JP2008540341A - 活性物質での細胞表面の装飾 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、2005年4月29日にファイルされた米国仮特許出願第60/676,049号の利益を主張するものであり、その開示の全体は本明細書に参照により組み込まれる。
政府の権益
ここに開示される主題は、国立衛生研究所により承認番号第1 R41 HL079855-01の下で認められた米国政府の援助により行われた。よって、米国政府は本主題において所定の権利を有する。
ここに開示される主題は、全般的に、活性物質で細胞を装飾する方法に関し、より具体的には、親和性により活性物質に結合する官能化脂質(functionalized lipid)を配合した融合性脂質小胞(fusogenic lipid vesicles)を用いて細胞を装飾する方法に関する。
ACI = オーガストとコペンハーゲン−アイリッシュ(ラット交雑株)
APC = 抗原提示細胞
CABG = 大動脈冠動脈バイパス移植
CPB = 心肺バイパス
CR1 = 補体受容体1
CTLA4 = 細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4
DAF = 崩壊促進因子
DGF = 臓器移植後臓器機能障害(delayed graph function)
DOPC = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DOPC-e = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン
DOPE = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン
DOPS = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン]
DODAP = 1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン
DOTAP = 1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン
EDTA = エチレンジアミン四酢酸
EJV = 外頚静脈
FBS = ウシ胎児血清
FUV = 融合性一枚膜小胞(fusogenic unilamellar vesicle)
GVHD = 移植片対宿主疾患
HBSS = ハンクス液
HUVEC = ヒト臍帯静脈内皮細胞
ICAM = 細胞間接着分子
IRI = 虚血再潅流障害
LCR = リガーゼ連鎖反応
LPS = リポ多糖
MAC = 膜侵襲複合体
MLR = 混合リンパ球反応
PBS = リン酸緩衝生理食塩水
PCR = ポリメラーゼ連鎖反応
PDPC = 1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3- ホスホコリン
PEG = ポリエチレングリコール
POPA = 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート
SA = ストレプトアビジン
SPICE = 補体酵素の天然痘阻害剤(smallpox inhibitor of complement enzyme)
SUV = 小さい一枚膜小胞
SA-VCP = ストレプトアビジン - VCP融合タンパク質
SVG = 伏在静脈移植片
TNF = 腫瘍壊死因子
tPA = 組織プラスミノゲン活性化因子
UW = ウィスコンシン大学液
VCP = ワクシニアウイルス補体調節タンパク質
WF = ウィスター−フュルト(Wistar-Furth) (ラット)
持続性の虚血及び再潅流障害(IRI)を受けた組織は、その他の毒の中でも酸素及び窒素のラジカルを産生し、炎症、動脈及び静脈における血栓形成活性の増加、並びに同種移植片の急性拒絶の割合の増加に導く内皮の損傷をもたらす。
第2経路は、リポ多糖(LPS)と、自発的に発生するある程度のC3bとの存在により活性化される。この経路において、C3bは因子Bに結合して複合体を形成し、これは因子Dにより切断されて第2のC3コンバターゼであるC3b(H2O)Bbを形成する。プロパージンは、増幅活性化因子として作用し、この複合体を安定化して、切断産物C3bがこれに結合することを可能にして、第2のC5コンバターゼ(C3b3bBb)を形成する。
よって、全ての経路は、C3を用い、C5を切断し、このことは強力な炎症誘発性切断産物であるC5a及びC5b-9 (膜侵襲複合体、MAC)をもたらす。補体活性化のこれらの2つの産物は、C5-欠損動物において確認されたように、IRIにおいて第一次の役割を演じると考えられており(Mollnes, T. E.ら, 2002, Trends Immunol., 23:61〜64)、これらはIRIのモデルにおいて遠隔及び局所の損傷を減少させた。
この要約は、今回開示される主題のいくつかの実施形態を列挙し、多くの場合、これらの実施形態の変形及び置換を列挙する。この要約は、多数の種々の実施形態の単なる例示である。与えられる実施形態の1つ又は複数の代表的な特徴について述べることも、同様に例示である。このような実施形態は、典型的に、言及される特徴を有するか又は有さずに存在できる。同様に、これらの特徴は、この要約に列挙されるか否かに関わらず、今回開示される主題のその他の実施形態に適用できる。過剰な繰り返しを避けるために、この要約は、このような特徴の全ての可能な組み合わせについて列挙又は示唆しない。
ある実施形態において、該官能化脂質は、リン脂質、例えばホスホエタノールアミン、又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む。
ある実施形態において、テザー部分は、ビオチン、ニッケル、チオール、マレイミド、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される。
ある実施形態において、活性物質のリガンド部は、アビジン、ストレプトアビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される。
ある実施形態において、活性物質は、ポリペプチド、アプタマー、又は小分子である。
さらに、ある実施形態において、治療用分子は、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される。
ある実施形態において、脂質小胞は、少なくとも約20小胞融合(vesicle fusions)/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である。
ある実施形態において、脂質小胞は、約1:1〜約500:1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する。
ある実施形態において、不安定小胞形成メンバーは、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である。
ある実施形態において、該キットは、活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞と、リガンド部を含む活性物質とを含む。
ある実施形態において、該キットは、内皮細胞を装飾するための指示書を含む。
ある実施形態において、該脂質小胞は第1容器に収容され、治療用分子は第2容器に収容される。
ある実施形態において、該方法は、活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂肪小胞を細胞と接触させ、ここで該テザー部分は、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択され;及び該細胞を、テザー部分に結合するリガンド部を含む活性物質と接触させることを含む。
ある実施形態において、該細胞は内皮細胞である。
ある実施形態において、該内皮細胞は、組織又は器官の内皮細胞である。
ある実施形態において、該組織又は器官は、脂質小胞を含む第1組成物及び活性物質を含む第2組成物で潅流される(perfused)。
ある実施形態において、テザー部分は、活性物質のリガンド部に非共有結合型で結合する。
ある実施形態において、細胞膜は、複数の異なる活性物質で装飾される。
ある実施形態において、該方法は、組織又は器官を、脂質小胞を含む第1組成物と接触させ、ここで該脂質小胞は、治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み、該テザー部分は、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択され;及び該組織又は器官を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第2組成物と接触させることを含む。
ある実施形態において、該組織又は器官は、対象への移植の前に第1及び第2組成物と接触させる。
ある実施形態において、テザー部分は、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する。
ある実施形態において、該方法は、組織又は器官を、脂質小胞を含む第1組成物と接触させ、ここで該脂質小胞は、補体阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質から選択される治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み;及び該組織又は器官を、テザー部分と結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第2組成物と接触させることを含む。
ある実施形態において、テザー部分は治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する。
本明細書に開示される主題の1つ又は複数の実施形態の詳細は、以下に続く説明に記載される。本明細書に開示される主題のその他の特徴、目的及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになる。本明細書に記載される全ての出版物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。争いの場合は、定義を含む本明細書が支配する。
以下の用語は、当業者によってよく理解されると考えられるが、以下の定義は、本明細書で開示される主題の説明を促進するために記載される。
そうでないと定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本明細書で開示される主題が属する技術における当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に開示されるものに類似又は均等ないずれの方法、装置及び材料は、本明細書で開示される主題の実施又は試験において用いることができ、代表的な方法、装置及び材料をここに記載する。
「アリール」は、好ましくは3〜10個の炭素原子の、いずれの一価の芳香族炭素環式又は複素芳香族の基のことである。アリール基は、二環式(すなわちフェニル(又はPh))又は多環式(すなわちナフチル)であり得、非置換又は置換であり得る。好ましいアリール基は、フェニル、ナフチル、フリル、チエニル、ピリジル、インドリル、キノリル又はイソキノリルを含む。
「官能化脂質」は、その天然の構造に加えて、分子の修飾又は付加を有する脂質である。付加は、共有結合型又は非共有結合型(例えばキレートによる)で付加できる。このような修飾は、小分子(例えばビオチン又はFITC)、多糖類、ヘパリン及び元素(例えばニッケル)の付加を含む。
本明細書で開示される主題のある実施形態において、興味のある活性物質(例えば治療用分子)を標的細胞の細胞膜、及びある実施形態においては標的細胞の細胞膜外表面に結合させるテザー部分の送達に用いることができる脂質小胞が提供される。テザー部分は、標的細胞膜にいったん組み込まれると、標的された送達及びテザー部分がそれに対して結合親和性を有する活性物質での細胞の「装飾」を提供する。さらに、細胞上の装飾の密度は、小胞の形成におけるテザー部分の濃度を変更するか、溶液中の小胞の数を変更するか、及び/又は溶液中の小胞の密度を変更することにより制御できる。
X-L-(Z)2 (I)
X-L-(Z)2 (I)
ここで、XはH、Aであるか、又は式(II)の構造を有し:
Aは、H又はアルキル基であり;
Lは、2つの水素原子をさらに失ったアルキル基であり(合計で3つの空いている連結点を与えるために)、ある実施形態において、Lは、アルコキシ又はアミノ置換されたアルキルであり;
各Zは独立して、H、E又は式(XI)の構造であり:
Lは、式(VIII)、(IX)又は(X)からなる群より選択される構造を有し:
(1) 静電的相互作用の増大;
(2) 膜二重層の不安定化;
(3) 非二重層の相の増大;及び
(4) 異なる脂質の相の作製。
本明細書で開示される主題は、細胞、例えば細胞の細胞膜の外表面を、活性物質、例えばポリペプチド、アプタマー及び小分子を含む治療用分子で装飾する方法を提供する。細胞は、組織又は器官の細胞(例えば内皮細胞)であり得る。本明細書で開示される主題は、さらに、開示される方法に従って治療用分子で装飾された細胞を含む。
免疫寛容は、進行中の外因性免疫抑制の不在下で(例えば、その他の抗原に対する免疫応答は維持したまま)、特定の外来抗原に対する病原性の免疫応答が存在しないこととして定義できる。本明細書に記載される方法は、例えば移植された細胞、組織又は器官により産生される外来抗原に対する受容者対象の免疫応答を、安全かつ効果的にダウンレギュレーションする。さらに、本明細書に開示される方法は、IRIの原因である免疫系の成分、また、移植に関連する重要な懸念及び組織虚血をもたらすその他の手順の阻害を提供する。
本明細書で開示される主題の方法及び組成物は、例えば白血球浸潤及び活性化並びに補体の活性化を含む免疫応答の抑制により、自己移植片、異種移植片及び同種移植片における移植拒絶を予防するために用いることができる。
本明細書で開示される主題は、さらに、対象における虚血-再潅流障害を予防、阻害又は治療する方法を提供する。IRIにおいて観察される免疫応答の初期段階、例えば補体活性化を阻害できる治療用分子、及び血栓形成を阻害又は血栓を溶解できる治療用分子は、細胞上を装飾して、IRIを防止、阻害又は治療することができる。ある実施形態において、該方法は、組織又は器官を、治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞を含む第1組成物と接触させ、該組織又は器官を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第2組成物と接触させることを含む。
本明細書で開示される主題は、さらに、内皮細胞を装飾するためのキットを提供する。ある実施形態において、キットは、活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む本明細書に開示される脂質小胞と、リガンド部を含む活性物質とを含む。ある実施形態において、脂質小胞は第1容器に収納され、活性物質は第2容器に収納される。該容器は、希釈剤、バッファー及び防腐剤を含むその他の成分をさらに含み得る。
キットは、例えば移植に用いられる組織及び器官の内皮細胞を装飾するために用いることができるか、又は対象に直接投与される活性物質として用いることができる。
以下の実施例は、説明のための実施形態を提供する。本開示及び当業者の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の実施例が説明のみを意図し、多数の変更、改変及び変化は、本願で請求する主題の範囲を越えずに用いることができることを認識する。
ビオチン融合性脂質小胞の製造。 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-オレオール-sn-グリセロール-3-ホスフェート(POPA)、及び/又はN-ビオチノイル-1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン (BDGP)を、クロロホルム中で一緒に混合する。クロロホルムを、窒素ガスに曝露することにより脂質材料から除去する。脂質フィルムは、12時間真空吸引して、微量のクロロホルムを除去する。脂質材料は、バッファー溶液(乳酸加リンゲル又は改変クレブス・ヘンゼライト)中で、25 mg/mlの濃度まで含水させる。バッファー及び脂質は、1分間ボルテックスして、多重膜小胞を作り、37℃の浴中に5分間おき、6回繰り返す。多重膜小胞は、氷浴中におき、パルス超音波処理(40%デューティサイクル)を5分間用いる。得られた小さい融合性の一枚膜小胞(FUV)は、軽く遠心分離して、超音波処理器のプローブからの微量のチタンを除去する。FUVサイズは、それらをエクストルーダを通して押し出すことにより均一にする。FUVを調製した後に、サンプルを採取して、FUVの流体力学半径の平均を、Proterion DYNAPROTM LSD粒子サイズアナライザ(Proterion Corp., Piscataway, New Jersey, U.S.A.)を用いて測定して、小胞のサイズを確認する。
受容者手術。 受容者の首を剃毛した後に、右の前外側首の切開を行う。移植された心臓を緩く収容するためのポケットを作るために、皮膚を皮下組織から分離する。頚静脈をその入ってくる枝から単離し、総頚動脈を、鎖骨下動脈から可能な限り遠くで離れて結紮する。移植した心臓の右の上大静脈と受容者の頚静脈、及び提供者の大動脈と受容者の総頚動脈との吻合は、10/0ナイロンを用いて行う。強力なクランプを全て除去し、鼓動している移植片がうっ血していないことを確認して、切開部を、連続抱合の一層を用いて閉じる。
受容者外科手術。 ヌードラット受容者にイソフロラン(isoflourane) 2〜5%で麻酔をかけ、首領域の腹側の面を剃毛する。右の外頚動脈(ECA)及び外頚静脈(EJV)を露出させ、ECAを、頚部交感神経叢から注意して分離し、近位にてクランプし、切断する。EJVは遠位にてクランプし、切断する。次いで、弁を4つの支持縫合糸で首の領域におき、血管吻合術を、大腿動脈とECAとの間、及び大腿静脈とEJVとの間で行う。皮膚を6-0ナイロンを用いて閉じる。
融合性脂質小胞
ここに記載されるFUVは、リン脂質1,2 ジオレオイル-sn-グリセロール- 3-ホスホコリン(DOPC)、l-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロール-3-ホスフェート(POPA)、及びジオレオイルエチルホスファチジルコリン(DOPC-E)を含む。FUVの細胞へのインビトロでの融合速度(FUVの種類当たりn=6)を決定した。DOPC単独、DOPC/DOPC-E又はDOPC/POPAを含む小さい一枚膜小胞を、1 mMカルボキシフルオレセイン含有溶液中で作製した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、カルボキシフルオレセインを装填した小胞とインキュベートし、時間に対する送達速度を定量した。結果は、カルボキシフルオレセインの細胞への送達の動態が、脂質小胞の組成に高く依存することを証明した。DOPC小胞は、対数送達速度を示し、最初の30分間はほとんど又は全く融合が観察されなかった。この種類の送達速度は、融合よりもエンドサイトーシスにより特徴的である。対照的に、DOPC/DOPC-Eは、初期の速度はより速いが、より遅い最終速度を示した。送達の最高速度は、DOPC/POPA FUVを用いて見出され、これは、カルボキシフルオレセインの著しい送達が5分以内に観察される指数送達速度を示した。この種類の送達速度は、エンドサイトーシスよりも融合に特徴的である。3種全ての小胞は、細胞の拡散蛍光染色を60分以内に達成することができた。DOPC/POPA混合物は、2分未満で完全拡散染色を達成した。
インビトロで潅流したときに内皮細胞膜に取り込まれる融合性小胞からの脂質
1 BDGP/ 5 DOPCリン脂質の比でDOPC/POPAとビオチン化脂質(N-ビオチノイル-1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(BDGP); Molecular Probes, Eugene Oregon, U.S.A.)とからなる融合性小胞を調製した。HUVEC細胞培養物を融合性小胞と60分間インキュベートし、培養物を3回洗浄し、次いで培養物を1 mlの蛍光SA (0.5 mg/ml)と15分間インキュベートした。次いで、培養物を再び3回洗浄した。コントロールとして、ビオチン化リン脂質をDOPC/POPAから融合性小胞に組み込まずに同じ計画を行った。実験結果は、洗浄後に、ビオチン化FUVで処理した群の明るく輝く細胞に比べて、コントロールの細胞がほとんど蛍光を示さなかったことを示した。これらの結果は、ビオチンテザーがHUVEC細胞膜に取り込まれて、蛍光標識SAに結合できたことを明確に示す。
インビボで潅流したときに内皮細胞膜に取り込まれる融合性小胞からの脂質
微細血管の内皮細胞と融合するFUVの能力を、DOPC/POPA及び蛍光標識リン脂質である1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(カルボキシフルオレセイン) (DOPE-CF)を用いて調べた。単離(単一の茎(pedicle))したラット精巣挙筋調製物及び蛍光生体内ビデオ顕微鏡を用いて、FUVの内皮細胞への融合を観察した。懸垂体を単離した後に、血液を塩水で流し出し、続いてDOPC/POPA/DOPE-CFで作られたFUVを注入した。注入の直後に、懸垂体の茎を20分間クランプした。微小クランプを取り除き、懸垂体を再潅流させた。遊離の蛍光FUVは血流により洗い流されるので、血管の端がハロ効果を示す可視の蛍光微小血管ツリーが残っており、このことは蛍光リン脂質が内皮細胞膜に取り込まれたことを示した。2時間の再潅流の後に、蛍光強度は変わらず、このことは、単に細胞表面上で凝集するよりはむしろ、細胞膜へのFUVの実際の融合が起こったことを示唆した。組織を切断して蛍光顕微鏡の下で観察したところ、内皮は、内皮の明確な蛍光染色により、周囲の組織から明らかに突出していた。また、より明確ではないが、血管の周囲の筋肉繊維は蛍光で染色され、融合性小胞がいくつかの点から脈管構造を出て行き、血管を取り囲む細胞と融合したことを示した。
融合性小胞を用いて、キメラ分子をインビボで内皮細胞表面に少なくとも14日間連結させることができる
ウィスターフュルト(WF)ラットに麻酔をかけ、外科手術の準備をした。大腿血管を解剖し、後脚を、骨及び神経(大腿及び坐骨)以外は体から分離した。動脈をクランプし、カニューレを挿入し、静脈をクランプし、クランプから遠位で切断した。脚にヘパリン処理乳酸加リンゲル液を10分間流した。脚に3 mlの乳酸加リンゲル溶液を潅流させ、血管を1時間クランプした。1時間後に、脚に乳酸加リンゲル液を10分間流し、次いで、脚に1mlの蛍光ストレプトアビジン(0.1 mg)を潅流させた。15分間のインキュベーションの後に、脚に乳酸加リンゲル溶液を10分間、再び流した。1a群(ネガティブコントロール)において、5%ホルマリンでの固定後に大腿動脈及び大腿静脈を回収した。血管を、5ミクロンの厚さの10の横断面で切断し、蛍光強度を定量した。1b群(ネガティブコントロール)において、血管を再び吻合し、後脚筋及び皮膚を外科的に再び連結した。動物を14日間追跡した。次いで、動物に麻酔をかけ、失血させ(exanguinated)、5%ホルマリン溶液を潅流させた。血管を解離させ、横断面で切断し、1a群のようにして分析した。
ビオチン化の割合の最適化
融合性小胞中のビオチンの最適量を決定した。融合性小胞は、種々のレベルでビオチン化して調製し、培養内皮細胞に最大量のビオチン化リン脂質を組み込むことができる小胞を決定した。HUVEC細胞をペトリ皿中で準備し、5% CO2中で37℃にてインキュベートした。FUVを、表1で同定される組成で調製した。
ニッケル化の割合の最適化
融合性小胞中のニッケルの最適量を決定できる。融合性小胞は、種々のレベルでビオチン化して調製し、培養内皮細胞に最大量のビオチン化リン脂質を組み込むことができる小胞を決定する。HUVEC細胞をペトリ皿中で準備し、5% CO2中で37℃にてインキュベートできる。FUVを、表2で同定される組成で調製できる。
キメラSA-FasLポリペプチドは、天然のストレプトアビジンのビオチン結合能力を維持する
SA-FasLが内皮膜においてビオチン化リン脂質に結合できるかを決定するために、HUVECを96ウェルプレートに入れ、単層にさせる。実験は、3回繰り返す。各実験において、6つのウェルを3つのビオチン化FUV処方に割り当て、残りのウェルはコントロールとして用いる。HUVEC単層を、ビオチン化FUVと1時間インキュベートする。インキュベーションの後に、細胞を3回洗浄し、1 mlのSA-FasL (100 ng - M.W. 32 kDa)と15分間インキュベートする。細胞を3回洗浄し、抗-FasL蛍光ポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotech)と20分間インキュベートし、3回洗浄する。ウェル当たりの蛍光量をマクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いて測定する。結果を統計的に分析し、コントロールの値と比較する。コントロールとして、HUVEC単層をビオチン化HBSS、非ビオチン化融合性小胞、及びその両方とともに1時間インキュベートする。
結合したSA-FasLの有効性
内皮細胞上のリン脂質につながれたストレプトアビジン-FasL (SA-FasL)と接触する活性化T細胞は、アポトーシスを受けることができる。3つの実験群において、ACIで感作された WFラットからの脾細胞を回収して、インビトロで内皮ACI細胞に曝露する。次に、WF脾細胞を分離し、ヌード受容者ラット(PVG rnu/rnu)に養子細胞移入する。次いで、ヌードラットにACI血管新生化皮膚弁を移植し、拒絶を観察する。
融合性小胞及びSA-FasLでの潅流は、移植されたラットの心臓の免疫拒絶を遅らせるか又は妨げる
異所(heterotopic)ラット心臓移植のモデルを用いて、ビオチン化リン脂質テザーを介してSA-FasLで被覆した心臓同種移植片の内皮が、インビボでの免疫拒絶に対して保護されるかを決定する。I群はコントロール群である。WF及びACIラットを調製し、第0日に麻酔をかける。心臓をACIドナーから回収し、以前に記載されたようにして調製し、冷乳酸加リンゲル液で潅流し、クランプし、1時間インキュベートし、WF受容者の首に皮下移植した。吻合に用いた血管は、頚動脈及び頚静脈である。受容者を12週間追跡する。拒絶は、首を触診し、心臓がまだ鼓動しているかを評価することにより監視する。12週間、又は心臓が拒絶されるならばそれより前に、受容者を安楽死させ、血液及び心臓を組織学的研究のために回収する。特に、組織拒絶の階級及び内皮上のSA-FasLの存在を評価する。
6×His-VCPポリペプチドはニッケル結合能力を有する
本実施例は、6×His-VCPキメラポリペプチド中のポリヒスチジン部分がニッケル結合能力を有するか否かを決定することに関係する。実験は、培養されたHUVECを用いて行う。全部で12群を用いることができる。実験は、各群に8つのウェルを割り当てた96ウェルプレートを用いる。実験は3回繰り返す。細胞ベースの蛍光アッセイを用いて、2〜12群の処理の効果を定量する。2〜6群はネガティブコントロールであり、7〜12群は、ニッケル化内皮細胞を異なる濃度の6×His-VCPで処理する実験群である。細胞当たりの6×His-VCPの被覆の平均パーセントを算出する。
1群(細胞計数コントロール)。 1群を用いて、ウェル当たりの細胞数を決定する。各実験の最後に、96ウェル全てからの培地を回収し、プレートを凍結させる。24時間後にプレートを融解し、200μLのCyQUANT GR (登録商標)色素/細胞溶解バッファー(Molecular Probes)を1群のウェルに加える。次いで、プレートを完全な暗所で室温にて5分間インキュベートする。各ウェルの蛍光を、励起及び発光フィルタをそれぞれ約480 nm及び約520 nmに設定したプレートリーダーを用いて測定する。8つのウェルからの平均蛍光を決定して、これを用いて標準曲線からウェル当たりの細胞数を算出する。各プレート中の96ウェル全てが同じ細胞密度で播種されているので、1群は、ウェル当たりの平均細胞数を定量する役目を果たす。
2群(未処理コントロール)。 HUVECをHBSSと30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、HBSSとさらに30分間インキュベートする。インキュベーション期間の最後に、一次抗-VCP抗体(200μL)を加え、30分間インキュベートする。次いで、二次蛍光抗体を加えて15分間インキュベートする。蛍光を定量する。2群は、抗-VCP抗体のNi-FUV又は6×His-VCPを受けていないHUVECへの非特異的結合を測定する役目を果たす。2群の細胞は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。この群の細胞はHBSSのみとインキュベートするが、これらを他の群と同じ実験手順に曝すためにこれらを30分洗浄することが記載される。
4群(FUVコントロールで処理された細胞への抗-VCPの非特異的結合)。 4群の実験手順は、HUVECを200μLの非ニッケル化FUV溶液と30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、200μLのHBSSでさらに30分間インキュベートする以外は、2群の手順と同じである。3群は、非ニッケル化FUVで処理されたHUVECへの抗-VCPの非特異的結合を測定する役目を果たす。4群は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。
ストレプトアビジン-VCP融合タンパク質(SA-VCP)の構築
構築するポリペプチドは、ワクシニア補体調節タンパク質(VCP)と、ストレプトミセス・アビジニイ(Streptomyces avidinii)からのストレプトアビジン(SA)との融合である。VCPドメインは、キメラタンパク質の免疫調節効果を媒介し、SAドメインは、タンパク質を血管内皮上のビオチンテザーに標的させるために用いられる。SA-VCP融合タンパク質は、遺伝子レベルで構築した。865塩基対のDNAを含有する融合遺伝子は、VCP触媒ドメインとSA結合ドメインとを含有する融合タンパク質をコードする。まず、VCP及びSAタンパク質の構成性要素をコードする遺伝子配列を、NCBIのGenBankデータベースから得た。融合の結合及び発現ベクタークローニングのための適切な制限酵素の実行可能性の評価の際に、32個のオリゴヌクレオチドプライマーをInvitrogen, Inc.から注文した。プライマーは、13塩基対の重複を有する40マーのフォワード及びリバースを含む。プライマーは、共有結合型の連結の作製において、95%のフォワード反応においてT4-ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)で不可逆的にリン酸化される。Pfu DNAリガーゼを用いるその後のリガーゼ連鎖反応(LCR)において、重複セグメントは、特異的ヌクレオチドプライマーに挟まれた領域に沿った正しい順序でプライマーをアニールして連結させるように導いた。PCR (Taqポリメラーゼを用いる)を付加的に用いて、電気泳動での検出のために、LCR産物を増幅させた。
キメラSA-VCPポリペプチドは、天然のストレプトアビジンのビオチン結合能力を維持する
本実施例は、SA-VCPキメラポリペプチド中のストレプトアビジンがそのビオチン結合能力を保持するか否かを決定することに関係する。実験は、培養されたHUVECを用いて行う。全部で12群を用いることができる。実験は、各群に8つのウェルを割り当てた96ウェルプレートを用いる。実験は3回繰り返す。細胞ベースの蛍光アッセイを用いて、2〜12群の処理の効果を定量する。2〜6群はネガティブコントロールであり、7〜12群は、ビオチン化内皮細胞を異なる濃度のSA-VCPで処理する実験群である。細胞当たりのSA-VCPの平均パーセント被覆を算出する。
1群(細胞計数コントロール)。 1群を用いてウェル当たりの細胞数を決定する。各実験の最後に、96ウェル全てからの培地を回収し、プレートを凍結させる。24時間後にプレートを融解し、200μLのCyQUANT GR (登録商標)色素/細胞溶解バッファー(Molecular Probes)を1群のウェルに加える。次いで、プレートを完全な暗所で室温にて5分間インキュベートする。各ウェルの蛍光を、励起及び発光フィルタをそれぞれ約480 nm及び約520 nmに設定したプレートリーダーを用いて測定する。8つのウェルからの平均蛍光を決定して、これを用いて標準曲線からウェル当たりの細胞数を算出する。各プレート中の96ウェル全てが同じ細胞密度で播種されているので、1群は、ウェル当たりの平均細胞数を定量する役目を果たす。
2群(未処理コントロール)。 HUVECをHBSSと30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、HBSSとさらに30分間インキュベートする。インキュベーション期間の最後に、一次抗-VCP抗体(200μL)を加え、30分間インキュベートする。次いで、二次蛍光抗体を加えて15分間インキュベートする。蛍光を定量する。2群は、抗-VCP抗体のBioFLV又はSA-VCPを受けていないHUVECへの非特異的結合を測定する役目を果たす。2群の細胞は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。この群の細胞はHBSSのみとインキュベートするが、これらを他の群と同じ実験手順に曝すためにこれらを30分洗浄することが記載される。
4群(FUVコントロールで処理された細胞への抗-VCPの非特異的結合)。 4群の実験手順は、HUVECを200μLの非ビオチン化FUV溶液と30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、200μLのHBSSでさらに30分間インキュベートする以外は、2群の手順と同じである。3群は、非ビオチン化FUVで処理されたHUVECへの抗-VCPの非特異的結合を測定する役目を果たす。4群は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。
ヒルジン-コアストレプトアビジン(HN-SA)タンパク質の構築
本実施例は、我々のビオチン化FUVと働くように設計された抗血栓キメラタンパク質の構築を説明する。構築されるタンパク質は、ヒルの唾液からの天然のHNと、ストレプトミセス・アビジニイからのコアストレプトアビジン(SA)との融合である。HNドメインは、キメラタンパク質の抗血栓効果を媒介でき、SAドメインは、タンパク質を血管内皮上のビオチンテザーに標的させるために用いられる。SAはビオチンに堅く結合し、これは、本明細書に開示されるビオチン化FUVにより血管内皮細胞の表面上に効率的に組み込まれ得る。HN-SA融合タンパク質は、遺伝子レベルで構築できる。SAドメインとHNドメインの順序が異なる遺伝子の2つの形を作成する。遺伝子の各バージョンは、長さ約700 DNA塩基対であり、フレキシブルリンカー(スタンダード(Gly4-Ser)3を用い得る)により分けられたHNドメインとSAドメインの両方を含有する。HN要素及びSA要素の配列はともに、NCBIのGene bankデータベースに開示される。コーディング配列は、ピキア・パストリスでの最適発現のために最適化されたコドンであり得る。さらに、ドメイン同士を交換し、コーディング配列全体をシャトル輸送するための制限部位を含む。合成の後に、両方のHN-SA融合遺伝子を、ピキアでの発現、ゲノムへの組込み、及び選択のための要素を含有する発現ベクターにクローニングする。形質転換の後に、最高発現レベルのクローンをタンパク質産生のために選択する。発現は、ウェスタンブロット分析により決定する(抗-SA抗体を用いる)。発現の際に、HN-SAタンパク質を上清から回収し、アフィニティクロマトグラフィーにより精製する(SAドメインについても)。2つの融合タンパク質のそれぞれのHN機能を野生型HNと比較する。HN-SAを精製した後に、融合タンパク質又は野生型HNの種々の濃度を1 mLの新しく採取したラットの血液と混合し、エカリン凝固時間(ECT)を、ECTテストカード(Pharmanetics Inc, Cary,North Carolina, U.S.A.)を用いて測定する。2つの異なるHN-SAタンパク質及び野生型HNを用いて作製した曲線を互いに比較する。
ヒルジン-ポリヒスチジン(HN-6×His)の構築
本実施例は、本明細書に開示されるニッケル化FUVと働くように設計された抗血栓キメラタンパク質の構築を説明する。構築されるタンパク質は、ヒルの唾液からの天然のHNと6ポリヒスチジンペプチド(6×His)との融合である。HNドメインは、キメラタンパク質の抗血栓効果を媒介でき、Hisドメインは、タンパク質を血管内皮上のニッケルテザーに標的させるために用いることができる。Hisはニッケルに堅く結合し、これが本明細書に開示されるニッケル化FUVにより血管内皮細胞の表面上に効果的に取り込まれ得る。HN-6×His融合タンパク質は、遺伝子レベルで構築できる。6×HisとHNドメインの順序が異なる遺伝子の2つの形を作成する。HN-6×His遺伝子は、長さ約220 DNA塩基対であり、フレキシブルリンカー(最初はスタンダード(Gly4-Ser)3が用いられる)により分けられている場合もあるHNと6×Hisドメインの両方を含有する。HNの配列は、NCBIのGene bankデータベースに開示される。コーディング配列は、ピキア・パストリスでの最適発現のために最適化されたコドンであり得る。さらに、ドメイン同士を交換し、コーディング配列全体をシャトル輸送するための制限部位を含む。合成の後に、両方のHN-6×His融合遺伝子を、ピキアでの発現、ゲノムへの組込み、及び選択のための要素を含有する発現ベクターにクローニングする。形質転換の後に、最高発現レベルのクローンをタンパク質産生のために選択する。発現は、ウェスタンブロット分析により決定する(抗-His抗体を用いる)。発現の際に、HN-6×Hisタンパク質を上清から回収し、アフィニティクロマトグラフィーにより精製する(Hisドメインについて)。2つの構築された融合タンパク質のそれぞれのHN機能を野生型HNと比較する。HN-6×Hisを精製した後に、融合タンパク質又は野生型HNの種々の濃度を1 mLの新しく採取したラットの血液と混合し、エカリン凝固時間(ECT)を、ECTテストカード(Pharmanetics Inc, Cary,North Carolina, U.S.A.)を用いて測定する。2つの異なるHN-6×Hisタンパク質及び野生型HNを用いて作製した曲線を互いに比較する。
HN-SAのビオチンテザーへの結合動態の決定
これらの実験において、HN-SAのビオチンテザーへの結合動態を定量する。タンパク質による細胞の最大の被覆に必要なHN-SAの最小濃度を、ビオチンテザーの最大数が培養HUVECの表面上に提示されるときに定量する。6つの実験群を含み得る。実験は、各群に8つのウェルを割り当てた96ウェルプレートを用いる。HUVECは、DOPC、POPA及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル) (BDPG)の組み合わせで作製したビオチン化FUVを用いてビオチン化する。各実験群において、HUVECを異なる濃度のHN-SAで処理する。細胞ベースの蛍光アッセイを用いて、細胞に結合したHN-SAの量を定量する。細胞当たりのHN-SAの平均パーセント被覆を算出する。いくつかのコントロール群を含んで、HN-SAの非ビオチン化HUVECへの、又は抗-HN抗体の未処理の細胞へのいずれの非特異的結合の発生を決定する。各実験において、CyQUANT (登録商標)細胞増殖アッセイキット(Molecular Probes)を用いてウェル当たりの細胞の平均数を算出するのに8つのウェルを用いる。実験は、3重に繰り返す。HUVECをビオチン化FUV溶液と30分間インキュベートする。次いで、細胞を洗浄し、以下の濃度の1つのHN-SA溶液とさらに30分間インキュベートする:100pg/mL (1群)、1ng/mL (2群)、10ng/mL (3群)、100ng/mL (4群)、1μg/mL (5群)又は10μg/mL (6群)。これらの群は、細胞膜の最大のタンパク質での被覆を得るために必要なHN-SAの最小濃度を決定する役目を果たす。7、8及び9群は、ネガティブコントロールである。7群は、BioFLVもHN-SAも受けていないHUVECへの抗-HN抗体の非特異的結合を測定する。細胞を、HBSSのみとインキュベートし、次いでFITC-標識抗-HNモノクローナル抗体(mAb)とインキュベートする。8群は、非ビオチン化HUVECへのHN-SAの非特異的結合を測定する。細胞をHN-SA溶液のみとインキュベートし、次いでFITC-標識抗-HN mAbとインキュベートする。9群は、非ビオチン化FLVで処理したHUVECへのHN-SAの非特異的結合を測定する。細胞を非ビオチン化FLVで処理し、次いでHN-SA溶液で処理する。次いで、細胞をFITC-標識抗-HN mAbとインキュベートする。
HN-SA提示の抗血栓効果
第1日の大腿静脈は、本明細書に記載することと同様に、最大レベルのビオチン化FUV及びHN-SAで処理する。治療的投与の後に、静脈を修復し、処置したセグメントに2つの縫合糸で印をつける。皮膚を閉じ、動物を麻酔から回復させる。処置後第7、14、21又は30日に、「つまみ」損傷又は塩化第二鉄処置後の血栓の形成を、異なる動物の群において定量する。完全な血管の閉塞を決定するために、ドップラープローブを血栓の近位末端において、血流を監視する。全ての研究は、イソフロラン(2〜5%)の吸入により麻酔をかけたスプレーグ−ドーリーラットに対して行う。提示される種々の濃度のHN-SAの急性効果の研究についての実験設計は、2つの処置(ビオチン化FUV及び非ビオチン化FUV)×3つの曝露時間×2つの小胞濃度×1つのHN-SA濃度= 12個の実験群からなる。提示されるHN-SAの効果的な持続性の研究についての実験設計は、2つの処置(ビオチン化FUV及び非ビオチン化FUV)×4つの時間点(第7、14、21及び30日)×1つの曝露時間×1つの小胞濃度×1つのHN-SA濃度= 8つの実験群からなる。血栓形成研究の間に、ラットの血圧、心拍、呼吸及び体温を監視する。各実験の最後に、動物を安楽死させ、全身に5%ホルマリンを潅流させて、全ての組織を加圧固定(pressure-fix)する。処理した対側性の大腿静脈を、組織学的及び免疫組織化学的な分析のために回収する。
ヒト組織ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子-ポリヒスチジン(UK-6×His)の構築
本実施例は、本明細書に開示されるニッケル化FUVとともに働くように設計された血栓溶解性キメラタンパク質の構築を説明する。構築物は、ヒト組織ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子タンパク質(UK)及び6ポリヒスチジンペプチド(6×His)の高い発現が可能な核酸ベクターを含む。核酸ベクターは、ヒト組織UKと1つ又は複数の調節配列に機能可能に連結された増幅可能な優性選択マーカーとをコードする合成の又はcDNA由来のDNAフラグメントを含む。調節配列は、リーディングフレームを含むmRNA転写産物の発現を制御する。調節配列は、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御要素を含む。発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞におけるヒトUKの発現のために設計される。アデノウイルス2又はサイトメガロウイルスに由来する一般的に用いられるプロモーターを用いる。ベクター核酸は、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム、リポフェクション又はエレクトロポレーションを含む外来核酸を宿主細胞に導入するために用いられる通常の形質転換又はトランスフェクション法により、宿主細胞に導入できる。タンパク質のUKドメインは、キメラタンパク質の血栓溶解効果を媒介し、6×Hisドメインは、タンパク質を血管内皮上のニッケルテザーに標的させるために用いられる。6×Hisはニッケルに堅く結合し、これはニッケル化FUVにより血管内皮細胞の表面上に効率的に組み込まれ得る。UK-6×His融合タンパク質は、フレキシブルリンカー(スタンダード(Gly4-Ser)3)を介してN-末端及びC-末端のいずれかに連結した6×Hisを用いて構築される。6×Hisドメイン及びUKドメインの順序が異なる遺伝子の2つの形を作る。UK-6×His遺伝子は、長さ約1850 DNA塩基対であり、UKドメイン及び6×Hisドメインをともに含む。UKの配列は、NCBIのGenebankデータベースに開示される。コーディング配列は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えばDG44又はDXB11)における最適発現のために最適化されたコドンである。さらに、ドメイン同士の交換及びコーディング配列全体のシャトル輸送のための制限部位を含む。形質転換の後に、最高の発現レベルのクローンをタンパク質産生のために選択する。発現は、ウェスタンブロット分析により決定する(抗-His抗体を用いる)。発現の際に、UK-6×Hisタンパク質を、溶解させたCHO細胞から回収し、カラムクロマトグラフィーにより精製する。2つの構築した融合タンパク質のそれぞれのUK機能を、天然のUKと比較する。2つのUK-6×Hisタンパク質を精製した後に、繊維素溶解活性をフィブリン-寒天プレートアッセイを用いて測定し、市販のUKと比較する。フィブリン-寒天試薬は、ダルベッコのリン酸バッファー中で調製する。TPAプロテアーゼを、0.5〜5.0μg/mLの範囲の濃度にてフィブリン-寒天プレート中で48時間インキュベートする。トロンビン(PBSバッファー中に36ユニット/mL)をプラスミノゲン(PBSバッファー中に2.5ユニット/mL)と47℃にて混合する。それぞれの30 mL FalconプレートにME-アガロース15 mL(PBSバッファー中に5.3 mg/mL)を加え、続いて5 mLのフィブリノゲン(PBSバッファー中に11 mg/mL)を加える。いくつかの3 mmプラグがプレート上に形成され、10μLのコントロールを含む試験溶液及び試験溶液を各プラグに加える。プレートを加湿した箱に入れ、溶液を48時間インキュベートする。溶解領域の直径を各サンプルについて測定する。標準曲線を、希釈の活性ユニットに対してプロットしたコントロールTPA溶液により作り出された溶解領域の直径を用いて構築する。次いで、標準曲線を用いて、UK-6×Hisサンプルの活性及び量を決定する。
UK-6×His提示の抗血栓効率
第1日の大腿静脈は、最大レベルのニッケル化FUV及びUK-6×Hisで処理する。治療的投与の後に、静脈を修復し、処置したセグメントに2つの縫合糸で印をつける。皮膚を閉じ、動物を麻酔から回復させる。処置後第7、14、21又は30日に、「つまみ」損傷又は塩化第二鉄処置後の血栓の形成を、異なる動物の群において定量する。完全な血管の閉塞を決定するために、ドップラープローブを血栓の近位末端において、血流を監視する。全ての研究は、イソフロラン(2〜5%)の吸入により麻酔をかけたスプレーグ−ドーリーラットに対して行う。提示される種々の濃度のUK-6×Hisの急性効果の研究についての実験設計は、2つの処置(ニッケル化FUV及び非ニッケル化FUV)×3つの曝露時間×2つの小胞濃度×1つのUK-6×His濃度= 12個の実験群からなる。提示されるUK-6×Hisの効果的な持続性の研究についての実験設計は、2つの処置(ニッケル化FUV及び非ニッケル化FUV)×4つの時間点(第7、14、21及び30日)×1つの曝露時間×1つの小胞濃度×1つのUK-6×His濃度= 8つの実験群からなる。血栓形成研究の間に、ラットの血圧、心拍、呼吸及び体温を監視する。各実験の最後に、動物を安楽死させ、全身に5%ホルマリンを潅流させて、全ての組織を加圧固定する。処理した大腿静脈と対側性の大腿静脈を、組織学的及び免疫組織化学的な分析のために回収する。
Claims (169)
- 活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み、該テザー部分がニッケル、チオール、マレイミド、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される脂質小胞。
- 官能化脂質が、リン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項1に記載の脂質小胞。
- 官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項2に記載の脂質小胞。
- リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項2に記載の脂質小胞。
- 活性物質のリガンド部が、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項1に記載の脂質小胞。
- 活性物質が、ポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項1に記載の脂質小胞。
- 活性物質が、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子である請求項1に記載の脂質小胞。
- 治療用分子が、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項7に記載の脂質小胞。
- 凍結乾燥されている請求項1に記載の脂質小胞。
- 少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項1に記載の脂質小胞。
- (a) 安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b) 安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項1に記載の脂質小胞。 - 約1:1〜約500:1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項11に記載の脂質小胞。
- 安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項11に記載の脂質小胞。
- ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項14に記載の脂質小胞。
- 不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項11に記載の脂質小胞。
- 補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞。
- 官能化脂質が、リン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項18に記載の脂質小胞。
- 官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項19に記載の脂質小胞。
- リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項19に記載の脂質小胞。
- テザー部分がビオチンである請求項21に記載の脂質小胞。
- テザー部分を含む官能化脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)からなる群より選択される請求項22に記載の脂質小胞。
- テザー部分が、ビオチン、ニッケル、チオール、マレイミド、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される請求項18に記載の脂質小胞。
- 治療用分子のリガンド部が、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項18に記載の脂質小胞。
- 治療用分子が、ポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項18に記載の脂質小胞。
- 治療用分子が、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項18に記載の脂質小胞。
- 凍結乾燥されている請求項18に記載の脂質小胞。
- 少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項18に記載の脂質小胞。
- (a) 安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b) 安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項18に記載の脂質小胞。 - 約1:1〜約500:1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項30に記載の脂質小胞。
- 安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項30に記載の脂質小胞。
- ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項34に記載の脂質小胞。
- 不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項30に記載の脂質小胞。
- テザー部分を含む官能化脂質を含み、該テザー部分が活性物質のリガンド部に結合し、該テザー部分がニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される、装飾された内皮細胞。
- 組織又は器官の内皮細胞である請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
- テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合している請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
- 複数の異なる治療用分子で装飾されている請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
- 官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
- 官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項39に記載の装飾された内皮細胞。
- リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項39に記載の装飾された内皮細胞。
- 活性物質のリガンド部が、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
- 活性物質が、ポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
- 活性物質が、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子である請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
- 治療用分子が、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項46に記載の装飾された内皮細胞。
- テザー部分を含む官能化脂質を含み、該テザー部分が、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子のリガンド部に結合している装飾された内皮細胞。
- 組織又は器官の内皮細胞である請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
- テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合している請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
- 複数の異なる治療用分子で装飾されている請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
- 官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
- 官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項52に記載の装飾された内皮細胞。
- リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項52に記載の装飾された内皮細胞。
- テザー部分がビオチンである請求項54に記載の装飾された内皮細胞。
- テザー部分を含む官能化脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)からなる群より選択される請求項55に記載の装飾された内皮細胞。
- テザー部分が、ビオチン、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
- 治療用分子のリガンド部が、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
- 治療用分子がポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
- 治療用分子が、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
- (a) 活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞と、
(b) リガンド部を含む活性物質と
を含む、内皮細胞を装飾するためのキット。 - 内皮細胞を装飾するための指示書をさらに含む請求項61に記載のキット。
- 脂質小胞が第1容器に収納され、治療用分子が第2容器に収納される請求項61に記載のキット。
- (a) 細胞を、活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞と接触させ、ここでテザー部分はニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択され、
(b) 前記細胞を、テザー部分と結合するリガンド部を含む活性物質と接触させる
ことを含む、細胞膜を活性物質で装飾する方法。 - 細胞が内皮細胞である請求項64に記載の方法。
- 内皮細胞が、組織又は器官の内皮細胞である請求項65に記載の方法。
- 組織又は器官が、脂質小胞を含む第1組成物と活性物質を含む第2組成物とで潅流される請求項66に記載の方法。
- テザー部分が、活性物質のリガンド部に非共有結合型で結合する請求項64に記載の方法。
- 細胞膜が、複数の異なる活性物質で装飾される請求項64に記載の方法。
- 官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項64に記載の方法。
- 官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項70に記載の方法。
- リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項70に記載の方法。
- 活性物質のリガンド部が、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項64に記載の方法。
- 活性物質が、ポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項64に記載の方法。
- 活性物質が、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子である請求項64に記載の方法。
- 治療用分子が、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項75に記載の方法。
- 脂質小胞が凍結乾燥されている請求項64に記載の方法。
- 脂質小胞が、少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項64に記載の方法。
- 脂質小胞が、
(a) 安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b) 安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項64に記載の方法。 - 脂質小胞が、約1:1〜約500:1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項79に記載の方法。
- 安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項79に記載の方法。
- ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項83に記載の方法。
- 不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項79に記載の方法。
- (a) 細胞を、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子のリガンド部に対する親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞と接触させ、
(b) 前記細胞を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子と接触させる
ことを含む、細胞膜を治療用分子で装飾する方法。 - 細胞が内皮細胞である請求項86に記載の方法。
- 内皮細胞が、組織又は器官の内皮細胞である請求項87に記載の方法。
- 組織又は器官が、脂質小胞を含む第1組成物と治療用分子を含む第2組成物とで潅流される請求項88に記載の方法。
- テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する請求項86に記載の方法。
- 細胞膜が、複数の異なる治療用分子で装飾される請求項86に記載の方法。
- 官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項86に記載の方法。
- 官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項92に記載の方法。
- リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項92に記載の方法。
- テザー部分がビオチンである請求項94に記載の方法。
- テザー部分を含む官能化脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)からなる群より選択される請求項95に記載の方法。
- テザー部分が、ビオチン、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される請求項86に記載の方法。
- 治療用分子のリガンド部が、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項86に記載の方法。
- 治療用分子がポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項86に記載の方法。
- 治療用分子が、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか又は合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項86に記載の方法。
- 脂質小胞が凍結乾燥されている請求項86に記載の方法。
- 脂質小胞が、少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項86に記載の方法。
- 脂質小胞が、
(a) 安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b) 安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項86に記載の方法。 - 脂質小胞が、約1:1〜約500:1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項103に記載の方法。
- 安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項103に記載の方法。
- ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項107に記載の方法。
- 不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項103に記載の方法。
- (a) 組織又は器官を、脂質小胞を含む第1組成物と接触させ、ここで該脂質小胞は治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み、該テザー部分はニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択され、
(b) 前記組織又は器官を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第2組成物と接触させる
ことを含む、対象における移植された組織又は器官の拒絶を阻害する方法。 - 組織又は器官を、対象に移植する前に第1及び第2組成物と接触させる請求項110に記載の方法。
- テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する請求項110に記載の方法。
- 官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項110に記載の方法。
- 官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項113に記載の方法。
- リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項113に記載の方法。
- 治療用分子のリガンド部が、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項110に記載の方法。
- 治療用分子がポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項110に記載の方法。
- 治療用分子が、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される請求項110に記載の方法。
- 治療用分子が、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項118に記載の方法。
- 脂質小胞が凍結乾燥されている請求項110に記載の方法。
- 脂質小胞が、少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項110に記載の方法。
- 脂質小胞が、
(a) 安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b) 安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項110に記載の方法。 - 脂質小胞が、約1:1〜約500:1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項122に記載の方法。
- 安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項122に記載の方法。
- ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項126に記載の方法。
- 不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項122に記載の方法。
- (a) 組織又は器官を、脂質小胞を含む第1組成物と接触させ、ここで該脂質小胞は、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み、
(b) 前記組織又は器官を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第2組成物と接触させる
ことを含む、移植された組織又は器官の拒絶を阻害する方法。 - 組織又は器官を、対象に移植する前に第1及び第2組成物と接触させる請求項129に記載の方法。
- テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する請求項129に記載の方法。
- 官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項129に記載の方法。
- 官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項132に記載の方法。
- リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項132に記載の方法。
- テザー部分がビオチンである請求項134に記載の方法。
- テザー部分を含む官能化脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)からなる群より選択される請求項135に記載の方法。
- テザー部分が、ビオチン、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される請求項129に記載の方法。
- 治療用分子のリガンド部が、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項129に記載の方法。
- 治療用分子がポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項129に記載の方法。
- 治療用分子が、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか又は合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項129に記載の方法。
- 脂質小胞が凍結乾燥されている請求項129に記載の方法。
- 脂質小胞が、少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項129に記載の方法。
- 脂質小胞が、
(a) 安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b) 安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項129に記載の方法。 - 脂質小胞が、約1:1〜約500:1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項143に記載の方法。
- 安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項143に記載の方法。
- ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項147に記載の方法。
- 不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項143に記載の方法。
- (a) 組織又は器官を、脂質小胞を含む第1組成物と接触させ、ここで該脂質小胞は、補体阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み、
(b) 前記組織又は器官を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第2組成物と接触させる
ことを含む、組織又は器官への虚血再潅流障害を阻害する方法。 - テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する請求項150に記載の方法。
- 官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項150に記載の方法。
- 官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項152に記載の方法。
- リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項152に記載の方法。
- テザー部分がビオチンである請求項154に記載の方法。
- テザー部分を含む官能化脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)からなる群より選択される請求項155に記載の方法。
- テザー部分が、ビオチン、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される請求項150に記載の方法。
- 治療用分子のリガンド部が、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項150に記載の方法。
- 治療用分子がポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項150に記載の方法。
- 治療用分子が、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、コンプスタチン、FUT-175、化合物4077、C1s-INH-248、化合物53、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)及びマトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)からなる群より選択される請求項150に記載の方法。
- 脂質小胞が凍結乾燥されている請求項150に記載の方法。
- 脂質小胞が、少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項150に記載の方法。
- 脂質小胞が、
(e) 安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(f) 安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも1つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項150に記載の方法。 - 脂質小胞が、約1:1〜約500:1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項163に記載の方法。
- 安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項163に記載の方法。
- ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項167に記載の方法。
- 不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項163に記載の方法。
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