-10 (2003)）。ＴＲＩＦのＮ末端部分は、ＴＲＡＦ６にも関連していることが示されており（S. Sato, et al., J Immunol, 171:4304-10 (2003)、Z. Jiang, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:3533-8 (2004))、ＴＲＡＦ６は、ＴＬＲ媒介性ＮＦ−κＢの活性化に密接に関与して（J. Gohda, et al., J Immunol, 173:2913-7 (2004)）、ＴＲＩＦのＣ末端部分がＲＩＰ１に関連していることが示されており（E. Meylan, et al., Nat Immunol, 5:503-7 (2004)）、したがって、ＲＩＰ１は、ＴＲＩＦのＣ末端部分に由来するＮＦ−κＢの活性化に関与することが示された。

ＴＬＲシグナル伝達の負の制御： 微生物成分によるＴＬＲの刺激により、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２等）の誘導が誘発される。全てのこれらのサイトカインが過剰に産生される場合、これらは宿主の死亡率が高い重篤な全身性障害を誘導する。したがって、生物がそれらのＴＬＲ媒介性応答の調整機構を進化させてきたことは驚くべきことではない。ＴＬＲシグナル伝達経路は、幾つかの分子によって負に制御される。ＩＲＡＫ−Ｍは、受容体からのＩＲＡＫ−１／ＩＲＡＫ−４複合体の解離を阻害する。ＭｙＤ８８は、ＩＲＡＫ−４のＭｙＤ８８との会合を遮断する。ＳＯＣＳ１は、ＩＲＡＫ−１と会合してその活性を阻害する可能性が高い。ＴＲＩＡＤ３Ａは、ＴＬＲ４及びＴＬＲ９のユビキチン化媒介性分解を誘導する。ＴＩＲドメイン含有受容体であるＳＩＧＩＲＲ及びＴ１／ＳＴ２はまた、ＴＬＲシグナル伝達を負に調整することが示されている。したがって、幾つかの分子は、ＴＬＲシグナル伝達経路を負に調整すると仮定され、これらが組み合わされて、ＴＬＲシグナル伝達経路を有害な障害を引き起こす過剰な生得的応答を制限するように正常に精巧に調整することができる。

ＬＰＳ等の微生物成分への曝露により、その後のＬＰＳによる攻撃誘発（内毒素又はＬＰＳ耐性と呼ばれる）に対する応答が非常に減少する。幾つかの負の制御機構はまた、ＬＰＳ耐性に関与することも示されている(H. Fan, et al., J Endotoxin Res, 10:71-84 (2004))。

Ｃ．ＴＬＲ３又はＴＬＲ４シグナル伝達を過剰発現することによって誘導したＩＲＦ−１シグナル伝達が自己免疫炎症性疾患に重要である
ＩＲＦ−１の調節作用が、自己免疫炎症性疾患の幾つかのｉｎ ｖｉｔｒｏモデル及びｉｎ ｖｉｖｏモデルで報告されている：関節炎（A. Shiraishi, et al., J Immunol, 159:3549-54 (1997)、T. Inoue, et al., J Rheumatol, 28:1229-37 (2001)、S. John, et al., J Rheumatol, 28:1752-5 (2001)）、結腸炎（M. Clavell, et al., J Pediatr Gastroenterol Nutr, 30:43-7 (2000)）、（M. Kennedy, et al., Int J Mol Med, 4:437-43 (1999)）、神経炎症（M. Delgado, et al., J Immunol, 162:4685-96 (1999)、U. Schlomann, et al., J Neurosci, 20:7964-71 (2000)）、脳虚血（C. Iadecola, et al., J Exp Med, 189:719-27 (1999)、W. Paschen, et al., Neuroreport, 9:3147-51 (1998)）、 V. L. Raghavendra Rao, et al., J Neurochem, 83:1072-86 (2002)）、肺損傷（V. R. Sunil, et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 282:L872-80 (2002)）、筋炎（S. Matsubara, et al., J Neuroimmunol, 119:223-30 (2001)）、心筋炎（K. Azzam-Smoak, et al., Virology, 298:20-9 (2002)、S. Kawamoto, et al., J Virol, 77:9622-31 (2003)、R. Kamijo, et al., Science, 263:1612-5 (1994)、J. R. Allport, et al., J Exp Med, 186:517-527 (1997)）、内毒素性ショック（G. Andonegui, et al., J Clin Invest, 111:1011-1020 (2003)、V. L. Raghavendra Rao, et al., J Neurochem, 83:1072-86 (2002)、S. Heinz, et al., J Biol Chem, 278:21502-9 (2003)、C. W. Wieland, et al., Infect Immun, 70:1352-8 (2002)、Y. Pang, et al., Brain Res, 914:15-22 (2001)、O. Kobayashi, et el., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 281:688-96, (2001)）、糖尿病（A. Akabane, et al., Biochem Biophys Res Commun, 215:524-30 (1995)、M. S. Baker, et al., Surgery, 134:134-41 (2003)、C. A. Gysemans, et al., Diabetologia, 44:567-74 (2001)、A. E. Karlsen, et al., J Clin Endocrinol Metab, 85:830-6 (2000)、T. Nakazawa, et al., J Autoimmun 17:119-25, (2001)）、肝炎（B. Jaruga, et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 287:G1044-52 (2004)、P. M. Pitha, et al., Biochimie, 80:651-8 (1998)）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、（K. M. Pollard, et al., Ann N Y Acad Sci, 987:236-9 (2003)）、及び自己免疫成分を有する多発性炎症モデル（N. L. Mccartney- Francis, et al., J Immunol, 169:5941-7 (2002)）。ＩＲＦ−１は、ヒトモデル及び齧歯類モデルにおいてウイルス感染に関連する自己免疫心筋炎を有する患者に関係している（K. Bachmaier, et al., Circulation, 96:585-91 (1997)）。

ＩＲＦ−１は、マクロファージ、樹状細胞及びＣＤ−４ Ｔ細胞において、炎症性の遺伝子発現を増大することによって、生来の適応レベルで炎症性の免疫応答を上方制御し得る。したがって、ＩＲＦ−１遺伝子発現の上方制御により、アラキドン酸シグナル伝達等の炎症性メディエーター、すなわちＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２酵素（X. Teng, et al., Am J Physiol Cell Physiol, 282:C144-52, (2002)）、ケモカイン（M. S. Baker, et al., Surgery, 134:134-41 (2003)、Y. Ohmori, et al., J Leukoc Biol, 69:598-604 (2001)）、ｉＮＯＳ（M. Delgado, et al., J Immunol, 162:4685-96 (1999)、M. S. Baker, et al., Surgery, 134:134-41 (2003)、X. Teng, et al., Am J Physiol Cell Physiol, 282:C144-52 (2002)、Y. Ohmori, et al., J Leukoc Biol, 69:598-604 (2001)）、ＩＬ−１２ ｐ４０（M. Clavell, et al., J Pediatr Gastroenterol Nutr, 30:43-7 (2000)、C. Feng, et al., Int Immunol, 11 :1185-94 (1999)）、１型ＩＦＮ−α及び１型ＩＦＮ−β（L. A. Eader, et al., Cell Immunol, 157:211-22 (1994)、S. Kirchhoff, et al., Eur J Biochem, 261:546-54 (1999)）、並びに炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ１−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２及びＩＮＦ−γの発現が増大し得る。したがってＩＲＦ−１遺伝子の過剰発現は、マクロファージ、樹状細胞、及びＣＤ４＋−Ｔｈ１細胞、リンパ球細胞に対するその効果によって自己免疫炎症性疾患を誘導し得る。

マクロファージ、樹状細胞、ＣＤ４＋−Ｔｈ１細胞、及びリンパ球性細胞においてＩＲＦ−１シグナル伝達の重要性に関する情報があるにもかかわらず、非免疫細胞においてＩＲＦ−１のＴＬＲ３又はＴＬＲ４媒介性増加後に同程度の影響はあまり明確ではなかった。しかし、本明細書中にまとめられた橋本甲状腺炎、大腸炎、毒素ショック、及びアテローム性動脈硬化症に関連したメチマゾール、メチマゾール誘導体、及び互変異性環状チオン、特に、フェニルメチマゾール（Ｃ１０）の効果の研究により、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４シグナル過剰発現に関連するか又はこれらに起因する非免疫細胞中でのその過剰発現の重要性が確証される。

Ｄ．過剰発現したＴＬＲ４シグナル伝達によって誘導されるＩＲＦ−１シグナル伝達はアテローム性動脈硬化症で重要である
白血球接着は、アテローム性動脈硬化症（自己免疫性炎症性疾患）の中核を成す。アテローム硬化性病変発症の最も初期の段階の１つは、内皮の先端面への白血球（単球及びリンパ球）の接着及びその後の内皮を介した動脈樹状構造（arterial tree）中の選択した解剖学的位置での内皮細胞下空間への移動である。このプロセスは、接着事象のカスケードによって起こる。この接着カスケードは、内皮表面上の接着分子（例えば、ＶＣＡＭ−１）への白血球表面上に存在する分子（例えば、β_１インテグリン）の結合によって部分的に媒介される。血管外空間への移動後、単球由来マクロファージは、脂質を取り込んで泡沫細胞を形成するようになる。動員した白血球の活性化は、病変発症プロセスを継続するという目的を果たす炎症の重要なメディエーター（例えば、炎症誘発性サイトカイン）の放出を誘導すると考えられる。平滑筋細胞は、泡沫細胞及びリンパ球と共に脂肪点（fatty spot）に動員されて脂肪線条（病変中間体（intermediate lesion））を形成する。この全プロセスは、線維脂肪病変まで継続され、最終的に線維性プラークを形成し得る。全てのプラーク発生にわたって、血管内皮は無傷のままである。アテローム発生機構が「一般的な」病的炎症に存在する機構と類似するので、アテローム発生は、しばしば、病的炎症疾患と見なされる。実際、最近、マウスモデルにおいて強力な炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αの阻害によってアテローム性動脈硬化症が軽減されることが示された(L. Branen, et al., Arterioscler Thromb Vase Biol, 24:2137-42 (2004))。

病理学的炎症の際の白血球動員に関与することが知られている内皮細胞接着分子（ＥＣＡＭ）（例えばＶＣＡＭ−１、Ｅ選択性及びＩＣＡＭ−１）は、炎症部位で上方制御され、また白血球接着におけるこれらの役割により疾患進行及び／又は組織損傷の一因となることが示されている（F. W. Luscinskas, et al., Annu. Rev. Med., 47:413-421 (1996)）。ＶＣＡＭ−１は、アテローム性動脈硬化症との関連で最も関心がもたれている。ＶＣＡＭ−１は、早期発泡性細胞病変（early foam cell lesions）を覆う大動脈内皮上で局在的に観察されており（M. I. Cybulsky, et al., Science, 251 :788-791 (1991)）、内皮に単球及びリンパ球接着し、また内皮を通って移動するのに重要な役割を果たすことが示されている（F. W. Luscinskas, et al., J. Cell Biol., 125:1417-27 (1994)、C. L. Ramos, et al., Circ. Res., 84:1237-44 (1999)）。ヒトのアテローム性動脈硬化症の十分に認められたモデルであるアポリポタンパク質Ｅ欠損（ＡｐｏＥ^−／−）マウスによる研究により、ＶＣＡＭ−１が、病変傾向の部位（早ければ５週までに）及び進行性病変で内皮上に存在することが明らかにされた（Y. Nakashima, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol, 18:842-51 (1998)）。単球は、野生型マウスから単離した頸動脈と比較して、ＡｐｏＥ^−／−マウスから単離した頸動脈に対する接着が大幅に増大したことを示し、この接着の増大は、ＶＣＡＭ−１により部分的に介在される（C. L. Ramos, et al., Circ. Res., 84:1237-44 (1999)）。

ＥＣＡＭの発現は、或る特定の転写因子（例えばＮＦ−κＢ）（M. J. May, et al., Immunol. Today, 19:80-88 (1998)）及びＩＲＦ−１（A. S. Neish, et al., Mol. Cell Biol, 15:2558-2569 (1995)）の活性を増大する炎症誘発性サイトカイン（例えばＴＮＦ−α）により部分的に調節される。活性化又は増大した転写因子がＥＣＡＭ遺伝子に対するプロモーター要素と結合している。病理学的炎症のための幾つかの現在の又は潜在的な治療は、白血球が動物モデルにおいて内皮に接着し、炎症を低減するのを阻害する転写因子の活性を調節することによって、少なくとも部分的に作用する（E. M. Conner, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 282:1615-1622 (1997)、J. W. Pierce, et al., J. Immunol, 156:3961-3969 (1996)、N. M. Dagia, et al., Am. J. Phys., 285:C813-C822 (2003)、C. Weber, et al., Circulation, 91 :1914-1917 (1995)）。

１つのこのような群としては、メチマゾール、メチマゾール誘導体、及び互変異性環状チオンが挙げられる（Kohn, L. D., et al.,米国特許第６，３６５，６１６号, April 2, (2002.)、Kohn, L. D., et al.,米国特許出願第１０／８０１，９８６号(2004)）。試験されたフェニルメチマゾール（Ｃ１０）が、炎症促進性（例えばＴＮＦ−α）誘導性ＥＣＡＭの発現、及び結果として起こる内皮細胞との白血球接着を低減した場合（N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004)）、Ｃ１０は、（ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏで存在する条件を模倣するｉｎ ｖｉｔｒｏ流条件下で、サイトカインが炎症したヒトの大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）との単球細胞接着を阻害し、（ｉｉ）タンパク質及びｍＲＮＡレベルでＶＣＡＭ−１のサイトカイン誘導性ＨＡＥＣ発現を強く阻害し、（ｉｉｉ）Ｅ選択性発現に対する適当な効果を有しており、（ｉｖ）ＩＣＡＭ−１発現に対する効果をほんの少ししか有していない。

ＶＣＡＭ−１プロモーターは、ＴＮＦ−α誘導性のヒトのＶＣＡＭ−１発現において役割を果たすことが知られている幾つかのシス要素を含む：ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１、ＳＰ−１、ＩＲＦ−１及びＧＡＴＡ。内皮細胞のＴＮＦ−α刺激がＮＦ−κＢを活性化させるが（M. J. May, et al., Immunol. Today, 19:80-88 (1998)）、Ｃ１０は、核へのＮＦ−κＢ転座又はＶＣＡＭ−１プロモーターとの結合に対していかなる効果も有していないと思われる（N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004)）。ＩＲＦ−１は、静止内皮細胞において非常に低いレベルで存在しているが、ＴＮＦ−αによる刺激時に、ＩＲＦ−１が誘導され、ＶＣＡＭ−１プロモーターと結合し、完全なサイトカイン誘導性の転写活性化に必要である（A. S. Neish, et al., Mol. Cell Biol, 15:2558-2569 (1995)、N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004)）。Ｃ１０は、タンパク質及びｍＲＮＡレベルでのＴＮＦ−α誘導性のＩＲＦ−１発現を阻害する。ＶＣＡＭ−１の阻害因子が幾つか知られているが、たとえあったとしても、ほんのわずかだけが、ＶＣＡＭ−１を選択的に抑制し、ＩＲＦ−１を介して作用し、流体せん断下でのサイトカインが炎症した内皮との単球細胞接着を阻害することを示している。

内皮細胞におけるＩＲＦ−１のＴＮＦ−α誘導機構はＳｔａｔ１を含む。ＩＲＦ−１プロモーター領域は、２つのＮＦ−κＢ結合部位と、活性化Ｓｔａｔ１−ＧＡＳ結合配列とを含む（Y. Ohmori, et al., J Biol Chem, 272:14899-907 (1997)、H. Ochi, et al, Eur J Immunol, 32:1821-31 (2002)）。ＴＮＦ−α活性化ＮＦ−κＢはＩＲＦ−１遺伝子転写の活性に直接関与しているが、ＮＦ−κＢは、完全な発現に不十分であり、ＧＡＳ部位のＳｔａｔ１占有が必要である。Ｓｔａｔ１は、間接的又は直接的な手段で増大し得る。このように、ＴＮＦ−αは、ＮＦ−κＢに対するその効果、１型ＩＦＮの増大、及びＳｔａｔ１に対する１型ＩＦＮのオートクリン／パラクリン（autocrine/paracrine）活性化によって、ＩＲＦ−１プロモーター活性を誘導することができる（O. Tliba, et al., J Biol Chem, 278:50615-23 (2003)）。代替的には、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドがヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＴＮＦ−α誘導性のＩＲＦ−１発現に影響しないので、ＴＮＦ−αはＳｔａｔ１を直接活性化することができ（H. Ochi, et al., Eur J Immunol, 32:1821-31 (2002)）、ＴＮＦ−αが、タンパク質合成、すなわちＩＦＮのデノボ合成なしで、ＩＲＦ−１の発現増大を誘導することができることを示唆している。

Ｅ．トール様受容体の過剰発現及び自己免疫性炎症性疾患におけるシグナル伝達
炎症性自己免疫障害にＴＬＲが関与するという幾つかの一連の証拠がここ数年で得られている。例えば、欠損ＩＬ−１０シグナル伝達に起因する免疫細胞の構成性活性化により、慢性小腸結腸炎が発症する(K. Takeda, et al., Immunity, 10:39-49 (1999))。これらの変異マウスへのＴＬＲ４欠損の導入により、腸炎が改善される(M. Kobayashi, et al., J Clin Invest, 111 : 1297-308 (2003))。アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスで認められたアテローム性動脈硬化症の発症は、ＭｙＤ８８欠損の導入によって助けられ、アテローム性動脈硬化症の発症においてＴＬＲ媒介性経路が関与する(K. S. Michelsen, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:10679-84 (2004))。ＳＬＥ及び関節リウマチにおける自己抗体の誘導におけるＴＬＲ９−ＭｙＤ８８依存性経路の関与は上術した。

非免疫細胞並びに単球、マクロファージ、及び樹状細胞におけるＴＬＲ３／ＴＬＲ４の過剰発現及びＴＬＲ３／ＴＬＲ４シグナルは、自己免疫性炎症性疾患に関連する。複数の自己免疫性炎症性疾患は、現在、非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞におけるＴＬＲ３及びＴＬＲ４の過剰発現及びそれらのシグナルに関連する。ＴＬＲ３／ＴＬＲ３シグナル伝達の場合、これらには、橋本甲状腺炎及び１型糖尿病が含まれ、ＴＬＲ４／ＴＬＲ４シグナル伝達の場合、これらには、潰瘍性大腸炎、クローン病、アテローム性動脈硬化症、及び毒素ショックが含まれる。ＴＬＲ３／４又はＴＬＲ３／４シグナル伝達の過剰発現は、これらの障害に限定されず、ＴＬＲシグナル伝達が活性化されてＩ型ＩＦＮ又はサイトカイン増加ＥＣＡＭ発現及び白血球接着が増加する任意の疾患（例えば、全身性狼瘡、関節リウマチ、又は任意の自己免疫性炎症性疾患）が含まれる。

橋本甲状腺炎： 樹状細胞上のＴＬＲ３がｄｓＲＮＡを認識し、その後にサイトカイン及び免疫細胞相互作用に重要な認識分子中でシグナルが増加することが十分に認識されている。ＴＬＲ３のｍＲＮＡ及びタンパク質は、現在、甲状腺細胞上で発現し、橋本甲状腺炎に関連すると認識されている(N. Harii, et al., Mol Endocrinol, 19:1231-50 (2005))。甲状腺細胞のポリ（Ｉ：Ｃ）とのインキュベーションにより、（ｉ）ＮＦ−κＢ／Ｅｌｋ１及びＩＲＦ−３／ＩＦＮ−βシグナル経路の両方の転写活性化、（ｉｉ）ＮＦ−κＢ及びＥＲＫ１／２の転写後活性化、及び（ｉｉｉ）ＩＦＮ−βｍＲＮＡの増加が起こるので、ＴＬＲ３は機能的である。ｄｓＲＮＡの細胞へのトランスフェクション、インフルエンザＡ型ウイルスでの感染、又はＩＦＮ−βとのインキュベーションによって、ＴＬＲ３を、ＰＫＲ、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）−Ｉ又はＩＩ、及びＩＲＦ−１と共に過剰発現することができるが、ｄｓＲＮＡ又はＩＦＮ−γとのインキュベーション或いはｄｓＤＮＡトランスフェクションでは過剰発現することができない。メチマゾール（ＭＭＩ）及び誘導体（例えば、フェニルメチマゾール（Ｃ１０））は、ＩＲＦ−３及びＩＳＲＥの転写活性化の増大、ＳＴＡＴリン酸化の阻害によって過剰発現を有意に防止するが、ＮＦ−６β活性化の阻害では防止されない。ｄｓＲＮＡトランスフェクション又はＩＦＮ−β処置によって、培養ヒト甲状腺細胞中でＴＬＲ３を機能的に過剰発現することができる。免疫組織化学的研究は、試験した１００％の橋本甲状腺炎患者において免疫細胞に囲まれたヒト甲状腺細胞中でＴＬＲ３タンパク質が過剰発現するが、正常な甲状腺細胞又はグレーブス病の甲状腺細胞では過剰発現しないことを示す。理論に拘束されることを決して望まないが、甲状腺細胞上に機能的ＴＬＲ３が存在し、病原体関連刺激によってＴＬＲ３下流シグナルを過剰発現することができ、ＴＬＲ３シグナル系のＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β／ＳＴＡＴアームのみの阻害によって過剰発現をＣ１０＞＞ＭＭＩに逆転することができ、ＴＬＲ３過剰発現が甲状腺細胞中で、橋本甲状腺炎及び免疫細胞浸潤物の発症において重要であり得る先天性免疫応答を誘導することができると結論づけることができる。

ヒトにおいて最も頻度の高い組織特異的な自己免疫疾患である橋本甲状腺炎は、Ｂリンパ球及びＴリンパ球による甲状腺の浸潤、細胞性及び体液性自己免疫、及び甲状腺の自己免疫破壊を特徴とする（C. M. Dayan, et al., N Engl J Med, 335:99-107 (1996)）。橋本甲状腺炎の患者の甲状腺細胞はＩＣＡＭ−１、Ｂ７−１、免疫細胞の相互作用に重要な必須の共刺激分子、Ｉ群の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導性タンパク質ＩＰ−１０、リンパ細胞における走化性活性を働かせるＣＸＣＬケモカイン、及び密接に結び付いた腫瘍壊死因子遺伝子群の成員であるＦａｓ遺伝子を発現する（G. Pesce, et al., J Endocrinol Invest, 25:289-95 (2002)、M. A. Garcia-Lopez, et al., J Clin Endocrinol Metab, 86:5008-16 (2001)）。

感染因子（Infectious agents）は、甲状腺炎（Y. Tomer, et al., Endocr Rev, 14:107-20 (1993)）を含む自己免疫疾患（J. Guardiola, et al., Crit Rev Immunol, 13:247-68 (1993)、R. Gianani, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 93:2257-9 (1996)、M. S. Horwitz, et al., Nat Med, 4:781-5 (1998)、H. Wekerle, Nat Med, 4:770-1 (1998)、C. Benoist, et al., Nature, 394:227-8 (1998)）の誘導に関係している。１９９０年代には、自己免疫のウイルス性誘発は、組織の局部感染、ＭＨＣ遺伝子の発現の異常な、すなわち増大した誘導、免疫細胞に対する自己抗原の提示、及びＴ細胞のバイスタンダー（bystander）活性化に由来し得ることを示唆している（M. S. Horwitz, et al., Nat Med, 4:781-5, (1998)、H. Wekerle, Nat Med, 4:770-1, (1998)、C. Benoist, et al., Nature, 394:227-8, (1998)）。

内毒素性ショック： 種々の研究でＴＬＲ４が内毒素性ショックに関与していた。例えば、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスは、Ｔｌｒ４遺伝子中に点変異を有し、それにより、ＴＬＲ４シグナル伝達が欠損し、ＬＰＳでの攻撃誘発に対する応答が低下する(K. Hoshino, et al., J Immunol, 162:3749-52 (1999))。最近の研究(G. Andonegui, et al., J Clin Invest, 111:1011-1020 (2003))において、内皮ＴＬＲ４は、白血球ＴＬＲ４と対照的に、内毒素性ショックにおいて重要な役割を果たすという強い証拠が見出された。したがって、内皮ＴＬＲ４欠損マウスは、ＬＰＳでの攻撃誘発後に肺における白血球分画が有意に軽減されたが、白血球ＴＬＲ４欠損マウスでは軽減されなかった。

培養マウスマクロファージ（例えば、ＲＡＷ２６４．７細胞）は、ＬＰＳで処置された場合、多数の遺伝子の急速な誘導を示す。培養マウスマクロファージは、炎症応答の調節因子であり、内毒素性ショック変化のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルと見なされる(M. A. Dobrovolskaia, et al., Microbes Infect, 4:903-14 (2002))。培養マウスマクロファージ中のＬＰＳ刺激遺伝子には、マクロファージ／単球自体又は他の標的細胞のいずれかに対して敗血症性ショックで起こる炎症プロセスを調節するように作用する炎症誘発性サイトカイン（ＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２）をコードする遺伝子が含まれる。ＬＰＳでの刺激の際、マクロファージはまた、ＩＰ−１０等のＣＸＣケモカインを産生することができ、これらが免疫細胞を炎症部位にさらに引き付けるように働く(K. M. Kopydlowski, et al., J Immunol, 163:1537-44 (1999))。ＬＰＳで刺激したマクロファージはまた、誘導性一酸化窒素シンターゼ酵素（ｉＮＯＳ）発現の結果として一酸化窒素（ＮＯ）を生成し得る(C. Bogdan, Nat Immunol, 2:907-16 (2001))。敗血症性ショックの発症において重要と見なされるこれらの各因子は、典型的に、非刺激マクロファージ中に存在しないか、非常に低レベルで見出される。

Ｉ型インターフェロン受容体に対するＩＦＮ−βの結合により、マウスのマクロファージにおけるｉＮＯＳ及びＩＰ−１０の発現を誘導する核へのシグナルの導入のために重要な成分として、Ｓｔａｔ１をリン酸化させる（Y. Ohmori, et al., J Leiikoc Biol, 69:598-604 (2001)）。Ｓｔａｔ１欠損（null）動物は、致死用量のＬＰＳで攻撃誘発した場合、生存率が約５０％高まったことを示している一方で（M. Karaghiosoff, et al., Nat Immunol, 4:471-7 (2003)）、致死用量のＬＰＳで攻撃誘発したＩＦＮ−β欠損マウスは、生存率が１００％増大したことを示していた（M. Karaghiosoff, et al., Nat Immunol, 4:471-7 (2003)）。したがって、ＩＦＮ−βシグナル経路の阻止部分は、この経路を完全に阻止するほど効果的ではない。

マクロファージ／単球のＬＰＳ治療により、インターフェロン応答因子（ＩＲＦ）−１のレベルが増大する（M. A. Dobrovolskaia, et al., Microbes Infect, 4:903-14 (2002)）。ＩＲＦ−１はＤＮＡと直接結合する転写因子として作用し、ｉＮＯＳ等の他の遺伝子の転写を高める（R. Kamijo, et al., Science, 263:1612-5 (1994)）。ＬＰＳで処理したマクロファージでは、ＩＲＦ−１が、ｉＮＯＳ遺伝子の転写制御に必要とされる（R. Kamijo, et al., Science, 263:1612-5 (1994)）。抗ウイルス性Ｍｘタンパク質をコードするインターフェロン誘導性ＭＸ遺伝子等の幾つかの他のＩＲＦ−１標的遺伝子が存在している（D. Danino, et al, Curr Opin Cell Biol, 13:454-60 (2001)）。ＭＸプロモーターが強いＩＲＦ−１結合因子を含むことが示されている（C. E. Grant, et al., Nucleic Acids Res, 28:4790-9 (2000)）。

炎症誘発性サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２がＴＬＲ４を介したＬＰＳシグナル伝達によって誘導され（M. A. Dobrovolskaia, et al., Microbes Infect, 4:903-14 (2002)）、内毒素性ショックにおいて役割を果たすことができる（N. C. Riedemann, et al., J Clin Invest, 112:460-7 (2003)）。しかし、近年の報告により、重大な二次エフェクターとしてＩＦＮ−βが同定され、これはＴＬＲ４シグナル伝達のＬＰＳ活性化の際に誘導され、マウスの敗血性ショックモデルの死亡率に寄与する（M. Karaghiosoff, et al., Nat Immunol, 4:471-7 (2003)）。

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）： ＴＬＲ４及び正常な胃腸のグラム陰性細菌の成分は、結腸炎の発症において重要な役割を果たすと考えられる（C. Fiocchi, Gastroenterology, 115:182-205 (1998)、E. Cario, et al., Infect Immun, 68:7010-7 (2000)）。この疾患は、結腸組織における重度の炎症、浮腫、及び白血球浸潤に関連する（C. Fiocchi, Gastroenterology, 115:182-205 (1998)、E. Cario, et al., Infect Immun, 68:7010-7 (2000)、U. P. Singh, et al., J Immunol, 171:1401-6 (2003)、M. B. Grisham, et al., Inflammatory Bowel Disease, 55-64 (1999)）。インターフェロン（ＩＦＮ）の産生及び分泌が増大し、またＴＮＦ−α及びＩＬ−１を含むサイトカインのレベルが増大し、これは白血球接着に関連している内皮細胞接着分子（ＥＣＡＭ）、特にＶＣＡＭ−１を上方制御する。結腸炎関連であることが知られているＩＰ−１０等のケモカインのレベルが増大している（U. P. Singh, et al., J Immunol, 171:1401-6 (2003)）。

Cario et al.（E. Cario, et al., Infect Immun, 68:7010-7 (2000)）は、ＴＬＲ４がＩＢＤの患者から単離した腸上皮細胞系で上方制御されたことを報告した。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）−クローン結腸炎及び潰瘍性結腸炎に関連した結腸の誘導性マウスモデルを使用して、Ortega-Cava et al.（C. F. Ortega-Cava, et al., J Immunol, 170:3977-85 (2003)）は、ＴＬＲ４が正常なマウスに関連する結腸炎マウスの結腸において上方制御されることを見出した。腸炎がＴＬＲ４／Ｓｔａｔ３欠損マウスで有意に改善されることが報告された一方で、ＴＮＦ−α／Ｓｔａｔ３欠損マウスは依然として重度の腸炎を有しており、このことは腸炎のマウスモデルでＴＬＲ４の重要性も示している（M. Kobayashi, et al., J Clin Invest, 111 : 1297-308 (2003)）。

アテローム性動脈硬化並びに１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、及び高血圧の血管合併症： 近年の研究により、アテローム性動脈硬化の発症及び進行におけるＴＬＲ４の重要性が実証されている（K. S. Michelsen, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101 :10679-84 (2004)、G. Pasterkamp, et al., Eur J Clin Invest, 34:328-34 (2004)、G. Andonegui, et al., J Clin Invest, 111:1011-1020 (2003)）。したがって、マウスのノックアウト研究及びヒトのＴＬＲ４多型の研究により、ＴＬＲ４がアテローム性動脈硬化及び血管疾患の発症及び進行における役割を果たすことが実証されている。さらに、内皮細胞ＴＬＲ４が欠損したマウスは、アテローム性動脈硬化傾向のアポリポタンパク質Ｅ欠損（ＡｐｏＥ^−／−）マウスにおいて大動脈プラークの進行を有意に低減し、ＴＬＲ４シグナル伝達の欠失により、ＴＬＲ４^−／−内皮との単球接着が低減し得る（K. S. Michelsen, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:10679-84 (2004)）。

出現したモデルは、有害な障害事象として酸化ＬＤＬ、エンテロウイルス、又は腸内細菌が血流が乱れた領域におけるＴＬＲ発現を増加させるように作用する。ＭｙＤ８８経路、ＮＦ−κＢ、及びサイトカイン（ＴＮＦα）の増加により、ＶＣＡＭ−１が増加し、白血球を誘引する。したがって、病巣での損傷を誘導する高脂質及び／又は高血圧を遮断するだけでなく、病的ＴＬＲ４誘導及び免疫細胞の誘引及び白血球の接着を引き起こすシグナル伝達も遮断することが重要であることが既に示唆されている(G. Pasterkamp, et al., Eur J Clin Invest, 34:328-34 (2004))。

１型糖尿病： 最近の報告は、１型糖尿病における膵臓β細胞中のＴＬＲ３の過剰発現及び破壊的変化に関連している(L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004))。さらに、この報告は、ｄｓＲＮＡが動物において膵島炎（insulinitis）及び１型糖尿病を誘導することができ、このことは既知の動物モデルと一致し、ここで、ＮＯＤマウスにおいてコクサッキーウイルスが１型糖尿病を誘導することを示していた。Devendra及びEisenbarth (D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111 :225-33 (2004))は、広範な種々の研究によってエンテロウイルスが１型糖尿病の発症における潜在的因子として関与すること指摘している。それにより、β細胞が破壊されるウイルス感染機構がサイトカインインターフェロンα（ＩＦＮ−α）（Ｉ型ＩＦＮ様ＩＦＮβ）を含むことが示唆され、ｄｓＲＮＡによるＴＬＲの活性化及びＩＦＮ−αの誘導によって免疫媒介性β細胞破壊を活性化又は促進することができると仮定される。彼らは、「ＩＦＮ−αを標的化する治療薬は、１型糖尿病及び自己免疫の防止において潜在的に有利であり得る」と結論づけている(D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111 :225-33 (2004))。

Ｉ型糖尿病は、許容性遺伝的背景及びウイルスであり得る外部因子が必要なようである。島細胞抗体は、疾患の最初の１ヶ月に共通している。これらは、おそらく、β細胞損傷に一部起因し、一次自己免疫疾患を示す。１型糖尿病における顕著な代謝異常は、高血糖及び糖尿である。糖尿病の後期合併症は多数存在し、卒中を伴うアテローム性動脈硬化症の増加、心臓合併症、腎臓疾患及び腎不全、並びに完全な消耗性であり得る神経障害が含まれる。ＨＬＡ抗原との関連は、１９７０年から既知であった。一定のＨＬＡ対立遺伝子は、疾患頻度の増加に関連し、他は頻度の減少に関連する。島細胞におけるＭＨＣクラスＩ及び異常なＭＨＣクラスＩＩ発現の増加は記載されている(G. F. Bottazzo, et al., N Engl J Med, 313:353-60 (1985)、A. K. Foulis, et al., Diabetes, 35:1215-24 (1986))。ＭＨＣクラスＩとの明確な関連は、遺伝子動物疾患モデルで得られている。したがって、ＭＨＣクラスＩ欠損により、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発症に対する耐性が得られる(D. V. Serreze, et al., Diabetes, 43:505-9 (1994)、L. S. Wicker, et al., Diabetes, 43:500-4 (1994))。最近のＴＬＲ３データとコクサッキーウイルスマウスモデル由来のデータを組み合わせて、感染又は１型糖尿病の環境的誘導が一般に感受性哺乳類で起こり、ＧＡＤ及び抗島細胞抗体が全ての島細胞破壊前の長期の潜伏期について異常であり、ＴＬＲ誘導性のＭＨＣ遺伝子の変化が疾患発現で重要であると仮定される。

自己免疫炎症性疾患の環境誘導因子： ＴＬＲシグナル伝達経路及びその非免疫細胞における病理学的発現は、ウイルス性因子と自己免疫炎症性疾患との間の興味深い結び付きを示している。例えば、複数のウイルスが１型糖尿病と結び付いている（例えばコクサッキーＢ４ウイルス）（J. Guardiola, et al., Crit Rev Immunol, 13:247-68 (1993)、R. Gianani, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 93:2257-9 (1996)、M. S. Horwitz, et al, Nat Med, 4:781-5 (1998)、H. Wekerle, Nat Med, 4:770-1 (1998)、C. Benoist, et al., Nature, 394:227-8 (1998)、Y. Tomer, et al., Endocr Rev, 14:107-20 (1993)、M. F. Prummel, et al., Thyroid, 13:547-51 (2003)、G. S. Cooper, et al., J Rheumatol, 28:2653-6 (2001)、M. M. Ward, et al., Arch Intern Med, 152:2082-8 (1992)）。他の「有害な」環境事象の関与も疑わしい。

有害な環境誘導プロセスの１つの例はタバコ及び喫煙である。多くの疫学研究により、喫煙と関節リウマチ、自己抗体、レイノー現象、グッドパスチャー症候群、及びグレーブス病を含む自己免疫炎症状態との間に明らかな関連性が見出されている（I. Roitt, Essential Immunology, 7th ed., 312-346 (1991)、S. A. Jimenez, et al., Ann Intern Med, 140:37-50 (2004)、C. Nagata, et al., Int J Dermatol, 34:333-7 (1995)）。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）並びにこれらの患者における末期の腎疾患の急速な進行の危険性の著しい増大が示されている（G. S. Cooper, et al., J Rheumatol, 28:2653-6 (2001)、M. M. Ward, et al, Arch Intern Med, 152:2082-8 (1992)）。喫煙が、糖尿病に対する独立した危険因子であり、重病及び早死の危険性を増大させる（E. B. Rimm, et al., Am J Public Health, 83:211-4 (1993)、E. B. Rimm, et al., BMJ, 310:555-9 (1995)、N. Kawakami, et al, Am J Epidemiol, 145:103-9 (1997)、D. Haire-Joshu, et al., Diabetes Care, 22:1887-98 (1999)、J. C. Will, et al., Int J Epidemiol, 30:540-6 (2001)）。横断的研究及びプロスペクティブ研究の両方の結果により、微小血管疾患及び大血管疾患、並びに喫煙と糖尿病との組合せによる早期死亡の危険性が高まることが示されている。分子レベル及び細胞レベルにおいて、潜在的に重要な病理機構は、タバコの煙の反応性因子（reactive elements：リアクタンス因子）による化学的に改変したＤＮＡの発生であり、これにより、改変ＤＮＡに対して特異的に自己抗体が産出される（B. H. Hahn, N Engl J Med, 338:1359-68 (1998)、J. B. Winfield, et al., J Clin Invest, 59:90-6 (1977)）。さらに、喫煙により、動脈壁に影響を及ぼす高いグルコースレベルの能力が高まり、これにより動脈壁が脂肪性沈着物を発達させる可能性がより高くなる。喫煙により、糖尿病患者の高血圧になる危険性、トリグリセリド等の脂質のレベルが高くなる危険性、及び保護的なＨＤＬコレステロールのレベルが低くなる危険性が高まる。したがって、タバコの喫煙が、肥満（oobesity）及び感染因子等の他の環境刺激と合わせて作用する危険性があり、糖尿病及びその合併症の進行における主要な関連した環境因子として構築され得る。

したがって、橋本甲状腺炎は、インスリン欠乏症（insulinitis）及び１型糖尿病、結腸炎、毒素ショック、並びにＴＬＲ３又はＴＬＲ４過剰発現と、非免疫細胞、単球、マクロファージ及び環境病原体の分子署名を伴う誘導プロセスによる樹状細胞におけるシグナル伝達とに関連する自己免疫／炎症性疾患としてのアテローム性動脈硬化症でグループ化され得ることが明らかである（K. S. Michelsen, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:10679-84 (2004)、G. Pasterkamp, et al., Eur J Clin Invest, 34:328-34 (2004)、D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111:225-33 (2004)、L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004)、G. Andonegui, et al., J Clin Invest, 111 :1011-1020 (2003)、C. Fiocchi, Gastroenterology, 115:182-205 (1998)、B. Beutler, Nature, 430:257-63 (2004)、K. S. Michelsen, et al., J Immunol, 173:5901-7 (2004)）。本発明は、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４過剰発現と、非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞におけるシグナル伝達とに関連する自己免疫／炎症性疾患の治療のためのフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体、及び互変異性環状チオンの使用を提供している。さらに本発明は、ＩＲＦ−３の活性化、１型ＩＦＮの合成、ＳＴＡＴの活性化、ＩＲＦ−１遺伝子発現の増大、及びＩＳＲＥ要素によるタンパク質の活性化を伴うＴＬＲシグナル伝達の病理学的活性化に関する自己免疫／炎症性疾患の治療のためのフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体、及び互変異性環状チオンの使用を提供している。

［発明の概要］
本発明は、非免疫細胞及び単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるトール様受容体３及びトール様受容体４の過剰発現並びに／又はそのシグナルに関連する自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患、並びに関連病態の治療に関する。本発明はまた、非免疫細胞及び単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるトール様受容体３及びトール様受容体４の過剰発現並びに／又はそのシグナルに関連する自己免疫疾患及び炎症性疾患、並びに関連病態の治療のためのフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体、及び互変異性環状チオンの使用に関する。本発明はまた、非免疫細胞及び単球、マクロファージ、又は樹状細胞における異常なトール様受容体３及びトール様受容体４並びにそのシグナルに関連する疾患又は病態を有する被験体の治療に関する。

別の実施の形態では、本発明は、ＩＲＦ−３の活性化又は病的シグナル伝達に関与するＴＬＲ媒介性疾患を治療する方法を提供する。別の実施の形態では、本発明は、１型インターフェロンの過剰発現又は病的シグナル伝達に関与する疾患を治療する方法を提供する。別の実施の形態では、本発明は、ＩＳＲＥ含有遺伝子の過剰発現又は病的シグナル伝達に関与するＴＬＲ３媒介性疾患を治療する方法を提供する。別の実施の形態では、本発明は、ＩＲＦ−１の過剰発現又は病的シグナル伝達に関与するＴＬＲ媒介性疾患を治療する方法を提供する。別の実施の形態では、本発明は、Ｓｔａｔ１又はＳｔａｔ３の活性化又は病的シグナル伝達に関与するＴＬＲ媒介性疾患を治療する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、ＩＲＦ−３が活性化されるＴＬＲシグナル経路の活性化又は病的発現に関与する疾患を治療する方法を提供する。別の実施の形態では、本発明は、１型インターフェロンが合成されるＴＬＲシグナル経路の過剰発現又は病的発現に関与する疾患を治療する方法を提供する。別の実施の形態では、本発明は、ＩＳＲＥ含有遺伝子が活性化されるＴＬＲシグナル経路の過剰発現又は病的発現に関与する疾患を治療する方法を提供する。別の実施の形態では、本発明は、ＩＲＦ−１が過剰発現されるＴＬＲシグナル経路の病的発現に関与する疾患を治療する方法を提供する。別の実施の形態では、本発明は、Ｓｔａｔ１又はＳｔａｔ３が活性化されるＴＬＲシグナル経路の活性化又は病的発現に関与する疾患を治療する方法を提供する。

別の実施の形態において、本発明は、治療を必要とする患者においてＴＬＲ媒介性疾患又は傷害を治療する方法であって、治療上有効な量のフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体、及び／又は互変異性環状チオンを投与することを含む、治療する方法を提供する。

別の実施の形態において、本発明は、治療を必要とする患者において、異常な細胞増殖に由来する病的状態；移植拒絶；自己免疫；炎症性、増殖性、過剰増殖性、又は心血管の疾患を含む、ＴＬＲ媒介性疾患又は傷害を治療する方法であって、治療上有効な量のフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体、及び／又は互変異性環状チオンを投与することを含む、治療する方法を提供する。

別の実施の形態において、本発明は、ＴＬＲ媒介性自己免疫炎症性疾患であるか、又はＴＬＲ媒介性自己免疫炎症性疾患に対する素因を有する被験体を治療する方法であって、治療上有効な量の本発明の組成物を被験体に投与することを含む、治療する方法を提供する。

一実施の形態において、ＴＬＲ媒介性自己免疫炎症性疾患は、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性眼瞼炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合型寒冷グロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、グレーブス病、ギラン−バレー、橋本甲状腺炎、分娩後甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、２型糖尿病、１型糖尿病又は２型糖尿病の合併症、若年性関節炎、扁平苔癬、全身性狼瘡、メニエール病、混合性結合組織病、神経炎症、肺損傷、筋炎、心筋炎、肝炎、肉芽腫性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、並びにヴェゲナー肉芽腫症又は重症筋無力症である。

別の実施の形態では、ＴＬＲ−３媒介性自己免疫性炎症性疾患はインスリン依存性糖尿病である。

別の実施の形態では、本発明は、治療を必要とする患者における非免疫細胞におけるＴＬＲ媒介性疾患又は障害を治療する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、治療を必要とする患者におけるＴＬＲ媒介性自己免疫性炎症性疾患又は障害を治療する方法であって、治療上有効な量のフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオンを投与することを含む、治療する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、治療を必要とする患者における非免疫細胞に関与するＴＬＲ媒介性自己免疫性炎症性疾患又は障害を治療する方法であって、治療上有効な量のフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオンを投与することを含む、治療する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、治療を必要とする患者における免疫細胞の浸潤及び非免疫細胞の破壊に関連するＴＬＲ媒介性自己免疫性炎症性疾患又は障害を治療する方法であって、治療上有効な量のフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオンを投与することを含む、治療する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、治療を必要とする患者における病的先天性免疫応答に関与するＴＬＲ媒介性疾患又は障害を治療する方法であって、治療上有効な量のフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオンを投与することを含む、治療する方法を提供する。

一実施の形態では、ＴＬＲ媒介性疾患又は障害は、異常な細胞増殖、移植拒絶、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、過剰増殖性疾患、又は心血管疾患に起因する病的状態である。

別の実施の形態では、心血管疾患又は障害は、再狭窄、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、アテローム発生、脳血管疾患又は事象、冠状動脈事象、狭心症、虚血性疾患、鬱血性心不全、急性心筋梗塞に関連する肺水腫、血栓症、高血圧症における高血圧又は血圧の上昇、血小板凝集、血小板接着、平滑筋細胞増殖、医療機器の使用に関連する血管又は非血管の合併症、医療機器の使用に関連する創傷、血管壁又は非血管壁の損傷、経皮経管的冠状動脈造影法後の末梢血管疾患又は新生内膜過形成である。

一実施の形態では、脳血管疾患又は事象は、脳硬塞若しくは卒中（血管の閉塞又は出血に起因する）、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、失神、又は頭蓋内及び／若しくは頭蓋外動脈のアテローム性動脈硬化症等である。一実施の形態では、冠状動脈事象は、心筋梗塞、心筋血管再生手術、狭心症、心血管死、又は急性冠状動脈症候群である。

別の実施の形態では、本発明は、哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症の１つ又は複数の症状を改善する方法であって、アテローム性動脈硬化症の１つ又は複数の症状の改善に十分な量で、メチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオンを当該哺乳類へ投与することを含む、改善する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、哺乳類における心筋疾患の１つ又は複数の症状を改善する方法であって、心筋疾患の１つ又は複数の症状の改善に十分な量で、メチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオンを当該哺乳類へ投与することを含む、改善する方法を提供する。別の実施の形態では、心筋疾患は、炎症性及び免疫学的性質を有する。別の実施の形態では、心筋疾患は、冠状動脈性心疾患、可逆性又は非可逆性心筋虚血／再潅流傷害、急性又は慢性心不全、及び再狭窄である。

別の実施の形態では、本発明は、哺乳類における炎症に対する急性期反応に関連する冠状動脈合併症を緩和又は防止する方法であって、当該冠状動脈合併症はアテローム性動脈硬化症の症状であり、当該方法は、冠状動脈合併症の緩和又は防止に十分な量で、メチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオンを、急性期反応を有するか又は急性期反応のリスクのある哺乳類へ投与することを含む、緩和又は防止する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、急性期反応を緩和又は防止する方法を提供する。別の実施の形態では、急性期反応は、再発性炎症性疾患に関連する炎症応答である。

別の実施の形態では、急性期反応は、ハンセン病、結核、全身性エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛、結節性多発性動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、ＡＩＤＳ、冠状動脈石灰化、石灰沈着性大動脈狭窄、骨粗鬆症、及び関節リウマチから成る群から選択される疾患に関連する。

別の実施の形態では、急性期反応は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、臓器移植、創傷、埋め込み式人工器官、寄生虫感染、敗血症、内毒素性ショック症候群、及びバイオフィルム形成から成る群から選択される状態に関連する炎症応答である。

別の実施の形態では、本発明は、治療を必要とする患者における免疫細胞の浸潤及び非免疫細胞の破壊に関連するＴＬＲ媒介性自己免疫性炎症性疾患又は障害を治療する方法であって、治療上有効な量のフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオンを、敗血症性ショック、敗血症、内毒素性ショック、血行動態性ショック、敗血症症候群、虚血後再灌流障害、マラリア、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、鬱血性心不全、線維性疾患、悪液質、移植片拒絶、癌、自己免疫疾患、ＡＩＤＳにおける日和見感染、関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎、他の関節炎状態、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、限局性腸炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ハンセン病におけるＥＮＬ、放射線損傷、喘息、及び高酸素性肺胞損傷から成る群から選択される１つ又は複数の病態の治療に有効な量又は混合物で哺乳類へ投与することを含む、治療する方法を提供する。

一実施の形態では、ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は、急性炎症性疾患である。別の実施の形態では、ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は、（ａ）内毒素血症、又は（ｃ）敗血に関連する（ｂ）毒素ショック症候群、及び（ｄ）感染症から成る群から選択される急性炎症性疾患である。

別の実施の形態では、ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は、全ての型、病因、若しくは発症の敗血症性ショック、又は、腎不全、急性腎不全、悪液質、マラリア性悪液質、下垂体悪液質、尿毒症性悪液質、心臓性悪液質、悪液質性副腎機能亢進若しくはアジソン病、癌性悪液質、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染の結果としての悪液質に関連する敗血症性ショックから選択される。別の実施の形態では、敗血症性ショックは内毒素性ショックである。別の実施の形態では、内毒素性ショックは、グラム陰性細菌によって誘導される。さらに別の実施の形態では、内毒素性ショックは、グラム陽性細菌によって誘導される。別の実施の形態では、敗血症性ショックはＬＰＳ誘導性ショックである。別の実施の形態では、毒素ショック、敗血症性ショック、内毒素血症、内毒素性ショック、又はＬＰＳ誘導性ショック症候群は、抗生物質が被験体に投与される疾患に関連する。

別の実施の形態では、本発明は、治療を必要とする患者における瘢痕組織の軽減又は創傷収縮の阻害のために異常な細胞増殖、移植拒絶、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、過剰増殖性疾患、又は血管疾患に起因するか又はこれらにおけるＴＬＲ３媒介性病的状態を治療する方法であって、治療上有効な量のフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体、及び／又は互変異性環状チオンをこのような治療を必要とする被験体へ投与することを含む、治療する方法を提供する。

別の実施の形態では、異常な細胞増殖に起因する病的状態は、癌、カポジ肉腫、肝内胆管癌、絨毛癌、新生芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキン病、黒色腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、又は急性若しくは慢性顆粒球性リンパ腫である。

別の実施の形態では、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、過剰増殖性疾患、又は血管疾患は、関節リウマチ、再狭窄、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、真性糖尿病、ブドウ膜炎、腎炎症候群、多発性硬化症、炎症性皮膚疾患、炎症性肺疾患、炎症性腸疾患、身体通路の閉塞に影響を及ぼすが原因となる炎症性疾患、眼、鼻、又は喉の炎症、真菌感染、及び食物関連アレルギーである。

別の実施の形態では、本発明は、アレルゲンに起因するＴＬＲ３媒介性病的状態を治療する方法を提供する。別の実施の形態では、本発明は、アレルギーを引き起こすＴＬＲ３媒介性病的状態を治療する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、喘息、慢性気管支狭窄、急性気管支狭窄、気管支炎、小気道閉塞、気腫、閉塞性気道疾患、炎症性気道疾患、急性肺損傷、又は気管支拡張症に起因するＴＬＲ３／４媒介性疾患、障害、又は状態を治療する方法を提供する。別の実施の形態では、喘息は、アトピー性喘息、非アトピー性喘息、アレルギー喘息、アトピー性気管支ＩｇＥ媒介性喘息、気管支喘息、体質性喘息、真性喘息、病態生理学的障害に起因する内因性喘息、環境因子に起因する外因性喘息、未知又は明らかでない原因の体質性喘息、気管支炎性喘息、気腫性喘息、運動誘発性喘息、アレルゲン誘導性喘息、冷気誘導性喘息、職業性喘息、細菌、真菌、原生動物、又はウイルスの感染に起因する感染性喘息、非アレルギー喘息、初期喘息、呼吸困難乳児症候群、及び細気管支炎である。

別の実施の形態では、本発明は、閉塞性気道疾患又は炎症性気道疾患に起因するＴＬＲ３媒介性病的状態を治療する方法を提供する。一実施の形態では、閉塞性気道疾患又は炎症性気道疾患は、慢性好酸球性肺炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎を含むＣＯＰＤ、ＣＯＰＤに関連するか又は関連しない肺気腫若しくは呼吸困難、不可逆性進行性気道閉塞によって特徴付けられるＣＯＰＤ、成人呼吸急迫症候群（ＡＲＤＳ）、他の薬物療法の結果としての気道過反応の増悪、又は肺高血圧症に関連する気道疾患である。別の実施の形態では、閉塞性気道疾患又は炎症性気道疾患は、気管支炎である。一実施の形態では、気管支炎は、慢性気管支炎、急性気管支炎、急性咽頭気管気管支炎、アラキン酸気管支炎、カタル性気管支炎、クループ性気管支炎、乾性気管支炎、感染性喘息性気管支炎、湿性気管支炎、ブドウ球菌性気管支炎、連鎖球菌性気管支炎、又は肺胞性気管支炎である。一実施の形態では、気管支拡張症は、円柱状気管支拡張症、小嚢気管支拡張症、紡錘状気管支拡張症、毛管状気管支拡張症、嚢状気管支拡張症、乾性気管支拡張症、又は濾胞状気管支拡張症である。

一実施の形態では、本発明は、炎症に関連する症状を改善するか又は既存の炎症を減少させるために治療することができる状態を誘導する他の炎症に起因するトール様受容体３過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療する方法を提供する。一実施の形態では、関連する他の炎症又は刺激は、昆虫刺傷又は虫刺され、特定の植物型（例えば有毒オーク等）との接触、照射（例えばＵ．Ｖ．）、非感染性結膜炎、痔核（急性）、擦過傷、指の巻き爪又は足の巻き爪（肉芽形成）、皮膚移植片のドナー部位、膣炎、乾癬、単純ヘルペス（ヘルペス（cold sores）、アフター性潰瘍）、肛門／下腿（cruri）の掻痒、化学的炎症等からのものであり得る。

一実施の形態では、本発明は、炎症に関連する症状を改善するか又は既存の炎症を減少させるために治療することができる状態を誘導する他の炎症に起因するトール様受容体３／４過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療する方法であって、炎症が細胞又は組織に対する外部誘導性損傷の結果である、治療する方法を提供する。このような損傷を、ヒト及び動物の皮膚又は粘膜に対する化学的及び／又は物理的影響によって誘導することができる。物理的影響の例は、梗塞、熱、低温、照射、及び電気ショックであり、化学的影響の例は、酸、塩基、及びアレルゲンとの接触である。炎症を、皮膚に作用する微生物又はその分子シグネチャー分子によって誘導することができ、炎症は、ヒト又は動物の身体に侵入する微生物の結果である。

別の実施の形態では、改善することができる炎症応答は、被験体の皮膚又は粘膜上で起こる場合があり、萌出した親知らず周囲の炎症、抜歯後、歯周膿瘍、粘膜上の人工器官誘導性褥創、真菌感染、抜歯後に生じ得る疼痛状態である乾燥性歯槽炎（alveolitis sicca dolorosa）の露呈骨表面の治療、慢性及び急性の炎症性疾患、例えば限定はされないが膵炎、関節リウマチ、骨関節炎、喘息、炎症性腸疾患、乾癬、並びにアルツハイマー病等の一定の神経障害が含まれるが、これらに限定されない。他の症状は、例えば、日光及び風への曝露、外傷又は創傷、例えば切傷、バム（bums）、又は擦過傷、アルカリセッケン、重金属（例えば鉛又は水銀）、界面活性剤、脂質溶媒、油、防腐剤等の化学物質への曝露、及び疾患（例えば、湿疹、乾癬、脂漏性皮膚炎）の環境因子的なものである。

一実施の形態では、本発明は、トール様受容体３過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患（例えば、橋本甲状腺炎、炎症性肺疾患、及び１型糖尿病）を治療する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、ＮＦ−κＢシグナル経路ではなくＩＲＦ−３シグナル経路の増加の阻害により、病原体又は病原体分子のシグナルに関与するＴＬＲ３又はＴＬＲ４関連疾患を治療する方法を提供する。一実施の形態では、病原体関連作用物質又は生成物は、ウイルス、細菌、ｄｓＲＮＡ、１型ＩＦＮ、又は環境誘導事象（例えば、タバコ）である。別の実施の形態では、細菌の例は、クラミジア又は腸内細菌であるが、これらに限定されない。さらに別の実施の形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。さらに別の実施の形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス、エンテロウイルス、クラミジア、又はコクサッキーウイルスである。別の実施の形態では、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルスである。別の実施の形態では、ウイルスは、インフルエンザＡ型である。

別の実施の形態では、本発明は、１型インターフェロン遺伝子発現を増加させる病原体又は病原体分子のシグナルに関与するＴＬＲ３又はＴＬＲ４関連疾患を治療する方法を提供する。一実施の形態では、病原体関連作用物質又は生成物は、ウイルス、細菌、ｄｓＲＮＡ、１型ＩＦＮ、又は環境誘導事象（例えば、タバコ）である。別の実施の形態では、細胞の例は、クラミジア又は腸内細菌であるが、これらに限定されない。さらに別の実施の形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。さらに別の実施の形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス、エンテロウイルス、又はコクサッキーウイルスである。別の実施の形態では、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルスである。別の実施の形態では、ウイルスは、インフルエンザＡ型である。

別の実施の形態では、本発明は、Ｓｔａｔ１又はＳｔａｔ３活性化を増加させるＴＬＲ３又はＴＬＲ４関連病原体又は病原体分子のシグナルを阻害する方法を提供する。一実施の形態では、病原体関連作用物質又は生成物は、ウイルス、細菌、ｄｓＲＮＡ、１型ＩＦＮ、又は環境誘導事象（例えば、タバコ）である。別の実施の形態では、細胞の例は、クラミジア又は腸内細菌であるが、これらに限定されない。さらに別の実施の形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。さらに別の実施の形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス、エンテロウイルス、又はコクサッキーウイルスである。別の実施の形態では、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルスである。別の実施の形態では、ウイルスは、インフルエンザＡ型である。

別の実施の形態では、本発明は、インターフェロン感受性応答要素（ＩＳＲＥ）活性化を増加させるＴＬＲ３又はＴＬＲ４関連病原体を阻害する方法を提供する。一実施の形態では、病原体関連作用物質又は生成物は、ウイルス、細菌、ｄｓＲＮＡ、１型ＩＦＮ、又は環境誘導事象（例えば、タバコ）である。別の実施の形態では、細胞の例は、クラミジア又は腸内細菌であるが、これらに限定されない。さらに別の実施の形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。さらに別の実施の形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス、エンテロウイルス、又はコクサッキーウイルスである。別の実施の形態では、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルスである。別の実施の形態では、ウイルスは、インフルエンザＡ型である。

別の実施の形態では、本発明は、Ｓｔａｔ１又はＳｔａｔ３活性化を増加させるＴＬＲ３又はＴＬＲ４関連病原体又は病原体分子のシグナルを阻害する方法を提供する。一実施の形態では、病原体関連作用物質又は生成物は、リポポリサッカリド、１型ＩＦＮ、環境誘導事象（例えば、タバコ）、又は高脂血症である。別の実施の形態では、病原体は、細菌である。さらに別の実施の形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。さらに別の実施の形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。別の実施の形態では、病原体は、ウイルスである。別の実施の形態では、ウイルスは、エンテロウイルスである。

別の実施の形態では、本発明は、インターフェロン感受性応答要素（ＩＳＲＥ）を有する遺伝子の活性化を増加させるＴＬＲ３又はＴＬＲ４関連病原体又は病原体分子のシグナルを阻害する方法を提供する。一実施の形態では、病原体関連作用物質又は生成物は、リポポリサッカリド、１型ＩＦＮ、又は環境誘導事象（例えば、タバコ、高脂血症）である。別の実施の形態では、病原体は細菌である。別の実施の形態では、細菌は、グラム陰性細菌である。別の実施の形態では、病原体はウイルスである。別の実施の形態では、ウイルスはエンテロウイルスである。

別の実施の形態では、本発明は、インターフェロン感受性応答要素（ＩＳＲＥ）の活性化を増加させるサイトカインを阻害する方法を提供する。一実施の形態では、サイトカインはＩＬ−１である。別の実施の形態では、サイトカインは、ＴＮＦ−αである。別の実施の形態では、サイトカインは、γインターフェロンである。別の実施の形態では、サイトカインは、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、又はＩＦＮ−βが含まれるが、これらに限定されない）である。

別の実施の形態では、本発明は、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は血清中の病的ＴＬＲ３又はＴＬＲ４発現及びＴＬＲ３又はＴＬＲ４媒介性シグナル分子並びに自己免疫疾患又は炎症性疾患（例えば、１型糖尿病、結腸炎、自己免疫性甲状腺炎、アテローム性動脈硬化症、及び糖尿病の血管合併症）等の病状を軽減する作用因子の治療有効性を測定する方法を提供する。一実施の形態では、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は血清中のＴＬＲ３又はＴＬＲ４及びＴＬＲ３又はＴＬＲ４のシグナル伝達分子の発現レベルは、自己免疫性炎症性疾患において病的ＴＬＲ３又はＴＬＲ４発現及びＴＬＲ３又はＴＬＲ４媒介シグナル分子を軽減する作用因子の治療有効性を予想するための診断的測定である。

別の実施の形態では、甲状腺細胞又は膵島細胞におけるＴＬＲ３の発現レベルを、橋本病、膵島炎（insulinitis）、又は１型糖尿病を診断する方法としてだけでなく、これらの自己免疫性炎症性疾患で変化した病的ＴＬＲ３発現及びＴＬＲ３媒介性シグナル分子を軽減する作用因子による治療基準として測定する。さらに別の実施の形態では、単球、マクロファージ、血管内皮細胞、又は腸上皮細胞におけるＴＬＲ４及びＴＬＲ４媒介性シグナル分子の発現レベルを、診断する方法としてだけでなく、病的状態（例えば、血管疾患、大腸炎、又は毒素ショック）における病的ＴＬＲ４発現及びＴＬＲ４媒介性シグナル分子を軽減する作用因子による治療基準として測定する。

別の実施の形態では、本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患（例えば、全身性狼瘡、ブドウ膜炎、関節リウマチ、グレーブス病）におけるＴＬＲ及びＴＬＲ媒介性シグナル分子の病的発現を軽減する作用因子の診断及び治療有効性を測定する方法を提供する。一実施の形態では、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は血清中のＴＬＲ及びＴＬＲ媒介性シグナル分子の発現レベルを測定して、自己免疫性炎症性疾患における病的ＴＬＲ発現及びＴＬＲ媒介性シグナル分子を軽減する作用因子の治療有効性を測定する。

別の実施の形態では、本発明は、ＴＬＲに関与する自己免疫疾患又は炎症性疾患の非ＭｙＤ８８関連経路におけるＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ、ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−３、又はＩＳＲＥ調節分子の病的発現を軽減する作用因子の診断有効性及び治療有効性を測定する方法を提供する。一実施の形態では、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は血清中の非ＭｙＤ８８関連経路におけるＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ、ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−３、又はＩＳＲＥ調節分子の発現レベルを測定して、自己免疫性炎症性疾患の病的発現を軽減する作用因子の治療有効性を測定する。

別の態様では、本発明は、細胞内又は細胞外サイトカイン又は炎症性サイトカインの内因性量を減少させる治療上有効な量の作用物質を、炎症状態又は疾患を患う患者へ投与することにより、炎症性又は感染性の状態或いは疾患を治療する方法に関する。「炎症性又は感染性の状態或いは疾患」という用語は、自己免疫疾患又は炎症性疾患（例えば、多発性硬化症、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病及び慢性関節リウマチ）、外傷、化学療法反応、移植拒絶反応、全身性シュワルツマン反応、全身性炎症反応症候群、敗血症、重度の敗血症又は敗血症性ショックを包含するが、これらに限定されないことが当業者に理解されよう。

さらなる態様では、本発明は、細胞内又は細胞外ＴＮＦαの内因性量を減少させる治療上有効な量の作用物質を、下記疾患を患う患者に投与することにより、対宿主性移植片病、急性呼吸促迫症候群、肉芽腫症性疾患、移植拒絶反応、悪液質、寄生虫感染、真菌感染、外傷及び細菌感染のような疾患を治療する方法に関する。

本発明はまた、治療が被験体のための治癒的療法、予防的療法、改善的療法、又は防止的療法である、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４媒介性疾患又は障害を治療する方法を提供する。

本発明の化合物はまた、例えばステロイド、シクロオキソゲナーゼ−２阻害剤、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤＳ、抗生物質、免疫抑制剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、ＬＴＢ_４アンタゴニスト及びＬＴＡ_４ヒドロラーゼ阻害剤、並びに抗細胞接着分子（例えば、Ｅ−セレクチン）と一緒に、部分的に又は完全に他の従来の抗炎症剤に代わって、同時療法で使用され得る。

別の実施の形態では、本発明は、サリチル酸塩（スルファサラジン、オルサラジン及びメサラミンを包含する）、副腎皮質ステロイド、免疫抑制薬（アザチオプリン及び６−メルカプトプリンを包含する）、抗生物質、抗接着分子（例えば、Ｅ−セレクチン）及びビタミンＤ化合物（例えば、１−α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）と組み合わせたメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンを含む混合物(combination)を利用して、症状を軽減する方法を意図する。

一実施の形態では、本発明は、メチマゾール（１−メチル−２−メルカプトイミダゾール）及びその誘導体の使用を提供する。別の実施の形態では、本発明は、カルビマゾール（ネオメルカゾール）及びその誘導体として既知のメチマゾールのプロドラッグ形態の使用を提供する。

別の実施の形態では、本発明はメチマゾール、メトロニダゾール、２−メルカプトイミダゾール、２−メルカプトベンズイミダゾール、２−メルカプト−５−ニトロベンズイミダゾール、２−メルカプト−５−メチルベンズイミダゾール、ｓ−メチルメチマゾール、ｎ−メチルメチマゾール、５−メチルメチマゾール、５−フェニルメチマゾール、及び１−メチル−２−チオメチル−５（４）ニトロイミダゾールから成る群から選択される１つ又は複数の化合物を含有する組成物の使用を提供する。好ましくは、５−フェニルメチマゾールが使用される。

別の実施の形態では、本発明は、トール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現及び／若しくはそれに由来する過剰発現されたシグナルに関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患並びに関連病態の治療のためのフェニルメチマゾール（化合物１０、Ｃ−１０、Ｃ１０）とその誘導体との使用を提供する。

本発明の化合物は、任意の従来の技法を使用して合成され得る。好ましくは、これらの化合物は、容易に入手可能な出発材料から化学的に合成される。

本発明の化合物はまた、選択的な生物学的特性を増強するために、適切な官能性を付加することにより修飾され得る。このような修飾は、当該技術分野で既知であり、所定の生物学的系（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的浸透を増大させる修飾、経口による利用可能性を増大させる修飾、注射による投与を可能にさせるように溶解性を増大させる修飾、代謝を変更させる修飾及び排出の速度を変更させる修飾が挙げられる。

合成されると、本発明による化合物の活性及び特異性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して確定され得る。

これらの方法は、単剤療法、又は抗炎症薬又は免疫抑制薬と組み合わせて本発明の化合物を使用することができる。このような併用療法は、同時又は異なる時間に投与される単回投薬形態又は複数回投薬形態の作用因子の投与を含む。

本発明の幾つかの実施の形態は、本明細書中に記載の疾患、障害、状態、又はその合併症を予防又は治療する方法であって、治療上有効な量又は用量の本発明の化合物を、スルホニル尿素、メグリチニド、ビグアニド、α−グルコシダーゼ阻害剤、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ（すなわち、ＰＰＡＲ−γ）アゴニスト、インスリン、インスリン類似体、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、コレステロール降下剤（例えば、フィブラート（フェノフィブラート、ベザフィブラート、ゲムフィブロジル、及びクロフィブラート等が含まれる）、胆汁酸金属イオン封鎖剤（コレスチラミン及びコレスチポール等が含まれる）、及びナイアシン））、抗血小板薬（例えば、アスピリン及びアデノシン二リン酸受容体アンタゴニスト（クロピドグレル及びチクロピジン等が含まれる））、抗アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、及びアジポネクチンから成る群から選択される少なくとも１つの薬学的因子（pharmaceutical agent）と組み合わせてこのような予防又は治療を必要とする個体へ投与することを含む、予防又は治療する方法を含む。幾つかの実施の形態では、本発明の方法は本発明の化合物を含み、薬学的因子を個別に投与する。さらなる実施の形態では、本発明の化合物及び薬学的因子を同時に投与する。

さらなる活性因子（複数可）は、他の薬学的活性を有する脂質調整化合物若しくは脂質調整薬又は脂質調整効果及び他の薬学的活性の両方を有する作用因子であり得る。使用することができるさらなる活性因子の例には、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（ラクトン化形態又はジヒドロキシオープンアシッド形態のスタチン及びその薬学的に許容可能な塩及びエステル（ロバスタチン（米国特許第４，３４２，７６７号を参照のこと）、シンバスタチン（米国特許第４，４４４，７８４号を参照のこと）、ジヒドロキシオープンアシッド型シンバスタチン（特に、そのアンモニウム塩又はカルシウム塩）、プラバスタチン（特に、そのナトリウム塩）（米国特許第４，３４６，２２７号を参照のこと）、フルバスタチン（特にそのナトリウム塩）（米国特許第５，３５４，７７２号を参照のこと）、アトルバスタチン（特に、そのカルシウム塩）（米国特許第５，２７３，９９５号を参照のこと）、セリバスタチン（特に、そのナトリウム塩）（米国特許第５，１７７，０８０号を参照のこと）、ピタバスタチン（ＮＫ−１０４とも呼ばれる（ＰＣＴ国際公開ＷＯ９７／２３２００号を参照のこと））及びＺＤ４５２２が含まれる）が含まれる）；ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、スクアレンシンテターゼ阻害剤（スクアレンシンターゼ阻害剤としても既知）、アシル−補酵素Ａ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤（ＡＣＡＴ−１又はＡＣＡＴ−２の選択的インヒビター並びにＡＣＡＴ−１及び−２のデュアル阻害剤が含まれる）；ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、プロブコール、ナイアシン、胆汁酸金属イオン封鎖剤、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体インデューサー、血小板凝集阻害剤（例えば、糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａフィブリノゲン受容体アンタゴニスト及びアスピリン）、ヒトペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲＯγ）アゴニスト（一般にグリタゾンと呼ばれる化合物（例えば、トログリタゾン、ピオグリタゾン、及びロシグリタゾン）及びチアゾリジンジオンとして既知の構造クラス内に含まれる化合物並びにチアゾリジンジオン構造クラス外のＰＰＡＲ−αアゴニストが含まれる）；ＰＰＡＲδアゴニスト（クロフィブラート、フェノフィブラート（微粉化フェノフィブラート及びゲムフィブロジルが含まれる）；ＰＰＡＲα／γデュアルアゴニスト、ビタミンＢ６（ピリドキシンとしても既知）及びその薬学的に許容可能な塩（塩酸塩等）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミンとしても既知）、葉酸又はその薬学的に許容可能な塩若しくはエステル（ナトリウム塩及びメチルグルカミン塩等）、抗酸化ビタミン（ビタミンＣ及びＥ並びにβカロテン等）、β遮断薬、アンギオテンシンＩＩアンタゴニスト（ロサルタン等）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（エナラプリル及びカプトプリル等）、カルシウムチャネル遮断薬（ニフェジピン及びジルチアゼム等）、内皮アンタゴニスト、ＡＢＣＡ１遺伝子発現を増強する作用因子、ＦＸＲリガンド（阻害剤及びアゴニストの両方が含まれる）、ビスホスホネート化合物（アレンドロン酸ナトリウム等）、及びシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤（ロフェコキシブ及びセレコキシブ等）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明の化合物を、抗レトロウイルス治療に関連する脂質異常を治療するために、ＡＩＤＳ感染患者において抗レトロウイルス療法と組み合わせて使用することができる（例えば、インジナビル、ネルフィナビル（nelfinavir）、リトナビル、及びサキナビル等のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤と組み合わせたその使用であるが、これに限定されない）。

本発明の化合物と組み合わせて使用することができるさらに別の作用因子型は、コレステロール吸収阻害剤（植物ステロールを含む）である。コレステロール吸収阻害剤は、腸管腔から小腸壁の腸細胞へのコレステロールの移動を遮断する。この遮断は、血清コレステロールレベルの低下におけるその主な作用様式である。これらの化合物は主に、アシル補酵素Ａ等の作用機構（コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害）、トリグリセリド合成阻害、ＭＴＰ阻害、胆汁酸金属イオン封鎖、及び転写調整（核ホルモンのアゴニスト又はアンタゴニスト等）によって血清コレステロールレベルを低下させる化合物と異なる。コレステロール吸収阻害剤は、米国特許第５，８４６，９６６号、米国特許第５，６３１，３６５号、米国特許第５，７６７，１１５号、米国特許第６，１３３，００１号、米国特許第５，８８６，１７１号、米国特許第５，８５６，４７３号、米国特許第５，７５６，４７０号、米国特許第５，７３９，３２１号、米国特許第５，９１９，６７２号、ＷＯ００／６３７０３、ＷＯ／００６０１０７号、ＷＯ００／３８７２５号、ＷＯ００／３４２４０号、ＷＯ００／２０６２３号、ＷＯ９７／４５４０６号、ＷＯ９７／１６４２４号、ＷＯ９７／１６４５５号、及びＷＯ９５／０８５３２号（これらの全ての内容全体が本明細書中に参照により援用される）に記載されている。

本発明の化合物の他の薬学的因子との併用療法の範囲は本明細書中に列挙した範囲（上記又は下記）に制限されないが、代謝関連障害に関連する疾患、状態、又は障害の予防又は治療に有用な任意の薬学的因子又は薬学的組成物との任意の組み合わせが概ね含まれると理解されるであろう。

一実施の形態では、本発明は、被験体におけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４媒介性疾患及び関連疾患を診断する方法及び当該疾患を阻害する作用因子のその後の治療有効性であって、（ａ）被験体から得た非免疫組織細胞又は血清の試験サンプルにおける、及び（ｂ）同一の細胞型又は血清の既知の正常な非免疫組織細胞の対照サンプルにおけるＴＬＲ３／ＴＬＲ４又はＴＬＲ３／ＴＬＲ４シグナル伝達分子の発現レベルを検出することを含み、対照サンプルと比較した試験サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４又はそのシグネチャーシグナル分子の発現レベルの高低が、試験組織細胞を得た被験体におけるＴＬＲ３／４関連疾患の存在又は治療有効性を示す、診断する方法及び当該疾患を阻害する作用因子のその後の治療有効性を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、被験体における非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるトール様受容体過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を診断する方法であって、（ａ）被験体から得た非免疫細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、又は血清の試験サンプルにおける、及び（ｂ）同一の細胞型の既知の正常な非免疫細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、又は血清の対照サンプルにおけるＴＬＲ又はＴＬＲシグナル伝達分子の発現レベルを検出することを含み、対照サンプルと比較した試験サンプルにおけるＴＬＲ又はＴＬＲシグナル伝達分子の発現レベルの高低が、試験組織細胞を得た被験体におけるトール様受容体の過剰発現又は過剰発現したシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患の存在又は療法の有効性を示す、診断する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、被験体における非免疫細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、又は血清におけるＴＬＲの非ＭｙＤ８８誘導性ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥシグナル系の病的活性化によって誘導された遺伝子又は遺伝子産物の過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を診断する方法であって、（ａ）被験体から得た非免疫細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、又は血清の試験サンプルにおける、及び（ｂ）同一の細胞型の既知の正常な非免疫細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、又は血清の対照サンプルにおけるＴＬＲの非ＭｙＤ８８誘導性ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥシグナル系の過剰発現によって変わる分子の発現レベルを検出することを含み、対照サンプルと比較した試験サンプルにおけるＴＬＲ又はＴＬＲシグナル伝達分子の発現レベルの高低が、試験組織細胞を得た被験体における過剰発現したシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患の存在又は療法の有効性を示す、診断する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、トール様受容体３若しくはＴＬＲ４の発現又はそのシグナルを阻害する化合物を同定する方法であって、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現又は活性を正常に示す細胞を、候補化合物との接触の同時、前、又は後にこの発現又は活性のエンハンサー（例えば、ＬＰＳ、Ｉ型ＩＦＮ、ｄｓＲＮＡトランスフェクション、ウイルス、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）と接触させること、試験化合物に対する細胞による応答性又は応答性不足を決定することを含む、同定する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、非免疫細胞におけるトール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現又は過剰発現したシグナル伝達を阻害する化合物を同定する方法であって、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４又はＴＬＲ３／４活性を過剰発現する非免疫細胞を候補化合物と接触させること、及びＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４又はそのシグナル分子の活性又は発現を決定することを含む、同定する方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、被験体におけるトール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現及び／又はシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を防止、改善、安定化、又は治療する可能性について試験化合物をスクリーニングする方法であって、被験体におけるトール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現及び／又はシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患しているか又は発症リスクのある被験体からの非免疫細胞サンプル、単球、マクロファージ、又は樹状細胞を試験化合物に最初に接触させる工程、ｂ）被験体からの第２の非免疫細胞サンプル、単球、マクロファージ、又は樹状細胞を既知の標準化合物と接触させる工程であって、ここで、第１の非免疫細胞サンプル及び第２の非免疫細胞サンプルを同一様式で試験化合物に接触させる、接触させる工程、及びｃ）第１の非免疫細胞サンプル及び第２の非免疫細胞サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現又は活性を測定する工程であって、ここで、第１の非免疫細胞サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現又は活性が第２の非免疫細胞サンプルと比較して減少する場合、化合物は潜在性を有すると判断される、測定することを含む、スクリーニングする方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、被験体におけるトール様受容体の過剰発現又はシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を防止、改善、安定化、又は治療する可能性について試験化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）被験体におけるトール様受容体の過剰発現又はシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患しているか又は発症リスクのある第１の被験体からの非免疫細胞サンプル、単球、マクロファージ、又は樹状細胞を試験化合物に最初に接触させる工程、ｂ）トール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現又はシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患していないか又は発症する傾向のない第２の被験体からの第２の非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞サンプルを試験化合物と接触させる工程であって、ここで、第１の非免疫細胞サンプル及び第２の非免疫細胞サンプル、単球、マクロファージ、又は樹状細胞を同一様式で試験化合物に接触させる、接触させる工程、及びｃ）第１の非免疫細胞サンプル及び第２の非免疫細胞サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現又は活性を測定する工程であって、ここで、第１の非免疫細胞サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現又は活性が第２の非免疫細胞サンプルと比較して減少する場合、化合物は可能性を有すると判断される、測定する工程を含む、スクリーニングする方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、被験体における非ＭｙＤ８８誘導性ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を防止、改善、安定化、又は治療する可能性について試験化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）被験体における過剰発現した非ＭｙＤ８８誘導性ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患しているか又は発症リスクのある第１の被験体からの非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞サンプルを試験化合物に最初に接触させる工程、ｂ）過剰発現した非ＭｙＤ８８誘導性ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患していないか又は発症する傾向のない第２の被験体からの第２の非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞サンプルを試験化合物と接触させる工程であって、ここで、第１の非免疫細胞サンプル及び第２の非免疫細胞サンプル、単球、マクロファージ、又は樹状細胞を同一様式で試験化合物に接触させる、接触させる工程、及びｃ）第１の非免疫細胞サンプル及び第２の非免疫細胞サンプルにおける非ＭｙＤ８８誘導性ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥシグナル伝達遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性を測定する工程であって、ここで、第１の非免疫細胞サンプルにおける発現又は活性が第２の非免疫細胞サンプルと比較して減少する場合、化合物は治療可能性を有すると判断される、測定する工程を含む、スクリーニングする方法を提供する。

別の実施の形態では、本発明は、被験体におけるＴＬＲ３、ＴＬＲ４、又はＴＬＲ発現の増加又は非ＭｙＤ８８誘導性ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥシグナル伝達の増加に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を防止、改善、安定化、又は治療する可能性について試験化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞サンプルをＴＬＲ３、ＴＬＲ４、又はＴＬＲ発現又は増加した非ＭｙＤ８８誘導性ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥシグナル伝達のインデューサーに最初に接触させる工程、ｂ）第２の非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞サンプルをＴＬＲ３、ＴＬＲ４、又はＴＬＲ発現又は増加した非ＭｙＤ８８誘導性ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥシグナル伝達のインデューサーに同一の様式であるが、試験化合物の前又は後に接触させる工程、ｃ）第３の非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞サンプルをＴＬＲ３、ＴＬＲ４、又はＴＬＲ発現又は増加した非ＭｙＤ８８誘導性ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥシグナル伝達のインデューサーに同一の様式でビヒクル使用の前又は後に試験化合物と接触させる工程であって、第１の非免疫細胞サンプル、第２の非免疫細胞サンプル、及び第３の非免疫細胞サンプル、単球、マクロファージ、又は樹状細胞を同一様式で試験化合物に接触させる、接触させる工程、及びｄ）第１の非免疫細胞サンプル、第２の非免疫細胞サンプル、及び第３の非免疫細胞サンプルにおけるＴＬＲ３、ＴＬＲ４、又はＴＬＲ発現又は増加した非ＭｙＤ８８誘導性ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥシグナル伝達遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性を測定する工程であって、第２の非免疫細胞サンプルにおける発現又は活性が第１の非免疫細胞サンプル及び第３の非免疫細胞サンプルと比較して減少する場合、化合物は治療可能性を有すると判断される、測定する工程を含む、スクリーニングする方法を提供する。

本発明の上記概要は、本発明のそれぞれの実施の形態又はあらゆる実施態様について記載するように意図されているものではない。利点及び達成は、本発明のより完全な理解と共に、添付の図面と併せて以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を参照することにより明らかとなり、且つ理解されるであろう。

この文書全体にわたって、温度はすべて、セ氏温度で与えられ、パーセントはすべて、別記しない限り重量パーセントである。本明細書で言及される刊行物はすべて、目下記載される本発明に関連して使用され得る刊行物において記載される組成物及び方法論について記載並びに開示する目的で、参照により本明細書に援用される。本明細書中で論述される刊行物は、本出願の出願日に先立つそれらの開示に関してのみ示されている。本明細書中のいずれの刊行物も、本発明が先行発明によりこのような開示に先行するものではないという承認として解釈されるべきではない。

特許請求の範囲で規定されるような本発明は、以下の図面を参照してより良好に理解され得る。

例示される実施の形態の以下の説明において、実施の形態の一部を成し、且つ例として本発明が実施され得る様々な実施の形態が示される添付の図面を参照する。他の実施の形態を利用してもよく、また本発明の範囲を逸脱することなく構造的及び機能的変更が成されてもよいことを理解されたい。

本発明の組成物、装置、及び方法について記載する前に、本発明は、記載する特定の方法論、装置、配合物及び組成物に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ると理解すべきである。

本開示全体で使用される場合、以下の用語は、他で示さない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。

本明細書中で定義される薬学的に活性な化合物及び薬学的組成物の「投与」という用語は、それらの注射による（特に、非経口的に）ような全身的な使用、静脈内注入、坐剤及び経口投与、並びに化合物及び組成物の局所塗布を含む。経口投与は、本発明において特に好ましい。

「アレルゲン」は、感受性被験体においてアレルギー性反応又は喘息性反応を誘導することが可能な物質をいう。アレルゲンのリストは膨大であり、花粉、昆虫毒、動物鱗屑（dander）、塵、真菌胞子及び薬物（例えば、ペニシリン）が含まれ得る。天然、動物、及び植物のアレルゲンの例には、以下の属（genus）に特異的なタンパク質が含まれる：イヌ属（Canine）（カニス・ファミリアリス（Canis familiaris））；デルマトファゴイデス属（Dermatophagoides）（例えばコナヒョウダニ（Dermatophagoides farinae））；ネコ属（Felis）（フェリス・ドメスティクス（Felis domesticus））；ブタタサ属（Ambrosia）（ブタクサ（Ambrosia artemiisfolia））；ドクムギ属（Lolium）（例えばホソムギ（Lolium perenne）又はネズミムギ（Lolium multiflorum））；スギ属（Cryptomeria）（スギ（Cryptomeria japonica））；アルテルナリア属（Alternaria）（アルテルナリア・アルテルナタ（Alternaria alternata））；ハンノキ属（Alder）；ハンノキ属（Alnus）（アルヌス・グルティノサ（Alnus gultinosa））；カバノキ属（Betula）（ベツラ・ベルコサ（Betula verrucosa））；コナラ属（Quercus）（クウェルクス・アルバ（Quercus alba））；オリーブ属（Olea）（オリーブ（Olea europa））；ヨモギ属（Artemisia）（ヨモギ（Artemisia vulgaris））；オオバコ属（Plantago）（例えば、ヘラオオバコ（Plantago lanceolata））；ヒカゲミズ属（Parietaria）（例えばパリエタリア・オフィチナリス（Parietaria officinalis）又はパリエタリア・ユダイカ（Parietaria judaica））；チャバネゴキブリ属（Blattella）（例えばチャバネゴキブリ（Blattella germanica））；ミツバチ属（Apis）（例えばアピス・ムルティフロルム（Apis multiflorum））；イトスギ属（Cupressus）（例えば、クプレスス・セムペルビレンス（Cupressus sempervirens）、クプレスス・アリゾニカ（Cupressus arizonica）及びクプレスス・マクロカルパ（Cupressus macrocarpa））；ビャクシン属（Juniperus）（例えば、ユニペルス・サビオノイデス（Juniperus sabinoides）、ユニペルス・ビルギニアナ（Juniperus virginiana）、ユニペルス・コムニス（Juniperus communis）及びユニペルス・アシェイ（Juniperus ashei））；クロベ属（Thuya）（例えば、ツヤ・オリエンタリス（Thuya orientalis））；ヒノキ属（Chamaecyparis）（例えば、ヒノキ（Chamaecyparis obtusa））；ゴキブリ属（Periplaneta）（例えば、ワモンゴキブリ（Periplaneta americana））；カモジグサ属（Agropyron）（例えば、アグロピロン・レペンス（Agropyron repens））；ライムギ属（Secale）（例えば、ライムギ（Secale cereale））；コムギ属（Triticum）（例えば、コムギ（Triticum aestivum））；カモガヤ属（Dactylis）（例えば、カモガヤ（Dactylis glomerata））；ウシノケグサ属（Festuca）（例えば、ヒロハノウシノケグサ（Festuca elatlior））；イチゴツナギ属（Poa）（例えば、ナガハグサ（Poa pratensis）又はポア・コンプレサ（Poa compressa））；カラスムギ属（Avena）（例えば、エンバク（Avena sativa））；シラゲガヤ属（Holcus）（例えば、シラゲガヤ（Holcus lanatus））；ハルガヤ属（Anthoxanthum）（例えば、ハルガヤ（Anthoxanthum odoratum））；オオカニツリ属（Arrhenatherum）（例えば、オオカニツリ（Arrhenatherum elatius））；ヌカボ属（Agrostis）（例えば、コヌカグサ（Agrostis alba））；アワガエリ属（Phleum）（例えば、オオアワガエリ（Phleum pratense））；クサヨシ属（Phalaris）（例えば、クサヨシ（Phalaris arundinacea））；スズメノヒエ属（Paspalum）（例えば、パスパルム・ノタツム（Paspalum notatum））；モロコシ属（Sorghum）（例えば、ソルグム・ハレペンシス（Sorghum halepensis））；及びスズメノチャヒキ属（Bromus）（例えばコスズメノチャヒキ（Bromus inermis））。

「アレルギー」は、物質（アレルゲン）に対する後天的過敏症をいう。アレルギー性疾患には、湿疹、アレルギー性鼻炎又はコリーザ、枯草熱、気管支喘息、じんま疹及び食物アレルギー、及び他のアトピー性疾患が含まれる。

「改善する」又は「改善」は、療法を受ける被験体における障害の有害な影響又は重症度、当該技術分野で既知である手段により確定される応答の重症度の緩和を意味する。

「喘息」は炎症、気道の狭窄、及び吸入作用因子（inhaled agent）に対する気道反応性の増加により特徴付けられる呼吸器系の障害をいう。喘息は、すべてではないが、しばしばアトピー性症状又はアレルギー性症状と関連している。

「アテローム動脈硬化症」は、通常は血流を制御する血管緊張を調節する動脈壁中の幾つかの正常な血管平滑筋細胞がその性質を変化させて「癌様」挙動を発症する慢性血管損傷形態である。これらの血管平滑筋細胞は異常に増殖して炎症性成長因子に応答するようになり、次いで、組織分解酵素及び他のタンパク質を分泌し、これらが内部血管内層に侵入及び拡散することが可能となり、ここで、これらが脂肪及び炎症性デブリ（inflammatory debris）を貪食し、溶解し、そしてこのサイクルを繰り返し、それにより、血管の内部炎症内層が拡大する。この過程により、血管の直径が減少し、血流が遮断され、白血球及び血小板による完全な遮断に異常に感受性を示し、血管内皮上に過剰発現した接着分子に接着する。局所血管凝固が継続し、それにより、その動脈によって支配されている組織が死滅する。

「自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、過剰増殖性疾患、又は血管疾患」は、慢性又は急性のいずれかである当該技術分野で既知の任意の自己免疫性、炎症性、増殖性、又は過剰増殖性の疾患又は障害をいい、以下が含まれるが、これらに限定されない：関節リウマチ、再狭窄、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、真性糖尿病、ブドウ膜炎、腎炎症候群、多発性硬化症、炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬、皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹、及び脂漏症等）、外科的接着、結核症、炎症性肺疾患（喘息、塵肺、慢性閉塞性肺疾患、気腫、気管支炎、鼻ポリープ、及び肺線維症等）、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎等）、移植片拒絶、身体通路（body passageway）の閉塞に影響を及ぼすか又はその原因となる炎症性疾患（脈管炎、ウェゲナー肉芽腫症、及び川崎病等）、眼、鼻、又は喉の炎症（眼の血管新生疾患（血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後方線維増殖症、黄斑変性、角膜血管新生（角膜感染等）が含まれる）等）、免疫学的過程（移植片拒絶、スティーブン−ジョンソン症候群、アルカリによる火傷、外傷、及び（任意の原因の）炎症等）、真菌感染（例えば、カンジダ、白癬菌、ミクロスポラム属、エピデルモフィトン属（Eepidermophyton）、クリプトコッカス属、アスペルギルス属、コクシジオイデス属（Coccidiodes）、パラコクシシオデス属（Paracocciciodes）、ヒストプラズマ属、又はブラストミセス属による感染症等）、食物関連アレルギー（例えば、片頭痛、鼻炎、及び湿疹等）、血管疾患（大動脈瘤等）。炎症性疾患の記載を、ＷＯ９２／０５１７９号、ＷＯ９８／０９９７２号、ＷＯ９８／２４４２７号、ＷＯ９９／６２５１０号、及び米国特許第５，８８６，０２６号（それぞれの開示全体が本明細書中に援用される）で見出すことができる。

「血液」には、血液生成物及び血液成分等が含まれる。

「心血管疾患又は障害」は、当該技術分野で既知の任意の心血管疾患又は障害をいい、以下が含まれるが、これらに限定されない：再狭窄、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、アテローム発生、脳血管疾患、狭心症（特に、慢性狭心症、安定狭心症）、虚血性疾患、鬱血性心不全、急性心筋梗塞に関連する肺水腫、血栓症、高血圧症における高血圧又は血圧の上昇（特に、心血管外科手術に関連する高血圧）、血小板凝集、血小板接着、平滑筋細胞増殖、医療機器の使用に関連する血管又は非血管の合併症、医療機器の使用に関連する創傷、血管壁又は非血管壁の損傷、及び末梢血管疾患、及び経皮経管的冠状動脈造影法後の新生内膜過形成等。医療機器の使用に関連する合併症は、血小板の沈積、活性化、血栓形成、又は血小板及び凝固タンパク質の消費の結果として起こり得る。「心血管疾患又は障害」の定義の範囲内のこのような合併症には、例えば、心筋梗塞、肺血栓塞栓症、脳血栓塞栓症、血栓性静脈炎、血小板減少症、出血障害、及び／又は上記障害の結果として直接又は間接的に起こる任意の他の合併症が含まれる。

本明細書中で使用される、用語「脳血管疾患又は事象」は、脳硬塞若しくは卒中（血管の閉塞（blockage）又は出血に起因する）、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、失神、又は頭蓋内及び／若しくは頭蓋外動脈のアテローム性動脈硬化症等をいう。

「ケモカイン」は、多種多様な細胞により放出されて、マクロファージ、Ｔ細胞、好酸球、好塩基球、好中球及び内皮細胞を炎症及び腫瘍成長の部位へ誘引する走化性サイトカインである。２つの主な種類のケモカイン、即ちＣＸＣ−ケモカイン及びＣＣ−ケモカインが存在する。上記種類は、最初の２つのシステインが、単一アミノ酸により分離される（ＣＸＣ−ケモカイン）か、又は隣接している（ＣＣ−ケモカイン）か否かに依存する。ＣＸＣ−ケモカインとしては、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、好中球活性化タンパク質−１（ＮＡＰ−１）、好中球活性化タンパク質−２（ＮＡＰ−２）、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＩＰ−１０、ＭＩＧ及びＰＦ４が挙げられる。ＣＣケモカインとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−２β、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３及びエオタキシンが挙げられる。

本明細書中の「適合性」とは、本発明を構成する組成物の構成要素が、通常の使用条件
下で薬学的に活性な化合物の有効性を実質的に減少させる様式で相互作用することなく混合することが可能であることを意味する。

本明細書中で使用される、用語「冠状動脈事象」は、心筋梗塞、心筋血管再生手術、狭心症、心血管死、及び急性冠状動脈症候群（coronary syndrome）をいう。

「副腎皮質ステロイド」とは、コレステロールに由来することができ、且つ水素化シクロペンタノペルヒドロフェナントレン環系を特徴とする任意の天然に存在するステロイドホルモン又は合成ステロイドホルモンを意味する。天然に存在する副腎皮質ステロイドは一般的に、副腎皮質により生産される。合成副腎皮質ステロイドは、ハロゲン化され得る。活性に要される官能基としては、Δ４での二重結合、Ｃ３ケトン及びＣ２０ケトンが挙げられる。副腎皮質ステロイドは、グルココルチコイド及び／又はミネラルコルチコイド活性を有し得る。

用語「内毒素性ショック」又は「敗血症性ショック」には、グラム陰性細菌由来の内毒素の放出又はグラム陽性細菌由来のスーパー抗原の放出によって誘導される身体又は精神の障害が含まれるがこれらに限定されない。用語「敗血症性ショック」又は「敗血症」は、臨床障害をいい、その症状には、体温、心拍数、呼吸数、白血球数、高血圧症後の低血圧症（hypertension then hypotension）、器官潅流異常、及び多臓器機能障害における十分に定義された異常が含まれ得る。これは、細菌（グラム陰性又はグラム陽性のいずれか）、真菌、ウイルス、又は他の感染性刺激、及び非感染性刺激（多発外傷、重度の火傷、臓器移植、及び膵炎等）に起因するか又は関連し得る。敗血症性ショックは、一般に、「グラム陰性」内毒素−（ＬＰＳ）産生好気性桿状菌、大腸菌、肺炎桿菌、プロテウス属、緑膿菌、及びサルモネラ属に起因する。グラム陰性細菌が関与する敗血症性ショックは、「内毒素性ショック」と呼ばれる。

例示的な副腎皮質ステロイドとしては、例えば、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、二酢酸トリアムシノロン、トリアムシノロンヘキサアセトニド、べクロメタゾン、ジプロピオン酸塩、ジプロピオン酸べクロメタゾン一水和物、ピバル酸フルメタゾン、二酢酸ジフロラゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオロメトロン、酢酸フルオロメトロン、プロピオン酸クロベタゾール、デソキシメタゾン、フルオキシメステロン、フルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、ヒドロコルチゾンシピオネート、ヒドロコルチゾンプロブテート(hydrocortisone probutate)、吉草酸ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、酢酸パラメタゾン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、テブト酸プレドニゾロン、ピバル酸クロコルトロン、２１酢酸デキサメタゾン、１７吉草酸ベタメタゾン、イソフルプレドン、９−フルオロコルチゾン、６−ヒドロキシデキサメタゾン、ジクロリゾン、メクロリゾン、フルプレジデン、ドキシベタゾール、ハロプレドン、ハロメタゾン、クロベタゾン、ジフルコルトロン、酢酸イソフルプレドン、フルオロヒドロキシアンドロステンジオン、フルメタゾン、ジフロラゾン、フルオシノロン、クロベタゾール、コルチゾン、パラメタゾン、クロコルトロン、２１へミコハク酸遊離酸(21-hemisuccinate free acid)プレドニゾロン、メタスルホ安息香酸プレドニゾロン、及び２１パルミチン酸トリアンシノロンアセトニドが挙げられる。「低用量副腎皮質ステロイド」とは、炎症の治療のために患者に一般的に与えられるであろう用量よりも低い用量を意味する。例示的な低用量の副腎皮質ステロイドは、次の通りである：コルチゾール１２ｍｇ／日；コルチゾン１５ｍｇ／日；プレドニゾン３ｍｇ／日；メチルプレドニゾロン２．５ｍｇ／日；トリアメイノロン２．５ｍｇ／日；ベタメタゾン２５０μｇ／日；デキサメタゾン４５０μｇ／日；ヒドロコルチゾン９ｍｇ／日。

「シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤」は、シクロオキシゲナーゼ−１酵素と比較してシクロオキシゲナーゼ−２酵素を選択的に阻害する化合物をいう。好ましくは、その化合物は、シクロオキシゲナーゼ−２のＩＣ_５０が約０．５μＭ未満であり、シクロオキシゲナーゼ−１阻害に対するシクロオキシゲナーゼ−２阻害の選択比が少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００でもある。さらにより好ましくは、その化合物は、シクロオキシゲナーゼ−１のＩＣ_５０が約１μＭ超、より好ましくは２０μＭ超である。その化合物はまた、酵素（リポキシゲナーゼ及び／又はホスホジエスターゼ）を阻害することができる。このような好ましい選択性は、一般的なＮＳＡＩＤ誘導性副作用の発生を減少する能力を示し得る。

「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」は、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、用語「３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素阻害剤」、「ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤」、及び「スタチン」の同意語である。これらの３つの用語は、本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通して交換可能に使用される。同義語によって示唆されるように、スタチンは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素の阻害剤であり、それ自体で、血漿コレステロールレベルの低減に有効である。スタチン及びその薬学的に許容可能な塩は、哺乳類、特にヒトにおける低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルの低減に特に有用である。本明細書中における使用に適切なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤には、以下が含まれるが、これらに限定されない：シンバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン（rivastatin）、メバスタチン、フルインドスタチン（fluindostatin）、セリバスタチン、ベロスタチン（velostatin）、フルバスタチン, ダルバスタチン（dalvastatin）、ジヒドロコンパクチン（dihydrocompactin）、コンパクチン、若しくはロバスタチン、又はシンバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、フルインドスタチン、ベロスタチン、フルバスタチン、ダルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、コンパクチン、ロバスタチンの薬学的に許容可能な塩、又はその薬学的に許容可能な塩。しかし、アトルバスタチンカルシウムが本発明の組み合わせで使用すべき特に好ましいスタチンであることを留意すべきである。米国特許第５，２７３，９９５号（本明細書に参照により援用される）を参照のこと。本明細書中に開示のスタチンを、当業者に既知の方法によって調製する。具体的には、シンバスタチンを、米国特許第４，４４４，７８４号（本明細書に参照により援用される）に開示の方法に従って調製することができる。プラバスタチンを、米国特許第４，３４６，２２７号（本明細書に参照により援用される）に開示の方法に従って調製することができる。セリバスタチンを、米国特許第５，５０２，１９９号（本明細書に参照により援用される）に開示の方法に従って調製することができる。代替的に、セリバスタチンを、欧州特許出願公開番号ＥＰ６１７０１９に開示の方法に従って調製することができる。メバスタチンを、米国特許第３，９８３，１４０号（本明細書に参照により援用される）に開示の方法に従って調製することができる。ベロスタチンを、米国特許第４，４４８，７８４号及び米国特許第４，４５０，１７１号（その両方が本明細書に参照により援用される）に開示の方法に従って調製することができる。フルバスタチンを、米国特許第４，７３９，０７３号（本明細書に参照により援用される）に開示の方法に従って調製することができる。コンパクチンを、米国特許第４，８０４，７７０号（本明細書に参照により援用される）に開示の方法に従って調製することができる。ロバスタチンを、米国特許第４，２３１，９３８号（本明細書に参照により援用される）に開示の方法に従って調製することができる。ダルバスタチンを、欧州特許出願公開番号７３８５１０Ａ２に開示の方法に従って調製することができる。フルインドスタチンを、欧州特許出願公開番号３６３９３４Ａ１に開示の方法に従って調製することができる。ジヒドロコンパクチンを、米国特許第４，４５０，１７１号（本明細書に参照により援用される）に開示の方法に従って調製することができる。一定の上記スタチンが化学構造の一部として遊離カルボン酸基又は遊離アミン基のいずれかを含むと認識されるであろう。さらに、本発明の範囲内の一定のスタチンはラクトン部分を含み、ラクトン部分は遊離カルボン酸形態と平衡状態で存在する。これらのラクトンを、ラクトンの薬学的に許容可能な塩の調製によってカルボン酸塩として維持することができる。したがって、本発明は、これらのカルボン酸基又はアミン基の薬学的に許容可能な塩を含む。「薬学的に許容可能な塩」という表現には、薬学的に許容可能な酸付加塩及び薬学的に許容可能な陽イオン塩の両方が含まれる。「薬学的に許容可能な陽イオン塩」という表現は、限定されないが、アルカリ金属塩（例えばナトリウム及びカリウム）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム及びマグネシウム）、アルミニウム塩、アンモニウム塩、及びベンザチン（Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン）、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、ベネタミン（Ｎ−ベンジルフェネチルアミン）、ジエチルアミン、ピペラジン、トロメタミン（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）及びプロカイン等の有機アミンによる塩のような塩を定義するように意図される。「薬学的に許容可能な酸付加塩」という表現は、限定されないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸（メシル酸）塩及びｐ−トルエンスルホン酸（トシル酸)塩のような塩を定義するように意図される。遊離カルボン酸を含むスタチンの薬学的に許容可能な陽イオン塩は、共溶媒において遊離酸形態のスタチンを適切な塩基（通常１当量）で反応させることによって容易に調製され得る。典型的な塩基は、塩酸ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、水素化ナトリウム、カリウムメトキシド、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、ベンザチン、コリン、ジエタノールアミン、ピペラジン、及びトロメタミンである。塩は、乾燥するまでの濃縮（concentration to dryness）又は非溶媒の付加によって単離される。多くの場合、塩は酸溶液を陽イオン（エチルへキサン酸ナトリウム又はエチルへキサン酸カリウム、オレイン酸マグネシウム）の異なる塩溶液と混合すること、所望の陽イオン塩を析出する溶媒（例えば酢酸エチル）を用いることによって調製されるのが好ましく、そうでなければ、濃縮及び／又は非溶媒の付加によって単離することができる。

遊離アミン基を含むスタチンの薬学的に許容可能な酸付加塩は、遊離塩基形態のスタチンを適切な酸で反応させることによって容易に調製することができる。この塩が一塩基酸（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、酢酸塩）である場合、水素形態の二塩基酸（例えば、硫酸水素塩、コハク酸塩）、又は二水素形態の三塩基酸（例えば、二水素リン酸塩、クエン酸塩）、少なくとも１つのモルが同等、及び通常は過剰モルの酸が用いられる。しかし、硫酸塩として、ヘミコハク酸塩、水素リン酸塩、又はリン酸塩のような塩が望まれる場合、適切で正確な化学的に同等の酸が一般的に使用される。遊離塩基及び遊離酸は通常、所望の塩が析出する共溶媒で通常組み合わせられるか、又はそうでなければ非溶媒の濃縮及び／又は添加によって単離することができる。

本明細書中で使用される場合、用語「感染症」には、感染因子又は感染性生物体に起因する任意の疾患が含まれるが、これらに限定されない。感染性生物体は、ウイルス（例えば、一本鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ、Ｂ、及びＣ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ））、寄生虫（例えば、原生動物及び後生動物病原体（マラリア原虫種、リーシュマニア種、住血吸虫種、トリパノソーマ種等））、細菌（例えば、マイコバクテリア（特に、結核菌）、サルモネラ菌、連鎖球菌、大腸菌、ブドウ球菌）、真菌（例えば、カンジダ種、アスペルギルス種）、ニューモシスチス・カリニ、及びプリオンを含み得る。

感染性ウイルスの例には以下のものが含まれる：レトロウイルス科（Retrovirldae）（例えば、ＨＩＶ−Ｉ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも称される）又はＨＩＶ−ＩＩＩ；及びＨＩＶ−ＬＰ等の他の単離体等のヒト免疫不全ウイルス類）；ピコルナウイルス科（Picornaviridae）（例えば、ポリオウイルス（polio virus）類、肝炎Ａウイルス（hepatitis A virus）；エンテロウイルス（enterovirus）類；ヒトコクサッキーウイルス（human coxsackie virus）類、ライノウイルス（rhinovirus）類、エコーウイルス（echovirus）類）；カルシウイルス科（Calciviridae）（例えば、胃腸炎を起こす株）；トガウイルス科（Togaviridae）（例えば、ウマ脳炎ウイルス（equine encephalitis virus）類、風疹ウイルス（rubella virus）類）；フラビウイルス科（Flaviviridae）（例えば、デング熱ウイルス（dengue virus）類、脳炎ウイルス（encephalitis virus）類、黄熱病ウイルス（yellow fever virus）類）；コロナウイルス科（Coronaviridae）（例えば、コロナウイルス（coronavirus）類）；ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）（例えば、水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus）類、狂犬病ウイルス（rabies virus）類）；フィロウイルス科（Filoviridae）（例えば、エボラウイルス（ebola virus）類）；パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）（例えば、パラインフルエンザウイルス（parainfluenza virus）類、流行性耳下腺炎ウイルス（mumps virus）、麻疹ウイルス（measles virus）、呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial virus））；オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）（例えば、インフルエンザウイルス（influenza virus）類）；ブンガウイルス科（Bungaviridae）（例えば、ハンターンウイルス（Hantaan virus）類、ブンガウイルス（bunga virus）類、フレボウイルス（phlebovirus）類及びナイロウイルス（Nairo virus）類）；アレナウイルス科（Arena viridae）（出血性熱ウイルス（hemorrhagic fever virus）類）；レオウイルス科（Reoviridae）（例えば、レオウイルス（reovirus）類、オルビウイルス（orbivirus）類及びロタウイルス（rotavirus）類）；ビルナウイルス科（Birnaviridae）；ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）（肝炎Bウイルス（Hepatitis B virus））；パルボウイルス科（Parvoviridae）（パルボウイルス（parvovirus）類）；パポバウイルス科（Papovaviridae）（パピローマウイルス（papilloma virus）類、ポリオーマウイルス（polyoma virus）類）；アデノウイルス科（Adenoviridae）（大部分のアデノウイルス（adenovirus）類）；ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）（単純疱疹ウイルス（herpes simplex virus （HSV））１及び２、水痘−帯状疱疹ウイルス（varicelia zoster virus）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus（CMV））、疱疹ウイルス（herpes virus）類）；ポックスウイルス科（Poxviridae）（痘瘡ウイルス（variola virus）類、ワクシニアウイルス（vaccinia virus）類、ポックスウイルス（pox virus）類）；及びイリドウイルス科（Iridoviridae）（例えば、ブタコレラウイルス（African swine fever virus））；及び分類されないウイルス（例えば、スポンジ型脳症（Spongiform encephalopathy）の病因病原体、デルタ肝炎の病原体（肝炎Ｂウイルスの不完全付随体と考えられている）、非Ａ、非Ｂ肝炎の病原体（１型＝経口感染、２型＝非経口感染（すなわち、肝炎Ｃ））；ノーウォーク（Norwalk）及び関連ウイルス、及びアストロウイルス（astrovirus）類）。

感染性細菌の例には以下のものが含まれる：ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyloris）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borelia burgdorferi）、レジュネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophilia）、ミコバクテリウム（Mycobacteria）種（例えば、結核菌（M．tuberculosis）、トリ結核菌（M．avium）、Ｍ．イントラセルラレ（M．intracellulare）、Ｍ．カンサイ（M．kansaii）、Ｍ．ゴルドナイ（M．gordonae））、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコックス・アガラクティアイ（Streptococcus agalactiae）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（Streptococcus）（ヴィリダンス群（viridans group））、糞便連鎖球菌（Streptococcus faecalis）、ストレプトコックス・ボビス（Streptococcus bovis）、連鎖球菌（Streptococcus）（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、病原性カンピロバクター（Campylobacter）種、腸球菌（Enterococcus）種、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、炭疽菌（Bacillus antracis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）種、ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、パスツレラ・ムルトチダ（Pasturella multocida）、バクテロイド（Bacteroides）種、フゾバクテリウム・ヌタレアツム（Fusobacterium nucleatum）、ストレプトバチラス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidium）、フランベジアトレポネーマ（Treponema pertenue）、レプトスピラ属（Leptospira）及びイスラエル放線菌（Actinomyces israelli）。

感染性真菌の例には以下のものが含まれる：クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、クラジミア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）。他の感染性生物（すなわち原生動物）には：熱帯性マラリア原虫（Plasmodium falciparum）及びトキソプラズマ・ゴンジ（Toxoplasma gondii）が含まれる。

「炎症性疾患又は障害」は、虚血器官への再灌流障害、心筋梗塞、炎症性腸疾患、関節リウマチ、骨関節炎、高血圧症、乾癬、臓器移植拒絶、臓器保存、女性又は男性の性機能障害、放射線誘発損傷、喘息、アテローム性動脈硬化症、血栓症、血小板凝集、再狭窄、転移、インフルエンザ、失禁、卒中、バム（bum）、 外傷、急性膵炎、腎盂腎炎、肝炎、自己免疫疾患、免疫障害、老人性痴呆症、インスリン依存性糖尿病、播種性血管内凝固、脂肪塞栓症、アルツハイマー病、成人又は乳児の呼吸器疾患、発癌、又は新生児出血をいう。

本明細書中で使用される場合、「炎症応答」は、発赤、高熱、腫脹及び疼痛（すなわち、炎症）によって特徴付けられ、典型的には、組織の損傷又は破壊に関与する。炎症応答は通常、組織の損傷又は破壊によって誘発される局在化した防御的応答であり、有害物質及び損傷組織の両方を破壊するか、希釈するか、囲む（封鎖する）働きをする。炎症応答は、白血球の流入及び／又は白血球（例えば、好中球）の走化性に顕著に関連する。炎症応答は、病原性生物及びウイルスの感染、非感染性手段（外傷又は心筋梗塞又は卒中後の再潅流、外来抗原に対する免疫応答、及び自己免疫疾患等）に起因し得る。本発明の方法及び化合物を使用した治療に従う炎症応答は、特定の防御システムの反応に関連する状態及び非特異的防御システムの反応に関連する状態を含む。

「ナイアシン」には、ナイアシンアミド、ナイアシン、及びナイアシンエステルの誘導体のような薬剤が含まれる。このような例としては、サリチル酸ナイアシンアミド、リポ酸ナイアシンアミド、マンデル酸ナイアシンアミド、乳酸ナイアシンアミド、グリコール酸ナイアシンアミド、リンゴ酸ナイアシンアミド、アデノシンリン酸ナイアシンアミド、三リン酸ナイアシンアミド、アスコルビン酸ナイアシンアミド、葉酸ナイアシンアミド、ヒドロキシクエン酸ナイアシンアミド、ヒドロキシテトロン酸ナイアシンアミド、パントテン酸ナイアシンアミド、サリチル酸ナイアシン、リポ酸ナイアシン、マンデル酸ナイアシン、乳酸ナイアシン、グリコール酸ナイアシン、リンゴ酸ナイアシン、アデノシンリン酸ナイアシン、アデノシン三リン酸ナイアシン、アスコルビン酸ナイアシン、葉酸ナイアシン、ヒドロキシクエン酸ナイアシン、パントテン酸ナイアシン、ヒドロキシテトロン酸ナイアシン、ベンジルニコチン酸リポ酸（ベンジルリポ酸ナイアシン）、メチルニコチン酸リポ酸（メチルリポ酸ナイアシン）、ベンジルアスコルビン酸ナイアシン、メチルアスコルビン酸ナイアシン、ベンジルサリチル酸ナイアシン、メチルサリチル酸ナイアシン、ベンジルパントテン酸ナイアシン、メチルパントテン酸ナイアシン、ベンジル乳酸ナイアシン、メチル乳酸ナイアシン、ベンジルリンゴ酸ナイアシン、メチルリンゴ酸ナイアシン、ラウリルリポ酸ナイアシン、ラウリルアスコルビン酸ナイアシン、ラウリルサリチル酸ナイアシン、ラウリル乳酸ナイアシン、メチルグリチルリチン酸ナイアシン、グリチルリチン酸ナイアシンアミド、グリチルリチン酸ナイアシンアミド、ヒアルロン酸ナイアシンアミド、ピロリドンカルボン酸ナイアシンアミド、ベンジルヒアルロン酸ナイアシン、ベンジルピロリドンカルボン酸ナイアシン、ヒドロキノンカルボン酸ナイアシンアミド、ヒドロキノンカルボン酸ナイアシン、メチルヒドロキノンカルボン酸ナイアシン、ベンジルヒドロキノンカルボン酸ナイアシン、ラウリルヒドロキノンカルボン酸ナイアシン、メチルウルソル酸ナイアシン、ラウリルウルソル酸ナイアシン、ベンジルウルソル酸ナイアシン、エラグ酸ナイアシンアミド、ロスマリン酸ナイアシンアミド、クロロゲン酸（chloroginate）ナイアシンアミド、メチルエラグ酸ナイアシン、メチルクロロゲン酸ナイアシン、ラウリルエラグ酸、ラウリルクロロゲン酸、ラウリルロスマリン酸、及びメチルロスマリン酸ナイアシンが挙げられるが、これらに限定されない。

「ＮＳＡＩＤ」は、非ステロイド系抗炎症化合物又は非ステロイド系抗炎症薬をいう。ＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ（プロスタグランジンの生合成を担う酵素）を阻害し、一定のオータコイド（autocoid）阻害剤（シクロオキシゲナーゼ（シクロオキシゲナーゼ−１及び−２が含まれるが、これらに限定されない）の種々のイソ酵素の阻害剤が含まれる）、並びにシクロオキシゲナーゼ及びリポキシゲナーゼの両方の阻害剤である。

「患者」という用語は本明細書中で使用する場合、本発明の化合物、組成物及び方法による治療から利益を享受し得る任意の哺乳類、動物又はヒト被験体を包含すると意図され、未成年者及び成人を含む。

「薬学的に許容可能な」は、本明細書中で定義される薬学的組成物及び方法で使用される薬学的に活性な化合物及び他の成分が、合理的な有益性／危険性の比に相応して、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等を伴わずにヒト及び下等動物の組織と接触させた使用に適切であることを意味するものとする。

「ホスホジエステラーゼ阻害剤」又は「ＰＤＥ阻害剤」は、酵素ホスホジエステラーゼを阻害する任意の化合物をいう。この用語は、環状グアノシン３'，５'−ホスホジエステラーゼ一リン酸（ｃＧＭＰ−ＰＤＥ）及び環状アデノシン３'，５'−ホスホジエステラーゼ一リン酸（ｃＡＭＰ−ＰＤＥ）の選択的又は非選択的な阻害剤をいう。

「α−アドレナリン受容体アンタゴニスト」は、任意のα−アドレナリン受容体の活性化を可逆的又は不可逆的に遮断する任意の化合物をいう。

「ホスホキナーゼ阻害剤」は、ホスホキナーゼを阻害する任意の化合物をいい、キナーゼリン酸化Ｓｔａｔ、ウイルス活性化キナーゼ、タモキシフェン、ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）、並びにセリンキナーゼの阻害剤（イソペンテニルアデニン、６−ジメチルアミノプリン、オロモウシン、ロスコビチン、ＣＶＴ−３１３、プルバノール（purvanol）、ブチロラクトン−Ｉ、フラボピリドール、スタウロスポリン、インジルビン、ヒメニアルデシン（hymenialdesine）、及びパウロン（paullone）が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。

「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素若しくは他の化学物質の作用及び／又は条件により身体又はそれらの細胞内で活性形態（即ち、薬物）へ変換される不活性形態で調製される治療剤を示す。

「呼吸器疾患又は障害」は、任意の肺機能障害（例えば、急性肺血管収縮、肺炎、外傷、呼吸若しくは吸入損傷（aspiration or inhalation injury）、肺の脂肪塞栓症、アシドーシス、肺炎、成人呼吸窮迫症候群、急性肺水腫、急性高山病、喘息、心臓手術後急性肺高血圧症、新生児持続性肺高血圧症、周産期呼吸症候群（perinatal aspiration syndrome）、ヒアリン膜症、急性肺血栓塞栓症、ヘパリン−プロタミン反応、敗血症、喘息、喘息発作重積状態、若しくは低酸素症(片側肺麻酔中に起こり得るものが含まれる)、慢性肺血管収縮、慢性肺高血圧症、気管支肺異形成、慢性肺血栓塞栓症、特発性若しくは原発性肺高血圧症、又は慢性低酸素症が含まれる）をいう。

本明細書中で使用される場合、「安全且つ有効な量」は、ＴＬＲ媒介性疾患の発現及び関連病態を阻害するために十分な、薬学的に活性な化合物の量を意味する。一実施形態では、「安全且つ有効な量」は、異常なＭｙＤ８８依存性シグナル伝達及びＭｙＤ８８非依存性シグナル伝達に関与するＴＬＲ３、ＴＬＲ４、又はＴＬＲ媒介性疾患の発現及び関連病態、最も好ましくはＩＲＦ−３、１型ＩＦＮ、ＳＴＡＴ、ＩＲＦ−１、及びＩＳＲＥの増加又は活性化を増加させる異常なＭｙＤ８８非依存性シグナル伝達に関与するＴＬＲ３、ＴＬＲ４、又はＴＬＲ媒介性疾患の発現及び関連病態を阻害するために十分な、薬学的に活性な化合物の量を意味する。正常な医学的判断の範囲内で、治療上有効な量の薬学的活性因子又は活性因子を含む薬学的組成物は、治療される状態の重症度、治療の持続時間、補助治療の性質、患者の年齢及び身体の状態、及び使用する特定の活性化合物等によって変化するであろう。以下でより完全に考察を行った。特定の化合物についての「安全且つ有効な量」に到達するために、これらのリスクを考慮しなければならない。

本明細書中で使用される場合、「治療薬」は、障害又は病的生理学的状態の防止又は治療に有用な作用因子をいう。治療薬には、プロドラッグ及びその薬学的誘導体（対応するニトロソ化誘導体及び／又はニトロシル化誘導体が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。

「治療上有効な量」は、その意図する目的を達成するために有効な化合物及び／又は組成物の量をいう。

「トール様受容体」又は「ＴＬＲ」は、その細胞外ドメインにおける反復したロイシンが豊富なモチーフ及びトール／ＩＬ１受容体（ＴＩＲ）ドメインと呼ばれる保存領域を含有する細胞質側末端を含有するＩ型膜貫通タンパク質である。少なくとも１０個の哺乳類ＴＬＲタンパク質、即ちトール様受容体１〜１０が同定されている。ＴＬＲは、微生物又は有害な環境因子を検知することにより侵入病原体に対する初期先天免疫性において重要な役割を果たす。これらの進化的に保存された受容体（ショウジョウバエトール遺伝子のホモログ）は、病原体関連微生物パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる微生物病原体によって発現される高度に保存された構造モチーフ及び有害因子又は組織障害による組織損傷のセンス産物（例えば、ｄｓＲＮＡ）を認識する。ＰＡＭＰは、リポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、及びリポペプチド等の様々な細菌細胞壁構成成分、並びにフラゲリン、細菌ＤＮＡ及びウイルス二重鎖ＲＮＡを包含する。したがって、ＴＬＲは、病原性生物の産物に応答して「先天免疫」応答を発生することにより、ウイルス、細菌、寄生因子（parasitic agent）、又は真菌等の病原性生物及び組織障害から哺乳類を防御する。したがって、これらは、細胞を破壊し、ＴＬＲと相互作用することができるｄｓＲＮＡ又は他のＰＡＭＰを放出する有害環境因子から動物をさらに防御することができる。先天免疫応答は、幾つかの炎症性サイトカイン、ケモカイン、及び補助刺激分子をコードする遺伝子の増大をもたらし、抗原特異的適応免疫性の発生に重要である。ＰＡＭＰによるＴＬＲの刺激は、多数のタンパク質（ＭｙＤ８８及びＩＲＡＫ１等）を包含するシグナル伝達カスケードを開始させる。このシグナル伝達カスケードは、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦα及びＩＬ−１β等）及び適応免疫応答を指示するエフェクターサイトカインの分泌を誘導する転写因子ＮＦ−κＢの活性化を招く。シグナル伝達カスケードは、さらに、１型ＩＦＮ産生を増加させ、Ｓｔａｔを活性化し、ＩＲＦ−１遺伝子発現を増加させ、ＩＳＲＥ、インターフェロン応答因子（ＩＲＦ）要素を活性化するようにＩＲＦ−３経路にシグナル伝達することができるＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１等のアダプターを含む。ウイルスの場合、ｄｓＲＮＡ又はその複製を有する一本鎖ＲＮＡの注入により、ウイルスキナーゼを活性化し、ＴＬＲを迂回し、ＰＫＲ及びＩＲＦ−３を活性化し、ＮＦ−κＢ及び１型ＩＦＮカスケードを開始することができ、１型ＩＦＮのオートクリン／パラクリン作用により、サイトカイン及びケモカインは先天性免疫−適応的免疫応答系列（sequence）を開始することができる。

「移植拒絶」は、臓器又は組織の移植片拒絶、同種移植片拒絶、移植片対宿主疾患を引き起こす任意の臓器又は身体部分の移植物（transplant）（心臓、腎臓、肝臓、肺、骨髄、角膜、及び皮膚の移植物が含まれるが、これらに限定されない）をいう。

「治療する」、「治療すること」、「治療」及び「療法」は本明細書中で使用する場合、被験体のための任意の治癒的療法、予防的的療法、改善的療法及び防止的療法をいう。

「血管作用薬」は、血管及び／又は非血管平滑筋を弛緩することができる任意の治療薬をいう。適切な血管作用薬には、カリウムチャネル活性化薬、カルシウムチャネル遮断薬、β遮断薬、長時間作用型及び短時間作用型のα−アドレナリン受容体アンタゴニスト、プロスタグランジン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシン、麦角アルカロイド、血管作用性腸管ペプチド、ドーパミンアゴニスト、オピオイドアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、及びトロンボキサン阻害剤等が含まれるが、これらに限定されない。

「ウイルス感染」は、ＲＮＡウイルス感染及びＤＮＡウイルス感染の両方をいう。ＲＮＡウイルス感染には、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、ラブドウイルス科、コロナウイルス科（Coronavaridae）、トガウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、及びレトロウイルス科（Reteroviridae）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡウイルス感染には、アデノウイルス科、プロポキシウイルス科（proxviridae）、パポバウイルス科、ヘルペトウイルス科（Herpetoviridae）、及びヘルペスウイルス科が含まれるが、これらに限定されない。１つの特定の実施形態では、ウイルス感染には、二本鎖又は一本鎖ＲＮＡウイルス（インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、エンテロウイルス、及びコクサッキーウイルス）、ヘルペトウイルス科のウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（Herpes varicella-zoster）（ＶＺＶ）、エプスタイン・バール(ＥＢＶ)、ＨＨＶ６、ＨＨＶ７、仮性狂犬病、及び鼻気管炎等が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図せず、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるとも理解すべきである。

本明細書中及び添付の特許請求の範囲中で使用される場合、単数形「一つの（ａ）」、「一つの（and）」、及び「その（the）」には、他に明確に記述されていない限り、複数形が含まれる。他に定義されていない限り、本明細書において使用されている全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと類似又は均等な任意の方法、装置、及び材料を本発明の実施又は試験で使用することができるが、好ましい方法、装置、及び材料をここに記載する。

本発明は、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４媒介性疾患並びに関連病態の治療に関する。本発明は、ＴＬＲ３媒介性疾患（橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、及び膵島炎が含まれるが、これらに限定されない）の治療に関する。本発明は、ＴＬＲ４媒介性疾患（毒素ショック、アテローム性動脈硬化症、高脂血症に関連する血管疾患、潰瘍性大腸炎、及びクローン病が含まれるが、これらに限定されない）の治療に関する。本発明はまた、ＴＬＲ媒介性疾患及び関連病態（例えば、ＴＬＲ９（ＩＲＦ−３／Ｉ型ＩＦＮシグナル経路の活性化に関与するＭｙＤ８８非依存性シグナル伝達の病的発現に関与する）（全身性狼瘡及び関節リウマチが含まれるが、これらに限定されない疾患等））に関する。

本発明は、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるＴＬＲ３及びＴＬＲ４媒介性疾患並びに関連病態の治療に関する。本発明は、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるＴＬＲ３媒介性疾患（橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、及び膵島炎が含まれるが、これらに限定されない）の治療に関する。本発明は、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるＴＬＲ４媒介性疾患（毒素ショック、アテローム性動脈硬化症、高脂血症に関連する血管疾患、潰瘍性大腸炎、及びクローン病が含まれるが、これらに限定されない）の治療に関する。

本発明は、ＩＲＦ−３、１型ＩＦＮ、ＳＴＡＴ、及びＩＲＦ−１シグナル伝達が異常なＴＬＲ媒介性疾患及び関連病態の治療に関する。したがって、本発明は、ＴＬＲ媒介性疾患（この経路を介して異常なＴＬＲシグナル伝達が起こるグレーブス病、全身性狼瘡、関節リウマチ、自己免疫性ブドウ膜炎、及び乾癬が含まれるが、これらに限定されない）の治療に関する。

本発明は、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるＩＲＦ−３、１型ＩＦＮ、ＳＴＡＴ、及びＩＲＦ−１シグナル伝達が異常なＴＬＲ媒介性疾患及び関連病態の治療に関する。したがって、本発明は、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるＴＬＲ媒介性疾患（この経路を介して非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞に異常なＴＬＲシグナル伝達が起こるグレーブス病、全身性狼瘡、関節リウマチ、自己免疫性ブドウ膜炎、及び乾癬が含まれるが、これらに限定されない）の治療に関する。

本発明はまた、細胞に侵入して異常なＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−３、１型ＩＦＮ、ＳＴＡＴ、及びＩＲＦ−１シグナル伝達を引き起こすウイルス又は有害因子によって誘導される、異常なトール様受容体３又はＴＬＲ４の発現又はシグナル伝達によって誘導される自己免疫性炎症疾患に関連する状態又は障害及び血清中の１型ＩＦＮレベルが増加した疾患によって例示される関連病態を有する被験体の治療に関する。

本発明はまた、細胞に侵入して異常なＩＲＦ−３、１型ＩＦＮ、ＳＴＡＴ、及びＩＲＦ−１シグナル伝達のＴＬＲ媒介性発現を引き起こす感染性因子又は有害因子の食作用によって引き起こされる、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞における異常なトール様受容体の発現又はシグナル伝達によって誘導される自己免疫性炎症疾患に関連する疾患又は状態及び血清中の１型ＩＦＮレベルが増加した疾患によって例示される関連病態を有する被験体の治療に関する。

本発明はまた、細胞に侵入して異常なＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−３、１型ＩＦＮ、ＳＴＡＴ、及びＩＲＦ−１シグナル伝達を引き起こすウイルス又は有害因子によって誘導される、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞における異常なトール様受容体３又はＴＬＲ４の発現又はシグナル伝達によって誘導される自己免疫性炎症疾患に関連する疾患又は状態及び血清中の１型ＩＦＮレベルが増加した疾患によって例示される関連病態を有する被験体の治療に関する。

本発明はまた、細胞に侵入して異常なＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−３、１型ＩＦＮ、ＳＴＡＴ、及びＩＲＦ−１シグナル伝達を引き起こす感染性因子又は有害因子の食作用によって引き起こされる、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞における異常なトール様受容体の発現又はシグナル伝達によって誘導される自己免疫性炎症疾患に関連する疾患又は状態及び血清中の１型ＩＦＮレベルが増加した疾患によって例示される関連病態を有する被験体の治療に関する。

本発明はまた、細胞に侵入して異常なＩＲＦ−３、１型ＩＦＮ、ＳＴＡＴ、及びＩＲＦ−１シグナル伝達を引き起こすウイルス又は有害因子によって誘導される、異常なトール様受容体３又はＴＬＲ４の発現又はシグナル伝達によって誘導される自己免疫性炎症疾患に関連する疾患又は状態及び血清中の１型ＩＦＮレベルが増加した疾患によって例示される関連病態を有する被験体の治療に関する。

本発明はまた、トール様受容体３又はトール様受容体４の過剰発現、活性化、及びシグナル伝達又はその両方を媒介するか又はこれらに関連する病変を防止、改善、又は阻害することができる本発明のメチマゾール（ＭＭＩ）、フェニルメチマゾール、及び互変異性環状チオン化合物、並びにそれらの活性誘導体から選択される治療上有効な量の１つ又は複数の化合物をこのような治療を必要とする患者に投与することを含む、このような疾患を治療する方法を提供する。

本発明は、治療上有効な量の量のフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体、及び／又は互変異性環状チオン化合物を投与することを含む、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４媒介性自己免疫性炎症応答を阻害する方法を提供する。免疫応答は、炎症応答であり得る。免疫応答は、白血球応答であり得る。より具体的には、免疫応答には、以下のうちの１つ又は複数が含まれ得る：有向白血球遊走、白血球スーパーオキシド産生、白血球脱顆粒（好中球エラスターゼエクソサイトーシスが含まれるが、これらに限定されない）、及び白血球遊出、及び／又は白血球溢出。白血球を、好中球、好酸球、好塩基球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、及びマスト細胞から成る群から選択することができる。本明細書中で使用される場合、「内因性因子」は、宿主細胞（例えば、治療される個体の細胞）によって合成される生成物と定義される。代表的な内因性因子には、以下が含まれるが、これらに限定されない：腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、補体因子Ｃ３ａ、補体因子Ｃ５ａ、ケモカインＣＸＣＬ１、ケモカインＣＸＣＬ２、ケモカインＣＸＣＬ３、ケモカインＣＸＣＬ４、ケモカインＣＸＣＬ５、ケモカインＣＸＣＬ６、ケモカインＣＸＣＬ７、インターロイキン１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン（ＩＬ−１５）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、プロスタグランジン、単球化学走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、ケモカインＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、マクロファージ炎症タンパク質−１−α（ＭＩＰ−１−α）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、エオタキシン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、ロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）、ロイコトリエンＤ４（ＬＴＤ４）、ロイコトリエンＥ４（ＬＴＥ４）、リポキシン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、及びリゾリン脂質。

本発明を治療する方法には、炎症細胞活性化に関連する状態の改善方法が含まれる。「炎症細胞活性化」は、増殖性細胞応答の刺激（サイトカイン、抗原、又は自己抗体が含まれるが、これらに限定されない）による誘導、可溶性メディエーター（サイトカイン、活性酸素、酵素、プロスタノイド、増殖因子、又は血管作動性アミンが含まれるが、これらに限定されない）の産生、炎症細胞（単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、顆粒球（好中球、好塩基球、及び好酸球が含まれる多形核白血球）、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、又は抗原提示細胞になる非免疫細胞（平滑筋細胞、血管内皮細胞、又は上皮細胞が含まれるが、これらに限定されない）における新規又は増加したメディエーター（主要組織適合性抗原又は細胞接着分子が含まれるが、これらに限定されない）の細胞表面発現をいう。これらの細胞中のこれらの表現型の１つ又は組み合わせの活性化が炎症状態の開始、永続化、又は悪化に寄与し得ることが当業者に認識されるであろう。

したがって、種々の実施形態では、本発明は、種々の炎症状態（関節炎（関節リウマチ（ＲＡ）、骨関節炎、痛風性関節炎、脊椎炎、及び反応性関節炎等）が含まれるが、これらに限定されない）；ベーチェット症候群；敗血症；敗血症性ショック；内毒素ショック；グラム陰性敗血症；グラム陽性敗血症；毒素性ショック症候群；敗血症、外傷、又は出血に続発する多臓器傷害症候群；眼科障害（アレルギー性結膜炎、春季カタル、ブドウ膜炎、眼瞼炎、及び甲状腺関連眼症が含まれるが、これらに限定されない）；好酸球性肉芽腫；肺又は呼吸性の状態（喘息、慢性気管支炎、アレルギー性鼻炎、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、慢性肺炎（例えば、慢性閉塞性肺疾患）、ケイ肺症、肺サルコイドーシス、胸膜炎、胞隔炎、血管炎、肺炎、気管支拡張症、遺伝性肺気腫、及び肺の酸素中毒が含まれるが、これらに限定されない）；例えば、心筋、脳、又は四肢の虚血性再灌流傷害；線維症を引き起こす炎症（嚢胞性線維症が含まれるが、これらに限定されない）；ケロイド形成又は瘢痕組織形成を引き起こす炎症；アテローム性動脈硬化症を引き起こす炎症；自己免疫性炎症性疾患（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症、幾つかの糖尿病型、及びレイノー症候群が含まれるが、これらに限定されない）；組織又は臓器移植拒絶障害（移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び同種移植片拒絶が含まれるが、これらに限定されない）；慢性又は急性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、壊死性腸炎、及び限局性腸炎が含まれるが、これらに限定されない）；炎症性皮膚炎（接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、及びじん麻疹が含まれるが、これらに限定されない）；感染症に起因する発熱及び筋肉痛；中枢神経系又は末梢神経系の炎症状態（髄膜炎（例えば、急性化膿性髄膜炎）、脳炎、及び軽度の外傷に起因する脳又は脊髄の損傷が含まれるが、これらに限定されない）；シェーグレン症候群；白血球血管外漏出に関与する疾患；アルコール性肝炎；細菌性肺炎；市中肺炎（ＣＡＰ）；ニューモシスチス（neumocystis）カリニ肺炎（ＰＣＰ）；抗原抗体複合体媒介性疾患；血液量減少性ショック；Ｉ型糖尿病；急性及び遅延型過敏症；白血球悪液質及び転移に起因する病状；熱傷；顆粒球輸血関連症候群；サイトカイン誘発毒性；卒中；膵炎；心筋梗塞、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症；脊髄損傷；１型及び２型糖尿病、高脂血症、及び高血圧の心血管合併症；並びに糖尿病の大血管又は微小血管合併症（腎症、神経障害、網膜症が含まれるが、これらに限定されない））を治療する方法を提供する。

本発明は、全ての型、病因、若しくは発症の喘息又はアトピー性喘息、非アトピー性喘息、アレルギー喘息、アトピー性気管支ＩｇＥ媒介性喘息、気管支喘息、体質性喘息、真性喘息（true asthma）、病態生理学的障害に起因する内因性喘息、環境因子に起因する外因性喘息、未知又は明らかでない原因の体質性喘息、非アトピー性喘息、気管支喘息、気腫性喘息、運動誘発性喘息、職業性喘息、細菌、真菌、原生動物、又はウイルスの感染に起因する感染性喘息、非アレルギー喘息、初期喘息、及び呼吸困難乳児症候群（wheezy infant syndrome）、慢性若しくは急性気管支炎、小気道閉塞、及び気腫から成る群から選択される喘息、全ての型、病因、若しくは発症の閉塞性又は炎症性気道疾患、又は喘息、塵肺、慢性好酸球性肺炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎を含むＣＯＰＤ、ＣＯＰＤに関連する肺気腫若しくは呼吸困難、不可逆性進行性気道閉塞によって特徴付けられるＣＯＰＤ、成人呼吸急迫症候群（ＡＲＤＳ）、及び他の薬物療法の結果としての気道過反応の増悪から成る群から選択される閉塞性又は炎症性気道疾患、全ての型、病因、若しくは発症の塵肺又はアルミニウム肺症又はボーキサイト労働者の疾患、炭粉沈着症又は炭鉱作業員喘息、石綿症又は蒸気管工事人の喘息、石粉症又は火打ち症、ダチョウの羽由来の埃の吸入に起因するダチョウ肺塵症、鉄粒子の吸入に起因する鉄沈着症、ケイ肺症又は塵埃症、綿肺小又は綿塵喘息（cotton-dust asthma）、及び滑石肺から成る群から選択される塵肺、全ての型、病因、若しくは発症の気管支炎、又は急性気管支炎、急性咽頭気管気管支炎、アラキン酸気管支炎、カタル性気管支炎、クループ性気管支炎、乾性気管支炎、感染性喘息性気管支炎、湿性気管支炎（productive bronchitis）、ブドウ球菌性気管支炎、又は連鎖球菌性気管支炎、及び肺胞性気管支炎から成る群から選択される気管支炎、全ての型、病因、若しくは発症の気管支拡張症、又は円柱状気管支拡張症、小嚢気管支拡張症、紡錘状気管支拡張症（fusiform bronchiectasis）、毛管状気管支拡張症（capillary bronchiectasis）、嚢状気管支拡張症、乾性気管支拡張症、及び濾胞状気管支拡張症（follicular bronchiectasis）から成る群から選択される気管支拡張症、全ての型、病因、若しくは発症の季節性アレルギー性鼻炎、通年性アレルギー性鼻炎、又は副鼻腔炎、又は化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、及び篩骨、前頭、上顎骨、又は蝶形骨の副鼻腔炎から成る群から選択される副鼻腔炎、全ての型、病因、若しくは発症の関節リウマチ、又は急性関節炎, 急性痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、及び椎骨関節炎から成る群から選択される関節リウマチ、炎症に関連する通風、熱、及び疼痛、全ての型、病因、若しくは発症の好酸球関連病理学的障害、又は好酸球増加症、肺浸潤性好酸球増加症、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増多症、気管支肺炎性アスペルギルス症、アスペルギルス腫、好酸球を含む肉芽腫、アレルギー性肉芽腫性血管炎（angijtis）若しくはチャーグ・ストラウス症候群、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）、及び全身性壊死性血管炎から成る群から選択される好酸球関連病理学的障害、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、又はアレルギー性若しくはアトピー性湿疹、全ての型、病因、若しくは発症のじんま疹、又は免疫媒介性じんま疹、補体媒介性じんま疹、じんま疹発生物質誘導性じんま疹、物理的刺激誘導性じんま疹、ストレス誘導性じんま疹、特発性じんま疹、急性じんま疹、慢性じんま疹、血管浮腫、コリン作動性じんま疹、寒冷じんま疹（常染色体優性型又は後天型）、接触性じんま疹、巨大じんま疹、及び丘疹性じんま疹から成る群から選択されるじんま疹、全ての型、病因、若しくは発症の結膜炎、又は光線性結膜炎、急性カタル性結膜炎、急性伝染性結膜炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性結膜炎、慢性カタル性結膜炎、化膿性結膜炎、及び春季カタルから成る群から選択される結膜炎、全ての型、病因、若しくは発症のブドウ膜炎、又はブドウ膜の全部又は一部の炎症、前部ブドウ膜炎、虹彩炎、毛様体炎、虹彩毛様体炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性（phacoantigenic）ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、脈絡膜炎、及び脈絡網膜炎から成る群から選択されるブドウ膜炎、乾癬、全ての型、病因、若しくは発症の多発性硬化症、又は一次性進行型多発性硬化症及び再発性弛張性多発性硬化症から成る群から選択される多発性硬化症、全ての型、病因、若しくは発症の自己免疫性／炎症性疾患、又は自己免疫性血液疾患、溶血性貧血、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、硬化症、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、内分泌眼病（endocrin opthamopathy）、グレーブス病、サルコイドーシス、胞隔炎、慢性過敏性肺炎、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病又は糖尿病1型、前部ブドウ膜炎、肉芽腫性又は後部ブドウ膜炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、びまん性間質性肺線維症又は間質性肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、乾癬性関節炎、ネフローゼ症候群を伴う糸球体腎炎及び伴わない糸球体腎炎、急性糸球体腎炎、特発性ネフローゼ症候群、微小変化型ネフローゼ、炎症性／高増殖性（hyperproliferative）皮膚疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、良性家族性天疱瘡、紅斑性天疱瘡、落葉状天疱瘡、及び尋常性天疱瘡から成る群から選択される自己免疫性／炎症性疾患、臓器移植後の外来移植物拒絶の防止、全ての型、病因、若しくは発症の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、コラーゲン形成大腸炎、ポリープ様大腸炎、全層性大腸炎、及びクローン病（ＣＤ）から成る群から選択される炎症性腸疾患、全ての型、病因、若しくは発症の敗血症性ショック、又は腎不全、急性腎不全、悪液質、マラリア性悪液質、下垂体悪液質、尿毒症性悪液質、心臓性悪液質、悪液質性副腎機能亢進若しくはアジソン病、癌性悪液質、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染の結果としての悪液質から成る群から選択される敗血症性ショック、肝臓損傷、肺高血圧及び低酸素症誘導性肺高血圧、骨量低下疾患、原発性骨粗鬆症、及び続発性骨粗鬆症、全ての型、病因、若しくは発症の中枢神経系の病理学的障害、又は抑うつ、パーキンソン病、学習障害及び記憶障害、遅発性ジスキネジア、薬物依存、動脈硬化性認知症、及びハンチントン舞踏病を伴う認知症、ウィルソン病、振戦麻痺、及び視床萎縮症から成る群から選択される中枢神経系の病理学的障害；感染症、特にウイルス感染症（これらのウイルスは、その宿主中でのＴＮＦ−αの産生を増加させ、これらのウイルスは、その複製又は他の生命活動に負の影響を及ぼすようにその宿主中のＴＮＦ−αの上方制御に感受性を示し、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びＨＩＶ−３、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、アデノウイルス、及びヘルペスウイルス（帯状疱疹及び単純ヘルペスが含まれる）から成る群から選択されるウイルスが含まれる）、酵母及び真菌感染症（例えば、真菌性髄膜炎）（これらの酵母及び真菌は、特に、全身性酵母及び真菌感染の治療のために選択された他の薬物（ポリマイシン（例えば、ポリマイシンB）、イミダゾール（例えば、クロトリマゾール、エコナゾール、ミコナゾール、及びケトコナゾール）、トリアゾール（例えば、フルコナゾール及びイトラナゾール（itranazole）、及びアンホテリシン（例えば、アムホテリシンＢ及びリポソームアムホテリシンＢが含まれるが、これらに限定されない）と併せて投与した場合、その宿主におけるＴＮＦ−αによる上方制御に感受性を示すか、ＴＮＦ−α産生を誘発する）、虚血再灌流障害、自己免疫性糖尿病、レチナール自己免疫、慢性リンパ性白血病、ＨＩＶ感染症、エリテマトーデス、腎・尿管疾患、泌尿生殖器障害及び胃腸障害、及び前立腺疾患、宿主におけるＩ型ＩＦＮ産生を誘発する感染因子又は有毒環境因子によって誘導される任意の疾患から成る群から選択される１つ又は複数の以下の疾患、病理学的障害（pathological disorder）、又は病的状態の治療薬又は予防薬の調製のための本発明のメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオン化合物の使用方法を提供する。

特に、本発明のメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオン化合物は、（１）炎症性疾患及び状態（関節炎、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、骨関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、慢性糸球体腎炎、皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、２型糖尿病の血管性合併症、及びクローン病が含まれる）、（２）呼吸器疾患及び状態（喘息、急性呼吸促迫症候群、慢性肺炎症性疾患、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、及びケイ肺症が含まれる）、（３）感染症及び状態（敗血症、敗血症性ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症、毒素性ショック症候群、細菌、ウイルス、又は真菌の感染に起因する発熱及び筋肉痛、及びインフルエンザが含まれる）、（４）免疫疾患及び状態（自己免疫性糖尿病、全身性エリテマトーデス、ＧｖＨ反応、外来性移植片の拒絶、多発性硬化症、乾癬、及びアレルギー疾患が含まれる）、及び（５）他の疾患及び状態（骨吸収疾患、再灌流障害、感染症又は悪性疾患に続発する悪液質、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に続発する悪液質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、又はエイズ関連複合体（ＡＲＣ）、ケロイド形成、瘢痕組織形成、１型糖尿病、及び白血病が含まれる）の治療に適切である。

本発明を治療する方法がヒト用薬物分野及び動物用薬物分野で有用であると認識されるであろう。したがって、治療すべき個体は、哺乳類、好ましくはヒト、又は他の動物であり得る。獣医学的目的のために、個体には、家畜（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及びヤギが含まれる）、ペット（companion animal）（イヌ及びネコ等）、外来及び／又は動物園の動物、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、及びハムスターが含まれる）、及び家禽類（ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、及びガチョウ等）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、本発明は、毒素性ショック症候群を防止又は治療するためのウマ等の動物における術前又は術後の介入に関するが、これらに限定されない。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアと一緒に、安全且つ有効な量で使用される具体的に定義されるメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンを含む。

本発明の組成物において使用されるメチマゾール誘導体は、下記構造式を有するものである：

これらの式において、Ｙは、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、−ＮＯ_２及び下記フェニル部分：

から選択され、ここで上記活性化合物中のわずか１つのＹ基が、フェニル部分であってもよく、Ｒ^１は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４エステル又はＣ_１〜Ｃ_４置換エステルから選択され、Ｒ^２は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル又はＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから選択され、Ｒ^３は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル又は−ＣＨ_２Ｐｈ（ここで、Ｐｈはフェニルである）から選択され、Ｒ^４は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル又はＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから選択され、Ｘは、Ｓ又はＯから選択され、Ｚは、−ＳＲ^３、−ＯＲ^３、Ｓ（Ｏ）Ｒ^３、又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルから選択され、ここでＹがフェニル部分でない場合、上記化合物中のＲ^２基及びＲ^３基の少なくとも２つはＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、またＺがアルキルである場合、少なくとも１つのＹは−ＮＯ_２であり、薬学的に許容可能なキャリアを伴う。

Ｙは、好ましくはＨ、下記フェニル部分又は−ＮＯ_２であり、最も好ましくはＨ又は下記フェニル部分である：

定義される化合物において、わずか１つのＹ基が、フェニル部分であってもよい。Ｒ^１は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ）、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４エステル及びＣ_１〜Ｃ_４置換エステルから選択され、好ましくはＲ^１は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、−ＯＯＣＣＨ_２Ｍ（ここで、Ｍは、Ｈ又はハロゲンである）であり、最も好ましくはＨである。Ｒ^２は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから選択され、好ましくはＲ^２基の一方又は両方がメチルである。本明細書中で使用する場合、「置換アルキル」又は「置換エステル」は、１つ又は複数の場所でヒドロキシル又はアルコキシル基、カルボキシル基、ハロゲン、ニトロ基、アミノ又はアシルアミノ基及びそれらの部分の混合物で置換されるアルキル、アリール又はエステル基を包含すると意図される。好ましい「置換アルキル」基は、Ｃ_１〜Ｃ_４ヒドロキシル又はアルコキシル基、並びにハロゲンで置換された基である。上記式中のＲ^３基は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル及び−ＣＨ_２Ｐｈ（ここで、Ｐｈはフェニルである）から選択され、好ましい化合物では、Ｒ^３は、Ｈ又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、最も好ましくはＲ^３は、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、特にメチルである。Ｒ^４は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから選択され、好ましくはＨである。Ｘは、Ｓ又はＯであってもよく、好ましくはＳである。最後に、Ｚは、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、−ＳＲ^３、−Ｓ（Ｏ）Ｒ^３及び−ＯＲ^３から選択され、好ましくは−ＳＲ^３、−ＯＲ^３及び−Ｓ（Ｏ）Ｒ^３であり、最も好ましくは−ＳＲ^３及び−ＯＲ^３、特に−ＳＲ^３である。上記式中において、Ｙがフェニル部分でない場合、化合物のＲ^２基及びＲ^３基の少なくとも２つは、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルでなくてはならない。さらに、ＺがＣ_１〜Ｃ_４アルキルである場合、Ｙ基の少なくとも１つは−ＮＯ_２であるべきである。

本発明で有用な化合物は、下記式：

（式中、
Ｒ^５、Ｒ^６＝ＣＨ_３、ＣＨ_３；Ｐｈ、Ｈ；Ｈ、Ｐｈであり、
Ｒ^７＝Ｈ、ＣＨ_３であり、
Ｒ^８＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＣＨ_３である）
を有するKjellin and Sandstrom（Acta Chemica Scandanavica 23: 2879-2887(1969)）（参照により本明細書に援用される）に開示される互変異性環状チオンを包含する。

本発明の組成物における使用に好ましい化合物としては、下記式を有する化合物が挙げられる：

好ましい組成物の別の群としては、下記式：

（式中、Ｒ^１０は、Ｈ、ＮＯ_２、Ｐｈ、４−ＨＯＰｈ及び４−ｍ−Ｐｈ（ここで、ｍは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである）から選択される）
を有するものが挙げられる。

本明細書中で定義される薬学的化合物の特に好ましいサブセットは、Ｙ基の１つが上記で定義されたフェニル部分であるものである。これらの化合物は、下記式を有する：

これらの化合物において、Ｙは、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから選択され、好ましくはＨである。Ｒ^１は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ）、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４エステル及びＣ_１〜Ｃ_４置換エステルから選択され、好ましくはＨ、−ＯＨ、ハロゲン、−ＯＯＣＣＨ_２Ｍ（ここで、Ｍは、Ｈ又はハロゲンである）であり、好ましくはＨではない。Ｒ^２は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから選択され、Ｒ^２基の少なくとも１つがメチルであることが好ましい。Ｒ^３は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、及び−ＣＨ_２Ｐｈから選択され、好ましいＲ^３部分は、Ｈ及びメチルである。Ｒ^４は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから選択され、好ましくはＨである。Ｘは、Ｓ及びＯから選択され、好ましくはＳである。最後に、Ｚ部分は、−ＳＲ^３及び−ＯＲ^３から選択され、好ましくは−ＳＲ^３である。特に好ましい化合物は、下記構造式を有する化合物である：

他の好ましい化合物としては、下記：

（式中、Ｒ^９は、−ＯＨ、−Ｍ及び−ＯＯＣＣＨ_２Ｍから選択され、Ｍは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩから選択される）
が挙げられる。

以下に挙げる構造を有する化合物が最も好ましい：

本明細書中で定義される薬学的に活性な化合物の混合物もまた使用され得る。上述のメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンは、当業者に既知の技法を使用して合成することができる。例えば、幾つかの互変異性環状チオンの合成は、Kjellin及びSandstrom（G. Kjellin,et al., Acta Chem Scand, 23: 2879-2887 (1969)）（参照により本明細書に援用される）に記載されている。

代表的なメチマゾール誘導体は、以下の手順を使用して合成され得る。アセトアルデヒドの適切に置換された類縁体は、臭素及びＵＶ光による処理により２位で臭素化して、続いて無水エタノールを使用して相当するジエチルアセタールの形成を行った。続いて、封管中で約１２０℃で最長約１６時間の無水メチルアミン又は他の適切なアミンによる処理により、この化合物から臭素を除去した。蒸気浴温度で一晩の塩酸の存在下での得られたアミノアセタールとチオシアン酸カリウムとの反応により、メチマゾール類縁体が得られる。

本発明の代表的なメチマゾール誘導体化合物を表１６に示す。

本発明の薬学的組成物は、安全且つ有効な量のメチマゾール誘導体又は互変異性環状チオン化合物（即ち、活性化合物）の１つ又は複数を含む。好ましい組成物は、約０．０１％〜約２５％の活性化合物を含有し、最も好ましい組成物は、約０．１％〜約１０％の活性化合物を含有する。本発明の薬学的組成物は、従来の既知の任意の方法で、例えば、腹腔内的に、静脈内的に、筋内的に、又は局所的に投与され得るが、経口投与が好ましい。好ましい組成物は、単位投薬形態、即ち個々の投与量が使用者により測定されることを要さずに単回投与量投与に適した予め測定された形態で利用可能な薬学的組成物、例えば丸剤、錠剤又はアンプルである。

本発明の薬学的組成物は、上述のメチマゾール誘導体又は互変異性チオンと適合性の薬学的に許容可能なキャリアをさらに包含する。薬学的に許容可能なキャリアのほかに、薬学的組成物は、それらの技術分野で通用するレベルで、さらなる適合性の成分（例えば、さらなる薬学的活性物質、賦形剤、配合助剤（例えば、錠剤化助剤）、着色剤、芳香剤、防腐剤、可溶化剤又は分散剤及び当業者に既知の他の材料）を含有してもよい。

本明細書中で使用する場合、「薬学的キャリア」という用語は、固体又は液体の充填剤、希釈剤或いは封入物質を意味する。これらの材料は、医薬品の技術分野の熟練者に既知である。薬学的キャリアとして機能し得る物質の幾つかの例は、糖（例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース）、デンプン（例えば、コーンスターチ及びポテトスターチ）、セルロース及びその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース）、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油（例えば、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びカカオ脂）、ポリオール（例えば、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール）、寒天、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張性生理食塩水及びリン酸緩衝溶液、並びに薬学的配合物で使用される他の無毒性の適合性物質である。それらは、生分解性ポリマーを包含する脂質若しくは高分子粒子で作製されるリポソーム又は薬物キャリアか、或いは標的送達用途（例えば抗体への連結）を含んでもよい。湿潤剤及び潤滑剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）並びに着色剤、芳香剤、錠剤化剤及び防腐剤もまた存在し得る。それらは、水可溶化を高めるシクロデキストリン等の賦形剤を含んでもよい。薬学的組成物への構成要素の配合は、従来の技法を使用して行われる。

本発明の薬学的組成物と併せて使用される薬学的キャリアは、実用的な大きさと投与量の関係を提供するのに十分な濃度で使用される。好ましくは、薬学的キャリアは、総薬学的組成物の約２５重量％〜約９９．９９重量％、好ましくは約５０重量％〜約９９．９重量％を構成する。配合物は、治療的効果を達成するように投与される。身体において長期の残留期間を示す化合物に関して、１日１回のレジメンが可能である。或いは、通常１日につき最大３回の用量のような複数回用量が、より有効な療法を提供し得る。したがって、単回用量又は複数回用量レジメンが使用され得る。

本発明の薬学的組成物で治療される状態には、一般に、特に、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞（これらに限定されない）におけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の過剰発現又はシグナル伝達又はＴＬＲ３又はＴＬＲ４の両方の過剰発現又はシグナル伝達によって媒介されるか又はこれらに関連する任意の自己免疫性炎症性疾患（例えば、橋本病、膵島炎、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、１型又は２型糖尿病の血管性合併症、肥満又は高脂血症が付随する血管性合併症、毒素ショック、大腸炎、又はＩＢＤ、及びＩＢＤの定義の範囲内に含まれる種々の症状であるが、これらに限定されない）が含まれる。配合物は、治療的効果を達成するように投与される。身体において長期の残留期間を示す化合物に関して、１日１回のレジメンが可能である。或いは、通常１日につき最大３回の用量のような複数回用量が、より有効な療法を提供し得る。したがって、単回用量又は複数回用量レジメンが使用され得る。

本発明の薬学的組成物で治療される状態には、一般に、特に、ＴＬＲの過剰発現又はシグナル伝達を誘導する感染因子又は有毒環境因子を貪食する非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞（これらに限定されない）におけるＴＬＲの過剰発現又はシグナル伝達によって媒介されるか又はこれらに関連する任意の自己免疫性炎症性疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、自己免疫性眼瞼炎であるが、これらに限定されない）が含まれる。配合物は、治療的効果を達成するように投与される。身体において長期の残留期間を示す化合物に関して、１日１回のレジメンが可能である。或いは、通常１日につき最大３回の用量のような複数回用量が、より有効な療法を提供し得る。したがって、単回用量又は複数回用量レジメンが使用され得る。

本発明はまた、特に、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞（これらに限定されない）におけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の過剰発現又はシグナル伝達又はＴＬＲ３又はＴＬＲ４の両方の過剰発現又はシグナル伝達によって媒介されるか又はこれらに関連する任意の自己免疫性炎症性疾患（例えば、橋本病、膵島炎、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、１型又は２型糖尿病の血管性合併症、肥満又は高脂血症が付随する血管性合併症、毒素ショック、大腸炎、又はＩＢＤ、及びＩＢＤの定義の範囲内に含まれる種々の症状であるが、これらに限定されない）における診断、治療、及びその後の治療介入方法も提供する。例えば、腸上皮細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞におけるＴＬＲ４の過剰発現及びＴＬＲ４シグナル伝達によって特徴付けられる大腸疾患である潰瘍性大腸炎は、痙性腹痛、直腸出血、並びに血液、膿汁、及び粘液の放出低下（loose discharge）を伴う慢性下痢に関与する。この疾患の徴候は、広く多様である。悪化及び寛解のパターンが、ほとんどの潰瘍性大腸炎の患者（７０％）の臨床的経過の典型となるが、寛解を伴わない連続的な症状が、潰瘍性大腸炎を有する幾らかの患者に存在する。潰瘍性大腸炎の全身性合併症としては、関節炎、眼の炎症（例えば、ブドウ膜炎）、皮膚潰瘍及び肝臓疾患が挙げられる。さらに、潰瘍性大腸炎、特に長期にわたる広範囲の疾患は、結腸癌腫の危険性の増大に関連する。同様に、１型糖尿病は、膵臓β細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞におけるＴＬＲ３の過剰発現及びＴＬＲ３シグナル伝達によって特徴付けられ、長期の炎症状態又は膵島炎、島細胞及びＧＡＤ自己抗体を有する蜜月期間（honeymoon period）又は誘導期、インスリン分泌が喪失する破壊期、高血糖、高脂血症、並びに組織合併症（大血管及び微小血管疾患（アテローム性動脈硬化症、卒中、心筋梗塞、腎症、神経障害、網膜症が含まれる）等）、並びに自己免疫性甲状腺疾患及び癌のより高い発生率によって特徴付けられる膵臓の自己免疫性炎症性疾患である。

いずれの場合でも、薬学的組成物は、化合物が患者の血流へ送達されるような様式で投与される。これを遂行するための１つの優れた様式は、静脈内投与である。静脈内用量レベルは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／時間〜約１００ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲の有効なアミド化合物であり、すべて約１〜約１２０時間、特に１〜９６時間である。約０．００１〜約５００ｍｇの前負荷ボーラスはまた、適正な定常状態レベルを達成するのに投与され得る。筋内又は腹腔内注射のような他の形態の非経口投与も同様に使用することができる。この場合、類似した用量レベルが用いられる。

経口投薬を用いる場合、１日につき１〜３回の、それぞれ約０．００１〜約１５０ｍｇ／ｋｇの活性化合物の経口用量が使用され、好ましい用量は、約０．０５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。直腸投薬を用いる場合、１日につき１〜３回の、それぞれ約１〜約１５０ｍｇ／ｋｇの活性化合物の直腸用量が使用され、好ましい用量は、約１〜約１００ｍｇ／ｋｇである。

任意の治療レジメンにおいて、医療専門家は、患者の状態を評価すべきであり、患者が治療により益を享受するか否かを確定すべきである。或る程度の日常的な用量最適化が、最適な投薬レベル及びパターンを確定するのに要され得る。正の用量応答関係が観察されている。したがって、また副作用の重症度及び症状の最大の考え得る改善を提供する利点に配慮して、設定によって、上述のような大量の活性化合物を投与することが望ましい場合がある。

本発明の薬学的組成物は、適切なレベルの薬学的な活性物が血流で達成されるように投与される。所定の場合で要される正確な投与量レベルは、例えば使用される特定のメチマゾール誘導体、治療される疾患の性質並びに患者の大きさ、体重、年齢及び体調に依存する。

「薬学的に許容可能な塩」とは、無機塩基又は有機塩基並びに無機酸又は有機酸を含む薬学的に許容可能な無毒の塩基又は酸から調製される塩をいう。無機塩基由来の塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛等が挙げられる。特に好ましくは、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、及びナトリウム塩である。薬学的に許容可能な無毒な有機塩基由来の塩としては、１級、２級、及び３級アミン類、自然発生的な置換アミン類を含む置換アミン類、環状アミン類の塩、塩基イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン類、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等が挙げられる。本発明の化合物が塩基性である場合、塩は無機酸及び有機酸を含む薬学的に許容可能な無毒の酸から調製することができる。このような酸としては、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩化水素酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。特に好ましくは、クエン酸、臭化水素酸、塩化水素酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、及び酒石酸である。本明細書中で使用される場合、本明細書中で言及される化合物はまた、薬学的に許容可能な塩を含むことを意図すると理解されるであろう。

本発明の治療用化合物の予防的又は療法的用量の規模は、当然のことながら治療されるべき状態の重症度の性質により、また本発明の特定の治療用化合物及びその投与経路により様々である。本発明の治療用化合物の予防的又は療法的用量の規模はまた、個々の患者の年齢、体重及び応答に応じて様々である。概して、日用量範囲は、単回用量又は分割用量で、哺乳類の体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇ、最も好ましくは１ｋｇ当たり０．１〜１０ｍｇの範囲内に存在する。他方で、場合によっては、これらの限界の範囲外の投与量を使用することが必要であり得る。

静脈内又は腹腔内投与用の組成物が用いられる使用に関して、適切な投与量範囲は、１日につき体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ〜約２５ｍｇ（別の実施形態では０．０１ｍｇ〜約１ｍｇ）の本発明の治療用化合物であり、細胞保護的使用に関しては、１日につき体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ（別の実施形態では約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、別の実施形態では約１ｍｇ〜約１０ｍｇ）の本発明の治療用化合物である。

経口用組成物が用いられる場合では、適切な投与量範囲は、例えば、１日につき体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ、別の実施形態では１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの本発明の治療用化合物であり、細胞保護的使用に関しては、１日につき体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ（別の実施形態では約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、別の実施形態では約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ）の本発明の治療用化合物である。

本発明は、薬学的処方技法を使用して、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるＴＬＲ３の過剰発現又はＴＬＲ３シグナル伝達、ＴＬＲ４の過剰発現又はＴＬＲ４シグナル伝達、又はその両方によって媒介されるか又はこれらに関連する炎症性疾患及び／又は自己免疫性疾患又は自己免疫性炎症性疾患（前に定義した橋本病、膵島炎、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、肥満、又は高脂血症の血管性合併症、毒素ショック、大腸炎、ＩＢＤ、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性眼瞼炎、乾癬が含まれるが、これらに限定されない）の治療のためのメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンの組成物を提供する。本発明は、薬学的処方技法を使用して、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ／ＩＲＦ−１／及びＩＳＲＥを有する遺伝子の過剰発現に関与するＴＬＲシグナル伝達の過剰発現によって媒介されるか又はこれらに関連する炎症性疾患及び／又は自己免疫性疾患又は自己免疫性炎症性疾患（全身性狼瘡及び関節リウマチが含まれるが、これらに限定されない）の治療のためのメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンの組成物を提供する。

疾患を防止、抑制又は阻害するのに有効な本発明の化合物の投与量及び用量の速度は、様々な因子（例えば、阻害剤の性質、患者の大きさ、治療の目標、治療されるべき病態の性質、使用される特定の薬学的組成物及び治療する医師の判断）に依存する。

種々の投薬形態に関する胃腸管を通る通過時間は、十分知られている。投薬量形態が胃から空になったら、小腸を通る通過は、３〜５時間かかる。大腸における残留時間は、相当長く、２５〜５０時間である。理想的には、局所的な影響のために、投薬形態が胃の中にとどまる間は、放出が起きるべきではない。小腸における大腸炎が治療されようとしている場合、投薬形態が胃を離れた後の約５時間中放出が続くべきである。大腸が治療されようとしている場合、局所的な放出は、理想的には盲腸で始まり、最長５０時間続くべきである。

薬学的組成物で見られる「組成物」という用語は、活性成分（複数可）及びキャリアを構成する不活性成分（複数可）（薬学的に許容可能な賦形剤）、並びに直接的に又は間接的に、成分の任意の２つ以上の組合せ、錯化又は凝集に起因するか、或いは成分の１つ又は複数の解離に起因するか、或いは成分の１つ又は複数の他のタイプの反応又は相互作用に起因する任意の生成物を含む生成物を包含すると意図される。したがって、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物、さらなる活性成分（複数可）、及び薬学的に許容可能な賦形剤を混合することにより作製される任意の組成物を包含する。

哺乳類、特にヒトに本発明の化合物を効果的な用量で提供するのに、任意の好適な投与経路を使用することができる。例えば、経口、直腸、局所、非経口、眼球、肺、鼻等を使用することができる。投薬形態としては、錠剤、トローチ、分散液（dispersion）、懸濁液、溶液、カプセル、クリーム、軟膏、エアロゾル等が挙げられる。これらは、便利なことに単位投薬形態で与えられ、薬学分野で既知の任意の方法で調製することができる。

吸入による投与に関して、本発明の化合物は、加圧パック又はネブライザーからのエーロゾルスプレー提示の形態で利便性よく送達される。化合物はまた、配合され得る粉末として送達されてもよく、粉末組成物は、吸送粉末吸入器デバイスを用いて吸入され得る。吸入用の好ましい送達系は、適切な噴霧剤（例えば、フルオロカーボン又は炭化水素）中の本発明の化合物の懸濁液又は溶液として配合され得る定量吸入（ＭＤＩ）エーロゾル、及びさらなる賦形剤あり又はなしで本発明の化合物の乾燥粉末として配合され得る乾燥粉末吸入（ＤＰＩ）エーロゾルである。適切な局所用配合物としては、経皮デバイス、エーロゾル、クリーム、軟膏、ローション、散布剤等が挙げられる。

実用的には、本発明の化合物は、従来の薬学的配合技法に従って、薬学的キャリアと緊密に混合した活性成分として組み合わせることができる。投与のそれらの簡易性のために、錠剤及びカプセルが、最も好適な経口用単位投薬形態を表し、この場合、明らかに固体薬学的キャリアが用いられる。望ましい場合、錠剤は、標準的な水性又は非水性技法によりコーティングされ得る。上述の一般的な投薬形態のほかに、本発明の治療用化合物はまた、米国特許第３，８４５，７７０号、同第３，９１６，８９９号、同第３，５３６，８０９号、同第３，５９８，１２３号、同第３，６３０，２００号及び同第４，００８，７１９号に記載されるもののような制御放出手段及び／又は送達デバイスにより投与されてもよい。

経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、粉末又は顆粒として、或いは水性液体、非水性液体、水中油型エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョン中の溶液又は懸濁液として、それぞれ既定量の活性成分を含有するカプセル、カシェ剤又は錠剤のような別個の単位として提示され得る。このような組成物は、調剤の方法のいずれかにより調製され得るが、すべての方法が、１つ又は複数の必須の成分を構成するキャリアと活性成分を結合させる工程を包含する。概して、組成物は、活性成分を液体キャリア又は微細固体キャリア、或いはその両方と均一且つ緊密に混合すること、続いて必要であれば、生成物を所望の提示へ造形することにより調製される。例えば、錠剤は、任意に１つ又は複数の補助成分を用いた圧縮又は成形により調製され得る。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤又は分散剤と任意に混合された粉末又は顆粒のような易流動性形態の活性成分を、適切な機械で圧縮することにより調製され得る。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を、適切な機械で成形することにより作製され得る。望ましくは、錠剤はそれぞれ、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有し、カシェ剤又はカプセルはそれぞれ、約１〜約５００ｍｇの活性成分を含有する。

併用療法−予防及び治療
本発明の文脈では、本明細書中に記載の化合物又はその薬学的組成物を、本明細書中に記載のＴＬＲ３／４媒介性疾患、状態、及び／又は障害の活性の調整のために使用することができる。ＴＬＲ３／４媒介性疾患の活性の調整の例には、代謝関連障害（Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、不適合耐糖能、インスリン抵抗性、高血糖、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、異常脂質血症、及びＸ症候群等）の予防又は治療が含まれる。ＴＬＲ３／４媒介性疾患の活性の調整の他の例には、食品摂取の減少（飽食（すなわち、満腹感）を誘導する）、体重増加の調節、体重の減少、及び／又はレシピエントの体重が減少し、そして／又は体重を維持するような代謝への影響による肥満及び／又は過体重の予防又は治療が含まれる。また、本発明の文脈では、本明細書中に記載の化合物又はその薬学的組成物を、ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ／ＩＲＦ−１／及びＩＳＲＥ含有遺伝子に関与するシグナル伝達の増加した本明細書中に記載のＴＬＲ媒介性疾患、状態、及び／又は障害の活性の調整のために使用することができる。これらのＴＬＲ媒介性疾患の活性の調整の例には、全身性狼瘡、関節リウマチ、大腸炎、クローン病、又は他の炎症性障害等（これらに限定されない）の障害の予防又は治療が含まれる。

本発明の化合物を単一の活性薬学的因子（すなわち、単剤療法）として投与することができる一方で、本発明の化合物を、本明細書中に記載の疾患／状態／障害の治療のための他の薬学的因子と組み合わせて使用することもできる（すなわち、併用療法）。したがって、本発明の別の態様は、本明細書中に記載の１つ又は複数のさらなる薬学的因子と組み合わせて治療上有効な量の本発明の化合物を予防及び／又は治療を必要とする個体に投与することを含む、代謝関連障害又は体重関連障害（肥満等）の予防及び／又は治療する方法を含む。

本発明の化合物と組合せて使用することができる好適な薬学的作用物質としては、アポリポプロテイン−Ｂ分泌／ミクロソームトリグリセリド伝達タンパク質（アポ−Ｂ／ＭＴＰ）阻害剤、ＭＣＲ−４アゴニスト、コレシストキニン−Ａ（ＣＣＫ−Ａ）アゴニスト、セロトニン及びノルエピネフリン再取り込み阻害剤（例えば、シブトラミン）、交感神経様作動薬、β−３アドレナリン作動性受容体アゴニスト、ドーパミンアゴニスト（例えば、ブロモクリプチン）、メラニン細胞刺激ホルモン受容体類似体、カンナビノイド１受容体アンタゴニスト（例えば、ＳＲ１４１７１６：Ｎ−（ピペリジン−１−イル）−５−（４−クロロフェニル）−−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド）、メラニン濃縮ホルモンアンタゴニスト、レプトン（ＯＢタンパク質）、レプチン類似体、レプチン受容体アゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、リパーゼ阻害剤（例えば、テトラヒドロリプスタチン、いわゆるオルリスタット）、食欲減退剤（例えば、ボンベシンアゴニスト)、神経ペプチド−Ｙアンタゴニスト、甲状腺ホルモン剤、デヒドロエピアンドロステロン又はその類似体、糖質コルチコイド受容体アゴニスト又はアンタゴニスト、オレキシン受容体アンタゴニスト、ウロコルチン結合タンパク質アンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、毛様体神経栄養因子（例えばアキソキン（Regeneron Pharmaceuticals, Inc.（Tarrytown, N. Y. and Procter & Gamble Company, Cincinnati, Ohio）から入手可能））、ヒトのアグーチ関連タンパク質（ＡＧＲＰ）、グレリン受容体アンタゴニスト、ヒスタミン３受容体アンタゴニスト又は逆アゴニスト、ニューロメディンＵ受容体アゴニスト、ノルアドレナリン作動性食欲減退剤（例えば、フェンテルミン、マジンドール等）及び食欲抑制剤（例えば、ブプロピオン）等の抗肥満剤が挙げられる。

幾つかの実施形態において、抗肥満剤は、本発明の方法と共に使用され、オルリスタット、シブトラミン、ブロモクリプチン、エフェドリン、レプチン、及び偽エフェドリンから成る群より選択される。さらなる実施形態では、本発明の化合物及び併用療法は、運動及び／又は健康的な食事と共に行われる。

さらに詳細には、限定はされないが、本発明の方法は、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポイエチン、幹細胞因子、及びエリスロポイエチン又はその抗体の１つ又は複数と共に、治療的に効果的な量のフェニルメチマゾール、メチマゾール誘導体、及び／又は互変異性環状チオンを投与することを含み得る。本発明による組成物は、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、及びＡｎｇ−Ｙ等の他の既知のアンジオポイエチン、骨形態形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−３、骨形態形成タンパク質−４、骨形態形成タンパク質−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、骨形態形成タンパク質−８、骨形態形成タンパク質−９、骨形態形成タンパク質−１０、骨形態形成タンパク質−１１、骨形態形成タンパク質−１２、骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体ａ、サイトカイン誘導性好中球化学走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球化学走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球化学走化性因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、表皮成長因子、表皮由来好中球誘因因子、線維芽細胞成長因子４、線維芽細胞成長因子５、線維芽細胞成長因子６、線維芽細胞成長因子７、線維芽細胞成長因子８、線維芽細胞成長因子８ｂ、線維芽細胞成長因子８ｃ、線維芽細胞成長因子９、線維芽細胞成長因子１０、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α−１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体ａ２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質ａ、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮成長因子、幹細胞成長因子、幹細胞成長因子受容体、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子受容体、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチン産生細胞成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子、神経成長因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子受容体α、血小板由来成長因子受容体β、前Ｂ細胞成長刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、形質転換成長因子β−１、形質転換成長因子β−１、形質転換成長因子β−２、形質転換成長因子β−３、形質転換成長因子β−５、潜在性形質転換成長因子β−１、形質転換成長因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩＩ、Ｉ型腫瘍壊死因子受容体、ＩＩ型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化受容体、キメラタンパク質、及びその生物学的若しくは免疫学的に活性なフラグメント、又はそれに対する抗体等の他の既知のアンジオポイエチンも含み得る。

本発明の化合物を、本発明の化合物が有用な疾患又は状態の治療／予防／抑制又は改善で使用される他の薬物と組み合わせて使用することができる。このような他の薬物を、一般的に使用されている経路及び量で、したがって、本発明の化合物（メチマゾール誘導体及び互変異性環状チオン等）と同時又は連続的に投与することができる。本発明の化合物を、１つ又は複数の薬物と同時に使用する場合、本発明の化合物に加えてこのような他の薬物を含む薬学的組成物が好ましい。したがって、本発明の薬学的組成物には、本発明の化合物に加えて１つ又は複数の他の有効成分も含む薬学的組成物が含まれる。個別に投与されるか、又は同一の薬学的組成物中で投与される本発明の化合物と組み合わせることができる他の有効成分の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：（ａ）ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、又はＥ−セレクチンアンタゴニスト；（ｂ）ステロイド（ベクロメタゾン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、プレドニゾン、デキサメサゾン、及びヒドロコルチゾン等）；（ｃ）免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、及び他のＦＫ５０６型免疫抑制薬等）；（ｄ）抗ヒスタミン薬（Ｈ１ヒスタミンアンタゴニスト）（ブロムフェニラミン、クロルフェニラミン、デクスクロルフェニラミン、トリプロリジン、クレマスチン、ジフェンヒドラミン、ジフェニルピラリン、トリペレナミン、ヒドロキシジン、メトジラジン、プロメタジン、トリメプラジン、アザタジン、シプロヘプタジン、アンタゾリン、フェニラミンピリラミン、アステミゾール、テルフェナジン、ロラタジン、セチリジン、フェキソフェナジン、デスカルボエトキシロタラジン等）；（ｅ）非ステロイド性抗喘息薬（β２アゴニスト（テルブタリン、メタプロテレノール、フェノテロール、イソエタリン、アルブテロール、ビトルテロール、サルメテロール、及びピルブテロール）、テオフィリン、クロモリンナトリウム、アトロピン、臭化イプラトロピウム、ロイコトリエンアンタゴニスト（ザフィルルカスト、モンテルカスト、プランルカスト、イラルカスト（iralukast）、ポビルカスト（pobilukast）、ＳＫＢ−１０６、２０３）、ロイコトリエン生合成阻害剤（ジロートン、ＢＡＹ−１００５）等）；（ｆ）非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（プロピオン酸誘導体（アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシン酸（bucloxic acid）、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン（fluprofen）、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン（miroprofen）、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、及びチオキサプロフェン（tioxaprofen））、酢酸誘導体 （インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク（fenclofenac）、フェンクロジン酸（fenclozic acid）、フェンチアザク、フロフェナク（furofenac）、イブフェナク（ibufenac）、イソキセパク（isoxepac）、オキシピナク（oxpinac）、スリンダク、チオピナク（tiopinac）、トルメチン、ジドメタシン（zidometacin）、及びゾメピラック）、フェナミン酸（fenamic acid）誘導体（フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルミン酸、及びトルフェナム酸）、ビフェニルカルボン酸誘導体（ジフルニサル及びフルフェニサル（flufenisal））、オキシカム（イソキシカム（isoxicam）、ピロキシカム、スドキシカム（sudoxicam）、及びテノキシカン）、サリチル酸塩（アセチルサリチル酸、スルファサラジン）、及びピラゾロン （アパゾン、ベンズピペリロン（bezpiperylon）、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン）等）；（ｇ）シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤（セレコキシブ等）；（ｈ）IV型のホスホジエステラーゼ阻害剤（ＰＤＥ−ＩＶ）；（ｉ）ケモカイン受容体のアンタゴニスト（特に、ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−２、ＣＣＲ−３、及びＣＸＣＲ４）；（ｊ）コレステロール低下薬（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（ロバスタチン、シンバスタチン及びプラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、及び他のスタチン）、金属イオン封鎖剤（コレスチラミン及びコレスチポール）、ニコチン酸、フェノフィブリン酸誘導体（ゲムフィブロジル、クロフィブラート、フェノフィブラート、及びベンザフィブラート（benzafibrate）、及びプロブコール等）；（ｋ）抗糖尿病薬（インスリン、スルホニル尿素、ビグアニド（メトホルミン）、ａ−グルコシダーゼ阻害剤（アカルボース）、及びグリタゾン（glitazones）（トログリタゾン、ピオグリタゾン、エングリタゾン（englitazone）、ＭＣＣ−５５５、及びＢＲＬ４９６５３等）等）；（ｌ）１型インターフェロンの調製物（例えば、βインターフェロン及びαインターフェロン）；（ｍ）抗コリン薬（ムスカリンアンタゴニスト（臭化イプラトロピウム）等）；（ｎ）他の化合物（５−アミノサリチル酸及びそのプロドラッグ、代謝拮抗薬（アザチオプリン及び６−メルカプトプリン等）、及び細胞傷害性癌化学療法剤等）；（ｏ）抗生物質；（ｐ）サイトカイン又はケモカイン活性（例えば、抗ＴＮＦ−α）を遮断するか、又は白血球接着（例えば、抗ＶＣＡＭ−１又は抗Ｅ−セレクチン）を遮断する抗体； 血小板又は白血球の接着を阻害する降圧薬（プラキセル（plaxel）等）。

本発明の化合物と組み合わせて使用することができる他の適切な薬学的因子には、代謝関連障害及び／又はその合併症の治療で有用な作用因子が含まれる。例えば、鬱血性心不全、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、不適合耐糖能、インスリン抵抗性、高血糖、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、異常脂質血症、Ｘ症候群、網膜症、腎症、及び神経障害であるが、これらに限定されない。本明細書中に引用した１つ又は複数の疾患の予防又は治療は、以下（これらに限定されない）に言及した薬物クラスに属する当該技術分野で既知の１つ又は複数の薬学的因子の使用を含む：スルホニル尿素、メグリチニド、ビグアニド、α−グルコシダーゼ阻害剤、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ(すなわち、ＰＰＡＲ−γ)アゴニスト、インスリン、インスリン類似体、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、コレステロール低下薬 (例えば、フィブラート（フェノフィブラート、ベザフィブラート、ゲムフィブロジル、及びクロフィブラート等が含まれる）；胆汁酸金属イオン封鎖剤（コレスチラミン及びコレスチポール等が含まれる）；及びナイアシン)、抗血小板薬 (例えば、アスピリン及びアデノシン二リン酸受容体アンタゴニスト（クロピドグレル及びチクロピジン等が含まれる)）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、及びアディポネクチン等。本発明の１つの態様によれば、本発明の化合物を、本明細書中に引用した１つ又は複数の薬物クラスに属する薬学的因子（複数可）と組み合わせて使用することができる。

さらに、本発明の化合物を、適応症及び所望の治療効果に応じて単独又は１つ又は複数のさらなる作用因子と組み合わせて使用することができる。例えば、糖尿病、インスリン抵抗性、及び関連状態又は合併症（肥満及び高脂血症が含まれる）の場合、このようなさらなる作用因子（複数可）を、以下から成る群から選択することができる：インスリン又はインスリン模倣物、スルホニル尿素(アセトヘキサミド、クロルプロパミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、トルブタミド等)又は他のインスリン分泌促進物質(ナテグリニド及びレパグリニド等)、チアゾリジンジオン(ピオグリタゾン及びロシグリタゾン等)又は他のペルオキシソーム増殖剤活性化受容体(ＰＰＡＲ)−γアゴニスト、フィブラート(ベザフィブラート、クロフィブラート、フェノフィブラート、及びゲムフィブロゾール（gemfibrozol）等)又は他のＰＰＡＲ−αアゴニスト、ＰＰＡＲ−Δアゴニスト、ビグアニド(メトホルミン等)、スタチン(フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、及びシンバスタチン等)又は他のヒドロキシメチルグルタリル(ＨＭＧ)ＣｏＡ還元酵素阻害剤、α−グルコシダーゼ阻害剤(アカルボース、ミグリトール、及びボグリボース等)、胆汁酸結合樹脂(コレスチラミン、セレスチポール（celestipol）等)、高密度リポタンパク質(ＨＤＬ)低下薬（アポリポタンパク質Ａ−Ｉ(ａｐｏＡ１)、及びナイアシン等）、プロブコール及びニコチン酸。好ましいさらなる作用因子には、例えば、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、フィブラート、又はスタチン、好ましくは、スルホニル尿素が含まれる。

炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び他のこのようなサイトカイン媒介性障害の場合、さらなる作用因子（複数可）を、以下から成る群から選択することができる：非ステロイド性抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)(ジクロフェナク、ジフルニサル、イブプロフェン、及びナプロキセン等)、シクロオキシゲナーゼ２阻害剤(セレコキシブ、及びロフェコキシブ等)、副腎皮質ステロイド(プレドニゾン及びメチルプレドニゾン等)又は他の免疫抑制薬(メトトレキサート、レフルノミド、シクロホスファミド、及びアザチオプリン等)、疾患修飾性抗リウマチ薬(ＤＭＡＲＤ) (注射用金、ペニシラミン（penicilliamine）、ヒドロキシクロロキン、及びスルファサラジン等)、ＴＮＦ−α阻害剤(エタネルセプト及びインフリキシマブ等)、他のサイトカイン阻害剤(可溶性サイトカイン受容体及び抗サイトカイン抗体等)、他の免疫調節薬(シクロスポリン、タクロリムス、及びラパマイシン等、並びに免疫賦活性オリゴヌクレオチド及び／又はイムノマー(immunomer）等)、及び麻薬性薬剤(ヒドロコドン、モルヒネ、コデイン、及びトラマドール等)。

好ましい方法によって治療することができる好ましい疾患には、炎症性疾患又は免疫疾患（例えば、関節リウマチ、骨関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎、喘息、急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、又は多発性硬化症）が含まれる。好ましい方法によって治療することができるさらに好ましい疾患には、糖尿病、高脂血症、冠動脈心疾患、癌、又は増殖性疾患が含まれる。

本発明の別の態様は、治療上有効な量の本明細書中に記載のメチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオン化合物を糖尿病又は関連状態を罹患した被験体に投与することを含む、糖尿病及び関連疾患を治療する方法である。さらに、本発明は、有効な量の本明細書中に記載のメチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオン化合物をこのような治療を必要とする被験体に投与することによる炎症、炎症性疾患、又はサイトカイン、ＰＤＥ４、ＰＤＥ３、ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ、ｉＮＯＳ、及び／又はＣＯＸ−２によって媒介される疾患を治療する方法を提供する。さらに、本明細書中で意図する治療で使用するための薬学的又は生理学的に許容可能なキャリアと共に治療上有効な量の１つ又は複数の本明細書中に記載のメチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオン化合物を含む薬学的組成物も提供する。

本発明の化合物は、血糖値の上昇によって特徴付けられる糖尿病（すなわち、真性糖尿病（１型及び２型糖尿病の両方が含まれる）等の高血糖障害）並びに他の高血糖関連障害（肥満、コレステロールの増加、高脂血症（高トリグリセリド血症等）、腎臓関連障害等の治療に有用である。化合物はまた、インスリン抵抗性及び／又は高インスリン血症に関与する障害（糖尿病に加えて、高アンドロゲン性状態（多嚢胞性卵巣症候群(Ibanez et al., J.Clin Endocrinol Metab, 85:3526-30, (2000)、Taylor A.E., Obstet Gynecol Clin North Am, 27:583-95, (2000))等）、冠動脈疾患（アテローム性動脈硬化症及び血管性再狭窄等）及び末梢血管疾患が含まれる）の治療に有用である。さらに、本発明の化合物はまた、炎症及び免疫疾患（炎症促進性サイトカインに関与するシグナル伝達経路によって媒介されるもの（関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、並びに接触性及びアトピー性皮膚炎等））の治療に有用である。

幾つかの実施形態では、本発明の方法で使用される免疫刺激性オリゴヌクレオチド及び／又はイムノマーは、ＣｐＧ、Ｃ^＊ｐＧ、ＣｐＧ^＊、及びＣ^＊ｐＧ^＊（式中、Ｃはシチジン又は２'−デオキシシチジンであり、Ｃ^＊は、２'−デオキシチミジン、アラビノシチジン、２'−デオキシ−２'置換アラビノシチジン、２'−Ｏ置換アラビノシチジン、２'−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２'−デオキシ−Ｎ−４−アルキル−シチジン、２'−デオキシ−４−チオウリジン、他の非天然ピリミジンヌクレオシド、又は１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり、Ｇはグアノシン又は２'−デオキシグアノシンであり、Ｇ^＊は２'デオキシ−７−デアザグアノシン、２'−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２'−デオキシ−２'置換アラビノグアノシン、２'−Ｏ置換アラビノグアノシン、又は他の非天然プリンヌクレオシドであり、ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、及びホスホロジチオエートから成る群から選択されるヌクレオシド間結合である）から成る群から選択される免疫刺激性ジヌクレオチドを含む。或る特定の好ましい実施形態では、免疫刺激ジヌクレオチドはＣｐＧではない。

β−アドレナリン受容体アンタゴニストは、交感神経系及び不随意神経系の一部の作用を遮断する。これらの神経作用の遮断により、心拍数を減少させ、異常に速い心拍リズムの治療に有用である。これらの薬物はまた、心筋収縮力を低下させ、血圧を低下させる。心拍数及び筋収縮力の低下により、β遮断薬は心筋の酸素要求量を減少させる。有用なβアドレナリン遮断薬を、アテノロール、ベタキソロール、アセブトロール、ビソプロロール、カルテオロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、及びチモロールを含む群から選択する。アテノロールは、現在好ましいβアドレナリン受容体遮断薬である。

本発明は、本発明の方法と組み合わせた任意の有効なコレステロール低下薬又はこのような作用因子の組み合わせを使用する。有用なコレステロール低下薬には、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻害剤、胆汁酸金属イオン封鎖剤、プロブコール、及びフィブリン酸薬が含まれる。採用した名称が「エゼチミブ」であり、化学名が１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３−（４−フルオロフェニル）−３（Ｓ）−ヒドロキシプロピル］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンである腸コレステロール吸収の選択的阻害剤も有用である。エゼチミブは、スタチンと共に投与した場合に特に有用である。

ＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素阻害剤が好ましい。これらの作用因子は、ＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素の競合的阻害剤であり、コレステロール生合成の律速段階である。これらは、ＨＭＧ ＣｏＡの結合部位の一部を占め、酵素上の活性部位へのこの基質の接近を阻害する。ＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、アトルバスタチン、セルビスタチン（cerivistatin）、フルインドスタチン（fluindostatin）、フルバスタチン、ロバスタチン,メバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、及びベロスタチン（velostatin）を含み、最も好ましい作用因子は、ロバスタチン及びプラバスタチン、特に、ロバスタチンである。

本発明の化合物と併せて使用することができる適切な薬学的因子には、レニン・アンジオテンシン系の阻害剤が含まれる。レニン・アンジオテンシン系は、血圧調節で主な役割を果たす。レニン（酵素）は、アンジオテンシン前駆体に作用してデカペプチドアンジオテンシンＩを形成するように機能する。アンジオテンシンＩは、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によってオクタペプチドアンジオテンシンＩＩに急速に変換される。アンジオテンシンＩＩは、血圧を上昇させる多数の機構（総末梢抵抗の惹起が含まれる）によって作用する。レニン・アンジオテンシン系の阻害剤は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤及びアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（ＡＲＢ）に分類される。アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤の例は、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、フェンチアプリル（fentiapril）、ホシノプリル、インドラプリル（indolapril）、リシノプリル、ペリンドプリル、ピボプリル（pivopril）、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、トランドラプリル、及びゾフェノプリルであり、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、キナプリル、ラミプリル、及びトランドラプリルが本発明の使用に好ましく、エナラプリルがより好ましい。有用なアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストには、ロサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、ゾラサルチン（zolasartin）、及びタソサルタンが含まれる。ロサルタンが好ましい。本発明では、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤は、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストよりも好ましい。

シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、その血小板に影響を及ぼす能力により、本発明で有用である。最も広く使用され、且つ研究されているシクロオキシゲナーゼ阻害剤はアスピリンであり、アスピリンは、心筋事象のリスクのある患者に長期間にわたって低用量を毎日投与した場合、血栓症に起因する心筋梗塞及び卒中を防止することが示されている。十分なアスピリンが循環系に存在する場合、形成された血小板はその７〜１０日間の全寿命にわたって凝集能力が損なわれる。

利尿薬は、尿の流速及びナトリウム排泄を増加させる。利尿薬を使用して、種々の臨床状況（高血圧、うっ血性心不全、腎不全、腎炎症候群、及び肝硬変が含まれる）において体液の体積及び／又は組成を調整する。利尿薬を、種々のクラス（炭酸脱水酵素の阻害剤、ループ利尿薬、チアジド及びチアジド様利尿薬、Ｋ＋節約利尿薬、及び鉱質コルチコイド受容体のアンタゴニスト等）から選択することができる。

本発明の一実施形態では、チアジド及びチアジド様誘導体は好ましい利尿薬であり、ベンドロフルメタジド（bendroflumethazide）、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメタジド（hydroflumethazide）、メチクロタジド、ポリチアジド、
トリクロルメタジド（trichlormethazide）、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、及びキウネタゾン（qiunethazone）が含まれる。現在、最も好ましい利尿薬はヒドロクロロチアジドであり、腎臓内での塩の遮断及び流動物の再吸収によって作用して、尿量を増加させる(利尿)。利尿薬は、軽度高血圧の治療で広く使用されている。

さらに、組み合わせ生成物は、少なくとも１つの抗糖尿病薬（経口血糖降下薬であるメトホルミン、スルホニル尿素薬であるグリベンクラミド、トルブタミド、トラザミド、グリブリド、グリピジド、及びグリミピリド（glimipiride）、並びにチアゾリジンジオン薬であるトログリタゾン、ロシグリタゾン、及びピオグリタゾン等）を含み得る。これらは、一般に、細胞によるインスリン利用を改善し、（幾つかの場合）膵臓によりインスリン産生を刺激するか、又は肝臓のグルコース産生を減少させるように作用する。抗糖尿病薬を、非インスリン依存性糖尿病患者に使用することを意図する生成物中に含めることができる。

ホモシステインの血清中濃度の上昇は、アテローム性動脈硬化症、心疾患、卒中、及び末梢血管疾患と相関性が高い。ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、及び葉酸は、ホモシステインレベルを低下させ、これらの病状の発生率を低下させるように作用する。ビタミンＢ６を、約２ｍｇ〜２ｇの量で含めることができる。ビタミンＢ１２を、約３μｇ〜２ｍｇの量で含めることができる。葉酸を、一般に、約５ｍｇまでの量（約４００〜８００ｇ、約５００μｇ〜２ｍｇ、又は約１ｍｇ〜５ｍｇ等）の量で含めることができる。

本発明の化合物と併せて使用することができる適切な薬学的因子には、スルホニル尿素が含まれる。スルホニル尿素(ＳＵ)は、細胞膜内のＳＵ受容体を介したインスリン分泌シグナルの伝達によって膵臓β細胞からのインスリン分泌を促進する薬物である。スルホニル尿素の例には、グリブリド、グリピジド、グリメピリド、及び当該技術分野で既知の他のスルホニル尿素が含まれる。

本発明の化合物と併せて使用することができる適切な薬学的因子には、メグリチニドが含まれる。メグリチニドは、安息香酸誘導体であり、新規のインスリン分泌促進物質クラスに相当する。これらの作用因子は、食後高血糖を標的し、ＨｂＡ１ｃの減少においてスルホニル尿素に匹敵する有効性を示す。メグリチニドの例には、レパグリニド、ナテグリニド、及び当該技術分野で既知の他のメグリチニドが含まれる。

本発明の化合物と併せて使用することができる適切な薬学的因子には、ビグアニドが含まれる。ビグアニドは、嫌気的解糖を刺激し、末梢組織中のインスリンに対する感受性を増加させ、腸からのグルコース吸収を阻害し、肝臓の糖新生を抑制し、脂肪酸酸化を阻害する薬物クラスに相当する。ビグアニドの例には、フェンホルミン、メトホルミン、ブホルミン、及び当該技術分野で既知のビグアニドが含まれる。

本発明の化合物と併せて使用することができる適切な薬学的因子には、αグルコシダーゼ阻害剤が含まれる。αグルコシダーゼ阻害剤は、膵臓又は小腸中でα−アミラーゼ、マルターゼ、α−デキストロリナーゼ、スクラーゼ等の消化酵素を競合的に抑制する。α−グルコシダーゼ阻害剤による可逆的阻害により、デンプン及び糖の消化の遅延によって血糖値が遅延するか、減少するか、又はそうでなければ低下する。α−グルコシダーゼ阻害剤の例には、アカルボース、Ｎ−(１，３−ジヒドロキシ−２−プロピル)バリオラミン（valiolamine）(一般名ボグリボース)、ミグリトール、及び当該技術分野で既知のα−グルコシダーゼ阻害剤が含まれる。

本発明の化合物と併せて使用することができる適切な薬学的因子には、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ（すなわち、ＰＰＡＲ−γ）アゴニストが含まれる。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γアゴニストは、核内受容体ＰＰＡＲ−γを活性化し、それにより、グルコースの産生、輸送、及び利用の調節に関与するインスリン応答遺伝子の転写を調節する化合物クラスに相当する。このクラスの作用因子はまた、脂肪酸代謝の調整を容易にする。ＰＰＡＲ−γアゴニストの例には、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、テサグリタザル、ネトグリタゾン（netoglitazone）、ＧＷ−４０９５４４、ＧＷ−５０１５１６、及び当該技術分野で既知のＰＰＡＲ−γアゴニストが含まれる。

本発明の化合物と併せて使用することができる適切な薬学的因子には、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が含まれる。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、スタチン化合物とも呼ばれる作用因子であり、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素の阻害によって血中コレステロールを低下させる薬物クラスに属する。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、コレステロール生合成における律速酵素である。スタチンは、ＬＤＬ受容体活性の上方制御によって血清ＬＤＬ濃度を低下させ、血液からのＬＤＬのクリアランスに関与する。スタチン化合物の幾つかの代表例には、ロスバスタチン、プラバスタチン及びそのナトリウム塩、シンバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、ＢＭＳの「スーパースタチン」、並びに当該技術分野で既知のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が含まれる。

本発明の化合物と併せて使用することができる適切な薬学的因子には、フィブラートが含まれる。フィブラート化合物は、肝臓中でのトリグリセリドの合成及び分泌を阻害し、リポタンパク質リパーゼを活性化することによって血中コレステロールレベルを低下させる薬物クラスに属する。フィブラートは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体を活性化してリポタンパク質リパーゼ発現を誘導することが知られている。フィブラート化合物の例には、ベザフィブラート、ベクロブラート（beclobrate）、ビニフィブラート（binifibrate）、シプロフィブラート（ciplofibrate）、クリノフィブラート、クロフィブラート、クロフィブリン酸、エトフィブラート（etofibrate）、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、ニコフィブラート（nicofibrate）、ピリフィブラート（pirifibrate）、ロニフィブラート、シンフィブラート、テオフィブラート（theofibrate）、及び当該技術分野で既知のフィブラートが含まれる。

本発明の化合物と併せて使用することができる適切な薬学的因子には、アンジオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)阻害剤が含まれる。アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、アンジオテンシン変換酵素の阻害によって血糖値を部分的に低下させ、血圧も低下させる薬物クラスに属する。アンジオテンシン変換酵素阻害剤の例には、カプトプリル、エナラプリル、アラセプリル、デラプリル；ラミプリル、リシノプリル、イミダプリル、ベナゼプリル、セロナプリル（ceronapril）、シラザプリル、エナラプリラート、ホシノプリル、モベルトプリル（moveltopril）、ペリンドプリル、キナプリル、スピラプリル、テモカプリル、トランドラプリル、及び当該技術分野で既知のアンジオテンシン変換酵素阻害剤が含まれる。

本発明の化合物と併せて使用することができる適切な薬学的因子には、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストが含まれる。アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストは、アンジオテンシンＩＩ受容体サブタイプ１(すなわち、ＡＴ１)を標的にし、高血圧に対して有利な影響が証明されている。アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストの例には、ロサルタン(及びカリウム塩形態)及び当該技術分野で既知のアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストが含まれる。

本明細書中に引用した１つ又は複数の疾患の他の治療は、以下のように呼ばれる薬物クラスに属する当該技術分野で既知の薬学的因子の使用を含む（これらに限定されない）：アミリンアゴニスト(例えば、プラムリンチド（pramlintide）)、インスリン分泌促進物質(例えば、ＧＬＰ−１アゴニスト、エキセンジン−４、インスリノトロピン（insulinotropin）(ＮＮ２２１１)、ジペプチルペプチダーゼ阻害薬(例えば、ＮＶＰ−ＤＰＰ−７２８)、アシルＣｏＡコレステロールアセチル基転移酵素阻害剤(例えば、エゼチミブ及びエフルシミブ（eflucimibe）等の化合物)、コレステロール吸収阻害剤(例えば、エゼチミブ及びパマクエシド等の化合物)、コレステロールエステル転移タンパク質阻害剤（例えば、ＣＰ−５２９４１４、ＪＴＴ−７０５、及びＣＥＴｉ−１等の化合物）、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質阻害剤(例えば、インプリタピド（implitapide）等の化合物)、コレステロール修飾因子（例えば、ＮＯ−１８８６等の化合物）、胆汁酸修飾因子（例えば、ＧＴ１０３−２７９等の化合物）、及びスクアレン合成酵素阻害剤。

スクアレン合成阻害剤は、スクアレン合成の阻害によって血中コレステロールレベルを低下させる薬物クラスに属する。スクアレン合成阻害剤の例には、（Ｓ）−α−［ビス［２，２−ジメチル−ｌ−−オキソプロポキシ）メトキシ］ホスフィニル］−３−フェノキシベンゼンブタンスルホン酸、モノカリウム塩（ＢＭＳ−１８８４９４）、及び当該技術分野で既知のスクアレン合成阻害剤が含まれる。

本発明の併用療法を、単独又は別の療法と併せて行うことができ、この併用療法を、自宅、医師のオフィス、クリニック、病院の外来部門、又は病院で提供することができる。治療は、一般に、医師が治療効果を綿密に観察し、必要とされる任意の判断を下すことができるように、病院で開始する。併用療法の持続期間は、治療を受ける障害の型、患者の年齢及び状態、患者の疾患の病期及び型、並びに患者が治療にどのように応答するかに依存する。さらに、障害の発症リスクがより高い患者（例えば、遺伝的に罹患しやすいか、又は以前に疾患若しくは障害を罹患した患者）に、予防治療を行って、応答を阻害又は遅延させることができる。同様に、併用療法の持続期間は、過剰発現したＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４のシグナル伝達事象、過剰発現したサイトカイン、ケモカイン、又はインターフェロン、患者の年齢及び状態、患者の疾患の病期及び型、並びに患者が治療にどのように応答するかに関連する自己免疫性炎症性障害の型に依存する。さらに、疾患又は関連自己免疫性炎症性疾患（すなわち、糖尿病における甲状腺炎）の発症リスクがより高い患者（すなわち、遺伝的に罹患しやすいか、又は以前に疾患若しくは障害を罹患した患者）に、予防治療を行って、応答を阻害又は遅延させることができる。

本発明による併用療法は、単独で、或いは別の療法と併用して実施されてもよく、自宅、医師のオフィス、クリニック、病院の外来部門又は病院で提供され得る。治療は概して、医師が治療の効果を密接に観察することができ、且つ必要とされる任意の調節を行うことができるように病院で始める。併用療法の持続期間は、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるＴＬＲ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、又は全過剰発現及びシグナル伝達に起因するか又は関連する疾患の型（橋本甲状腺炎、１型、膵島炎、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、糖尿病の血管合併症、肥満、又は高脂血症、毒素ショックが含まれるが、これらに限定されない）、治療を受ける自己免疫性炎症性障害、患者の年齢及び状態、患者の疾患の病期及び型、並びに患者が治療にどのように応答するかに依存する。さらに、非免疫細胞、単球、マクロファージ、又は樹状細胞におけるＴＬＲ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、又は全過剰発現及びシグナル伝達に起因するか又は関連する自己免疫性炎症性障害（橋本甲状腺炎、１型、膵島炎、１型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、糖尿病の血管合併症、肥満、又は高脂血症、毒素ショック、又は自己免疫性炎症性障害が含まれるが、これらに限定されない）の発症リスクのより高い患者（例えば、遺伝的に罹患しやすいか、又は以前に疾患又は障害を罹患した患者）に、予防治療を行って、応答を阻害又は遅延させることができる。

組合せの各構成要素の投与の投与量、頻度及び様式は、独立して制御することができる。例えば、或る化合物は、１日につき３回経口投与され得るのに対して、第２の化合物は、１日につき１回、筋内投与され得る。併用療法は、休息期間を包含する断続的なサイクルで付与され得る。化合物はまた、１回の投与が両方の化合物を送達するように一緒に配合されてもよい。

化合物の相対的有効性を、各化合物が予め定義した範囲に活性を阻害する濃度の決定及びその後の結果の比較によって確証することができる。典型的には、生化学アッセイで活性の５０％を阻害する濃度（すなわち、５０％阻害濃度又は「ＩＣ_５０」）を決定することが好ましい。ＩＣ_５０を、当該技術分野で既知の従来の技術を使用して測定することができる。一般に、ＩＣ_５０を、研究中に一定範囲の濃度の阻害剤の存在下での所与の酵素活性の測定によって決定することができる。次いで、実験的に得た活性の値を、使用した阻害剤濃度に対してプロットする。（任意の阻害剤の非存在下における活性と比較して）５０％活性を示す阻害剤の濃度を、ＩＣ_５０値とした。同様に、活性の適切な決定によって、他の阻害濃度を定義することができる。例えば、幾つかの設定において、９０％阻害濃度（すなわち、ＩＣ_９０）等を確証することが望ましい場合がある。上記のように、メチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオン化合物を、典型的には、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現又は活性を選択的に阻害するような量で投与する。

組成物上の任意の律速層は、水不溶性ポリマー又は水不溶性ポリマーの混合物或いは水溶性ポリマー及び水不溶性ポリマーの混合物を含む。

一実施形態では、組成物は、本発明の化合物、及び治療用化合物の結合剤として、また化合物の放出のための律速層として作用する水溶性又は水不溶性ポリマーを含む。このようなポリマーは、セルロース誘導体、アクリル系ポリマー及びコポリマー、ビニルポリマー及び他の高分子ポリマー誘導体又は合成ポリマー（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリビニルピロリドン、酢酸ポリビドン、酢酸ポリビニル、ポリメタクリル酸系及びエチレン−酢酸ビニルコポリマー）或いはそれらの組合せから選択され得る。好ましい膜形成ポリマーは、水性分散形態のエチルセルロース又はアクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルのコポリマーである。

別の実施形態では、組成物は、上述の水不溶性ポリマー又は水不溶性ポリマーの混合物或いは水溶性ポリマー及び水不溶性ポリマーの混合物中に含有される均質に分配されたメチマゾール誘導体及び互変異性環状チオンを含む。

別の実施形態では、組成物は第２の律速層を含む。第２の層におけるポリマーは、薬学的目的に適しており、且つ低いｐＨでかろうじて溶解性であるが、より高いｐＨでは溶解性である（溶解性に関するｐＨ限界は、ｐＨ４〜ｐＨ７．５の間である）陰イオン性カルボン酸ポリマーから成る群から選択されてもよく、上記群は、酢酸フタル酸セルロース、酢酸トリメリット酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸ポリビニル及びアクリル酸ポリマー（例えば、部分的にエステル化されたメタクリル酸ポリマー）を含む。これらのポリマーは、単独で、或いは互いに組み合わせて、或いは上述の水不溶性ポリマーと組み合わせて使用され得る。

コーティングは、膜形成ポリマーの特性を改善させる他の薬学的に許容可能な材料（例えば、可塑剤、付着防止剤、界面活性剤及び分散促進物質又は分散遅延物質）を任意に含んでもよい。適切な可塑剤は、フタル酸エステル、トリアセチン、セバシン酸ジブチル、モノグリセリド、クエン酸エステル及びポリエチレングリコールを含む。好ましい可塑剤は、クエン酸アセチルトリブチル及びクエン酸トリエチルである。適切な付着防止剤は、タルク及び金属ステアレートを含む。

ユニット上に塗布される第１のコーティングの量は一般的に、０．５重量％〜３０重量％、好ましくは１重量％〜１５重量％の範囲である。この量は、関連したケースでは、治療補助剤、例えばステロイド又はスタチン等の重量も包含する。ユニット上に塗布される第２のコーティングの量は一般的に、コーティングされるユニットの重量に基づいて算出して、１重量％〜５０重量％、好ましくは２重量％〜２５重量％の範囲である。残部は、投与量の重量を構成する。

第２の活性成分又は第３の活性成分に対する本発明の治療用化合物の重量比は多様であり、各成分の有効用量に依存する。概して、それぞれの有効用量が使用される。したがって、例えば、治療薬をＮＳＡＩＤと組み合わせる場合、ＮＳＡＩＤに対する本発明の治療用化合物の化合物の重量比は概して、約１０００：１〜約１：１０００、好ましくは約２００：１〜約１：２００の範囲である。同様に、治療薬及び他の活性成分の組合せは概して、上述の範囲内に存在するが、それぞれの場合で、各活性成分の有効用量が使用されるべきである。

本発明の薬学的組成物
非免疫細胞、マクロファージ、単球、又は樹状細胞におけるトール様受容体３及び４の過剰発現及び病的シグナル伝達に関連する自己免疫／炎症性疾患の治療のために、単位投薬形態の薬学的組成物は、約０．０５〜約６００ｍｇが得られる組成物の量を含む。別の実施形態では、組成物は、１日当たり約０．０５〜約２００ｍｇの活性化合物を供給する。本発明の活性化合物の投与のための有用な薬学的処方物を、以下に説明することができる。これらを、従来の技法を使用して作製する。

カプセル
活性成分 ０．０５〜２００ｍｇ
ラクトース ２０〜１００ｍｇ
コーンスターチＵ．Ｓ．Ｐ． ２０〜１００ｍｇ
エーロゾル化されたシリカゲル ２〜４ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １〜２ｍｇ

錠剤
活性成分 ０．０５〜２００ｍｇ
微結晶性セルロース ５０ｍｇ
コーンスターチＵ．Ｓ．Ｐ． ８０ｍｇ
ラクトースＵ．Ｓ．Ｐ． ５０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウムＵ．Ｓ．Ｐ． １〜２ｍｇ

この錠剤は、従来技術の実践に従って糖衣をかけることができる。色彩がコーティングに添加されてもよい。

チュアブル錠
活性成分 ０．０５〜２００ｍｇ
マンニトール、Ｎ．Ｆ． １００ｍｇ
風味 １ｍｇ
ステアリン酸マグネシウムＵ．Ｓ．Ｐ． ２ｍｇ

坐剤
活性成分 ０．０５〜２００ｍｇ
坐剤基剤 １９００ｍｇ
ジメチルスルホキシド ０．１〜３％

液剤
活性成分 ２．０％
ポリエチレングリコール３００、Ｎ．Ｆ． １０．０％
グリセリン ５．０％
亜硫酸水素ナトリウム ０．０２％
ソルビタン溶液７０％、Ｕ．Ｓ．Ｐ． ５０％
メチルパラベン、Ｕ．Ｓ．Ｐ． ０．１％
プロピルパラベン、Ｕ．Ｓ．Ｐ． ０．２％
蒸留水、Ｕ．Ｓ．Ｐ．（適量） １００．０ｍｌ（ｃｃ）
ジメチルスルホキシド ０．１〜３％

注射可能物質
活性物質 ０．０２〜２００ｍｇ
ポリエチレングリコール６００ １．０ｍｌ（ｃｃ）
亜硫酸水素ナトリウム、Ｕ．Ｓ．Ｐ． ０．４ｍｇ
注射用水、Ｕ．Ｓ．Ｐ（適量） ２．０ｍｌ（ｃｃ）
ジメチルスルホキシド ０．１〜３％

さらに、本明細書中に記述される事項を補足する手順又は他の詳細に関する情報は、参照により本明細書に具体的に援用される引用参照文献に記載されている。

本発明の新規教示から逸脱することなく、本明細書中に記載する好ましい実施形態に対して変更又は変形が成され得ることは、当業者に明らかであろう。このような変更及び変形はすべて、本明細書中及び特許請求の範囲内に包含されると意図される。

以下の実施例は、本発明の薬学的に活性な化合物、薬学的組成物及び治療の方法を説明すると意図されるが、それらを限定するものと意図されない。

ＴＬＲ３は、甲状腺細胞中で発現し、機能的であり、ウイルスによって病的に過剰発現する可能性があり、橋本甲状腺炎に関与し、その病的過剰発現状態又はシグナル伝達を、メチマゾール、メチマゾール誘導体、及び互変異性環状チオンによって逆転することができる。

ＴＬＲ３は、甲状腺細胞中に存在し、機能的である。

ＴＬＲ３は、甲状腺細胞中に存在する： ノーザンブロッティングを使用して、ラットＦＲＴＬ−５甲状腺細胞は^３２Ｐ標識マウスＴＬＲ３ ｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成する検出可能レベルの１つの５．８ｋｂ ｍＲＮＡを含み、マウス脾臓中に存在する（陽性対照）ことが示された。連続培養で成長したＦＲＴＬ−５甲状腺細胞上でのＴＬＲ３の存在は、無傷のマウスの甲状腺と重複しており、類似のサイズのＲＮＡを有していた。ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞、又はマウス肝臓のいずれにおいても有意なレベルの類似のサイズのハイブリッド形成バンドは認められなかったので、特異性を示した。特異性のさらなる証拠は、細菌ＤＮＡを哺乳類ＤＮＡと区別する特異的非メチル化ＣｐＧ−ＯＤＮ配列の認識に関与するＴＬＲ９ ｍＲＮＡは、脾臓細胞中の明らかな出現にもかかわらず、ＦＲＴＬ−５細胞の基底に発現されなかったという所見であった。マウス心臓由来のｍＲＮＡで検出された低レベルのＴＬＲ３ ｍＲＮＡは、マウスの心臓、肺、脳、及び腎臓中でのＴＬＲ３発現を研究した以前の報告と一致する（L. Alexopoulou, et al., Nature, 413:732-8, (2001)）。

これらのデータは、ＴＬＲ３ ｍＲＮＡがマウス甲状腺組織及びラット甲状腺細胞の基底に存在することを初めて証明している。しかし、本発明者らは、ウェスタンブロッティングによってＴＬＲ３タンパク質が発現したことも示すことができた。ＦＲＴＬ−５細胞の溶解物を、モノクローナルＴＬＲ３抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＴＬＲ３ ＭＡｂによって免疫沈降されたＦＲＴＬ−５細胞溶解物中で約１２０ｋＤａのタンパク質が検出された。陽性対照として、本発明者らは、ヒトＴＬＲ３発現ベクター又はマウス由来のもので一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞中に類似のサイズのＴＬＲ３タンパク質がＴＬＲ３ ＭＡｂによって検出されたことを示した。これは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をヒトＴＬＲ４発現ベクターでトランスフェクトした場合にはそうではなく、タンパク質の同定及び測定手段の特異性が証明された。これらのデータは、ＴＬＲ３が甲状腺細胞の基底に発現したことを確証した。以下の実験は、ＴＬＲ３が機能的であることを確証した。

ＴＬＲ３は甲状腺細胞で機能的である： ＴＬＲ３に特異的なリガンドである化学的に合成したｄｓＲＮＡである、ポリ（Ｉ：Ｃ）(K. Takeda, et al., Annu Rev Immunol, 21:335-76 (2003)、K. Takeda, et al., Cell Microbiol, 5:143-53 (2003)、L. Alexopoulou, et al., Nature, 413:732-8 (2001)）を、培養培地に加え、ＴＬＲ３シグナル伝達を刺激した。細胞外ｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ３−／−マウス由来線維芽細胞における細胞外ｄｓＲＮＡに対する応答の欠失から明らかなように、ＴＬＲ３で特異的に認識されることが知られている（L. Alexopoulou, et al., Nature, 413:732-8 (2001)）。ＮＦ−κＢ／ｐ３８ＭＡＰＫ及びＩＲＦ−３／ＩＦＮ−βのシグナルのＴＬＲ３活性化はＴＲＩＦで分岐する（K. Takeda, et al., Annu Rev Immunol, 21 :335-76 (2003)、K. S. Michelsen, et al., J Immunol, 173:5901-7 (2004)）（K. Takeda, et al., Cell Microbiol, 5:143-53 (2003)、H. Oshiumi, et al., Nat Immunol, 4:161-7 (2003)、M. Yamamoto, et al., J Immunol, 169:6668-72 (2002)、M. Miettinen, et al., Genes Immun, 2:349-55 (2001)、Z. Jiang, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:3533-8 (2004)）。本発明者らは、これらの経路の両方がＦＲＴＬ−５甲状腺細胞で活性化したか否かを求めた（asked）。

ＮＦ−６Ｂ経路の存在を、細胞外ｄｓＲＮＡ（ポリ（Ｉ：Ｃ））のｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃトランスフェクションＦＲＴＬ−５細胞とのインキュベーション、レポーター遺伝子活性の測定、ＮＦ−κＢコンセンサスオリゴヌクレオチドプローブを使用した非トランスフェクション細胞中のＥＭＳＡによって評価した。非処置細胞又は大腸菌ｄｓＤＮＡでインキュベートした細胞との比較によって、ポリ（Ｉ：Ｃ）はＮＦ−κＢ Ｌｕｃ活性を増加させた。抗ｐ５０又は抗ｐ６５と共に処置細胞由来の核抽出物を含むインキュベーションによってその機能が阻害されたが、抗体陰性対照として使用したｃ−ｒｅｌ、抗ｐ５２、又は抗ｒｅｌＢとのインキュベーションでは阻害されなかった主な複合体の外観によって証明されるように、ポリ（Ｉ：Ｃ）インキュベーションはまた、ｐ６５／ｐ５０ ＮＦ−κＢ複合体の形成を増加させた。

抗ｐ５０及び抗ｐ６５によるインキュベートの場合において、データは、ＭＨＣクラスＩ（G. Pasterkamp, et al., Eur J CHn Invest, 34:328-34 (2004)、C. Giuliani, et al., J Biol Chem, 270:11453-62 (1995)、S. I. Taniguchi, et al., Mol Endocrinol, 12:19-3, (1998)）又はＶＣＡＭ−１プロモーター(N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004)）と結合するｐ５０／ｐ６５の研究の結果と同様であった。ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、又はホルボールエステル、ＴＰＡで処理した細胞は、ＦＲＴＬ−５細胞におけるｐ６５／ｐ５０複合体の形成に対する陽性対照としての役目を果たした。

免疫ブロットにおけるリン酸化ＥＲＫ１／２の測定によって検出したところ、ポリ（Ｉ：Ｃ）インキュベーションはまた、１５分以内にＥＲＫ１／２ＭＡＰＫを活性化することができた。インスリン処置ＦＲＴＬ−５細胞由来の溶解物を、陽性対照として使用した。ルシフェラーゼ活性によって測定したところ、Ｅｌｋ１はまた、ＦＲＴＬ−５細胞トランスフェクタントにおけるレポーター遺伝子結合ＥＬＫ−１のポリ（Ｉ：Ｃ）処置によってトランス活性化された。ＥＬＫ−１を活性化することができるＩＬ−１β処置（K. Takeda, et al., Annu Rev Immunol, 21 :335-76 (2003)）を、陽性対照として使用した。

ＴＬＲ３活性に対するメチマゾール、メチマゾール誘導体、及び互変異性環状チオンの影響に最も重要且つ最も関連して、本発明者らは、ＴＬＲ３−ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β結合シグナル系もＦＲＴＬ−５甲状腺細胞中で発現することを示すことができた。ポリ（Ｉ：Ｃ）インキュベーションにより、ＩＦＮ−βプロモーター活性（図１Ａ）及びＩＦＮ−β ｍＲＮＡレベル（図１Ｂ）の両方が増加した。ＩＦＮ−βプロモーター活性を、ポリ（Ｉ：Ｃ）とｐＩＦＮ−β−ｌｕｃ構築物でトランスフェクトしたＦＲＴＬ−５細胞とのインキュベーションによって測定した。ポリ（Ｉ：Ｃ）インキュベーションにより、ＩＦＮ−βプロモーター活性が非常に増加したのに対して、大腸菌ｄｓＤＮＡは影響が無かった（図１Ａ、左のパネル）。対照として、内因性ＴＬＲ３を含まないｐＩＦＮ−β−ｌｕｃトランスフェクションＨＥＫ２９３細胞は、これらをヒトＴＬＲ３発現プラスミドで最初にトランスフェクトしない限り、ポリ（Ｉ：Ｃ）インキュベーションに応答できなかったことが証明された（図１Ａ、右のパネル）。ノーザン分析は有意なレベルのＩＦＮ−β ｍＲＮＡを検出できなかったにもかかわらず、遺伝子特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ分析（S. Yokoyama, et al, Biochem Biophys Res Commun, 232:698-701 (1997)）は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の添加によってＦＲＴＬ−５細胞中のＩＦＮ−β ｍＲＮＡが増加したことを証明した（図１Ｂ）。

ＩＲＦ−３は、ＴＬＲ３と連結した、ＴＲＩＦ経路におけるＩＦＮ−β遺伝子発現を増大する媒介物として活性化される必要があるので(K. Takeda, et al., Cell Microbiol, 5:143-53 (2003)、H. Oshiumi, et al., Nat Immunol, 4:161-7 (2003)、M. Yamamoto, et al., J Immunol, 169:6668-72 (2002)、Z. Jiang, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:3533-8 (2004)）、本発明者らは、ポリ（Ｉ：Ｃ）のインキュベーションが、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞においてＩＲＦ−３のトランス活性化活性を増大させたことをさらに示した（図１Ｃ）。ＩＬ−１βによるインキュベーションは同様に、陽性対照としての役目を果たした。

ＴＲＩＦアダプタータンパク質が、ＦＲＴＬ−５細胞においてＴＬＲ３及びシグナル発生と連結することができるか否かを見るために、本発明者らは、ＩＦＮ−β／ＴＩＲ含有アダプター分子（ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ）−１を誘導する野生型ＴＩＲドメイン含有分子アダプターの同時トランスフェクトが、ポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性ＩＦＮ−β遺伝子の活性化を高めるか否かを求めた。ＦＲＴＬ−５細胞におけるＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１の外因性発現は、用量依存的にポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性ＩＦＮ−βプロモーターの活性を高めるが、ＩＬ−１βが増加するＩＦＮ−βプロモーターの活性は高めない（図１Ｄ）。ＩＬ−１β（陰性対照）は、ＴＲＩＦ連結機構でＩＲＦ−３及びＩＦＮ−βを活性化しない(D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111:225-33 (2004)、L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004)、E. Cario, et al., Infect Immun, 68:7010-7 (2000)、K. S. Michelsen, et al., J Immunol, 173:5901-7 (2004)、Z. Jiang, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:3533-8 (2004)、M. Muzio, et al., J Immunol, 164:5998-6004 (2000)）。野生型又は優性阻害（dominant negative）（ＤＮ）のＭｙＤ８８（陰性対照）の過剰発現は、有意なポリ（Ｉ：Ｃ）誘導性ＩＦＮ−βプロモーターの活性化又は阻害をもたらさず（図１Ｄ）、またこれらは、ポリ（Ｉ：Ｃ）が増大したＮＦ−６Ｂルシフェラーゼ活性も有意に活性化又は阻害しなかった（データ図示せず）。

要するに、ＦＲＴＬ−５細胞はＴＬＲ３受容体を発現するのみではなく、細胞外のポリ（Ｉ：Ｃ）でインキュベートした場合、免疫細胞と同様に、ＮＦ−６Ｂ及びＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β経路の両方を通じてシグナル伝達するとされる。これらの二重活性化により、先天性免疫応答の遺伝子応答特徴がもたらされる（K. Takeda, et al., Annu Rev Immunol, 21:335-76 (2003)、K. Takeda, et al., Cell Microbiol, 5:143-53 (2003)、B. Beutler, Nature, 430:257-63 (2004)、K. S. Michelsen, et al, J Immunol, 173:5901-7 (2004)）。

ｄｓＲＮＡトランスフェクション又はウイルス感染による甲状腺細胞中のＴＬＲ３及びＴＬＲシグナル伝達の過剰発現： Ｉ型ＩＦＮは重要な中間体である。

ｄｓＲＮＡトランスフェクション及びＩＦＮ−βは、ＴＬＲ及びＴＬＲ３シグナル伝達の過剰発現を誘導する： ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞とポリ（Ｉ：Ｃ）とのインキュベーションにより、２４時間にわたってＴＬＲ３、ＰＫＲ、又はＭＨＣクラスＩのｍＲＮＡレベルは増加しなかったが、ポリ（Ｉ：Ｃ）インキュベーションによってＩＰ−１０ ｍＲＮＡが有意に増加し、且つＩＣＡＭ−１ ｍＲＮＡレベルがわずかに増加した。このことは、この実験におけるポリ（Ｉ：Ｃ）の機能活性を証明している（図２Ａ）。ＩＬ−１β（陽性対照）はＩＰ−１０及びＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡレベルも増加させたが、ＴＬＲ３、クラスＩ、又はＰＫＲのｍＲＮＡレベルは変化しなかった（図２Ａ）。これにより、ＴＬＲ３とのｄｓＲＮＡインキュベーションがＦＲＴＬ−５細胞中でのＴＬＲ３発現の有効な増加手段ではなく、自己免疫性炎症性疾患の発現で重要な遺伝子の変化も誘導されないことが示唆された。

ポリ（Ｉ：Ｃ）インキュベーションデータと際立って対照的に、ＦＲＴＬ−５細胞の細胞質へのポリ（Ｉ：Ｃ）のトランスフェクションにより、対照細胞（Ｃ）又はｄｓＲＮＡを使用しない偽トランスフェクション（Ｌ）と比較して、トランスフェクションから１２時間後及び２４時間後の両方で、ＴＬＲ３ ｍＲＮＡが非常に増加し、ＭＨＣクラスＩ、ＰＫＲ、ＩＣＡＭ−１、及びＩＰ−１０のｍＲＮＡレベルに増加した（図２Ｂ、レーン３及び７）。ｄｓＲＮＡと異なり、ｄｓＤＮＡトランスフェクションは、ＴＬＲ３ ｍＲＮＡの増加に少ししか有効ではなかったが、以前に報告されるように（K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sd USA, 96:2285-90 (1999)）、１２時間後のみで（図２Ｂ、レーン４及び８）、対照細胞（Ｃ）又は偽トランスフェクション（Ｌ）（図２Ｂ、レーン１、２、５、及び６）と比較して、ＰＫＲ及びＭＨＣクラスＩの増加に有効であり、ＩＣＡＭ−１及びＩＰ−１０のｍＲＮＡレベルにも同様に有効であった。これらの結果により、トランスフェクトしたｄｓＲＮＡのＴＬＲ３を増加させる作用は、ｄｓＲＮＡがインキュベーション中にＴＬＲ３に結合して受容体−リガンド相互作用によってシグナル伝達を誘導する能力と異なることが示唆される。これらは、ｄｓＲＮＡトランスフェクションがｄｓＤＮＡトランスフェクションの作用と異なるようであることも示した。これらの結果は、さらに、非免疫細胞におけるＴＬＲ３の過剰発現にはｄｓＲＮＡのＴＬＲ３への単なる結合ではなく病的刺激が必要であることを示した。

報告されているように(K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sd USA, 96:2285-90 (1999))、ｄｓＲＮＡトランスフェクション及びｄｓＤＮＡトランスフェクションは、ＰＫＲではなくＩＦＮ−βの誘導が主に異なる。それにもかかわらず、トランスフェクトしたｄｓＲＮＡによるＴＬＲ３過剰発現におけるＰＫＲの可能な活性化の役割を評価するために、本発明者らは、２−アミノプリン（２−ＡＰ）（図２Ｃ）（ＰＫＲ阻害剤）で細胞を処置した(L. J. Mundschau, et al., J Biol Chem, 270:3100-6 (1995))。ＴＬＲ３ ｍＲＮＡは、対照細胞（Ｃ）又は偽トランスフェクション（Ｌ）との比較により、２−ＡＰの存在下でｄｓＲＮＡトランスフェクションによって依然として増加した（図２ｃ、レーン７対３）。ＴＬＲ３発現の場合と同様に、２−ＡＰは、ＩＦＮ−β ｍＲＮＡレベルでｄｓＲＮＡトランスフェクション誘導性の増加を阻害しなかったが（図２Ｃ、レーン７対３）、２−ＡＰは、ｄｓＲＮＡトランスフェクションがＥＭＳＡ中でＮＦ−κＢ ｐ６５／ｐ５０複合体形成を増加させる能力を強く阻害した（図２Ｃ、下）。さらに、ｄｓＲＮＡトランスフェクション誘導性のＰＫＲ及びＭＨＣクラスＩの増加は、１０ｍＭの２−ＡＰによってわずかに減少しただけであったのに対して（図２Ｃ、レーン７対３）、ｄｓＲＮＡトランスフェクション誘導性のＰＫＲの増加は消失し、ＭＨＣ Ｉの増加は対照レベル付近まで減少した（図２Ｃ、レーン８対４）。これにより、２つのトランスフェクション剤によるＰＫＲ及びＭＨＣクラスＩの上方制御機構が異なり、ｄｓＤＮＡ効果は恐らくＮＦ−６Ｂ活性化に関与するのに対して、ｄｓＤＮＡトランスフェクション効果はＩＲＦ−３／ＩＦＮ−βシグナル伝達により関与する可能性があることが示唆された。本発明者らは、線維芽細胞をマイトマイシンで死滅させ、６週間にわたって腹腔内に注射した場合、ｄｓＤＮＡトランスフェクションがＴＳＨＲと共に線維芽細胞中でグレーブス病を引き起こすことを報告した((L. D. Kohn, et al., Research Ohio, In press, (2005)、K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci US A, 96:2285-90 (1999)、L. D. Kohn, et al., Int Rev Immunol, 19:633-64 (2000)、N. Shimojo, et al., Int Rev Immunol, 19:619-31 (2000)、K. Suzuki, et al., Clin Exp Immunol, 127:234-42 (2002))。ｄｓＤＮＡ効果は、基底に存在しないＴＬＲ９活性と一致し得るが、トランスフェクション及び食作用後の甲状腺細胞のリソソーム−エンドソーム画分で発現することができる。

ｄｓＲＮＡトランスフェクションによって産生されたＩ型インターフェロンがｄｓＲＮＡトランスフェクション後に甲状腺細胞のオートクリン／パラクリン活性化因子であり得る可能性を考慮し、確認した。マウスマクロファージと同様に(M. Miettinen, et al., Genes Immun, 2:349-55 (2001))、外因性に添加したＩ型ＩＦＮ（本発明者らの場合、ＩＦＮ−β）は、時間及び用量依存様式でＦＲＴＬ−５甲状腺細胞中のＴＬＲ３ ｍＲＮＡレベルを増加させた（表１）。高用量（１０００単位／ｍｌ）のＩＦＮ−γを使用した場合でさえ、増加は、ＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−γ）と重複しなかった（表１）。ＩＦＮ−βはまた、ＭＨＣ Ｉ、ＰＫＲ、及びＩＰ−１０のｍＲＮＡレベルも増加させ、ＴＬＲ３ ｍＲＮＡレベルの増加を伴った。

表１では、ＴＬＲ３及び幾つかの他の遺伝子のｍＲＮＡレベルに対するＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γの影響を、時間の関数として測定した。ＦＲＴＬ−５細胞を、１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γで１時間〜１２時間でインキュベートした。ＩＦＮ−βは、ＴＬＲ３、ＰＫＲ、ＭＨＣクラスＩ、及びＩＰ−１０のＲＮＡレベルの増加によってｄｓＲＮＡトランスフェクションの影響が重複したのに対して、ＩＦＮ−γは影響がなかった。同様に、細胞を１０単位〜１０００単位のＩＦＮ−β又はＩＦＮ−γで３時間刺激し、総ＲＮＡを精製し、２０μｇの総ＲＮＡを図２の放射性標識したｃＤＮＡプローブを使用してノーザン分析によって分析した場合、ＩＦＮ−βのみがＴＬＲ３、ＰＫＲ、ＭＨＣクラスＩ、及びＩＰ−１０のＲＮＡレベルを増加させた。

要するに、これらの実験は、トランスフェクトしたｄｓＲＮＡの作用メカニズムが、トランスフェクトしたｄｓＤＮＡのものとは異なっているというデータを支持している（K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:2285-90., (1999)）。このデータは、ＩＦＮ−βが、ＴＬＲ３を増大するｄｓＲＮＡのトランスフェクトの能力におけるメディエーター又はオートクリン／パラクリン媒介物であり得るという可能性を支持している。さらに、ｄｓＲＮＡトランスフェクトではなく、ｄｓＤＮＡの作用が完全にＰＫＲ依存性であり、ＮＦ−６Ｂシグナル経路と単に連結していると思われる。これに対して、ＩＦＮ−β、ＰＫＲ、及びＭＨＣ ＩのｍＲＮＡにおけるｄｓＲＮＡトランスフェクト誘導性の増大が、これまでに、Ｉ６Ｂ関連キナーゼ（ＩＫＫ）−ＩＫＫエプシロン／ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）を含むことが知られているウイルス活性化キナーゼ（ＶＡＫ）と結び付いたＩＲＦ−３関連シグナル伝達経路によるシグナル伝達の活性化に由来する可能性がある（S. Sharma, et al., Science, 300:1148-51 (2003)、K. A. Fitzgerald, et al., Nat Immunol, 4:491-6 (2003)、Z. Jiang, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:3533-8 (2004)、M. J. Servant, et al., J Biol Chem, 276:355-63 (2001)、M. J. Servant, et al., J Interferon Cytokine Res, 22:49-58 (2002)、M. J. Servant, et al., J Biol Chem, 278:9441-7 (2003)、J. Hiscott, et al., Ann N Y Acad Sci, 1010:237- 48 (2003)、H. Hemmi, et al., J Exp Med, 199:1641-50 (2004)）。

インフルエンザＡウイルスは、ｄｓＲＮＡのトランスフェクト並びにＴＬＲ及びＴＬＲ３シグナル伝達の過剰発現を誘導するＩＦＮ−βの作用を模倣する： ｄｓＲＮＡのインキュベートではなく、ＴＬＲ３レベルを増大させるｄｓＲＮＡのトランスフェクトの能力が、これまでに支持されてきたように、ＲＮＡを細胞に注入するウイルスの作用を模倣することが推測される（M. Yamamoto, et al., J Immunol, 169:6668-72 (2002)、M. Miettinen, et al., Genes Immun, 2:349-55 (2001)、L. Alexopoulou, et al., Nature, 413:732-8 (2001)、S. Sharma, et al., Science, 300:1148-51 (2003)、K. A. Fitzgerald, et al., Nat Immunol, 4:491-6 (2003)、Z. Jiang, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:3533-8 (2004)、J. Guardiola, et al., Crit Rev Immunol, 13:247-68 (1993)、R. Gianani, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 93:2257-9 (1996)、M. S. Horwitz, et al., Nat Med, 4:781-5 (1998)、H. Wekerle, Nat Med, 4:770-1 (1998)、C. Benoist, et al., Nature, 394:227-8 (1998)、Y. Tomer, et al., Endocr Rev, 14:107-20 (1993)、K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:2285-90 (1999)、J. Hiscott, et al., Ann N Y Acad Sci, 1010:237-48 (2003)、H. Hemmi, et al., J Exp Med, 199:1641-50 (2004)）。この可能性を試験するために、本発明者らは、ＦＲＴＬ−５細胞を一本鎖ＲＮＡウイルスであるインフルエンザＡウイルスに感染させた。

ＦＲＴＬ−５細胞のインフルエンザＡ型での２４時間の処置により、ノーザン分析（図３Ａ）によって測定したところ、ｄｓＲＮＡトランスフェクションがＴＬＲ３ ｍＲＮＡを過剰発現し、ＰＣＲ（図３Ｂ）によって測定したところ、ＩＦＮ−β ｍＲＮＡを増加させる能力を模倣した。注目すべきことは、ｄｓＲＮＡトランスフェクション及びインフルエンザＡ型の感染の両方ともまたＩＲＦ−１及びＭＨＣ ＩＩのｍＲＮＡレベルを増加させ（図３Ａ）、ｄｓＲＮＡトランスフェクションによって誘導されたあまり顕著でないＭＨＣ ＩＩ複合体がＭＨＣ ＩＩよりもＭＨＣ Ｉの方が高い応答を示す本発明者らの以前の結果と一致する（K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sd USA, 96:2285-90 (1999)）。データをＭＯＩ＝１で得て、同一又は１０倍超のＭＯＩでのコクサッキー又は単純ヘルペス感染と重複しなかった（データ示さず）。以下に考察するように、依然としてウイルス特異性をさらに調査している。

ＭＨＣクラスＩＩの増加は、既に証明されているｄｓＲＮＡトランスフェクションによるクラスＩの増加に従う（図２、K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sd USA, 96:2285-90 (1999)）。ＩＲＦ−１遺伝子の過剰発現は至適なＴＮＦ−α増加ＶＣＡＭ−１遺伝子発現及び白血球接着並びにＮＦ−κＢに必要であるので、ＩＲＦ−１の増加は興味深い（N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004)）。本データは、ＩＲＦ−１遺伝子の過剰発現はＴＬＲ３過剰発現を引き起こす同一の病的刺激に起因することを示唆する。以下の実験では、本発明者らは、フェニルメチマゾール（Ｃ１０）及びＭＭＩ（すなわち、メチマゾール）、メチマゾール誘導体、又は互変異性環状チミンがＳｔａｔ１リン酸化を阻害して、ＩＲＦ−１遺伝子発現を調節し（R. Pine, et al., Embo J, 13:158-67 (1994)）、この効果はＴＲＩＦ結合ＮＦ−６Ｂシグナル経路ではなくＴＲＩＦ結合ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−βを阻害する作用を反映することを証明する。

フェニルメチマゾール（Ｃ１０）、互変異性環状チオン、及びメチマゾール誘導体は、甲状腺細胞におけるＩＲＦ−３／ＩＳＲＥ／ＳＴＡＴ経路を介したＴＬＲ３シグナル伝達を阻害する。

Ｃ１０及びＭＭＩがＴＬＲ３発現及びシグナル伝達を阻害する： メチマゾール（ＭＭＩ）を自己免疫グレーブス病を治療するのに使用し、これは甲状腺ホルモン形成を阻害するため或る程度効果的である（D. S. Cooper, N. Engl. J. Med., 311:1353-62 (1984)）。しかし、ＭＭＩは広く活性のある免疫賦活剤として機能することによって自己免疫／炎症性疾患の長期寛解に寄与している。したがって、ＭＭＩはヒトにおいて乾癬を治療する（A. N. Elias, et al., Int. J. Dermatol, 34:280-3 (1995)）並びに全身性エリテマトーデス、自己免疫眼瞼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、甲状腺炎、及び糖尿病のマウスモデルを治療する（L. D. Kohn, et al., 米国特許第６，３６５，６１６号, April:(2002)、C. C. Chan, et al., J Immunol, 154:4830-5 (1995)、T. F. Davies, et al., J Clin Invest, 73:397-404 (1984)、P. Wang, et al., J Leukoc Biol, 73:57-64 (2003)）際の免疫抑制薬として使用されている。これは、ＦＲＴＬ−５細胞で異常に増大したＭＨＣ Ｉ及びＭＨＣ ＩＩ遺伝子の発現の転写阻害因子であり、自己免疫疾患を予防するＩ群のノックアウトの効果を模倣することが示唆されている（M. Saji, et al., J Clin Endocrinol Metab, 75:871-8 (1992)、V. Montani, et al., Endocrinology, 139:290-302 (1998)、L. D. Kohn et al.,米国特許第６，３６５，６１６号(2002)、E. Mozes, et al., Science, 261 :91-3 (1993)、D. S. Singer, et al., J Immunol, 153:873-80 (1994)）。フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、ＭＨＣ遺伝子発現を抑制する５０〜１００倍強力な誘導体である（L. D. Kohn et al., 米国特許第６，３６５，６１６号(2002)）。

本発明者らは、Ｃ１０及びＭＭＩがＴＬＲ３の発現及びシグナル伝達を阻害する能力を評価した。ＰＣＲによって測定したところ、Ｃ１０は、ｄｓＲＮＡのＩＦＮ−βでのトランスフェクション及びインキュベーションがＦＲＴＬ−５細胞のＴＬＲ３ ＲＮＡレベルを増加させる能力を妨害した（図４Ａ）。さらに、ノーザン分析により、Ｃ１０は、ＩＦＮ−β（図４Ｂ）及びｄｓＲＮＡトランスフェクション（データ示さず）がＴＬＲ３を増加する能力を妨害し、この妨害に関して、１０倍低い濃度のＭＭＩよりも有意に良好であった（０．５ｍＭ対５ｍＭ）。Ｃ１０の疎水性のために、ＤＭＳＯはＣ１０のビヒクルである。ＤＭＳＯは、基底活性に有意な影響を及ぼさず、本明細書中に記載の全実験において対照値として使用した。

Ｃ−１０及びＭＭＩは、ＩＦＮ−βがＰＫＲ及びＭＨＣクラスＩのＲＮＡレベルを増加させる能力を低下させるが、相対的にその低下はＴＬＲ３より低い（図４Ｂ）。Ｃ１０は、ＴＬＲ３ ｍＲＮＡの基底レベルをわずかに減少させ、対照ＰＫＲ又はクラスＩのＲＮＡレベルに影響を及ぼさなかった（図４Ｂ、レーン２対１）。したがって、ノーザンのデータにより、Ｃ１０は、ＭＭＩよりもはるかに広い範囲で、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞におけるＴＬＲ３誘導性先天性免疫応答の病的発現を遮断することができると示唆された。本発明者らは、Ｃ１０の作用機構を問題として取り上げた。

０．５ｍＭのＣ１０は、ｐＩＦＮ−β−ｌｕｃ構築物でトランスフェクトしたＦＲＴＬ−５甲状腺細胞とインキュベートした場合、ポリ（Ｉ：Ｃ）がＩＦＮ−βプロモーター活性（ルシフェラーゼ発光；Ｐ＜０．０１）を増加させる能力を阻害した（図５の左上、ポリ（Ｉ：Ｃ）対非処置（−））。使用濃度（ＭＭＩについては最大である（データ示さず））でさえ、Ｃ−１０は、ＭＭＩよりも有意に良好であった（Ｐ＜０．０５又はそれより良好）（図５の左上、ポリ（Ｉ：Ｃ）処置したＭＭＩ対Ｃ１０及び対非処置（−））。リポポリサッカリド（ＬＰＳ）インキュベーションはまた、ＩＬ−１βでの処置と同様に、ＦＲＴＬ−５細胞におけるＩＦＮ−βルシフェラーゼ活性を増加させ（図５左上）、両方の場合、０．５ｍＭのＣ−１０及び５ｍＭのＭＭＩが増加を有意に（Ｐ＜０．０５又はそれより良好）阻害した（図５の左上、ＬＰＳ又はＩＬ−１β＋Ｃ−１０又はＭＭＩ対非処置（−））。また、Ｃ−１０は、ＭＭＩよりも有意に良好であり（Ｐ＜０．０５又はそれより良好）（図５の左上）、値は基底レベルになった。

これらのデータにより、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞が機能的なＩＬ−１受容体を有することが確認される（図１Ｃも参照のこと）。ＩＬ−１受容体は、非ＴＲＩＦ結合機構によってＩＲＦ−３及びＩＦＮ−βを活性化することが報告されている(D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111:225-33 (2004)、L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004)、E. Cario, et al., Infect Immun, 68:7010-7 (2000)、B. Beutler, Nature, 430:257-63 (2004)、K. S. Michelsen, et al., J Immunol, 173:5901-7 (2004)、M. Muzio, et al., J Immunol, 164:5998-6004 (2000)、S. E. Doyle, et al., J Immunol, 170:3565-71 (2003))。ＬＰＳの主な標的はＴＬＲ４である。本発明者らは、ＦＲＴＬ−５細胞に対するＴＬＲ４ ｍＲＮＡの能力を証明することができたが、ＬＰＳ又はポリ（Ｉ：Ｃ）がＴＬＲ４ ｍＲＮＡを増加させる能力は証明できなかった（データ示さず）。これらのデータにより、Ｃ１０は活性化された特異的受容体（ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、又はＩＬ−１）又は使用した結合タンパク質（ＴＲＩＦ又は非ＴＲＩＦ）と無関係にＩＦＮ−βルシフェラーゼ活性の増加を阻害することができるが、ＭＭＩではその程度が有意に低いことが示唆されるであろう（図５の左上）。これらのデータにより、Ｃ１０が作用し得る共通の特徴が下流である（すなわち、ＩＲＦ−３トランス活性化を阻害することができる）ことが示唆された。

本発明者らは、ＩＲＦ−３シスレポーター系を使用して、Ｃ１０がＦＲＴＬ−５甲状腺細胞においてＩＲＦ−３トランス活性化活性を阻害する能力を測定した（図５の下）。本発明者らは、０．５ｍＭのＣ−１０とのインキュベーションが、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、又はＩＬ−１βによるＩＲＦ−３トランス活性化を有意に（Ｐ＜０．０５又はそれより良好）阻害するを示すことができた（図５の右上）。ＭＭＩは、有意にあまり有効でなかった（データ示さず）。

ＩＦＮ−βのオートクリン／パラクリン作用による他のＩＦＮ誘導性遺伝子活性化の手掛かりは、一部がＳＴＡＴＳのリン酸化によるＩＳＲＥで下流遺伝子を調節する作用である。ＳＴＡＴＳは、インターフェロン刺激応答因子（ＩＳＲＥ）及びインターフェロンγ活性化部位（ＧＡＳ）の重要なアクチベーターである。レポーター遺伝子としてのルシフェラーゼに結合したＩＳＲＥ配列（ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ）を使用して、本発明者らは、Ｃ−１０がポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、及びＩＦＮ−γによるＩＳＲＥ活性化の有効な阻害剤であることを示すことができた（表２）。ＩＳＲＥとＮＦ−６Ｂ結合部位との間の配列の類似性及びポリ（Ｉ：Ｃ）がＦＲＴＬ−５細胞においてＮＦ−６Ｂ−ｌｕｃを活性化する能力にもかかわらず、０．５ｍＭのＣ１０又は５ｍＭのＭＭＩの両方は、ポリ（Ｉ：Ｃ）増加ＮＦ−６Ｂ−ルシフェラーゼ活性への影響は最小であった（表２）。さらに、これらは、ポリ（Ｉ：Ｃ）又はＬＰＳ増加ｐ６５／ｐ５０複合体形成に任意の有意な影響を与えなかった（図６Ａ）。

表２に示すように、フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞においてポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、及びＩＦＮ−γがＩＳＲＥレポーター遺伝子を活性化する能力を阻害する。細胞を、ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ及びｐＲＬＴｋ−Ｉｎｔで同時トランスフェクトし、次いで、ＤＭＳＯ（−）又はＣ１０の存在下で、処置しないか（なし）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（１００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ−β（１００Ｕ／ｍｌ）、及びＩＦＮ−γ（１０００Ｕ／ｍｌ）で６時間処置した。デュアルルシフェラーゼアッセイシステムを使用してデータを得た。以下の２つの要素が類似するにもかかわらず、ＩＳＲＥ要素に対する影響は、ＮＦ−κＢレポータープラスミドと重複しない：
それぞれ、（ＴＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＣＣ）_５（配列番号３）対（ＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣ）_５（配列番号４）。データは、複数の実験の代表である。Ｃ１０は、ポリＩ：Ｃ、ＬＰＳ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、又はＩＦＮ−γがＮＦ−κＢ要素ではなくＩＳＲＥ要素を含む遺伝子の発現を増加させる作用を有意に阻害する。

さらに、Ｃ１０は、総タンパク質を変化させることなく、ウイルス（図６Ｂ）又はＩＦＮ−β（データ示さず）で刺激したＳｔａｔ１のリン酸化の顕著な阻害剤である（図６Ｂ）。本実験中のＤは、ビヒクル（ＤＭＳＯ）対照であった。

橋本病におけるＴＬＲ３発現： １型糖尿病のプロトタイプ
ヒトにおけるＴＬＲ３の発現及び調節は、ラット又はマウスとは非常に異なり得る。これに取り組むために、本発明者らは、最初に、Clontechの市販の組織ブロットを使用して、ＴＬＲ３ ＲＮＡをヒト甲状腺組織中で発現するか否かを調査した。本発明者らは、脾臓陽性対照と比較した場合、甲状腺組織中のＴＬＲ３ ＲＮＡ発現を検出した。したがって、結果は、マウス組織における本発明者らの所見と類似していた。

ヒト甲状腺細胞中のＴＬＲ３の存在及び機能性を確認するために、本発明者らは、培養したＮＰＡヒト甲状腺細胞におけるＴＬＲ３発現を評価した。ＮＰＡ甲状腺細胞は、乳頭状癌に由来するが、正常な甲状腺細胞の機能的性質を保持することが既知である。ｄｓＲＮＡ［ポリ（Ｉ：Ｃ）］でのトランスフェクションは、ノーザンブロットにおいてＴＬＲ３ ｍＲＮＡレベルを増加させることができるが、ｄｓＤＮＡによるトランスフェクション又はポリ（Ｉ：Ｃ）とのインキュベーションではできなかった。上記のようにＰＣＲで測定したところ、ｄｓＲＮＡはまた、ＩＦＮ−β ｍＲＮＡレベルを増加させることができるが、ｄｓＤＮＡトランスフェクションではできなかった。さらに、ＦＲＴＬ−５細胞及びｄｓＲＮＡトランスフェクションの場合と同様に、ＩＦＮ−βはＰＫＲ ｍＲＮＡレベル及びＴＬＲ３ ＲＮＡレベルを増加させた。最後に再び、ＦＲＴＬ−５細胞の場合のように、本発明者らは、０．５ｍＭのＣ１０はｄｓＲＮＡトランスフェクション又はＩＦＮ−βがＴＬＲ３ ｍＲＮＡレベルを増加させる能力を減少させるを示すことができた。

これまでのデータのまとめによって提示される基本的な問題は、ＴＬＲ３が培養物におけるヒト甲状腺細胞だけでなく自己免疫／炎症性疾患においてｉｎ ｖｉｖｏで過剰発現するかどうかであった。本発明者らは、免疫組織化学によって、ヒト甲状腺組織におけるＴＬＲ３タンパク質レベルを評価した。甲状腺組織の免疫組織化学を、ＴＬＲ３抗体（１：１００）を使用して行った。正常な甲状腺及びグレーブス病由来の組織では、免疫反応性ＴＬＲ３は検出されなかった。慢性リンパ球性甲状腺炎（橋本病）では、試験した患者の１００％で上皮細胞中にＴＬＲ３が検出された（細胞質中の褐色沈着物によって示される）（表３）。染色強度は、リンパ−形質細胞浸潤領域中の化生好酸性上皮で最も高かった。

ＴＬＲ３及びＩＦＮ−βは、橋本甲状腺炎患者の９５％の甲状腺で共に上方制御されるのに対して（表３）、ＰＫＲは、橋本甲状腺炎患者の５０％未満で上方制御される（表３）。これらの実験における陽性の甲状腺細胞は褐色であり、ＩＦＮ−β分析でリンパ球が褐色に染色されないことが甲状腺細胞と比較して顕著であった。橋本病甲状腺細胞におけるＴＬＲ−３シグナル伝達ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−βの増加は、橋本病におけるＴＬＲ３及びＰＫＲの関連性と比較し、グレーブス病対ＴＬＲ３発現におけるＩＲＦ−３／ＩＦＮ−βシグナル伝達の存在（ゼロである）と比較した場合、統計的に有意な様式でＴＬＲ３過剰発現と相関していた。

グレーブス病でのＩＲＦ−３／ＩＦＮ−βシグナル伝達の増加は、ｄｓＤＮＡトランスフェクション及び過剰発現したＴＳＨＲがグレーブス病を誘導する能力と一致する（L.D Kohn et al.の２００５年２月１７に出願された米国特許公報ＵＳ２００５／００３６９９３号）。ＴＬＲ９はｄｓＤＮＡを認識し、ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−βを介してシグナルも認識するので、この増加は、グレーブス病の場合のＴＬＲ９活性の発現と等しく一致する。

これらのデータのまとめは、ＴＬＲ３を非免疫細胞中で過剰発現することができ、ＴＬＲ３は先天性免疫遺伝子の応答を生じることができるので、適応的免疫細胞（ＴＨ１）応答が生じるという解釈と一致するが、これらに限定されない。関連する重要なシグナル系は、Ｉ型ＩＦＮである。メチマゾール、メチマゾール誘導体、及び互変異性環状チミン（例えば、Ｃ１０）は、ｄｓＲＮＡ又はウイルスがＴＬＲ３シグナルを過剰発現した場合に活性化されるＩＲＦ−３／Ｉ型ＩＦＮシグナル系の支配的な阻害によってこれを防止することができる。

材料及び方法
材料： ポリ（Ｉ：Ｃ）［合成ｄｓＲＮＡ］、内毒素無含有の大腸菌ＤＮＡ、マウスのＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１、マウス及びヒトのＴＬＲ３発現ベクターは、（Invivogen, San Diego, CA）から購入した。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１βは、（Biosource International, Camarillo, CA）から購入した。インスリン及び２−アミノプリンはSigma（St. Louis, MO）製である。この研究に使用した抗体は抗ＴＬＲ３（IMGENEX, San Diego, CA）、抗ＩＦＮ−β（Chemicon International, Temecula, CA）、抗Ｓｔａｔ１ＰＹ７０１（Cell Signaling Technologies, Beverley, MA）、抗Ｓｔａｔ１ｐ８４／ｐ９１ Ｅ−２３（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA）、抗ＰＫＲ（Cell Signaling Technology, Beverly, MA）、及び抗リン酸特異的ＥＲＫ １／２（Biosource International, Camarillo, CA）であった。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎユニバーサルクイックキット（Vector Laboratories, Burlingame, CA）抗体アンマスキング溶液及びＤＡＢ基質キットを使用した。Ｃ−１０はRicerca（Cleveland, OH）で記載されたように合成した（L. D. Kohn et al., 米国特許第６，３６５，６１６号(2002)）。Ｃ−１０はＤＭＳＯ中で２００ｍＭのストック溶液として調製した。ＭＭＩはSigma製であった。全ての他の材料源はこれまでに報告されたものと同じであった（K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:2285-90 (1999)）。

細胞： ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞（Interthyr Research Foundation, Baltimore, MD［ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８３０５］）のＦ１サブクローンは、ウシのＴＳＨ（１×１０^−１０Ｍ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、コルチゾール（０．４ｎｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、グリシル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−リジン酢酸塩（１０ｎｇ／ｍｌ）、及びソマトスタチン（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む６つのホルモンの混合物（６Ｈ培地）に加えて、５％のウシ血清、２ｍＭのグルタミン、及び１ｍＭの非必須アミノ酸で補充したクーン改変ハムＦ−１２培地で成長させた。ＨＥＫ２９３Ｈ細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA）は、１０％のウシ胎仔血清でＤＭＥＭ中に維持された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）は、１０％のウシ胎仔血清でハムＦ−１２培地中に維持された。

ＮＰＡ−８７細胞は、乳頭状上皮癌由来の連続した細胞系（continuous line）のヒトの甲状腺細胞である。これらは、ＴＳＨが増大したｃＡＭＰシグナル伝達を含む幾つかの機能的な応答を保持する（J. Xu, et al., J Clin Endocrinol Metab, 88:4990-6 (2003)）。これらはDr. Guy Julliardによって親切に提示され（University of California, Los Angeles, CA）、２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、０．１４ｍＭの非必須アミノ酸、１．４ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１０％のウシ胎仔血清（ｐＨ７．２）で補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で成長された。

ＲＮＡ単離及びノーザン分析： ＲＮＡはＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen Inc., Valencia, CA）及び製造業者によって記載された方法を使用して調製された。ノーザンでは、１５〜２０μｇの総ＲＮＡを変性アガロースゲル上に走らせ、Ｎｙｔｒａｎ膜（Schleicher & Schuell, Keene, NH）上にキャピラリーブロットし、ＵＶ架橋して、ハイブリッド形成を行った。プローブは、ラダーマン標識キット(Takara, Madison, WI)を使用して［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。ＭＨＣ Ｉ、ＩＣＡＭ−１、ＩＲＦ−１、ＰＫＲ及びＧＡＰＤＨに対するプローブが記載されている（K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:2285-90 (1999)）。ＩＦＮ−βに対するプローブは、遺伝子特異的なプライマー（これも記載されている）を使用して得られた（S. Yokoyama, et al., Biochem Biophys Res Commun, 232:698-701 (1997)）。ＴＬＲ３に対するプローブは、Invivogenの発現ベクターから得られたマウス又はヒトの総ｃＤＮＡであった。ＩＰ−１０プローブは、以下のプライマー：ｍＩＰ−１０（５'）：５'−ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＧＣＣＧ−３'（配列番号５）及びｍＩＰ−１０（３'）：５'−ＧＧＡＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＡＣＡＣＴＧＧ−３'（配列番号６）によるマウスのマクロファージの総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって調製された部分的なマウスのＩＰ−１０ ｃＤＮＡ（４６９ｂｐ）であった。これまでに記載されたように、膜をハイブリダイズし洗浄した（K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:2285-90 (1999)）。

ＲＴ−ＰＣＲ： ＤＮＡは、製造業者の取り扱い説明書に従って、ＤＮＡ−ｆｒｅｅキット(Ambion)を使用して総ＲＮＡから取り除いた。製造業者のプロトコルに従って、ＡｄｖａｎｔａｇｅのＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲキット（BD Biosciences）を使用してｃＤＮＡを合成するのにＲＮＡを１μｇ使用した。その後、ｃＤＮＡ ５０ｎｇをＴＬＲ−３、及びβ−アクチンのＰＣＲに使用し、ｃＤＮＡ ２５０ｎｇをＩＦＮ−βのＰＣＲに使用した。ヒトのＴＬＲ−３及びβ−アクチンの増幅に使用したプライマーはこれまでに記載されている（K. U. Saikh, et al., Clin Diagn Lab Immunol, 10:1065-73 (2003)）。ネズミのＩＦＮ−β及びＧＡＰＤＨに対する遺伝子特異的なプライマー並びにＰＣＲ条件が記載されている (S. Yokoyama, et al., Biochem Biophys Res Commun, 232:698-701 (1997)、K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:2285-90 (1999)）。ヒトのＩＦＮ−βプライマーは以下のようなものである：（５'プライマー）５'−ＴＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧ−３'（配列番号７）及び（３'プライマー）５'−ＴＣＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＡＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧＡ−３'（配列番号８）。ヒトのＴＬＲ−３及びβ−アクチンのＰＣＲ反応条件は、以下のようなものである：９４℃で５分間、その後９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル、及び７２℃で７分間の最終サイクル。ヒトのＩＦＮ−βのＰＣＲ反応条件は、９４℃で３分間、その後９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル、及び７２℃で１０分間の最終サイクルである。

レポーター遺伝子アッセイのためのプラスミド： ヒトのＩＲＦ−３がヒトのｃＤＮＡから増幅され、ＴＯＰＯ／ＴＡ(Invitrogen, Carlsbad, CA)のクローン化法によってｐＣＲ２．１にクローン化され、それからシークエンシングした。その後、ＩＲＦ−３は、ＥｃｏＲＩ消化によって切除され、トランス活性化アッセイに使用するためにｐＣＭＶ−ＢＤ(Stratagene, La Jolla, CA)にサブクローン化した。ＩＦＮ−β−ｌｕｃを構築するために、Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ポリメラーゼ（Takara, Madison, WI）を使用して、ヒトのＩＦＮ−βプロモーター配列をヒトのゲノムＤＮＡ(Clontech, Palo Alto, CA)から増幅した。ＰＣＲフラグメントは、転写開始部位（＋１）に比べて、−１２５〜＋３４であるヒトのＩＦＮ−βプロモーター配列を含み、それぞれ、５'末端及び３'末端にＫｐｎＩ制限部位及びＸｈｏＩ制限部位を組み込んだ。プライマーは以下のようなものである：ｈＩＦＮ−β（−１２５）ＫｐｎＩ（５'−ＣＡＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＴＴＴＴＡＧＡＡＡＣＴＡＣＴＡＡＡＡＴＧ−３'）（配列番号９）及びｈＩＦＮ−β（＋３４）ＸｈｏＩ（５'−ＧＴＡＣＴＣＧＡＧＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＧＡＡＡＧＧ−３'）（配列番号１０）。フラグメントはＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで消化し、それから同様に消化されるｐＧＬ３ベーシック（Promega, Madison, WI）ベクターにライゲーションした。ヒトのＭｙＤ８８野生型及び優性阻害発現ベクターはDr. P. E. Auronによって親切に与えられた。ｐＦＲ−ｌｕｃ（５×Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン及び最小のＴＡＴＡボックス）、ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、及びＥｌｋ１トランスレポートシステム（trans-Reporting System）はStratageneから購入した。ｐＲＬ ＴＫ−ＩｎｔはPromegaから購入した。

一過性発現分析： ＤＥＡＥ手順を使用して、ＦＲＴＬ−５細胞にプロモーター−ルシフェラーゼ遺伝子構築物及び発現プラスミドをトランスフェクトした。簡潔に述べれば、ＦＲＴＬ−５細胞を、２４ウェルプレート中で約７０％コンフルエンスまで成長させ、０．５ｍｌの無血清培養培地（６Ｈ０培地）で洗浄し、次いで、１ウェル当たり１２５μｌの予め作製されたプラスミド−ＤＥＡＥ混合物に室温で１５分間曝露した。各実験で別に記載しない限り、プラスミド−ＤＥＡＥ混合物を、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡの３．１２５μｌのＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ（１０ｍｇ／ｍｌ）（Promega,Madison WI）とのインキュベーションによって調製した。ＦＲＴＬ−５細胞を、この混合物とＣＯ_２インキュベータ中にて３７℃で２時間インキュベートし、その後、２ｍｌの６Ｈ５培地を添加した。発現ベクターのトランスフェクションのためのＣＨＯ−Ｋ１及びＦＲＴＬ−５細胞を、リポフェクション法に付した。細胞を、１０ｃｍ皿中で約８０％コンフルエンスまで成長させ、次いで、製造者（Invitrogen,CA）により記載のように、プラスミド−リポフェクタミン２０００混合物に曝露した。

免疫沈降及びウエスタンブロット分析： 全細胞溶解物が、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０）で調製された。核抽出物は、以下に示されるプロテアーゼ阻害剤（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）と共にＮＥ−ＰＥＲ抽出試薬を使用して調製した。２５μｇの全細胞溶解物又は核抽出物のいずれかをＮｕ−ＰＡＧＥシステム（Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用して、変性ゲル上で分解した。全てのタンパク質をニトロセルロース膜に移動させ、その後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を使用して抗体結合を明らかにした。免疫沈降では、４℃で６時間、抗ＴＬＲ３抗体（Imgenex, San Diego, CA）（１０μｇ／ｍｌ）で溶解物をインキュベートし、その後プロテインＧ−セファロースビーズ（Amersham Pharmacia Biotech）へ吸着した。沈殿物を洗浄し、上記のように分解した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を２０μｇの発現ベクターで一時的にトランスフェクトした。

核抽出物及びＤＮＡ移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）： ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で擦る（scraping）こと、及びＰＢＳで２回洗浄することによって、ＦＲＴＬ−５細胞を回収した。それから、核抽出物を、ＮＥ−ＰＥＲ抽出試薬（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）を使用して調製した。このプロトコルは製造業者の取り扱い説明書の通りであり、プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（塩酸ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ−６４プロテアーゼ阻害剤、レウペプチン、ペプスタチン）(Calbiochem)の存在を含んでいた。オリゴヌクレオチド（ＮＦ−κＢ センス５'−ＡＧＴ ＴＧＡ ＧＧＧ ＧＡＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＡＧＧ Ｃ−３'（配列番号１１）；ＮＦ−κＢ アンチセンス５'−ＧＣＣ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＧＴ ＣＣＣ ＣＴＣ ＡＡＣ Ｔ−３'（配列番号１２））がアニーリングされ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して［γ^３２Ｐ]−ＡＴＰで標識された。３μｇの核抽出物を使用して、ＥＭＳＡを行った。競合研究において、５０倍のモルの過剰な非標識オリゴヌクレオチド又は２μｇの抗体を混合物に添加した。^３２Ｐ標識化オリゴヌクレオチドプローブ（１００，０００ｃｐｍ）を添加し、インキュベートを室温で、２０分間継続した。５％の天然ポリアクリルアミドゲル上で混合物を分析し、オートラジオグラフィーを行った。

ウイルス感染： インフルエンザＡＡ／ビクトリア／３／７５を、Diagnostic Hybrids Inc. (Athens, OH)から得た。ＦＲＴＬ−５細胞を、６Ｈ成長培地中で６０％コンフルエンスまで成長させ、次いで、感染前に５Ｈ（−ＴＳＨ）培地中で７日間維持した。１０ｃｍの皿は、感染時に９５〜１００％コンフルエンスであった。７００万個のウイルス粒子を、５Ｈ培地中に細胞を含む１０ｃｍの皿にそれぞれ添加した。感染の２４時間前に、新鮮な５Ｈ培地を添加した。細胞をウイルスと２４時間インキュベートし、この時点で、Ｃ１０を培地に添加し、６時間インキュベートした後に回収した。

患者及び組織サンプル： 組織標本を、Ukrainian Center of Endocrine Surgery in Kievで処置した３０人の個体から得た。甲状腺病変を、２１症例においては橋本甲状腺炎に分類し、２０症例においあてはグレーブス病に関連する過形成に分類した。正常な甲状腺組織は、腺腫又は腫瘍のために甲状腺手術を受けた２０人の患者の対側腺に由来していた。１０％ホルマリンでの固定及びパラフィン包埋後、各標本について厚さ５μｍの連続切片を作製した。５μｍの切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。

免疫組織化学染色： 切片を脱蝋し、アルコールに浸漬し、抗原非マスキング溶液中で１０分間のマイクロ波処理後、３％過酸化水素中で１５分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼ活性を不活化した。次いで、切片を、抗ＴＬＲ３抗体（１００倍希釈）と４℃で一晩インキュベートした。製造者の説明書に従って、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｑｕｉｃｋキットの使用によって免疫染色を行った。３，３−ジアミノベンジジンにてペルオキシダーゼ染色を明らかにした。抗血清の省略によって陰性対照を適用した。

フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、ＴＬＲ３媒介性１型糖尿病からマウスを防御し、生存率を改善する。

実施例１では、本発明者らは、ＴＬＲ３及びＩＦＮ−βタンパク質が、免疫細胞に取り囲まれている橋本甲状腺炎患者由来の甲状腺細胞中にｉｎ ｓｉｔｕで発現するが、正常な個体又はグレーブス病の自己免疫性甲状腺機能亢進症由来の甲状腺細胞では発現しないことを示す。これは、以前に決して証明されていなかった新規の所見である。培養ヒト甲状腺細胞由来の結果は、ＴＬＲ３の活性化及びシグナル伝達の機能的増加はヒト及びラットの培養甲状腺細胞で起こり、リンパ球は主にＩＩ型インターフェロンを産生するので、これはリンパ球又はリンパ球産生ＩＦＮの非存在下で起こり得ることを示す（T. Taniguchi, et al., Annu Rev Immunol, 19:623-55 (2001)）。これと一致して、免疫細胞化学研究は、ＩＦＮ−βによる強い褐色の染色は甲状腺細胞に局在化し、免疫細胞中で有意ではないことを示す。したがって、結果から、甲状腺細胞が一次損傷（insult）の影響を受けてＴＬＲ３系を活性化し、樹状細胞のものを模倣した先天性免疫応答を生じるという可能性が得られる。受容細胞とは異なり、甲状腺細胞はリンパ器官を移動することができないので、得られたサイトカイン及び同時刺激分子の甲状腺細胞中での変化は、リンパ球の腺への誘引に寄与し得る。

本明細書中の結果は、驚いたことに、ＴＬＲ３の関与及び過剰発現、病原体誘導及びｄｓＲＮＡの役割、見かけ上のオートクリン／パラクリン因子としての１型ＩＦＮの関与、免疫細胞の浸潤、及び機能低下を引き起こす細胞特異的破壊を使用した別の疾患（すなわち、膵島炎及び１型糖尿病）の研究に類似している（D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111:225-33 (2004)、L. Wen, et al, J Immunol, 172:3173-80 (2004)）。Wen, et al. (L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004))は、ｄｓＲＮＡが動物において膵島炎及び１型糖尿病を誘導することができ、これは、既知の動物モデルと一致する（コクサッキーウイルスがＮＯＤマウスにおいて１型糖尿病を誘導する）ことを示している。Devendra and Eisenbarth (D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111 :225-33 (2004))は、ヒトとの関連性を強調し、エンテロウイルスが１型糖尿病の発症における潜在的因子として多数の研究で注目されていることに留意している。彼らは、β細胞が破壊されるウイルス感染機構がＩＦＮ−α（ＩＦＮβのようなＩ型ＩＦＮ）に関与することに留意している。彼らは、二本鎖ＲＮＡ又はポリ−ＩＣ（ウイルス模倣物）によるＴＬＲの活性化により、ＩＦＮ−αの誘導を介して、免疫媒介性β細胞破壊を活性化又は容易にすることができるとの仮説を立てている。彼らは、多数の臨床例から自己免疫疾患（特に、甲状腺炎（以下を参照のこと））でＩＦＮ−α療法が関与し、血清ＩＦＮ−αレベルの上昇が１型糖尿病及び甲状腺自己免疫／炎症性疾患に関連していることに留意している（M. F. Prummel, et al., Thyroid, 13:547-51 (2003)）。本発明のデータをまとめると、本発明者らは、疾患の発症と機構的に重要に関連する可能性があると見なした。橋本病及び１型糖尿病は、免疫細胞が浸潤し、甲状腺細胞が破壊されるか又はβ細胞が変化し得る。これは特定組織の細胞が最初に損傷を受けてＴＬＲ３が活性化し、組織細胞において先天性免疫応答が生じるからであり、この事象は発症機構における初期事象であり得る（D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111 :225-33 (2004)、L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004)、B. Beutler, Nature, 430:257-63 (2004)、K. S. Michelsen, et al., J Immunol, 173:5901- 7 (2004)）。

Devendra and Eisenbarthは、D. Devendra, et al.,（Clin Immunol, 111 :225-33 (2004)）は、（産生又は活性に関して）ＩＦＮ−αを標的化する治療薬が１型糖尿病及び自己免疫の予防に潜在的に有益であり得ると示唆している。実施例１は、Ｉ型ＩＦＮレベルを増加させるＴＬＲ３の過剰発現／シグナル伝達がメチマゾール（ＭＭＩ）又はそのより強力な誘導体であるフェニルメチマゾール（Ｃ１０）の免疫調整作用に感受性を示し得るか否か(M. Saji, et al., J Clin Endocrinol Metab, 75:871-8 (1992)、V. Montani, et al., Endocrinology, 139:290-302 (1998)、L. D. Kohn et al., 米国特許第6,365,616号 (2002)、E. Mozes, et al., Science, 261:91-3 (1993)、D. S. Singer, et al., J Immunol, 153:873-80 (1994))、さらに、どのようにしてデータはＣ１０がＭＭＩよりも有意に広い範囲で、ＮＦ−６Ｂシグナル経路ではなくＴＬＲ３調節ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β／ＩＳＲＥ／ＳＴＡＴシグナル経路の阻害によってＴＬＲ／ＴＬＲシグナル伝達の過剰発現を遮断することを示すのかについて注目した。これはＩＲＦ−３トランス活性化の単なる阻害よりも広範に作用し、したがって、他の遺伝子上の広範なＩＳＲＥ配列の活性化を阻害することができる。これに関して、ＮＦ−６Ｂ部位に加えて、ＩＲＦ−１は、Ｓｔａｔ１に結合するＧＡＳを有することに留意すべきである。Ｃ１０がＩＲＦ−１遺伝子発現を遮断する能力は、本明細書中及び本発明者らのＴＮＦ−∀誘導ＶＣＡＭ−１及び白血球接着のＣ１０阻害の研究の両方において、ＴＬＲ３調節ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β／ＩＳＲＥ／ＳＴＡＴシグナル経路の成分へのその作用に関連すると示唆することが妥当である。簡潔に述べれば、Ｃ１０は、Davendra及びEisenbathがその概説(D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111:225-33 (2004))で要望している新規の治療パラダイムを満たす作用因子の例であり得る。

ＮＯＤマウスは、１型糖尿病の原型的な例である。「清潔でない」動物施設での実験では、Ｃ１０は、ＮＯＤマウスにおける糖尿発症の遅延に有効であった（表４）。これを「清潔な」研究所で繰り返した場合、Ｃ１０の影響は認められなかった。しかし、留意すべきことは、マウスの糖尿の発症は、「清潔な」マウス施設と対照的に、「清潔でない」施設で維持された動物ではるかに早いことである（表４）。エンテロウイルスは、１型糖尿病の発現に関連し、１型糖尿病のコクサッキーウイルスマウスモデルで十分に説明されている。したがって、本発明者らは、本発明者らの結果を、清潔でない施設における疾患のウイルス誘導によって説明することができるとの仮説を立て、Ｃ１０が糖尿病のコクサッキーウイルス誘導性ＮＯＤマウスモデルで有効であるか否かを試験した。この仮説を試験するための実験では（表４）、Ｃ１０はこのモデルにおける糖尿の遅延及び死亡に有効であった。したがって、本発明者らは、Ｃ１０は、ＭＭＩ誘導体の代表的なリード化合物（互変異性環状チオンファミリー）として、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＬＲ３／ＴＬＲ３シグナル伝達疾患を逆転することができ、ＮＯＤマウスにおける糖尿病のコクサッキーウイルスモデル等において、疾患発現が環境病原体によって誘導される場合にこの疾患を予防することができる可能性が非常に高いと結論づけることができる。ＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体、薬物の互変異性環状チオンファミリーは、初期の損傷及び誘導期における損傷の繰り返しの両方を防止する可能性が高い。さらなる間欠療法は、疾患が完全に予防されない場合、誘導期の寿命を延ばすのに有用であり得る。ＮＯＤモデルは自己免疫性ヒト疾患の誘導に適用可能な機構及び療法の評価のために広く使用されており、且つ１型糖尿病と同様にヨウ化物誘導性甲状腺炎に関連することが示されているので、これをヒトにおける１型糖尿病と同様に橋本自己免疫性甲状腺炎に適用可能であろう。

表４は、Ｃ１０のＮＯＤマウスにおけるコクサッキーウイルス誘導性糖尿を弱める能力ことを示す。マウスを、無菌施設（「清潔」と呼ぶ）又はウイルス感染が起こり得る通常の施設（「不潔」と呼ぶ）に収容した。尿試験紙が１＋を超える陽性を示す動物が陽性であり、糖尿病であると見なす（L. S. Wicker, et al., Diabetes, 35:855-60 (1986)）。「不潔な」動物施設における実験では、Ｃ１０は、ＮＯＤマウスにおける糖尿発症の遅延に有効であった。これを、「清潔」又は無菌の研究所で繰り返した場合、Ｃ１０の影響は認められなかった。しかし、留意すべきことは、マウスの糖尿の発症は、「清潔な」マウス施設と対照的に、「不潔な」施設で維持された動物ではるかに早いことである。さらに、各群に８匹のマウスを有する実験では、不潔な施設でさえ、ＣＶＢ４ エドワーズコクサッキーウイルスの注射により、糖尿発現が進行した（最後の２つの行）。これらの結果により、Ｃ１０が遺伝的に感受性を示すＮＯＤマウスにおける１型糖尿病の環境又はウイルス誘導性発現を阻害することが示唆される。

糖尿病を罹患した動物では、糖尿は、血中レベルの測定にによって確認され、膵臓内のウイルス価が正であると判断され、糖尿病動物で２＋〜４＋の膵島炎が微視的に認められたが、Ｃ１０処置動物では認められなかった。

材料及び方法
糖尿病の誘導及び薬剤による治療： ＮＯＤ／Ｌｔの雌のマウスは、Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine)からのものであった。全ての実験は、「実験動物の管理及び使用に関する指針（Guide for Care and Use of Laboratory Animals）」（NIH Publication 85-23、１９８５年改訂）に従って行った。２００μｌのＰＢＳ又は５×１０^５ＰＦＵのＣＶＢ４エドワードコクサッキーウイルス株をマウスに腹腔内で注射した（D. V. Serreze, et al., J Virol, 79:1045-52 (2005)）。Ｃ−１０、ＭＭＩ、２．５％のＤＭＳＯ（Ｃ１０キャリア対照）、又はＰＢＳ（ＭＭＩキャリア対照）の腹腔注射でマウスを毎日処理した。注射の後、Ｃｈｅｍｓｔｒｉｐｓ（Boehringer Mannheim）を使用して、毎週、血液及び尿のグルコースレベルをモニタリングした。２４時間を超えて離れた２つの事象における連続した２４０ｍｇ／ｄｌを超える値が、糖尿病の特徴であると考えられた。実験では、最大３つの実験で８体のマウス／群を使用した。

ウイルス価の評価： 安楽死させたマウスの膵臓を秤量し、ＰＢＳに入れて、磨り潰し、超音波処理して、３回の凍結溶解サイクルにかけ、その後低速で遠心分離して（D. V. Serreze, et al., J Virol, 79:1045-52 (2005)）、上述のように分析のために膵島を単離した。清浄な溶解物をＰＢＳ中で段階希釈し、２００μｌのアリコートを３５ｍｍウェルの融合ＢＳＣ４０細胞（American Type Culture Collection）に添加した。１％メチルセルロース培地によるオーバーレイ（overlay：重層）及び３７℃で７２時間のインキュベートの後、オーバーレイを取り除き、単層をメタノール−オキサロ酢酸で固定して、それからクリスタルバイオレットで染色した。プラークを計測し、力価を以下のように算出した：プラーク数／接種量）／希釈係数。

インスリン欠乏症の評価： 膵臓をボーイン溶液で固定し、３つの非重複レベルに分割した（D. V. Serreze, et al., J Virol, 79:1045-52 (2005)）。粒状β細胞をアルデヒドフクシンで染色し、白血球をヘマトキシリン及びエオシン対比染色で染色した。膵島（１匹のマウス当たり少なくとも２０個）が０、病変無し；１、膵島周辺の白血球の凝集及び膵管周辺の浸潤；２、２５％未満の膵島破壊；３、２５％超の膵島破壊；及び４、完全な膵島破壊でスコア付けされる。それぞれのマウスに対するインスリン欠乏症のスコアは、それぞれの膵臓に対する全スコアを実験された膵島の数で割ることによって得られた。データは、平均インスリン欠乏症スコア±実験群に対する平均の標準誤差として求められた。

フェニルメチマゾールは、マウスをＴＬＲ４シグナルで媒介されたＬＰＳ誘導性内毒素ショックから守り、生存率を高める
内毒素ショックを引き起こすＬＰＳは、非免疫細胞、単球、マクロファージ及び樹状細胞でＴＬＲ−４受容体と結合し、それからＭｙＤ８８依存性（M. Yamamoto, et al., J Immunol, 169:6668- 72 (2002)、T. Ogawa, et al., Int Immunol, 14:1325-32 (2002)、K. Ruckdeschel, et al., J Immunol, 168:4601-11 (2002)）及びＭｙＤ８８非依存性（M. Yamamoto, et al., Nature, 430:218-22 (2004)）の２つのシグナル伝達経路を活性化する（S. Sato, et al., Int Immunol, 14:783-91 (2002)）。両方の経路がこの症候群の致命的結果をもたらす。ＭｙＤ８８依存性経路は、ＮＦ−κＢシグナル及びＭＡＰキナーゼシグナル系を活性化する。リン酸化反応及びＩκＢの分解の後、並びにＩκＢ由来のｐ５０及びｐ６５サブユニットの放出の後、ｐ５０及びｐ６０が核に侵入し、多様な遺伝子プロモーターと相互作用して、炎症促進性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＩＬ１２の合成及び分泌、並びに接着分子ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン、及びＭＣＰ−１等のケモカインの合成が引き起こされる（S. Uematsu, et al., J Immunol, 168:5811-6 (2002)、K. A. Ryan, et al., Infect Immun, 72:2123-30 (2004)）。これらの遺伝子産物は、全ての器官における炎症性症候群、全ての器官の急性全身障害、並びに低血圧、低体温症、及びショックの一因となるメディエーターの幾つかにすぎない。さらに、ＭｙＤ８８非依存性経路は、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）遺伝子プロモーター（ＩＲＦ−３）を活性化し、上方制御、ＩＮＦ−βの合成及び分泌、Ｓｔａｔ１の活性化、ＩＳＲＥ（インターフェロン感受性応答因子）による多様な遺伝子の活性化、並びにＩＲＦ−１及びケモカインＩＰ−１０の発現の増大を引き起こす（V. Toshchakov, et al., J Endotoxin Res, 9:169-75 (2003)、K. Hoshino, et al., Int Immunol, 14:1225-31 (2002)、T. Kawai, et al., J Immunol, 167:5887-94 (2001)、K. A. Fitzgerald, et al., Nat Immunol, 4:491-6 (2003)、K. Hoebe, et al., Nature, 424:743-8 (2003)、D. D. Bannerman, et al., J Biol Chem, 276:14924-14932 (2001)）。したがって、それぞれのシグナルを有する、両方のＴＬＲ４及びＴＬＲ４アダプター分子が、器官レベルで、毒素ショック症候群及び関連の細胞の炎症性浸潤に関与する。

メチマゾール（ＭＭＩ）は、グレーブス病の治療並びに全身性エリテマトーデス（D. S. Singer, et al., J Immunol, 153:873-80 (1994)、E. Mozes, et al., Isr J Med Sci, 32:19-21 (1996)）、自然発生的な自己免疫疾患（E. Mozes, et al., J Clin Immunol, 18:106-13 (1998)）、及び実験による全身性エリテマトーデスのマウスにおける眼周囲の炎症（C. C. Chan, et al., J Immunol, 154:4830-5 (1995)）に広く使用されている。ＭＭＩの抗炎症特性が、ＩＦＮ−γシグナル伝達に対する効果を含む抗酸化免疫調節の効果に寄与している（L. D. Kohn, et al., 米国特許第６，３６５，６１６号(2002)）。互変異性環状チオンのファミリーにおけるより強力なメチマゾール誘導体であるフェニルメチマゾール（Ｃ１０又はｐＭＭＩ）が、ＭＨＣ遺伝子発現を抑制するその能力に基づいて開発されているが（L. D. Kohn et al., 米国特許第６，３６５，６１６号(2002)）、ヒトの大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）及びヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＴＮＦ−αが増大した細静脈細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）の転写を阻害することがこれまでに示されている（N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004)）。Ｃ１０が、ＶＣＡＭ−１プロモーターにおけるＮＦ−κＢプロモーター因子のＴＮＦ−α活性化を阻害することによってではなく、インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）遺伝子のＴＮＦ−α誘導性の過剰発現を阻害することによって作用することを示していた（N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004)）。ＩＲＦ−１は、ＮＦ−κＢ因子よりもＶＣＡＭ−１プロモーターにおける転写開始部位により近い因子と結合し、ＶＣＡＭ−１プロモーターの最適なＴＮＦ−α活性化に必要である（N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004)）。

さらに、フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、腸上皮細胞におけるＴＬＲ４過剰発現に対するその下方制御効果及び病的に発現されたＴＬＲ４シグナル（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、インターフェロンタンパク質−１０（ＩＰ−１０）、及びＶＣＡＭ−１の遺伝子転写が含まれる）の減少によって、ＤＳＳ誘導性大腸炎の炎症応答を抑制し、生存率を改善することが示されたが、メチマゾール（ＭＭＩ）では認められなかった（L.D. Kohn, et al., Research Ohio, In press (2005)）。以下の研究では、本発明者らは、フェニルメチマゾール（Ｃ１０又はｐＭＭＩ）が内毒素性ショックの齧歯類モデル及びウマモデルにおけるＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４媒介性毒素性ショック症候群の病的シグナル伝達を逆転する能力に注目した。

２０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの研究では、マウスは注射から６〜１２時間後に毒素性ショック症候群（低血圧、低体温症、虚脱）を発症し、１２〜３６時間までに死亡した（表５Ａ）。フェニルメチマゾール（Ｃ１０又はｐＭＭＩ）は、本実験及び３つの個別の同型実験において、試験動物の１００％で（表５Ａ）ＬＰＳ注射後の死亡からマウスを防御した。この防御は、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）に起因し、Ｃ１０のために使用した溶媒（ＤＭＳＯ）によるものではなかった（表５Ａ）。ＬＰＳ注射から１２時間後に臨床症状をチェックした場合、ｐＭＭＩ又はＣ１０で処置したマウスは軽度の症状（すなわち、軽度の体温低下）を示したが、正常な食餌及び水飲み行動を維持し、運動性も同様であることが認められた（表５Ｂ）。著しく対照的に、全ての他のマウスは、顕著な低体温症、低血圧、及びショックを発症した（表５Ｂ）。このマウスは、消沈し、体温が低く、食餌及び水飲みが停止した（表５Ｂ）。さらに、重症ショックを発症した全てのマウスは、３６時間以内に死亡した（表５Ａ及び５Ｂ）。

表５： Ｃ１０は、ＬＰＳで攻撃誘発したマウスにおける生存率及びショックの徴候が劇的に増加する。（Ａ）２０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、１２時間以内にショック症状を示し、３６時間以内に死亡する。ＬＰＳ注射の３０分前にＣ１０（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に（ｉ／ｐ）注射した１００％のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは３６時間生存するのに対して、Ｃ１０よりも有効性が低いメチマゾール（ＭＭＩ）（L. D. Kohn, et al.の米国特許第６，３６５，６１６号(2002)）又はプレドニゾロン、及びメグルミンのフルニキシン（現在、ヒト及び動物におけるＬＰＳショックの治療のために臨床的に使用されている）で処置した全てのマウスは死亡した。Ｃ１０で処置したマウスは、観察期間の間は生存していた（４週間）。（Ｂ）さらに、Ｃ１０で処置したマウスは、ＬＰＳ投与の１２時間後にわずかな体温低下が認められただけで、ショックの徴候はなかった。（Ｃ）ＬＰＳでの攻撃誘発から１２時間後に０．１又は１ｍｇ／ｋｇの1日量で投与したＣ１０はまた、対照マウスの生存率０％と比較して生存率１００％である。

ｐＭＭＩ（Ｃ１０）の影響をメチマゾール（ＭＭＩ）、プレドニゾロン（ＰＳＬ）、及びメグルミンのフルニキシンと比較した場合でさえ、ｐＭＭＩ（Ｃ１０）のみによってショックから防御されたことが認められた（表５Ｂ）。今日、プレドニゾロンは、ヒトの療法で一般的に使用されており、メグルミンのフルニキシンは、動物治療で使用されている。ＬＰＳを注射し、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）以外の薬物で処置したマウスは、ＬＰＳ注射から１２時間後にショック徴候を示し、３６時間以内に死亡した（表５Ａ及び５Ｂ）。これは、重要な臨床上の意義を有する新規の結果である。

これらの実験では、１ｍｇ／ｋｇのＣ１０をＬＰＳ注射の３０分前に投与した。致死量のＬＰＳ注射から３０分後〜１２時間後に０．１〜１ｍｇ／ｋｇ投与したＣ１０はまた、１００％の症例で生存した（表５Ｃ）。ＬＰＳ注射後の処置時間及びＣ１０の用量（０．１〜１ｍｇ／ｋｇ）に応じて、低体温症及び軽度の低血圧等の幾つかの軽度のショック徴候がこれらのマウスで生じた。それにもかかわらず、まとめると、これらの結果は、Ｃ１０は、毒素性ショックの症状及び徴候が認められるが、内毒素ショック及びＬＰＳ誘導性内毒素性ショックにおける死亡の両方からマウスを防御することができ、ＬＰＳ処置後の毒素性ショック症候群を用量依存様式で逆転することができることことを示す。

ＩＲＦ−１、ＭＣＰ−１、及びＩＰ−１０、並びに下流遺伝子（炎症誘発性サイトカイン遺伝子、ＣＯＸ遺伝子、及びＩＮＯＳ等）は、マウスにおけるＬＰＳ誘導性内毒素性ショックによって変化し、首尾のよい療法に関連したＣ１０（ｐＭＭＩ）によって通常レベルに逆転する。

インターフェロン誘導性遺伝子（ＩＲＦ−１及びＩＰ−１０）がＭｙＤ８８非依存性ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β経路のＬＰＳ活性化後の報告された主な誘導性遺伝子であるのに対して、ＭＣＰ−１は、主にＭｙＤ８８依存性ＮＦ−κＢ結合経路によって活性化される遺伝子である。Ｃ１０がＩＲＦ−３、ＩＦＮ−β、Ｓｔａｔ１、ＩＳＲＥ、ＩＲＦ−１経路を遮断するが、ＮＦ−κＢ経路を遮断しないように作用する場合（N. Harii, et al., Mol Endocrinol, 19:1231-50 (2005)、(N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004)、及び上記）、本発明者らは、Ｃ１０がｉｎ ｖｉｖｏでＩＲＦ−１及びＩＰ−１０のみを阻害して、ＭＣＰ−１を阻害しないであろうと予想した。しかし、説明するように、これらの遺伝子の３つの全ての過剰発現は、ほとんどの器官でＣ１０（ｐＭＭＩ）によって正常レベルまで抑制された（図７）。したがって、ＬＰＳ処置は、ほとんどの器官でＩＲＦ−１ ＲＮＡレベルを顕著に増加させるが、肝臓ではあまり増加させず、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）は、ｍＲＮＡレベルを通常の条件下における正常な組織中のｍＲＮＡレベルに逆転した。ＩＰ−１０遺伝子発現は、ＩＲＦ−１よりも大量にＩＰ−１０が増加した肝臓を除いた全器官においてＩＲＦ−１パターンに従った。同様に、ＬＰＳ及びＬＰＳ＋Ｃ１０（ｐＭＭＩ）を使用したＭＣＰ−１パターンは、ＮＦ−κＢ経路のＬＰＳ活性化によって誘導されたＲＮＡ増加を減少させるこの作用因子の優れた能力を再現していた。簡潔に述べれば、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）は、ＭｙＤ８８非依存性経路及び依存性経路の両方で重要であることが報告されている遺伝子のＬＰＳ増加ｍＲＮＡレベルの有効な抑制因子であった。したがって、一次経路の選択性についてのｉｎ ｖｉｔｒｏでの証拠にもかかわらず、ＴＬＲ４媒介性ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−３／ＩＦＮ−βシグナル経路の両方の下流の遺伝子の病的発現が抑制された。ＭＣＰ−１のＮＦ−κＢ活性化がＩＦＮ−β活性に続く遅延シグナルの結果であり得ると文献中で示唆される。また、ｉｎ ｖｉｖｏで経路が重複することが可能であり、このことは、混合細胞集団（すなわち各組織中の血管内皮細胞の存在）に一部起因する。したがってまとめると、ｉｎ ｖｉｖｏでは、これらのデータにより、Ｃ１０がＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β誘導性経路における遺伝子発現を阻害し、二次ＩＦＮ−βがｉｎ ｖｉｖｏでＮＦ−κＢ経路に影響を及ぼす可能性さえもあると示唆された。

ｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＳ誘導性ＩＦＮ−βシグナル伝達及びＩＲＦ−１及びＩＰ−１０のＬＰＳ誘導性の増加がＳｔａｔ１活性化に対するＣ１０処置の影響によって弱められ得るか否かをより明確に決定するために、全組織溶解物中のＳｔａｔ１のタンパク質リン酸化レベルを、表５由来のマウスにおいて試験した。腎臓組織及び肺組織の両方は、ＬＰＳ＋対照溶媒（ＤＭＳＯ）で処置したマウスにおいてリン酸化フェニルアラニン７０１に特異的な抗体を使用して測定したところ、検出可能なレベルの活性化Ｓｔａｔ１タンパク質を示し、外因性ＬＰＳ注射に曝露したことがない対照（図８、レーン１及び４）との比較によってショックから防御されなかった（ぞれぞれ、図８のレーン２及び５）。これらのレベルは、Ｃ１０での処置によってＬＰＳ誘導性ショックから防御されたマウスにおいて基底レベルまで減少した（それぞれ、図８のレーン３及び６）。対照的に、ＬＰＳ及びＣ１０のいずれにおいても、これらの組織中の総Ｓｔａｔ１にいかなる影響も及ぼさなかった（図８、下のブロット）。これらのデータは、Ｃ１０が毒素性ショックにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＳｔａｔ１及びＩＲＦ−１の遺伝子発現を阻害することを確証する。免疫細胞に記載の文献研究及び本発明者らが非免疫細胞で記載の結果に基づいて（図４〜６、表２、表３）、Ｃ１０がｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでＳｔａｔ１／ＩＲＦ−１シグナルを遮断すると言及することが妥当であり、これは、毒素性ショック治療で重要であり、毒素性ショックにはこれらの遺伝子が関与するだけでなく、疾患発現にも重要である。したがって、Ｃ１０療法は、複数の組織の病的変化の軽減に重要であり、その臓器不全は毒素性ショックの徴候及び症状に寄与することが既知である。

炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、及びＩＦＮ−γは、ＮＦ−κＢ遺伝子活性化を介したＬＰＳ−ＴＬＲ−４−ＭｙＤ８８依存性経路の活性化によって合成及び分泌されると報告されている。これらの炎症誘発性サイトカイン遺伝子は、表５の動物由来の複数の組織における組織化学によって決定したところ、ＬＰＳで２４時間の内毒素性ショックの誘導によって強く増加した。しかし、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）処置によって誘導は抑制された。これは、ノーザン分析によって試験した全ての組織において、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αについて明らかであった（図９）。ＩＦＮ−γの場合、この現象は、試験したほとんどの組織で正しかった（図９）。これらの結果を、血中のサイトカイン濃度の決定によってさらに確認した（表６）。したがって、ＥＬＩＳＡ技法を使用して、ＬＰＳ及びＬＰＳ＋ＤＭＳＯ処置マウスで増加した多くのサイトカインレベルは、対照又はＬＰＳを投与したＣ１０（ｐＭＭＩ）処置マウスと比較して１０００倍を超えて上昇した（表６）。非常に明確には、フェニルメチマゾールＣ１０（ｐＭＭＩ）は、毒素性ショックにおける疾患発現に対する有効な影響を伴って、これらのサイトカインレベルを正常な対照マウスのレベルに減少させた。

まとめると、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＳ−ＴＬＲ−４−ＭｙＤ８８依存性及び非依存性経路によって誘導された炎症誘発性サイトカイン産生を抑制し、これは、その毒素性ショックを防止又は逆転する効果と一致した（表５）。データは、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）がＩＲＦ３／ＩＦＮ−β／Ｓｔａｔ１／ＩＳＲＥ／ＩＲＦ−１シグナル伝達経路を下方制御するという以前のｉｎ ｖｉｔｒｏでのデータ（N. Harii, et al., Mol Endocrinol, 19:1231-50 (2005)、N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004)）と一致する。しかし、データは、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞が不均質な非免疫器官において、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）がＮＦ−κＢ活性化経路に関与する遺伝子も調節し、これは恐らくＭｙＤ８８関連シグナル系の直接遮断よりもむしろ非免疫細胞に対するＩＦＮ−βオートクリン／パラクリン効果に対する二次効果によることが示唆される。

シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素系は、プロスタグランジン合成を触媒し、その組織レベルを調節する。プロスタグランジンは、内毒素性ショックにおける低血圧の誘導で重要であることが十分に説明されている。ＣＯＸ−２は、毒素性ショック及び毒素性ショックに関連する自己免疫性炎症性疾患で過剰発現し、癌の進行時にも過剰発現する。ＣＯＸ−２は、ＰＧＥ２形成の触媒を担い、ＰＧＥ２は敗血症性ショックにおける血圧低下及び低血圧を担うプロスタグランジンである。ＣＯＸ−２と対照的に、ＣＯＸ−１は、防御で役割を果たす「ハウスキーピング」酵素である。Ｃ１０は、ＬＰＳ誘導性内毒素性ショックによって組織中で増加するＣＯＸ−２発現を選択的に抑制して、ＣＯＸ−１遺伝子発現を増加させ、それにより、ＬＰＳ誘導性内毒素性ショックによって組織中で正常レベルまで減少する。ＣＯＸ−２／ＣＯＸ−１比は、疾患の発現及び治療有効性の両方において重要であると見なされている。

ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２のＲＮＡ発現レベルを、表５に記載の異なるマウス群の器官におけるＲＴ−ＰＣＲによって評価した場合、ＣＯＸ−１ ＲＮＡレベルは、ＬＰＳ処置マウスの脾臓及び心臓以外のほとんどの試験した器官で下方制御された一方で、Ｃ１０はＲＮＡレベルを正常レベルに戻した（図１０）。これらのデータは、ＣＯＸ−１が炎症過程における防御酵素であるので、Ｃ１０がＬＰＳによって誘導された損傷から細胞を防御することを示す。さらに、免疫細胞に支配されている脾臓に対するＬＰＳの影響はないが、肺、腎臓、及び肝臓ではＬＰＳ及びＣ１０の有意な影響があることは、Ｃ１０の支配的な増加及び有意な作用がこれらの組織中の非免疫細胞に対するものであることを示す。このことは、脾臓の場合と異なり、非免疫細胞がこれらの組織を支配するからである。

ＣＯＸ−１と対照的に、ＣＯＸ−２ ＲＮＡレベルは、内毒素性ショックを罹患したマウスの腎臓、肝臓、肺、脾臓、及び心臓で上方制御され（図１０）、それにより、全ての器官が強い炎症過程を被ることを確証している。さらに上昇したＣＯＸ−２ ＲＮＡレベルは、腎臓、肝臓、及び肺においてＣ１０によって完全に抑制されて正常に戻り、脾臓及び心臓でも抑制されるが、その抑制はあまり劇的ではなかった。これらのデータは、ＣＯＸ−１と比較してＣ１０が選択的なＣＯＸ−２阻害剤であり、正常レベルへのＣＯＸ−２の増加及びＣＯＸ−１の減少の両方の逆転によってより生理学的な調節因子として作用することを確証する。脾臓の変化は、免疫細胞におけるＣＯＸ−２酵素の変化が免疫細胞及び非免疫細胞における疾患発現の重要な成分であることを示す。それにもかからず、脾臓でＣＯＸ−１が変化しないことは、非免疫細胞においてＬＰＳに誘導され、Ｃ１０で減少するＣＯＸ−２の変化も毒素性ショック及びＣ１０によるその有効な療法で重要であることが強調される。

ＩＮＯＳは、ショック及び炎症の幾つかの最終的なメディエーターのうちの１つに過ぎない。内毒素性ショックにおける一酸化窒素（ＮＯ）の過剰生成は十分に報告されており、自己免疫性炎症性疾患及びアテローム性動脈硬化症においても報告されている。同様に、複数の経路由来のペルオキシ亜硝酸塩によって誘導された組織損傷が報告されている。データ（図１０）は、ＲＴ−ＰＣＲによって測定したことろ、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ遺伝子発現が正常な組織中で検出不可能であるか、又は不十分に発現されることを示す（図１０、非処置マウス）。この遺伝子は、マウス器官中でＬＰＳによって明らかに誘導される（図１０、脾臓、肝臓、肺、腎臓、心臓中のｉＮＯＳ）。Ｃ１０は、ＬＰＳによって増加したｉＮＯＳ ＲＮＡレベルが抑制され、正常レベルに戻った。これらのデータは、Ｃ１０が毒素性ショック及び自己免疫性炎症障害によって組織中に誘導されたペルオキシ亜硝酸塩形成及び組織損傷を改善することができるという考えを支持している。

ＩＲＦ−１は、自己免疫及び炎症に関与する幾つかの遺伝子の発現を調節する。ＩＲＦ−１によって調節された遺伝子には、特に、１型ＩＦＮサイトカイン（ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β）、２型ＩＦＮ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）及びＩＬ−１５、並びに一酸化窒素、ＣＯＸ−２、ＭＨＣ−Ｉ、及びβ−２ミクログロブリンが含まれる。したがって、ＩＲＦ−１は、微生物及び環境障害に対するＴｈ１応答及び宿主防御を生じる複数の異なる下流経路の交差点（intersection）に配置されるようであり、さらに、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４シグナルに影響を及ぼすように決定的に配置される。

図１〜１０及び表３〜６中のデータのまとめ及び本発明者らの以前の研究（L. D. Kohn et al.の米国特許第６，３６５，６１６号、２００年４月）から、Ｃ１０はｉｎ ｖｉｖｏで自己免疫性炎症性疾患を遮断し、正常組織では明らかでないＩＲＦ−１遺伝子発現の病的増加に対する重要な影響によって作用する作用因子群を代表するリード化合物であると仮定することが妥当である。これは、２つの重要な結果を有する。第１に、正常組織中で高いＩＲＦ−１遺伝子発現は認められないので、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）は、正常組織又は正常個体で有意に影響しない。第２に、ＩＲＦ−１遺伝子発現の病的増加を、非免疫性組織、マクロファージ、単球、及び樹状細胞におけるＴＬＲ３／ＴＬＲ４の病的発現によって媒介することができる。したがって、Ｃ１０は、ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ／ＩＳＲＥ／ＩＲＦ１シグナル経路の遮断による病的自己免疫性炎症性障害で重要な複数の遺伝子の病的発現を遮断するリード化合物である。さらに、ＮＦ−κＢシグナル遺伝子を二次的に増加することができる１型ＩＦＮのオートクリン／パラクリン作用によるか、又はおそらく、器官の細胞不均質及びシグナルの進行につれて異なる細胞に対するＣ１０の異なる影響（血管対非血管）により、以下に明らかなように、化合物のＣ１０ファミリーは、下流遺伝子又は遺伝子産物中のＮＦ−κＢシグナル伝達による増加をｉｎ ｖｉｖｏで減少させるように作用することができる。大腸炎及び毒素性ショックモデルにおけるＴＬＲ４関連障害及びＴＬＲ３媒介性疾患について証明され、さらに膵島炎及びＩ型糖尿病モデルについて（おそらくその関連疾患である橋本甲状腺炎についても）証明されるように、最終的な結果は、Ｃ１０及びそのファミリー成員がＴＬＲ４及びＴＬＲ３関連自己免疫性炎症性障害に関連する非免疫組織におおいて病的先天性免疫応答を遮断することである。

フェニルメチマゾール（ｐＭＭＩ又はＣ１０）は、微小血管損傷を改善し、炎症性細胞浸潤を減少させ、内毒素性ショックを罹患した組織の血管内皮細胞上での接着分子の発現を減少させる。

炎症性浸潤の減少： ＬＰＳ注射から１８時間後の動物由来のＨ＆Ｅで染色した切片の組織病理学的所見は、他の著者によって既に記載された炎症の変化を示した。これらの変化は、評価した異なる組織の微小循環で明らかであった。肺では、全てのこれらの変化が通常最も重篤であり、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４の両方が関連している（L. Guillot, et al., J Biol Chem, 280:5571-80 and 279:2712-8 (2004)）。したがって、本発明者らは、肺切片におけるＬＰＳによって誘導された炎症の変化に対するＣ１０（ｐＭＭＩ）の影響を評価した。２０倍及び４０倍で認めれた血流により、ＬＰＳ処置マウスでは、微小血管の管腔は血球で満たされており、急性炎症細胞数が増加していた（図１１）。血管内皮に沿った顆粒球の辺縁趨向（すなわち、動的流れの縁部への移動又は移動過程）及び血管内皮上の積層は、ＬＰＳ群でより明確であった。幾つかの動物では、組織病理学的写真がより重篤である場合、小血管の管腔中の微小塞栓が認められた。急性炎症細胞の浸潤及び移動によって、肺胞中隔が正常より肥厚し、それにより、ＬＰＳ処置マウスの肺組織中で急性炎症細胞がより密集する。微小循環系の損傷及び炎症細胞の浸潤は、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）によって改善された（図１１）。ＬＰＳによって誘導された炎症過程が明らかであった他の器官（例えば肝臓、心臓、又は腎臓）では、同一の結果が認められた。まとめると、これらのデータは、内毒素性ショックによって誘導された全身性炎症がＣ１０（ｐＭＭＩ）によって抑制されたことを示した。

内毒素性ショックを罹患している器官の血管内皮中で上方制御される接着分子は、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）によって抑制される： 異なる器官由来の切片を免疫組織化学によって研究して、内毒素性ショックにおけるＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１接着分子に対するｐＭＭＩの影響を評価した。ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１の両方は、敗血症性ショックにおいて内皮に結合して組織に浸潤するための全身性炎症細胞のリガンドである。さらに、炎症細胞による器官の浸潤は、全身性器官不全に強く関連している。データは、ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１接着分子がＬＰＳで処置された内毒素性ショックを罹患したマウスにおいて強く上方制御されることを示していた。ＩＣＡＭ−１は、肺及び肝臓で過剰発現する。肺毛細血管の内皮細胞のＩＣＡＭ−１特異的染色はＣ１０（ｐＭＭＩ）によって減少し、静脈の内皮細胞及び肝臓の細網内皮空隙（space）でも同様であった。ＶＣＡＭ−１は、大静脈で特異的に上方制御され、Ｃ１０（ｐＭＭＩ）は、ＶＣＡＭ−１レベルを抑制する。

したがって、これらの結果は、ＬＰＳを注射したマウスにおいて、ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１染色は明らかに増加し、正常なマウス及びＣ１０（ｐＭＭＩ）処置マウスよりも強かったことを示した。結果は、Ｃ１０処置マウスの結果をＬＰＳ＋ＤＭＳＯ処置マウス由来の結果又はＬＰＳのみで処置した結果と比較して同一であった。これらのデータは、Ｃ１０（ｐ−ＭＭＩ）が内皮細胞でのＬＰＳ−ＴＬＲ４活性化によって誘導されるＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１の過剰発現を共に抑制することを示した。

材料及び方法
実験デザイン： Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存曲線を作成するために、このマウスに異なる薬物及び溶媒（以下の表７を参照のこと）を腹腔内（ｉ／ｐ）に注射し、３０分後にＬＰＳを注射した（以下のスキーム１を参照のこと）。次いで、２０ｍｇ／Ｋｇの大腸菌由来のＬＰＳを、各マウスの腹腔内（ｉ／ｐ）に注射した。それぞれ３回の実験において少なくとも８匹のマウスを使用して実験を行った。ＬＰＳ注射後、６時間、１２時間、１８時間、３６時間、及び１週間で生存曲線を作成した。結果を、ＬＰＳ処置を行わない生存率に対する比率として示す。

腹腔内ＬＰＳ注射による内毒素性ショックの誘導から１８時間後にマウスを評価した。ｍＲＮＡの単離、組織学、及び免疫組織化学のためにサンプルを回収した（スキーム１を参照のこと）。脾臓、肺、肝臓、心臓、及び腎臓におけるＬＰＳ−ＴＬＲ４増加ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＣＯＸ−２、ｉＮＯｓ、及びＭＣＰ−１遺伝子発現に対するＣ１０（ｐＭＭＩ）の影響を、ノーザン分析及びＲＴ−ＰＣＲによって測定した。結果を、ＥＬＩＳＡを使用したタンパク質研究及び免疫組織化学によって確認した。ＬＰＳ−ＴＬＲ４−ＭｙＤ８８非依存性のＩＦＮ−βシグナル伝達した遺伝子（ＩＲＦ−１、ＩＰ−１０、ＣＯＸ−２、及びｉＮＯＳが含まれる）を同様に研究した。遺伝子発現及びタンパク質発現の結果は、組織学的研究と相関していた。１８時間後に得た組織も使用して、器官レベルでの全身性炎症応答を測定した。接着分子ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１の発現は、炎症の免疫組織化学マーカー及びＴＬＲ４シグナル伝達の変化と相関していた。肺を、炎症組織学研究の基準器官として使用し、肺及び肝臓を接着分子研究のために使用した。

組織学： 正常なマウス、ＬＰＳ処置マウス、及びＬＰＳ＋Ｃ−１０処置マウス由来の肝臓、肺、腎臓、及び心臓由来の組織（表５の実験）を、４％ＰＢＳ−ホルマリン中で一晩固定した。次いで、アルコール５０％−７０％−９０％−１００％で連続的に脱水し、クロロホルム中で明澄化し、パラフィルムに包埋した。５μｍの切片を得て、Ｖｅｃｔａｂｏｎｄ（商標）(Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA)で前処理したスライド上にマウントした。切片を、キシロール中にて２回インキュベートし（それぞれ１０分間）、連続アルコール処理（１００％−９０％−７０％−５０％）及びその後蒸留水によって再水和した。組織を、標準的プロコールを使用してヘマトキシリン−エオシンで染色し、マウントし、二重盲検様式で光学顕微鏡によって観察した。

免疫組織化学（ＩＨＣ）： ＬＰＳによって誘導された接着分子の過剰発現に対するＣ１０（ｐＭＭＩ）の影響を、異なる器官で研究した。これらの結果は、肺及び肝臓に注目する。ＬＰＳ注射から１８時間後、マウスを屠殺し、心臓、肺、肝臓、脾臓、及び腎臓を取り出し、４％ホルマリンのＰＢＳ溶液で固定した。次いで、組織を、連続アルコール（５０％ｖ／ｖ、２回；７０％ｖ／ｖ、２回；８０％ｖ／ｖ、２回；９５％ｖ／ｖ、２回；及び１００％ｖ／ｖ、２回）で脱水し、純粋なクロロホルムで明澄化し、パラフィンに包埋し、切片にし（厚さ５μｍ）、Ｖｅｃｔａｂｏｎｄ（商標）(Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA)で前処理したスライド上にマウントした。次いで、切片を、キシロールへの２回の曝露（それぞれ１０分間）によってパラフィンを除去し、連続アルコール処理（１００％−９０％−７０％−５０％）を使用して再水和した。３％Ｈ_２Ｏ_２を含むメタノールでの内因性ペルオキシダーゼ阻害及び５％ＢＳＡ（Sigma Aldrich）を使用した非特異的タンパク質のブロッキング後、組織切片を、一次抗体としての５μｌ／ｍｌの抗マウスＶＣＡＭ−１ポリクローナルヤギＩｇＧ又は３μｌ／ｍｌの抗マウスＩＣＡＭ−１細胞外ドメイン特異的ヤギＩｇＧ(R&D System, Inc. Minneapolis, MN)で４℃で一晩インキュベートした。サンプルをＰＢＳで大規模にリンスし、ヤギエクストラビジン染色キット(Sigma-Aldrich St. Louis, MO)を使用して２０倍希釈したビオチン化抗ヤギＩｇＧでインキュベートした（１時間）。大規模な洗浄後、切片を、同一のキット由来の２０倍希釈したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼでインキュベートした。次いで、切片を３回洗浄し、ＤＡＢ色素試薬（Sigma-Aldrich）でインキュベートした（１０分間）。スライドを洗浄し、メチルグリーン(Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA)を使用して対比染色し、エタノール及びその後純粋なキシレンで脱水した。スライドをマウントし、４０倍の光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ−Ｅ６００）下で試験した。

血中の炎症誘発性サイトカインの定量： 血清中のサイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１２を、ＥＬＩＳＡ技法を使用して定量した。麻酔下で眼の内眼角から採血し、血清を取り出し、使用するまで−２０℃で保持した。ＥＬＩＳＡキットはR&D Systemのものであり、結果を、ｐｇ／ｍｌの血清で示した。

ＲＮＡ単離及び遺伝子発現のノーザンブロット分析： ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＩＲＦ−１、ＩＰ−１０、及びＭＣＰ−１の遺伝子発現を測定するために使用するＲＮＡを、トリゾール(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して抽出し、以前に記載の様式と同様の様式でのノーザンブロット分析に付した(V. Toshchakov, et al., J Endotoxin Res, 9:169-75 (2003))。ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡは、Clontech (Palo Alto, CA)の製品であった。ＴＮＦ−α ｃＤＮＡを、ｐＯＲＦ９−ｍＴＮＦベクター(Invivogen, San Diego, CA)から切り出した。他のプローブ配列を、以下のｃＤＮＡ特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ（前出）によって合成した。

ｍＩＰ−１０：５' ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＧＣＣＧ ３'（配列番号１３）及び５' ＧＧＡＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＡＣＡＣＴＧＧ ３'（配列番号１４）（４６９ｂｐ）；ｍＩＬ−１β：
ＣＴＣＡＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣ ３'（配列番号１５）及び５' ＣＣＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＣＴＧ ３'（１００６ｂｐ）（配列番号１６）。

ＲＮＡ単離及び遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析： ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、及びｉＮＯｓの発現を、異なる器官で研究した。組織を、異なるマウス群から単離し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２〜７．４）で洗浄した。組織を０．５ｍｌのトリゾール(Invitrogen, Carlsbad, CA)中で均質化した後、ＲＮＡをクロロホルム−イソプロパノールによって抽出し、７０％アルコールで洗浄し、乾燥させ、ＲＮアーゼ無含有水に再溶解した。ＤＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ ｃａｔ＃ １９０６）を使用して総ＲＮＡを処理して、任意のＤＮＡ夾雑物を除去した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＲＴ ｆｏｒ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｃａｔ ＃ Ｋ １４０２−２）を使用してｃＤＮＡを得た。各プライマー組のための条件を至適化した後、Ｔａｋａｒａ ｋｉｔ ｆｏｒ ＰＣＲ（Takara BIO, Inc, Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃ ＲＯＯ１Ａによる）を使用してＰＣＲを行った。標準的な手順を使用してプライマーを設計し、BIO Synthesis Incから得た。特異的ＤＮＡ増幅後、サンプルを、４％臭化エチジウムを含むＴＡＥ緩衝液の２％アガロースゲルで泳動した。サンプルを蛍光強度によって分析した。Ｃｏｘ−１、Ｃｏｘ−２、ｉＮＯｓ及び「ハウスキーピング遺伝子」、ＧＡＰＤＨに対する相対量のＲＮＡが、連結した逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって求められた。それぞれの場合に使用したプライマーは以下のようなものであった：Ｃｏｘ−１センスプライマー５'ＣＣＣＡＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＣＧＡＡＧＧＡＧ−３'（配列番号１７）、アンチセンス５'−ＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＣＴＣＧＧ−３'（配列番号１８）；Ｃｏｘ−２センスプライマー５'−ＧＣＡＡＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＣ−３'（配列番号１９）、アンチセンスプライマー５'−ＧＣＡＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧ−３'（配列番号２０）；ｉＮＯＳセンスプライマー５'−ＣＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＣＧＡＣＡＧＣＧＧＣ−３'（配列番号２１）、アンチセンスプライマー５'−ＧＧＣＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＧＴＧＧＣＴＴＴＧＧ−３'（配列番号２２）。

フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、マクロファージにおけるＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４シグナル伝達を減少させる。

ＬＰＳで処置した動物におけるマクロファージは、炎症応答の調節因子である多数の遺伝子の迅速な誘導を示す(M. A. Dobrovolskaia, et al., Microbes Infect, 4:903-14 (2002))。培養マウスマクロファージ自体はまた、ＬＰＳで処置した場合、炎症応答の調節因子である多数の遺伝子の迅速な誘導を示す(M. A. Dobrovolskaia, et al., Microbes Infect, 4:903-14 (2002))。どのようにしてＣ１０は本発明の動物モデルにおいて内毒素性ショックを防止することができるのかということについてより完全に理解するために、本発明者らは、培養マウスマクロファージ、特に、マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７におけるＬＰＳ刺激遺伝子に対するＣ１０の影響を試験することを選択する。ＲＡＷ２６４．７細胞は、形質転換された機能的マクロファージ細胞株である(W. C. Raschke, et al., Cell, 15:261-7 (1978))。ＲＡＷ２６４．７細胞株は、マクロファージに対するＬＰＳの影響をさらに理解するために使用した化学文献における一般的で十分に許容されるツールであった(V. Toshchakov, et al., J Endotoxin Res, 9:169-75 (2003)、T. Horng, et al., Nat Immunol, 2:835-41 (2001)、D. Schilling, et al., J Immunol, 169:5874-80 (2002)、B. W. Jones, et al., Ann Rheum Dis, 60 Suppl 3:iii6-12 (2001))。

本発明者らは、現在の一連の文献で関連すると考えられる遺伝子の発現プロファイルを研究した。したがって、本発明者らは、多機能且つ複雑な一連の因子（炎症誘発性サイトカイン（ＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２）、ＣＸＣケモカイン（ＩＰ−１０）、一酸化窒素（ｉＮＯＳ）の産生を触媒する酵素、及び転写因子（ＩＲＦ−１）が含まれる）に対するＣ１０の影響を試験した。各因子は、内毒素性ショックで役割を果たすと報告されている(M. A. Dobrovolskaia, et al, Microbes Infect, 4:903-14, (2002))。炎症誘発性サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２を、ＴＬＲ４を介したＬＰＳシグナル伝達によって直接又は間接的に誘導することができ(M. A. Dobrovolskaia, et al., Microbes Infect, 4:903-14, (2002))、内毒素性ショックで或る特定の役割を果たすにもかかわらず(N. C. Riedemann, et al., J Clin Invest, 112:460-7, (2003))、最近の報告では、重要な二次エフェクターとしてＩＦＮ−βが同定された。ＩＦＮ−βは、ＴＬＲ４シグナル伝達のＬＰＳ活性化の際に誘導され、マウス敗血症性ショックモデルの死亡率に寄与する(M. Karaghiosoff, et al., Nat Immunol, 4:471- 7, (2003))。ＩＦＮ−βがマウス内毒素性ショックモデルにおける動物の死亡率で重要な役割を果たすという証拠のために(M. Karaghiosoff, et al., Nat Immunol, 4:411-1 (2003))、本発明者らは、ＩＦＮ−β依存性機構のＬＰＳ刺激に対するＣ１０の影響をより詳細に試験した。

結果
ＬＰＳ誘導性遺伝子は、培養マウスマクロファージ中で下方制御される： ＬＰＳは、単球及びマクロファージを活性化して、サイトカイン（ＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２等）を産生することができ、これらのサイトカインが敗血症性ショックで起こる炎症過程を調節するようにマクロファージ／単球自体又は他の標的細胞のいずれかに作用する(M. A. Dobrovolskaia, et al., Microhes Infect, 4:903-14, (2002))。ＬＰＳでの刺激の際、マクロファージはまた、ＩＰ−１０等のＣＸＣケモカインを産生することができ、このケモカインは、炎症部位に免疫細胞をさらに誘引するように作用する(K. M. Kopydlowski, et al., J Immunol, 163:1537-44 (1999))。ＬＰＳで刺激したマクロファージはまた、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現の結果として一酸化窒素（ＮＯ）を産生することができる(C. Bogdan, Nat Immunol, 2:907-16 (2001))。

敗血症性ショックの発症で重要であると見なされるこれらの各因子は、典型的には、ノーザン分析（図１２Ａ、レーン１）又はｉＮＯＳについてのＲＴ−ＰＣＲ（図１３Ａを参照のこと）によって確認したところ、非刺激ＲＡＷ２６４．７マクロファージは存在しないか、又は非常に低レベルで見出される。ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で１、３、又は６時間のマウスマクロファージの刺激の際、ノーザンブロット分析により、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＰ−１０、及びＩＬ−６についてのＣ１０又はビヒクル対照（ＤＭＳＯ）の存在下でのｍＲＮＡ発現プロファイルが明らかとなった（図１２Ａ）。測定した各ｍＲＮＡの場合、ＤＭＳＯレーンとＣ１０レーンとの間で異なっていた。この影響はＴＮＦ−αではあまり顕著ではなく、ＬＰＳがＮＦ−κＢシグナル伝達機構を介したＴＮＦ−αを直接増加させる能力に寄与し得る。

ノーザンブロッティングが遺伝子発現レベルの信頼できる定量的決定方法を提供する一方で、マクロファージにおけるＬＰＳ誘導性サイトカインの遺伝子発現に対するＣ１０の影響を正確に決定するために、より定量的且つ感度の高い方法が必要であった。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）を使用して、Ｃ１０によるｍＲＮＡ発現阻害の定量的プロファイルを得た。本発明者らは、ＤＭＳＯ対照の存在下又はＣ１０薬処置におけるＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）での処置から１、２、３、４．５、又は６時間後のＩＦＮ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びＩＬ１２ｐ４０の遺伝子発現を測定した（図１２Ｂ）。遺伝子発現レベルを、内因性対照（ＧＡＰＤＨ）への正規化及び非処置（ＤＭＳＯ対照）への正規化によって定量し、これにより、Ｃ１０処置したＬＰＳ刺激マクロファージ対ＤＭＳＯ対照処置したＬＰＳ刺激マクロファージにおけるｍＲＮＡレベルの比較が可能であった（図１２Ｂ）。

誘導されたＩＦＮ−β遺伝子発現の倍数減少は、１時間後に最も大きく減少し（８倍）、全時間経過を通して低レベルで維持された（図１２Ｂ）。ＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−α増加の低下は、３時間後に最大であったが（４倍）（図１２Ｂ）、ＬＰＳ増加ＴＮＦ−αレベルが低い場合、１時間又は６時間で減少を示さなかった。ＩＬ−６のＬＰＳ誘導性増加は、３時間後に最も減少し、１６倍よりも減少が大きかった（図１２Ｂ）。ＬＰＳ誘導性ＩＬ−１βは、１時間後に最大に減少した（１１倍）（図１２Ｂ）。ＩＬ−１２ ｐ４０は、４〜５時間まで検出できなかったが、６時間後に大きく減少した（１６倍）（図１２Ｂ）。まとめると、これらのリアルタイムＰＣＲデータは、Ｃ１０がＬＰＳ作用を研究するために古典的に使用される単球／マクロファージにおける広範な炎症誘発性サイトカインのＬＰＳ依存性産生を効果的に減少させることを示す。

マクロファージにおいて、ｉＮＯＳのＬＰＳ誘導の結果としてＮＯが産生され（C. Bogdan, Nat Immunol, 2:907-16 (2001)）、ＮＯ産生は、ＩＦＮ−βによるオートクリンシグナル伝達に依存する過程である。本発明者らは、標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、Ｃ１０の存在下でのＬＰＳ誘導性ｉＮＯＳ転写の阻害を検出した（図１３Ａ）。ＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｃ１０、そのビヒクル対照、ＤＭＳＯ、又は別の賦形剤ビヒクル（化合物Ｂ、表８を参照のこと）の存在下にてＬＰＳで３時間処置した。表８は、化合物Ｂ賦形剤の存在下で水に溶解した場合、Ｃ１０がマウス毒素性ショックモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで有効であり、ＦＲＴＬ−５細胞アッセイにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効である（すなわち、単にＣ１０のＤＭＳＯ溶液としてＣ１０の水溶性形態がｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で有効である）ことを確証する。ＤＭＳＯ対照（図１３Ａ、レーン４）又はビヒクルＢのみ（図１３Ａ、レーン５）の存在下で、ＬＰＳのみと比較した場合、それぞれｉＮＯＳ減少はほとんど検出されないか又は全く検出されなかった（図１３Ａ、レーン３）。Ｃ１０で処置した細胞は、ＬＰＳ誘導性ｉＮＯＳ ｍＲＮＡの大きな減少を示した（図１３Ａのレーン６及び７対レーン４及び５）。ＤＭＳＯ対照のみの存在下で穏やかな影響が認められたので（図１３Ａ、レーン４）、Ｃ１０を溶液Ｂと呼ばれる別のビヒクルに溶解したが、単独では影響を及ぼさなかった（図１３Ａ、レーン５）。まとめると、Ｃ１０は、化合物を溶解するために使用したビヒクルと無関係に、ｉＮＯＳ ＲＮＡレベルに強い阻害効果を示した。

表８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｃ１０を含む賦形剤がＣ１０を含むＤＭＳＯと同等に良好であることを示す。表５に記載の研究では、Ｃ１０をＤＭＳＯ中に配合し、腹腔内で投与した。水性環境下でＣ１０は溶解度が低いのでＤＭＳＯを使用したが、非依存性の影響が十分に報告されている（M. S. Ivanovic, et al, Toxicology Letters, 147:153-159 (2004)）。さらに、ＤＭＳＯに溶解し、作業濃度に希釈したＣ１０は、長期間安定ではない。これらの問題を回避するために、本発明者らは、Ｃ１０の水性処方物を作製するためにヒトでの使用がＦＤＡで承認されている商標登録されたシクロデキストリン（ＣＤ）賦形剤を使用した。使用前に水性調製物中で６週間保存したＣ１０は、ＤＭＳＯを使用した溶液との比較によって、甲状腺細胞におけるＴＬＲ３及びＩＦＮ−βのｍＲＮＡレベルの減少において等しく有効であった。ＬＰＳ誘導性毒素性ショックを使用した試験では、希釈形態にて４℃で８週間保存した経口賦形剤可溶化Ｃ１０は、同一の１ｍｇ／ｋｇの用量で新たに腹腔内で作製したＣ１０を含むＤＭＳＯと同様に死亡の防止に有効であった。ＤＭＳＯで希釈して希釈形態にて４℃又は−７０℃のいずれかで保存したＣ１０溶液は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏで不活性であった。

シクロヘキサミド処置を行い（図１３Ａ、ＣＨＸ）、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡのＬＰＳ誘導に新規のタンパク質合成が必要であることを確認し、１型インターフェロンシグナル伝達が、ＴＬＲ４シグナル伝達の直接的影響よりもむしろｉＮＯＳの増加を担い得ることを支持する。有効には、本発明者らは、Ｃ１０は新規のタンパク質合成（すなわち、ＩＦＮ−βの合成）が必要とする機構を介して作用し得るか否かを考慮した。シクロヘキサミドの存在下でのＣ１０のものと同等なＬＰＳ増加ｉＮＯＳの喪失によって示されるように、これは真実である（図１３Ａ、ＣＨＸ）。本発明者らは、Ｃ１０がＩＦＮ−β ｍＲＮＡのＬＰＳ誘導性転写を減少させることができることを既に認めていた（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。以前の報告では、マウスマクロファージにおけるｉＮＯＳのＬＰＳ誘導がオートクリンＩＦＮ−βのその受容体への結合及びその後のＳｔａｔ１活性化によって起こり得ることが見出されている（D. Schilling, et al., J Immunol, 169:5874-80, (2002)）。

Ｃ１０は、培養マクロファージにおけるＳｔａｔ１のＬＰＳ誘導性活性化を阻害する： ＬＰＳ誘導性敗血症性ショックにおけるＩ型インターフェロンの重要な役割が、マウスモデルにおいて近年証明された(M. Karaghiosoff, et al., Nat Immunol, 4:471-7 (2003))。本発明者らは、図１２Ａ及び図１２Ｂに、ＩＦＮ−β（Ｉ型インターフェロン）ｍＲＮＡレベルのＬＰＳ誘導性増加がＣ１０によって強く阻害されることを既に示している。Ｉ型インターフェロン受容体へのＩＦＮ−βの結合によって、マウスマクロファージ中でｉＮＯＳ及びＩＰ−１０の発現を誘導するための核小体へのシグナル伝達のための重要成分としてのＳｔａｔ１がリン酸化されることを示している(Y. Ohmori, et al., J Leukoc Biol, 69:598-604 (2001))。Ｃ１０は、細胞質画分及び核画分の両方でＬＰＳ誘導性Ｓｔａｔ１リン酸化レベルを低下させることができる（図１３Ｂのレーン５及び９）。ＤＭＳＯ対照のみを使用した場合、明らかな影響は認められなかった（図１３Ｂのレーン４及び８）。シクロヘキサミド対照（図１３Ｂ、レーン１０）は、ＬＰＳ誘導性Ｓｔａｔ１リン酸化が新規のタンパク質合成（おそらく、ＩＦＮ−β）に必要であることを示す(V. Toshchakov, et al., J Endotoxin Res, 9:169-75, (2003))。Ｃ１０は、シクロヘキサミドと類似の効果を有し（図１３Ｂ、レーン９対１０）、Ｃ１０がＩＦＮ−β合成の阻害剤としても作用することができることを示す。ＩＦＮ−β ｍＲＮＡ及びタンパク質の減少を示す図１２Ａ及び図１２Ｂ中のデータをＳｔａｔ１リン酸化の減少を示す図１３Ｂ中のデータと組み合わせて解釈した場合、以下の仮説を述べることができる。Ｃ１０は、ＩＦＮ−βのＬＰＳ誘導性オートクリン／パラクリン作用を減少させることによってＩＦＮ−βシグナル経路を介してシグナル伝達を減少させ、それにより、Ｓｔａｔ１活性化を減少することができる。

Ｃ１０は、ＬＰＳ処置マクロファージにおいてＩＲＦ−１及びＩＲＦ−１ ＤＮＡ結合を下方制御する： ＩＲＦ−１は、Ｓｔａｔ１依存性機構を介したマクロファージのＬＰＳ刺激に際に誘導される転写因子である(Y. Ohmori, et al., J Leukoc Biol, 69:598-604 (2001))。したがって、ＩＲＦ−１は、ＬＰＳ誘導性ＩＦＮ−βシグナル伝達の阻害剤によって影響を受け得る応答の別の例を提供する。これまで研究された他の分子と異なり、ＩＲＦ−１は、ｉＮＯＳ等の他の遺伝子の転写を増強するためのＤＮＡに直接結合する転写因子として作用する(R. Kamijo, et al., Science, 263:1612-5, (1994))。ＬＰＳで処置したマクロファージでは、ｉＮＯＳ遺伝子の転写調節にＩＲＦ−１が必要である(R. Kamijo, et al., Science, 263:1612-5 (1994))。マクロファージを、Ｃ１０、ＤＭＳＯ対照、又は市販のＣ１０の誘導体（ＭＭＩ）の存在下で、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で１、２、又は３時間以上処置した（図１４Ａ）。各時点についての典型的なＬＰＳ誘導は、各ＬＰＳ＋ＤＭＳＯレーンで認められる（図１４Ａ、レーン２、５、８）。ＬＰＳ増加ＩＲＦ−１ ＲＮＡは、１時間後は少量であるが、ＤＭＳＯ（Ｃ１０溶媒）の存在下で最大３までになった（図１４Ａ、レーン８）。Ｃ１０での２時間及び３時間の処置に際に、ＬＰＳ増加ＩＲＦ−１ ｍＲＮＡの大きな減少が以前として認められる（図１４Ａ、それぞれ、レーン６及び９対５及び８）。Ｃ１０による減少は、ＭＭＩによるよりもはるかに高い（図１４Ａ、それぞれ、レーン６及び９対７及び１０）。

ＩＲＦ−１が遺伝子転写を増強するために、ＩＲＦ−１は標的遺伝子上に存在するシス−ＤＮＡ要素に結合しなければならない。ｉＮＯＳは、ＩＲＦ−１シス結合要素を含む標的遺伝子の例である（R. Kamijo, et al., Science, 263:1612-5 (1994)）。抗ウイルス性Ｍｘタンパク質をコードするインターフェロン誘導性ＭＸ遺伝子等の幾つかの他のＩＲＦ−１標的遺伝子が存在する（D. Danino, et al., Curr Opin Cell Biol, 13:454-60 (2001)）。ＭＸプロモーターは、強いＩＲＦ−１結合要素を含むことが示されている（C. E. Grant, et al., Nucleic Acids Res, 28:4790-9 (2000)）。本発明者らは、ＭｘＩＳＲＥ（ＩＲＦ−１結合部位）及びＥＭＳＡを使用して、ＭｘＩＳＲＥ要素へのＬＰＳ誘導性ＩＲＦ−１結合に対するＣ１０の影響を測定した。

非処置物と比較した場合、２時間のＬＰＳ刺激（１μｇ／ｍＬ）の際に２つの複合体が誘導された（図１４Ｂ、レーン２、５及び８対１）。Ｃ１０（図１４Ｂ、レーン３及び４）及びＭＭＩ（図１４Ｂ、レーン６及び７）処置細胞の両方由来のサンプル中において用量依存性減少が認められた。非標識ＭｘＩＳＲＥプローブとの抽出物のインキュベーションの際に特異性が認められた（図１４Ｂ、レーン９）。核抽出物をＩＲＦ−１又はＩＲＦ−３（図１４Ｂ、それぞれ、レーン１１及び１２）のいずれかに指向する抗体とインキュベートするスーパーシフト研究を使用して複合体を同定した。ＩＲＦ−１抗体とインキュベートした場合、複合体がＩＲＦ−１含有複合体として同定されるスーパーシフトが認められた（図１４Ｂ、レーン１１）。２つの異なるＩＲＦ−３抗体を使用して、スーパーシフトは認められず（図１４Ｂ、レーン１２の抗体番号１；抗体番号２についてはデータを示さず）、これは、複合体中にＩＲＦ−３が存在しないことを示した。興味深いことに、抽出物をヒトＩＦＮ−β ＩＲＦ−１結合要素に対する非標識プローブ（競合性阻害剤として作用する）とプレインキュベートした場合、ＩＲＦ−１複合体も消失した（図１４、レーン１０）。これらの最後のデータは、これらの抽出物中のＬＰＳ誘導性ＩＲＦ−１もヒトＩＦＮ−β ＩＲＦ−１結合要素に結合するであろうことを示した。

実施例３における内毒素性ショックへの関与：内毒素性ショック防御マウスは、活性化Ｓｔａｔ１の組織レベルが減少した

致死用量のＬＰＳで攻撃誘発した場合にＳｔａｔ１欠損動物の生存率が約５０％増加することが最近証明された（M. Karaghiosoff, et al., Nat Immunol, 4:471-7 (2003)）。この研究では、致死用量のＬＰＳで攻撃誘発したＩＦＮ−β欠損マウスの生存率が１００％増加した（M. Karaghiosoff, et al., Nat Immunol, 4:471-7 (2003)）。したがって、ＩＦＮ−βシグナル経路の遮断部分（blocking parts）は、経路の完全遮断（すなわち、リガンド受容体相互作用の妨害又はリガンド受容体相互作用によって誘導された初期シグナルの遮断による）ほど有効ではない。ｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＳ誘導性ＩＦＮ−βシグナル伝達がＣ１０処置によって弱められるか否かを判定するために、本発明者らは、表５の実験におけるマウス由来の全組織溶解物中のＳｔａｔ１のタンパク質リン酸化レベルを試験した。腎臓組織及び肺組織の両方は、マウスマクロファージと同様に、ショックから防御されないマウスにおいて検出可能なレベルの活性化Ｓｔａｔ１タンパク質を示した（それぞれ、図８のレーン２及び５）。これらのレベルは、Ｃ１０での処置によってＬＰＳ誘導性ショックから防御されたマウスにおいて基底レベルに減少した（それぞれ、図８のレーン３及び６）。

まとめると、ＲＡＷ２６４．７におけるこれらのデータは、Ｃ１０が内毒素性ショックに関与することが示された複数の因子に対して強い阻害効果を有することを示す。これらのデータは、マウス内毒素性ショックモデルにおけるＣ１０防御機構を理解するために重要である。Ｃ１０は、その誘導がＬＰＳ依存性ＴＬＲ４シグナル伝達の直接的結果であるＩＦＮ−β及びＩＬ−１β等の最初期遺伝子の誘導を抑制するようである。ＴＮＦ−αはまた、直接ＴＬＲ４シグナル伝達によって迅速に誘導される。しかし、ＴＮＦ−αに対するＣ１０の影響は１時間では無視できるほどであり、このことは、Ｃ１０がＴＬＲ４シグナル伝達の全ての局面に等しく影響を及ぼさないことを示す。これは、実施例３のｉｎ ｖｉｖｏデータと対比させると特に興味深い。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでは、Ｃ１０はＴＮＦ−αＲＮＡレベル及びタンパク質を減少させたが、これがＩＦＮ−βを介した二次作用を反映することが可能なようであるか、又は複数の相互作用細胞型が非免疫細胞に対するＣ１０の最初の作用に影響を受ける可能性があった。それにもかかわらず、ＩＲＦ−１、ｉＮＯＳ、及びＩＰ−１０の転写上方制御のためにマクロファージにおいて必要とされるＳｔａｔ１の活性化に起因するその複数の下流の影響のために、ＬＰＳ誘導性ＩＦＮ−βは魅力的な治療標的であることが明らかである。組織中のマクロファージ及び非免疫細胞におけるＳｔａｔ１の減少は、実施例３のマウス組織中の遺伝子の減少を部分的に説明することができる。

材料及び方法
細胞培養物： マウスのマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７（ＴＩＢ−７１）は、American Type Culture Collection(Manassas, VA)から得られた。ＲＡＷ２６４．７は、グルタミン及び１０％ＦＢＳで補充されたＤＭＥＭ中で培養された。

ＲＮＡ単離及びノーザンブロット分析： ノーザンブロット分析は、内毒素性ショックに関与するのに重要な炎症性メディエーターのｍＲＮＡレベルを特徴付けるのに使用された（M. A. Dobrovolskaia, et al., Microbes Infect 4:903-14, (2002)）。ＲＮＡを、トリゾール（登録商標）(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して抽出し、これまでに示されたものと同様の様式でノーザンブロット分析を行った（K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:2285-90 (1999)）。Ｇ３ＰＤＨ ｃＤＮＡはClontech（Palo Alto, CA）製であった。ｍＴＮＦ−αプローブは、ｐＯＲＦ９−ｍＴＮＦ−α（Invivogen, San Diego, CA）から切除された。他のプローブ配列は、以下のｃＤＮＡ特異的なプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって合成された（K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:2285-90 (1999)）：ｍＩＰ−１０、５' ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＧＣＣＧ ３'（配列番号２３）及び５' ＧＧＡＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＡＣＡＣＴＧＧ ３'（４６９ｂｐ）（配列番号２４）；ｍＩＬ−１β ５' ＣＴＣＡＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣ ３'（配列番号２５）及び５' ＣＣＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＣＴＧ ３'（１００６ｂｐ）（配列番号２６）；ｍＩＬ−６、５' ＣＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧ ３'（配列番号２７）及び５' ＧＴＣＣＴＴＡＧＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣ ３'（５３０ｂｐ）（配列番号２８）；ｍＩＦＮ−β、５' ＡＡＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣ ３'（配列番号２９）及び５' ＴＧＡＡＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＡＣＣ ３'（５８６ｂｐ）（配列番号３０）。ＩＲＦ−１プローブは、これまでに示されたように調製した（K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:2285-90 (1999)）。

リアルタイムＰＣＲ： 総ＲＮＡをトリゾール（登録商標）（Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用して単離した。ゲノムＤＮＡの任意のキャリーオーバーを取り除くために、ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）キット（Ambion, Austin, TX）を使用して、ＤＮＡｓｅで総ＲＮＡを処理した。ＰＣＲのためのＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ＲＴ（BD Biosciences, Palo Alto, CA）を使用して、ｃＤＮＡを総ＲＮＡから合成した。要するに、１μｇの総ＲＮＡをランダム六量体プライマーとの５０μｌ反応混合物に使用した。リアルタイムプライマー及びＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、及びＧＡＰＤＨに対するＦＲＥＴプローブを(Biosource, Camarillo, CA)から購入し、製造業者の取り扱い説明書に従って使用した。要するに、２．５μｌのｃＤＮＡ鋳型をABIのＴａｑｍａｎ（登録商標）ユニバーサルマスターミックス（Applied Biosystems, Branchburg, NJ）との２５μｌのリアルタイムＰＣＲ反応物に使用した。２５μｌの反応量において１μｌのｃＤＮＡ鋳型を使用して、製造業者の取り扱い説明書に従って、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｓｙｂｒ（登録商標）緑色キットを使用して、Ｓｙｂｒ（登録商標）緑色染料でＩＦＮ−β反応を行った。ＩＦＮ−βに使用したプライマーは以下の通りのものであった：５' ＡＴＧＡＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＣ ３'（配列番号３１）及び５' ＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣＡＧＴＡＧＡＴＴＣＡ ３'（配列番号３２）。熱サイクル条件は、Bio-RadのｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システム（Bio-Rad, Hercules, CA）において９５℃で１０分、その後、９５℃で１５秒及び６０℃で１分の４０サイクルから構成された。

閾値サイクル（Ｃｔ）値を、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱソフトウェア(Bio-Rad, Hercules, CA)を使用して計算した。各遺伝子についての検量線を、対応するｃＤＮＡの１０倍連続希釈から準備した。検量線を、ｃＤＮＡ分子数（コピー数）対閾値サイクル（Ｃｔ）に関してプロットした。次いで、ソフトウェアを使用して、目的の遺伝子について検量線に基づいて各サンプル中の出発ｃＤＮＡのコピー数を計算した。次いで、各遺伝子についてのコピー数を、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。ＬＰＳ誘導性ｍＲＮＡレベルに対するＣ１０の影響を求め、ＧＡＰＤＨの検量線から求めたＲＮＡレベルへの正規化及びＬＰＳ刺激前（基底レベル）の発現レベルとの比較によって目的の遺伝子の転写のｎ倍減少として示した。

ｉＮＯＳのための標準的な逆転写酵素のＰＣＲ： ＲＮＡを上記のように単離し、上記のようにＤＮＡｓｅで処理した。それから、全量２０μｌでＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲキット（BD Biosciences, Palo Alto, CA）によって、１μｇのＤＮＡを含まないＲＮＡを逆転写した。その後、反応量２５μｌでＥｘＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Takara, Madison, WI）を使用して、５μｌのｃＤＮＡを増幅した。熱サイクル条件は、９４℃で３分間、その後の９４℃で１０秒、５８℃で３０秒、及び７２℃で４５秒間の３５サイクルから構成された。プライマー配列は実施例３と同じであった。２０μｌのそれぞれの反応物を２％アガロースゲル上に分散させ、臭化エチジウムで染色した。

ＲＡＷ２６４．７及びマウス組織の免疫ブロット分析： プロテアーゼ阻害剤混合物（ＰＭＳＦ、レウペプチン、及びペプスタチンＡ)の存在下におけるＮＥ−ＰＥＲ（登録商標）抽出試薬(Pierce, Rockford, IL)を使用して、ＲＡＷ細胞の核及び細胞質抽出物を調製した。マウス組織を１×ＰＢＳで均質にし、ホモジネートを遠心分離でペレット化し、プロテアーゼ阻害剤混合物（ＰＭＳＦ、レウペプチン、及びペプスタチンＡ）の存在下で、緩衝溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＩＧＥ−ＰＡＬ ＣＡ６３０、及び５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））中で溶解する前にＰＢＳを除去した。ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓシステム（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を使用した変性条件下で、２５μｇの核細胞質、又は総組織溶解物を３〜８％トリス酢酸ＰＡＧＥゲル上に分散し、それからニトロセルロース膜に移し、この膜は活性化Ｓｔａｔ−１の検出のためにウサギ抗ヒトのホスホ−Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）Ａｂ（９１７１；Cell Signaling Technology, Beverly, MA)でプローブ化し、それから充填対照としての非活性化Ｓｔａｔ１の検出のためにウサギ抗ヒトのＳｔａｔ１ ｐ８４／ｐ９１（Ｅ−２３）Ｘ Ａｂ（ｓｃ−３４６Ｘ、Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）で外して（stripped）再びプローブ化した。ＥＣＬｐｌｕｓウエスタンブロット検出システム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を使用して、ＨＲＰ共役ヤギ抗ウサギＡｂ（ｓｃ−２０５４、Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）の結合を検出した。

ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＥＭＳＡ： プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＭＳＦ、レウペプチン、ペプスタチン−Ａ）の存在下でＮＥ−ＰＥＲ（登録商標）抽出試薬（Pierce Chemical Co.; Rockford, IL）を使用して核抽出物を調製した。オリゴヌクレオチドのセンス鎖プローブ配列は以下のようなものであった：ＭｘＩＳＲＥプローブ：５' ＣＧＧＡＧＡＡＡＣＧＡＡＡＣＴＡＡＧＡＴＣ−３'（配列番号３３）及びＩＦＮ−β−ＩＲＦ部位プローブ：５'−ＧＡＣＡＴＡＧＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＴＧＧＧＡＡ−３'（配列番号３４）。オリゴヌクレオチド（センス及びアンチセンス鎖）（Biosynthesis Inc.; Lewisville, TX）をアニーリングし、得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを析出して、それからＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を使用して、^３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。結合反応物（２０分、室温）には、^３２Ｐ標識プローブ（活性１００，０００ｃｐｍ）、５μｇのＲＡＷ核抽出物、１μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）、１ｍＭのＤＴＴ、１０％グリセロール及び１×結合緩衝液が含まれる。ＥＭＳＡの結合緩衝液（１０×）は、１００ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）であった。競合研究では、１００倍のモル過剰の非標識二本鎖オリゴヌクレオチドで核抽出物をインキュベートした。スーパーシフト研究では、ＩＲＦ−１（Ｈ−２０５、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）又はＩＲＦ−３（Active Motif, Carlsbad, CA）に対する適切な抗体２μｇで核抽出物をインキュベートした。インキュベート後、１×ＴＢＥ（５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのホウ酸、及び１ｍＭのＥＤＴＡ）中の５％グリセロールを含む５％非変性ポリアクリルアミドゲル上で反応混合物をエレクトロポレーションした（１６０Ｖ、室温）。ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーを行った。

Ｃ１０は、ＬＰＳ又は腹膜炎によって誘導された内毒素性ショックからウマを防御する。

マウス研究を、ヒトに無関係であると主張することができる。しばしば、ヒトと系統発生的関係がより近く、ヒトと類似の疾患を罹患した大型動物が実験モデルとして望ましい。ウマの内毒素性ショックは、ヒトの内毒素性ショックモデルの１つである。ウマの内毒素血症は、血中内毒素の生物学的結果に起因する。内毒素は、グラム陰性細菌壁の構造成分であり、代表的分子は、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）である。ＬＰＳは、腸からその周囲の環境（すなわち、腹膜腔及び血流）に放出され得る。一旦ＬＰＳがいずれかに到達すると、ＬＰＳは、単核の食細胞と相互作用することができる。この相互作用により、これらの細胞の内毒素に対する感受性が１０００倍に増加し、免疫カスケードの過剰な応答（アラキドン酸の活性化、ＴＬＲ４シグナル経路の活性化、及び凝固カスケードの活性化が含まれる）が誘導される。最終的に、炎症誘発性メディエーターが産生され、循環ショック（例えば、ＴＮＦ−α）を発症する。

ＴＬＲ４シグナルによって媒介されるＴＮＦ−αの合成及び放出は、他の炎症メディエーター（インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、プロスタグランジン、及び組織因子（急性期タンパク質等）が含まれる）の合成に関連する（D. D. Morris, J Vet Intern Med, 5:167- 81 (1991)、D. L. Hawkins, et al., Vet Immunol Immunopathol, 66:1-10 (1998)、H. Kato, et al., Vet Immunol Immunopathol, 48:221-31 (1995)）。ＩＬ−６活性の血清濃度は、血清ＴＮＦ−αから約１時間後から増加し始め、内毒素症の発症から３時間〜６時間の間にピークになる。ＩＬ−６及びＩＬ−１は内毒素誘導性発熱応答を媒介し、これらは急性期応答を構成する炎症カスケードに関与する。

スーパーオキシドラジカルは内因性一酸化窒素（ＮＯ）と反応して、強力な酸化剤であるペルオキシ亜硝酸アニオンを産生することができる（C. Gonzalez, et al., Biochem Biophys Res Commun, 186:150-6 (1992)、B. Zingarelli, et al., Br J Pharmacol, 120:259-67 (1997)、C. Gagnon, et al., FEBS Lett, 431:107-10, (1998)）。さらに、一酸化窒素は動物及びヒトにおける内毒素性ショック組織障害の既知のメディエーターである（A. Petros, et al., Cardiovasc Res, 28:34-9 (1994)、P. Wang, et al., Arch Surg, 129:1137-43 (1994)、J. A. Avontuur, et al., Circ Res, 76:418- 25 (1995)、C. Szabo, et al., Proc Biol Sci, 253:233-8 (1993)、C. Szabo, Ann N Y Acad Sci, 851 :422-5 (1998)）。ＬＰＳは誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の強力な誘導因子であり（P. P. Wolkow, Inflamm Res, 47:152-66 (1998)）、この誘導因子は多量のＮＯ及びペルオキシ亜硝酸の合成を触媒して、他の因子の中でも、後期の低血圧、血管痙攣、細胞窒息、アポトーシス、乳酸アシドーシス、及びウマ並びに別の動物及びヒトにおける内因性ショックの多臓器障害に関与する（P. P. Wolkow, Inflamm Res, 47:152-66 (1998)）。実際に、構成的内皮ＮＯＳ（ｃｅＮＯＳ）とｉＮＯＳとをはっきりと区別しないＮＯＳ阻害剤の実験的及び臨床的使用によりＬＰＳ誘導性の低血圧が予防される（P. P. Wolkow, Inflamm Res, 47:152-66 (1998)）。

ウマの腸管腔は、通常、大量の内毒素を含む。正常なウマの盲腸（ceacum）及び腹側結腸が２ｇを超える内毒素を含み、この内毒素は有効な粘膜関門によって腸管腔に限定されると推定される。したがって、粘膜関門を損傷させる任意の病変により、内毒素が腹膜腔及び血液に到達される（D. D. Morris, J Vet Intern Med, 5:167-81 (1991)、J. N. Moore, et al., Can J Comp Med, 45:330-2 (1981)、D. Chakravortty, et al., Microbiol Immunol, 43:527-33 (1999)、J. Drabkova, Cesk Epidemiol Mikrobiol Imunol 42:102-5, (1992)）。したがって、虚血性腸のウマは手術前に内毒素の悪影響を受け、数日後に虚血性腸が除去されている。罹患動物における最も一般的な臨床所見には以下が含まれる：「有毒ライン（toxic line）」が存在する粘膜の色の変化、毛細管への充填時間（refill time）の延長、心拍数及び呼吸数の増加、腹鳴の減少、発熱、血液濃縮、好中球減少、虚脱、及び腹痛。

内毒素性ショックと同様に炎症性腸疾患及び結腸炎のマウスモデルを使用して、Ｃ−１０は、インターフェロン誘導遺伝子（ＩＰ−１０、ＩＲＦ−１、及びＭＣＰ−１）、炎症誘発性サイトカイン遺伝子（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６）及びＩＲＦ−１依存性遺伝子（ＣＯＸ−２、ｉＮＯＳ）の多重度に対する抑制作用を示した。

Ｃ１０は、複数の細胞系（甲状腺細胞、マクロファージ、ヒト大動脈血管内皮細胞）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ及び大腸炎及び毒素性ショックのマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＩＦＮ−β及びＩＲＦ−１の遺伝子発現及び／又は分泌を阻害する。さらに、マウスにおける本発明者らの結果（表５）は、Ｃ１０を単回用量としてＬＰＳ注射前に投与した場合に１００％のマウスがＬＰＳ誘導性毒素性ショック及び死亡から防御されることを示した。実施例３では、Ｃ−１０は、標的器官中の炎症誘発性サイトカイン、接着分子、走化性タンパク質、ＩＲＦ−１、ＩＦＮ−β、ｉＮＯＳ、及びＣＯＸ−２、並びに内毒素性ショックの徴候及び症状（すなわち、低血圧、多臓器不全（multi-systemic failure）、及び播種性血管内凝固）に関連するＬＰＳ処置動物における循環炎症メディエーターを阻害することができた。

上記のデータ及びバックグラウンドに基づいて、本発明者らは、（ｉ）内毒素性ショックのＬＰＳ誘導性ウマモデルににおける毒素性ショック、及び（ｉｉ）外来内毒素負荷盲腸物質の腸から腹膜腔への注射又は腹膜炎を引き起こす病変を矯正するための腹部手術のいずれかによって誘導された腹膜炎のウマモデルにおける有効な治療薬としてＣ−１０が作用する能力を試験した。

結果
ウマにおける内毒素症の臨床パラメーターの確立： 本発明者らは、ＬＰＳ処置群における症状及び徴候の分析に基づいて、内毒素症を臨床的に分類した。さらに、本発明は、以下の異なる病期での症状を考慮した：初期症状、虚脱又はショック期、及び正常化期。内毒素症の初期に（ＬＰＳ注射から、１５分後、３０分〜１時間後）、本発明者らは、多汗、興奮状態、脆弱な筋緊張、腹痛、水様性下痢（diarrhea with watery deposit）を観察した。本発明者らは、鼻汁、有意な呼吸促迫（呼吸困難）、呼吸数の増加（頻呼吸）、及び心拍数の増加（頻拍症）も観察した。脈拍は弱く且つ検出不可能であり、毛細管への充填時間が増加した。内毒素注射から３０分後、全てのウマは、１００ｍｍＨｇの収縮期圧及び７０ｍｍＨｇの拡張期圧を発症するまで、血圧低下が進行した。この時、全てのウマが低血圧及び強いチアノーゼを伴う低酸素血症になった。毛細管充填時間の増加はピークに到達したが、１〜６時間の循環ショック期間中に依然として有意であった。

血中酸素飽和度（％ＰＯ_２）はショックと同期して減少し、粘膜が強くチアノーゼになり、全身虚脱（toital collapse）が短期間続く。ショックの時点で、消化器系は、腹鳴の抑制、腸の回盲部活性の抑制、腹痛、仙痛、腸閉塞、絞扼、及び粘膜関門の変化によって特徴付けられる。６時間後に体温が上昇し、２４時間後に正常になった。

実験室での研究により、３時間後に高血糖が検出され、２４時間後に正常になった。３時間後に白血球減少症を発症し、６時間後に正常になった。血中のクレアチニン及び尿素は、ＬＰＳ摂種から２４時間後に数倍に増加し、１週間後に正常になった。これらの結果は、内毒素性ショックが一過性の急性腎不全を誘導したことを示した。赤血球濃度の増加が測定され、これは血液由来の水の喪失及び幾つかの器官における浮腫の存在に起因する可能性が高い。

最後に、ＬＰＳ注射から２４時間後に、粘膜が充血してチアノーゼ性を示しているにもかかわらず、血圧が正常化してｓＰＯ_２が正常であった。これにより、低酸素症及び組織内潅流が回復していないことが示唆された。

これらの変化を、表９〜表１３で説明し、これらの表は、呼吸急迫、下痢、及び虚脱を増強するＬＰＳの影響並びにＣ１０がこれらをほぼ完全に防止する能力を示す。

表９及び表１０に示すように、Ｃ１０は、ＬＰＳによって誘導された内毒素性ショックからウマを防御する。ウマを、純粋なＤＭＳＯ（１０ｍｌ）又は１０ｍｌの純粋なＤＭＳＯ中に溶解したＣ１０（２ｍｇ／ｋｇ）の静脈内（ｉｖ）注射での前処置後に、亜致死用量のＬＰＳ（１０μｇ／ｋｇ）で処置した。ＬＰＳを用いたウマは、２４時間にわたって低血圧、低体温、頻呼吸、急速な拍動、異常な心拍動曲線、及び最終的な虚脱を伴う毒素性ショックを罹患するのに対して、Ｃ１０処置動物はこれらの変化は認められなかった。表９及び表１０中の結果は、初期の時点から２４時間まで研究し、その後１週間追跡したＬＰＳ又はＬＰＳ＋ＤＭＳＯ対ＬＰＳ＋Ｃ１０処置動物を使用した典型的な実験に由来する。この実験では、以下の循環ショックの心血管パラメーターを測定した：毒素症、鬱血、及びチアノーゼ。

ＬＰＳによって誘導された内毒素性ショックからウマを防御するＣ１０の能力も、表１１及び表１２で証明する。ウマを、純粋なＤＭＳＯ（１０ｍｌ）又はＣ１０（２ｍｇ／ｋｇ）を含む１０ｍｌの純粋なＤＭＳＯ静脈内注射での前処置後に、亜致死用量のＬＰＳ（１０μｇ／ｋｇ）で処置した。ＬＰＳを用いたウマは、２４時間にわたって血圧の低下、低体温、頻呼吸、急速な拍動、異常な心拍動曲線、及び最終的な虚脱を伴う毒素性ショックを罹患するのに対して、Ｃ１０処置動物はこれらの変化は認められなかった。表１１及び表１２は、初期の時点から２４時間まで研究し、その後１週間追跡したＬＰＳ又はＬＰＳ＋ＤＭＳＯ対ＬＰＳ＋Ｃ１０処置動物を比較した典型的な実験を示す。この実験では、肺内の流動物を、聴診並びに頻呼吸、及び呼吸困難によって測定した。これらは、Ｃ１０が毒素性ショック中に罹患した肺急迫の徴候を抑制することを証明している。

表１３で認められる様に、Ｃ１０はまた、腹痛、下痢、排便回数の増加、立っている状態よりもむしろ横たわっている状態での虚脱又は疲労によって測定されるＬＰＳによって誘導された内毒素性ショックからウマを防御する。ウマを、１０ｍｌの純粋なＤＭＳＯ又はＣ１０（１ｍｇ／ｋｇ）を含む１０ｍｌの純粋なＤＭＳＯの静脈内注射での前処置後に、亜致死用量のＬＰＳ（１０μｇ／ｋｇ）で処置した。ＬＰＳを用いたウマは、２４時間にわたって血圧の低下、低体温、頻呼吸、急速な拍動、異常な心拍動曲線、及び最終的な疲労又は虚脱を伴う毒素性ショックを罹患するのに対して、Ｃ１０処置動物はこれらの変化は認められなかった。表１３は、初期の時点から２４時間まで研究し、その後１週間追跡した典型的なＬＰＳ又はＬＰＳ＋ＤＭＳＯ対ＬＰＳ＋Ｃ１０処置動物を示す。この実験では、腹痛、水様下痢、排便回数、及び横たわっている状態での虚脱対正常な胃腸管の機能及び性質を測定した。重篤な腹痛、下痢、排便頻度の増加は、ＬＰＳ処置動物の虚脱及びショック応答と同様に、典型的なＬＰＳ又はＬＰＳ＋ＤＭＳＯ処置動物で３時間まで明らかであった。これは、ＬＰＳ＋Ｃ１０で処置した動物では起こらなかった。これらのデータは、各群における全動物の代表である。

フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、ＬＰＳ誘導性内毒素血症及び内毒素性ショックからウマを防御する： まとめると、Ｃ１０は、内毒素血症の症状（低血圧及び低酸素症が含まれる）並びに内毒素性ショックによる虚脱、心酸素欠乏症、急性腎不全、及びあらゆる局面における血液からの水の喪失を明確に防いだ（表９〜表１３）。対照的に、ＤＭＳＯビヒクルは、内毒素（ＬＰＳ）接種後に、低血圧、低酸素症、ショック、虚脱、及び臓器不全から防御しなかった（表９〜表１３）。

フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、腹膜炎誘導性内毒素血症及び内毒素性ショックからウマを防御する： Ｃ１０は、腸液によって誘導された敗血症性腹膜炎による内毒素性ショック及び死亡からウマを防御した。腸（盲腸）液を正常なウマに腹腔内接種した後、動物は、明確な内毒素血症の症状を迅速に示した。このことは恐らく、腸液が遊離内毒素を含んでいたためである。Ｃ１０は、内毒素血症の初期段階で防御し、これは、腸管腔中に遊離リポポリサッカリドが存在することに起因する（表１４）。３０分、１時間、３時間、６時間での動物の臨床評価により、非Ｃ１０処置動物において内毒素血症の臨床的特徴が示されたが、内毒素血症から臨床的に防御されたＣ１０処置動物では示されなかった。

１２時間後、全動物は、異常な痛み及び熱を伴った臨床的腹膜炎を発症し始めた（表１４）。この時点で、全動物を、抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン）で処置し始めて、細菌感染の臨床的進行及び細菌の死滅によるＬＰＳのさらなる放出を回避した。１２時間後、２つの動物群のうちの１群に、Ｃ１０（２ｍｇ／ｋｇ）をボーラスで静脈内接種したのに対して、２頭の他のウマは治療しないままにした（すなわち、抗生物質のみでの処置）。２４時間後、非Ｃ１０処置動物は死亡したのに対して（表１４）、Ｃ１０で処置した動物は生存し、わずかな消沈及び軽度の内毒素血症の徴候を示しただけであった（表１４）。Ｃ−１０ボーラス後、動物は直ちに好転し、食餌を取り、水を飲んだ。任意の虚脱又は消沈の徴候は、１５分以内に消失した。生き残った動物は、２４時間後又は実験終了から１週間後でさえも臓器不全の徴候を示さず（表１４）、Ｃ−１０は臓器不全（呼吸困難、急性腎不全、低血圧、心酸素欠乏症、及び低酸素症）を防御することを示した。

表１４に示すように、Ｃ１０は、腸（盲腸）液の腹腔内投与によって誘導された腹膜炎後の死亡からウマを防御する。動物に、細菌及び遊離内毒素を含む１００ｍｌの盲腸液を腹腔内注射した。一方の群に、２ｍｇ／ｋｇのＣ１０を含む１０ｍｌ用量の１００％ＤＭＳＯを盲腸液注射の３０分前に静脈内投与した。他方の群に、１０ｍｌの１００％ＤＭＳＯのみを盲腸液注射の３０分前に投与した。盲腸液注射時と注射から１２時間後との間に、Ｃ１０処置動物は、ＤＭＳＯ対照動物と比較して、内毒素血症の症状が最小であった。１２時間後、全動物は腹膜炎の徴候を示し始めた。抗生物質のみで処置し、且つ進行した腹膜炎の徴候を示したウマは、２４時間にわたって血圧の低下、低体温、頻呼吸、急速な拍動、異常な心拍動曲線、及び虚脱を伴う毒素性ショックを発症したのに対して、Ｃ１０処置動物はこれらの変化は認められなかった。Ｃ１０で前処置した動物に２ｍｇ／ｋｇのＣ１０を含む１０ｍｌの第２の用量の１００％ＤＭＳＯを１２時間投与したのに対して、他方の群には１０ｍｌの１００％ＤＭＳＯのみを投与した。両群に、治療用量のペニシリン及びストレプトマイシンも１２時間投与した。Ｃ１０を付加した動物は、２４時間以内に歩行及び食餌し、全症例で完全に回復したのに対して、他方の群は全症例で毒素性ショックを発症し、死亡した。本実験は、幾つかの群の２頭のウマを各群中で組み合わせている。これらの結果は、Ｃ１０が腹膜炎及び内毒素性ショックに付されたウマにおける毒素性ショックを防止するのに有効であることを示す。このような処置を受けた１０頭の動物において治療は１００％有効であり、同一の動物を反復処置した場合でさえも有効であった。

壊死性腸を修復するための外科的手順に付されたウマに対するフェニルメチマゾール（Ｃ１０）の影響：動物群を、腸の小部分における血管をクランプする外科的手順にも付した。２日以内に、腸壊死が起こり、腹膜炎がそれに続いた。その時、動物を再度手術して懐死性腸を除去し、手術３日前及び３日後に２ｍｇ／ｋｇのＣ１０又はＤＭＳＯのみで処置した。Ｃ１０で処置した動物は、２４時間以内に歩行及び食餌し、全症例で完全に回復したのに対して、Ｃ１０を使用しなかった動物は、ほとんどの症例で毒素性ショックを発症し、重症となり、死亡した。両群に、上記と同一の抗生物質療法を行った。これらの結果は、Ｃ１０が外科的手順又は内毒素投与に付したウマにおける毒素性ショックを防止するのに有効であることを示す。

まとめると、内毒素血症及び内毒素性ショックは、ウマにおける主な死因であり、仙痛炎及び新生児子馬敗血を引き起こす胃腸障害の発症と密接に関連している。フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、メチマゾール誘導体であり、非免疫組織、単球、マクロファージ、及び樹状細胞におけるＴＬＲ３／ＴＬＲ４シグナル伝達の病的活性化を遮断する互変異性環状チオン薬ファミリーのリード化合物である。これらは、Ｉ型インターフェロン遺伝子（例えば、ＩＦＮ−β）、インターフェロン誘導遺伝子（ＩＰ−１０、ＩＲＦ−１）、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）、ケモカイン（ＭＣＰ−１、ＣＯＸ−２、及びｉＮＯＳ等）の発現を抑制する。ウマにおける内毒素血症及び内毒素性ショックは、幾つかのメディエーター（ＣＯＸ−２依存性メディエーター（プロスタグランジン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、及びｉＮＯＳ等））の上方制御に関連する。内毒素性ショックの生存率は、ノックアウト齧歯類モデルにおいてＩ型インターフェロン転写遺伝子に強く依存する。本発明者らは、内毒素血症ウマモデルを使用して臨床研究を行い、フェニルメチマゾール（Ｃ１０）が大腸菌リポポリサッカリドによって誘導された内毒素血症及び内毒素性ショックの臨床徴候（低血圧、低酸素血症、頻呼吸、頻拍症、低酸素血症、呼吸促迫、腹痛及び仙痛、水性下痢、腸運動低下及び肛門弛緩、急性腎不全、高血糖、及び循環ショック、又は虚脱）からウマを防御することを示した。腸管内菌叢の腹腔内接種を使用して敗血性腹膜炎に起因する内毒素血症及び内毒素性ショックを誘導した場合、非処置動物の生存率０％と比較して、Ｃ１０生存率は１００％であった。

材料及び方法
内毒素血症防御実験： 大腸菌ＬＰＳによって誘導された実験的毒素血症に対するＣ−１０の影響を判定するために、３つのウマ群を使用した。群１（ＬＰＳ群）では、他者（J. N. Moore, et al., Equine Vet J, 13:95-8 (1981)、G. E. Burrows, Am J Vet Res, 40:991-8 (1979)）によって推奨された静脈内ボーラス注射によって、１０μｇ／ｋｇの大腸菌（Sigma, St. Louisの０５５ＬＰＳ）をウマに注射した。群２のウマ（ＬＰＳ＋ＤＭＳＯ）に、同用量のビヒクル（１００％ＤＭＳＯ）を注射し、ＤＭＳＯのみの影響を分析した。群３（ＬＰＳ＋Ｃ−１０）のウマに、ビヒクルとして使用したＬＰＳ＋１００％ＤＭＳＯを注射した。異なる群由来のウマを、異なる時点で臨床的に研究した。ＬＰＳ＋Ｃ−１０群及びＬＰＳ＋ＤＭＳＯ、Ｃ−１０及びＤＭＳＯを、ＬＰＳの３０分前に注射した。

時間０を、ＬＰＳの注射前の正常なウマと定義した。ＬＰＳ注射後、１５分後、３０分後、１時間後、３時間後、６時間後、２４時間後、及び１週間後に動物を評価した。以下のＬＰＳによって標的される生物系の変化を評価した：心血管、循環、腹腔、及び肺。毛細管の流動時間、血管の完全性及び他の血管の変化を臨床的に評価した。最大静脈血圧(ＮＩＢＰｍａｘ．)、最小静脈血圧（ＮＩＢＰｍｉｎ．）、心電図（ＥＣＧ）、及び血中酸素飽和度（ＰｓＯ_２）（％で示す）を、Ｃａｒｄｅｌｌ Ｍｏｎｉｔｏｒ９４０３を使用して測定した。正常な腹部腸活性、回盲部括約筋活性、排便数（糞便）、及びその特徴（下痢）、並びに肛門筋の緊張力（tone）の研究を臨床的に評価した。呼吸数、呼吸困難、肺の聴診、気道中の液体の存在、及び肺うっ血を臨床的に評価した。グルコース、ＧＯＴ（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ酵素）、ＧＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ酵素）、クレアチニン、尿素、末梢血液像、ヘモグロビン（Ｈｂ)、ヘマトクリット（Ｈｔ）、赤血球数、ＰＭＮ数（好中球、好酸球、好塩基球）、単球数、及びリンパ球数を、異なる時点で測定した。動物がＣ１０を投与されていることを知らされていない熟練した獣医が臨床所見を記録した（すなわち、結果を盲検様式で評価した）。

内毒素性ショック生存実験： 正常なウマの盲腸（ceacum）及び腹側結腸は、２ｇを超える遊離内毒素及びグラム陰性細菌を含み、これらは、無傷の腸関門（intestinal barrier）によって腸管腔に限定されている。粘膜関門が損傷する病変により、内毒素が腹膜腔及び血液に到達可能である。ウマ内毒素性ショックの生存率に対するＣ−１０の防御効果を評価するために、１００ｍｌの盲腸液を腹腔内で注射して、腹膜炎及び内毒素性ショックを誘導した。盲腸液を、麻酔下でウマから抽出した。腸液を腹膜内接種したウマ群は、腹腔内液の接種から１２時間後に臨床的腹膜炎及び内毒素血症の症状を示した。全ての動物を、治療用量のペニシリン及びストレプトマイシンで処置した。一方のウマ群に同用量の盲腸液を接種し、液接種から１２時間後に抗生物質でも処置するが、盲腸液注射の３０分前及び１２時間後に２ｍｇ／ｋｇのＣ−１０を投与した。０−１５−３０分、１、３、６、１２、１８、及び２４時間後、並びに１週間後の生存を評価した。

フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、アテローム性動脈硬化症に関連するＴＬＲ４媒介性炎症を軽減する。

アテローム性動脈硬化症は、異常なＴＬＲ４発現及び下流遺伝子（ＶＣＡＭ−１等）を増加させるシグナル伝達に関与する循環器の全身疾患である。血管上皮細胞上のＶＣＡＭ−１の増加は、炎症領域に白血球を誘引するのに重要である。アテローム性動脈硬化症は、糖尿病、高血圧、及び高脂血症患者でより進行する。糖尿病の蔓延は、アテローム性動脈硬化症の合併症と広範に見なされている心血管合併症（心筋梗塞、卒中等）の蔓延に関与する。炎症応答を弱めることができる薬物は、ＴＬＲ４ノックアウトによって潜在的に有効であると示唆されている。障害を与える損傷（damaging insult）、高脂質血症が残存しているので、これは病変を消失させない。酸化脂質を、内皮層を貫通した場合に炎症を誘発する環境シグニチャー分子と解釈することができる。しかし、呼び戻すべき重要な点は、この病変が選択性を示し得る（主に一方又は他方の血管床に存在し得る）ことである。さらに、これらは、炎症応答に影響を受けて、血管壁の腫脹及び管腔サイズの減少を引き起こし得る。その管腔の減少、さらに、管腔開口部がさらに減少する白血球／血小板結合により、閉塞性疾患を発症する。

したがって、多数の生理学的及び病理学的な炎症過程の重要な構成要素は、循環の流体力学的環境下での内皮への白血球の接着である。内皮への白血球の接着は、自由流からの内皮への繋留（すなわち、付着）、内皮先端面上での回転、ローリングの中断（「中止」と呼ばれる）、より多形性の形状への拡大、及び血管外空隙に到達するための隣接する内皮細胞間の移動を含む接着事象のカスケードを介して起こる。この接着カスケードは、その一部が、白血球表面上に存在する分子（インテグリン等のリガンド）と内皮表面上に存在する同族分子（受容体；例えば、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１）との間に形成される共有結合によって媒介される。

白血球リガンドに対する内皮受容体は、一般的に内皮細胞接着分子（ＥＣＡＭ）と称される。白血球動員の役割を果たすことが知られている或る特定のＥＣＡＭが、病理学的炎症部位で増大する。例えば、ＶＣＡＭ−１は、アテローム性動脈硬化症における早期泡沫細胞の病変を覆う大動脈内皮上に局所的に存在する。ＥＣＡＭの発現の増大により、一部、炎症部位への白血球の選択的な動員が媒介される（T. A. Springer, Cell, 76:301-314, (1994)）。病理学的炎症部位におけるＥＣＡＭの発現の上方制御が、炎症及び疾患の進行及び／又は組織損傷に重要な成分である、組織の異常な白血球接着及び浸潤の一因となり（例えばＶＣＡＭ−１は、進行した及び進行性のアテローム性動脈硬化症の病変部位において上方制御される（M. I. Cybulsky, et al., Science, 251:788-791 (1991)）、アテローム発生中の内皮細胞への単球の接着に関与している（F. W. Luscinskas, et al., J. Cell Biol., 125:1417-27 (1994)、C. L. Ramos, et al., Circ. Res., 84:1237-44 (1999)）。したがって、病理学的炎症を治療するための有望な治療的なアプローチは、ＥＣＡＭの抑制を介して、内皮細胞への異常な白血球の接着を低減させることである（J. Panes, et al., Br. J. Pharmacol, 126:537-550 (1999)）。

ＥＣＡＭ発現は転写因子の活性によって遺伝子レベルで調節される。内皮細胞の炎症促進性サイトカイン（例えばＴＮＦ−α）治療により、或る特定の転写因子（例えばＮＦ−κＢ）の活性が刺激され（M. J. May, et al., Immunol. Today, 19:80-88 (1998)）、また他の転写因子（例えばＩＲＦ−１）の発現を誘導する（A. S. Neish, et al., Mol. Cell Biol, 15:2558-2569 (1995)）。活性／誘導性転写因子は、ＥＣＡＭ遺伝子の転写及び最終的なタンパク質発現に至るこれらのそれぞれの結合部位にライゲーションする。病理学的炎症のための幾つかの治療は、転写因子の活性を調節することによって少なくとも部分的に作用する（E. M. Conner, et al., J. Pharmacol Exp. Ther., 282:1615-1622 (1997)、J. W. Pierce, et al., J. Immunol, 156:3961-3969 (1996)、C. Weber, et al., Circulation, 91:1914-1917(1995)、J. W. Pierce, et al., J. Biol. Chem., 272:21096-21103 (1997)、M. Umetani, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 272:370-4 (2000)）。実際には、転写レベルでのサイトカイン誘導性ＥＣＡＭの発現を阻止する化合物が、内皮細胞への白血球の接着を阻害すること（J. W. Pierce, et al., J. Immunol, 156:3961-3969 (1996)、N. M. Dagia, et al., Am. J. Phys., 285:C813-C822 (2003)、C. Weber, et al., Circulation, 91:1914-1917 (1995)、J. W. Pierce, et al., J. Biol. Chem., 272:21096-21103 (1997)）及び動物モデルにおいて炎症を低減すること（E. M. Conner, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 282:1615-1622 (1997)、J. W. Pierce, et al., J. Biol. Chem., 272:21096-21103 (1997)）が示されている。

フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、潜在的にこの目的に役立ち得る(N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004))。Ｃ１０は、（ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏで存在する条件を模倣したｉｎ ｖｉｔｒｏ流動条件下でサイトカイン炎症性ヒト大動脈上皮細胞（ＨＡＥＣ）への単球細胞の接着を阻害し、（ｉｉ）ＮＦ−κＢではなく転写因子ＩＲＦ−１の抑制によってＶＣＡＭ−１のサイトカイン誘導性ＨＡＥＣ発現を強く阻害し、（ｉｉｉ）Ｅ−セレクチン発現に対してより穏やかな影響を及ぼし、（ｉｖ）ＩＣＡＭ−１発現に対してほとんど影響を及ぼさない。幾つかの他の転写阻害剤が既知であるが、ほとんどなく、あるとすれば、ＶＣＡＭ−１を選択的に抑制し、ＩＲＦ−１を介して作用し、流動物剪断（fluid shear）下でのサイトカイン炎症性内皮への単球細胞の接着を阻害することが示されている。したがって、アテローム性動脈硬化症におけるＣ１０の使用は、検討に値する。

アポリポタンパク質Ｅ欠損（ＡｐｏＥ^−／−）マウス（十分に許容されるヒトアテローム性動脈硬化症モデル）を使用した以前の研究により、ＶＣＡＭ−１が内皮上の病変形成傾向のある部位に存在し（早ければ５週間）、病変を発症することが明らかとなった(Y. Nakashima, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 18:842-51 (1998))。Leyのグループによる簡潔な（elegant）研究(C. L. Ramos, et al., Circ. Res., 84:1237-44 (1999))により、単球が、野生型マウスから単離した頸動脈と比較して、ＡｐｏＥ^−／−マウスから単離した頸動脈への接着が非常に高いことが証明された。この接着の増加は、部分的に、ＶＣＡＭ−１によって媒介される(C. L. Ramos, et al., Circ. Res., 84:1237-44 (1999)、M. Kobayashi, et al., J Clin Invest, 111 :1297-308 (2003))。Michelsen他(K. S. Michelsen, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101 :10679-84 (2004))は、ＴＬＲ４欠損マウスが、アテローム性動脈硬化症を罹患しやすいアポリポタンパク質Ｅ欠損（ＡｐｏＥ^−／−）マウスにおける大動脈プラーク発生を有意に減少させることを発見し、これにより、アテローム性動脈硬化症においてＴＬＲ４が重要な役割を果たすことが示唆された。

結果
十分に許容されるＡｐｏＥ^−／−マウスモデル(Y. Nakashima, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 18:842-51 (1998))は、本発明者らのアテローム性動脈硬化症の動物モデルであった。最初の実験では、これらのマウスに高脂肪食を与え、Ｃ１０を１日おきに腹腔内に注射するか、又は１日おきに経口投与した。８週間目にマウスを屠殺し、病変を特徴付けた（文献ベースの研究（Y. Nakashima, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol, 18:842-51 (1998)）に従ったＶＣＡＭ−１及びＴＬＲ４の発現が含まれる）。巨視的分析、顕微鏡的分析、及び分子分析のために、心臓、大動脈、及び頸動脈を取り出した。これには、病変サイズの確定、組織の切断及びその後のタンパク質レベルでのＥＣＡＭ及びＴＬＲ４の存在及び細胞局在化についての染色、並びに白血球／マクロファージ浸潤の評価が含まれていた。Ｃ１０で処置したマウス由来の結果を対照と比較して、Ｃ１０が頸動脈中の病変に統計的影響を及ぼすか否かを確定した。

Ｃ１０は、高脂肪食を与えたＡｐｏＥ^−／−マウスにおける血管炎症を軽減した： Ｃ１０（１ｍｇ／ｋｇ）を、１日おきにマウスに８週間腹腔投与した。対照マウスに、ＤＭＳＯのみを投与した。８週目にマウスを屠殺し、異なる組織においてヘマトキシリン及びエオシン染色によって確定する組織病理を試験した。図１５では、Ｃ１０処置（図１５、パネルＡ）マウス及び非処置マウス（図１５、パネルＢ）の大動脈基部の切片並びにＣ１０処置マウス（図１５、パネルＣ）及び非処置マウス（図１５、パネルＤ）における冠状動脈脈管構造の切片を示す。Ｃ１０処置マウス及び非処置マウスにおいて心筋内の血管を比較した。パネルＢでは、矢印は、大動脈基部の病変の重症度がＣ１０処置マウスと比較して非処置マウスで顕著に高いことを示す（図１５、パネルＡ）。同様に、パネルＤでは、写真は非処置マウスにおいてはプラークでほぼ完全に閉塞された冠状動脈の長切片を代表するのに対して、Ｃ１０処置マウス（パネルＣ）では、冠状動脈はあまり閉塞しなかった。さらに、病変が明らかな場合でさえ、血管の管腔は開存したままであった。心筋内の血管は、Ｃ１０の非存在下でプラークによって閉塞したが、Ｃ１０で処置したマウスにおいては開存しプラークはほぼ存在しなかった。データは、複数の動物から採取した複数のスライドの代表である。

病変を定性的に評価した場合、Ｃ１０は、ＴＬＲ４媒介性炎症マーカーの減少（表１５）に関連する疾患の重症度及び進行（表１５）を減少させた。

表１５に示すように、アテローム性動脈硬化症病変は、Ｃ１０処置マウスで減少する。冠状動脈及び心筋並びに大動脈基部の切片を、病変、病変の質、過剰発現したＴＬＲ４、過剰発現したＶＣＡＭ−１の程度、並びに炎症及びプラークの程度の両方について非処置マウス対Ｃ１０処置マウスで比較した。病変及び所見を、重症の＋＋＋＋から非常に軽度の＋までを使用して定性的に評価した。Ｃ１０処置動物は、明らかに改善した。結果は、Ｃ１０が、ＴＬＲ４陽性細胞が豊富でありマクロファージ浸潤領域が存在する広範囲に及ぶ炎症応答を減少させることを示した。評価を、二重盲検で行った。

マウスのＡｐｏＥ^−／−モデルは、ヒトアテローム硬化性プラークの変化の代表である： ヒト組織におけるアテローム硬化性病変は、過剰発現したＴＬＲ４及びＶＣＡＭ−１と関連する。外科的に取り出したプラーク由来の冠状動脈切片を、パラフィルム包埋ブロック由来の連続スライスにおいて抗ＴＬＲ４（図１６、右下のパネル）、抗ＶＣＡＭ−１（図１６、右上のパネル）、抗ＩＣＡＭ−１（図１６、左下のパネル）で免疫染色した。Ｈ＆Ｅ染色（図１６、左上のパネル）は、泡沫細胞を含む閉塞血管（筋肉壁及び心筋組織に取り囲まれた脂質保有「プラーク」）を示す。ＶＣＡＭ−１（暗灰色）が病変中に過剰発現したが、病変領域の反対側の内皮層にも過剰発現した。ＴＬＲ４（暗灰色）は、病変の反対側の領域でより多く発現し、驚いたことに、特にプラークと反対側の血管周囲の平滑筋層の至るところに発現した。ＴＬＲ４は、心筋の筋肉組織にも発現した。発現により、広範な炎症応答が示唆され、この炎症応答は、マクロファージ浸潤領域又は他の細胞中にＴＬＲ４陽性細胞が豊富である。あらゆる点で、これらのデータは、ＡｐｏＥ^−／−マウスのデータと重複し、したがって、Ｃ１０療法に感受性を示すＡｐｏＥ^−／−マウス（表１５）における病変に類似するはずである。

Ｃ１０は、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）におけるＳｔａｔ１のリン酸化及びＩＲＦ−１の活性化のＩＦＮ−β誘導を減少させる： 血管内皮細胞を直接評価するために、本発明者らは、培養ヒト大動脈内皮細胞を使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β／Ｓｔａｔ−１／ＩＲＦ−１シグナル経路を阻害する能力がｉｎ ｖｉｖｏでのＣ１０作用に必須なようである。したがって、ＩＲＦ−１タンパク質のＩＦＮ−β誘導は、Ｃ１０によって減少し（図１７Ａ、下、レーン４対レーン２）し、ビヒクルのみによって模倣されなかった（図１７Ａレーン３のＤＭＳＯ又はＤ）。Ｓｔａｔ１の活性化形態（Ｙ７０１でのリン酸化）のために剥離及び再探索した同一のブロットでは、ＩＦＮ−β誘導性Ｓｔａｔ１リン酸化の減少（図１７Ａ、上、レーン４対レーン２）も認められ、これは、ビヒクルのみによって模倣されなかった（図１７Ａレーン３のＤＭＳＯ又はＤ）。

Ｓｔａｔ１のチロシンリン酸化は、下流遺伝子活性化のための１つの要件である。チロシンリン酸化は、感受性遺伝子上でのプロモーター要素へのＳｔａｔ結合に必要な二量体形成過程で重要である。別の要件は、全Ｓｔａｔ１転写活性化に寄与するセリンリン酸化である。Ｓｔａｔ１のセリンリン酸化に対する影響を評価するために、以下の実験を行った。（ｉ）ラット甲状腺細胞（ＦＲＴＬ−５）を、インフルエンザＡ型ウイルスで２４時間感染させるか（図１７Ｂ、レーン２）、又は感染させず（図１７Ｂ、レーン１）、次いで、ＤＭＳＯ（１％）（図１７Ｂ、レーン３）又は１ｍＭ Ｃ１０（図１７Ｂ、レーン４）のいずれかで処置した。（ｉｉ）ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）を、ＤＭＳＯ（１％）（図１７Ｂ、レーン５）又は１ｍＭ Ｃ１０（図１７Ｂ、レーン６）の存在下で１００Ｕ／ｍＬのｈＩＦＮ−β（Biosource, Camarillo,CA）と２時間インキュベートした。（ｉｉｉ）マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を、５００ｎｇ／ｍｌの濃度の大腸菌ＬＰＳ血清型０１１１：Ｂ４（Sigma, Milwaukee, WI）と、単独（図１７Ｂ、レーン７）、又はＤＭＳＯ（０．５％）の存在下（図１７Ｂ、レーン８）、又は０．５ｍＭ Ｃ１０の存在下（図１７Ｂ、レーン９）で３時間インキュベートした。図１７Ｂで認められるように、ビヒクル対照ＤＭＳＯを投与したＩＦＮ−βはまた、ＨＡＥＣにおいてセリンリン酸化を増加させ（図１７Ｂレーン５）、これはＣ１０によって減少する（図１７Ｂ、レーン６）。Ｓｔａｔ１の病理学的に誘導されたセリンリン酸化を減少させるＣ１０の影響は、ＨＡＥＣに制限されず、ＦＲＴＬ−５細胞（図１７Ｂ、レーン４対レーン２及び３）及びＲＡＷ細胞（図１７Ｂ、レーン９対レーン７及び８）でも認められる。さらに、これは、ＩＦＮ−βによる病的誘導に制限されず（図１７Ｂ、レーン６対５）、ＦｌｕＡ感染を使用して模倣した病的誘導（図１７Ｂ、レーン４対レーン２及び３）及びＬＰＳでの細胞の処置によって模倣された病的誘導（図１７Ｂ、レーン９対レーン７及び８）でも有効である。まとめると、Ｃ１０は、ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β／Ｓｔａｔ／ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥ活性経路の阻害剤であり、非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞におけるＴＬＲ３／ＴＬＲ４病的シグナルによって誘導されたＳｔａｔ１チロシン及びセリンリン酸化に対する病的に増加した影響を遮断する。

化合物１０は、（高脂食を）１日おきに投与し、損傷発生から８週間後に評価した場合でさえも、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルにおける有効な作用因子である。しかし、化合物１０は、より早い時点でも有効である。したがって、４週間でマウスに対する経口及びｉｐの両方で投与したＣ１０の影響を比較した場合、体重に対して有意な影響が認められた。このマウス株は、２型糖尿病の急速な発症に関する肥満動物研究で使用したものと同一である（M. Fujimoto, et al., Diabetes, 54:1340-8, (2005)）。これに関して、慢性炎症は、インスリン抵抗性の発症で重要な役割を果たすと主張され、ｉＮＯＳの過剰発現に関連する（M. Fujimoto, et al., Diabetes, 54:1340-8 (2005)）。Ｃ１０は、明らかに４週間前に体重増加を減少させ、炎症性ＴＬＲ４媒介性応答も減少させた。

材料及び方法
実験動物： ２０匹のメスＡｐｏＥ^−／−マウス（Jackson Laboratory）（５週齢で体重１４．５ｇ（平均体重））を、以下の４群に分けた：（１）１０％ＤＭＳＯで処置した動物、（２）Ｃ−１０を含むＤＭＳＯ（１ｍｇ／ｋｇ体重）を経口で処置した動物、（３）Ｃ−１０を含むＤＭＳＯ（同用量）をＩ／Ｐで処置した動物、及び（４）処置しない対照動物。

処置を１日おき（８週間）又は毎日行った。動物にHarlan, Teklanからの西洋型食事（ＴＤ ８８１３７）を与えた。実験を、４週間後又は８週間後に終了した。

組織の調製： 実験終了後、動物を、アベルチン０．１ｍｌ／５ｇ体重のＩＰ注射によって麻酔した。ＰＢＳ、その後にＰＢＳ／４％ホルムアルデヒドを使用して、３７℃で１０分間ｉｎ ｓｉｔｕ潅流固定を行った。心臓及び大動脈を取り出し、大動脈弓、胸大動脈、及び腹大動脈部分を解剖し、周囲組織を慎重に除去した。組織を、ＰＢＳ／４％ホルムアルデヒド中への浸漬によって４℃で一晩後固定した。次いで、組織サンプルを、ＰＢＳで１０分間洗浄し、脱水後、パラフィン包埋し、切片（厚さ７μｍ）にした。切片を、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、光学顕微鏡下で試験した。

ＨＡＥＣの免疫ブロット分析： Ｃ１０がＨＡＥＣにおけるＳｔａｔ１のチロシンリン酸化のＩＦＮ−β媒介性活性化を遮断するか否かを確定するために、Ｃ１０（１．０ｍＭ）、０．２５％ＤＭＳＯ（Ｃ１０のキャリア対照）の非存在下又は存在下で、コンフルエントなＨＡＥＣを１００Ｕ／ｍｌ ＩＦＮ−βで２時間処置した。全細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤混合物（ＰＭＳＦ、ロイペプチン、及びペプスタチンＡ）の存在下で、溶解緩衝液（１５０ｍ ＭＮａＣｌ、１％ＩＧＥ−ＰＡＬ ＣＡ６３０、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中で調製した。２５μｇの溶解物を、ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓシステム(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を使用した変性条件下での３〜８％Ｔｒｉｓ−ＡｃｅｔａｔｅＰＡＧＥゲルで分離し、次いで、ニトロセルロース膜に移し、ウサギ抗ヒトＩＲＦ−１（Ｈ−２０５）Ａｂ(ｓｃ−１３０４１、Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)で最初に探索し、次いで、膜を剥離し、活性化Ｓｔａｔ１の検出のためにウサギ抗ヒトホスホ−Ｓｔａｔ−１（Ｔｙｒ７０１）Ａｂ(９１７１、Cell Signaling Technology, Beverly, MA)で再探索した。二次ＨＲＰ抱合ヤギ抗ウサギＡｂ(ｓｃ−２０５４、Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)の結合を、ＥＣＬｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を使用して検出した。

残基７２７でのＳｔａｔ１セリンリン酸化に対するＣ１０の影響を、ホスホセリン特異的Ｓｔａｔ１抗体(Biosource, Camarillo, CA)を使用したウェスタンブロットによって観察した。以下のように３つの異なる細胞型を刺激した。（ｉ）ラット甲状腺細胞（ＦＲＴＬ−５）を、インフルエンザＡ型ウイルスで２４時間感染させ、次いで、ＤＭＳＯ（１％）又は１ｍＭ Ｃ１０のいずれかで処置した。（ｉｉ）ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）を、ＤＭＳＯ（１％）又は１ｍＭ Ｃ１０の存在下で１００Ｕ／ｍＬのｈＩＦＮ−β（Biosource, Camarillo,CA）と２時間インキュベートした。（ｉｉｉ）マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を、５００ｎｇ／ｍＬの濃度の大腸菌ＬＰＳ血清型０１１１：Ｂ４（Sigma, Milwaukee, WI）と、単独、又はＤＭＳＯ（０．５％）の存在下、又は０．５ｍＭ Ｃ１０の存在下で３時間インキュベートした。２５μｇの各全細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜にブロットし、次いで、表示の抗体で探索した。ローディングを、剥離及び非リン酸化Ｓｔａｔ１に指向する抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA）での再探索によって調節した。

考察
本発明者らは、フェニルメチマゾール（Ｃ１０）（メチマゾールのリード化合物）、メチマゾール誘導体、互変異性環状チオンファミリーが非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞における病的ＴＬＲ３／ＴＬＲ４の過剰発現及び／又はシグナル伝達の減少に有効であることを証明した。本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方並びに示したこの作用が以下にそれぞれ代表する疾患に有効であることを証明した：Ｉ型糖尿病（ＴＬＲ３）及び内毒素性ショック、大腸炎、及びアテローム性動脈硬化症（ＴＬＲ４）。本発明者らは、ヒト疾患状態を模倣する疾患を罹患したマウスだけでなく、ウマにおける有効性も証明した。類推すると、この薬物は、自己免疫性炎症性疾患を引き起こす病的ＴＬＲ発現及びシグナル伝達を有する任意の疾患で有効なはずである。

本発明者らは、連続培養における非免疫細胞及びマクロファージが基底レベルのＴＬＲ３又はＴＬＲ４を発現すること、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４が機能的であること、並びに、その活性化によってそのＭｙＤ８８及び／又はＴＲＩＦアダプタータンパク質を介したＴＬＲ３又はＴＬＲ４シグナル伝達に関与している以下の２つのシグナル経路の遺伝子及び遺伝子産物が増加又は減少することを証明している：（ｉ）ＴＲＡＦ６相互作用から生じるように見なされるＮＦ−κＢ及びＥＲＫ１／２ＭＡＲＫ経路、及び（ｉｉ）ＩＲＦ−３及びＩＦＮ−βシグナル経路。これらの所見は、マウス細胞又はラット細胞（ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞、ＲＡＷマクロファージ）だけでなく、ヒト細胞（ＨＡＥＣ、ＮＰＡ甲状腺細胞、ＨＵＶＥＣ）にも関連する。Ｃ１０の影響は、感染因子からｄｓＲＮＡ及び有害環境による損傷（高脂肪含有食の過食に関与する高脂血症等）への複数の病的刺激に適用可能であることが示される。

本発明者らは、下流サイトカイン媒介性炎症応答を伴うＴＬＲ３／４の過剰発現及びシグナル伝達を、Ｃ１０及びこの化合物のファミリーによってｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで遮断することができることを証明した。本発明者らは、ｄｓＲＮＡによる感染に起因する疾患は、ウイルス（インフルエンザＡ型）による感染を模倣することを示し、このウイルスは、感染後のその複製及び活性がｄｓＲＮＡトランスフェクションによって模倣される可能性が高い一本鎖ＲＮＡウイルスである。膵島炎及び糖尿病に関連する膵臓細胞系並びに肺自己免疫炎症性障害に関連する肺上皮細胞における報告はまた、ウイルス感染、ｄｓＲＮＡトランスフェクション、及びＴＬＲ３過剰発現に関与し、このことは、Ｃ１０のこの現象及び作用を複数の組織における非免疫細胞に適用可能であることを示す。

本発明者らは、ＴＬＲ３及びＩＦＮ−βタンパク質が、免疫細胞に取り囲まれている橋本病患者由来の甲状腺細胞中にｉｎ ｓｉｔｕで発現するが、正常な個体又はグレーブス病の自己免疫性甲状腺機能亢進症由来の甲状腺細胞では発現しないことを示す。これは、以前に全く証明されていなかった新規の所見である。培養ヒト甲状腺細胞由来の結果は、ＴＬＲ３の活性化及び増加はヒト及びラットの培養甲状腺細胞で起こる可能性があり、リンパ球は主にＩＩ型インターフェロンを産生するので、これはリンパ球又はリンパ球産生ＩＦＮの非存在下で起こり得ることを示す（６３）。したがって、この結果から、甲状腺細胞が一次損傷（insult）の影響を受けてＴＬＲ３系を活性化し、樹状細胞を模倣した先天性免疫応答を生じるという可能性が得られる。受容細胞とは異なり、甲状腺細胞はリンパ器官に移動することができないので、得られたサイトカイン及び同時刺激分子の甲状腺細胞中での変化は、リンパ球の腺への誘引に寄与し得る。

甲状腺細胞における結果は、驚いたことに、ＴＬＲ３の関与及び過剰発現、病原体誘導及びｄｓＲＮＡの役割、見かけ上のオートクリン／パラクリン因子としての１型ＩＦＮの関与、免疫細胞の浸潤、及び機能的を引き起こす細胞特異的破壊を使用した別の疾患（すなわち、膵島炎及び１型糖尿病）の研究に類似している（D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111:225-33 (2004)、L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004)）。Wen他(L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004))は、ｄｓＲＮＡが動物において膵島炎及び１型糖尿病を誘導することができ、これは、既知の動物モデルと一致する（コクサッキーウイルスがＮＯＤマウスにおいて１型糖尿病を誘導する）ことを示している。Devendra及びEisenbarth (D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111 :225-33 (2004))は、ヒトとの関連性を強調し、エンテロウイルスが１型糖尿病における潜在的因子として多数の研究で注目されていることに留意している。彼らは、β細胞が破壊されるウイルス感染機構がＩＦＮ−α（ＩＦＮβのようなＩ型ＩＦＮ）に関与することに留意している。彼らは、二本鎖ＲＮＡ又はポリ−ＩＣ（ウイルス模倣物）によるＴＬＲの活性により、ＩＦＮ−αの誘導を介して、免疫媒介性β細胞破壊を活性化又は促進することができるとの仮説を立てている。彼らは、多数の臨床例から自己免疫疾患（特に、甲状腺炎（以下を参照のこと））でＩＦＮ−α療法が関与し、血清ＩＦＮ−αレベルの上昇が１型糖尿病及び甲状腺自己免疫／炎症性疾患に関連していることに留意している（M. F. Prummel, et al., Thyroid, 13:547-51 (2003)）。本発明のデータをまとめると、本発明者らは、これらが疾患の発症と機構的に重要に関連する可能性があると提起した。橋本病及び１型糖尿病は、免疫細胞が浸潤し、甲状腺細胞が破壊されるか又はβ細胞が変化し得る。これは特定組織の細胞が最初に損傷を受けてＴＬＲ３が活性化し、組織細胞において先天性免疫応答が生じるからであり、この事象は発症機構における初期事象であり得る（D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111 :225-33 (2004)、L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004)、B. Beutler, Nature, 430:257-63 (2004)、K. S. Michelsen, et al., J Immunol, 173:5901- 7 (2004)）。

Devendra及びEisenbarth（D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111 :225-33 （2004））は、（産生又は活性に関して）ＩＦＮ−αを標的化する治療薬が１型糖尿病及び自己免疫の防止に潜在的に有益であり得ると示唆している。本発明者らは、より良好な影響が、１型ＩＦＮのみに対する部分的作用よりもむしろ、１型ＩＦＮを増加させるＴＬＲシグナル伝達事象の抑制であろうことを示す。したがって、本発明者らは、ＴＬＲ３の過剰発現／シグナル伝達がメチマゾール（ＭＭＩ）又はそのより強力な誘導体であるフェニルメチマゾール（Ｃ１０）の免疫調整作用に感受性を示し得るか否か(M. Saji, et al., J Clin Endocrinol Metab, 75:871-8 (1992)、V. Montani, et al., Endocrinology, 139:290-302 (1998)、L. D. Kohn et al., 米国特許第６，３６５，６１６号 (2002)、E. Mozes, et al., Science, 261:91-3 (1993)、D. S. Singer, et al., J Immunol, 153:873-80 (1994))、さらに、Ｃ１０がＭＭＩよりも有意に広い範囲で、ＴＬＲ−ＭｙＤ８８結合ＮＦ−６Ｂシグナル経路ではなくＴＬＲ３調節ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β／ＩＳＲＥ／ＳＴＡＴシグナル経路の阻害によってＴＬＲ／ＴＬＲシグナル伝達の過剰発現を遮断することを示すのかについて調査した。これはＩＲＦ−３トランス活性化の単なる阻害よりも広範に作用し、したがって、他の遺伝子上の広範なＩＳＲＥ配列の活性化を阻害することができる。これに関して、ＮＦ−６Ｂ部位に加えて、ＩＲＦ−１は、Ｓｔａｔ１に結合するＧＡＳを有することに留意すべきである。Ｃ１０がＩＲＦ−１遺伝子発現を遮断する能力は、本明細書中及び本発明者らのＴＮＦ−∀誘導ＶＣＡＭ−１及び白血球接着のＣ１０阻害の研究の両方において、ＴＬＲ３調節ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β／ＩＳＲＥ／ＳＴＡＴシグナル経路の成分へのその作用に関連すると示唆することが妥当である。簡潔に述べれば、Ｃ１０は、Davendra及びEisenbathがその概説(D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111:225-33 (2004))で要望している、１型ＩＦＮのみに対するその影響によるのではなく、ＩＲＦ−３／ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β／ＩＳＲＥ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路に関与する全ＴＬＲ３／４媒介性シグナル経路の遮断による新規の治療パラダイムを満たす作用因子の一例であり得る。本発明者らは、Ｃ１０はＳｔａｔ１二量体形成及び完全な転写活性化の両方に重要なチロシン及びセリンのリン酸化をそれぞれ遮断することができるので、Ｃ１０が特に有用であることを示す。これらの異なるリン酸化事象が遺伝子活性化に別に影響を及ぼすことができ、ＮＦ−κＢシグナル伝達を直接阻害できないことと共にＣ１０の選択性が強調されると認識されている。ＮＦ−κＢシグナル伝達遺伝子の活性化は、罹患していない状態で多数の遺伝子を調節する正常な過程である。例えば、ＶＡＫキナーゼによるＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β／ＩＳＲＥ／ＳＴＡＴシグナルの超活性化（super activation）は、例えば、ウイルス感染によって誘導される病的事象である。Ｃ１０が阻害するのはこのためである。ＩＲＦ−１は通常は発現されず、病的状態においてのみ増加し、Ｃ１０療法によって有効に遮断される。

ＴＬＲシグナル伝達は未知のものが多くあり、依然として複雑なままである。ＩＲＦ−３のリン酸化反応におけるＰＩ３キナーゼの役割及びＡｋｔの関与が近年明らかになっており（S. N. Sarkar, et al., Nat Struct Mol Biol, 11:1060-7 (2004)）、ＩＲＦ−３の完全なリン酸化反応にはＴＢＫ−１及びＡｋｔが必要である。ＳＴＡＴのウイルス誘導性の活性化における反応性酸素種の関与が認識されている（T. Liu, et al., J Biol Chem, 279:2461-9 (2004)）。Ｐ３８ａｌｐｈａＭａｐキナーゼ経路は、Ｉ型ＩＦＮ依存性遺伝子転写及び関与に関わる下流のエフェクターに重要である（Y. Li, et al., J Biol Chem, 279:970-9 (2004)）。 ＩＦＮ−β遺伝子の転写活性化には、転写因子ＡＴＦ−２／ｃ−Ｊｕｎ、ＩＲＦ−３／ＩＲＦ−７、ＮＦ−κＢ、及びＨＭＧＩ（Ｙ）を含むエンハンセオソーム（enhanceosome）のアセンブリが必要であり（D. Panne, et al., Embo J, 23:4384-93 (2004)）、このようにして、２つのシグナル経路がＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β活性化の最初のレベル並びにＶＣＡＭ−１遺伝子発現等の下流分子の両方において結び付けられることが示される。それにもかかわらず、本発明者らのデータは、重要な機構的工程に重要であり、少なくともＣ１０がＴＬＲ３／４シグナル経路の複雑性を分析するのを助けるが、またより重要なことには、病理学的なＴＬＲ３／ＴＬＲ４発現、並びに非免疫細胞、マクロファージ、単球及び樹状細胞におけるシグナル伝達によって誘導される自己免疫性炎症性疾患を治療する新規の作用物質であることを実証している。

ＴＮＦ−∀誘導性ＶＣＡＭ−１遺伝子発現及び白血球接着を阻害するＣ１０の有効性の本発明者らのこれまでの記載は、非免疫細胞におけるＴＬＲ４過剰発現又はシグナル伝達が自己免疫／炎症性疾患と結び付く２つの他の疾患であるアテローム性動脈硬化症及び結腸炎に強く関連している（K. S. Michelsen, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:10679-84 (2004)、G. Pasterkamp, et al., Eur J Clin Invest, 34:328-34 (2004)、G. Andonegui, et al., J Clin Invest, 111:1011-1020 (2003)、B. Beutler, Nature, 430:257-63 (2004)、K. S. Michelsen, et al., J Immunol, 173:5901- 7 (2004)、N. M. Dagia, et al., J Immunol, 173:2041-9 (2004)、C. Fiocchi, Am J Physiol, 273:G769-75, (1997)、N. Harii, et al., Mol Endocrinol,19:l23l-50 (2005)）。

したがって、橋本甲状腺炎がインスリン欠乏症及び１型糖尿病だけでなく、過剰発現が環境病原菌の分子署名による誘導を伴う、非免疫細胞におけるＴＬＲ３／４過剰発現又はシグナル伝達に関連する自己免疫／炎症性疾患として、結腸炎及びアテローム性動脈硬化症にもグループ化され得ることを結論付けることが妥当である（K. S. Michelsen, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101 : 10679-84 (2004)、G. Pasterkamp, et al., Eur J Clin Invest, 34:328- 34 (2004)、D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111:225-33 (2004)、L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80 (2004)、G. Andonegui, et al., J Clin Invest, 111:1011-1020 (2003)、B. Beutler, Nature, 430:257-63 (2004)、K. S. Michelsen, et al., J Immunol, 173:5901-7 (2004)、C. Fiocchi, Am J Physiol, 273:G769-75 (1997)、N. Harii, et al., Mol Endocrinol, 19: 1231-50 (2005)）。

ＤＳＳモデルを使用して、潰瘍性大腸炎及びクローン病を研究する。最近の研究により、ＴＬＲ４が両方において強く上方制御され（E. Cario, et al., Infect Immun, 68:7010-7 (2000)）、別のマウス小腸結腸炎モデルにおける小腸結腸炎がＴＬＲ４欠損マウスで有意に改善されることが示されている。これらのデータは、Ｔｈ１依存性小腸結腸炎における先天性免疫及びＴＬＲ４の重要性（M. Kobayashi, et al., J Clin Invest, 111 :1297-308 (2003)）、したがって、それによるＤＳＳモデルにおける結腸上皮細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＴＬＲ４過剰発現の遮断におけるＣ１０の重要性を示す。

本明細書中の理論に拘束されることを決して望まないが、橋本病及び１型糖尿病が相互の原型である可能性があり、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞の研究は膵臓β島細胞及び糖尿病の研究のための関連モデルであると推測することが妥当である。高血糖値はＭＨＣＩ発現を転写的に増加させ、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞におけるインターフェロン−作用を像封させることができる（G. Napolitano, et al., Endocrinology, 143:1008-17 (2002)）。振り返ってみると、これは、高血糖値によって誘導された島細胞の変化に適用することができる。

本発明者ら（N. Harii, et al., Mol Endocrinol,19:123l-50 (2005)）、並びに他者（K. S. Michelsen, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:10679-84, (2004)、G. Pasterkamp, et al., Eur J Clin Invest, 34:328-34, (2004)、D. Devendra, et al., Clin Immunol, 111 :225-33, (2004)、L. Wen, et al., J Immunol, 172:3173-80, (2004)、G. Andonegui, et al., J Clin Invest, 111:1011-1020 (2003)、B. Beutler, Nature, 430:257-63 (2004)、K. S. Michelsen, et al., J Immunol, 173:5901-7 (2004)、C. Fiocchi, Am J Physiol, 273:G769-75 (1997)、L. Guillot, et al., J Biol Chem, 279:2712-8 (2004)）は、I型ＩＦＮ（ＩＦＮ−α又はβ）が先天性ウイルス免疫応答の重要な因子であることを示している。本発明者らは、非免疫細胞におけるＩ型ＩＦＮ遺伝子発現の増大が、オートクリン／パラクリン様式となることができ、ＩＲＦの活性化によってＴＬＲ３をさらに上方制御させることを示唆している。Ｉ型ＩＦＮは宿主防御及び恒常性の強力な細胞外メディエーターとして作用し、抗ウイルス性の成長阻害及び免疫調節応答を媒介するタンパク質を合成させる。分泌されたＩ型ＩＦＮは、ＴＬＲ３及びＰＫＲ等のｄｓＲＮＡ認識分子の発現の増大並びにＰＫＲによるｄｓＤＮＡの認識によって、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＤＮＡに対して、同じか又は隣接する細胞を感受性にすることができる。非免疫細胞の先天性免疫応答におけるＴＬＲ３及びＩ型ＩＦＮを誘発する（invoking）同様のモデルが、インフルエンザＡに感染した肺組織で誘発されている（L. Guillot, et al., J Biol Chem, 279:2712- 8 (2004)）。

Ｉ型ＩＦＮは保護的サイトカインであるので、これがＣ型肝炎及びＢ型肝炎、慢性骨髄性白血病、黒色腫、並びに腎癌を治療する臨床設定で使用されている（C. E. Samuel, Clin Microbiol Rev, 14:778-809 (2001)）。しかし、Ｉ型ＩＦＮ治療の１つの副作用は、自己免疫疾患の発生率の増加である。橋本甲状腺炎の危険性がＨＣＶ肝炎患者におけるＩ型ＩＦＮ治療により増大する。甲状腺自己抗体は、Ｉ型ＩＦＮによる治療を受ける患者の最大２０％までで見いだされ、これらの患者の約５％が臨床的な甲状腺機能低下症を発症する（P. Burman, et al., J Clin Endocrinol Metab, 63:1086-90 (1986)、H. Gisslinger, et al., Clin Exp Immunol, 90:363-7 (1992)、A. Imagawa, et al., J Clin Endocrinol Metab, 80:922-6 (1995)）。Ｉ型ＩＦＮの可能性のある自己免疫誘導活性と一致して、Ｉ型ＩＦＮの上方制御が、乾癬、全身性エリテマトーデス、及びインスリン依存性真性糖尿病である何人かの患者で観察された（P. Schmid, et al., J Interferon Res, 14:229-34 (1994)、X. Huang, et al., Diabetes, 44:658-64 (1995)、A. A. Bengtsson, et al., Lupus, 9:664-71 (2000)、L. Farkas, et al., Am J Pathol, 159:237-43 (2001)）。したがって、後者が起こり得る部分的な治療並びに疾患治癒にすぎないため、Ｃ１０治療が１型インターフェロンのものに取って代わる一方、Ｃ１０、メチマゾール、メチマゾール誘導体、及び互変異性環状チオンが、自己免疫性炎症性応答の全体的な病理学的発現を阻止する手段を与える。

幾つかの最後のポイントが注目に値する。ｄｓＲＮＡトランスフェクトが、ＰＫＲ依存性ＮＦ−κＢ活性、又はＩＲＦ−３活性化を介するＩＦＮ−β遺伝子発現をもたらす別々のキナーゼ系を活性化するのに使用された。ｄｓＲＮＡトランスフェクト又はｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルス感染に次ぐＩＲＦ−３活性化をもたらす上方制御機構が明らかになっている。薬理学的研究及び分子研究により、ＰＫＲの代わりに新規のウイルス活性化セリン／スレオニンキナーゼ（ＶＡＫ）が、細胞質ｄｓＲＮＡに応じてＩＲＦ−３を活性化させることが示唆される（M. J. Servant, et al., J Biol Chem, 276:355-63 (2001)、M. J. Servant, et al., J Interferon Cytokine Res, 22:49-58 (2002)、M. J. Servant, et al., J Biol Chem, 278:9441-7 (2003)）。これまでに、このことがＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ及びＩ６Ｂ関連キナーゼ（ＩＫＫ）−ＩＫＫｅｐｓｉｌｏｎ／ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）を誘発する複雑な現象であることが分かっている（M. J. Servant, et al., J Biol Chem, 276:355-63 (2001)、M. J. Servant, et al., J Interferon Cytokine Res, 22:49-58 (2002)、M. J. Servant, et al., J Biol Chem, 278:9441-7 (2003)）。これらの見解と一致して、ＰＫＲが、抗ウイルス性細胞応答をもたらす主要な細胞内ＲＮＡ認識分子であるという証拠があるにもかかわらず、ＰＫＲ−／−マウスは身体的に正常であり、ポリ（Ｉ：Ｃ）及びウイルスによるＩ型ＩＦＮの誘導が損なわれない。

次に、データの合計により、ＴＬＲ３／ＴＬＲ４上方制御の存在、及びｄｓＲＮＡトランスフェクト又はＬＰＳによるシグナル伝達が本発明者らのこれまでの研究におけるデータを説明し得ることが示唆され（K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:2285-90 (1999)）、これによりウイルス感染、プラスミドのトランスフェクト、ｄｓＤＮＡのトラスフェクト、又は細胞の細胞質へのｄｓＲＮＡのトランスフェクトがＭＨＣ Ｉの発現を増大し、ＭＨＣ ＩＩの異常発現を引き起こし、抗原提示（ＡＰＣ発生）に必要な他の遺伝子の発現を引き起こし得ることが示された。ｄｓＲＮＡ又はｄｓＤＮＡのトランスフェクトの作用がＮＦ−κＢの活性化を誘発するが、ｄｓＲＮＡのみではＩＦＮ−β ＲＮＡレベルが増大すると考えられる（K. Suzuki, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:2285-90 (1999)）。これらの現象は、単球及びマクロファージを含む他の細胞で明らかであり、動物における免疫−炎症性応答に関連していた（K. J. Ishii, et al., J Immunol, 167:2602-7 (2001)）。ＴＬＲシグナル伝達事象を阻止することによりＣ１０は、これらの下流の付帯現象を阻止する。

最後に、Ｃ１０ファミリーは、非免疫細胞、マクロファージ、単球、及び樹状細胞に対して有効であるが、他の免疫細胞に対する作用はわずかであることが示された。さらに、Ｃ１０ファミリーは、ＩＲＦ−３／１型ＩＦＮ／ＳＴＡＴ／ＩＳＲＥ／ＩＲＦ−１シグナルに対するその作用が限定的であり、ＮＦ−κＢシグナル系の直接活性に対するその影響はわずかである。ＩＲＦ−１が正常細胞中で発現するだけでなく、病的誘導（すなわち、ウイルス感染、ＬＰＳ、ｄｓＲＮＡトランスフェクション、又は有害環境による損傷による）後にも誘導される場合、この化合物ファミリーは、疾患及び正常ではない宿主の免疫防御を引き起こす病的過剰発現のみに対する影響に明らかな選択性を示す。これらは、選択的作用因子のようである。

まとめると、これらの最後の４つのポイントは、本発明の新規性及び有用性を強調する。これらは、免疫細胞の代わりに非免疫細胞事象を攻撃することによって免疫細胞を対象とする療法に関して現在の見解に反する。これらは、唯一の正しい治療アプローチとしての疾患感受性をもたらす遺伝子を攻撃する現在の概念に反するが、むしろ、遺伝的に感受性を示す動物においてさえも共通の環境事象の刺激組を攻撃する。したがって、これらは、病原因子（１型糖尿病、橋本病、毒素性ショック）としての再発性の環境事象の遮断によって予防し、慢性再発性疾患（大腸炎及びアテローム性動脈硬化症等）における合併症を治療することもできる。

ＴＬＲ３は、存在し、甲状腺細胞に対して機能的であり、ＭｙＤ８８関連（ＮＦ−κＢ／ＭＡＰキナーゼ）及び非ＭｙＤ８８（ＩＲＦ−３／ＩＮＦ−β）シグナル伝達の増加を示す。本発明に関する図１の有意性を理解するために、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞中でＴＬＲ３ ＲＮＡが基底レベルで見出されると理解しなければならない。ＲＮＡは、ノーザン分析によってＦＲＴＬ−５甲状腺細胞及び種々のマウス甲状腺中で検出されたが、他の細胞株では検出されなかった。これらの実験では、２０μｇ（細胞株）及び７．５μｇ（マウス組織）の総ＲＮＡを使用した。２９３細胞及びＣＨＯ細胞を陰性対照として使用し、マウス脾臓を陽性対照として使用した。ブロットを、放射性標識マウスＴＬＲ３ｃＤＮＡとハイブリッド形成させた。ＴＬＲ３タンパク質発現も、１０μｇ／ｍｌの抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体を含むか（ＩＰ＋）又は含まない（ＩＰ−）第１の免疫沈降細胞溶解物によってＦＲＴＬ−５細胞中で検出された。次いで、免疫沈降画分を、２０μｇの表示のＴＬＲ発現ベクターで一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞由来の全細胞溶解物（２０μｇ）と共にブロッティングし、抗ＴＬＲ３抗体（４μｇ／ｍｌ）を使用したウェスタンブロットによって分析した。 ポリ（Ｉ：Ｃ）（試験化合物として一般に使用されるｄｓＲＮＡリガンド）は、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞においてＴＬＲ３媒介性ＮＦ−κＢ／Ｍａｐキナーゼシグナル経路を活性化する。ＦＲＴＬ−５細胞を、１００ｎｇのルシフェラーゼレポーターｐＮＦ−κＢ Ｌｕｃ及び２ｎｇの内部対照ｐｈＲＬ−Ｔｋで一過性にトランスフェクトした。３６時間後、細胞を、１００ｎｇ／ｍｌポリ（Ｉ：Ｃ）又は無内毒素大腸菌ＤＮＡと６時間インキュベートした。デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を使用して測定した。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＴＬＲ３媒介性ＮＦ−κＢ媒介性ルシフェラーゼ活性（遺伝子発現）を６倍に増加させた。ｄｓＤＮＡは効果がなかった。電気泳動シフト分析（EMSA）によってさらに支持された。ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞を１００μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、又はＴＰＡとインキュベートすると、細胞は１時間後に溶解し、ＮＦ−κＢの核転座が測定された。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、特定の新規のタンパク質／ＤＮＡ複合体の存在及び抗ｐ５０抗体及びｐ６５抗体によるその阻害によって測定したところｐ５０／ｐ６５複合体形成を誘導するが、抗ｐ５２抗体、ｃ−ｒｅｌ、及びＲｅｌＢ抗体では誘導されず、複合体はまた、抗ｐ５０によってスーパーシフト（supershifted）した。ポリ（Ｉ：Ｃ）はまた、ＴＬＲ３媒介性ＥＲＫ１／２及びＭＡＫＫ活性を増加させた。ＦＲＴＬ−５細胞を、インスリン及びＴＳＨを含まない培地（４ホルモン又は４Ｈ）中に維持し、次いで、１００μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）又は１０μＭインスリンで刺激した。全細胞溶解物（２０ｎｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した後、リン酸化特異的ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫに対する抗体を使用したウェスタンブロット分析は、ポリ（Ｉ：Ｃ）はインスリンと同様にＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫタンパク質レベルを２〜４倍に増加させることを示した。さらに、ＦＲＴＬ−５細胞をｐＣＭＶ−ＢＤ−Ｅｌｋ１及びｐＦＲ−ｌｕｃで同時トランスフェクトし、１００μｇ／ｍｌ ポリ（Ｉ：Ｃ）又はＩＬ−１βと６時間インキュベートすると、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）で測定した場合、ＥＬＫ１トランス活性化は、ポリ（Ｉ：Ｃ）及びＩＬ−１βによって２倍に増加した。ＴＬＲ３結合ｄｓＲＮＡによって惹起されたＮＦ−κＢ／ＭＡＰキナーゼシグナルは、ＴＬＲ３機能的発現の唯一の部分である。以下のさらなる図で証明されるように、図１は、メチマゾール、メチマゾール誘導体、互変異性環状チオンを使用した療法に関連するより重要な経路によるシグナル伝達を示す。 図１Ａでは、ＦＲＴＬ−５細胞を、１００ｎｇのルシフェラーゼレポーターＩＦＮ−β−プロモーター−ｌｕｃ及び２ｎｇの内部対照であるｐｈＲＬ−Ｔｋ−Ｉｎｔで一過性にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＴＬＲ３発現プラスミドの同時トランスフェクションの存在下（ｈＴＬＲ３）又は非存在下（偽）でＩＦＮ−β−プロモーター−ｌｕｃ及びｐｈＲＬ−Ｔｋでトランスフェクトした。３６時間後、細胞を指示用量のポリ（Ｉ：Ｃ）又は無内毒素大腸菌ＤＮＡと６時間インキュベートした。デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を使用してデータを得た。したがって、ＴＬＲ３活性化により、ＩＦＮ−β遺伝子発現が増加した。図１Ｂでは、ＦＲＴＬ−５細胞を、１００μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）とインキュベートした。表示の時点後、総ＲＮＡを単離し、遺伝子特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによってＩＦＮ−β及びＧＡＰＤＨを決定した（S. Yokoyama, et al., Biochem Biophys Res Commun, 232:698-701, (1997)）。図１Ｃでは、細胞をｐＣＭＶ−ＢＤ−ｈＩＲＦ−３及びｐＦＲ−ｌｕｃで同時トランスフェクトし、ポリ（Ｉ：Ｃ）又はＩＬ−１βと６時間インキュベートした。甲状腺細胞におけるＴＬＲ３活性化により、ＩＲＦ−３活性が増加し、ＩＦＮ−βプロモーターへのその結合により、ＩＦＮ−β遺伝子発現が増加した。図１Ｄでは、細胞を２００ｎｇのＩＦＮ−β−プロモーター−ｌｕｃ、指示用量のＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１、野生型ＭｙＤ８８、又はドミナントネガティブＭｙＤ８８、及び２ｎｇの内部対照ｐｈＲＬ−Ｔｋで一過性にトランスフェクトした。３６時間後、細胞を指示用量のポリ（Ｉ：Ｃ）又はＩＬ−１βと６時間インキュベートした。デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を使用してデータを得た。したがって、ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭは、甲状腺細胞で機能的である。まとめると、甲状腺細胞上のＴＬＲ３受容体は、活性化された場合、ＴＲＩＦ結合シグナルが増加し、ＩＲＦ−３／ＩＦＮ−βが増加し、さらに、ＮＦ−κＢシグナル系が明らかに増加し得る。 ポリ（Ｉ：Ｃ）インキュベーションにより、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞中のＴＬＲ３ ｍＲＮＡは上方制御されないが、対照的に、ポリ（Ｉ：Ｃ）トランスフェクションによってＰＫＲと無関係にＴＬＲ３発現が増加する。図２Ａでは、ＴＬＲ３及び幾つかの他の遺伝子のｍＲＮＡレベルに対する影響を、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞と１００μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）又は１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βとの表示の時間でのインキュベーション後に測定した。総ＲＮＡ精製後、２０μｇの総ＲＮＡを、表示の放射性標識ｃＤＮＡプローブを使用して分析した。ポリＩＣインキュベーションにより、ＴＬＲ３、主要組織適合クラスＩ、又はＰＫＲはいずれも増加せず、このことは、ＩＰ−１０増加にもかかわらず自己免疫性炎症性疾患に関与する。（Ｂ）では、ＴＬＲ３及び幾つかの他の遺伝子のｍＲＮＡレベルに対する二本鎖ヌクレオチドのインキュベーションではなく、トランスフェクションに対する影響を評価した。細胞を、リポフェクタミン２０００のみ（Ｌ）又は表示量のポリ（Ｉ：Ｃ）（ＲＮＡ）又は無内毒素大腸菌ＤＮＡでトランスフェクトした。１２時間後及び２４時間後、２０μｇの総ＲＮＡを、表示の放射性標識ｃＤＮＡプローブを使用して分析した。ポリＩＣ（ＲＮＡ）トランスフェクションにより、ＴＬＲ３、主要組織適合クラスＩ、及びＰＫＲが増加し、このことは、自己免疫性炎症性疾患に関与する。ＤＮＡトランスフェクションはそれほど有効でなかった。（Ｃ）では、トランスフェクトしたｄｓＲＮＡ誘導ＴＬＲ３ｍＲＮＡレベルに対する２−アミノプリン（ＰＫＲ阻害剤）の影響を測定した。ここでも、細胞を、１０ｍＭ ２−アミノプリンの存在下又は非存在下でリポフェクタミン２０００のみ又はリポフェクタミンと表示量のポリ（Ｉ：Ｃ）又は無内毒素大腸菌ＤＮＡでトランスフェクトした。表示のインキュベーション期間後、細胞を採取し、２０μｇの総ＲＮＡを、表示の放射性標識ｃＤＮＡプローブを使用して分析した。ＰＫＲ阻害剤により、ｄｓＤＮＡのＰＫＲ、ＭＨＣクラスＩ、及びＴＬＲ３のｍＲＮＡレベルをわずかに増加させる能力が有意に低下したが、これに関して、ｄｓＲＮＡトランスフェクションに影響はなかった。パネルＣの下で、ＩＦＮ−β遺伝子発現に対する２−ＡＰの影響を、遺伝子特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって測定し（S. Yokoyama, et al., Biochem Biophys Res Commun, 232:698-701, (1997)）、ｄｓＲＮＡ誘導ＮＦ−κβ活性化に対する２−ＡＰの影響をＥＭＳＡによって測定した。２−ＡＰは、ｄｓＲＮＡ誘導ＮＦ−κβ複合体を強く減少させるが、ＩＦＮ−β ｍＲＮＡレベルに対して影響を及ぼさなかった。データは、複数の実験の代表である。まとめると、ｄｓＲＮＡトランスフェクションは、自己免疫性炎症性疾患に関与するシグナル（ＭＨＣ遺伝子及び高レベルのＩ型インターフェロン等）の遺伝子発現を増加させるのに必要であるが、単に、ＴＬＲ３受容体へのｄｓＲＮＡ結合によるｄｓＲＮＡとの甲状腺細胞のインキュベーションによるＴＬＲの活性化ではない。さらに、ＰＫＲの増加にもかかわらず、ｄｓＲＮＡトランスフェクションによるＴＬＲ３／Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達に関与する重要なシグナルはＰＫＲ媒介ではない。 ＦＲＴＬ−５細胞のインフルエンザＡ型ウイルス感染により、ｄｓＲＮＡトランスフェクションの作用と同様に、ＴＬＲ３、ＩＲＦ−１、ＭＨＣクラスＩＩ、及びＩＦＮ−βレベルが過剰発現する。（Ａ）細胞を、インフルエンザＡ型で２４時間感染させるか（＋）、感染させなかった（−）。別個に、細胞を、ｄｓＲＮＡ（＋）でトランスフェクトするか、偽トランスフェクション（−）に曝露した。総ＲＮＡ（２０μｇ）を単離し、放射性標識ｃＤＮＡプローブを使用してノーザンブロットを行い、ＴＬＲ３、ＩＲＦ−１、及びＭＨＣ ＩＩを検出した。サンプルのローディング及び完全性についての対照としてリボゾームバンドを示す。インフルエンザＡ型感染は、ｄｓＲＮＡトランスフェクションがＴＬＲ３、ＩＲＦ−１、及びＭＨＣクラスＩＩｍＲＮＡレベルを増加させる能力に模倣していた。（Ｂ）では、総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これをテンプレートとして使用して、ＰＣＲによってＩＦＮ−β又はＧＡＰＤＨを増幅した。インフルエンザＡ型及びｄｓＲＮＡのトランスフェクションは、ＩＦＮ−βのｍＲＮＡレベルを有意に増加させるがＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子対照）は変化しなかった。したがって、総ＲＮＡをノーザンブロット（Ａ）又はＰＣＲ（Ｂ）のいずれでの使用したかにかかわらず、結果は類似していた。インフルエンザＡ型及びｄｓＲＮＡのトランスフェクションは、甲状腺細胞におけるＴＬＲ３発現及びシグナル伝達に対してほぼ同一の影響を及ぼした。データは、複数の実験の代表である。 フェニルメチマゾール（Ｃ１０）及びメチマゾール（ＭＭＩ）は、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞においてＩＦＮ−βがＴＬＲ３、ＰＫＲ、及びＭＨＣクラスＩのＲＮＡレベルを増加させる能力を阻害する。細胞を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｃ１０、又はＭＭＩの存在下で１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βを使用するか又は使用せずに３時間インキュベートした。ＤＭＳＯは、ビヒクル対照である。２０μｇの総ＲＮＡを使用してノーザンブロットを行い、放射性標識ｃＤＮＡプローブを使用してＴＬＲ３、ＰＫＲ、ＭＨＣ Ｉ、及びＧＡＰＤＨを検出した。データは、複数の実験の代表である。図２Ｂのポリ（Ｉ：Ｃ）トランスフェクションの場合のように、ＩＦＮ−βはＴＬＲ３を増加させた。ポリ（Ｉ：Ｃ）トランスフェクション（データ示さず）及びＩＦＮ−βの両方によって誘導されたＴＬＲ３の増加は、ＰＣＲ（Ａ）又はノーザン分析（Ｂ）のいずれによって測定されたかにかかわらず、Ｃ１０の作用によって完全に防止された。（Ｂ）におけるＩＦＮ−βによって増加したＭＨＣクラスＩレベル及びＰＫＲｍＲＮＡレベルも、Ｃ１０によって有意に減少し、Ｃ１０はメチマゾール（ＭＭＩ）よりも有効であった。 フェニルメチマゾール（Ｃ１０）及びメチマゾール（ＭＭＩ）は、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞におけるポリ（Ｉ：Ｃ）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、及びＩＬ−１βがＩＦＮ−β遺伝子発現（左上）及びＩＲＦ−３トランス活性化（右上）を増加する能力を阻害する。（左上）細胞を、ＩＦＮβ−Ｌｕｃ及び対照ベクター（ｐＲＬＴｋ−Ｉｎｔ）で同時トランスフェクトし、次いで、ビヒクル（ＤＭＳＯ）のみ（−）、Ｃ１０、又はＭＭＩの存在下で、ポリ（Ｉ：Ｃ）（１００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、又はＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いるか又は用いずに（−）６時間処置した。デュアルルシフェラーゼアッセイシステムを使用してデータを得た。（右上）細胞を、Ｇａｌ４ＤＢＤ／ＩＲＦ−３及びＧａｌ４−Ｌｕｃで同時トランスフェクトし、次いで、（左上）と同様に、ＤＭＳＯ又はＣ１０の存在下で非処置（−）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、又はＩＬ−１βで６時間処置した。ルシフェラーゼアッセイによってデータを得た。どのようにしてシスレポートシステムが作用するのかについてのグラフ（下）も示す。データは、複数の実験の代表である。Ｃ１０は、ＩＲＦ−３トランス活性化及びＩＦＮ−β遺伝子発現に対するポリ（Ｉ：Ｃ）（１００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、又はＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）の影響を有意に減少させ、その影響はＭＭＩよりもはるかに良好である。 フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、ポリ（Ｉ：Ｃ）又はＬＰＳがＮＦ−６Ｂのｐ５０／ｐ６５ヘテロ二量体複合体形成を増加させる能力に影響を及ぼさないが（Ａ）、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞におけるＳｔａｔ１リン酸化のインフルエンザＡ型誘導活性化を阻害することができる（B）。（Ａ）では、ＤＭＳＯ、Ｃ１０、又はＭＭＩの存在下で、処置していないか（なし）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（１００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で６時間処置した細胞由来の核抽出物を使用してＥＭＳＡを行った。プローブは、ＮＦ−κβコンセンサスオリゴヌクレオチドであった。ｐ６５／ｐ５０及びｐ５０／ｐ５０複合体を示し、図２Ｂと同様に誘導複合体のｐ５０成分又はｐ６５の抗体阻害又はスーパーシフトによって同定した。（Ｂ）では、細胞にインフルエンザＡ型を２４時間感染させ、次いで、ＤＭＳＯ又はＣ１０を培地に６時間添加した。それぞれにおいて、Ｓｔａｔ１ ＰＹ７０１を検出するために行ったウェスタンブロットで２５μｇの核抽出物を使用した。次いで、ブロットを剥離し、非リン酸化Ｓｔａｔ１について再探索した。第１のレーンは、非感染対照（−）である。Ｓｔａｔ１のセリンリン酸化及びリン酸化Ｓｔａｔ３を使用して、二重の影響が認められた（以下を参照のこと）。 Ｃ１０は、異なる組織におけるＬＰＳ誘導されたＭＣＰ−１、ＩＲＦ−１、及びＩＰ−１０の発現を阻害し、ＴＬＲ４が増加するＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路又はＭｙＤ８８非依存性シグナル伝達経路の両方の産物と見なされた。対照マウス又はＬＰＳ、ＬＰＳ＋Ｃ１０、ＬＰＳ＋ＤＭＳＯ（ビヒクル対照）で処置されたマウスの種々の器官由来のＲＮＡのノーザン分析（M. Saji, et al., J Clin Endocrinol Metab, 75:871-8 (1992)、D. S. Singer, et al.,の米国特許第５，５５６，７５４号(1996)、V. Montani, et al., Endocrinology, 139:290-302 (1998)）（全て表５由来）。リボゾームバンドを、サンプルのローディング及び完全性についての対照として示す。ノーザンブロットは、ＴＬＲ４によって活性化されるＮＦ−κＢ（ＭＣＰ−１）及びＩＲＦ−３／ＩＦＮ−β（ＩＰ−１０、ＩＲＦ−１）の両方のシグナル経路の由来の産物のＬＰＳ誘導性発現がＬＰＳによって有意に増加するが、Ｃ１０処置によって減少することを証明している。 Ｃ１０によって内毒素性ショックから保護されたマウスは、活性化Ｓｔａｔ１の組織レベルが減少した。ｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＳ誘導性ＩＦＮ−βシグナル伝達及びＬＰＳ誘導性のＩＲＦ−１の増加をＳｔａｔ１活性化に対するＣ１０処置の影響によって減少し得るか否かを判断するために、全組織溶解物におけるＳｔａｔ１のタンパク質リン酸化レベルを試験した。腎臓組織及び肺組織の両方は、ＬＰＳ＋対照溶媒（ＤＭＳＯ）で処置されたマウスにおいて検出可能なレベルの活性化Ｓｔａｔ１タンパク質を示し、対照（レーン１及び４）と比較してショックから保護されなかった（それぞれレーン２及び５）。これらのレベルは、Ｃ１０での処置によってＬＰＳ誘導性ショックから保護されたマウスにおいて基底まで減少した（それぞれレーン３及び６）。ホスホセリン活性化Ｓｔａｔ１を測定する抗体を使用して、類似の結果が得られた（すなわち、Ｃ１０は、代表的な遺伝子としてのＩＲＦ−１の全発現に必要な転写活性化及び二量体形成の両方を阻害した）。対照マウス及びＬＰＳ、ＬＰＳ＋Ｃ１０、又はＬＰＳ＋ＤＭＳＯ（溶媒対照）で処置されたマウスは全て表５に由来する。 内毒素性ショックによって誘導された炎症誘発性サイトカインは、Ｃ１０によって抑制される。炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、及びＩＦＮγは、ＬＰＳ−ＴＬＲ−４−ＭｙＤ８８依存性経路の活性化によって分泌されると報告されているが、ＭｙＤ８８非依存性シグナルも関与する。ＬＰＳ注射された脾臓、肝臓、肺、腎臓、及び心臓、並びにマウスにおける２４時間後のこれらの炎症誘発性サイトカイン遺伝子の発現は、ノーザン分析によって判断したところ、内毒素性ショックによって強く誘導され、Ｃ１０によって抑制された。これらの結果を、ＥＬＩＳＡ技法を使用した血中サイトカイン濃度の確定によって確認した（表６）。ほとんどのサイトカインレベルはＬＰＳマウスで増加し、ＬＰＳ＋ＤＭＳＯ処置マウスは、Ｃ１０で処置したマウスと比較して１０００倍も増加した。フェニルメチマゾール（Ｃ１０）は、これらのサイトカインを正常な対照マウスに近いレベルに正常化した。麻酔下で眼の内眼角から採血し、血清を取り出し、使用するまで−２０℃で保持した。R&D SystemのＥＬＩＳＡキットを使用し、結果を、ｐｇ／ｍｌ血清で示した。 Ｃ１０は、マウスにおけるＬＰＳ／毒素性ショック増加ＣＯＸ−２及びｉＮＯｓ発現を減少させるが、ＣＯＸ−１発現を減少させる。ＰＣＲによって分析したところ、ＬＰＳ及びＣ１０は、ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、及びｉＮＯＳの発現に逆の影響を及ぼす。表５中の実験由来のマウスのＬＰＳ注射は、正常レベルと比較して、２４時間後の心臓、腎臓、及び肝臓におけるＣＯＸ−１発現を減少させた。Ｃ１０処置は、これらの器官におけるＣＯＸ−１のこのＬＰＳ効果を減少させ、発現が正常レベルに戻った。脾臓においてＬＰＳ注射に起因するＣＯＸ−１発現の変動は認められなかった。ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳは、ＬＰＳ注射後の５つ全ての器官で過剰発現され、Ｃ１０処置により、過剰発現が正常レベルに戻った。 Ｃ１０は、マウス肺におけるＬＰＳ誘導性内毒素性ショックの病的炎症効果を改善する。肺のヘマトキシリン及びエオシン染色は、２０倍にて微小血管レベルで炎症の変化及び内毒素性ショックによって誘導された炎症性細胞の浸潤を示した。表５由来のＬＰＳ処置マウスは、時間関数で炎症細胞の増加を示した（同倍率でパネルＡと比較したパネルＢ及びＣ）。血管管腔中の炎症細胞が増加した（全パネルでＶによって示す）。これは、特に、血管壁に対する細胞の辺縁趨向又は粘性によって証明され、これらにより、炎症細胞の回転及び接着が示唆される（パネルＣの太い矢印）。パネルＢ及びＣでは、ＬＰＳ処置群において中隔の肥厚が増加し、これは炎症細胞の浸潤による（パネルＢ及びＣの小さな矢印対Ａの小さな矢印によって示す）。Ｃ１０（フェニルメチマゾール）で処置したマウスの肺における血管管腔中の炎症細胞数の減少が明らかであり（パネルＤのＶ）、炎症細胞の顕著な減少及び炎症の変化に起因する中隔の肥厚も減少した（パネルDの小さな矢印）。ＬＰＳ及びＬＰＳ＋Ｃ１０の組織切片を正常な肺（パネルＡ）と比較した場合、Ｃ１０処置によって炎症過程が有意に改善されることが明らかである。これら全てにより、Ｃ１０が炎症細胞の増加、辺縁趨向の増加、壁への粘性、管腔から中隔への漏出及び移動を遮断することが示唆される。したがって、Ｃ１０は、ＬＰＳ処置マウス肺に対する微小循環損傷及び炎症細胞の浸潤を改善する。肺炎症応答におけるＬＰＳ誘導性毒素性ショックの変化に対するＣ１０処置の同一の結果が４０倍で認められた。これらの実験は、マウス由来の組織を使用し、その生存曲線を表５に詳述する。肺及び組織の血管への炎症細胞の誘引は、血管細胞中の接着分子発現の増加に関連するはずである。肺における炎症の減少に加えて、対照（パネルＡ）として正常マウスを使用して、ＬＰＳ（パネルＢ及びＣ）又はＬＰＳ＋Ｃ１０（パネルＤ）で処置した異なるマウス群由来の肺組織と比較した場合に証明されるように、Ｃ１０は、肺内での接着分子ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１の発現を減少させた。接着分子の発現を、組織内の褐色の強度によって強調した。ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１分子の発現は明らかに増加し、血管内皮に局在した。Ｃ１０は、ＬＰＳ処置群と比較して明らかにＶＣＡＭ−１発現を減少させ、変化を正常レベルに戻した。これらのデータにより、Ｃ１０が、肺内皮細胞におけるＬＰＳ−ＴＬＲ−４経路の過剰発現によって誘導された白血球の浸潤、血管の変化、及び接着分子の増加を減少させる効果が確証される。Ｃ１０が炎症の変化及び接着分子の増加を減少させる能力は、肺に限定された。したがって、ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１は、ＬＰＳ処置群において（小葉中心性）静脈の内皮細胞及び肝洞様毛細血管を上方制御し、Ｃ１０がＩＣＡＭ−１／ＶＣＡＭ−１増加を抑制した。両方の発現は、Ｃ１０処置によって正常に戻った。これらのデータにより、Ｃ１０が肝臓及び肺の血管内皮細胞におけるＬＰＳ−ＴＬＲ−４経路の活性化によって誘導された接着分子の過剰発現を減少させる能力が確証される。両組織は、内毒素性ショックにおける臓器不全部位である。 Ｃ１０は、ＲＡＷマクロファージにおけるＬＰＳによって増加されたＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＰ−１０、及びＩＬ−６を減少させる。ＲＡＷマウスマクロファージを、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で異なる時間刺激し、ノーザン分析（Ａ）又はリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｂ）のためにＲＮＡを抽出した。（Ａ）では、ノーザン分析で、Ｃ１０又はビヒクル対照（ＤＭＳＯ）の存在下でのｍＲＮＡ発現プロファイルを比較した。ＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＩＰ−１０、及びＩＬ−６の場合、ＤＭＳＯ対照と比較して、Ｃ１０に曝露したＬＰＳ処置マクロファージの有意な減少が明らかであった。この影響は、ＴＮＦ−αではあまり顕著ではなく、異なるＴＬＲ４シグナル伝達活性化経路又はアッセイの非感受性（insensitivity）に寄与し得る。（Ｂ）では、リアルタイムＰＣＲを使用して、ｍＲＮＡレベルを、内因性対照（ＧＡＰＤＨ）への正規化及びＣ１０処置と非処置（ＤＭＳＯ対照）との比較によって定量した。ＬＰＳによって増加したＩＦＮ−β遺伝子発現は、１時間の時点でＣ１０によって強く減少し（１／８）、その後、全経時変化にわたってＣ１０によって低レベルに維持された。ＩＬ−６は３時間の時点で最大に減少し（１／１６）、ＩＬ−１βは１時間で最大に減少し（１／１１）、ＩＬ−１２ ｐ４０は４．５時間までに検出できなかったが、６時間で強く減少した（１／１６）。ＴＮＦ−αの減少は３時間で明らかであったが（１／４）、１時間又は６時間で減少は認められなかった。まとめると、これらのデータは、Ｃ１０はＲＡＷマクロファージにおける広範な炎症誘発性サイトカインのＬＰＳ依存性産生を有効に減少させること、並びに、結果は図１０及び表４に示すｉｎ ｖｉｖｏ実験における結果をおおよそ再現することを示す。 Ｃ１０は、ＲＡＷマクロファージにおけるＬＰＳによって増加したｉＮＯＳｍＲＮＡ及びＳｔａｔ１活性化を減少させる。（Ａ）では、ＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｃ１０、対照ＤＭＳＯ、又は別のビヒクル（ビヒクルＢ）の存在下にてＬＰＳで３時間処置した。ＤＭＳＯ対照（レーン４）又はビヒクルＢのみ（レーン５）でのＬＰＳ処置では、ＬＰＳのみ（レーン３）と比較した場合、ｉＮＯＳの減少はほとんど検出されないか又は全く検出されなかった。対照的に、Ｃ１０で処置した細胞は、ＬＰＳ誘導性ｉＮＯＳｍＲＮＡの強い減少を示した（レーン６及び７対レーン４及び５）。Ｃ１０は、化合物を溶解するために使用したビヒクルと無関係に、強い阻害効果を有していた。シクロヘキサミド処置を行い、ｉＮＯＳｍＲＮＡのＬＰＳ誘導のために新規のタンパク質合成が必要であることを確認し、したがって、インターフェロンシグナル伝達はｉＮＯＳの増加を担うがＴＬＲ４シグナル伝達は直接担わないことを確認した。これは、Ｃ１０がＩＦＮ−βｍＲＮＡのＬＰＳ誘導性増加を減少させる能力と一致する（図１２）。Ｓｔａｔ１のリン酸化は、マウスマクロファージにおけるｉＮＯＳ及びＩＰ−１０の発現を誘導するための核へのＩＦＮ−βシグナルの形質導入のための重要な構成要素である（Y. Ohmori, et al., J Leukoc Biol, 69:598-604 (2001)）。（Ｂ）では、Ｃ１０は、細胞質画分及び核画分の両方においてＬＰＳ誘導性Ｓｔａｔ１リン酸化レベルを減少させることができた（レーン５及び９）。ＤＭＳＯ対照のみでは明らかな影響は認められなかった（レーン４及び８）。シクロヘキサミド対照（レーン１０）は、ＬＰＳ誘導性Ｓｔａｔ１リン酸化には新規のタンパク質合成（恐らく、ＩＦＮ−β）が必要であることを示す（V. Toshchakov, et al., J Endotoxin Res, 9:169-75 (2003)）。異なる機構にもかかわらずＣ１０がシクロヘキサミドと同様の影響を及ぼすので（レーン９対１０）、Ｃ１０もＩＦＮ−β合成の阻害剤として作用することができる。Ｃ１０は、Ｓｔａｔ１活性化を開始するために利用可能なＩＦＮ−βのＬＰＳ誘導性オートクリン／パラクリン増加の減少によってＩＦＮ−βシグナル経路を介したシグナル変換を減少させることができるようである。 Ｃ１０は、ＲＡＷマクロファージにおけるＬＰＳによって増加したＩＲＦ−１ ＲＮＡレベル及びＩＳＲＥ要素へのＩＲＦ−１ ＤＮＡ結合を下方制御する。（Ａ）マクロファージをＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で１、２、又は３時間処置した場合にノーザン分析によって測定したＬＰＳによって増加したＩＲＦ−１ｍＲＮＡレベル。Ｃ１０は、２時間及び３時間後にＩＲＦ−１ ｍＲＮＡを強く減少させた。メチマゾール（ＭＭＩ）は有意に顕著な影響を及ぼさなかったが、ＩＲＦ−１ ｍＲＮＡレベルを減少させる。ＩＲＦ−１が遺伝子転写を増強するために、ＩＲＦ−１は標的細胞上に存在するシスＤＮＡ要素に結合しなければならない。ＭｘＩＳＲＥ（ＩＲＦ−１結合部位）及びＥＭＳＡを使用して（Ｂ）、ＭｘＩＳＲＥ要素へのＬＰＳ誘導性ＩＲＦ−１結合に対するＣ１０の影響を測定した。非処置細胞由来の抽出物と比較した場合、２時間のＬＰＳ刺激（１μｇ／ｍＬ）の際に２つの複合体が誘導された（レーン２、５、８対レーン１）。Ｃ１０（レーン３及び４）及びメチマゾール（ＭＭＩ）処置（レーン６及び７）の両方を使用して、濃度依存性減少が認められた。非標識ＭｘＩＳＲＥプローブとの抽出物のインキュベーションの際に特異性が認められた（自己、レーン９）。核抽出物をＩＲＦ−１（レーン１１）又はＩＲＦ−３（レーン１２）のいずれかに指向する抗体とインキュベートするスーパーシフト研究を使用して複合体を同定した。ＩＲＦ−１抗体とインキュベートした場合、複合体がＩＲＦ−１含有複合体として同定されるスーパーシフトが認められた（レーン１１）。２つの異なるＩＲＦ−３抗体を使用して、スーパーシフトは認められなかった（レーン１２の抗体番号１；抗体番号２についてはデータを示さず）。興味深いことに、抽出物をヒトＩＦＮ−βＩＲＦ−１結合部位に対する非標識プローブとプレインキュベートした場合、ＭｘＩＳＲＥプローブへのＩＲＦ−１の結合も消失した（レーン１０）。このことは、これらの抽出物中のＬＰＳ誘導性ＩＲＦ−１もヒトＩＦＮ−β ＩＲＦ−１／ＩＳＲＥ結合要素に結合するであろうことを示す。 Ｃ１０は、高脂肪食を与えたＡｐｏＥ−／−マウスにおける血管炎症を軽減する。Ｃ１０（１ｍｇ／ｋｇ）を、１日おきに８週間マウスに経口投与した。対照マウスに、ＤＭＳＯのみを投与した。８週目にマウスを屠殺し、異なる組織においてヘマトキシリン及びエオシン染色によって決定する組織病理を試験した。Ｃ１０処置マウス（パネルＡ）及び非処置マウス（パネルＢ）の大動脈基部の切片並びにＣ１０処置マウス（パネルＣ）及び非処置マウス（パネルＤ）における冠状動脈脈管構造の切片を示す。パネルＡ対Ｂの大動脈基部での病変範囲の減少及び血管の開通性及びパネルＣ対Ｄにおける冠状動脈の開通性対閉塞によって両方において有意な改善が明らかである。パネルＢでは、矢印は、大動脈基部の病変の重症度がＣ１０処置マウス（パネルＡ）と比較して非処置マウスで顕著に高いことを示す。同様に、パネルＤでは、写真は非処置マウスにおける泡沫細胞を含む病変でほぼ完全に閉塞された冠状動脈の長切片を代表するのに対して、Ｃ１０処置マウス（パネルＣに示す）では、冠状動脈はあまり閉塞しなかった。要するに、ここに例示されるように、Ｃ１０は、複数の切片において疾患範囲を明らかに減少させた。Ｃ１０処置マウス及び非処置マウスと比較した場合、心筋中の血管においてさらにより劇的な影響が示された。第１に、病変が明らかな場合でさえ、血管の管腔は開存したままであった。さらに、心筋内の血管は、Ｃ１０の非存在下で泡沫細胞を含む病変によって閉塞したが、Ｃ１０で処置したマウスにおいては開存しており泡沫細胞を含む病変はほぼ存在しなかった。非処置マウス由来の冠状動脈切片を、抗ＴＬＲ４、抗ＶＣＡＭ−１、抗ＩＣＡＭ−１で免疫染色した。ＶＣＡＭ−１は、病変中で過剰発現したが、病変領域の反対側の内皮層でも過剰発現した。ＴＬＲ４は、病変の反対側の領域でより多く発現し、驚いたことに、特にプラークと反対側の血管周囲の平滑筋層の至るところに発現した。ＴＬＲ４は、心筋の筋肉組織にも発現した。発現により、広範な炎症応答が示唆され、この炎症応答は、マクロファージ浸潤領域又は他の細胞（すなわち、心筋鞘（myocardical sheath）周辺の間質細胞）中にＴＬＲ４陽性細胞が豊富である。これらのデータは、以下に説明するヒト疾患において類似していた。表１５で認められるように、Ｃ１０は、両方の発現を減少させた。データは、複数の動物から採取した複数のスライドの代表である。 ヒト組織におけるアテローム硬化性病変は、過剰発現したＴＬＲ４及びＶＣＡＭ−１と関連する。外科的に取り出したプラーク由来の冠状動脈切片を、パラフィルム包埋ブロック由来の連続スライスにおいて抗ＴＬＲ４（右下のパネル）、抗ＶＣＡＭ−１（右上のパネル）、抗ＩＣＡＭ−１（左下のパネル）で免疫染色した。Ｈ＆Ｅ染色（左上のパネル）は、泡沫細胞を含む閉塞血管（筋肉壁及び心筋組織に取り囲まれた脂質保有「プラーク」）を示す。ＶＣＡＭ−１（暗色）が病変中に過剰発現されが、病変領域の反対側の内皮層にも過剰発現した。ＴＬＲ４（暗色）は、病変の反対側の領域でより多く発現し、驚いたことに、特にプラークと反対側の血管周囲の平滑筋層の至るところに発現した。ＴＬＲ４は、心筋の筋肉組織にも発現した。発現により、広範な炎症応答が示唆され、この炎症応答は、マクロファージ浸潤領域又は他の細胞中にＴＬＲ４陽性細胞が豊富である。あらゆる点で、これらのデータは、ＡｐｏＥ−／−マウスのデータと重複し、したがって、Ｃ１０療法に感受性を示すＡｐｏＥ−／−マウス（表１５）における病変に類似するはずである。 Ｃ１０は、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）におけるＳｔａｔ１のリン酸化及びＩＲＦ−１の活性化のＩＦＮ−β誘導を減少させる。Ｃ１０はまた、ＨＡＥＣ並びにラット甲状腺細胞及びＲＡＷ細胞におけるＳｔａｔ１セリンリン酸化を減少させる。（Ａ）では、ＩＲＦ−１タンパク質のＩＦＮ−β誘導は、Ｃ１０によって強く減少したが、ＤＭＳＯビヒクル対照ではそうではなかった（Ｄとして示す）。Ｓｔａｔ１の活性化形態（Ｙ７０１でリン酸化）のために剥離及び再探索した同一のブロットは、ＩＦＮ−β誘導性Ｓｔａｔ１リン酸化の減少を示した。したがって、Ｃ１０がＩＲＦ−１遺伝子発現のＴＬＲ３／４によって増加したＩＦＮ−β依存性誘導を減少させる能力は、活性化Ｓｔａｔ１の減少に起因し得る。ＨＡＥＣを、Ｃ１０（１ｍＭ）又はＤＭＳＯ（Ｄ）キャリア対照の非存在下又は存在下で２時間処置した。対照として非感染／非処置サンプルを含んでいた（左端のレーン）。２５ｍｇの全細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いで、ニトロセルロース膜にブロットした。（Ｂ）では、ホスホセリン特異的Ｓｔａｔ１抗体を使用したウェスタンブロットによって、ラット甲状腺細胞、ＨＡＥＣ細胞、及びＲＡＷ細胞において残基７２７でのＳｔａｔ１セリンリン酸化に対するＣ１０の影響も認められた。ラット甲状腺細胞（ＦＲＴＬ−５）を、感染させないか（レーン２）、又はインフルエンザＡ型ウイルスで２４時間感染させ（レーン２）、次いで、ＤＭＳＯ（１％）（レーン３）又は１ｍＭ Ｃ１０（レーン４）のいずれかで処置した。ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）を、ＤＭＳＯ（１％）（レーン５）又は１ｍＭ Ｃ１０（レーン６）の存在下で１００Ｕ／ｍＬのｈＩＦＮ−βと２時間インキュベートした。マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を、５００ｎｇ／ｍｌの濃度の大腸菌ＬＰＳと、単独（レーン７）、ＤＭＳＯ（０．５％）の存在下（レーン８）、又は０．５ｍＭ Ｃ１０（レーン９）と３時間インキュベートした。パネルＡの場合、２５μｇの各全細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜にブロットし、次いで、表示の抗体で探索した。ローディングを、剥離及び非リン酸化Ｓｔａｔ１に指向する抗体での再探索によって調節した。Ｃ１０は、細胞型（非免疫細胞（甲状腺細胞、ＨＡＥＣ細胞）又はマクロファージ）又は刺激（ＩＦＮ−β、インフルエンザＡ型、又はＬＰＳ）と無関係にＳｔａｔ１セリンリン酸化を阻害する。Ｓｔａｔ３リン酸化は、同様に阻害された。

Claims (166)

1. 治療を必要とする被験体におけるＴＬＲ媒介性疾患又は障害を治療する方法であって、治療上有効な量の１つ又は複数のメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を該被験体へ投与することを含む、治療する方法。
2. 前記メチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体は、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＴＬＲ媒介性疾患は、非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞から成る群から選択される細胞を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＴＬＲ媒介性疾患は、ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害である、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は、ＴＬＲ−３又はＴＬＲ−４に関与する、請求項４に記載の方法。
6. 前記ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は、免疫細胞の浸潤及び非免疫細胞の破壊に関連するＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害である、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は、病的先天性免疫応答に関与するＴＬＲ媒介性疾患又は障害である、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は、異常な細胞増殖、移植拒絶、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、過剰増殖性疾患、又は心血管疾患に起因する病的状態である、請求項７に記載の方法。
9. 前記ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は、心血管疾患である、請求項８に記載の方法。
10. 前記心血管疾患又は障害は、再狭窄、冠状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、アテローム発生、脳血管疾患又は事象（events）、冠状動脈事象（coronary events）、狭心症、虚血性疾患、鬱血性心不全、急性心筋梗塞に関連する肺水腫、血栓症、高血圧症における高血圧又は血圧の上昇、血小板凝集、血小板接着、平滑筋細胞増殖、医療機器の使用に関連する血管又は非血管の合併症、医療機器の使用に関連する創傷、血管壁又は非血管壁の損傷、経皮経管的冠状動脈造影法後の末梢血管疾患又は新生内膜過形成である、請求項９に記載の方法。
11. 前記心血管疾患又は障害は、脳血管疾患又は事象である、請求項９に記載の方法。
12. 前記脳血管疾患又は事象は、脳硬塞若しくは卒中（血管の閉塞（blockage）又は出血に起因する）、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、失神、又は頭蓋内及び／若しくは頭蓋外動脈のアテローム性動脈硬化症等である、請求項１１に記載の方法。
13. 心血管疾患又は障害は、心筋梗塞、心筋血管再生手術、狭心症、心血管死、又は急性冠状動脈症候群（coronary syndrome）である、請求項９に記載の方法。
14. 前記ＴＬＲ媒介性疾患又は障害は、敗血症性ショック、敗血症、内毒素性ショック、血行動態性ショック（hemodynamic shock）、敗血症症候群、虚血後再灌流障害、マラリア、マイコバクテリア感染、髄膜炎、乾癬、鬱血性心不全、線維性疾患、悪液質、移植片拒絶、癌、自己免疫疾患、ＡＩＤＳにおける日和見感染、関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、骨関節炎、他の関節炎状態、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ハンセン病におけるＥＮＬ、放射線損傷、喘息、及び高酸素性肺胞損傷（hyperoxic alveolar injury）から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
15. 被験体におけるアテローム性動脈硬化症の１つ又は複数の症状を改善する方法であって、アテローム性動脈硬化症の１つ又は複数の症状の改善に十分な量で、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択されるメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を該被験体へ投与することを含む、改善する方法。
16. 前記アテローム硬化性疾患は、炎症性及び免疫学的性質を有する、請求項１４に記載の方法。
17. 炎症性及び免疫学的性質は、先天性免疫応答の発現に関連する、請求項１６に記載の方法。
18. 被験体における心筋疾患の１つ又は複数の症状を改善する方法であって、心筋疾患の１つ又は複数の症状の改善に十分な量で、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択されるメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を該被験体へ投与することを含む、改善する方法。
19. 前記心筋疾患は、炎症性及び免疫学的性質を有する、請求項１８に記載の方法。
20. 前記炎症性及び免疫学的性質は、先天性免疫応答の発現に関連する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記心筋疾患は、冠状動脈性心疾患、可逆性又は非可逆性心筋虚血／再潅流傷害、急性又は慢性心不全、及び再狭窄である、請求項２０に記載の方法。
22. 被験体における炎症に対する急性期反応に関連する冠状動脈合併症を緩和又は防止する方法であって、該冠状動脈合併症はアテローム性動脈硬化症の症状であり、該方法は、冠状動脈合併症の緩和又は防止に十分な量で、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択されるメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を、急性期反応を有するか急性期反応のリスクのある被験体へ投与することを含む、緩和又は防止する方法。
23. 前記方法は、急性期反応を緩和又は防止することを含む、請求項１９に記載の方法。
24. 前記急性期反応は、再発性炎症性疾患に関連する炎症応答である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記急性期反応は、再発性炎症性疾患及び先天性免疫応答に関連する炎症応答である、請求項２３に記載の方法。
26. 前記急性期反応は、ハンセン病、結核、全身性エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛、結節性多発性動脈炎、強皮症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、ＡＩＤＳ、冠状動脈石灰化、石灰沈着性大動脈狭窄、骨粗鬆症、及び関節リウマチから成る群から選択される疾患に関連する、請求項２３に記載の方法。
27. 前記急性期反応は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、臓器移植、創傷、埋め込み式人工器官、寄生虫感染、敗血症、内毒素性ショック症候群、及びバイオフィルム形成から成る群から選択される状態に関連する炎症応答である、請求項２３に記載の方法。
28. 改善を必要とする被験体における免疫細胞の浸潤及び非免疫細胞の破壊に関連するＴＬＲ３又はＴＬＲ４媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害の１つ又は複数の症状を改善する方法であって、免疫細胞の浸潤及び非免疫細胞の破壊に関連するＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害の１つ又は複数の症状の改善に十分な量で、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択されるメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を該被験体へ投与することを含む、改善する方法。
29. 前記ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は、（ａ）内毒素血症、（ｂ）敗血、（ｃ）毒素ショック症候群、及び（ｄ）感染症から成る群から選択される急性炎症性疾患である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は、ＴＬＲ−４媒介性である、請求項２９に記載の方法。
31. 前記ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は、全ての型、病因、若しくは発症の敗血症性ショック、腎不全、急性腎不全、悪液質、マラリア性悪液質、下垂体悪液質、尿毒症性悪液質、心臓性悪液質、悪液質性副腎機能亢進（cachexia suprarenalis）若しくはアジソン病、癌性悪液質、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染の結果としての悪液質から成る群から選択される成員である敗血症性ショックから選択される、請求項２９に記載の方法。
32. 前記ＴＬＲ媒介性自己免疫／炎症性疾患又は障害は内毒素性ショックである、請求項２９に記載の方法。
33. 前記内毒素性ショックは、グラム陰性細菌によって誘導される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記内毒素性ショックは、グラム陽性細菌によって誘導される、請求項３２に記載の方法。
35. 前記敗血症性ショックはＬＰＳ誘導性ショックである、請求項３２に記載の方法。
36. 前記方法は、抗生物質を前記被験体へ投与することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
37. 治療を必要とする被験体における瘢痕組織の軽減又は創傷収縮の阻害のために異常な細胞増殖、移植拒絶、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、過剰増殖性疾患、若しくは血管疾患に起因するか又はこれらにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４媒介性病的状態を治療する方法であって、治療上有効な量の互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択されるメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体をこのような治療を必要とする被験体へ投与することを含む、治療する方法。
38. 前記異常な細胞増殖に起因する病的状態は、癌、カポジ肉腫、肝内胆管癌、絨毛癌、新生芽細胞腫（neoblastoma）、ウィルムス腫瘍、ホジキン病、黒色腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、又は急性若しくは慢性顆粒球性リンパ腫である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、過剰増殖性疾患、又は血管疾患は、関節リウマチ、再狭窄、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、真性糖尿病、ブドウ膜炎、腎炎症候群、多発性硬化症、炎症性皮膚疾患、炎症性肺疾患、炎症性腸疾患、身体通路（body passageway）の閉塞に影響を及ぼすか又は閉塞の原因となる炎症性疾患、眼、鼻、又は喉の炎症、真菌感染、及び食物関連アレルギーから成る群から選択される、請求項３７に記載の方法。
40. 改善を必要とする被験体におけるアレルゲンに起因するＴＬＲ３媒介性病的状態の１つ又は複数の症状を改善する方法であって、アレルゲンに起因する１つ又は複数の症状の改善に十分な量で、メチマゾール誘導体及び／又は互変異性環状チオンを被験体に投与することを含む、改善する方法。
41. 改善を必要とする被験体におけるアレルゲンに起因するＴＬＲ３媒介性病的状態の１つ又は複数の症状を改善する方法であって、アレルギーに起因する１つ又は複数の症状の改善に十分な量で、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択されるメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を被験体へ投与することを含む、改善する方法。
42. 前記ＴＬＲ媒介性疾患は、喘息、慢性気管支狭窄、急性気管支狭窄、気管支炎、小気道閉塞、気腫、閉塞性気道疾患、炎症性気道疾患、急性肺損傷、又は気管支拡張症から成る群から選択される１つ又は複数の状態に起因するＴＬＲ３又はＴＬＲ４媒介性疾患、障害、又は状態である、請求項２に記載の方法。
43. 前記喘息は、アトピー性喘息、非アトピー性喘息、アレルギー喘息、アトピー性気管支ＩｇＥ媒介性喘息、気管支喘息、体質性喘息、真性喘息（true asthma）、病態生理学的障害に起因する内因性喘息、環境因子に起因する外因性喘息、未知又は明らかでない原因の体質性喘息（essential asthma）、気管支炎性喘息、気腫性喘息、運動誘発性喘息、アレルゲン誘導性喘息、冷気誘導性喘息、職業性喘息、細菌、真菌、原生動物、又はウイルスの感染に起因する感染性喘息、非アレルギー喘息、初期喘息、呼吸困難乳児症候群（wheezy infant syndrome）、及び細気管支炎（bronchiolytis）である、請求項４２に記載の方法。
44. 前記ＴＬＲ媒介性疾患は、閉塞性気道疾患又は炎症性気道疾患に起因するＴＬＲ３媒介性病的状態である、請求項２に記載の方法。
45. 前記閉塞性気道疾患又は炎症性気道疾患は、慢性好酸球性肺炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎を含むＣＯＰＤ、ＣＯＰＤに関連するか又は関連しない肺気腫若しくは呼吸困難、不可逆性進行性気道閉塞によって特徴付けられるＣＯＰＤ、成人呼吸急迫症候群（ＡＲＤＳ）、他の薬物療法の結果としての気道過反応の増悪、又は肺高血圧症に関連する気道疾患から成る群から選択される、請求項４４に記載の方法。
46. 前記閉塞性気道疾患又は炎症性気道疾患は、気管支炎である、請求項４５に記載の方法。
47. 気管支炎は、慢性気管支炎、急性気管支炎、急性咽頭気管気管支炎、アラキン酸気管支炎、カタル性気管支炎、クループ性気管支炎、乾性気管支炎、感染性喘息性気管支炎、湿性気管支炎（productive bronchitis）、ブドウ球菌性気管支炎、連鎖球菌性気管支炎、又は肺胞性気管支炎である、請求項４６に記載の方法。
48. 気管支拡張症は、円柱状気管支拡張症、小嚢気管支拡張症、紡錘状気管支拡張症（fusiform bronchiectasis）、毛管状気管支拡張症（capillary bronchiectasis）、嚢状気管支拡張症、乾性気管支拡張症、又は濾胞状気管支拡張症（follicular bronchiectasis）である、請求項４２に記載の方法。
49. トール様受容体３又は４に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患は、炎症に関連する症状を改善するか又は既存の炎症を減少させるために治療することができる状態を誘導する他の炎症に起因する、請求項３７に記載の方法。
50. 前記関連する他の炎症又は刺激は、昆虫刺傷又は虫刺され、特定の植物型との接触、照射、非感染性結膜炎、痔核、擦過傷、指の巻き爪又は足の巻き爪（肉芽形成）、皮膚移植片のドナー部位、膣炎、乾癬、単純ヘルペス、肛門／下腿（cruri）の掻痒、化学的炎症から成る群から選択される、請求項５４に記載の方法。
51. トール様受容体３又は４の過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患は、炎症に関連する症状を改善するか又は既存の炎症を減少させるために治療することができる状態を誘導する他の炎症に起因し、該炎症は、細胞又は組織に対して外来性に誘導された損傷の結果である、請求項３７に記載の方法。
52. 前記他の炎症又は刺激は、前記被験体の皮膚又は粘膜に対する化学的及び／又は物理的影響である、請求項５１に記載の方法。
53. 前記関連する他の炎症又は刺激は、皮膚又は身体に作用する微生物によって誘導される、請求項５１に記載の方法。
54. 前記改善することができる炎症応答は、被験体の皮膚又は粘膜上で起こり、萌出した親知らず周囲の炎症、抜歯後、歯周膿瘍、粘膜上の人工器官誘導性褥創、真菌感染、抜歯後に生じる可能性のある疼痛状態である乾燥性歯槽炎（alveolitis sicca dolorosa）の露呈骨表面の治療、慢性及び急性の炎症性疾患、膵炎、関節リウマチ、骨関節炎、喘息、炎症性腸疾患、乾癬、並びにアルツハイマー病等の一定の神経障害から成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
55. 前記関連する他の炎症又は刺激は、日光又は風への曝露、外傷又は創傷、切傷、熱傷、又は擦過傷、アルカリセッケン、界面活性剤、脂質溶媒、油、防腐剤等の化学物質への曝露、及び疾患から成る群から選択される環境因子によって誘導される、請求項５３に記載の方法。
56. 改善を必要とする被験体における病原体又は病原体分子のシグナルに起因するＴＬＲ３又はＴＬＲ４関連疾患の１つ又は複数の症状を改善する方法であって、ＮＦ−κＢシグナル経路ではなくＩＲＦ−３シグナル経路の増加の阻害による病原体又は病原体分子のシグナルに起因する１つ又は複数の症状の改善に十分な量で、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択されるメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を該被験体へ投与することを含む、改善する方法。
57. 前記病原体関連作用物質又は生成物は、ウイルス、細菌、ｄｓＲＮＡ、１型ＩＦＮ、又は環境誘導事象である、請求項５６に記載の方法。
58. 前記細菌の例は、クラミジア（Chlamidia）又は腸内細菌であるが、これらに限定されない、請求項５７に記載の方法。
59. 前記細菌は、グラム陰性細菌である、請求項５７に記載の方法。
60. 前記ウイルスは、ＲＮＡウイルス、エンテロウイルス、クラミジア、又はコクサッキーウイルスである、請求項５７に記載の方法。
61. 前記ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項５７に記載の方法。
62. 前記ウイルスは、インフルエンザＡ型である、請求項５７に記載の方法。
63. 前記ＴＬＲ３又はＴＬＲ４関連疾患は、１型インターフェロン遺伝子発現を増加させる病原体又は病原体分子のシグナルに関与する、請求項５６に記載の方法。
64. 前記病原体関連作用物質又は生成物は、ウイルス、細菌、ｄｓＲＮＡ、１型ＩＦＮ、又は環境誘導事象である、請求項６３に記載の方法。
65. 前記細菌は、グラム陰性細菌である、請求項６３に記載の方法。
66. 前記ウイルスは、ＲＮＡウイルス、エンテロウイルス、又はコクサッキーウイルスである、請求項６３に記載の方法。
67. 前記ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項６３に記載の方法。
68. 前記ウイルスは、インフルエンザＡ型である、請求項６３に記載の方法。
69. 前記ＴＬＲ３又はＴＬＲ４関連疾患は、ＳＴＡＴ−Ｉ活性化を増加させる病原体又は病原体分子のシグナルに関与する、請求項５６に記載の方法。
70. 前記病原体関連作用物質又は生成物は、ウイルス、細菌、ｄｓＲＮＡ、１型ＩＦＮ、又は環境誘導事象である、請求項６９に記載の方法。
71. 前記細菌は、グラム陰性細菌である、請求項７０に記載の方法。
72. 前記ウイルスは、ＲＮＡウイルス、エンテロウイルス、又はコクサッキーウイルスである、請求項７０に記載の方法。
73. 前記ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項７０に記載の方法。
74. 前記ウイルスは、インフルエンザＡ型である、請求項７０に記載の方法。
75. ＴＬＲ３又はＴＬＲ４関連疾患は、インターフェロン感受性応答要素（ＩＳＲＥ）活性化を増加させる病原体又は病原体分子のシグナルに関与する、請求項５６に記載の方法。
76. 前記病原体関連作用物質又は生成物は、ウイルス、細菌、ｄｓＲＮＡ、１型ＩＦＮ、又は環境誘導事象である、請求項７５に記載の方法。
77. 前記細菌は、グラム陰性細菌である、請求項７６に記載の方法。
78. 前記ウイルスは、ＲＮＡウイルス、エンテロウイルス、又はコクサッキーウイルスである、請求項７６に記載の方法。
79. 前記ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項７６に記載の方法。
80. 前記ウイルスは、インフルエンザＡ型である、請求項７６に記載の方法。
81. ＴＬＲ３又はＴＬＲ４関連疾患は、インターフェロン感受性応答要素の活性化の増加に関与する、請求項５６に記載の方法。
82. 前記病原体関連作用物質又は生成物は、リポポリサッカリド、１型ＩＦＮ、環境誘導事象、又は高脂血症である、請求項８１に記載の方法。
83. 前記病原体は、細菌である、請求項８２に記載の方法。
84. 前記細菌は、グラム陰性細菌である、請求項８３に記載の方法。
85. 前記病原体は、ウイルスである、請求項８２に記載の方法。
86. 前記ウイルスは、エンテロウイルスである、請求項８５に記載の方法。
87. 治療必要とする被験体におけるＴＬＲ媒介性疾患又は障害を治療する方法であって、罹患した（前記疾患を患った）被験体における細胞内サイトカイン又は細胞外サイトカインの内因性量を減少させる互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択される治療上有効な量の１つ又は複数のメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を該被験体へ投与することを含む、治療する方法。
88. 前記サイトカインはＴＮＦαである、請求項８７に記載の方法。
89. 前記ＴＬＲ媒介性疾患は、移植片対宿主疾患、急性呼吸急迫症候群、肉芽腫性疾患、移植拒絶、悪液質、寄生虫感染、真菌感染、外傷、及び細菌感染から成る群から選択される、請求項８７に記載の方法。
90. 前記ＴＬＲ媒介性障害は、トール様受容体３又は４過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患である、請求項８７に記載の方法。
91. 前記ＴＬＲ媒介性障害は、非免疫細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞から選択される細胞中のトール様受容体３過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患である、請求項８７に記載の方法。
92. 前記ＴＬＲ媒介性障害は、ＩＲＦ−３の活性化又はＩＲＦ−３の病的シグナル伝達に関与するＴＬＲ３媒介性炎症性疾患である、請求項８７に記載の方法。
93. 前記ＴＬＲ媒介性障害は、１型インターフェロンによる過剰発現又は病的シグナル伝達に関与するＴＬＲ３媒介性炎症性疾患である、請求項８７に記載の方法。
94. 前記ＴＬＲ媒介性障害は、ＩＳＲＥ含有遺伝子の過剰発現又は病的シグナル伝達に関与するＴＬＲ３媒介性炎症性疾患である、請求項８７に記載の方法。
95. 前記ＴＬＲ媒介性障害は、ＳＴＡＴ１の活性化又はＳＴＡＴ１による病的シグナル伝達に関与するＴＬＲ３媒介性炎症性疾患である、請求項８７に記載の方法。
96. 前記ＴＬＲ媒介性障害は、異常な細胞増殖、移植拒絶、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、過剰増殖性疾患、又は心血管疾患に起因する病的状態に関与するＴＬＲ３媒介性炎症性疾患である、請求項８７に記載の方法。
97. 前記ＴＬＲ媒介性障害は橋本甲状腺炎である、請求項８７に記載の方法。
98. 前記ＴＬＲ媒介性障害は炎症性肺疾患である、請求項８７に記載の方法。
99. 前記ＴＬＲ媒介性障害は１型糖尿病である、請求項８７に記載の方法。
100. 前記ＴＬＲ媒介性障害はインスリン依存性糖尿病である、請求項８７に記載の方法。
101. 前記ＴＬＲ媒介性障害はＴＬＲ媒介性自己免疫疾患である、請求項８７に記載の方法。
102. 前記ＴＬＲ媒介性自己免疫疾患は、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック−スプルー皮膚炎（Celiac Sprue−Dermatitis）、慢性疲労免疫機能障害症候群(ＣＦＩＤＳ)、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼瘡（Discoid Lupus）、本態性混合型寒冷グロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、グレーブス病、ギラン−バレー、橋本甲状腺炎、分娩後甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、２型糖尿病、１型糖尿病又は２型糖尿病の合併症、若年性関節炎、扁平苔癬、全身性狼瘡、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群（Stiffinan Syndrome）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症、又は重症筋無力症である、請求項８７に記載の方法。
103. 被験体におけるＴＬＲ３によって媒介される疾患、障害、状態、又は症状を治療する方法であって、ＴＬＲ３によって媒介される疾患、障害、状態、又は症状の防止、阻害、又は抑制に有効な量で、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択されるメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を含む薬学的組成物を該被験体へ投与することを含み、前記疾患又は障害は、以下：移植片対宿主疾患、急性呼吸急迫症候群、肉芽腫性疾患、移植拒絶、悪液質、寄生虫感染、真菌感染、外傷、及び細菌感染のうち１つ又は複数のものである、治療する方法。
104. 本発明の化合物は、グルココルチコイド、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、β−２アドレナリン受容体アゴニスト、ムスカリン性Ｍ１及びＭ３アンタゴニスト、ムスカリン性Ｍ２アゴニスト、ＮＫ３アンタゴニスト、ＬＴＢ４アンタゴニスト、システイニルロイコトリエンアンタゴニスト、気管支拡張薬、ＰＤＥ４阻害剤、ＰＤＥ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、ＭＭＰ阻害剤、ホスホリパーゼＡ２阻害剤、ホスホリパーゼＤ阻害剤、ヒスタミンＨ１アンタゴニスト、ヒスタミンＨ３アンタゴニスト、ドーパミンアゴニスト、アデノシンＡ２アゴニスト、ＮＫ１及びＮＫ２アンタゴニスト、ＧＡＢＡ−ｂアゴニスト、ノシセプチンアゴニスト、去痰薬、粘液溶解剤、うっ血除去薬、抗酸化薬、抗ＩＬ−８抗体、抗ＩＬ−５抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＴＮＦ抗体、ＩＬ−１０、接着分子阻害剤及び成長ホルモンから成る群から選択される１つ又は複数の薬物、作用物質若しくは治療薬と併用して投与される、請求項２に記載の方法。
105. 本発明の化合物は、１つ又は複数の治療用ステロイドと併用して投与される、請求項３に記載の方法。
106. 前記１つ又は複数の治療用ステロイドは、コルチコイド、グルココルチコイド、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン及びベタメタゾンから成る群から選択される、請求項１０５に記載の方法。
107. 前記トール様受容体３誘導性疾患は、代謝関連障害及び体重関連障害から成る群から選択される１つ又は複数の疾患又は病態である、請求項３に記載の方法。
108. 前記ＴＬＲ媒介性疾患は、トール様受容体３誘導性炎症性疾患及び関連病態である、請求項１０７に記載の方法。
109. 前記トール様受容体３誘導性炎症性疾患は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、不適合耐糖能、インスリン抵抗性、高血糖、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、異常脂質血症、及びＸ症候群から成る群から選択される、請求項１０７に記載の方法。
110. 前記トール様受容体３誘導性疾患は、１つ又は複数の血管疾患である、請求項１０７に記載の方法。
111. 前記トール様受容体３誘導性疾患は、アテローム性動脈硬化症、移植片アテローム性動脈硬化症、静脈移植片アテローム性動脈硬化症、ステント再狭窄、及び血管形成術再狭窄から成る群から選択される１つ又は複数の疾患又は病態である、請求項１１０に記載の方法。
112. 本発明の化合物は、ステロイド、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤＳ、抗生物質、免疫抑制剤、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、ＬＴＢ_４アンタゴニスト及びＬＴＡ_４ヒドロラーゼ阻害剤及び抗細胞接着分子から成る群から選択される１つ又は複数の化合物と併用して投与される、請求項１１１に記載の方法。
113. 前記方法は、炎症状態を発症する危険性のある被験体を予防的に治療するのに使用される、請求項２に記載の方法。
114. 前記薬学的組成物は、プロドラッグ形態である、請求項２に記載の方法。
115. 前記薬学的組成物は、約０．０１％〜約２５％の前記活性化合物及び約７５％〜約９９．９９％の前記薬学的に許容可能なキャリアを含む、請求項２に記載の方法。
116. 本明細書中に記載の疾患、障害、状態、又はその合併症を予防又は治療する方法であって、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択される治療上有効な量又は用量の１つ又は複数のメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を少なくとも１つのさらなる活性因子と組み合わせてこのような予防又は治療を必要とする個体へ投与することを含む、予防又は治療する方法。
117. 前記さらなる活性因子は、スルホニル尿素、メグリチニド、ビグアニド、α−グルコシダーゼ阻害剤、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γアゴニスト、インスリン、インスリン類似体、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、コレステロール降下剤、抗血小板薬、抗アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、及びアジポネクチンから成る群から選択される１つ又は複数の作用因子である、請求項１１６に記載の方法。
118. 前記さらなる活性因子（複数可）は、脂質調整化合物又は脂質調整薬である、請求項１１６に記載の方法。
119. 前記さらなる活性因子は、１つ又は複数のＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、スクアレンシンテターゼ阻害剤（スクアレンシンターゼ阻害剤としても既知）、アシル−補酵素Ａ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤；ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、プロブコール、ナイアシン、胆汁酸金属イオン封鎖剤、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体インデューサー、血小板凝集阻害剤（例えば、糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａフィブリノゲン受容体アンタゴニスト及びアスピリン）、ヒトペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲＯ）アゴニスト、ＰＰＡＲアゴニスト、ＰＰＡＲα／γデュアルアゴニスト、ビタミンＢ６（ピリドキシンとしても既知）及びその薬学的に許容可能な塩（塩酸塩等）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミンとしても既知）、葉酸又はその薬学的に許容可能な塩又はエステル（ナトリウム塩及びメチルグルカミン塩等）、抗酸化ビタミン（ビタミンＣ及びＥ並びにβカロテン等）、β遮断薬、アンギオテンシンＩＩアンタゴニスト（ロサルタン等）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（エナラプリル及びカプトプリル等）、カルシウムチャネル遮断薬（ニフェジピン及びジルチアゼム等）、内皮アンタゴニスト、ＡＢＣＡ１遺伝子発現を増強する作用因子、ＦＸＲリガンド（阻害剤及びアゴニストの両方が含まれる）、ビスホスホネート化合物（アレンドロン酸ナトリウム等）、及びシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤（ロフェコキシブ及びセレコキシブ等）を含む、請求項１１６に記載の方法。
120. 前記さらなる活性因子は、１つ又は複数の抗糖尿病薬、血糖降下薬（hypoglycemic active ingredients）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲα／γアゴニスト、フィブリン酸塩、ＭＴＰ阻害剤、胆汁酸吸収阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤、高分子胆汁酸吸着剤、ＬＤＬ受容体インデューサー、ＡＣＡＴ阻害剤、抗酸化剤、リポタンパク質リパーゼ阻害剤、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ阻害剤、スクアレンシンテターゼ阻害剤、リポタンパク質（ａ）アンタゴニスト、リパーゼ阻害剤、インスリン、スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド、チアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害剤、β細胞のＡＴＰ依存性カリウムチャネルに作用する有効成分、ＣＡＲＴアゴニスト、ＮＰＹアゴニスト、ＭＣ４アゴニスト、オレキシンアゴニスト、カンナビノイド１受容体アンタゴニスト、Ｈ３アゴニスト、ＴＮＦアゴニスト、ＣＲＦアゴニスト、ＣＲＦ ＢＰアンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β−３アゴニスト、ＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）アゴニスト、ＣＣＫアゴニスト、セロトニン再摂取阻害剤、混合セロトニン作動性及びノルアドレナリン作動性化合物（mixed sertoninergic and noradrenergic compounds）、５ＨＴアゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、ＴＲＨアゴニスト、脱共役タンパク質２又は３モジュレーター、レプチンアゴニスト、ＤＡアゴニスト（ブロモクリプチン、ドプレキシン）、リパーゼ／アミラーゼ阻害剤、ＰＰＡＲモジュレーター、カンナビノイド１受容体アンタゴニスト、ＲＸＲモジュレーター、ＴＲ−βアゴニスト、又はアンフェタミンを含む、請求項１１６に記載の方法。
121. 前記さらなる活性因子（複数可）はスタチンである、請求項１１６に記載の方法。
122. 前記スタチンは、ロバスタチン、シンバスタチン、ジヒドロキシオープンアシッド型（dihydroxy open-acid）シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、及びピタバスタチンから成る群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
123. 炎症性疾患又は自己免疫疾患を診断、早期診断、鑑別診断、重症度評価、及び治療に伴うモニタリング及び予後診断する方法であって、疾患が存在するか又は疾患にＴＬＲ３及び／又はＴＬＲ４の活性化又は発現が疑われる被験体の生体液サンプル又は細胞サンプルを試験することを含み、前記ＴＬＲ３及び／又はＴＬＲ４の活性化又は発現は、疾患の存在、予想される原因、重症度、及び／又は治療法の意図する基準の成功を示す、方法。
124. 前記炎症性疾患又は自己免疫疾患は、全ての型、病因、若しくは発症の敗血症性ショック、又は、腎不全、急性腎不全、悪液質、マラリア性悪液質、下垂体悪液質、尿毒症性悪液質、心臓性悪液質、悪液質性副腎機能亢進若しくはアジソン病、癌性悪液質、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染の結果としての悪液質に関連する敗血症性ショックから選択される、請求項１２３に記載の方法。
125. 前記炎症性疾患又は自己免疫疾患は、１型糖尿病、大腸炎、自己免疫性甲状腺炎、アテローム性動脈硬化症、及び糖尿病の血管合併症から成る群から選択される、請求項１２３に記載の方法。
126. 甲状腺細胞におけるＴＬＲ３発現レベルを、橋本甲状腺炎の診断方法として測定する、請求項１２３に記載の方法。
127. 膵島細胞におけるＴＬＲ３の発現レベルを、膵島炎（insulinitis）又は１型糖尿病を診断する方法として測定する、請求項１２３に記載の方法。
128. 単球、血管内皮細胞、又は腸上皮細胞におけるＴＬＲ４の発現レベルを、自己免疫疾患又は炎症性疾患を診断する方法として測定する、請求項１２３に記載の方法。
129. 前記疾患は、血管疾患又は大腸炎である、請求項１２３に記載の方法。
130. 被験体におけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４媒介性関連疾患を診断する方法であって、（ａ）該被験体から得た非免疫組織細胞の試験サンプル及び（ｂ）同一の細胞型の既知の正常な非免疫組織細胞の対照サンプルにおけるＴＬＲ３の発現レベルを検出することを含み、該対照サンプルと比較した該試験サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現レベルの高低が、該試験組織細胞を得た被験体におけるＴＬＲ３関連疾患の存在を示す、診断する方法。
131. 被験体における非免疫細胞におけるトール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を診断する方法であって、（ａ）該被験体から得た非免疫細胞の試験サンプルにおける及び（ｂ）同一の細胞型の既知の正常な非免疫細胞の対照サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現レベルを検出することを含み、該対照サンプルと比較した該試験サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現レベルの高低が、該試験組織細胞を得た被験体におけるトール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患の存在を示す、診断する方法。
132. ＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現を阻害する化合物を同定する方法であって、ＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現又は活性を正常に示す細胞を、候補化合物との接触の同時、前、又は後に前記発現又は活性のエンハンサー（例えば、ＬＰＳ、Ｉ型ＩＦＮ、ｄｓＲＮＡトランスフェクション、ウイルス、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）と接触させること、及び該試験化合物に対する細胞による応答性又は応答性不足を決定することを含む、同定する方法。
133. 非免疫細胞におけるトール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現を阻害する化合物を同定する方法であって、該ＴＬＲ３又はＴＬＲ４を過剰発現する非免疫細胞を候補化合物と接触させること、及び該ＴＬＲ３又はＴＬＲ４の活性又は発現を決定することを含む、同定する方法。
134. 被験体におけるトール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を防止、改善、安定化、又は治療する可能性について試験化合物をスクリーニングする方法であって、該被験体におけるトール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患しているか或いは発症リスクのある被験体からの非免疫細胞サンプルを試験化合物に最初に接触させる工程、ｂ）該被験体からの第２の非免疫細胞サンプルを既知の標準化合物と接触させる工程であって、該第１の非免疫細胞サンプル及び第２の非免疫細胞サンプルを同一様式で該試験化合物に接触させる、接触させる工程、及びｃ）該第１の非免疫細胞サンプル及び第２の非免疫細胞サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現又は活性を測定する工程であって、該第１の非免疫細胞サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現又は活性が該第２の非免疫細胞サンプルと比較して減少する場合、前記化合物は潜在性（potential）を有すると判断される、測定する工程を含む、スクリーニングする方法。
135. 被験体におけるトール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を防止、改善、安定化、又は治療する可能性について試験化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）被験体におけるトール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現又はシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患しているか或いは発症リスクのある第１の被験体からの非免疫細胞サンプルを試験化合物に最初に接触させる工程、ｂ）該トール様受容体３又はＴＬＲ４の過剰発現又はシグナル伝達に関連する自己免疫疾患又は炎症性疾患を罹患していないか或いは発症する傾向のない第２の被験体からの第２の非免疫細胞サンプルを試験化合物と接触させる工程であって、該第１の非免疫細胞サンプル及び第２の非免疫細胞サンプルを同一様式で該試験化合物に接触させる、接触させる工程、及びｃ）該第１の非免疫細胞サンプル及び第２の非免疫細胞サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現又は活性を測定する工程であって、該第１の非免疫細胞サンプルにおけるＴＬＲ３又はＴＬＲ４の発現又は活性が該第２の非免疫細胞サンプルと比較して減少する場合、該化合物は可能性を有すると判断される、測定する工程を含む、スクリーニングする方法。
136. 薬学的組み合わせであって、互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性メチマゾール誘導体、非互変異性環状チオン誘導体、及びその組み合わせから成る群から選択されるメチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体、抗肥満薬、食欲抑制薬、抗糖尿病薬、抗高脂血症薬、脂質低下薬、コレステロール低下薬（hypocholesterolemic agents）、脂質調整薬、コレステロール低下薬（cholestelol-lowering agents）、脂質低下薬、抗高血圧薬、睡眠障害の治療のために使用される薬剤、薬物乱用及び常習性障害の治療のために使用される薬剤、抗不安薬、抗うつ薬、抗精神病薬、認識増強薬、認識障害の治療のために使用される薬剤、アルツハイマー病の治療のために使用される薬剤、パーキンソン病の治療のために使用される薬剤、抗炎症薬、神経変性の治療のために使用される薬剤、動脈硬化症の治療のために使用される薬剤、呼吸状態の治療のために使用される薬剤、腸障害の治療のために使用される薬剤、強心配糖体、及び抗腫瘍薬から成る群から選択される少なくとも１つのさらなる治療薬、並びに少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリア又は希釈剤を含む薬学的組み合わせ。
137. 前記抗肥満薬は、メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）アゴニスト、メラニン凝集ホルモン受容体（ＭＣＨＲ）アンタゴニスト、成長ホルモン分泌促進薬受容体（ＧＨＳＲ）アンタゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、ＣＣＫアゴニスト、ＧＬＰ−Ｉアゴニスト及び他のプレプログルカゴン由来ペプチド、ＮＰＹ１又はＮＰＹ５アンタゴニスト、ＮＰＹ２及びＮＰＹ４モジュレーター、副腎皮質刺激ホルモン放出因子アゴニスト、ヒスタミン受容体−３（Ｈ３）モジュレーター、ａＰ２阻害剤、ＰＰＡＲγモジュレーター、ＰＰＡＲδモジュレーター、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）阻害剤、アディポネクチン受容体モジュレーター、β３アドレナリン作動性アゴニスト、（ＡＪ９６７７、Ｌ７５０３５５、及びＣＰ３３１６４８又は他の既知のβ３アゴニストが含まれる）、甲状腺受容体βモジュレーター、リパーゼ阻害剤（オーリスタット（orlistat）及びＡＴＬ−９６２が含まれる）、セロトニン受容体アゴニスト（ＢＶＴ−９３３が含まれる）、モノアミン再取り込み阻害剤又は放出薬（フェンフルラミン、デクスフェンフルラミン、フルボキサミン、フルオキセチン、パロキセチン、セルトラリン、クロルフェンテルミン、クロフォレックス、クロルテルミン、ピシロレクス、シブトラミン、デキサンフェタミン、フェンテルミン、フェニルプロパノールアミン、及びマジンドールが含まれる）、食欲抑制薬、（トピラメートが含まれる）、毛様体神経栄養因子（アクソカインが含まれる）、脳由来神経栄養因子、レプチン、並びに他のカンナビノイド−１受容体アンタゴニスト（ＳＲ−１４１７１６及びＳＬＶ−３１９が含まれる）から選択される、請求項１３６に記載の薬学的組み合わせ。
138. 前記抗糖尿病薬は、インスリン分泌促進薬、インスリン感作物質、抗高血糖薬、ビグアニド、スルホニル尿素、グルコシダーゼ阻害剤、アルドース還元酵素阻害剤、ＰＰＡＲγアゴニスト（チアゾリジンジオンが含まれる）、ＰＰＡＲ−αアゴニスト（フィブリン酸誘導体が含まれる）、ＰＰＡＲ−δアンタゴニスト又はアゴニスト、ＰＰＡＲα／γデュアルアゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、メグリチニド、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−１アゴニスト、及びタンパク質チロシンホスファターゼ−ＩＢ阻害剤から選択される、請求項１３６に記載の薬学的組み合わせ。
139. 前記抗炎症薬は、プレドニゾン、デキサメタゾン、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（ＮＳＡＩＤ、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、ナプロキセン、セレブレックス、及びバイオックスから選択されるＣＯＸ−Ｉ及びＣＯＸ−２阻害剤が含まれる）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇアゴニスト及びアンタゴニスト、ＣＤ４０リガンドアンタゴニスト、ＩＭＰＤＨ阻害剤（ミコフェノレートが含まれる）、インテグリンアンタゴニスト、α−４β−７インテグリンアンタゴニスト、細胞接着阻害剤、インターフェロンγアンタゴニスト、ＩＣＡＭ−Ｉ、インフリキシマブ、ＯＲ１３８４、ＴＮＦ−α阻害剤（テニダップが含まれる）、抗ＴＮＦ抗体、又は可溶性ＴＮＦ受容体（エタネルセプトが含まれる）から選択される腫瘍壊死因子アンタゴニスト、シロリムス及びラパミューンから選択されるラパマイシン、エフルノミド（efmnomide）、プロスタグランジン合成阻害剤、ブデソニド、クロファジミン、ＣＮＩ−１４９３、ＣＤ４アンタゴニスト（プリリキシマブが含まれる）、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、ＩＫＫ阻害剤、ゼルノーム及びマキシ−Ｋオープナー（Maxi-K opener）から選択される過敏性腸症候群治療薬から選択される、請求項１３６に記載の薬学的組み合わせ。
140. 前記薬学的組成物は、安全且つ有効な量の互変異性メチマゾール誘導体：
     

     

     （式中、Ｙは、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、−ＮＯ_２及び下記フェニル部分：
     

     

     から成る群から選択され、ここで前記活性化合物中のわずか１つのＹ基が、フェニル部分であってもよく、Ｒ^１は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから成る群から選択され、Ｒ^２は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、及びフェニル部分から成る群から選択され、Ｒ^３は、Ｈであり、Ｒ^４は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから成る群から選択され、Ｚは、−ＳＲ^３及び−ＯＲ^３から選択され、ここでＹがフェニル部分でない場合、前記化合物はＣ_１〜Ｃ_４アルキルである）、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、請求項２、１５、１８、２２、２８、３７、５６、８７、１０３、１１６、又は１３６のいずれか一項に記載の方法。
141. 前記薬学的組成物は、安全且つ有効な量の非互変異性メチマゾール誘導体：
     

     

     （式中、Ｙは、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、−ＮＯ_２及び下記フェニル部分：
     

     

     から成る群から選択され、ここで前記活性化合物中のわずか１つのＹ基が、フェニル部分であってもよく、Ｒ^１は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから成る群から選択され、Ｒ^２は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、及びフェニル部分から成る群から選択され、Ｒ^３は、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、及び−ＣＨ_２Ｐｈから成る群から選択され、Ｒ^４は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから成る群から選択され、Ｚは、−ＳＲ^３、Ｓ（Ｏ）Ｒ^３、−ＯＲ^３、及びＣ_１〜Ｃ_４アルキルから選択され、ここでＹがフェニル部分でない場合、化合物中のＲ^２基及びＲ^３基の少なくとも２つはＣ_１〜Ｃ_４アルキルであり、Ｚがアルキルである場合、少なくとも１つのＹは−ＮＯ_２である）、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、請求項２、１５、１８、２２、２８、３７、５６、８７、１０３、１１６、又は１３６のいずれか一項に記載の方法。
142. 前記薬学的組成物は、安全且つ有効な量の非互変異性環状チオン誘導体：
     

     

     （式中、Ｙは、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、−ＮＯ_２及び下記フェニル部分：
     

     

     から成る群から選択され、ここで前記活性化合物中のわずか１つのＹ基が、フェニル部分であってもよく、Ｒ^１は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから成る群から選択され、Ｒ^２は、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、及びフェニル部分から成る群から選択され、Ｒ^４は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから成る群から選択され、ＸはＳである）、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、請求項２、１５、１８、２２、２８、３７、５６、８７、１０３、１１６、又は１３６のいずれか一項に記載の方法。
143. ＺはＳＲ^３であり、ＹはＨである、請求項１４０又は１４１に記載の方法。
144. Ｒ^３はＣ_１〜Ｃ_４アルキルである、請求項１４３に記載の方法。
145. Ｒ^３はメチルである、請求項１４４に記載の方法。
146. 少なくとも１つのＲ^２基はメチルである、請求項１４５に記載の方法。
147. Ｒ^２基の両方はメチルである、請求項１４２に記載の方法。
148. 前記活性化合物は、式：
     

     

     を有する、請求項１４１に記載の方法。
149. 前記活性化合物は、式：
     

     

     を有する、請求項１４１に記載の方法。
150. 前記活性化合物は、式：
     

     

     を有する、請求項１４２に記載の方法。
151. 前記活性化合物は、式：
     

     

     を有する、請求項１４２に記載の方法。
152. 前記活性化合物は、式：
     

     

     を有する、請求項１４１に記載の方法。
153. ＺはＳＲ^３であり、Ｙ基のうちの１つはフェニル部分である、請求項１４０又は１４１に記載の方法。
154. Ｒ^１及びＲ^４はＨである、請求項１５３に記載の方法。
155. ＺはＳＲ^３であり、Ｒ^３はメチルであり、Ｙ基のうちの１つはフェニル部分であり、ここで、Ｒ^１及びＲ^４はＨであり、Ｒ^２基はメチルである、請求項１４１に記載の方法。
156. ＺはＳＲ^３であり、Ｒ^３はＨであり、Ｙ基のうちの１つはフェニル部分であり、ここで、Ｒ^１及びＲ^４はＨであり、Ｒ^２基はメチルである、請求項１４０に記載の方法。
157. Ｙ基のうちの１つはフェニル部分であり、ここで、Ｒ^１及びＲ^４はＨであり、Ｒ^２基の両方はメチルである、請求項１４２に記載の方法。
158. 前記活性化合物は、式：
     

     

     である、請求項１４０に記載の方法。
159. 前記活性化合物は、式：
     

     

     である、請求項１４１に記載の方法。
160. 前記活性化合物は、式：
     

     

     である、請求項１４２に記載の方法。
161. 前記薬学的組成物は、プロドラッグ形態である、請求項１４０、１４１、又は１４２のいずれか一項に記載の方法。
162. 前記薬学的組成物は、約０．０１％〜約２５％の前記活性化合物及び約７５％〜約９９．９９％の前記薬学的に許容可能なキャリアを含む、請求項１４０、１４１、又は１４２のいずれか一項に記載の方法。
163. 前記薬学的組成物は、下記式：
     

     

     を有する安全且つ有効な量の活性化合物を含む、請求項１４２に記載の方法。
164. 前記薬学的組成物は、安全且つ有効な量の下記：
     

     

     （式中、Ｙは、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、−ＮＯ_２及び下記フェニル部分：
     

     

     から成る群から選択され、Ｒ^１は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４置換アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４エステル、及びＣ_１〜Ｃ_４置換エステルから成る群から選択され、Ｒ^２は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから成る群から選択され、Ｒ^４は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、及びＣ_１〜Ｃ_４置換アルキルから成る群から選択され、ＸはＳであり、ここでＹがフェニル部分でない場合、前記化合物中のＲ^２基はＣ_１〜Ｃ_４アルキルである）、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、請求項２、１５、１８、２２、２８、３７、５６、８７、１０３、１１６、又は１３６のいずれか一項に記載の方法。
165. 前記活性化合物は、以下の式：
     

     

     （式中、Ｒ^９は、−ＯＨ、−Ｍ、及び−ＯＯＣＣＨ_２Ｍから成る群から選択され、ここで、Ｍは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択される）から成る群から選択される、請求項２、１５、１８、２２、２８、３７、５６、８７、１０３、１１６、又は１３６のいずれか一項に記載の方法。
166. 前記活性化合物は、以下の式：
     

     

     （式中、Ｒ^１０は、Ｈ、−ＮＯ_２、Ｐｈ、４−ＨＯＰｈ、及び４−ＭＰｈから成る群から選択され、ここで、Ｍは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩから選択される）から成る群から選択される、請求項２、１５、１８、２２、２８、３７、５６、８７、１０３、１１６、又は１３６のいずれか一項に記載の方法。

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