JP2008533024A - 神経変性疾患のサーチュイン関連治療法及び診断法 - Google Patents
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Abstract
更にここでは、神経変性疾患など、神経細胞死に関連する疾患を治療する、防止する又は診断する方法も開示する。
Description
本発明は、米国国立保健研究所により支給される助成金GM53049、AG19719 及び AG19972 の下で政府支援を受けてなされた。政府は本発明において特定の権利を有するものである。
本出願は、引用をもってその全文をここに援用することとする、2005年3月7日出願の米国出願第11/074,374号の一部継続出願である。
加齢の速度は調節できるとの証拠がモデル生物から今や豊富にある1。寿命調節遺伝子が、げっ歯類、ハエ、線虫及び更にはパン酵母などの単細胞生物を含め、数多くの真核生物で同定されている(2、3にレビュー)。これらの遺伝子は、悪化する環境条件に応答して生存率を高めるように進化した、進化上保存された寿命経路の一部であるようである1,4。酵母S.セレビジエ(原語:S. ceRevisiae)は、寿命調節における細胞自律性経路を研究するために特に有用なモデルであることが立証されている2。この生物においては、複製寿命は、個々の母細胞が死ぬまでに生む娘細胞の数であると定義されている。酵母の寿命延長は、寿命タンパク質SiR2の強力な阻害剤であるニコチンアミドを枯渇させる、カロリ制限(CR)-及びストレス-応答遺伝子であるPNC1に支配されている。PNC1 及びSIR2 は、両者とも、CR及び軽いストレスによる寿命延長に必要であり5,6、これらの遺伝子のコピーが付加的にあると寿命が30-70%延びる5,7。これらの結果に基づき、我々は、CRが、多様な種において健康上の利益をもたらしている可能性があると提案した。なぜなら、サーチュイン媒介性生物防御応答を誘導するのは軽いストレスだからである6。
C.エレガンス(原語:C. elegans)、哺乳動物細胞、及び単細胞寄生生物リーシュマニア(原語:Leishmania)での研究では、サーチュインの生存及び寿命機能が保存されていることが示されている19−22。C.エレガンスでは、siR-2.1のコピーが付加的にあると、げっ歯類で寿命を調節することが最近示されたのと同じ経路であるインシュリン/IGF-1シグナル伝達経路を介して寿命が50%、延びる23−25。
サーチュインデアセチラーゼタンパク質ファミリ・メンバを活性化する方法をここで提供する。本方法は、サーチュインデアセチラーゼタンパク質ファミリ・メンバを、式1-25、30及び32-65から成る群より選択される構造を有する化合物に接触させるステップを含むであろう。式1-25、30 及び32-65の範疇に入り、かつ、サーチュインタンパク質を活性化する化合物を、ここでは「活性化化合物」と言う。該活性化化合物は、例えば植物ポリフェノール又はその類似体もしくは誘導体など、ポリフェノール化合物であってよい。化合物の例は、フラボン、スティルベン、フラバノン、イソフラボン、カテキン、カルコン、タンニン及びアントシアニン又はこれらの類似体もしくは誘導体から成る群より選択される。例示的な実施態様では、化合物は、レスベラトロール、ブテイン、ピセアタンノール、イソリキリチゲニン、フィセチン、ルテオリン、3,6,3’,4’-テトラヒドロキシフラボン、ケルセチン、及びこれらの類似体及び誘導体から成る群より選択される。いくつかの実施態様では、当該の活性化化合物が天然で生じる化合物である場合、それは、それが天然で生じる形でなくともよい。
タンパク質であってもよい。
該サーチュインデアセチラーゼタンパク質ファミリ・メンバの活性を判定するステップを含んでもよい。
スチルベン、フラボン及びカルコンのファミリ・メンバ又は他の寿命延長化合物から成る群より選択される少なくとも三種の化合物に、当該細胞を接触させるステップを含んでもよい。当該の細胞を、約10μM未満の濃度又は約10-100μMの濃度の化合物に接触させてもよい。当該細胞は
in vitRo にあっても、又はin vivo にあってもよく、それは酵母細胞でも、又は哺乳動物細胞でもよい。当該の細胞が対象内にあるとき、本方法は、該化合物をその対象に投与するステップを含むであろう。
定義
ここで用いられる場合の以下の用語及び文言は、下に記載された意味を有するものとする。他に定義しない限り、ここで用いられる全ての技術用語及び科学用語は、当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。
ID NO: 3及び 4)、並びに NM_030593 及び NP_085096 (バリアント2については; それぞれSEQ ID NO: 5 及び6)に相当する。 他のファミリ・メンバには、「HST
遺伝子」(SiR twoの相同体)HST1、HST2、HST3 及びHST4と呼ばれる4つの付加的な酵母SiR2様遺伝子と、5つの他のヒト相同体hSIRT3(Genbank 受託番号 NM_012239 及び NP_036371に相当する;それぞれSEQ ID NO: 7及び8)、hSIRT4(Genbank 受託番号 NM_012240 及び NP_036372に相当する;それぞれ SEQ ID NO: 9 及び10)、hSIRT5(バリアント1については Genbank 受託番号 NM_012241 及びNP_036373 に相当する(それぞれSEQ ID NO: 11 及び 12)並びにバリアント2についてはNM_031244 及び NP_112534 (それぞれSEQ ID NOs: 13 and 14)に相当する)、hSIRT6(Genbank 受託番号 NM_016539 及びNP_057623に相当する;それぞれ SEQ ID NO: 15 及び 16) 及びhSIRT7(Genbank 受託番号 NM_016538 及び NP_057622に相当する; それぞれSEQ ID NO: 17 及び 18)がある(BRachmann et al. (1995) Genes Dev. 9:2888 及び FRye et al. (1999) BBRC 260:273)がある。好適なサーチュインは、SIRT1に対してより類似性を持つもの、即ち、hSIRT1、及び/又は、SIRT2に対してよりSiR2に対して類似性を持つもの、例えばSIRT3が有するものなど、SIRT1には存在するがSIRT2にはないN末端配列の少なくとも一部分を有するメンバなど、である。
Sequence Analysis (1996)に解説されている。好ましくは、配列中のギャップを許容するアライメント・プログラムを用いて配列をアライメントするとよい。Smith-WateRmanは、配列アライメントにおいてギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997) を参照されたい。更に、 Needleman 及びWunsch アライメント法を用いたGAPプログラムも、配列をアライメントするために用いることができる。ある代替的な検索戦略は、MASPARコンピュータで作動するMPSRCHソフトウェアを用いるものである。MPSRCHはSmith-WateRman アルゴリズムを用いて、超並列処理コンピュータで配列を採点する。このアプローチは関係の遠い対合を取り出す能力を向上させるものであり、小さなギャップやヌクレオチド配列エラーに特に寛容である。核酸にコードされたアミノ酸配列を用いて、たんぱく質及びDNAの両方のデータベースを検索することができる。
vitRoでの化学的又は酵素による合成による生成を言う。
GRoups in ORganic Synthesis, 2nd ed.; Wiley: New YoRk, 1991)でレビューがなされている。
GRoups in ORganic ChemistRy 、第2章(McOmie, ed., Plenum PRess, New YoRk, 1973)に解説されている。適した基の例には、アシル保護基、例えば、例示するなら、ホルミル、ダンジル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、メトキシスクシニル、ベンジル及び置換ベンジル、例えば3,4-ジメトキシベンジル、o-ニトロベンジル、及びトリフェニルメチル;式-COORのもの(但し式中、Rにはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、2,2,2-トリクロロエチル、1-メチル-1-フェニルエチル、イソブチル、t-ブチル、t-アミル、ビニル、アリール、フェニル、ベンジル、p-ニトロベンジル、o-ニトロベンジル、及び2,4-ジクロロベンジルなどの基が含まれる);アシル基及び置換アシル、例えばホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、及びp-メトキシベンゾイル;並びに他の基、例えばメタンスルホニル、p-トルエンスルホニル、p-ブロモベンゼンスルホニル、p-ニトロフェニルエチル、及びp-トルエンスルホニル-アミノカルボニル、がある。好適なアミノ遮断基はベンジル(-CH2C6H5)、アシル [C(O)R1] 又はSiR13 (但し式中R1はC1-C4 アルキル、ハロメチル、又は2-ハロ-置換-(C2-C4 アルコキシ)である)、芳香族のウレタン保護基、例えばカルボニルベンジルオキシ(Cbz);並びに脂肪族のウレタン保護基、例えばt-ブチルオキシカルボニル(Boc)又は9-フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)、である。
サーチュインデアセチラーゼタンパク質ファミリ・メンバ (「サーチュインタンパク質」と言及する)を活性化するための方法及び化合物をここに提供する。本方法は、サーチュインデアセチラーゼタンパク質ファミリ・メンバを、植物性ポリフェノールなどのポリフェノールなどの「活性化化合物」又は「活性化化合物」とここで言及される化合物に接触させるステップを含むであろう。サーチュインデアセチラーゼタンパク質の例には、酵母サイレント情報調節因子 2 (SiR2) 及びヒトSIRT1がある。他のファミリ・メンバには、SiR2及びSIRT1のそれに対して有意なアミノ酸配列相同性や、例えばヒストン及びp53などの標的タンパク質の脱アセチル化能などの生物学的活性を有するタンパク質がある。
イソリキリチゲニン及びテトラヒドロキシカロン、例えばブテイン、などのトリヒドロキシカロンを含むヒドロキシカロンも用いることができる。テトラヒドロキシフラボン、例えばフィセチン、及びペンタヒドロキシフラボン、例えばケルセチン、を含むヒドロキシフラボンも用いることができる。化合物の例を表1−13及び21(コントロール速度に対する比が>1である化合物)を挙げる。表1−8の化合物は、バイオモル社、シグマ/アルドリッチ社又はインドフィン社から得られよう。
それぞれ独立に、R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルカリル、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表し;
R はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
M はO、NR、又はSを表し;
A-B は一個の二価のアルキル、アルケニル, アルキニル、アミド、スルホンアミド、ジアゾ、エーテル、アルキルアミノ、アルキルスルフィド、ヒドロキシルアミン、又はヒドラジン基を表し;そして
n は0 又は 1である。
R1、R2、R3、R4、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5、及びR” はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し;
R はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
M はH2、O、NR、又はSを表し;
Z はCR、O、NR、又はSを表し;
X はCR 又はNを表し;そして
Y はCR 又はNを表す。
R1、R2、R3、R4、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5、及び R”1 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し;
R はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
M は H2、O、NR、又はSを表し;
Z は C(R)2、O、NR、又はSを表し;
X は CR 又はNを表し;そして
Y は CR 又はNを表す。
R1、R2、R3、R4、R’1、R’2、R’3、R’4、及びR’5は、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表し;
R はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
M は H2、O、NR、又はSを表し;
Z はCR、O、NR、又は Sを表し;そして
X は CR” 又はNを表し、但しこの場合
R” はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルである。
は OHであり;そして R1、R2、R3、R4、R’1、R’2、R’4、及び R’5 はHである。更なる実施態様では、本方法は式4及び付属の定義の化合物を含み、但しこの場合は式中、X は CHであり;Z はOであり;M は Oであり;R4 及び R’3 はOHであり;そしてR1、R2、R3、R’1、R’2、R’4、及びR’5 はHである。更なる実施態様では、本方法は式4及び付属の定義の化合物を含み、但しこの場合は式中、X は CHであり;Z はOであり;M はOであり;R2 及び R4 は OHであり;そしてR1、R3、R’1、R’2、R’3、R’4、及びR’5 は Hである。更なる実施態様では、本方法は式4及び付属の定義の化合物を含み、但しこの場合は式中、X はCOHであり;Z は Oであり; M は Oであり; R2、R4、R’1、及び R’3 は OHであり;そしてR1、R3、R’2、R’4、及び R’5 はHである。更なる実施態様では、本方法は式4及び付属の定義の化合物を含み、但しこの場合は式中、X は CHであり;Z は Oであり;M は Oであり;R4 は OHであり;そしてR1、R2、R3、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は Hである。更なる実施態様では、本方法は式4及び付属の定義の化合物を含み、但しこの場合は式中、X は COHであり;Z は Oであり;M は Oであり;R2、R4、R’2、R’3、及びR’4 はOHであり;そして R1、R3、R’1、及び R’5 は Hである。更なる実施態様では、本方法は式4及び付属の定義の化合物を含み、但しこの場合は式中、X は COHであり;Z は Oであり;M は Oであり;R2、R’2、R’3、及びR’4 はOHであり;そしてR1、R3、R4、R’1、及びR’5 は Hである。更なる実施態様では、本方法は式4及び付属の定義の化合物を含み、但しこの場合は式中、X は COHであり;Z は Oであり;M は Oであり; R1、R2、R4、R’2、及びR’3 は OHであり;そして R3、R’1、R’4、及びR’5 はHである。
R1、R2、R3、R4、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5は、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し;
R はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
M は H2、O、NR、又はSを表し;
Z は C(R)2、O、NR、又は Sを表し;そして
Y は CR” 又はNを表し、但しこの場合は式中、
R” は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表す。
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R’2、R’3、R’4、R’5、及びR’6 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表し;
R は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
A-
は以下: Cl-、BR-、又は I-から選択される陰イオンを表す。
M は存在しないか、又はOであり;
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及びR’5 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し;
Ra
はH を表すか、あるいはRa が2つある場合は一個の結合を形成し;
R はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
n は 0 又は 1である。
は Hであり;R2、R4、R’2、及びR’3 はOHであり;そしてR1、R3、R’1、R’4、及びR’5 はHである。更なる実施態様では、本方法は式7及び付属の定義で表される活性化化合物を含み、但しこの場合は式中、n は 1であり;M は Oであり;2つのRa は一個の結合を形成し;R5 はOHであり;R2、R’2、及び R’3 はOHであり;そしてR1、R3、R4、R’1、R’4、及びR’5 は Hである。
R1
及びR2
はH、アリール、ヘテロ環、又は低分子アルキルを表し;
R7
は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
A、B、C、及びD はCR1 又はNを表し;そして
n は 0、1、2、又は3である;
R1
及びR2はH、アリール、ヘテロ環、又は低分子アルキルを表し;
R3
は低分子アルキルを表し;
R7
は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
A、B、C、及びD はCR1 又はNを表し;そして
n は 0、1、2、又は3である;
R1
及びR2
はH、アリール、ヘテロ環、又は低分子アルキルを表し;
R'1
、R'2、 R'3、 R'4 、及びR'5 は H 又は OR7を表し;
R7
は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
A、B、C、及びD はCR1 又はNを表し;そして
n は 0、1、2、又は3である;
R1
及びR2
はH、アリール、ヘテロ環、又は低分子アルキルを表し;
R3
は低分子アルキルを表し;
R'1
、R'2、 R'3、 R'4 、及びR'5 は H 又は OR7を表し;
R7
は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
A、B、C、及びD はCR1 又はNを表し;そして
n は 0、1、2、又は3である;
R1
及びR2
はH、アリール、又はアルケニルを表し;そして
R7
は H、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表す;
Rはヘテロ環又はアリールを表し;そして
n は 0以上10以下である;
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は H、ハロゲン、NO2、SH、SR、OH、OR、NRR'、アルキル、アリール、又はカルボキシを表し;
R は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
R' はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
A-B はエテン、エチン、アミド、スルホンアミド、ジアゾ、アルキル、エーテル、アルキルアミン、アルキルスルフィド、ヒドロキシアミン、又はヒドラジンを表す;
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は H、ハロゲン、NO2、SH、SR、OH、OR、NRR'、アルキル、アリール、又はカルボキシを表し;
R は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
R' はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
A−B はエテン、エチン、アミド、スルホンアミド、ジアゾ、アルキル、エーテル、アルキルアミン、アルキルスルフィド、ヒドロキシアミン、又はヒドラジンを表す;
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は H、ハロゲン、NO2、SH、SR、OH、OR、NRR'、アルキル、アリール、又はカルボキシを表し;
R は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
R' はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
X はCR8又は Nを表し;
Y はCR8又は Nを表し;
Z は O、S、C(R8)2、又は NR8を表し;そして
R8はアルキル、アリール又はアラルキルを表す;
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は H、ハロゲン、NO2、SH、SR、OH、OR、NRR'、アルキル、アリール、又はカルボキシを表し;
R は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
R' はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
X はCR8又は Nを表し;
Y はCR8又は Nを表し;
Z は O、S、C(R8)2、又は NR8を表し;そして
R8はアルキル、アリール又はアラルキルを表す;
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は H、ハロゲン、NO2、SH、SR、OH、OR、NRR'、アルキル、アリール、又はカルボキシを表し;
R は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
R' はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
Z は O、S、C(R8)2、又は NR8を表し;そして
R8はアルキル、アリール又はアラルキルを表す;
R は H、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;そして
R' はH、ハロゲン、NO2, SR、OR、NR2、アルキル、アリール、又はカルボキシである;
R は H、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドである;
R' はH、ハロゲン、NO2, SR、OR、NR2、アルキル、アリール、又はカルボキシであり;そして
R は H、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドである;
L はCR2、O、NR、又はSを表し;
R は H、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
R' はH、ハロゲン、NO2, SR、OR、NR2、アルキル、アリール、アラルキル又はカルボキシを表す;
L はCR2、O、NR、又はSを表し;
W はCR 又は Nを表し;
R は H、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
AR は一個の縮合したアリール又はヘテロアリール環を表し;そして
R' はH、ハロゲン、NO2, SR、OR、NR2、アルキル、アリール、アラルキル又はカルボキシを表す;
L はCR2、O、NR、又はSを表し;
R は H、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
R' はH、ハロゲン、NO2, SR、OR、NR2、アルキル、アリール、アラルキル又はカルボキシを表す;
L はCR2、O、NR、又はSを表し;
R は H、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
R' はH、ハロゲン、NO2, SR、OR、NR2、アルキル、アリール、アラルキル又はカルボキシを表す。
D は一個のフェニル又はシクロヘキシル基であり;
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、カルボキシル、アジド、エーテルを表すか;あるいは、隣り合ったいずれか2つのR1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 基が一緒になって一個の縮合ベンゼン又はシクロヘキシル基を形成し;
R はH、アルキル、アリール、アラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
A-B は一個のエチレン、エテニレン、又はイミン基を表し;
但し条件として、A-B がエテニレンである場合、Dはフェニルであり、そしてR’3 は Hである: R1、R2、R4、及びR5 が Hである場合、R3 はOHではない;そしてR1、R3、及びR5 がHである場合;R2及びR4 はOMeではない;そしてR1、R2、R4、及びR5 がHである場合、R3
はOMe ではない。
及びR4
はOHであり;そしてR’3 はCH2CH3である。
及びR4
はOHであり;そしてR’3 はFである。
R は H、あるいは一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は
ヘテロアラルキルであり;そして
R1
及びR2
は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルである。
R はH、あるいは一個の置換もしくは非置換
アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり;
R1
及びR2
は一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキル、であり;そして
L は O、S、又はNRである。
R、R1、及びR2 はH、あるいは一個の置換もしくは非置換
アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は
ヘテロアラルキル、であり;そして
n は0以上5以下の整数である。
はHであり、そしてn は 1である。
R は H あるいは一個の置換もしくは非置換
アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキル、であり;
R1
は 一個の置換もしくは非置換
アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は
ヘテロアラルキル、であり;
R2
は ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR3、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルであり;
R3
はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L はO、NR、又はSであり;
m は0以上3以下の整数であり;
n は0以上5以下の整数であり;そして
o は0以上2以下の整数である。
R、R3、及びR4 はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR5、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルであり;
R1
及びR2
は H 又は一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルであり;
R5
はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1
は O、NR1、S、C(R)2、又は SO2であり;そして
L2
及びL3
は O、NR1、S、又は C(R)2である。
は4-クロロフェニルであり、R2 は 4-クロロフェニルであり、そしてR3 は Hである。
R は ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR4、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルであり;
R1
は H 又は 一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルであり;
R2
及びR3
はH 又は 一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルであり;
R4はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L は O、NR1、又はSであり;そして
n は0以上4以下の整数である。
R 及びR1 は H あるいは
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は ヘテロアラルキルであり;そして
L1
及びL2
は O、NR、又はSである。
R は H、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR2、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は ヘテロアラルキルであり;
R1
は H 又は 一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アルカリール、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は ヘテロアラルキルであり;
R2
はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1
及びL2
はO、NR、又は Sであり;そして
n は0以上4以下の整数である。
R、R1、R2、R3 は H 又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アルカリール、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は ヘテロアラルキルであり;
R4
は ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR5、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は ヘテロアラルキルであり;
R5
はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1
及び L2
は O、NR、又はSであり;そして
n は0以上3以下の整数である。
はHである。
は Oである。
はHであり、L1 はOであり、そしてL2 はOである。
はOであり、L2 はOであり、そしてn は 0である。
R、R1、及びR3 は ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR4、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R2
は H、あるいは 一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、 ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R4はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1、L2、及びL3 はO、NR2、又はSであり;そして
m 及びn は0以上8以下の整数である。
はシアノであり、R2
はエチルであり、m は 0であり、そしてL1 は Sである。
は Sであり、そしてL2 はOである。
はOである。
R 及び R2 は H、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR4、エーテル、エステル、アミド、
ケトン、 カルボン酸、
ニトロ、 又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、 ヘテロアリール、 又は ヘテロアラルキルであり;
R1
及びR3
は H あるいは 一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、 ヘテロアリール、 又はヘテロアラルキルであり;
R4はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1、L2、L3、及び L4 は O、NR1、又は Sであり;
m は0以上6以下の整数であり;そして
n は0以上8以下の整数である。
は 4-メチルフェニルであり;そしてL1 はSである。
はOである。
はNR1である。
は NR1であり、そしてL4 はNR1である。
R 及びR1 はヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR4、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、 又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、 又は ヘテロアラルキルであり;
R2
及び R3
はH あるいは 一個の置換もしくは非置換 アルキル、 アリール、 アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、 ヘテロアリール、
又はヘテロアラルキルであり;
R4はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;そして
L1
及びL2
はO、NR2、又は Sである。
はNR2である。
R は H、
あるいは 一個の置換もしくは非置換
アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R1
は ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR2、エーテル、エステル、アミド、
ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は 一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、
アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、あるいは
ヘテロアラルキルであり;
R2 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;そして
L1、L2、及びL3 は O、NR、又はSであり;そして
n は0以上5以下の整数である。
R は ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR3、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、 又は ヘテロアラルキルであり;
R1
及びR2
はH あるいは 一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は ヘテロアラルキルであり;
R3アルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1
及びL2
は O、NR1、又はSであり;そして
n は0以上4以下の整数である。
R、R1、R2、及び R3 はヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR5、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は 一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は
ヘテロアラルキルであり;
R5 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1
及び L2
は O、NR4、又はSであり;
R4
はH、あるいは一個の置換もしくは非置換 アルキル、
アリール、 アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、
ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
n は0以上4以下の整数であり;
m は0以上3以下の整数であり;
o は0以上4以下の整数であり;そして
p は0以上5以下の整数である。
はClである。
はOH 又はIである。
R 及び R1 はヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR5、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、 又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、 又はヘテロアラルキルであり;
L1
及びL2
は O、NR4、又は Sであり;
R4
はH、あるいは 一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R5 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;そして
m 及びn は0以上4以下の整数である。
はメチル又はt-ブチルである。
はOである。
R、R1、R2、R3、R4、R5、及びR6 はヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR8、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は 一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R7 はH、あるいは
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は ヘテロアラルキルであり;
R8 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1、L2、及びL3 はO、NR7、又は S であり、そして
n は0以上4以下の整数である。
はC(O)OCH3であり、そしてR2 は C(O)OCH3である。
はC(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、そして R3 は C(O)OCH3である。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 は C(O)OCH3であり、そしてR4 はC(O)OCH3である。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 は C(O)OCH3であり、R4 は C(O)OCH3であり、そして R5 はメチルである。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 は C(O)OCH3であり、R4 は C(O)OCH3であり、R5 はメチルであり、そしてR6 はメチルである。
はC(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 は C(O)OCH3であり、R4 は C(O)OCH3であり、R5 はメチルであり、R6 はメチルであり、そしてR7は C(O)CF3である。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 は C(O)OCH3であり、R4 は C(O)OCH3であり、R5 は メチルであり、R6 はメチルであり、R7 は C(O)CF3であり、そしてL1 は Sである。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 は C(O)OCH3であり、R4 は C(O)OCH3であり、R5 はメチルであり、R6 はメチルであり、R7 は C(O)CF3であり、L1 は Sであり、そしてL2 は Sである。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 は C(O)OCH3であり、R4 は C(O)OCH3であり、R5 はメチルであり、R6 はメチルであり、R7 は C(O)CF3であり、L1 はSであり、L2 はSであり、そしてL3
は Sである。
R、R1、R2、R3、R4、及びR5 は ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR7、 エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、 又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は ヘテロアラルキルであり;
L1、L2、及びL3 は O、NR6、又はSであり;
R6
はH、あるいは 一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R7 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;そして
nは0以上4以下の整数である。
は C(O)OCH3である。
は C(O)OCH3であり、そしてR2 はC(O)OCH3である。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、そしてR3 はメチルである。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 は メチルであり、そしてR4 はメチルである。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 はメチルであり、R4 はメチルであり、そしてR5 はCH2CH(CH3)2である。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 はメチルであり、R4 はメチルであり、R5 はCH2CH(CH3)2であり、そしてL1 は Sである。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 は メチルであり、R4 はメチルであり、R5 はCH2CH(CH3)2であり、そして L1 は Sである。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 はメチルであり、R4 はメチルであり、R5 はCH2CH(CH3)2であり、L1 は Sであり、そして L2 は Sである。
は C(O)OCH3であり、R2 は C(O)OCH3であり、R3 は メチルであり、R4 は メチルであり、R5 はCH2CH(CH3)2であり、L1 は Sであり、L2 はSであり、そして L3
は Sである。
R 及びR1 は ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR4、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、
ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、 又はヘテロアラルキルであり;
R2
はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、アルコキシ、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、
又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、
又はヘテロアラルキルであり;
R4 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1
及びL2
は O、NR3、又は Sであり;
R3
はH、あるいは一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
n は0以上5以下の整数であり;そして
m は0以上4以下の整数である。
はシアノである。
はシアノであり、そしてL1
はSである。
はシアノであり、L1
はSであり、そしてL2は Sである。
R 及びR1 は ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR2、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、
又はヘテロアラルキルであり;
R2 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
n は0以上4以下の整数であり;そして
m は0以上2以下の整数である。
はフェニルである。
RはH、あるいは一個の置換もしくは非置換
アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、
又はヘテロアラルキルであり;
R1
及びR6
はヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR7、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、
又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R2
はアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり;
R3、R4、及びR5 は H、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR7、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は
一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R7 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1、L2、及びL3 はO、NR、又はSであり;
n 及びp は0以上3以下の整数であり;
m 及びo は0以上2以下の整数である。
はアルキニレンである。
はアルキニレンであり、そしてm
は 1である。
はアルキニレンであり、m は1であり、そしてR3 はOHである。
はアルキニレンであり、m は1であり、R3 はOHであり、そしてR4 はC(O)OEtである。
はアルキニレンであり、m は1であり、R3 はOHであり、R4 はC(O)OEtであり、そしてo は1である。
はアルキニレンであり、m は1であり、R3 はOHであり、R4 は C(O)OEtであり、o は1であり、そしてR5
はOHである。
はアルキニレンであり、m は1であり、R3 はOHであり、R4 は C(O)OEtであり、o は 1であり、R5 はOHであり、そして p は 0である。
はアルキニレンであり、m は 1であり、R3 はOHであり、R4 は C(O)OEtであり、o は 1であり、R5 はOHであり、p は0であり、そして L1
はNHである。
はアルキニレンであり、m は 1であり、R3 はOHであり、R4 はC(O)OEtであり、o は1であり、R5
はOHであり、p は 0であり、L1 はNHであり、そしてL2 はOである。
はアルキニレンであり、m は1であり、R3 はOHであり、R4 はC(O)OEtであり、o は1であり、R5
はOHであり、p は0であり、L1
はNHであり、L2 はOであり、そしてL3 はOである。
R、R1、R2、R3、R4、及びR5 は H、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR7、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
L1、L2、L3、及びL4 はO、NR6、又は Sであり;
R6
は H、あるいは一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R7 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;そして
n は0以上5以下の整数である。
はOである。
はOであり、そしてL4 は NHである。
はOであり、 L4 はNHであり、そして n は 1である。
R 及び R1 はH あるいは
一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R2、R4、及びR5 はヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR8、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又は
ヘテロアラルキルであり;
R3、R6、及びR7 はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR8、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、
又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R8 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L はO、NR、又はSであり;
n 及び o は0以上4以下の整数であり;そして
m は0以上3以下の整数である。
はHである。
はHであり、o は0であり、そしてR5
は Clである。
はHであり、o は0であり、R5
はClであり、そしてR6 はHである。
はHであり、o は0であり、R5
はClであり、R6 はHであり、そしてR7 はメチルである。
はHであり、o は0であり、R5
はClであり、R6 はHであり、R7 はメチルであり、そしてL はNHである。
はHであり、 o は0であり、R5 is Cl、R6 はHであり、R7
はメチルであり、L はNHであり、そしてn は 1である。
R、R1、R4、及びR5 は H あるいは一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R2
及びR3
は H、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR6、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は 一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R6
はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;そして
L1、L2、L3、及びL4 は O、NR、又はSである。
はHである。
はHであり、そしてL1 はSである。
はHであり、L1 は Sであり、そしてL2 はNHである。
はHであり、L1 は Sであり、L2 はNHであり、そしてL3 はNHである。
はHであり、L1 はSであり、L2 はNHであり、L3 はNHであり、そしてL4 はSである。
R 及びR1 は ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR3、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R3
はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1、L2、及びL3 は O、NR2、又は Sであり;
R2
はH、あるいは一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
n は0以上4以下の整数であり;そして
m は0以上5以下の整数である。
はSである。
R、R1、R2、及びR3 はヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR4、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、 又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R3
はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
A はアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレンであり;
n は0以上8以下の整数であり;
m は0以上3以下の整数であり;
o は0以上6以下の整数であり;そして
p は0以上4以下の整数である。
はメチルである。
はCO2Hである。
はCO2Hであり、そしてA はアルケニレンである。
R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、及びR9 はヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR11、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、
又はヘテロアラルキルであり;
R11
はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1、L2、及びL3 はO、NR10、又はSであり;
R10
はH、あるいは一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルである。
はOである。
はOであり、そしてL3 はOである。
R、R1、R2、及びR3 はH あるいは一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、
又はヘテロアラルキルであり;
L はOであり、 NR、S、又はSeであり;
n 及びm は0以上5以下の整数である。
はHである。
はHであり、そしてL はSeである。
はHであり、L はSeであり、そしてn は 1である。
はHであり、L はSeであり、n は 1であり、そして mは1である。
R はヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR4、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、 又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R1
及びR2
はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR4、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R4はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L はOであり、NR3、S、又はSO2であり;
R3
はH、あるいは一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
n は0以上4以下の整数であり;そして
m は1以上5以下の整数である。
R、R1、R2、及びR3 はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR4、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R4
はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;そして
n 及び m は0以上5以下の整数である。
はHである。
はHであり、そしてm は0である。
はHであり、そしてmは1である。
はHであり、mは1であり、そしてR3
は4-ヒドロキシである。
はHであり、mは1であり、そしてR3
は4-メトキシである。
R、R1、R2、R3、R4、R5、及びR6 はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR8、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、
又はヘテロアラルキルであり;
R8
はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L はO、NR7、又はSであり;そして
R7
はH、あるいは一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、 アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルである。
R、R1、及びR2 は H、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR3、エーテル、 エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;そして
R3はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドである。
R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、及びR7 は H、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR9、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、
又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、
又はヘテロアラルキルであり;
R9
はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;
L1、L2、及びL3 はCH2、O、NR8、又はSであり;そして
R8
はH、 あるいは一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルである。
はOである。
はOである。
RはH、あるいは一個の置換もしくは非置換
アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R1、R2、及びR3 はヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR4、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R4はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドであり;そして
L1
及びL2
はO、NR、又はSである。
はメチルである。
はメチルであり、そしてR2
はCO2Hである。
はメチルであり、R2
はCO2Hであり、そしてR3 はFである。
はメチルであり、R2
はCO2Hであり、R3 はFであり、そしてL1 はOである。
はメチルであり、R2
はCO2Hであり、R3 はFであり、L1 はOであり、そしてL2
はOである。
vitRoにある。細胞を、約0.1μM未満;0.5μM;約1μM未満;約10μM未満;又は約100μM未満の活性化化合物の濃度を有する溶液に接触させてもよい。更に、活性化化合物の濃度は、約0.1乃至1μM、約1乃至10μM、又は約10乃至100μMの範囲内であってもよい。適した濃度は、用いる特定の化合物及び特定の細胞や、所望の効果に依存するであろう。例えば、細胞を、サーチュインを少なくとも10%、30%、50%、100%、3、10、30、又は100の因数で活性化させるために充分な濃度など、「サーチュインを活性化させる」濃度の活性化化合物に接触させてよい。
対象から試料を得、p53アセチル化及び/又はアポトーシスのレベルのin vitRo分析を行うなどにより、判定することができる。
M は存在しないか、又はOであり;
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及びR’5 はH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し;
Ra
はH を表すか、あるいはRa が2つあることで一個の結合を形成し;
R はH、アルキル、アリール、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
n は0又は1である。
は一個の結合を形成する。更なる実施態様では、本方法は、式7及び付属の定義で表される化合物を含み、但しこの場合は式中、R5 はHである。更なる実施態様では、本方法は、式7及び付属の定義で表される化合物を含み、但しこの場合は式中、R5 はOHである。更なる実施態様では、本方法は、式7及び付属の定義で表される化合物を含み、但しこの場合は式中、R1、R3、及びR’3 はOHである。更なる実施態様では、本方法は、式7及び付属の定義で表される化合物を含み、但しこの場合は式中、R2、R4、R’2、及びR’3 はOHである。更なる実施態様では、本方法は、式7及び付属の定義で表される化合物を含み、但しこの場合は式中、R2、R’2、及びR’3 はOHである。
はHであり;R2、R4、R’2、及びR’3 は OHであり;そしてR1、R3、R’1、R’4、及びR’5 はHである。更なる実施態様では、本方法は、式7及び付属の定義で表される化合物を含み、但しこの場合は式中、n は 1であり;M はOであり;2つのRa
は一個の結合を形成し;R5
はOHであり;R2、R’2、及び R’3 はOHであり;そしてR1、R3、R4、R’1、R’4、及びR’5 はHである。
et al. Science (2002) 298:1745)。更に、最も近いヒトSiR2 相同体である SIRT1は、腫瘍サプレッサp53の活性を下方調節することによりヒト細胞の生存を促進する(Tissenbaum et al. NatuRe
410, 227-30 (2001); Rogina et al. Science
298:1745 (2002); and VaziRi, H. et
al. Cell 107, 149-59. (2001))。ストレス耐性及び細胞長寿におけるSIR2 の役割は、更に、細胞内ニコチンアミドを枯渇させることにより細胞の寿命及びストレス耐性を増すカロリ制限-及びストレス-応答性遺伝子として PNC1 が同定されたことでも裏付けられる(AndeRson et al. (2003) NatuRe 423:181 及び BitteRman et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 45099)。従って、ストレスから対象の細胞を保護し、ひいてはこの対象の細胞の寿命を延長するために、化合物を対象に投与できよう。
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、OR、NR2、アルキル、アリール、アラルキル、又はカルボキシを表し;
R はH、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
R” はアルキル、アルケニル、又はアルキニルを表し;
L はO、NR、又はSを表し;
R はH、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、SO3、OR、NR2、アルキル、アリール、アラルキル、又はカルボキシを表し;
a は1以上7以下の整数を表し;そして
b は1以上4以下の整数を表し;
L はO、NR、又はSを表し;
R はH、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、SO3、OR、NR2、アルキル、アリール、又はカルボキシを表し;
a は1以上7以下の整数を表し;そして
bは1以上4以下の整数を表し;
LはO、NR、又はSを表し;
R はH、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、SO3、OR、NR2、アルキル、アリール、アラルキル、又はカルボキシを表し;
a は1以上7以下の整数を表し;そして
bは1以上4以下の整数を表し;
RはH、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し;そして
R’3
はH、又はNO2であり;
A-B は一個のエテニレン又はアミド基である。
R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、及びR8 はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR9、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;そして
R9 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表す。
R、R1、R2、及びR3 はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR4、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;そして
R4 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表す。
はHである。
はHであり、そしてR3 はBRである。
R、R1、R2、R6、及びR7 はH、あるいは一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、
又はヘテロアラルキルであり;
R3、R4、及びR5 はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハリド、OR6、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R6 はアルキル、-SO3H、単糖、オリゴ糖、グリコフラノシル、グリコピラノシル、グルクロノシル、又はグルクロニドを表し、
L はO、 NR、又はSであり;
m は0以上4以下の整数であり;そして
n 及びo は0以上6以下の整数である。
はOHである。
はOHであり、そしてR5 はOHである。
はOHであり、R5 はOHであり、そしてR6 はHである。
はOHであり、R5 はOHであり、R6 はHであり、そしてR7
はHである。
はOHであり、R5 はOHであり、R6 はHであり、R7
はHであり、そしてL はNHである。
はOHであり、R5 はOHであり、R6 はHであり、R7
はHであり、L はNHであり、そしてn は 1である。
はOHであり、R5 はOHであり、R6 はHであり、R7
はHであり、L はNHであり、n は 1であり、そしてo は1である。
vivoで遊離させる、あらゆる共有結合した担体であると考えられる。ここで解説された化合物の、in vivo 分解生成物などの代謝産物も含まれる。
vivoで刺激又は阻害するなど修飾する作用物質を同定する方法は、(i)細胞を、検査物質と、クラスI及びクラスII HDACの阻害剤の存在下で細胞に進入することができる基質とに、該検査物質の非存在下でも該サーチュインが該基質を脱アセチル化するために適した条件下で接触させるステップと;(ii)該基質のアセチル化レベルを判定するステップであって、但しこの場合、該検査物質の非存在下に比較したときに該検査物質の存在下における該基質のアセチル化レベルが低いことは、該検査物質が、該サーチュインによる脱アセチル化を刺激することを示し、他方、該検査物質の非存在下に比較したときに該検査物質の存在下における該基質のアセチル化レベルが高いことは、該検査物質が、該サーチュインによる脱アセチル化を阻害することを示す、ステップとを含む。好適な基質は、ここで更に解説する(実施例)ように、アセチル化ペプチドであるが、このアセチル化ペプチドは好ましくは蛍光原性であるとよい。本方法は、更に、細胞を溶解させて、基質のアセチル化レベルを判定するステップを含んでもよい。基質は、約1μM乃至約10μM、好ましくは約10μM乃至1mM、更により好ましくは、例えば約200μMなど、約100μM乃至1mMの範囲の濃度で細胞に添加されてよい。好適な基質はアセチル化リジン、例えばε-アセチルリジン(FluoR
de Lys、FdL)又はFluoR de Lys-SIRT1である。クラスI及びクラスII HDACの好適な阻害剤は、約0.01乃至100μM、好ましくは1μMなど約0.1乃至10μMの範囲の濃度で用いてもよいトリコスタチンA(TSA)である。細胞の検査化合物及び基質とのインキュベーションは、約10分間乃至5時間、好ましくは約1−3時間、行われてもよい。TSAはすべてのクラスI及びクラスII HDACを阻害し、この特定の基質、例えばFluoR de Lysなど、はSIRT2にとっては弱い基質であり、そしてSIRT3-7にとっては更に弱い基質であるため、このような検定を、SIRT1のin vivoでの修飾物質を同定するために用いてもよい。検定の一例を実施例で更に解説し、図4aに示す。
ある実施態様では、細胞をここで解説する通りに in vitRo で処理して、増殖期をより長くしたり、それらのストレス耐性を増す、又は、アポトーシスを妨げるなどのために、それらの寿命を延長するなどのために、カロリ制限を模倣する。ここで解説された化合物は、ストレスへの耐性を増すであろう。これは、少なくとも、SiR2がストレス耐性をもたらし、そしてPNC1が細胞ストレスに応答してSiR2活性を修飾するという観察に少なくとも基づく(AndeRson et al. (2003) NatuRe 423:181)。これは特に、培養では限られた寿命しか有さないことが公知の初代細胞培養株(即ち、ヒトなどの生物から得た細胞)で特に有用である。例えば細胞を活性化又は寿命延長性化合物に接触させるなど、このような細胞をここで解説された方法に従って処理すると、培養で細胞が生きた状態に維持される時間が増すであろう。細胞は神経前駆細胞又は神経幹細胞などの神経細胞であってもよい。胚性幹(ES)細胞及び多能細胞や、それらから分化した細胞も、細胞又はそれらの後代をより長時間、培養で維持するなどのために、ここで解説された方法に従って処理することができる。「ニューロン」、「神経細胞」又は「神経細胞」は、例えば星状細胞、マルティノッティ細胞、カハル水平細胞、錐体細胞、顆粒細胞及びプルキンエ細胞などの感覚子神経細胞、運動(遠心性)ニューロン又は連合(連結又は神経細胞間)ニューロンなどであってもよい。
Cell 117:495などに解説された通りに処理することにより、調製することができる。ニコチンアミドリボシドは、酸化型又は還元型であってよいが、この後者はより安定であるようである (FRiedlos et al. (1992) Biochem PhaRmacol. 44:631。ニコチンアミドリボシド (1) を下に示す。
R はそれぞれ独立に、H、アセチル、ベンゾイル、アシル、ホスフェート、スルフェート、(アルキオキシ)メチル、トリアリールメチル、(トリアルキル)シリル、(ジアルキル)(アリール)シリル、(アルキル)(ジアリール)シリル又は(トリアリール)シリルを表し;そして
X はO 又は Sを表す。
本方法に従って用いる医薬組成物は、一種以上の生理学的に許容可能な担体及び医薬品添加物を用いて従来の態様で調合できよう。このように、活性化化合物及びそれらの生理学的に許容可能な塩及び溶媒化合物は、例えば注射、吸入又は通気(口又は鼻を通じて)又は経口、バッカル、非経口又は直腸投与などによる投与用に調合できよう。ある実施態様では、当該の化合物を、例えば罹患細胞などの標的細胞が存在する部位、即ち血中又は関節内に局部投与する。
1992), volume 9)。マイクロ乳濁液の調製には、界面活性剤(乳化剤)、共-界面活性剤(共-乳化剤)、油相及び水相が必要である。適した界面活性剤には、クリームの調製に典型的に用いられている乳化剤など、乳濁液の調製で有用なあらゆる界面活性剤がある。共-界面活性剤(又は共-乳濁剤)は、一般的には、ポリグリセロール誘導体、グリセロール誘導体及び脂肪アルコールから成る群より選択される。好適な乳化剤/共-乳化剤の組合せは、一般的には、しかし必ずしもではないが、モノステアリン酸グリセリル及びステアリン酸ポリオキシエチレン;ポリエチレングリコール及びパルミトステアリン酸エチレングリコール;並びにカプリン酸及びカプリル酸トリグリセリド及びオレオイルマクロゴールグリセリド、から成る群より選択される。水相には、水だけでなく、典型的には、緩衝剤、グルコース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、好ましくは低分子量ポリエチレングリコール(例えば PEG 300 及びPEG 400)、及び/又はグリセロール等が含まれ、他方油相は、一般的には、例えば脂肪酸エステル、改変植物油、シリコーン油、モノ-、ジ-及びトリグリセリドの混合物、PEGのモノ-及びジ-エステル(例えばオレオイルマクロゴールグリセリドなど)等を含む。
アルキル、メチルスルホキシド、例えばDMSO;ピロリドン、例えば2-ピロリドン及びN-メチル-2-ピロリドン;並びにDMA、がある。数多くの可溶化剤は吸収促進剤としても作用することができる。一種類の可溶化剤を当該の調合物に取り入れても、あるいは可溶化剤の混合物をそこに取り入れてもよい。
他の活性物質も調合物に含めてよい。
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(Neda et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:14143-14146)がある。つなげる方法は、タンパク質又は他の多種(例えばenvタンパク質をアシアロ糖タンパク質に転化させる乳糖など)との化学的架橋の形であっても、融合タンパク質の作製(例えば一本鎖抗体/env融合タンパク質)であってもよい。この技術は、特定の組織種に感染を制限又は指向させるために有用であるが、環境栄養性ベクタを両栄養性ベクタに変換するためにも用いることができる。
更にここでは、治療目的のためのキットなどのキットや、あるいは、細胞の寿命を修飾する、又は、アポトーシスを修飾するためのキットも提供される。キットは、例えば予め測定された用量でなど、ここで解説された一種以上の活性化又は阻害化合物を含んでよい。選択的には、キットは、細胞を当該化合物に接触させるための器具と、使用に関する指示を含んでよい。器具には、化合物を対象に導入したり、あるいは、それを対象の皮膚に施したりするためのシリンジ、ステント及び他の器具が含まれる。
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実施例1: SIRT1の低分子活性化剤
SIRT1活性を修飾する化合物を同定するために、我々は、数多くの低分子ライブラリを、蛍光脱アセチル検定を96ウェル・プレートで用いてスクリーニングした26。本検定で用いた基質は、in vivoにおけるSIRT1の公知の標的であるp53-K382アセチル化部位を含む配列に基づく蛍光原性ペプチドだった20,21,27。この基質は、他の公知のHDAC標的に基づいた多種の他の蛍光原性ペプチド基質よりも好ましかった(図5)。前記の低分子ライブラリには、ニコチンアミドの類似体、ε-アセチルリジン、NAD+、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及びプリン性リガンドも含まれていた。最初のスクリーニングでいくつかのサーチュイン阻害剤が見つかった(補助表7)。しかしながら、最も驚くべき結果は、SIRT1活性をそれぞれ5倍及び8倍、刺激したケルセチン及びピセアタンノールという2つの化合物の同定だった(表1)。ケルセチン及びピセアタンノールは、両者とも、タンパク質キナーゼ阻害剤として以前に同定されたものである28,29。
従って我々は、レスベラトロール、 EGCG、及び、上に挙げた数多くのポリフェノール・クラスの中の更なる代表を含む二回目のスクリーニングを行った。このスクリーニングでは、このグループで入手可能なヒドロキシル位置の変形例が多数であるため、フラボンがきわだった31。このスクリーニングの結果を補助表1−6に要約する。これらの表では、「コントロール速度に対する比」が1を越えることは、このような速度を持つ化合物は検査されたサーチュインの活性化剤であることを示し、1未満の数は当該化合物が阻害剤であることを示す。
レスベラトロール(3,5,4´-トリヒドロキシスチルベン)は、その付加的な3´-ヒドロキシルしか異ならないピセアタンノールよりも活性であったことに注目すべきである(表1)。4´-ヒドロキシルの活性にとっての重要性は、12種類の最も刺激性のあるフラボンのそれぞれがこの特徴を共有しているという事実で強調される(補助表1及び2)。
詳細な酵素動態調査をもっとも強力な活性化剤であるレスベラトロールを用いて行った。ポリフェノール・スクリーニング検定の条件下で行われた用量−応答実験(25μM NAD+、 25μM p53-382 アセチル化ペプチド)では、その活性化効果は11μMまでで速度を二倍にし、100μmのレスベラトロールで基本的に飽和したことが示された(図1a)。100μMのレスベラトロールの存在下又は非存在下における最初の酵素速度を、高NAD+ (3 mM NAD+、図1b)時のアセチル-ペプチド濃度の関数、又は、高アセチル-ペプチド (1 mM
p53-382 アセチル化ペプチド、図1c)時のNAD+ 濃度の関数として判定した。レスベラトロールは何の著しい効果も2つのVmax判定に対して持たなかった(図1b、1c)が、2つの見かけのKmには著明な効果を有していた。アセチル化ペプチドKmへのその効果は特に驚くべきものであり、35分の1の減少にまで至った(図1b)。レスベラトロールはNAD+のKmも5分の1まで低下させた(図1c)。レスベラトロールはKmにのみ作用するため、それを「K系」型のアロステリック・エフェクタとして分類できるかも知れない34。これは、この酵素の基質結合親和性のみが変化したのであり、律速触媒ステップが変化したのではないことを意味しているかも知れない。
これらの化合物がサーチュインをin vivoで刺激できるかどうかを調べるために、我々は、SiR2の上流の調節因子及び下流の標的が比較的によく理解されている生物であるS.セレビジエを用いた。SiR2脱アセチル化速度のレスベラトロール用量応答研究(図2a)では、実際に、レスベラトロールがSiR2をin vitRoで刺激し、その活性化剤の最適な濃度は2- 5μMであることが明らかになる。活性化のレベルはSIRT1のそれよりも幾分低く、またSIRT1とは違って、阻害は100μMを越える濃度で見られた。
これらの化合物がヒトSIRT1をin vivoで刺激できるかどうかを検査するために、我々はまず、我々が開発した細胞デアセチラーゼ検定法を用いた。この検定の手法の概略図を図4aに示す。細胞を、蛍光原性ε-アセチル-リジン基質「FluoR de Lys」(FdL)を含有する培地と一緒にインキュベートする。この基質は、アセチル化しているときには中性であるが、脱アセチル化すると正に荷電し、細胞内に蓄積する(図6aを参照されたい)。細胞を溶解させ、非細胞透過性「発色剤」試薬を添加すると、脱アセチル化した基質分子から特異的に蛍光体が放出される(図4a及び方法の項を参照されたい)。接着して成長させたHeLa細胞では、この検定で生じるシグナルの5-10% が、クラスI及びII HDACの強力な阻害剤であるがサーチュイン(クラスIII)の阻害剤ではないトリコスタチンA(TSA)1μMに対しては感受性がない42(図6b及び6c)。
化合物ライブラリ及び脱アセチル化検定
His6-タグ付き組換えSIRT1 及びGST-タグ付き組換えSiR2を前に解説された通りに調製した26。 0.1乃至1μgのSIRT1及び1.5μgのSiR2を、前に解説された通りに脱アセチル化検定毎に(全反応で50μl)用いた26。SIRT1検定及び いくつかのSiR2検定で、FdLではなくp53-382アセチル化基質(バイオモル社「FluoR de Lys-SIRT1」)を用いた。
酵母株はすべて、30℃で、他に述べた場合を除き、完全酵母抽出物/バクトペプトン、2.0% (w/v) グルコース (YPD) 培地で成長させた。カロリ制限を0.5% グルコースで誘導した。合成完全 (SC) 培地は、1.67% 酵母窒素ベース、2% グルコース、それぞれ40 mg/リットルの栄養要求性マーカから構成した。SIR2 を余分なコピーに組み込ませ、解説された通りに破壊した5。他の株は他の箇所で解説されている26。細胞脱アセチル化検定については、HeLa S3細胞を用いた。U2OS骨肉腫及びヒト胚性腎 (HEK 293) 細胞を、10%のウシ胎児血清(FCS)を1.0%グルタミン及び1.0%ペニシリン/ストレプトマイシンと一緒に含有するダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)で接着培養した。ドミナント・ネガティブSIRT1 H363Yを過剰発現するHEK 293はR. フライ氏(ピッツバーグ大)からの提供である。
寿命の測定を、PSY316AT MATαを前に解説された通りに用いて行った35。寿命分析用の化合物はすべて、95%エタノールに溶解させ、プレートを乾燥させ、24時間以内に用いた。寿命分析の前に、細胞をそれらの各培地上で少なくとも15時間、プレインキュベートした。新しいプレートへ移した後、細胞を培地上で最小4時間、平衡させてからそれらをマイクロ操作した。少なくとも30個の細胞を1実験当たり調べ、各実験を少なくとも2回、行った。寿命の統計学的に有意な差はウィルコキソンの順位和検定を用いて判定された。信頼度が95%を越えるときに差が有意であるとした。
URA3レポータを用いたリボゾームDNAサイレンシング検定を前に解説された通りに行った26。W303AR細胞37を低アデニン/ヒスチジンのYPD 培地上にプレートし、半分が赤く染まったコロニの割合をBio-Rad クォンティティ・ワン・ソフトウェアを前に解説された通りに用いて計数することにより、リボゾームDNA組換え頻度を判定した35。少なくとも6000個の細胞を一回の実験当たり分析し、全ての実験を三重にして行った。株はすべて、関係する化合物と一緒に、プレート前に15時間、予め成長させた。
組換えSiR2-GSTをE. coli で前に解説された通りに発現させ、精製したが、例外としてライセートは音波破砕を用いて調製した26。E. coli由来の組換えSIRT1を前に解説された通りに調製した26。p53-AcK382 に対するポリクローナル抗血清は、アセチル化ペプチド光源を前に解説された通りの用いて生じさせた20が、以下の変更を行った。抗Ac-K382抗体を非アセチル化p53-K382ペプチドを用いて親和精製し、−70℃のPBS中に保存すると、アセチル化したものは認識したが、アセチル化していないp53ペプチドは認識しなかった。抗アセチル化K382又は抗アクチン(ケミコン社)抗体を用いたウェスタン・ハイブリダイゼーションを1:1000 の抗体希釈度で行った。ポリクローナルp53抗体(サンタクルズ・バイオテック社)によるハイブリダイゼーションでは、1:500の抗体希釈度を用いた。150 mM NaCl、1 mM MgCl2、10% グリセロール、1% NP40、1 mM DTT 及び抗プロテアーゼ・カクテル(ロシュ社)を含有する緩衝液中で細胞を溶解させることにより、全細胞抽出物を調製した。
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酵母SiR2及びヒトSIRT1は大変相同性が高く、ヒトSIRT2とは、SIRT2にはないN末端ドメインが加わっている点で異なる。レスベラトロールの効果を、ヒト組換えSIRT2について以下のように検定した。ヒト組換えSIRT2を、25μMのFluoR de
Lys-SIRT2 (バイオモル社カタログ番号KI-179)及び25μMのNAD+を加えた1.25μg/ウェルの濃度で20分間、37℃で上に解説した通りにインキュベートした。図7に示すその結果は、SIRT1とは対照的に、レスベラトロールの濃度が増すにつれ、SIRT2活性が低下したことを示す。このように、SIRT1 及びSIRT2の構造上の違い、即ちN末端ドメインがないこと(図8を参照されたい)、に基づくと、SIRT1 及びSiR2 のN末端ドメインは、ここで解説した化合物による活性化に必要であると考えられる。具体的には、ここで解説された活性化剤化合物は、サーチュインのN末端部分と相互作用している可能性が高い。当該の化合物の作用にとって必要なSIRT1のこのN末端部分とは、約アミノ酸1位から約アミノ酸176位までと、SiR2のそれは約アミノ酸1位から約アミノ酸175位までである。
50匹のC.エレガンス蠕虫(株N2)を、100μMのレスベラトロールの存在下又は非存在下で、17日間、成長させた。17日目には、レスベラトロールのないコントロール群では5匹の蠕虫しか、生きていなかったが、レスベラトロールで処理された群では17匹の蠕虫が生きていた。このように、C.エレガンスの成長培地中にレスベラトロールが存在すると、それらの寿命が延長される。
実施例1で解説したスクリーニング検定を用いて、更に5つのサーチュイン活性化剤が同定された。これらを補助表8に記載する。
実施例で解説したスクリーニング検定を用いて、より多くの阻害剤を同定した。これらは補助表8に記載され、コントロール速度に対する比が1未満の化合物に相当する。
サーチュインの更なる活性化剤及び阻害剤を同定し、表9−13に記載する。これらの表において、「SE」は平均値の標準誤差を表し、そしてNは、平均のコントロール速度に対する比及び誤差を計算するために用いられた重複測定の数である。
は、25μMではなく5μMのp53-382アセチル化ペプチドが用いられたことを除き上記と同様に行われたSIRT1 比測定から得られた。熟成したストック溶液から希釈した化合物で得られたフォールド刺激(コントロール速度に対する比)を、固体化合物から調製したばかりのストック溶液からの同一の希釈液と比較した。「t1/2」は、熟成溶液からの化合物のSIRT1フォールド刺激が、調製したばかりの溶液から得られるそれの半分まで崩壊するのに必要な時間であると定義しておく。レスベラトロール、BML-212 及びBML-221のエタノール・ストックを2.5mMで調製し、当該の化合物を50μMの最終濃度で検定した。レスベラトロールの水ストックは100μMであり、検定は10μMで行われた。ストックをガラス製バイアルに入れて窒素雰囲気下で室温で保存することにより熟成させた。
(w/v) グルコース標準酵母完全培地
(YPD) を用い、標準的条件下で行われた。
b. 寿命検定は、N2 蠕虫に対して、E. coli を食糧として標準的条件下で行われた。
ND. 判定せず。
位置に置換を持つグループは、優れた薬理学的特性を持つ新しいSIRT1リガンドのデザインを特徴付ける上で助けになるであろう。この関係で興味深いと思われるパラメータの一つは安定性である。4’-置換類似体の一つであるBML-221は、レスベラトロールと比較して遙かに優れた溶液安定性を示し、in vitRo SIRT1活性化能は弱まっているが、レスベラトロールの生物学的活性の多くを保持している(寿命データを参照されたい)。レスベラトロールの4’-ヒドロキシルは、レスベラトロールのフリーラジカル除去反応性にとって第一に重要であると考えられる(S. Stojanovic et al. ARch.
Biochem. Biophys. 2001 391 79)。4’-置換類似体の大半は、溶液安定性についてはまだ検査されていないが、もしレスベラトロールの溶液中での不安定性がレドックス反応性が原因であるとすると、他の類似体の多くも、優れた安定性を示すであろうと予測される。
レスベラトロール類似体の大半を、同じ概略的手法により、一対の中間体、ベンジルホスホネート及びアルデヒドから合成した。これらの中間体の合成又は源は、第二項に解説されている。第三項は、ベンジルホスホネート/アルデヒドの対のいずれかから最終的な化合物を合成するための手法を解説する。カップリング反応(第三項、A)には、当該の中間体がメトキシメチル(第三項、B)又はメトキシ(第三項C)の保護基のいずれを含有するかに応じて、2つの脱保護反応の一方が続く。第四項は、特定の最終的化合物の合成で用いられる特定のベンジルホスホネート及びアルデヒドを挙げる表14−18に相当する。当該化合物−レスベラトロール、3,5-Diヒドロキシ、-4’-メトキシ-tRans-スチルベン、ラポンチンアグリコーン、BML-227、BML-221、ジヒドロレスベラトロール、BML-219−のうちの7つは該概略的手法では合成されず、「N/A」が表のそれらの見出しの隣に記載されている。レスベラトロールはバイオモル社製であり、残りの化合物の合成は第五項に解説されている。
A. ベンジルホスホネート(合成)
ジエチル 4-アセトアミド、ベンジルホスホネートの合成:ジエチル 4-アミノベンジルホスホネートの1:1 塩化メチレン/ピリジン溶液に、触媒性DMAP及び無水酢酸 (1.1 eq.)を加えた。3時間後、この反応液を蒸発させて乾燥させ、フラッシュ・クロマトグラフィ(シリカゲル)で精製した。
3,5-ジメトキシメトキシベンズアルデヒドの合成: 0℃の3,5-ジヒドロキシベンズアルデヒドのDMF溶液に水素化ナトリウム (2.2 eq.)を加えた。この反応液を30分間、0℃で攪拌した。クロロメチルメチルエーテル (2.2 eq.) をそのまま滴下で加え、その反応液を室温まで1.5時間かけて温めた。その反応混合液をジエチルエーテルで希釈し、水 (2X) 及びブライン (1X) で希釈し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。フラッシュ・クロマトグラフィ(シリカゲル)により所望の生成物を生じさせた。
A. ベンジルホスホネート/アルデヒドカップリング法
適した室温のベンジルホスホネート (1.2 eq.)のジメチルホルムアミド(DMF)溶液に、ナトリウムメトキシド(1.2 eq.)を加えた。この溶液を室温ほぼ45分間、攪拌した。次に、適したアルデヒド (1 eq.)を加えた(そのままで、又は、ジメチルホルムアミドの溶液の入れて)。その後、できた溶液を一晩、室温で攪拌した。薄層クロマトグラフィ(TLC)を用いて、この反応の終了を判定した。反応が終了していない場合、終了するまで溶液を45−50℃で加熱した。その反応混合液を水に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出した(2×)。配合した有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。フラッシュ・クロマトグラフィ(シリカゲル)により所望の生成物を生じさせた。
適したメトキシメチルスチルベン誘導体のメタノール溶液に濃塩酸を二滴、加えた。その結果できた溶液を一晩、50℃で加熱した。反応終了時、この溶液を蒸発させて乾燥させた。フラッシュ・クロマトグラフィ(シリカゲル)により、所望の生成物を生じさせた。
適したメトキシスチルベン誘導体の塩化メチレン溶液にヨウ化テトラブチルアンモニウム(メトキシ基一個当たり1.95 eq. )を加えた。この反応液を0℃まで冷却し、三塩化硼素(塩化メチレン中に1M;メトキシ基一個当たり2 eq. )を滴下で加えた。三塩化ホウ素の添加後、冷却槽を取り除き、反応液を室温で終了(TLCで示される)するまで攪拌した。飽和中炭酸ナトリウム溶液を加え、反応液を1時間、よく攪拌した。反応液を冷やした 1Mの塩酸中に注ぎ入れ、酢酸エチル(3×)で抽出した。配合した有機層を水(1×)及びブライン(1×)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。フラッシュ・クロマトグラフィ(シリカゲル)により、所望の生成物を生じさせた。
BML-219 (N-(3,5-ジヒドロキシフェニル)ベンズアミド)の合成:室温の無水塩化メチレンに入れた塩化ベンゾイル (1 eq.) にトリエチルアミン (1.5 eq.) 及び触媒量のDMAPを加えた後、3,5-ジメトキシアニリン (1 eq.)を加えた。この反応液を一晩、室温で攪拌した。終了時、この反応液を酢酸エチルで希釈し、1M の塩酸、水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。フラッシュ・クロマトグラフィ(シリカゲル)により、メトキシスチルベン誘導体を生じさせた。0℃のメトキシスチルベンの無水塩化メチレン溶液に、ヨウ化テトラブチルアンモニウム (3.95 eq.) を加えた後、三塩化ホウ素(4 eq.; 塩化メチレン中1M)を加えた。反応の終了時(TLC)、飽和重炭酸ナトリウムを加え、この混合液を1時間、よく攪拌した。この反応液を酢酸エチルで希釈し、1M の塩酸及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。フラッシュ・クロマトグラフィ(シリカゲル)により、所望の生成物を生じさせた。
ラポンチンのメタノール溶液に触媒のp-トルエンスルホン酸を加えた。この反応液を一晩、還流させた。反応の終了時(TLC)、この反応混合液を蒸発させて乾燥させ、酢酸エチル中に取り入れた。有機物を水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。フラッシュ・クロマトグラフィ(シリカゲル)により、所望の生成物を生じさせた。
活性化剤濃度の関数としてのSIRT1初速度をそれぞれ25μMのNAD+ 及びp53-382アセチル化ペプチドで、20分間のインキュベーションで判定した。SIRT1 のBML-230 及びレスベラトロールに対する用量応答の表は、BML-230で刺激された活性が、検査したすべての濃度で、レスベラトロールにより刺激されるそれを越えることを示している(図9a)。これは、 SIRT1がBML-230に対してより結合親和性が高いこと、SIRT1/BML-230 複合体又はこの二者の何らかの組合せの結合親和性が高いことが原因かも知れない。BML-230で刺激される酵素の速度の、レスベラトロールで刺激される酵素のそれに対する比の表は、結合親和性の高さが、BML-230の活性の向上に寄与することを示している(図9b)。結合及び活性化プロセスの簡単な2相モデルは、観察される速度(v)が、複合体を形成していない酵素と、複合体を形成した酵素の分数的寄与の合計であることを想定しており、この場合、 v0 は非刺激速度であり、v1 はリガンド-1(L1)を結合させた酵素の速度であり、そしてKL1 は酵素/リガンド-1複合体の解離定数である:
v = v0(1-[L1]/(KL1
+ [L1])) + v1(-[L1]/(KL1 + [L1])
[L]=[L1]=[L2]が含まれよう。2つのリガンドの解離定数が等しい場合 (KL1=KL2=KL)、この比は:
R = (v0KL
+ v1[L])/ (v0KL + v2[L])
になるであろう。
R = (v1[L]2
+ (v0KL1 + v1KL2 )[L] + v0KL1KL2)/
(v2[L]2 + (v0KL2 + v2KL1
)[L] + v0KL1KL2)
であろう。
に単調に近づいていく単純な双曲線になるであろう。二番目のケースでは、図9bのように、当該の表は、[L」値が高くなるに従ってv1/v2
に達する前に最大を通過するであろう。図9bのデータは、 v1/v2 (純粋なSIRT1/BML-230の速度を純粋なSIRT1/レスベラトロールのそれで除算したもの)
が ~1.4 (R は500μM)を越えず、またSIRT1/BML-230
複合体が実際に SIRT1/レスベラトロールよりも低い解離定数を有する(KL1
< KL2)ことを意味するものであろう。
GoldbeRg et al. Clin. Biochem. 2003
36 79を参照されたい)。合成誘導体のSIRT1結合親和性を高めれば、薬物のこの局面が向上するであろう。上に述べたように、例えば、ピノシルビンのH-、又はBML-217の-Clなど、レスベラトロール 4’-ヒドロキシルの多様な置換では、SIRT1活性化効果は大きくは減じられなかった。BML-230で得られた結果は、その部位を改変することにより、SIRT1/活性化剤結合親和性を実際に増すことが可能であろうことを示している。従って、BML-230の4’-チオメチルは、関連する誘導体(例えば4’-チオエチル等)の合成によりSIRT1結合親和性の更なる向上を探求する上での新しい開始点となる。
ヒト293を対数期まで標準的な条件下で成長させ、ある用量の化合物(50マイクロモル)に96時間、曝した。各時点での生存細胞の数をコールター・カウンターを用いて計数した。
カロリ制限(CR)は数多くの種で寿命を延長する。出芽中の酵母S.セレビジエでは、この効果には、サーチュイン・ファミリのNAD+-依存的デアセチラーゼ2,3の一メンバであるSiR21を必要とする。サーチュイン活性化化合物 (STAC) はヒト細胞の生存を促進し、酵母の複製寿命を延長することができる4。ここで我々は、レスベラトロール及び他のSTACが、ケノハブディティス-エレガンス及びドゥロソフィラ-メラノガスター由来のサーチュインを活性化し、これらの動物の寿命を、生殖能力を減じることなく最高で29%、延長することができることを示す。寿命の延長は機能的SiR2に依存し、栄養が制限された場合には観察されない。まとめると、これらのデータは、STACが後生生物の老化を、CRに関係する機序により遅らせることを示すものである。
yw 印付きの野生型株及び人口統計培養条件(ケージ)を用いて検査した(表20)。オス及びメスの独立した検査全体で、寿命は、フィセチンにより最高23%、そしてレスベラトロールにより最高29%、延長された(図12a、c、e)。寿命の延びは40日目前の死亡率の減少と関係していた(図14)。制限食によっては寿命はメスで40%、そしてオスでは14%、増加し(試験全体の平均)、そしてこれらの条件下では、レスベラトロール又はフィセチンのいずれも、それ以上、寿命を増すことはなかった(図12b、d、f)ことから、レスベラトロールはCRに関係する機序を通じて寿命を延長することが示唆された。
(図13c、d)では、寿命を延長することができなかった。レスベラトロールは、低次形態性dSiR2 対立遺伝子についてホモ接合型のハエ (dSiR2KG0087/
dSiR2KG0087) では、少しだが統計上は有意な量、寿命を延長し(表30、試験6)、そしてこの低次形態性対立遺伝子のコピーを一つと、野生型dSiR2 のコピーを一つ持つハエ(Canton-S/ dSiR2KG0087) では最高17%、寿命を増加させた(表20、試験7)。これらのデータは、レスベラトロールの、ハエの寿命を延長する能力には機能的なSiR2が必要であることを実証するものである。
サーチュインの精製
His6-タグ付き組換えSIR-2.1及びdSiR2を、pET28a-siR-2.1 又は pRSETc-dSiR2プラスミドのいずれかを持つE. coli BL21(DE3) plysS細胞から精製した。細胞を、pET28a-siR-2.1にはカナマイシン(50μg/mL) を、又は、pRSETc-dSiR2にはアンピシリン(100μg/ml) 及びクロラムフェニコール(25μg/ml) を、含有するLB培地中で30℃ (dSiR2) 又は37℃ (SIR-2.1) で成長させて0.6-0.8の OD600 にした。IPTG (1 mM)の添加後、フラスコを16℃に20時間、移動させた。細胞ペレットを300 mM NaCl、0.5 mM DTT、0.5 mM PMSF 及び無EDTAプロテアーゼ阻害剤錠剤を含有する冷やしたPBS緩衝液中に再懸濁させ、音波破砕で溶解させた。Ni2+-NTA ビーズを、その清澄した抽出物に加え、1−3時間後にこれらをカラムに充填し、緩衝液 (50 mM TRis. Cl pH 7.4、200 mM NaCl、30 mM イミダゾール) で洗浄した後、600 mM イミダゾールを含有する同じ緩衝液で溶出させた。
0.1 乃至 1μgのSIR-2.1 及び1μgのdSiR2 を、脱アセチル化検定毎に、変更はあるが前に解説された通りに(SIR-2.1:
200μM NAD+、10μM FluoR de Lys、FdL;dSiR2: 25μM NAD+、 10μM FdL)用いた26。STACを10 mM 、ジメチルスルホキシド (DMSO)中に検定当日に溶解させた。 In vitRo蛍光検定の結果を96ウェル・マイクロプレート(コーニング・コスター 3693)内でウォラック・ビクタ・マルチラベル・カウンタ
(パーキン・エルマ社、360
nmで励起、450 nmで放出)で読み取った。ドゥロソフィラS2 細胞をウシ胎児血清を入れたシュナイダー培地で23−28℃で成長させ、 9x104 個の細胞/ウェルになるように播種し、一晩成長させた後、1μM TSA、500μM ポリフェノール、及び200μM FdL に2時間、曝露した。全細胞のライセートによるDdLの脱アセチル化を解説された通りに判定した4。
他に明示しない限り、全ての初速度測定は、最初に存在した基質の5%以下が脱アセチル化した時点で、単一のインキュベーション時間で得られた三重以上の重複測定の平均であった。
ブリストル N2 (ケノハブディティス、ジェネティックス・センター)を野生型株として用いた。siR-2.1 変異株は、VC199 (siR-2.1(ok434)) をN2 に4回、戻し交配することにより作製された。培養株を標準的NGM培地上で成長させ、E. coli 株 OP50上に維持した。寿命検定については、同期化させた動物を若い成体(孵化から2日後、検定0日目)として処理プレートに移し、検定の最初の6乃至8日目までの間、2日毎に新鮮な処理プレートに移した。処理プレートは、PBSを注ぎ入れる(生きたOP50試験の場合)前に寒天に直接加えるか、又は、PBSで希釈してから示した最終濃度まで乾燥したプレート表面に加えた(死んだOP50試験の場合)、レスベラトロール又は溶媒(寿命に影響しないDMSO)を含有する増殖抑制剤 FUdR (シグマ社;100mg/L)を加えた標準的なNGM培地だった。いくつかの寿命試験については、熱で死滅させたOP50 を食糧源として用いた。OP50培養株を65℃まで、30分間、加熱した後ペレットにし、10mM MgSO4を添加したS Basal中に1/10容積になるように再懸濁させた。全ての検定で、プラチナ製ピックで静かにプローブすることにより、蠕虫を死亡率について毎日、観察した。検定は24℃で行われた。
生存率検定を、成体D.メラノガスターで2つの研究室で個別に行った。一番目の研究室では、すべての試験で、yw マークの付いた野生型株を用いた。幼虫を標準的な市販の糖-酵母(CSY)寒天食(コーンミール5%、ショ糖 10.5%、SAF 酵母2%、及び寒天0.7%)で飼育した。新たに孵化した成虫のオスほぼ75匹及びメス75匹、1L の人口統計ケージ内に入れた。3乃至4個の重複1L人口統計ケージを、各試験において各処理群に用いた。2日毎に死んだハエを取り除き、採点し、食料バイアルを新しいものにした。食料バイアルは、コーンミール-糖-酵母食に、重量で2%又は3%のSAF酵母を加えたものを含有していた。100μlのEtOHに入れた検査化合物(又はコントロールではブランクEtOH)を、溶解させたアリクォートの成虫食料培地に混合して、最終濃度を0、10又は100μMとした。新鮮なストック溶液及び成虫の培地を毎週、調製した。二番目の研究では、寿命試験を野生型株カントン-S、dSiR2 4.5 及びdSiR2 5.26 (オレゴン大学、S.スモリック氏)、dSiR217 (スウェーデン、ストックホルム大、S.アストロム氏)、及び dSiR2KG00871 (インディアナ州ブルーミントン、ドゥロソフィラ・ストック・センター)で行った。全検査の幼虫は標準的なコーンミール-糖-酵母食で飼育された。新たに孵化した成虫を、5 ml の15% 糖-酵母食 (15% SY) 又は 5% 糖-酵母 (5% SY) 食 (15% SY: 15% 酵母、15% ショ糖、2% 寒天;5% SY: 5% 酵母、5% ショ糖、2% 寒天を参考文献20の通り)を含有するプラスチック製のシェル・バイアル内で保温した。全ての試験において、最高20匹のオスと最高20匹のメスを10バイアル/処理群のそれぞれの中に配置した。2日毎にハエを新しいバイアルに通し、死んだハエを計数した。EtOHに入れたレスベラトロール(又はコントロールではEtOHのみ)を培地に、それを65℃まで冷却した後のその調製中に入れ、よく混合した。最終化合物濃度は0、10、100 又は200μMだった。新鮮なストック溶液及び成虫培地を毎週、調製した。
食で飼育した。オス及びメスを毎日、体重測定した。
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以下の高スループットのスクリーニング・プロトコルを用いて、更なる低分子サーチュイン活性化剤及び阻害剤をICCBライブラリから同定した。
A. 材料及び方法
タンパク質調製及びウェスタン・ブロット
抱水クロラールの腹腔内注射によりマウスをと殺した。マウス脊髄、マウス前脳、マウス海馬又は前前頭皮質の総タンパク質抽出物を、SDS-ウレアβ-メルカプトエタノール(0.5%
SDS、8M ウレアの 7.4 リン酸緩衝液溶液)又は TRiton X-100 (10 mM
TRis-HCl [pH 7.5]、150 mM NaCl、1 mM EDTA [pH
8.0]、及び 1% TRiton)中へのホモジナイゼーションにより得た。タンパク質濃度はブラッドフォード法(カリフォルニア州ヘラクレス、Bio-Rad LaboRatoRies社)により推定された。タンパク質を 7.5% SDS-PAGE で分画し、ウェスタン・ブロット分析用のニトロセルロース又はPVDF メンブレンにブロットした。メンブレンをSIRT1(07-131、Upstate社)、α-チューブリン(B512、Sigma社)、アクチン
(MAB 1501、Chemicon社)、FAK (C-20、Santa CRuz Biotechnology社)、Bax(N-20、Santa CRuz社)、GFP(B-2、Santa CRuz社)に対する抗体と一緒にインキュベートした。そのウェスタン・ブロットは、NEN Life Science 社(マサチューセッツ州ボストン)製のウェスタン・ブロット化学発光キットであるRENAISSANCEで明らかになった。定量をアクチン、α-チューブリン及びFAK のレベルで補正し、 Labscan プログラム(Image MasteR、2D ソフトウェアv
3.10、AmeRsham PhaRmacia biotech社)で行なった。
ラット皮質/初代神経細胞を分離し、培養し、リポフェクタミン 2000 でto Nguyen, M. D. et al. (Nat
Cell Biol 6, 595-608 (2004)) に従って 3 (SIRT1 又は SIRT1 H363Y 又は p53 RNAi): 1 (p25-GFP、WT SOD1 又は SOD1G93A 又は GFP)の比でトランスフェクトした。初代皮質神経細胞のイオノマイシン (1μm)、過酸化水素 (25μm) 又はレスベラトロール (50 nm 乃至 500 nm) により処理を Lee, M. S. et al. (NatuRe
405, 360-4 (2000))に従って行なった。
細胞の染色を
Nguyen, M. D. et al. (Nat Cell Biol
6, 595-608 (2004)) に従い、チューブリン (Tuj1;α-チューブリン、B512、Sigma AldRich社)、GFP (MoleculaR PRobes社)、SOD1
(Biodesign社)、FLAG (M2、Sigma社)に対する抗体を用いて行なった。ヒト前前脳皮質組織の染色を、CRuz, J. C. et al. (NeuRon
40, 471-83 (2003)) に従って SIRT1 (07-131、Upstate社) 及び APP/Aβ (4G8)に対する抗体を用いて行なった。
トランスジェニック・マウス及び p25 誘導性マウスの作製
SOD1G37R
(line 29) (G37R) を過剰発現するトランスジェニック・マウス及びp25-CK トランスジェニック・マウスを前に解説された通りに作製し、純粋なC57BL6 バックグラウンド (CRuz, J. C., et al., NeuRon
40, 471-83 (2003); Nguyen, M. D. et al., NeuRon
30, 135-47 (2001)上に維持した。
二重カニューレ(プラスチック1)を移植してから7日後に
1.2 % アベルチン麻酔 (0.4
ml/マウス)での実験を前に解説された通り (FischeR, A., et al.,
J NeuRosci 24, 1962-6 (2004)に行なった。レスベラトロール注射に向けてカニューレを AP - 0.5
mm、横 1 mm、深さ2 mmになるように側方脳室の両方に配置した。レスベラトロール(5μg/μl)又は賦形剤を両側に 2-3
x/週(5μgレスベラトロール/1μl/マウス)に、マイクロインジェクタ (CMA/MicRodialysis社) を60秒間用いて注射し、0.5μlの体積がそれぞれの側に注射されるようにした。レスベラトロール (25%DMSO/人工脳脊髄液)を新鮮なものを調製してからすぐ、それぞれの注射を行なった。SIRT1 レンチウィルス注射の場合、カニューレを背側海馬のAP-1.5 mm、横 1 mm、深さ 2 mmに配置した。SIRT1-HAレンチウィルス(1.5μl)を上述したように左側海馬に注射したが、他方、SIRT1-HA レンチウィルス(1.5μl)は1週間誘導されたCK-p25
マウスの右側海馬に注射された。GFP神経細胞の数を注射部位まで1乃至2mmのところで計数した。神経細胞コントロール側/神経細胞SIRT1側の比を計算して、両方の側の間の神経細胞のパーセンテージの違いを定量した。
恐怖の条件付け装置
(TSE システム)は、制御装置及びPCコンピュータに接続された規定された光とバックグラウンドのノイズ のある2つの検査ボックスから成った。実験のプロトコルはTSE恐怖の条件付けソフトウェアを用いてデザインされ、行なわれた。ボックス1は電気脚ショックを与える格子を容れており、各トレーニング又は検査期間前に70% エタノールで清浄にされた。二番目のボックスには格子はなく、各検査前に 1% の酢酸で清浄にされた。このボックスは、音依存的な恐怖記憶を分析するために用いられた。恐怖の条件付けは、文脈(ボックス1;3分間)への一回の暴露の後、脚ショック(2秒間、0.7mA、定電流)というものから成った。24時間後、ブラインドにした二人の観察者により、文脈依存的なすくみを10秒毎に180秒間にわたって測定し、観察の全回数の%で表した。
P53 RNAi 配列をSui et al. (Sui, G. et al., PRoc Natl Acad Sci U S A 99, 5515-20
(2002))が提案した基準に基づいて選択した。相補なヘアピン配列を商業ベースで合成してもらい、 pSilenceR 2.0 中のプロモータ U6 (Ambion社)の下流にクローニングした。p53
の配列は塩基対: gga
gtc ttc cag tgt gat gat (SEQ ID NO:
32)である。いずれの公知のmRNAにも相同性のないランダム配列をコントロールRNAiに用いた。 RNAi コンストラクトの全てを細胞株及び初代神経細胞培養株で検査した。
免疫沈降法を、Nguyen,
M. D. et al. (Nat Cell Biol 6,
595-608 (2004))に従って p25トランスジェニックマウス及び野生型マウスの前脳に対し、 p53 (Ab-3) (Calbiochem社/Oncogene社)を狙ったモノクローナル抗体を用いて行なった。メンブレンを自家製の Ac-p53 Ab 及びマウスモノクローナルp53 抗体 (pAb-240、Abcam社)でプローブした。
年齢に伴う神経細胞の進行的な消失は、アルツハイマー病(AD)及び筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む多種の衰弱性神経障害の基盤にあるが、現在利用可能な治療法はほとんどない。SIR2遺伝子は多種の生物で長寿を促進するが、哺乳動物において老化及び神経変性を遅らせる食餌であるカロリ制限の健康上の利益の基盤にあるのかも知れない。我々はここで、SIR2のヒト相同体である SIRT1が、アルツハイマー患者、AD、ALSのマウスモデルの脳組織、そして神経毒を与えた初代神経細胞において上方調節されていることを解説した。 AD/老人病及び ALSの細胞ベースのモデルでは、SIRT1及びレスベラトロールというSIRT1-活性化分子は、両者とも、神経細胞生存を促進する。AD/老人病のモデルであるp25トランスジェニック・マウスにおいては、レスベラトロールは海馬で神経変性を減らし、そして公知のSIRT1基質であるp53のアセチル化を減少させた。細胞死を媒介する2つの下流 p53 エフェクタであるカスパーゼ3及びBaxも減衰された。更に、SIRT1レンチウィルスをp25マウスの海馬に注射すると、大規模な神経変性が妨げられる。このように、SIRT1 は、老化とヒト神経変性障害との間に固有な分子的関係を提供するものであり、SIRT1活性化は、治療的介入にとって将来性ある道なのである。
et al., Nat Med 10, 1055-63 (2004);
Selkoe, D. J., Nat Cell Biol 6, 1054-61 (2004))。神経変性疾患の基盤にある関係する機序の存在から、老化に関連する悪化及び細胞死に対する身体自体の防御を活性化することにより、多種の神経学的障害を治療する一クラスの治療的海流を開発できる可能性が持ち上がる(Bossy-Wetzel et al., Nat Med 10 Suppl, S2-9 (2004); FoRman, M. S.
et al., Nat Med 10, 1055-63 (2004); Selkoe, D. J., Nat Cell Biol 6, 1054-61
(2004))。酵母により研究で、進化上保存されたNAD+依存的デアセチラーゼSiR2が、老化プロセスの重要な調節因子として特定された (AndeRson, R. M. et al., Science 302, 2124-6 (2003); AndeRson, R.
M. et al., NatuRe 423, 181-5 (2003); Cohen, H. Y. et al., Science 305, 390-2
(2004); Howitz, K. T. et al., NatuRe 425, 191-6 (2003); KaebeRlein, M. et al.,
Genes Dev 13, 2570-80 (1999); Imai, S. et al., NatuRe 403, 795-800 (2000))。酵母及び後生生物では SIR2 遺伝子のコピーが付加的にあると、神経変性を含め、哺乳動物において老化の疾患を遅らせる食餌であるカロリ制限に見た目上似たプロセスにより寿命が延びる (AndeRson, R. M. et al., Science 302, 2124-6 (2003); AndeRson, R.
M. et al., NatuRe 423, 181-5 (2003); Lin, S. J. et al., Science 289, 2126-8 (2000)) (Cohen, H. Y. et al., Science 305,
390-2 (2004); Howitz, K. T. et al., NatuRe 425, 191-6 (2003); BRunet, A. et
al., Science 303, 2011-5 (2004);
Motta, M. C. et al., Cell 116, 551-63 (2004); Langley, E. et al., Embo J 21,
2383-96 (2002); Cohen, H. Y. et al., Mol Cell 13, 627-38 (2004); Luo, J. et
al., Cell 107, 137-48 (2001); VaziRi, H. et al., Cell 107, 149-59 (2001))。哺乳動物は7つのSiR2相同体 (SIRT1-7) を持つが、その生物学的機能はまだ余り定義されていないままである。SIRT1
遺伝子は、細胞ストレス期間中に細胞保護を提供すると考えられている (Cohen, H. Y. et al., Science
305, 390-2 (2004); BRunet, A. et al., Science 303, 2011-5 (2004); Motta, M. C.
et al., Cell 116, 551-63 (2004); Langley, E. et al., Embo J 21, 2383-96 (2002);
Cohen, H. Y. et al., Mol Cell 13, 627-38 (2004))。これと合致して、培養マウス背根ガングリオン感覚神経細胞の
SIRT1 遺伝子をノックダウンすると、急性軸索切断切除後の軸索変性に対するNAD+合成増加の防御効果が損なわれる(ARaki, T., et al., Science 305, 1010-3 (2004))。
E., J NeuRal TRansm Suppl 53, 127-40
(1998)。神経原線維濃縮体及び神経網糸の特徴的な分布パターンを用いて、BRaak 及びBRaak 分類法は疾患の進行において以下の6つの段階を認識する:I−II:経内網膜(臨床上は無症状な症例);III−IV、辺縁系(初発性AD);V−VI、新皮質(完全に発症したAD)(BRaak, H. & BRaak, E., J NeuRal TRansm Suppl 53, 127-40 (1998)。免疫ブロット法で検出すると、AD試料はコントロールに比較して高レベルの SIRT1 タンパク質を示した (2.55 ± 0.23 vs 1.36 ± 0.27; P (T<=t) two-tails: 0.004) (図43A)が、SIRT1レベル間や BRaak 及び BRaak 段階間に何の一致する相関も見出されなかった。次に、3個体由来のパラフィン包埋した前前脳皮質組織中のSIRT1 の局在 (コントロール #1 並びに AD #1 及び 2)を、間接的免疫蛍光法を用いて判定した。
免疫ブロットでのデータと合致して、AD試料由来の前前脳皮質の灰白質の神経細胞には劇的に高いレベルの SIRT1 があったが、全試料の白質領域はまれにしかSIRT1要請細胞を示さなかった(図43B)。強力なSIRT1染色区域は、AD病理の兆候であるβ-アミロイド斑に隣接する神経細胞には限られていなかった (AD 試料 #2 及び #3; 図1C)。 正しくは、これらの結果は、SIRT1は、変性中の脳内領域では上方調節されていることを示すものである。
SIRT1 レベルを判定した。サイクリン依存的キナーゼ5(CDK5)の毒性のコアクチベータであるp25を発現するマウスは、AD/老人病の特徴を持つ、前脳の大規模な変性を示す (CRuz, J. C.
et al. NeuRon 40, 471-83 (2003))が、他方、ヒトALSに関係するとされている変異型のスーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1G37R)を発現するトランスジェニック・マウスは、脊髄で重篤な運動ニューロン及び軸索の変性を示す (Wong, P. C. et al., NeuRon 14, 1105-16 (1995); GuRney, M. E. et
al., Science 264, 1772-5 (1994))。
30, 135-47 (2001))(図37E−E)。家族性ADに関連付けられた変異型のアミロイド前駆タンパク質(APP)(PDAPP-V717F、n=7; 2−12ヶ月)を発現するマウス(Games,
D. et al., NatuRe 373, 523-7 (1995)) は有意な変性を示さなかったが、これらは年齢依存的な態様でADの兆候である実質的なβ-アミロイド斑を示す (Games, D. et al., NatuRe 373, 523-7 (1995)) (図38)。これらのマウスは前脳内のSIRT1に有意な増加を示さなかった(図38)。これらの結果は、SIRT1レベルは、神経細胞の進行性かつ重篤な消失を伴う神経変性とは相関するが、重篤な変性のない場合のβ-アミロイド斑病理とは相関しないことを示すものである。
(CRuz, J. C. et al., CuRR Opin NeuRobiol 14, 390-4 (2004); BRuijn, L. I. et
al., Annu Rev NeuRosci 27, 723-49 (2004))ため、我々はSIRT1がイオノマイシン(1μm)というイオン透過孔、又は過酸化水素(25μm)というフリーラジカル発生因子に応答して神経細胞内で誘導されるかどうかを検査した。これらの特定のストレスは以前、培養細胞において神経細胞形態の悪化やp25の形成を惹起することが示されている (Lee, M. S. et al., NatuRe 405, 360-4 (2000); Kusakawa, G. et al.,
J Biol Chem 275, 17166-72 (2000); Nath, R. et al., Biochem Biophys Res Commun
274, 16-21 (2000))。初代神経細胞をイオノマイシン又はH2O2 で処理すると、SIRT1タンパク質発現が急速に誘導され、そのレベル増加は最高1時間、続いた(図37F)。このように、SIRT1は神経変性のマウスモデルだけでなく、神経毒ストレスを受けた初代培養神経細胞でも誘導される。
(PatRick, G. N. et al., NatuRe
402, 615-22 (1999))。最高500nMまでの用量のレスベラトロールは、GFPをトランスフェクトした初代神経細胞に対する毒性の証拠を何ら、示さなかった(図39A)。 p25-GFP をトランスフェクトした結果、神経細胞プロセスの統一性低下 (GFP 及びチューブリン染色)、クロマチンの凝集及びDAPI染色で示される核形態の破壊に基づくと、高い程度の細胞死(24時間後では50%)が起きた (Lee, M. S. et al., NatuRe
405, 360-4 (2000); PatRick, G. N. et al., NatuRe 402, 615-22 (1999); Zhang, J.,
KRishnamuRthy et al. J NeuRochem 81, 307-13 (2002); Hamdane, M. et al., J Biol
Chem 278, 34026-34 (2003))(図39B−C)。レスベラトロールによる処理は、p25による細胞死の程度を45%、減少させた(図39B−C) (P(T<=t) ツーテイル: 0.01)。更にレスベラトロールは、SOD1G93A 毒性に対する45%の防御も提供した (P(T<=t)ツーテイル:0.01) (図39D−E)。これらの結果は、変異型(109Q)ハンチントンを過剰発現するトランスジェニック・マウス由来の培養神経細胞で、レスベラトロールがこの変異型タンパク質の神経毒性効果を抑制したことを示す我々の報告と一致する (PaRkeR, J. A. et al., Nat
Genet 37, 349-50 (2005))。
+/- 5.8 %; P (T<=t) ツーテイル: 0.27) (図40A−B;図41)。p25-GFP/SIRT1過剰発現神経細胞の形態は正常に見え、コントロールGFPトランスフェクト神経細胞からは区別ができなかった。この保護効果は、p25-GFPの安定性に対するSIRT1の効果が原因ではなかった。なぜなら、同様なレベルのp25-GFPが SIRT1過剰発現の存在下でも、又は非存在下でも検出されたからである
(図40C)。
% )が、ALS関連SOD1毒性の2つの兆候である細胞骨格破壊及びSOD1凝集物を示したが、野生型SOD1は示さなかった(図40D−E)。SIRT1の過剰発現も、SOD1G93A毒性からの保護を提供し、変性表現型を示す神経細胞を50%減少させた (62.3 +/- 8.9 % vs 30.1
+/- 10.2 %; P (T<=t) ツーテイル: 0.001; 62.3 +/- 8.9 %
vs 78.0 +/- 11.0 %; P (T<=t) ツーテイル: 0.33)(図40D−E)が、H363Yは保護しなかった。まとめると、これらの結果は、初代神経細胞でSIRT1のレベルが高いと、p25 又は変異型SOD1により誘導される神経毒性からの強力な保護がもたらされることを示すものである。H363Y変異型は保護をもたらさなかったという観察は、SIRT1のデアセチラーゼ活性が神経保護に必要であることを実証している。
vivoでの神経保護効果を検査するために、レスベラトロール(Resv)又は賦形剤(Veh)をICVにより(FischeR, A. et al., J NeuRosci
24, 1962-6 (2004)を参照されたい)2週間誘導p25マウスで3週間、eks at a dose of 5 mg/ml-1ml の用量を2乃至3日毎に注射して (Veh-処理動物、n=5;Resv処理動物、n=9)(図44A)導入した。P25誘導から5週後に細胞死及び神経変性が賦形剤処理動物の海馬で明白となり、以前の観察と一致した (CRuz, J. C. et al., NeuRon
40, 471-83 (2003))。対照的に、レスベラトロールを投与すると、Bax 及び活性化カスパーゼ3という2種のアポトーシス・マーカと、GFAPという星細胞腫マーカの低レベルで明らかなように、海馬のCA1及びCA3領域の神経変性が減少した(図44B−D、F;図47)。p25-GFP発現神経細胞を標識するGFP免疫染色は、レスベラトロール処理動物の海馬ではより強力だったことから、この神経細胞はp25発現により耐えて生存できることが示唆された(図44D)。倍率をより高くすると、レスベラトロール処理脳由来のCA1神経細胞は樹状突起の形態がより良好に保存されていることを示した(図44E)。我々は以前に、5乃至6週間誘導すると、 p25 マウスでは、文脈恐怖の条件付けパラダイムで明らかになったように、連想学習能が劇的に低下していることを報告している(FischeR et al., NeuRon in pRess)。まとめると、これらの結果は、レスベラトロールは、大規模な神経細胞消失及びtau病理を特徴とするCNS変性の動物モデルで神経保護を提供することを示すものである(図44E−F)。
vivoで神経保護をもたらす機序のヒントを得るために、我々は以下の理由からp53が神経保護を媒介する上で鍵となる役割を果たしているとの仮説を建てた。第一に、 p25/Cdk5 はp53をリン酸化することが公知であり、その転写活性を上方調節する (Zhang, J., et al., J NeuRochem
81, 307-13 (2002))。第二に、我々はp53タンパク質レベルがp25トランスジェニック・マウスで著しく増加していることを見出している(図45A)。第三に、この増加には、p53を安定化させ、p53のそのアポトーシス機能を増強することが公知の修飾である、p53のリジン382のアセチル化状態の増加(図45B)が伴う (Langley, E. et al., Embo J
21, 2383-96 (2002); Luo, J. et al., Cell 107, 137-48 (2001); VaziRi, H. et al.,
Cell 107, 149-59 (2001))。第四に、p53のリジン382(K382-p53)は良く特徴付けられたSIRT1のターゲットであり、レスベラトロールによるSIRT1の活性化は、我々がin vivoで観察した効果と一致するであろう。
21, 2383-96 (2002); VaziRi, H. et al., Cell
107, 149-59 (2001))。次に、我々は、レスベラトロールが同様な効果をin vivoでも有するかどうかに疑問を抱いた。図45Dに示すように、K382-p53 のアセチル化状態は、賦形剤に比較して、p25トランスジェニック・マウスのレスベラトロール処理海馬組織ではより低かった。全体的なp53レベルもレスベラトロール処理により減少しており、脱アセチル化型がより不安定であるということと合致する (Luo, J. et al., Cell
107, 137-48 (2001))。
コントロール・ウィルスの注射を受けた側よりも38% + / - 13% 高い数の神経細胞を示し、これらの神経細胞は形態学上、より健康であった。倍率を高くすると、HA及びGFP抗体により同時免疫染色で検出したところ、生存した神経細胞はSIRT1を発現していることが明白であった(図46G−I)。これらの結果は、レスベラトロールの保護効果がSIRT1活性化が原因であるという更なる証拠を提供するものであり、in vivoでのSIRT1の神経保護上の役割を実証するものである。
et al., Mol Cell 13, 627-38 (2004))。またレスベラトロールは、FOXO3/4 転写因子の脱アセチル化を刺激することで、抗酸化分子の遺伝子発現を促進し、またDNA修復を上方調節するものかも知れない (BRunet, A. et al., Science
303, 2011-5 (2004); Nguyen, M. D. et al., Cell Death DiffeR 9, 1294-306 (2002);
Smith, P. D. et al., Cell Cycle 3, 289-91 (2004))。
(2005); LombaRd, D. B. et al., Cell 120, 497-512 (2005); Lamming, D. W. et al.,
Mol MicRobiol 53, 1003-9 (2004))。上述したように、我々は初めて、SIRT1活性化分子が年齢依存的神経変性疾患を防止できることを示し、このような分子が、老化に関係する多種の他の疾患で効果を上げるであろうと予測する。興味深いことに、SIRT1遺伝子は家族性ADと関連付けられた第10番染色体上の遺伝子座にある(WIPO、国際公報 WO 2005/004815 A2)。SIRT1での変異又は多型が個体の神経変性易罹患性に影響している可能性がある。
引用された全ての参考文献(本出願全体を通じて引用された文献、GenBank受託番号、発行済み特許、公開済み特許出願)の内容を、引用をもって援用することをここに明示しておく。
当業者であれば、慣例的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
Claims (23)
- 細胞内のサーチュインの活性又はタンパク質レベルを増す作用物質を治療上有効量、それを必要とする対象に投与するステップを含む、対象の神経変性疾患を治療又は防止する方法。
- 前記サーチュインがSIRT1である、請求項1に記載の方法。
- 前記作用物質が、SIRT1をコードする核酸である、請求項2に記載の方法。
- 前記作用物質が、サーチュイン活性化化合物、その塩又はプロドラッグである、請求項1に記載の方法。
- 前記サーチュイン活性化化合物が、式1-25、30 及び32-65から成る群より選択される式を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項1に記載の方法。
- 前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、ハンチントン病、及び多発性硬化症から成る群より選択される疾患である、請求項1に記載の方法。
- 前記神経変性疾患を治療するための治療薬を治療上有効量、前記対象に投与するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象が、神経変性疾患を有すると診断された対象である、請求項1に記載の方法。
- 前記診断が、前記対象内のサーチュインのレベル又は活性を判定するステップを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、そして前記診断が、前記対象の脳試料内のSIRT1のレベル又は活性を判定するステップを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記神経変性疾患がALSであり、そして前記診断が、前記対象の脊髄試料内のSIRT1のレベル又は活性を判定するステップを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記神経変性疾患の進行を観察するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記神経変性疾患の進行を観察する前記ステップが、前記対象内のサーチュインのレベル又は活性を判定するステップを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記神経変性疾患がアルツハイマー病であり、そして前記神経変性疾患の進行を観察する前記ステップが、前記対象の脳試料内のSIRT1のレベル又は活性を判定するステップを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記神経変性疾患がALSであり、そして前記神経変性疾患の進行を観察する前記ステップが、前記対象の脊髄試料内のSIRT1のレベル又は活性を判定するステップを含む、請求項14に記載の方法。
- ある対象が神経変性疾患を有する、又は発症する可能性が高いかどうかを判定する方法であって、(i)対象から生体試料を得るステップと、(ii)前記生体試料中のサーチュインのレベル又は活性を判定するステップであって、コントロール・レベルに比較したときに、前記対象の生体試料のサーチュインのレベル又は活性が高いことは、前記対象が神経変性疾患を有する、又は発症する可能性が高いことの指標である、ステップと、を含む、方法。
- 前記サーチュインがSIRT1である、請求項17に記載の方法。
- 前記生体試料が脳試料である、請求項18に記載の方法。
- 前記疾患がアルツハイマー病である、請求項19に記載の方法。
- 前記疾患がALSであり、前記生体試料が脊髄試料である、請求項18に記載の方法。
- 対象の神経変性疾患を治療又は防止する方法であって、前記対象が神経変性疾患を有する、又は発症する可能性が高いかどうかを、請求項17に記載の方法に従って判定するステップと、神経変性疾患を有する、又は発症する可能性が高いと診断された対象に、前記神経疾患を治療するための治療薬を治療上有効量、投与するステップと、を含む、方法。
- 式 1-25、30 及び 32-65 から成る群より選択される式を有する化合物と、神経変性疾患を治療するための治療薬とを含む、組成物。
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