ES2326458B1 - Compuestos fluorescentes para diagnostico de infecciones, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. - Google Patents
Compuestos fluorescentes para diagnostico de infecciones, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2326458B1 ES2326458B1 ES200800951A ES200800951A ES2326458B1 ES 2326458 B1 ES2326458 B1 ES 2326458B1 ES 200800951 A ES200800951 A ES 200800951A ES 200800951 A ES200800951 A ES 200800951A ES 2326458 B1 ES2326458 B1 ES 2326458B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- fluorescent
- bdp
- compound according
- substituted
- microorganisms
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 37
- -1 compounds alkyl phospholipid Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 claims abstract description 9
- PQLXHQMOHUQAKB-UHFFFAOYSA-N miltefosine Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCOP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C PQLXHQMOHUQAKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 229960003775 miltefosine Drugs 0.000 claims description 37
- MHFRGQHAERHWKZ-HHHXNRCGSA-N (R)-edelfosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C MHFRGQHAERHWKZ-HHHXNRCGSA-N 0.000 claims description 22
- 229950011461 edelfosine Drugs 0.000 claims description 22
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 19
- ODEDPKNSRBCSDO-UHFFFAOYSA-N [2-(hexadecylsulfanylmethyl)-3-methoxypropyl] 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCSCC(COC)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ODEDPKNSRBCSDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 claims description 15
- KZMGYPLQYOPHEL-UHFFFAOYSA-N Boron trifluoride etherate Chemical compound FB(F)F.CCOCC KZMGYPLQYOPHEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000248418 Tetrahymena pyriformis Species 0.000 claims description 8
- 241000223105 Trypanosoma brucei Species 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 8
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 7
- 241000224432 Entamoeba histolytica Species 0.000 claims description 7
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 claims description 7
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 7
- 229940007078 entamoeba histolytica Drugs 0.000 claims description 7
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 7
- 241000224424 Acanthamoeba sp. Species 0.000 claims description 6
- 241001149959 Fusarium sp. Species 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 241001502502 Naegleria sp. Species 0.000 claims description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 6
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 241000934150 Balamuthia Species 0.000 claims description 5
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 claims description 5
- 241000220979 Trichomonas sp. Species 0.000 claims description 5
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 208000000230 African Trypanosomiasis Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 4
- XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N ethyl acetoacetate Chemical compound CCOC(=O)CC(C)=O XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000029080 human African trypanosomiasis Diseases 0.000 claims description 4
- 125000002525 phosphocholine group Chemical group OP(=O)(OCC[N+](C)(C)C)O* 0.000 claims description 4
- 201000002612 sleeping sickness Diseases 0.000 claims description 4
- 208000004881 Amebiasis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010001935 American trypanosomiasis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010001980 Amoebiasis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010035728 Pneumonia pneumococcal Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005448 Trichomonas Infections Diseases 0.000 claims description 3
- 206010044620 Trichomoniasis Diseases 0.000 claims description 3
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 3
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 claims description 3
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 3
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000007790 scraping Methods 0.000 claims description 3
- 208000022218 streptococcal pneumonia Diseases 0.000 claims description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims description 3
- 150000003732 xanthenes Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims 2
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QUPDWYMUPZLYJZ-UHFFFAOYSA-N ethyl Chemical compound C[CH2] QUPDWYMUPZLYJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 13
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 abstract description 4
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 21
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 18
- 210000003812 trophozoite Anatomy 0.000 description 15
- 241000224423 Acanthamoeba castellanii Species 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 12
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 11
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 10
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 10
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- 241000222727 Leishmania donovani Species 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 206010047505 Visceral leishmaniasis Diseases 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 241000224422 Acanthamoeba Species 0.000 description 5
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- XDRYMKDFEDOLFX-UHFFFAOYSA-N pentamidine Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1OCCCCCOC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 XDRYMKDFEDOLFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004448 pentamidine Drugs 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- RDFZYUOHJBXMJA-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethyl-1h-pyrrole-2-carbaldehyde Chemical compound CC1=CC(C)=C(C=O)N1 RDFZYUOHJBXMJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHIKIUXLJPZNCA-UHFFFAOYSA-N 4-ethyl-3,5-dimethyl-1h-pyrrole-2-carbaldehyde Chemical compound CCC1=C(C)NC(C=O)=C1C VHIKIUXLJPZNCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000224489 Amoeba Species 0.000 description 2
- 206010001981 Amoebic infections Diseases 0.000 description 2
- 101100491149 Caenorhabditis elegans lem-3 gene Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 239000008777 Glycerylphosphorylcholine Substances 0.000 description 2
- 241000224421 Heterolobosea Species 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 101000785134 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Probable phospholipid-transporting ATPase DNF3 Proteins 0.000 description 2
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003001 amoeba Anatomy 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000000724 leishmaniacidal effect Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHFRGQHAERHWKZ-UHFFFAOYSA-N 1-octadecyl-2-methylglycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(OC)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C MHFRGQHAERHWKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFGANBYCJWQYBI-UHFFFAOYSA-N 11-bromoundecan-1-ol Chemical compound OCCCCCCCCCCCBr XFGANBYCJWQYBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XEZNGIUYQVAUSS-UHFFFAOYSA-N 18-crown-6 Chemical compound C1COCCOCCOCCOCCOCCO1 XEZNGIUYQVAUSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBMUNILHNJLMBF-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-1,3,2$l^{5}-dioxaphospholane 2-oxide Chemical compound ClP1(=O)OCCO1 SBMUNILHNJLMBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZEBBLOXDLGIMEG-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2,4-dimethyl-1h-pyrrole Chemical compound CCC=1C(C)=CNC=1C ZEBBLOXDLGIMEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSXUEMBOMBFOMG-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2,5-dimethyl-1h-pyrrole Chemical compound CCC=1C=C(C)NC=1C MSXUEMBOMBFOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069408 Acanthamoeba keratitis Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000934146 Balamuthia mandrillaris Species 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- 206010011668 Cutaneous leishmaniasis Diseases 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108090000365 Cytochrome-c oxidases Proteins 0.000 description 1
- PAEYAKGINDQUCT-UHFFFAOYSA-N Ethyl 2-pyrrolecarboxylate Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=CN1 PAEYAKGINDQUCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001860 Eye Infections Diseases 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 206010019973 Herpes virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 238000006945 Knorr synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- WMFYOYKPJLRMJI-UHFFFAOYSA-N Lercanidipine hydrochloride Chemical compound Cl.COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC(C)(C)CN(C)CCC(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)C1C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 WMFYOYKPJLRMJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006968 MacDonald synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000224438 Naegleria fowleri Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108090000216 Phospholipid Transfer Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003867 Phospholipid Transfer Proteins Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 description 1
- 241000224526 Trichomonas Species 0.000 description 1
- 241000224527 Trichomonas vaginalis Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002514 anti-leishmanial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003904 antiprotozoal agent Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000882 contact lens solution Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- RCJVRSBWZCNNQT-UHFFFAOYSA-N dichloridooxygen Chemical compound ClOCl RCJVRSBWZCNNQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 208000011323 eye infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003234 fluorescent labeling method Methods 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940033802 impavido Drugs 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 244000000053 intestinal parasite Species 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 208000018769 loss of vision Diseases 0.000 description 1
- 231100000864 loss of vision Toxicity 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 description 1
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001459 mortal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 150000003233 pyrroles Chemical class 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 208000029257 vision disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- BCEHBSKCWLPMDN-MGPLVRAMSA-N voriconazole Chemical compound C1([C@H](C)[C@](O)(CN2N=CN=C2)C=2C(=CC(F)=CC=2)F)=NC=NC=C1F BCEHBSKCWLPMDN-MGPLVRAMSA-N 0.000 description 1
- 229960004740 voriconazole Drugs 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/66—Phosphorus compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/69—Boron compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0052—Small organic molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
- C09B23/04—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups one >CH- group, e.g. cyanines, isocyanines, pseudocyanines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B69/00—Dyes not provided for by a single group of this subclass
- C09B69/007—Dyestuffs containing phosphonic or phosphinic acid groups and derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56905—Protozoa
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
- C09K2211/1011—Condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/315—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
- G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Compuestos fluorescentes para diagnóstico de
infecciones, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.
La presente invención describe nuevos compuestos
fluorescentes análogos de alquilfosfolípidos, que contienen en su
estructura grupos fluorescentes de alta fotoestabilidad y que
emiten en la zona de longitudes de onda del espectro visible.
Dichos compuestos se incorporan fácilmente a microorganismos,
permitiendo la detección e identificación de estos organismos
mediante microscopia de fluorescencia. Asimismo, los nuevos
compuestos fluorescentes permiten diagnosticar de forma rápida y
sencilla la presencia de microorganismos patógenos caracterizados
por ser resistentes al tratamiento con alquilfosfolípidos.
Description
Compuestos fluorescentes para diagnóstico de
infecciones, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.
Composiciones farmacéuticas para el diagnóstico
clínico de enfermedades infecciosas, preferentemente oculares y
para identificar la presencia de microorganismos.
La prevención y el correcto tratamiento de
algunas de las enfermedades que afectan al ojo requiere la
identificación de una gran variedad de microorganismos susceptibles
de producir infecciones en dicho órgano. Muchas de estas
infecciones oculares pueden tener consecuencias muy graves para la
visión del paciente infectado, si no se diagnostican y tratan
tempranamente. Con este fin es necesario en algunos casos llevar a
cabo la detección del agente infeccioso directamente en el órgano
infectado, extrayendo del ojo fragmentos representativos del tejido
susceptible de infección (biopsia) o analizando fluidos
fisiológicos en contacto con dichos tejidos (lágrima, en este
caso). Los métodos habituales para la detección de microorganismos
en las muestras citadas se basan, frecuentemente, en realizar
cultivos que incrementen la población del posible microorganismo
patógeno, para facilitar su posterior identificación. Estos cultivos
pueden requerir períodos de tiempo prolongados, de
1-4 días, durante los cuales no se puede tratar al
paciente con medicamentos específicos para su infección, al
desconocerse el organismo causal de la misma. Estos tiempos de
espera tan dilatados pueden llegar a tener consecuencias de extrema
gravedad para el órgano infectado, por lo que sería de gran
utilidad disponer de métodos alternativos de detección que
disminuyan considerablemente el tiempo necesario para realizar el
correcto diagnóstico.
Por otra parte, para la prevención de este tipo
de infecciones es muy importante que aquellos elementos que
eventualmente puedan estar en íntimo contacto con el ojo durante
largos períodos de tiempo, tales como las lentes de contacto y los
líquidos de lavado correspondientes, se conserven y utilicen en
condiciones de higiene elevada que aseguren su esterilidad. De forma
análoga a lo descrito más arriba, para poder obtener información
fiable sobre la posible contaminación de dichas prótesis oculares y
de los medios de conservación de las mismas, frecuentemente es
necesario recurrir a laboriosos métodos de cultivo de
microorganismos. La complejidad de las actuales técnicas de
diagnóstico de estos materiales, basadas en cultivos celulares
limitan en este caso tanto la frecuencia como la extensión de su
aplicación, con el consiguiente aumento del riesgo de infección
para los usuarios.
Asimismo, se han desarrollado técnicas
alternativas de detección de microorganismos infecciosos de tipo
fluorimétrico, basadas en el uso de un compuesto marcador
fluorescente que se adiciona directamente al medio donde se
sospecha la existencia del microorganismo. Si el compuesto marcador
fluorescente se incorpora al microorganismo infeccioso, es posible
determinar la presencia y morfología del mismo utilizando diversos
dispositivos de visualización de fluorescencia, tales como
microscopios o citómetros de flujo (Kawamoto, F., Rapid diagnosis
of malaria by fluorescence microscopy with light microscope and
interference filter. Lancet 1991, 337,
200-202). Como estos dispositivos permiten detectar
intensidades muy pequeñas de fluorescencia, en principio es posible
realizar un diagnóstico correcto con un número de células muy
reducido, disminuyendo de manera considerable el tiempo requerido
para dicha operación. Desgraciadamente, la utilización de este
método directo de marcado fluorescente para la detección de
infecciones en el ojo queda gravemente limitado por la falta de
especificidad en el marcado fluorescente, causado porque la
afinidad de los marcadores fluorescentes tradicionales por
numerosos microorganismos patógenos de interés oftalmológico es muy
similar a la afinidad por células y tejidos del ojo sano,
dificultando la discriminación de la fluorescencia correspondiente a
los organismos patógenos.
El objetivo de la presente invención consiste
precisamente en utilizar un nuevo método sencillo y económico que
permite aumentar la afinidad del marcador fluorescente por el
organismo infeccioso. El nuevo método se basa en utilizar un
marcador fluorescente unido a un tipo de compuestos de estructura
molecular relativamente simple, que muestran mucha más afinidad por
el organismo patógeno que por las células normales sanas del ojo.
Estos compuestos, que se utilizan en la presente invención para la
incorporación selectiva en el organismo patógeno del marcador
fluorescente, pertenecen a la familia de los alquilfosfolípidos, y
entre los mismos se encuentran por ejemplo miltefosina (MT),
edelfosina (ET) e ilmofosina (IM) (Croft, S. L.; Engel, J.,
Miltefosine-discovery of the antileishmanial
activity of phospholipid derivatives. Trans R Soc Trop Med
Hyg 2006, 100 Suppl 1, S4-8).
Miltefosina (MT) se usa actualmente en el
tratamiento de metástasis cutáneas de cáncer de mama, y se
comercializa bajo el nombre de MILTEX. Además, miltefosina muestra
una potente actividad antiparasitaria, por lo que se utiliza para
tratamiento de la leishmaniasis humana (Soto, J.; Soto, P.,
Miltefosine: oral treatment of leishmaniasis. Expert Rev Anti
Infect Ther 2006, 4, (2), 177-85)
comercializándose bajo el nombre de IMPAVIDO (Zentaris S. A.) en
Colombia, India y Alemania. Recientemente se ha iniciado también la
utilización de MT para el tratamiento de leishmaniasis canina,
utilizándose con este fin la composición comercial MILTEFORAN
(Virbac). Por otro lado, se ha observado que la actividad
citotóxica de MT se extiende a otros protozoos, tales como
Trichomonas (Blaha, C.; Duchene, M.; Aspock, H.; Walochnik,
J., In vitro activity of hexadecylphosphocholine
(miltefosine) against metronidazole-resistant and
-susceptible strains of Trichomonas vaginalis. J
Antimicrob Chemother 2006, 57, (2),
273-8), Entamoeba histolytica (Seifert, K.;
Duchene, M.; Wernsdorfer, W. H.; Kollaritsch, H.; Scheiner, O.;
Wiedermann, G.; Hottkowitz, T.; Eibl, H., Effects of miltefosine
and other alkylphosphocholines on human intestinal parasite
Entamoeba histolytica. Antimicrob Agents Chemother
2001, 45, (5), 1505-10), amebas de vida
libre, como Acanthamoeba sp. o Naegleria sp. (Schuster, F.
L.; Guglielmo, B. J.; Visvesvara, G. S.,
In-vitro activity of miltefosine and
voriconazole on clinical isolates of free-living
amebas: Balamuthia mandrillaris, Acanthamoeba spp., and
Naegleria fowleri. J Eukaryot Microbiol 2006, 53,
(2), 121-6; Walochnik, J.; Duchene, M.; Seifert, K.;
Obwaller, A.; Hottkowitz, T.; Wiedermann, G.; Eibl, H.; Aspock, H.,
Cytotoxic activities of alkyiphosphocholines against clinical
isolates of Acanthamoeba spp. Antimicrob Agents
Chemother 2002, 46, (3), 695-701)
patógenas para el hombre así como a otros microorganismos patógenos
humanos, incluyendo hongos, levaduras (Obando, D.; Widmer, F.;
Wright, L. C.; Sorrell, T. C.; Jolliffe, K. A., Synthesis,
antifungal and antimicrobial activity of alkyiphospholipids.
Bioorg Med Chem 2007, 15, (15),
5158-65; Widmer, F.; Wright, L. C.; Obando, D.;
Handke, R.; Ganendren, R.; Ellis, D. H.; Sorrell, T. C.,
Hexadecylphosphocholine (miltefosine) has
broad-spectrum fungicidal activity and is
efficacious in a mouse model of cryptococcosis. Antimicrob Agents
Chemother 2006, 50, (2), 414-21) y
Streptococcus pneumoniae (Llull, D., Rivas, L., García, E.
In vitro bactericidal activity of the antiprotozoal drug
miltefosine against Streptococcus pneumoniae and other
pathogenic streptococci. Antimicrob Agents Chemother.
2007, 51,(5):1844-8).
Se conoce muy poco sobre el mecanismo detallado
mediante el cual miltefosina ejerce sus propiedades citotóxicas en
los organismos citados. Los estudios más recientes sobre algunos
parásitos específicos indican que posiblemente dicho mecanismo sea
del tipo multi-diana, ya que la concentración
intracelular de MT en los mismos es muy elevada, alcanzando en
Leishmania valores en el rango milimolar
(Luque-Ortega, J. R.; Rivas, L., Miltefosine
(hexadecylphosphocholine) inhibits cytochrome c oxidase in
Leishmania donovani promastigotes. Antimicrob Agents
Chemother 2007, 51, (4), 1327-32;Saugar,
J. M.; Delgado, J.; Hornillos, V.; Luque-Ortega, J.
R.; Amat-Guerri, F.; Acuña, A. U.; Rivas, L.,
Synthesis and Biological Evaluation of Fluorescent Leishmanicidal
Analogues of Hexadecylphosphocholine (Miltefosine) as Probes of
Antiparasite Mechanisms. J Med Chem 2007, 50, (24),
5994-6003). Esta hipótesis también se apoya en la
aparición de cepas de Leishmania resistentes a MT que se
caracterizan porque dicha resistencia procede únicamente de defectos
funcionales en los translocadores específicos del fármaco en el
parásito (Seifert, K.; Perez-Victoria, F. J.;
Stettler, M.; Sanchez-Canete, M. P.; Castanys, S.;
Gamarro, F.; Croft, S. L., Inactivation of the miltefosine
transporter, LdMT, causes miltefosine resistance that is conferred
to the amastigote stage of Leishmania donovani and persists
in vivo. Int J Antimicrob Agents 2007, 30,
(3), 229-35; Perez-Victoria, F. J.;
Sanchez-Canete, M. P.; Seifert, K.; Croft, S. L.;
Sundar, S.; Castanys, S.; Gamarro, F., Mechanisms of experimental
resistance of Leishmania to miltefosine: Implications for clinical
use. Drug Resist Updat 2006, 9, (1-2),
26-39; Perez-Victoria, F. J.;
Sanchez-Canete, M. P.; Castanys, S.; Gamarro, F.,
Phospholipid translocation and miltefosine potency require both
L. donovani miltefosine transporter and the new protein
LdRos3 in Leishmania parasites. J Biol Chem 2006,
281, (33), 23766-75; Perez-Victoria,
F. J.; Gamarro, F.; Ouellette, M.; Castanys, S., Functional cloning
of the miltefosine transporter. A novel P-type
phospholipid translocase from Leishmania involved in drug
resistance. J Biol Chem 2003, 278, (50),
49965-71). Estos transportadores específicos
pertenecen a la familia de aminofosfolípido translocasas; sin
embargo la identificación precisa de dicho transportador sólo se ha
realizado en Leishmania donovani
(Perez-Victoria, F. J.; Gamarro, F.; Ouellette, M.;
Castanys, S., Functional cloning of the miltefosine transporter. A
novel P-type phospholipid translocase from
Leishmania involved in drug resistance. J Biol Chem
2003, 278, (50), 49965-71), como LdMT3, y en
Saccharomyces cerevisiae como Lem3 (Hanson, P. K.; Malone,
L.; Birchmore, J. L.; Nichols, J. W., Lem3p is essential for the
uptake and potency of alkylphosphocholine drugs, edelfosine and
miltefosine. J Biol Chem 2003, 278, (38),
36041-50). En Leishmania las mutaciones del
transportador suponen la aparición de resistencia a miltefosina y
edelfosina, cursando con una inhibición concomitante de la
incorporación de miltefosina radioactiva al parásito; sin embargo,
en el caso de pérdida de función de Lem3 de S. cerevisiae,
aparece inhibida la incorporación del fosfolípido fluorescente
NBD–PC, asociada a un fenotipo de resistencia a edelfosina, que se
debe a una incorporación defectuosa del fármaco, aunque tal efecto
no ha sido medido experimentalmente (Hanson, P. K.; Malone, L.;
Birchmore, J. L.; Nichols, J. W., Lem3p is essential for the uptake
and potency of alkylphosphocholine drugs, edelfosine and
miltefosine. J Biol Chem 2003, 278, (38),
36041-50).
Las conclusiones que se derivan de los
anteriores estudios y que son relevantes para la presente invención
se pueden resumir en la forma siguiente: i) MT y otros
alquilfosfolípidos similares se incorporan selectivamente a
eucariotas inferiores y a células transformadas; ii) la acción letal
de estos compuestos está asociada a una incorporación intracelular
masiva de dichos fármacos y iii) los mecanismos de resistencia a MT
que se han identificado hasta el presente en varios tipos de
parásitos están asociados exclusivamente a la acumulación
defectuosa de dicho fármaco a dichos organismos.
Recientemente se ha iniciado el empleo masivo de
MT en pacientes infectados por leishmaniasis visceral en la India y
Nepal, especialmente en pacientes infectados con cepas resistentes
al tratamiento con fármacos antimoniales (Sundar, S.; Chatterjee,
M., Visceral leishmaniasis - current therapeutic modalities.
Indian J Med Res 2006, 123, (3),
345-52); la misma estrategia se utiliza también en
varios países de América del Sur, en el tratamiento de la
leishmaniasis cutánea (Soto, J.; Soto, P., Miltefosine: oral
treatment of leishmaniasis. Expert Rev Anti Infect Ther
2006, 4, (2), 177-85). Debido a las
dificultades para el correcto control hospitalario del tratamiento
en estos entornos, es predecible la rápida aparición de cepas del
parásito resistentes a MT. Experimentos en modelos animales han
demostrado que la virulencia de los parásitos resistentes, debido a
la deficiencia en el translocador de MT, es la misma que la de los
parásitos sensibles al fármaco (Seifert, K.;
Perez-Victoria, F. J.; Stettler, M.;
Sanchez-Canete, M. P.; Castanys, S.; Gamarro, F.;
Croft, S. L., Inactivation of the miltefosine transporter, LdMT,
causes miltefosine resistance that is conferred to the amastigote
stage of Leishmania donovani and persists in vivo.
Int J Antimicrob Agents 2007, 30, (3),
229-35). La disponibilidad de un reactivo y de un
procedimiento rápido y manejable, como el que se propone en la
presente invención, permitirá detectar tempranamente y atajar la
aparición de cepas resistentes.
Por otro lado, el diagnóstico precoz de la
presencia en el ojo de Acanthamoeba, infección amebiana con
una incidencia especialmente elevada en usuarios de lentes de
contacto con hábitos de higiene defectuosos, se realiza actualmente
tras descartar previamente posibles infecciones por herpes y
fúngicas, con el consiguiente daño ocasionado por dicho retraso, que
lleva a veces a la pérdida irreversible de visión (Hammersmith, K.
M., Diagnosis and management of Acanthamoeba keratitis.
Curr Opin Ophthalmol 2006, 17, (4),
327-31).
La aplicación adicional de los compuestos
descritos en la presente invención en el control de calidad de los
líquidos de preservación y lavado de lentes de contacto, así como
de los medios de almacenamiento de córneas para trasplante, se basa
en los mismos principios. Recientemente, una contaminación por
Fusarium del líquido de preservación de lentes afectó
seriamente a un elevado número de pacientes, con las consiguientes
pérdidas económicas para el fabricante (Chang, D. C.; Grant, G. B.;
O'Donnell, K.; Wannemuehler, K. A.; Noble-Wang, J.;
Rao, C. Y.; Jacobson, L. M.; Crowell, C. S.; Sneed, R. S.; Lewis,
F. M.; Schaffzin, J. K.; Kainer, M. A.; Genese, C. A.; Alfonso, E.
C.; Jones, D. B.; Srinivasan, A.; Fridkin, S. K.; Park, B. J.,
Multistate outbreak of Fusarium keratitis associated with use of a
contact lens solution. JAMA 2006, 296, (8),
953-63; Centers for Disease Control and Prevention
(CDC), Update: Fusarium keratitis-United States,
2005-2006. MMWR Morb Mortal Wkly Rep
2006, 55, (20), 563-4).
Las poblaciones de protozoos de vida libre
constituyen organismos centinelas de la calidad del agua, así como
de la contaminación ambiental (Martin-Cereceda, M.;
Perez-Uz, B.; Serrano, S.; Guinea, A., Dynamics of
protozoan and metazoan communities in a full scale wastewater
treatment plant by rotating biological contactors. Microbiol
Res 2001, 156, (3), 225-38), por lo que
la detección y visualización de estos microorganismos mediante el
compuesto de la invención se facilitarían tras su concentración e
incorporación del análogo fluorescente.
Existen estudios previos en los que se han
sintetizado y utilizado análogos fluorescentes de
alquilfosfolípidos:
1.- Se han preparado previamente análogos de un
compuesto similar (edelfosina), marcados con grupos feniltetraeno,
y se ha observado que dicho marcador no altera sustancialmente la
bioactividad del fármaco original (Quesada, E.; Delgado, J.;
Gajate, C.; Mollinedo, F.; Acuña, A. U.;
Amat-Guerri, F., Fluorescent phenylpolyene
analogues of the ether phospholipid edelfosine for the selective
labeling of cancer cells. J Med Chem 2004, 47, (22),
5333-5).
2.- Se han preparado análogos de MT con dichos
grupos marcadores feniltetraeno o feniltrienino que mantienen las
propiedades antiparasitarias del fármaco original y, además, se
incorporan específicamente a parásitos procedentes de cepas de
Leishmania sensibles al fármaco, pero no a los procedentes
de cepas resistentes (Saugar, J. M.; Delgado, J.; Hornillos, V.;
Luque-Ortega, J. R.; Amat-Guerri,
F.; Acuña, A. U.; Rivas, L., Synthesis and Biological Evaluation of
Fluorescent Leishmanicidal Analogues of Hexadecylphosphocholine
(Miltefosine) as Probes of Antiparasite Mechanisms. J Med
Chem 2007, 50, (24), 5994-6003).
3.- Se ha utilizado el análogo fluorescente de
pentamidina DB-99 para la detección temprana de
organismos resistentes al tratamiento con fármacos arsenicales en
la tripanosomiasis africana (Stewart, M. L.; Krishna, S.;
Burchmore, R. J.; Brun, R.; de Koning, H. P.; Boykin, D. W.;
Tidwell, R. R.; Hall, J. E.; Barrett, M. P., Detection of arsenical
drug resistance in Trypanosoma brucei with a simple
fluorescence test. Lancet 2005, 366, (9484),
486-7). En Trypanosoma brucei, el
microorganismo causante de dicha infección, la entrada de
pentamidina y de DB99 al interior del parásito se realiza a través
del mismo transportador de fármacos arsenicales. En consecuencia, la
ausencia o disfunción de dicho transportador supone la inhibición
de la internalización de pentamidina y de DB-99 y,
por tanto, la inhibición del marcado fluorescente del mismo, así
como la aparición de un fenotipo de resistencia a fármacos
arsenicales.
Un aspecto de la invención lo constituye un
compuesto fluorescente útil para la identificación diferencial de
microorganismos, en adelante compuesto de la invención, que
comprende un análogo de un alquilfosfolípido con un grupo
fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de
longitudes de onda del espectro visible.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "análogo de alquilfosfolípido" se refiere a un
compuesto obtenido por síntesis y cuya estructura se parece a la de
un alquilfosfolípido. Tal como se utiliza en la presente invención
el término "alquilfosfolípido" se refiere a un compuesto que
incluye en su estructura un resto lipofílico, formado por
combinaciones lineales o cíclicas de átomos de carbono e hidrógeno
(parte alquílica) unido a un resto hidrofílico, formado por un
grupo fosfato esterificado o libre (fosfolípido). Entre los
alquilfosfolípidos se encuentran, a título ilustrativo y sin que
limite el alcance de la invención: hexadecilfosfocolina
(miltefosina, MT),
1-O-octadecil-2-O-metil-sn-glicero-3-fosfocolina
(edelfosina, EF) y
1-S-hexadecil-2-metoximetil-rac-glicero-3-fosfocolina
(ilmofosina, IM). Ejemplos de análogos de alquilfosfolípidos son, a
título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención,
todo-(E)-13-feniltrideca-6,8,10,12-tetraenilfosfocolina
y
todo-(E)-13-feniltrideca-8,10,12-trien-6-inilfosfocolina.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "microorganismo" se refiere a cualquier protozoo,
ameba, hongo, levadura y bacteria, perteneciente, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: Leishmania sp, Trypanosoma brucei, Trypanosoma
cruzi, Trichomonas sp., Entamoeba histolytica, Acanthamoeba sp.,
Naegleria sp., Streptococcus pneumoniae, Fusarium sp., Tetrahymena
pyriformis, Balamuthia.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "grupo fluorescente" se refiere a un grupo
fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de
longitudes de onda del espectro visible, entre los que se
encuentran, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención: borodipirrometenos, xantenos, rodaminas, cianinas,
oxacinas, porfirinas, cumarinas e hidrocarburos policíclicos, con o
sin sustituyentes.
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el análogo de
alquilfosfolípido es miltefosina (MT), edelfosina (EF) o ilmofosina
(IM).
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el análogo de
alquilfosfolípido es un análogo de miltefosina (MT), edelfosina
(EF) o ilmofosina (IM).
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el grupo
fluorescente es borodipirrometeno (BDP) libre o sustituido.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el derivado de
alquilfosfolípido es miltefosina y el grupo fluorescente es BDP
libre o sustituido.
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye el compuesto de la invención BDP-MT o
Et-BDP-MT.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un procedimiento de obtención del compuesto de la
invención que comprende las siguientes etapas:
i) obtención del correspondiente
\alpha-H-pirrol sustituido a
partir de un dicetoalcohol y acetoacetato de etilo,
ii) condensación del
\alpha-H-pirrol con el adecuado
\alpha-formilpirrol,
iii) reacción del dipirrometeno así formado con
eterato de trifluoruro de boro,
iv) introducción del grupo fosfocolina.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye el uso de un compuesto de la invención en la elaboración
de una composición farmacéutica útil para un procedimiento de
identificación de microorganismos.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye la composición farmacéutica de diagnóstico, en adelante
composición farmacéutica de diagnóstico de la invención, que
comprende un compuesto de la invención, por ejemplo el compuesto
BDP-MT o
Et-BDP-MT.
Finalmente, otro aspecto particular de la
invención es el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico
de la invención, en adelante uso de la composición farmacéutica de
la invención, en un procedimiento de identificación de
microorganismos.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico de
la invención en un procedimiento de diagnóstico ex vivo a
partir de muestras biológicas humanas o veterinarias de individuos
portadores de enfermedades infecciosas pertenecientes, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: queratitis oculares, leishmaniasis, tripanosomiasis
africana y americana, neumonía por Streptococcus pneumoniae,
amebiasis, trichomoniasis y micosis.
Otra realización más particular lo constituye el
uso de la composición farmacéutica de la invención en el que la
enfermedad infecciosa está provocada por un microorganismo
perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la invención, al siguiente grupo: Leishmania sp, Trypanosoma
brucei, Trypanosoma cruzi, Trichomonas sp., Entamoeba histolytica,
Acanthamoeba sp., Naegleria sp., Streptococcus pneumoniae, Fusarium
sp., Tetrahymena pyriformis, Balamuthia.
Otra realización más particular de la invención
lo constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico
de la invención en el que el procedimiento de diagnóstico se lleva
a cabo sobre una muestra biológica de origen ocular, por ejemplo,
obtenida por un raspado corneal.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico de
la invención en el que el procedimiento se corresponde con la
identificación de microorganismos en muestras no humanas ni
animales, por ejemplo en aguas, prótesis oculares, lentes de
contacto, líquidos de limpieza de lentes de contacto o medios de
preservación de córneas.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que análogos bioactivos de
alquilfosfolípidos, como por ejemplo los compuestos
BDP-MT o Et-BDP-MT,
que contienen en su estructura grupos fluorescentes de alta
fotoestabilidad y que emiten en la zona de longitudes de onda del
espectro visible de 400-700 nm (Slavik, J.,
Fluorescent Probes in Cellular and Molecular Biology 1ed.;
CRC Press: Boca Raton, FL, 2004; p 320), se incorporan fácilmente a
microorganismos, y que esta incorporación es detectable con
microscopios de fluorescencia convencionales. Así, un experto en
diagnóstico visual podría identificar fácilmente la presencia de
microorganismos, por ejemplo hongos, protozoos, e incluso
determinadas bacterias, como Streptococccus pneumoniae etc.,
capaces de incorporar dichos compuestos. Asimismo, una vez
identificada la especie, el experto podría deducir la posible
resistencia a un tratamiento con alquilfosfolípidos, que se
relacionaría directamente con una deficiente incorporación del
compuesto y un fenotipo de resistencia a la acción citotóxica de
alquilfosfolípidos.
Con este fin es suficiente añadir el análogo
fluorescente al medio o tejido en el que se sospecha la presencia
de microorganismos. Por ejemplo, mediante la aplicación directa
sobre la córnea de la composición farmacéutica que comprende el
compuesto. En caso afirmativo, dichos microorganismos se marcan
rápidamente con el análogo fluorescente, permitiendo su
identificación visual mediante los métodos habituales de
observación microscópica. Además, si los organismos contienen el
transportador específico del fármaco original MT, se observa la
rápida aparición de fluorescencia en el interior del mismo. Por el
contrario, si el organismo es resistente al fármaco MT, en las
mismas condiciones no se observa fluorescencia en el interior del
parásito. De esta forma se dispone de un método de diagnóstico
rápido y sencillo de la presencia de dichos microorganismos y/o de
su resistencia al fármaco MT.
Más concretamente, y como ejemplo particular de
la invención, se han sintetizado y ensayado biológicamente una
serie de análogos fluorescentes de MT, caracterizados porque
incorporan un grupo fluorescente borodipirrometeno (BDP) a la
cadena alifática de dicho compuesto (ver ejemplos). Cuando se
adicionan dichos análogos emisores a un medio fisiológico en el que
están presentes trofozoítos de Acanthamoeba e hifas y
conidios de hongos, se incorporan rápidamente a ambos tipos de
organismos, permitiendo su correcta visualización y la consiguiente
identificación individual, basada en sus características
morfológicas. Este método facilitaría el diagnóstico diferencial de
microorganismos en el ojo, ya que es posible aplicar dichos
compuestos en forma de colirio a dicho órgano, para la observación
directa. Asimismo, el método mencionado es aplicable al diagnóstico
de la presencia de dichos organismos en muestras procedentes de
tejidos o fluidos biológicos, por ejemplo raspados corneales, o
para el análisis de líquidos de preservación de trasplantes de
córnea o de líquidos de preservación e higiene de lentes de
contacto.
A continuación se mencionan aplicaciones
posibles de estos compuestos, fundamentadas en los estudios
realizados hasta el momento y resumidos en el estado de la
técnica:
1.- Diagnóstico rápido y fiable de enfermedades
de la visión, como queratitis oculares provocadas por infecciones
fúngicas o amebianas (Acanthamoeba sp).
2.- Diagnóstico rápido y fiable de posibles
contaminaciones en prótesis oculares (lentes de contacto, etc.),
líquidos de limpieza de lentes de contacto o medios de preservación
de córneas, a partir de la detección de la presencia de organismos
patógenos en dichos medios.
3.- Diagnóstico rápido de pacientes y animales
(perro) infectados con cepas de Leishmania resistentes al
fármaco antiparasitario miltefosina, a partir de la detección de
parásitos resistentes, tanto en fluidos fisiológicos, incluyendo
sangre periférica, como en muestras y biopsias de tejidos
procedentes de dichos pacientes.
4.- Diagnóstico rápido del grado de higiene
medioambiental, a partir de la identificación de protozoos de vida
libre en medios acuosos de relevancia medioambiental.
5.- Investigación a nivel macroscópico y
molecular, mediante técnicas de bioimagen, de propiedades
farmacológicas y biológicas de miltefosina y alquilfosfolípidos
similares, tanto en estudios celulares como en animales de
experimentación, basados en la identificación diferencial de la
fluorescencia de dichos análogos en los diferentes órganos y
tejidos del animal de experimentación.
Por lo tanto, un aspecto de la invención lo
constituye un compuesto fluorescente útil para la identificación
diferencial de microorganismos, en adelante compuesto de la
invención, que comprende un análogo de un alquilfosfolípido con un
grupo fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona
de longitudes de onda del espectro visible.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "análogo de alquilfosfolípido" se refiere a un
compuesto obtenido por síntesis y cuya estructura se parece a la de
un alquilfosfolípido. Tal como se utiliza en la presente invención
el término "alquilfosfolípido" se refiere a un compuesto que
incluye en su estructura un resto lipofílico, formado por
combinaciones lineales o cíclicas de átomos de carbono e hidrógeno
(parte alquílica) unido a un resto hidrofílico, formado por un
grupo fosfato esterificado o libre (fosfolípido). Entre los
alquilfosfolípidos se encuentran, a título ilustrativo y sin que
limite el alcance de la invención: hexadecilfosfocolina
(miltefosina, MT),
1-O-octadecil-2-O-metil-sn-glicero-3-fosfocolina
(edelfosina, EF) y
1-S-hexadecil-2-metoximetil-rac-glicero-3-fosfocolina
(ilmofosina, IM). Ejemplos de análogos de alquilfosfolípidos son, a
título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención,
todo-(E)-13-feniltrideca-6,8,10,12-tetraenilfosfocolina
y
todo-(E)-13-feniltrideca-8,10,12-trien-6-inilfosfocolina.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "microorganismo" se refiere a cualquier protozoo,
ameba, hongo, levadura y bacteria, perteneciente, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: Leishmania sp, Trypanosoma brucei, Trypanosoma
cruzi, Trichomonas sp., Entamoeba histolytica, Acanthamoeba sp.,
Naegleria sp., Streptococcus pneumoniae, Fusarium sp., Tetrahymena
pyriformis, Balamuthia.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "grupo fluorescente" se refiere a un grupo
fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de
longitudes de onda del espectro visible, entre los que se
encuentran, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención: borodipirrometenos, xantenos, rodaminas, cianinas,
oxacinas, porfirinas, cumarinas e hidrocarburos policíclicos, con o
sin sustituyentes.
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el análogo de
alquilfosfolípido es miltefosina (MT), edelfosina (EF) o ilmofosina
(IM).
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el análogo de
alquilfosfolípido es un análogo de miltefosina (MT), edelfosina
(EF) o ilmofosina (IM).
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el grupo
fluorescente es borodipirrometeno (BDP) libre o sustituido.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un compuesto de la invención en el que el derivado de
alquilfosfolípido es miltefosina y el grupo fluorescente es BDP
libre o sustituido.
Un aspecto más particular de la invención lo
constituye el compuesto de la invención BDP-MT o
Et-BDP-MT.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un procedimiento de obtención del compuesto de la
invención que comprende las siguientes etapas:
i) obtención del correspondiente
\alpha-H-pirrol sustituido a
partir de un dicetoalcohol y acetoacetato de etilo,
ii) condensación del
\alpha-H-pirrol con el adecuado
\alpha-formilpirrol,
iii) reacción del dipirrometeno así formado con
eterato de trifluoruro de boro,
iv) introducción del grupo fosfocolina.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye el uso de un compuesto de la invención en la elaboración
de una composición farmacéutica útil para un procedimiento de
identificación de microorganismos.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye la composición farmacéutica de diagnóstico, en adelante
composición farmacéutica de diagnóstico de la invención, que
comprende un compuesto de la invención, por ejemplo el compuesto
BDP-MT o
Et-BDP-MT.
Finalmente, otro aspecto particular de la
invención es el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico
de la invención, en adelante uso de la composición farmacéutica de
la invención, en un procedimiento de identificación de
microorganismos.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico de
la invención en un procedimiento de diagnóstico ex vivo a
partir de muestras biológicas humanas o veterinarias de individuos
portadores de enfermedades infecciosas pertenecientes, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: queratitis oculares, leishmaniasis,
tripanosomiasis africana y americana, neumonía por Streptococcus
pneumoniae, amebiasis, trichomoniasis y micosis.
Otra realización más particular lo constituye el
uso de la composición farmacéutica de la invención en el que la
enfermedad infecciosa está provocada por un microorganismo
perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la invención, al siguiente grupo: Leishmania sp, Trypanosoma
brucei, Trypanosoma cruzi, Trichomonas sp., Entamoeba histolytica,
Acanthamoeba sp., Naegleria sp., Streptococcus pneumoniae, Fusarium
sp., Tetrahymena pyriformis, Balamuthia.
Otra realización más particular de la invención
lo constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico
de la invención en el que el procedimiento de diagnóstico se lleva
a cabo sobre una muestra biológica de origen ocular, por ejemplo,
obtenida por un raspado corneal.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de diagnóstico de
la invención en el que el procedimiento se corresponde con la
identificación de microorganismos en muestras no humanas ni
animales, por ejemplo en aguas, prótesis oculares, lentes de
contacto, líquidos de limpieza de lentes de contacto o medios de
preservación de córneas.
Figura 1.- Síntesis de los análogos
fluorescentes de BDP-MT y Et-BDP-
MT, a través de los intermedios 1 a 5.
Figura 2.- Detección diferencial de
resistencia a miltefosina en promastigotes de L. donovani
(cepa MHOM/ET/67/ L82). Promastigotes de L.
donovani sensibles (WT) (fila superior) o resistentes a MT (R40)
(fila inferior) se incubaron con BDP-MT 7.5 \muM
durante 2 h a 26ºC, se lavaron con seroalbúmina bovina (BSA) tres
veces, y se examinaron por microscopía confocal utilizando 488 nm
como longitud de excitación y 502-555 nm como
entorno de lectura de la emisión.
Figura 3.- Tinción diferencial de las dos
formas diferenciales de Acanthamoeba castellanii por
BDP-MT. Quistes (a) y trofozoítos (b) de A.
castellanii se incubaron a 32ºC con 5 \muM
BDP-MT durante 15 min, se lavaron con una
disolución de BSA (10 mg/mL) y se observaron en un microscopio
confocal, utilizando 488 nm como longitud de onda de excitación y
detectando la emisión en el intervalo 502-555
nm.
Figura 4.- Tinción simultánea diferencial por
BDP-MT de Fusarium y las dos formas de
Acanthamoeba castellanii . Trofozoítos (a) y quistes (b)
de A. castellanii conjuntamente con Hifas de Fusarium
sp. (c) se incubaron 15 minutos con 5 \muM
BDP-MT y se lavaron con BSA. Se observaron en un
microscopio confocal utilizando 488 nm como longitud de onda de
excitación y detectando la emisión en el intervalo
502-555 nm.
Figura 5.- Tinción simultánea diferencial por
Et-BDP-MT de Fusarium y las dos
formas de Acanthamoeba castellanii . Trofozoítos (a) y
quistes (b) de A. castellanii conjuntamente con hifas de
Fusarium sp (c) se incubaron 15 minutos a 30ºC con 5 \muM
Et-BDP-MT y se lavaron con BSA. La
fluorescencia se observó mediante un microscopio de
epifluorescencia con cámara CCD, y filtro de emisión de
480-520 nm.
Figura 6.- Tinción por BDP-MT
de Tetrahymena pyriformis, como protozoo de vida libre.
Tetrahymena pyriformis se incubó con 5 \muM
BDP-MT durante 4 h, y se lavó y se fijó con
paraformaldehído al 2%, para evitar movimientos durante el proceso
de adquisición de imágenes. Las células se observaron en un
microscopio confocal utilizando 488 nm como longitud de onda de
excitación y detectando la emisión en el intervalo
502-555 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos dos análogos fluorescentes con el
cromóforo borodipirrometeno (BDP) se obtienen por un procedimiento
similar en dos pasos, partiendo de los pirroles correspondientes
(Figura 1). Así, se condensa el \alpha-H pirrol 3
con
2-formil-3,5-dimetil-1H-pirrol
o con
2-formil-3,5-dimetil-4-etil-1H-pirrol
en presencia de oxicloruro de fósforo (reacción de MacDonald). Los
correspondientes dipirrometenos formados se convierten in
situ en los respectivos colorantes BDP sustituidos 4 y 5
mediante reacción con eterato de trifluoruro de boro en presencia
de trietilamina. En un último paso sintético se introduce el grupo
fosfocolina por reacción con
2-cloro-1,3,2-dioxafosfolano-2-óxido
en presencia de trimetilamina. Los precursores se obtienen como
sigue: el dicetoalcohol 1 se alcanza por monoalquilación de
acetilacetona con
11-bromo-1-undecanol
en acetona, en presencia de carbonato potásico y el éter corona
18-crown-6; el etoxicarbonilpirrol 2
se prepara en dos pasos: 1) acetoacetato de etilo se trata con
nitrito sódico, y 2) el hidroxi-imino compuesto
obtenido se reduce con zinc/ácido acético (síntesis de
Johnson-Knorr) en presencia de 1. El
\alpha-H pirrol 3 se obtiene por descarboxilación
de 2 por tratamiento con hidróxido sódico en agua/etanol.
2-Formil-3,5-dimetil-1H-pirrol
es un producto comercial, mientras que su homólogo
2-formil-4-etil-3,5-dimetil-1H-pirrol
se obtiene por formilación de
2,5-dimetil-3-etil-1H-pirrol
(kriptopirrol) con oxicloruro de fósforo en dimetilformamida.
\vskip1.000000\baselineskip
Los promastigotes de L. donovani cepa
MHOM/ET/67/L82 y su cepa resistente a miltefosina fueron
proporcionados por el Prof Simon Croft (London School of Tropical
Hygiene and Medicine, Londres, UK) y se cultivaron conforme a
métodos habituales: 26ºC en medio RPMI suplementado con 10% suero
fetal bovino inactivado, gentamicina, penicilina y 2 mM glutamina.
La cepa resistente a MT se creció de forma idéntica a la parental
sensible a MT, excepto por la adición de 40 \muM MT en el medio
de crecimiento. Ambos tipos de parásitos se recogieron en fase
estacionaria, se lavaron con medio RPMI 1640 carente de rojo fenol,
y se incubaron en dicho medio durante 2 horas a 26ºC a una densidad
de 2 x 10^{6} parásitos/mL, al que se adicionó 7.5 \muM
BDP-MT. A continuación se sometieron a tres lavados
con dicho medio en presencia de BSA libre de ácidos grasos, a 10
mg/mL, y finalmente se detectaron in vivo en un microscopio
confocal Leica
TCS-SP2-AOBS-UV,
utilizando 488 nm como longitud de onda de excitación y
502-555 nm como entorno de lectura de la
emisión.
Se puede observar en la Figura 2 que los
parásitos de la cepa sensible muestran una intensa fluorescencia
intracelular, mientras que los que proceden de la cepa resistente
muestran una débil fluorescencia, debido a la escasa incorporación
del análogo marcador BDP-MT.
Los trofozoítos y quistes de A.
castellanii fueron proporcionados por la Dra Carmen del Águila,
Universidad San Pablo CEU, Madrid. Los trofozoítos se crecieron en
medio CDC suplementado con suero fetal bovino al 5% a 27ºC,
posteriormente se lavaron en dicho medio en ausencia de suero fetal
bovino y se incubaron en el mismo medio durante 15 minutos a una
densidad de 7 x 10^{5} trofozoítos a 32ºC con 5 \muM
BDP-MT. Tras dicha incubación, se lavaron en el
mismo medio con 10 mg/mL de BSA y se observaron in vivo en un
microscopio confocal Leica
TCS-SP2-AOBS-UV,
utilizando 488 nm como longitud de onda de excitación y
502-555 nm como entorno de lectura de la
emisión.
Se puede observar en la Figura 3 que los
trofozoítos de A. castellanii, que constituyen la forma
metabólicamente activa del parásito, muestran un intenso marcado
fluorescente intracelular debido a la elevada incorporación de
BDP-MT. En el caso de los quistes, se observa en
dicha figura que la tinción fluorescente se concentra en la
superficie. Como este experimento se llevó a cabo con organismos
vivos, existen pequeñas diferencias de posición entre las imágenes
consecutivas de transmisión y de fluorescencia, debidas a la
movilidad de los trofozoítos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las hifas del hongo Fusarium se
mantuvieron en agarosa con medio de Saboroud. La expansión celular
se realizó a 32ºC en medio RPMI 1640 con antibióticos y sin
suplementar con suero fetal bovino. Tras lavado, las hifas se
resuspendieron durante 15 minutos a 32ºC en idéntico medio sin rojo
fenol y en presencia de BDP-MT 5 \muM. A
continuación, se lavaron tres veces con BSA y se observaron in
vivo en un microscopio confocal Leica
TCS-SP2-AOBS-UV,
utilizando 488 nm como longitud de onda de excitación y
502-555 nm como entorno de lectura de la emisión.
Las imágenes fluorescentes que se observan tras la incorporación de
BDP-MT son muy diferentes para las tres formas,
hifas, trofozoítos y quistes. En el caso de las hifas, se aprecia
nítidamente su morfología alargada característica, mientras que en
el caso de trofozoítos de A. castellanii, de tamaño
considerablemente menor, se observan formas irregulares; en ambos
casos se aprecia la incorporación intracelular del análogo
fluorescente. En el caso de los quistes de A. castellanii, de
forma esencialmente esférica, se observa el marcado fluorescente
únicamente en la superficie del organismo, como ya se comentó en el
ejemplo anterior.
El método de marcado fluorescente de organismos
patógenos demostrado más arriba, en el que se utilizaba el
compuesto BDP-MT, puede llevarse a cabo también
utilizando otros análogos, en los que, alterando la estructura del
grupo fluorescente, se consigue que tanto la longitud de onda de
excitación como la de emisión aparezcan en otras zonas diferentes
del espectro visible. Para ilustrar esta extensión en el presente
ejemplo se utiliza el análogo
Et-BDP-MT, en el que tanto la
excitación como la emisión ocurren a longitudes de onda desplazadas
hacia el rojo, en comparación con las del análogo
BDP-MT. Los tres paneles de la Figura 5 contienen
ejemplos representativos de organismos teñidos con
Et-BDP-MT, y allí se muestran
trofozoítos de Acanthamoeba castellanii (A), quistes de
Acanthamoeba castellanii (B), e hifas de Fusarium
(C). En todos los casos los microorganismos se marcaron
manteniéndolos en presencia del análogo
Et-BDP-MT, 5 \muM, durante 30
minutos. A continuación se lavaron con medio conteniendo BSA 10
mg/mL y se fotografiaron utilizando una Cámara CCD Digital Leica
DFC350FX acoplada a un microscopio Zeiss de epifluorescencia, con
un filtro de emisión de 480-520 nm.
En todos los casos se observa un patrón de
fluorescencia muy similar al obtenido para BDP-MT;
los trofozoítos de A. castellanii con marcado intracelular,
los quistes del mismo microorganismo no dañados con marcado tenue
superficial, y marcado de hifas de Fusarium, lo que demuestra
que los datos obtenidos para BDP-MT son fácilmente
extrapolables a otros compuestos estructuralmente similares.
Células del protozoo Tetrahymena
pyriformis se multiplicaron en el medio Proteasa Peptona
Glucosa Medium, y se recogieron por centrifugación a una densidad
de 10^{4} células/mL. A continuación se incubaron con
BDP-MT 5 \muM durante 4 h, se lavaron y fijaron
con paraformaldehído al 2% durante 30 minutos y se observaron con
un microscopio confocal Leica
TCS-SP2-AOBS-UV,
utilizando 488 nm como longitud de onda de excitación y
502-555 nm como entorno de lectura de la
emisión.
Como puede observarse en la Figura 6, el
microorganismo incorpora una gran cantidad de compuesto
fluorescente, lo que permite su identificación y localización,
incluso a concentraciones celulares muy bajas.
Claims (17)
1. Compuesto fluorescente útil para la
identificación diferencial de microorganismos caracterizado
porque comprende un derivado de alquilfosfolípido y un grupo
fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de
longitudes de onda del espectro visible.
2. Compuesto fluorescente según la
reivindicación 1 caracterizado porque el análogo de
alquilfosfolípido es la miltefosina (MT), edelfosina (EF) o
ilmofosina (IM).
3. Compuesto fluorescente según la
reivindicación 1 caracterizado porque el análogo de
alquilfosfolípido es un análogo de la miltefosina (MT), edelfosina
(EF) o ilmofosina (IM).
4. Compuesto fluorescente según reivindicación
1 caracterizado porque el grupo fluorescente es un grupo
fluorescente de elevada fotoestabilidad que emite en la zona de
longitudes de onda del espectro visible, entre los que se
encuentran, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención: borodipirrometenos, xantenos, rodaminas, cianinas,
oxacinas, porfirinas, cumarinas e hidrocarburos policíclicos, con o
sin sustituyentes.
5. Compuesto fluorescente según las
reivindicaciones 1 a la 4 caracterizado porque el grupo
fluorescente es borodipirrometeno (BDP) libre o sustituido
caracterizado por la fórmula general:
en
donde:
R^{1} = H, alquilo (lineal, no lineal, libre o
sustituido), arilo o heteroarilo (libre o sustituido), y R^{2} =
alquil-, alquenil- o alquinil-fosfolípido.
6. Compuesto fluorescente según reivindicación
5 caracterizado porque R' es un hidrógeno o un etilo.
7. Compuesto fluorescente según las
reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque el análogo de
alquilfosfolípido es miltefosina y el grupo fluorescente es BDP
libre o sustituido, caracterizado por la fórmula general:
en
donde:
R^{1} = H, alquilo (lineal, no lineal, libre o
sustituido), arilo o heteroarilo (libre o sustituido).
8. Compuesto fluorescente según reivindicación
7 caracterizado porque R^{1} es un hidrógeno (compuesto
BDP-MT) o un radical etilo (compuesto
Et-BDP-MT).
9. Procedimiento de obtención de un compuesto
fluorescente caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
i) obtención del correspondiente
\alpha-H-pirrol sustituido a
partir de un dicetoalcohol y acetoacetato de etilo,
ii) condensación del
\alpha-H-pirrol con el adecuado
\alpha-formilpirrol,
iii) reacción del dipirrometeno así formado con
eterato de trifluoruro de boro,
iv) introducción del grupo fosfocolina.
10. Uso de un compuesto fluorescente según
reivindicaciones 1 a 8 en la elaboración de una composición
farmacéutica útil para un procedimiento de identificación de
microorganismos.
11. Composición farmacéutica de diagnóstico
caracterizada porque comprende un compuesto según
reivindicaciones 1 a 8.
12. Composición farmacéutica de diagnóstico
según la reivindicación 11 caracterizada porque comprende,
al menos, uno de los siguientes compuestos: BDP-MT
y Et-BDP-MT.
13. Uso de la composición farmacéutica de
diagnóstico según las reivindicaciones 11 y 12 en un procedimiento
de identificación de microorganismos.
14. Uso de la composición farmacéutica de
diagnóstico según reivindicación 13 en un procedimiento de
diagnóstico ex vivo a partir de muestras biológicas humanas
o veterinarias de individuos portadores de enfermedades infecciosas
pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la invención, al siguiente grupo: queratitis oculares,
leishmaniasis, tripanosomiasis africana y americana, neumonía por
Streptococcus pneumoniae, amebiasis, trichomoniasis y
micosis.
15. Uso de la composición farmacéutica de
diagnóstico según reivindicación 14 caracterizado porque la
enfermedad infecciosa está provocada por un microorganismo
perteneciente al siguiente grupo: Leishmania sp, Trypanosoma
brucei, Trypanosoma cruzi Trichomonas sp., Entamoeba histolytica,
Acanthamoeba sp., Naegleria sp., Streptococcus pneumoniae, Fusarium
sp., Tetrahymena pyriformis, Balamuthia.
16. Uso de la composición farmacéutica de
diagnóstico según reivindicación 14 en un procedimiento de
diagnóstico sobre una muestra biológica de origen ocular, por
ejemplo, obtenida por un raspado corneal.
17. Uso de la composición farmacéutica de
diagnóstico según reivindicación 13 en un procedimiento de
identificación de microorganismos en muestras no humanas ni
animales, por ejemplo en aguas, prótesis oculares, lentes de
contacto, líquidos de limpieza de lentes de contacto o medios de
preservación de córneas.
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200800951A ES2326458B1 (es) | 2008-04-04 | 2008-04-04 | Compuestos fluorescentes para diagnostico de infecciones, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. |
US12/936,224 US20110086369A1 (en) | 2008-04-04 | 2009-03-30 | Fluorescent compounds for the diagnosis of infections, production method, and applications thereof |
CN2009801211149A CN102124076A (zh) | 2008-04-04 | 2009-03-30 | 用于诊断感染的荧光化合物、其制备方法和应用 |
EP09728879A EP2280052A4 (en) | 2008-04-04 | 2009-03-30 | FLUORESCENT COMPOUNDS FOR THE DIAGNOSIS OF INFECTIONS, THEIR PREPARATION AND USES |
PCT/ES2009/070077 WO2009121993A1 (es) | 2008-04-04 | 2009-03-30 | Compuestos fluorescentes para diagnóstico de infecciones, procedimiento de obtención y sus aplicaciones |
JP2011502402A JP2011516652A (ja) | 2008-04-04 | 2009-03-30 | 感染症を診断するための蛍光性化合物、方法及びこれらの適用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200800951A ES2326458B1 (es) | 2008-04-04 | 2008-04-04 | Compuestos fluorescentes para diagnostico de infecciones, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2326458A1 ES2326458A1 (es) | 2009-10-09 |
ES2326458B1 true ES2326458B1 (es) | 2010-07-26 |
Family
ID=41112772
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200800951A Expired - Fee Related ES2326458B1 (es) | 2008-04-04 | 2008-04-04 | Compuestos fluorescentes para diagnostico de infecciones, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110086369A1 (es) |
EP (1) | EP2280052A4 (es) |
JP (1) | JP2011516652A (es) |
CN (1) | CN102124076A (es) |
ES (1) | ES2326458B1 (es) |
WO (1) | WO2009121993A1 (es) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5702366B2 (ja) * | 2009-05-11 | 2015-04-15 | セレクター,インコーポレイティド | 蛍光リン脂質エーテル化合物、組成物、及びその使用 |
US8871181B2 (en) | 2009-05-11 | 2014-10-28 | Cellectar, Inc. | Fluorescent phospholipid ether compounds, compositions, and methods of use |
US20180221407A1 (en) * | 2017-02-03 | 2018-08-09 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Ophthalmic compositions for therapeutic and prophylactic uses |
WO2019175663A1 (en) * | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Menicon Co. Ltd. | Method for generating a contact lens recommendation |
WO2019175660A1 (en) * | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Menicon Co. Ltd. | Method for detecting a health condition with biomarkers |
GB2594907B (en) * | 2019-08-15 | 2024-01-31 | Univ Of The West Of Scotland | Composition comprising anti-acanthamoeba agents |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4774339A (en) * | 1987-08-10 | 1988-09-27 | Molecular Probes, Inc. | Chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes |
US5322794A (en) * | 1993-02-16 | 1994-06-21 | Lesley Davenport | Fluorescent phospholipid analogs and fatty acid derivatives |
TWI246848B (en) | 2003-07-03 | 2006-01-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | Image formation device |
WO2006119121A2 (en) * | 2005-04-29 | 2006-11-09 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Cell-surface decoration with active agents |
-
2008
- 2008-04-04 ES ES200800951A patent/ES2326458B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-03-30 US US12/936,224 patent/US20110086369A1/en not_active Abandoned
- 2009-03-30 WO PCT/ES2009/070077 patent/WO2009121993A1/es active Application Filing
- 2009-03-30 CN CN2009801211149A patent/CN102124076A/zh active Pending
- 2009-03-30 EP EP09728879A patent/EP2280052A4/en not_active Withdrawn
- 2009-03-30 JP JP2011502402A patent/JP2011516652A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JOSE M. SAUGAR et al. Synthesis and biological evaluation of fluorescent leishmanicidal analogues of hexadecylphosphocholine (miltefosine) as probes of antiparasite mechanims. J. Med. Chem 2007, vol, 50, páginas 5994-6003. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20110086369A1 (en) | 2011-04-14 |
CN102124076A (zh) | 2011-07-13 |
JP2011516652A (ja) | 2011-05-26 |
ES2326458A1 (es) | 2009-10-09 |
WO2009121993A1 (es) | 2009-10-08 |
EP2280052A4 (en) | 2012-10-24 |
EP2280052A1 (en) | 2011-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2326458B1 (es) | Compuestos fluorescentes para diagnostico de infecciones, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. | |
Ray | A culture technique for the diagnosis of infections with Dermocystidium marinum Mackin, Owen, and Collier in oysters | |
Fu et al. | Bovine serum albumin and skim-milk improve boar sperm motility by enhancing energy metabolism and protein modifications during liquid storage at 17 C | |
Wang et al. | Small-molecule fluorescent probes: big future for specific bacterial labeling and infection detection | |
Ma et al. | Development of organelle-targetable europium complex probes for time-gated luminescence imaging of hypochlorous acid in live cells and animals | |
CN106323925A (zh) | 一种检测真菌和皮肤寄生虫的荧光染色剂 | |
CN110023289A (zh) | 自噬潮和磷脂酶d的活化剂以及包括tau的蛋白聚集体的清除和蛋白质病的治疗 | |
US20170146546A1 (en) | Use of fluoroquinolone antibiotics | |
Sharma et al. | Imaging and quantitative detection of lipid droplets by yellow fluorescent probes in liver sections of plasmodium infected mice and third stage human cervical cancer tissues | |
US20170248595A1 (en) | Kit and method | |
CN106459126B (zh) | 新型葡萄糖衍生物、及使用该衍生物的细胞成像方法及显像剂 | |
US20140045171A1 (en) | Benzoxazole-based fluorescent metal ion indicators | |
KR20180035274A (ko) | 포름알데히드 검출 또는 농도 측정용 프로브, 이를 이용한 세포 또는 조직 내 포름알데히드의 이광자 비율 기준 형광 영상화 및 농도 측정 | |
US20180251478A1 (en) | Compounds as stimuli-responsive probes, methods and applications thereof | |
US20130236922A1 (en) | Copper(i)-ion selective fluorescent probe, method for preparing the same, method for diagnosing malignant disease and diagnosis kit using the probe | |
CN110407835B (zh) | 咪唑并[1,2-a]吡啶近红外比率型pH荧光探针及其制备和应用 | |
CN113683604B (zh) | 一种检测农作物线粒体中二氧化硫衍生物的比率型近红外荧光探针及其制备方法和用途 | |
EP3286200B1 (en) | Chemical fluorescent probes for detecting biofilms | |
CN106280533B (zh) | 一种近红外荧光染料及其合成方法和用于寄生虫荧光标记 | |
CN109988561B (zh) | 咪唑并[1,2-a]吡啶类比率型pH荧光探针及其制备方法和应用 | |
Nikitina et al. | Development of novel effective agents against Candida albicans biofilms | |
Fabbri et al. | Comparison of different staining methods for determination of viability on Mesocestoides vogae tetrathyridia | |
US20240216547A1 (en) | Use of fluorescein dicarbonate derivatives as a cell marker | |
CN87101986A (zh) | 真菌检测 | |
WO2018157367A1 (en) | Methods to quantify ion in dental biofilm |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20091009 Kind code of ref document: A1 |
|
FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2326458B1 Country of ref document: ES |
|
FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20170216 |