JP2008515401A - Citrobacterfreundiiフィターゼおよびホモログ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、飼料への添加のための分野に関する。さらに詳細には、本発明は、食物および動物の飼料におけるリン酸塩消化を増強するために用いられ得るフィターゼに関する。
フィターゼは、穀類およびマメ類におけるリンの主要な貯蔵形態である。しかし、ブタ、家禽および魚類のような単胃動物は、フィターゼ(またはフィチン酸)を代謝も吸収もできず、従ってこれが排出されて、集中的な家畜生産の地方ではリン汚染がもたらされる。さらに、フィチン酸はまた、カルシウム、銅および亜鉛のような金属因子をキレートすることによって、単胃動物における抗栄養剤として機能する。
Wodzinski RJ,Ullah AH.,Adv Appl Microbiol.,1996年,第42巻,p.263−302 Wyss M.ら,Appl.Environ.Microbiol.,1999年,第65巻,第2号,p.367−373 Berka R.M.ら,Appl.Environ.Microbiol.,1998年,第64巻,第11号,p.4423−4427 Lassen S.ら,Appl.Environ.Microbiol.,2001年,第67巻,第10号,p.4701−4707 Greiner Rら,Arch.Biochem.Biophys.,1993年,第303巻,第1号,p.107−113 Kerovuoら,Appl.Environ.Microbiol.,1998年,第64巻,第6号,p.2709−2085 Kim H.W.ら,Biotechnol.Lett.,2003年,第25巻,p.1231−1234 Greiner Rら,Arch.Biochem.Biophys.,1997年,第341巻,第2号,p.201−206 Yoon S.J.ら,Enzyme and Microbial technol.,1996年,第18巻,p.449−454 Zinin N.V.ら,FEMS Microbiol.Lett.,2004年,第236巻,p.283−290 Igbasan F.A.ら,ARch.Anim.Nutr.,2000年,第53巻,p.353−373 Kerovuo Jら,Biochem.J.,2000年,第352巻,p.623−628
広範な局面において、本発明は、細菌由来のフィターゼおよびその改変型に関する。詳細には、本発明は、細菌であるCitrobacter freundii由来の野性型フィターゼに、そして野性型酵素に比較して改善された特徴を示すそれらの改変体型/修飾型に関する。
本発明は、Citrobacter freundiiのフィターゼまたはその改変型、改変体、機能的な等価物もしくは有効なフラグメントに相当するアミノ酸配列を含む酵素を特徴とする。
22、23、24、28、46、53、57、67、74、75、77、78、79、82、88、95、96、97、98、101、102、103、105、109、112、122、126、136、140、142、143、148、151、152、154、156、160、161、164、168、170、176、177、195、199、203、204、205、206、207、215、224、225、229、233、235、274、279、288、301、307、308、322、343、358、360、362、365、366、367、370、383、384、385、386、391、393、395、397、408、および414。
A22T、E23K、E23Q、E24D、M28L、K46E、K46R、D53K、D53N、D57Y、G67R、G74R、E75K、E75V、V77I、S78T、E79V、Q82H、Q82K、Q82R、F88Y、N95D、N95P、N96P、N96S、N96Y、Q97T、T98G、T98P、S101F,P102L、G103E、V105I、A109T、D112V、D112Y、F122Y、L126I、Y136N、E140V、K142R、T143I、T143P、N148D、K151G、M152K、M152V、T154I、S156T、L160F、K161N、N164D、E168D,A170T、L176Q、L176V、Y177E、S195T、T199I、T203I、T203L、T203S、T203W、E204A、E204G、E204H、E204I、E204N、E204R、E204V、K205P、K205R、S206R、S206T、T207A、T207S,L215F、D224H、N225D,N225E、P229S、S233C、S235A、Q274H、Q274L、Q279E,R288M、L301S、E307Y、N308D,N308T、A322V、G343A、K358R、K360N、T362A、T362I、N365D、T366S、D367N、Q370H、D383V、I384F、I384L,I384M、Q385R、P386Q,K391N、A393P、K395T、D397N、S408IおよびL414Iまたは各々の位置での保存的変異。
23、46、53、75、82、88、95、96、98、112、143、152、176、177、199、203、204、205、225、229、233、274、288、307、308、362、370、384および385。
E23K、E23Q、K46E、K46R、D53K、D53N、E75K、E75V、Q82H、Q82K、Q82R、F88Y、N95D、N95P、N96P、N96S、N96Y、T98G、D112V、D112Y、T143I、T143P、M152K、M152V、L176Q、L176V、Y177F、T199I、T203I、T203L、T203S、T203W、E204A、E204G、E204H、E204I、E204N、E204R、E204V、K205P、K205R、N225D、N225E、P229S、S233C、Q274H、Q274L、R288M、E307Y、N308D、N308T、T362A、T362I、Q370H、I384F、I384L,I384M、およびQ385Rまたは各々の位置での保存的変異。
P229S;D112V;Q82R;Q274H;D112Y;F88Y;K46E;S233C;R288M;I384L;Q385R;Q274L;E307Y;T199I;Q82KおよびT203I。
a)親のフィターゼ酵素を選択する工程であって、この親のフィターゼ酵素が:
i.配列番号3に対して少なくとも75%の相同性である親のフィターゼ酵素
ii.Citrobacter spp.由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
b)この親のフィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である少なくとも1つの変更を作製して、フィターゼ酵素改変体を得る工程と、
c)この親フィターゼ酵素に比較して:
i.より高い熱安定性および/または
ii.比活性および/または
iii.タンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体をスクリーニングする工程と、および/または
d)フィターゼ酵素改変体を調製する工程と。
a)親のフィターゼ酵素をコードするDNA配列を突然変異誘発に供する工程であって、この親のフィターゼ酵素が
i.配列番号3に対して少なくとも75%の相同性である親のフィターゼ酵素
ii.Citrobacter spp.由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
b)工程(A)において得られた変異されたDNA配列を宿主細胞中で発現させる工程と、
c)この親フィターゼ酵素に比較して:
iv.より高い熱安定性および/または
v.より高い比活性*および/または
vi.より高いタンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞をスクリーニングする工程と、
および/または
この宿主細胞によって発現されるフィターゼ酵素改変体を調製する工程と。
より高い熱安定性(熱安定性相違)を有する改変体は好ましくは、実施例12に開示される方法を用いて決定される。
さらなる実施形態では、本発明は、フィターゼ酵素改変体を含む動物飼料の調製のための方法を提供する。
a)親のフィターゼ酵素を選択する工程であって、この親のフィターゼ酵素が:
i.配列番号3に対して少なくとも75%の相同性である親のフィターゼ酵素
ii.Citrobacter spp.由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
b)この親のフィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である少なくとも1つの変更を作製して、フィターゼ酵素改変体を得る工程と、
c)この親フィターゼ酵素に比較して:
i.より高い熱安定性および/または
ii.比活性および/または
iii.タンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体をスクリーニングする工程と、および/または
d)フィターゼ酵素改変体を調製する工程と、
e)調製されたこのフィターゼ酵素改変体を動物飼料に添加する工程。
a)親のフィターゼ酵素をコードするDNA配列を、突然変異誘発に供する工程であって、この親のフィターゼ酵素が
iii.配列番号3に対して少なくとも75%の相同性である親のフィターゼ酵素
iv.Citrobacter spp.由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
b)工程(A)において得られた変異されたDNA配列を宿主細胞中で発現させる工程と、
c)この親フィターゼ酵素に比較して:
vii.より高い熱安定性および/または
viii.より高い比活性*および/または
ix.より高いタンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞をスクリーニングする工程と、
および/または
d)この宿主細胞によって発現されるフィターゼ酵素改変体を調製する工程と、
f)この調製されたフィターゼ酵素改変体を動物飼料に添加する工程。
(a)配列番号2として示されるヌクレオチド配列、
(b)配列番号2として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントであるヌクレオチド配列;
(c)配列番号2に示されるヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列;
(d)配列番号2として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントの相補体であるヌクレオチド配列;
(e)配列番号2に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列;
(f)配列番号2として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントに対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列;
(g)配列番号2に示されるヌクレオチド配列に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列;
(h)配列番号2として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントに対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列;
(i)配列番号2に示されるヌクレオチド配列の相補体に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列;
(j)配列番号2として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントの相補体に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列。
好ましい局面は、添付の特許請求の範囲に、そして以下の詳細な説明および実施例のセクションに示される。
本発明は、動物飼料に対する添加物としてフィターゼを特に有用にさせる、多数の特性を有するフィターゼを提供するので有利である。
フィチン酸(myo−イノシトール六リン酸エステル)は、穀類、マメ科植物および脂肪種子の作物における重要な構成物である。塩型であるフィチン酸塩は、これらの植物におけるリンの主要な貯蔵形態である。
1局面では、好ましくはヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、単離型である。「単離された(isolated)」という用語は、この配列が、この配列が天然には通常会合している、そして天然には見出されるような、少なくとも1つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
1局面では、好ましくはヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、精製型である。「精製された(purified)」という用語は、この配列が比較的純粋な状態である−例えば、少なくとも約90%純粋、または少なくとも約95%もしくは少なくとも約98%純粋であることを意味する。
本発明の範囲は、本明細書に記載のような特定の特性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を包含する。
代表的には、本発明の範囲によって包含されるヌクレオチド配列または本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、組み換えDNA技術(すなわち、組み換えDNA)を用いて調製される。しかし、本発明の別の実施形態では、このヌクレオチド配列は、当該分野で周知の化学的方法を用いて、全体としてまたは部分的に合成されてもよい(Caruthers MHら(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215〜23およびHorn Tら(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225〜232を参照のこと)。
一旦、酵素をコードするヌクレオチド配列が単離されるか、および/もしくは精製されるか、または推定の酵素コードヌクレオチド配列が同定されれば、選択されたヌクレオチド配列を改変することが所望され得る。例えば、配列を変異させて、本発明に従う改善された安定特徴を有する酵素を調製することが所望され得る。
本発明の範囲はまた、本明細書に規定されるような特定の特性を有する酵素のアミノ酸配列を包含する。
本発明はまた、酵素の任意のアミノ酸配列の、またはこのような酵素をコードする任意のヌクレオチド配列の改変体、ホモログおよび誘導体の使用を包含する。
本発明においては、アミノ酸残基についての従来の1文字および3文字コードを用いる。参照の容易さのために、酵素改変体における変異は、以下の命名法の使用によって記載する:親の酵素におけるアミノ酸残基;位置;置換アミノ酸残基(単数または複数)。この命名法に従って、例えば、20位置でのアラニン残基のグリシン残基での置換は、Ala20GlyまたはA20Gと示される。同じ位置でのアラニンの欠失は、Ala20*またはA20*として示される。さらなるアミノ酸残基(例えば、グリシン)の挿入は、Ala20AlaGlyまたはA20AGとして示される。アミノ酸残基の連続的ストレッチの欠失(例えば、位置20のアラニンと位置21のグリシンとの間)は、Δ(Ala20−Gly21)またはΔ(A20−G21)と示される。親の酵素配列が、ナンバリングに用いられる酵素配列に比べて欠失を含む場合、このような位置での挿入(例えば、欠失位置20でのアラニン)は、*20Alaまたは*20Aとして示される。複数の変異はプラスの記号またはスラッシュによって隔てられる。例えば、アラニンおよびグルタミン酸をグリシンおよびセリンで置換する位置20および21における2つの変異は、それぞれ、A20G+E21SまたはA20G/E21Sとして示される。所定の位置のアミノ酸残基が、2つ以上の別のアミノ酸残基で置換される場合、これらの残基は、コンマまたはスラッシュで隔てられる。例えば、グリシンまたはグルタミン酸のいずれかでの位置30のアラニンの置換は、A20G,EまたはA20G/E、またはA20G、A20Eとして示される。改変に適切な位置が、示唆されている任意の特定の改変なしに本明細書において同定される場合、任意のアミノ酸残基が、この位置に存在するアミノ酸残基で置換され得ることが理解されるべきである。従って、例えば、位置20におけるアラニンの改変を言及するが特定されない場合、アラニンは、欠失されても、または任意の他のアミノ酸残基(すなわち、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、Vのいずれか1つ)で置換されてもよいことが理解されるべきである。
好ましくは、この改変体配列などは、本明細書に提示される配列と少なくとも同じ程度に生物学的に活性である。
本発明はまた、本発明の核酸配列に対して相補的である配列、または本発明の配列に対してもしくはそれに対して相補的である配列のいずれかに対してハイブリダイズし得る配列を包含する。
また、中度から最大のストリンジェンシーの条件下で、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に対してハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。
一旦、酵素コードヌクレオチド配列が単離および/もしくは精製されるか、または推定の酵素コードヌクレオチド配列が同定されれば、本発明の酵素を調製するために配列を変異させることが所望され得る。
1局面では、本発明における使用のための配列は、組み換え配列(すなわち、組み換えDNA技術を用いて調製されている配列)である。
1局面では、本発明における使用のための配列は、合成配列−すなわち、インビトロの化学的または酵素的な合成によって調製されている配列−である。これには、限定はしないが、宿主生物体−例えば、メチロトローフ酵母PichiaおよびHansenulaについて最適コドン用法で作製された配列が挙げられる。
本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、組み換え複製可能ベクターに組み込まれてもよい。ベクターは、ヌクレオチド配列を酵素の形態で、適合性の宿主細胞においておよび/またはその宿主細胞から、複製および発現するために用いられ得る。
「プラスミド(plasmid)」、「ベクター系(vector system)」または「発現ベクター(expression vector)」という用語は、インビボまたはインビトロで発現し得る構築物を意味する。本発明の状況では、これらの構築物は、宿主細胞へ酵素をコードする遺伝子を導入するために用いられ得る。適切には、発現が誘導される遺伝子は、「発現可能導入遺伝子(expressible transgenes)」と呼ばれてもよい。
いくつかの適用では、本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、選り抜きの宿主細胞などによる、ヌクレオチド配列の発現を提供し得る、調節性配列に対して作動可能に連結される。一例として、本発明は、このような調節性配列に対して作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、すなわち、発現ベクターであるベクターを包含する。
「構築物(construct)」という用語は、「結合体(conjugate)」、「カセット(cassette)」および「ハイブリッド(hybrid)」などの用語と同義であって、プロモーターに対して直接または間接的に結合された本発明による使用のためのヌクレオチド配列を包含する。
「宿主細胞(host cell)」という用語は、本発明に関しては、上記のようなヌクレオチド配列または発現ベクターのいずれかを含む任意の細胞であって、本明細書に規定されるような特定の特性を有する酵素の組み換え産生において、または本発明の方法において用いられる任意の細胞を包含する。
「生物体(organism)」という用語は、本発明に関しては、本発明に記載されるような酵素をコードするヌクレオチド配列および/またはそれから得られる産物、および/または本発明によるヌクレオチド配列の発現をこの生物体に存在する場合に可能にし得るプロモーターを含む任意の生物体を包含する。
以前に示されるように、宿主生物体は、原核生物または真核生物生物体であってもよい。適切な原核生物宿主の例としては、E.coliおよびBacillus subtilisが挙げられる。
宿主生物体は、真菌、例えば、糸状の真菌であってもよい。適切なこのような宿主の例としては、Thermomyces、アクレモニウム属(Acremonium)、コウジカビ属(Aspergillus)、アオカビ属(Penicillium)、ケカビ属(Mucor)、パンカビ属(Neurospora)、トリコデルマ属(Trichoderma)などの属に属する任意のメンバーが挙げられる。
別の実施形態では、トランスジェニックの生物体は酵母であってもよい。
本発明に適切な宿主生物体は植物であってもよい。一般的な技術の概説は、Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42:205〜225)およびChristou(Agro−Food−Industry Hi−Tech March/April 1994 17〜27)による文献に見出され得る。
本発明のヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、コードされた酵素の産生をもたらし、そして細胞および/または培養培地からの酵素の回収を容易にする条件下で培養され得る。
発現宿主から培養培地へ酵素が分泌されて、それから酵素がより容易に回収され得ることが所望され得る。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択され得る。ハイブリッドシグナル配列も、本発明の状況で用いられてもよい。
アミノ酸配列の発現を検出および測定するための種々のプロトコールは当該分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)および蛍光活性化細胞分取(FACS)が挙げられる。
本発明に従う使用のためのアミノ酸配列は、例えば、抽出および精製を補助するための融合タンパク質として生成され得る。融合タンパク質のパートナーの例としては、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、6×His、GAL4(DNA結合および/または転写活性化ドメイン)および(β−ガラクトシダーゼ)が挙げられる。融合タンパク質のパートナーと目的のタンパク質の配列との間にタンパク質分解性の切断部位を含んで、融合タンパク質配列の除去を可能にすることも好都合であり得る。
本発明による使用のための配列はまた、1つ以上のさらなる目的のタンパク質(proteins of interest)(POI)または目的のヌクレオチド配列(nucleotide sequences of interest)(NOIs)と組み合わせて用いられ得る。
本発明の1局面は、配列番号3のアミノ酸と免疫学的に反応性であるアミノ酸に関する。
本発明の1つの好ましい実施形態では、C.freundii由来のフィターゼをコードするアミノ酸配列または本発明の方法を大規模な適用のために用いる。詳細には、本発明の方法は、食料または飼料の組成物への添加物/補充物としての産業上の用途のためのフィターゼの大規模生成に用いられ得る。
上記で述べるとおり、本発明はまた、本明細書に記載のようなフィターゼの生成に関する。
a)C.freundiiフィターゼを含む発現可能な導入遺伝子を含む宿主細胞を提供する工程と;
b)導入遺伝子の発現のために適切な条件下でトランスジェニック生物体を培養する工程と;
c)培養物から有機リン酸化合物を回収する工程と;
この化合物は、フィターゼの特徴付けのためのアッセイを含む多数の適用のために用いられ得る。いくつかのイノシトールリン酸塩は、細胞内の調節におけるシグナル分子として含まれており、研究の化合物として用いられ得る。
本発明の酵素は、他の成分またはキャリアと組み合わせて用いられてもよい。
この化合物は、食品または飼料物質として、またはその調製において用いられ得る。ここで、「食物(food)」という用語は、広義に用いられ、そしてヒトのための食物および食品を、そして動物用の食品(すなわち、飼料)を包含する。「飼料(feed)」という用語を用いて、家畜の飼育において動物に給餌される生成物をいう。好ましい局面ではこの食物または飼料は、ブタ、家禽および魚類のような単胃動物による消費のためである。
この化合物は、食物または飼料成分として用いられ得る。
単胃動物のための飼料組成物は代表的には、フィチン酸塩を含む植物生成物を含む組成物を含む。このような組成物としては、コーンミール、ダイズミール、菜種かす、綿実粕、トウモロコシ、コムギ、オオムギおよびソルガムベースの飼料が挙げられる。
本発明のフィターゼはまた、いくつかの薬学的な効果を得るために、薬学的調製物においてまたは食品への組み合わせのために用いられ得る。例えば、欧州特許第1,389,915号は、ヒトの食品または飲料のカルシウム、鉄および/または亜鉛のアベイラビリティーを増大するための食物または飲料におけるフィターゼの使用を記載している。
本発明の生成物および/または化合物は、薬学的成分として用いられ得る。ここで本発明の生成物および/または組成物は、単独の活性成分であってもよいし、または活性成分の少なくとも1つのメンバー(すなわち、2つ以上)であってもよい。
本発明の生成物および/または化合物は、単独の場合であろうと、組成物中に存在する場合であろうと、任意の適切な形態で用いられ得る。同様に、本発明に従って生成されたフィターゼ(すなわち、成分−例えば、食物成分、機能的食品成分、または薬学的な成分)は、任意の適切な形態で用いられてもよい。
本発明は、他に示さない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組み換えDNAおよび免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、この文献に例示される。例えば、J.Sambrook,E.F.FritschおよびT.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版、Books1〜3、Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel,F.M.ら(1995)および定期補遺;Current Protocols in Molecular Biology、第9、13および16章、John Wiley&Sons,New York,N.Y.);B.Roe,J.CrabtreeおよびA.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley & Sons;M.J.Gait(編),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Irl Press;ならびにD.M.J.LilleyおよびJ.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Pressを参照のこと。これらの一般的なテキストの各々が本明細書において参照によって援用される。
フィターゼアッセイは、マイクロタイタープレートで行った。反応混合物(100μl9は以下を含んだ:2mMのフィチン酸塩および0.8mMのCaCl2が含有される200mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH3.5。この反応物は、37℃で1時間処理させて、その後に、放出されたリン酸塩を公知の手順の変法によって測定した(Heinonen J.K.,Lahti R.J.Anal Biochem.113(2),313〜317(1981))。要するに、200μlの新鮮に調製したAMM溶液(7.5N H2SO4、15mMのモリブデン酸アンモニウムおよびアセトン − 1:1:2)を、各々のマイクロタイタープレートウェル中で100μlの反応混合物に添加した。390nmでの吸光度は、AMM試薬の添加後、10分より後でかつ30分より前に測定した。リン酸塩の量は、濃度が既知のリン酸塩溶液を用いて検量線を作成することによって決定した。異なるpH値でフィターゼ活性を評価するためには、以下の(全てが200mM)緩衝液を用いた:グリシン/HClpH2.0〜3.0、酢酸ナトリウム/酢酸、pH3.5〜5.5、Tris/マレイン酸pH6.0〜7.5.
(実施例2.フィターゼ産生株P3−42)
細菌株P3−42はもともと、フィンランド南部の湿潤な森林において採集された腐敗しているカバノキの葉の塊から単離された。この株は多くの単純な培養培地、例えばLB(1%ペプトン、0.5%酵母抽出物、1%NaCl、pH7.4)または低リン酸塩培地PP1(1%ペプトン、1%ウシ抽出物、0.5%、酵母抽出物、CaCl2−0.2M)上において、30℃で好気的に培養され得る。この培地を、NaOHでpH11に調製して、10分間煮沸する。この沈殿物を、濾過によって除去し、pHを、5.5に再調節して、その培地は121℃で15分間のオートクレーブによって滅菌する。
染色体DNAは本質的に、標準的な手順によって調製した(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1996)。LB培地中において30℃で一晩増殖した250mlの培養物を、10,000rpmで30分間、遠心分離して、20mlの50mM tris−HCl、5mM EDTA pH8中で洗浄し、そして10mlの冷TES(50mM tris−HCl、5mM EDTA、15%グルコースpH8)中に再懸濁した。リゾチームを10mg/mlに添加して、その細胞懸濁液を、溶解が生じるまで37℃で30〜60分間インキュベートして、100μlの反応混合物の1mlの0.1%SDSへの希釈および「ネバネバの(slimy)」流動性についてチェックすることによって確認した。この時点で、SDSおよびプロテイナーゼK(SIgma)を、それぞれ1%および0.5mg/mlの最終濃度まで添加した。この反応混合物を、56℃で30分間インキュベートし、続いて2mMの5M NaClの添加および1.4mlの10%セチルトリメチルアンモニウムブロミド(Sigma)の添加を行った。このインキュベーションは、65℃で15分間継続した。その溶液をクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を用いて1回、フェノール/クロロホルムを用いて1回抽出した。抽出後、その水相を0.6容積のイソプロパノールと混合して、DNA沈殿物を遠心分離(10,000rpm、15分)によって収集し、70%エタノールで洗浄し、減圧乾燥して、2mlの10mMトリス−HCl、1mM EDTA pH8、5μg/mlのRNAseに再懸濁した。
株P3−42の16S rRNA遺伝子のフラグメントを、プライマー;536f(CAGCMGCCGCGGTAATWC)および1392r(ACGGGCGGTGTGTRC)(Lane,D.J.In Nucleic acid techniques in bacterial systematics,Stackbrandt,E、およびGoodfellow,M編、John Wiley & Sons,New York:pp115〜117(1991))を用いて、Taq DNAポリメラーゼ(Roche)を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。以下のプログラムを用いた:1)95℃5分の初回DNA変性工程;2)94℃1分、55℃1分、72℃1分の30サイクル;3)70℃の最終伸長工程10分間。約900塩基対のサイズのPCR産物を、0.8%アガロースゲル中における電気泳動によって精製し、製造業者の指示に従ってPCR Purification Kit(Qiagen)を用いてゲルから抽出した。精製されたPCR生成物は、Medprobe(Norway)によって商業的に配列決定させた。この配列決定された領域を配列番号1に列挙する。この配列を、GenBankデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)におけるDNA配列と比較した。最高のマッチング(824ヌクレオチドのうち823、99.9%)は、Citrobacter freundii DSM 30039由来の16S RNA遺伝子の配列と見出された。従って、株P3−42は分類学的に、Citrobacter freundiiとして分類され得る。
Citrobacter freundiiのP3−42株由来の染色体DNAを、制限エンドヌクレアーゼSau3Aで部分的に消化して、その消化物を1%のアガロースゲル上で分画した。3〜5kbのDNAフラグメントを、ゲル精製キット(Qiagen)を用いてゲルから単離して、BamHI消化した脱リン酸化λ―ZAPアーム(Stratagene)と連結させた。ライブラリー構築のための引き続く工程は、StratageneのZAP Express Predigested Vector/Gigapack Cloning Kitの指示に従った。ライブラリーのファージ型は、製造業者(Stratagene)によって記載されたとおりの「マス切除(mass excision)」手順によってプラスミド型に変換された。プラスミドライブラリーのスクリーニングは、ペトリプレートでのフィターゼ活性の検出のための初期の公開された方法と類似の方法によって行った(HowsonおよびDavis.Enzyme Microb.Technol.5,377〜382(1983);Chen J.C.Biotechnology techniques 12(10)751〜761(1998);Riccio M.L.ら、J.Appl.Microbiol.82,177〜185(1997))。いくつかのフィターゼ陽性クローンを単離して、サブクローニングによって精製した。これらの単離物は、液体培養物(LB培地で30℃かつ200rpmで約24時間)中で増殖させて、そしてフィターゼ活性を、得られた細胞懸濁液中で測定した(実施例1)。最高のフィターゼ活性を有した1つのクローン(約5U/ml、pH3.5)を引き続く特徴づけのために選択した。プラスミドDNAは、pBK(P3−42)と命名されたこのクローンから単離して、挿入DNAの部分的DNA配列決定によって特徴付けた(配列決定サービスは、Medprobe(Norway)から得た)。フィターゼ遺伝子を含むこの配列は、配列番号2として列挙する。C.freundiiフィターゼの、この推定アミノ酸配列は、配列番号3として列挙される。NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)によって提供されるBLASTサービスを用いるGenBankにおける配列との配列番号3の比較によって、E.coli由来のフィターゼは、C.freundiiのフィターゼの最も緊密な公知のホモログとして同定される。しかし、相同性レベルは低く、両方のタンパク質で同一であるのはアミノ酸残基のほぼ62%しかない。
フィターゼ遺伝子は、PCRによって増幅された。C.freundiiのP3−42株の染色体DNAを、テンプレートとして、そしてオリゴヌクレオチドo42−5(GGAATTCATATGAGTACATTCATCATTCG)およびo42−3(GGAATTCGGATCCCTTATTCCGTAACTGCACAC)をプライマーとして用いた。その増幅は、Expand High Fidelity PCR Systemキット(Roche)を用いて行った。以下のプログラムを用いた:1)94℃で3分間の初回のDNA変性;2)94℃で45秒、55℃で45秒、68℃で1分、72℃で1分、74℃で1分の35サイクル;3)72℃で10分の最終伸長工程。得られたPCR産物を、0.8%アガロースゲル中での電気泳動、その後のGel Purification Kit(Qiagen)を用いるゲルからのDNA抽出によって精製した。この精製されたPCR産物を、制限酵素NdeIおよびBamHIを用いて消化して、PCR Purification Kit(Qiagen)によって反応混合物から単離した。ベクタープラスミドpET11a(Novagen)を、制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIで消化して、エビのアルカリホスファターゼ(Roche)を用いて脱リン酸して、0.8%アガロースゲル中における電気泳動によって精製した。この直線化したプラスミドDNAのバンドをゲルから切り出して、Gel Purification Kit(Qiagen)を用いて精製した。この2つの精製されたDNAフラグメントを、T4 DNAリガーゼ(Roche)を用いて連結した。この連結反応物を70%エタノールで沈殿させて、エタノールで洗浄し、そして50μlのエレクトロコンピテントなE.coli XL1−Blue MRF’細胞中に直接再懸濁した。この懸濁物を0.1cmのエレクトロポレーションキュベット(BioRad)に移して、Gene Pulser Xcell(BioRad)セットを用いて、1800V、25μFおよび200Ωで電気泳動させた。電気泳動の直後に、1mlのLB培地を添加して、細胞懸濁液を15mlのプラスチックチューブ(Falcon)に移して、振盪(200rpm)しながら37℃で1時間インキュベートした。形質転換された細胞を、100μg/mlのアンピシリンを含有するLBプレート上にプレートして、37℃で一晩インキュベートした。24個の形質転換体を液体培地中で増殖させて、その培養物を、フィターゼ活性をアッセイすることおよびプラスミドDNAの単離のために用いた。最高のフィターゼ活性を生成し、かつプラスミドDNAの予想される認識パターンを生成する1クローンを選択した。pET11(P3−42)と命名されたこのクローンによって含まれるプラスミドを用いて、発現宿主株BL21(DE3)pLysS(Novagen)を形質転換した。この形質転換された細胞懸濁物を、2%グルコースを含有するLB中において37℃で1時間振盪し、アンピシリン(100μg/ml)およびグルコース(2%)を含有する50mlのLBに接種して、振盪(200rpm)しながら30℃で一晩増殖させた。得られた培養物のODは、600nmで測定して、その培養物を用いて、0.04のOD600になるまで1lのLB+アンピシリン(100μg/ml)に接種した。増殖は、30℃で一晩継続した。このような培養物におけるフィターゼ活性は代表的には、50〜60U/ml(pH3.5で測定した)であった。ほぼ全てのフィターゼが培養培地中に分泌された。C.freundiiのフィターゼが、その天然の宿主において、かつE.coliにおける異種発現の間においてその両方で効率的に分泌される酵素であるという事実は、C.brakii由来のフィターゼの細胞内性質とは対照的である(Kim H.W.ら、Biotechnol.Lett.25,1231〜1234(2003))。同じ条件下で増殖されたpET11で形質転換されたコントロールの株BL21(DE3)pLysSの培養物における活性は0.05U/ml未満であった。
pET11(P3−42)で形質転換されたBL21(DE3)pLysSの培養物を遠心分離して、細菌細胞を除去して、ロータリーエバポレーターを用いて約1/10のもとの容積まで濃縮して、溶液の伝導率が250μS/cm未満に低下するまで水に対して透析した。溶液のpHは、tris塩基を用いて8.0に調節し、そしてこれを、25mM tris−HCl、pH8.0で平衡化したDEAE Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)のカラム(3×20cm)に加えた。そのカラムを、平衡化緩衝液を3ml/分の流速で30分間用い、続いて、3つの連続的勾配のNaClが含有される25mM tris−HCl、pH8.0:0〜50mM、50〜150mMおよび150〜500mMを用いて、洗浄した。各々の3つの勾配は、3ml/分の一定流速を用いて1時間プログラムした。9mlの画分を収集して、フィターゼ活性についてアッセイした。活性の1つの強力なピークが検出された。ピーク画分中のタンパク質を、Centriplusコンセントレーター(Amicon)を用いて濃縮して、12%のゲルおよび標準的なLaemmli緩衝液システムを用いてSDS PAGEで分析した。この分析の結果、DEAE Sepharoseによって得られた組み換えC.freundiiのP3−42フィターゼの調製物が単一の突出したタンパク質成分を含むことが示された。ゲルのデジタル画像を走査することに基づく半定量的な分析(図1)によって約60〜79%という純度が示される。
(実施例7に従って精製された)C.freundiiのP3−42フィターゼの活性のpH依存性を、緩衝液中において、そして実施例1に記載の条件下で研究した。この酵素は、広範なpH領域(2〜5.5)で活性であり、pH3および4〜4.5の周囲で2つの活性最大値を有していた(図2)。
1つのイノシトール残基あたり3、4または5つのリン酸基を含むイノシトールリン酸塩の画分を真菌フィターゼ(Natuphos)で処理したフィチン酸の部分的加水分解物からイオン交換クロマトグラフィーによって単離した。これらの調製物の産生および精製は、BioChemicals Ltd(St.Petersburg,Russia)の商業的サービスであった。種々の程度のリン酸化を有するイノシトール−リン酸塩による各々の画分の混入は、HPLCによって5%未満であると判定された(Sandberg A.S.,Ahderinne R.J.Food Sci.51(3),547〜550)。市販のフルクトース1,6−二リン酸塩およびフルクトース6−リン酸塩(Sigma)を、二および一リン酸塩基質に向かうC.freundiiのP3−42フィターゼの特異性を評価するために用いたモデル基質として用いた。異なる基質での実施例7によって精製されたC.freundiiフィターゼの活性を、最終反応混合物中において2mM濃度の基質を用いて、pH3.5で標準的なアッセイ(実施例1)によって測定した。この結果(図3)によって、この酵素は、イノシトール五リン酸塩で最大活性を有することが示されている。イノシトール三リン酸および四リン酸塩、ならびにフィチン酸での活性は、ある程度類似していたが、フルクトース1,6−二リン酸塩は、むしろ劣った基質であった。フルクトース6−リン酸塩の加水分解は、信頼できる検出限界未満であった。
C.freundiiのフィターゼの比活性は、実施例7に従って精製された調製物を用いて評価した。フィターゼ活性は、実施例1に従ってpH3.5で測定した。フィターゼ濃度は、BCA Protein Assay Kit(Pierce)を用いて総タンパク質濃度を測定すること、およびSDS PAGEによって評価されるフィターゼ含量(実施例7)によってこれを補正することによって算出した。これらの測定によれば、C.freundiiのP3−42由来の組み換えフィターゼの比活性は約1100U/mgである。
初期に記載されたCitrobacterファミリーに属する細菌由来の唯一のフィターゼは、C.brakii YH−15由来の細胞内フィターゼである(Kim H.W.ら、Biotechnol.Lett.25,1231〜1234(2003))。この酵素は、本発明のC.freundiiの分泌フィターゼといくつかの特性を共有し、両方の酵素とも高い比活性の酸性フィターゼである。2つの酵素のアミノ酸配列の直接比較は、不可能である。なぜなら、C.brakii酵素に関する配列情報は、10アミノ酸残基のストレッチに限定される。C.freundiiのフィターゼの推定アミノ酸配列は、C.brakii酵素由来の配列と10残基のうち9残基を共有するフラグメントを含む。しかし、配列のこのような短いフラグメントの比較では、2つの酵素の全体的な相同性について結論を得ることはできない。2つの酵素の間の最も顕著な相違は、細胞位置である:C.brakii由来の酵素は、細胞内であるが、C.freundiiのフィターゼは明らかに分泌された酵素である。この酵素は、天然の宿主において分泌され、その推定のアミノ酸配列は、シグナルペプチド(Signal Pアルゴリズム:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/によって予想)を含み、その酵素はまた、その天然のシグナルペプチド下でE.coliから極めて効率的に分泌される。それに加えて、2つの酵素の生化学的な特性には多数の有意な相違が存在する(表1)。表1
(C.freundiiのP3−42由来のフィターゼとC.brakii YH−14由来のフィターゼとの比較)
フィターゼ改変体は、上記で列挙されるような突然変異誘発方法、例えば、Morinagaら(Biotechnology(1984)2,p646〜649)に、またはNelsonおよびLong(Analytical Biochemistry(1989)、180、p147〜151)に開示される方法、またはWO92/18645に記載のエラー限界値突然変異誘発プロトコールを用いて、配列番号2の突然変異誘発によって構築した。
改変体の熱安定性は、酵素の不活性化温度によって特徴付けた。この不活性化温度は、種々の温度での10分間のインキュベーションおよび引き続く室温への冷却後、実施例1に記載されるような酵素アッセイにおいて、酵素の残留活性を測定することによって決定した。この不活性化温度とは、この残留活性が、室温で同じ条件下で同じ期間にわたるインキュベーション後の残留活性に比較して50%である温度である。必要に応じて、測定された活性データからの適切な補間および外挿を行って、50%残留活性に相当する温度を決定する。熱安定性の相違の℃は、2つの酵素の不活性温度をお互いから差引きすることによって計算した。すなわち、熱安定性の相違(T.D.)を、親のフィターゼと比較する(=不活性化温度(改変体)−不活性化温度(親))。
表2:配列番号3に示される配列を有する親のフィターゼP3−42由来の改変体の熱安定性の相違
Claims (31)
- Citrobacter freundiiのフィターゼ、またはそのホモログ、改変型、機能的な等価物もしくは有効なフラグメントに相当するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
- 配列番号3に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも75%の同一性(相同性)を有する配列、もしくはその機能的なフラグメントを含む、請求項1に記載の単離されたポリペプチド。
- 配列番号3に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも75%の同一性(相同性)を有する配列、もしくはその機能的なフラグメントを有する単離されたポリペプチド。
- アクセッション番号NCIMB41247として寄託されたCitrobacter freundiiのP3−42株由来であるという点で特徴付けられるフィターゼ。
- フィターゼまたはその機能的な等価物であって、該フィターゼが少なくとも1100U/mgという比活性を有し、該比活性が、200mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH3.5に含有される、2mMのフィターゼ、0.8mMのCaCl2を含有する溶液中で該フィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられる、フィターゼまたはその機能的な等価物。
- フィターゼまたはその機能的な等価物であって、該フィターゼがpH3およびpH4〜4.5の周囲で2つの最大活性を有し、該活性が、200mMの酢酸ナトリウム緩衝液に含有される、2mMのフィターゼ、0.8mMのCaCl2を含有する溶液中で該フィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられる、フィターゼまたはその機能的な等価物。
- 請求項7または請求項8に記載の単離されたポリペプチドまたはフィターゼであって、以下:
P229S;D112V;Q82R;Q274H;D112Y;F88Y;K46E;S233C;R288M;I384L;Q385R;Q274L;E307Y;T199I;Q82KおよびT203I、
からなる群より選択される1つの変異を含む、単離されたポリペプチドまたはフィターゼ。 - Citrobacter freundiiのフィターゼという酵素、またはそのホモログをコードする単離された核酸分子。
- 配列番号3に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも75%の同一性(相同性)を有する配列、またはその有効なフラグメントを含む、ポリペプチドをコードする、請求項11に記載の単離された核酸分子。
- ヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、該ヌクレオチド配列が、配列番号2の任意の配列と同じであるか、もしくはそれに相補的であるか、もしくは配列番号2の任意の配列の任意の適切なコドン置換を含むか、または配列番号2と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%もしくは99%の配列相同性を有する配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはフィターゼをコードする単離された核酸分子。
- 配列番号2に示される配列を含む単離された核酸分子。
- 請求項1〜10のいずれかに記載される単離されたポリペプチドもしくはフィターゼまたはそのホモログもしくは誘導体を含むプラスミドまたはベクター系。
- 請求項11〜15のいずれかに記載の核酸配列を含む、請求項16に記載のプラスミドまたはベクター系。
- 配列番号2に示される核酸配列、またはそれに対して少なくとも75%相同性である配列もしくはその有効なフラグメントを含む、請求項16に記載のプラスミドまたはベクター系。
- 前記プラスミドまたはベクター系が、宿主細胞または微生物中において、それぞれのフィターゼ酵素またはそのホモログ、改変型、機能的な等価物もしくは有効なフラグメントの発現のための発現ベクターである、請求項16〜18のいずれかに記載のプラスミドまたはベクター系。
- 請求項16〜19のいずれかに記載のプラスミドまたはベクター系で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
- フィターゼを含む請求項20に記載の宿主細胞であって、該フィターゼが、配列番号3に示されるアミノ酸配列もしくはその機能的なフラグメント、またはそれに対して少なくとも75%相同である配列、または請求項7〜10のいずれかに記載のその改変体を含む、宿主細胞。
- 請求項20または21に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞が、B.subtilis、E.coliのような細菌を含む微生物、および、H.polymorpha、S.pombe、S.cerevisiaeのような酵母を含む真菌由来である、宿主細胞。
- 前記微生物が原核生物細菌細胞、そして好ましくはE.coliである請求項22に記載の宿主細胞。
- アクセッション番号NCIMB41247として寄託された、細菌細胞株Citrobacter freundiiのP3−42。
- フィターゼを産生する方法であって、該方法は、配列番号3に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも75%の相同性を有する配列、またはその改変型もしくは改変体もしくは有効なフラグメントを宿主細胞中で発現する工程と、該宿主細胞培養培地から該フィターゼを分離する工程とを包含する、方法。
- 請求項1〜25のいずれかに記載されるフィターゼを含む食物または動物飼料組成物。
- 食物または動物の飼料中における請求項1〜10のいずれかに記載のフィターゼの使用。
- 食物または動物飼料に対して請求項1〜10のいずれかに記載のフィターゼを液体形態で噴霧する工程を包含する、食物または動物飼料の生成のための方法。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のフィターゼを乾燥生成物として、前記食物または動物飼料とを混合する工程を包含する、食物または動物飼料の生成のための方法。
- フィターゼ酵素改変体を調製するための方法であって、該方法は:
a)親のフィターゼ酵素を選択する工程であって、該親のフィターゼ酵素が:
i.配列番号3に対して少なくとも75%の相同性である親のフィターゼ酵素
ii.Citrobacter spp.由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
b)該親のフィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である少なくとも1つの変更を作製して、フィターゼ酵素改変体を得る工程と、
c)該親フィターゼ酵素に比較して:
i.より高い熱安定性および/または
ii.比活性および/または
iii.タンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体をスクリーニングする工程と、および/または
d)フィターゼ酵素改変体を調製する工程と、
を包含する、方法。 - フィターゼ酵素改変体を調製する方法であって、該方法が:
a)親のフィターゼ酵素をコードするDNA配列を突然変異誘発に供する工程であって、該親のフィターゼ酵素が
i.配列番号3に対して少なくとも75%の相同性である親のフィターゼ酵素
ii.Citrobacter spp.由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
b)工程(A)において得られた変異されたDNA配列を宿主細胞中で発現させる工程と、
c)該親フィターゼ酵素に比較して:
iv.より高い熱安定性および/または
v.より高い比活性*および/または
vi.より高いタンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞をスクリーニングする工程と、
および/または
e)該宿主細胞によって発現されるフィターゼ酵素改変体を調製する工程と、
を包含する、方法。
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