JP2008241621A - 血液凝固測定用試薬及び組織因子安定化方法 - Google Patents

Abstract

【課題】安定な組織因子を含有する血液凝固測定用試薬、及び組織因子の安定化方法を提供する。
【解決手段】本発明における血液凝固測定用試薬は、非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン、及び組織因子を含有する。また、本発明における組織因子を安定化させる方法は、非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン及び組織因子を共存させることを特徴とする。本発明によれば、安定な組織因子を含有する血液凝固測定用試薬、及び組織因子の安定化方法を提供することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、組織因子を含有する血液凝固測定用試薬及び組織因子の安定化方法に関する。

組織因子は、血液凝固因子の外因性凝固因子に係るスタート因子である。この組織因子は、プロトロンビン時間測定等の血液凝固測定用試薬における主成分の一つであり、臨床において血液凝固能の異常を診断する上で広く利用されている。

血液凝固測定用試薬の原料としての組織因子は、一般的にウシやウサギ等の大脳より抽出されるものが使用される。しかしながら、このような動物の大脳から抽出された天然の組織因子には、血液成分、リポ蛋白質及び血漿タンパク質等の不純物が含まれており、長期間保存した場合、不溶性物質の析出等が生じ、安定性が悪いという問題があった。

このため、天然由来の組織因子を、血液凝固測定用試薬の原料として使用する場合、安定性を向上させるために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、クリスタリン（天野製薬）等の安定化タンパク質、界面活性剤又は高濃度グリセリン溶液等の安定化剤の試薬への添加や、抗体カラムクロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等による部分精製が行われている。しかしながら、ＢＳＡ等の安定化剤を試薬に添加した場合、該安定化剤が血液凝固測定に影響を及ぼす場合があり、また、部分精製は大量の組織因子を調製する際に、時間と費用がかかるという問題があった。

近年、大腸菌や酵母などを宿主とした遺伝子組換え技術が進歩し、遺伝子組換えヒト組織因子や遺伝子組換えウサギ組織因子が既に市販され入手可能になった。しかしながら、その遺伝子組換え組織因子原料であっても、その保存溶液の状態によってはタンパク質の変性や生物活性の低下を生じ、結果として保存安定性が悪いという問題があった。

尚、ニッケル化合物を含有する血液凝固測定用試薬（特許文献１）が既に報告されている。しかしながら、この技術は血液凝固測定の感度や精度を向上の技術に関するもので、血液凝固測定用試薬、特に組織因子の安定化について全く記載が無い。

更に、一般的にニッケル等の重金属は、タンパク質を不安定化させることが知られている。そのため、酵素等のタンパク質を含有する溶液では、重金属の影響を除去するためにＥＤＴＡ等のキレート剤を添加することが知られている（非特許文献１）。そのメカニズムは、重金属イオンの触媒作用による過酸化あるいは酸化、変性を抑制あるいは防御するものであり、さらには溶液中に微量に混在する金属プロテアーゼによる加水分解の阻害のためである。

特開２００１−２５５３３２号公報 岡田 雅人、宮崎 香編集、「タンパク質実験ノート(上)抽出と分離精製」羊土社出版、１９９６年９月１０日発行、ｐ２４

本発明は、安定な組織因子を含有する血液凝固測定用試薬、及び組織因子の安定化方法を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、
（１）非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン、及び組織因子を含有する血液凝固測定用試薬；
（２）非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル及び／又はポリオキシエチレンソルビタンエステルである（１）に記載の血液凝固測定用試薬；
（３）非イオン性界面活性剤の濃度が、０．５〜５（Ｖ／Ｖ）％である、（
１）又は（２）に記載の血液凝固測定用試薬；
（４）ニッケルイオンが、硫酸ニッケル、塩化ニッケル、硝酸ニッケル及び／又は酢酸ニッケル由来である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の血液凝固測定用試薬；
（５）ニッケルイオンの濃度が０．０２５〜０．５ｍＭである、（１）〜（４）のいずれか１に記載の血液凝固測定用試薬；
（６）組織因子が、ヒト、ウシ、サル、ウサギ及び／又はサル由来の組織因子、又はカイコ蛹から調製された遺伝子組換えウシ組織因子である、（１）〜（５）のいずれか１に記載の血液凝固測定用試薬；
（７）血液凝固測定用試薬が、血液凝固第ＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩ因子及び／又は血液凝固第Ｘ因子を測定する、（１）〜（６）のいずれか１に記載の血液凝固測定用試薬；
（８）非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン及び組織因子を共存させることにより、組織因子を安定化させる方法；
を提供するものである。

本発明によれば、安定な組織因子を含有する血液凝固測定用試薬、及び組織因子の安定化方法を提供することができる。

本実施形態における、非イオン性（ノニオン性）界面活性剤としては、水溶液においてイオンを解離しない界面活性剤であれば、特に制限されるものではないが、例えば、オクチルグルコシド、ペプチルチオグルコシド、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステル等が挙げられ、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルが好ましく、特にポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル（商標名：ＮＰ−４０）、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（商標名：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）及びポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商標名：Ｔｗｅｅｎ ８０）が好ましい。

非界面活性剤の添加量は、血液凝固測定用試薬による血液凝固能の測定結果が、診断に影響を及ぼさない程度であれば、特に限定されないが、例えば、血液凝固測定用試薬中の濃度として０．１〜１０（Ｖ／Ｖ）％でが好ましく、特に０．５〜５（Ｖ／Ｖ）％が好ましい。

本実施形態におけるニッケルイオンとは、血液凝固測定用試薬中に存在するニッケルイオンを示す。ニッケルイオンは、ニッケル塩を血液凝固測定用試薬に添加することで容易に形成することができる。ニッケル塩としては、硫酸ニッケル、塩化ニッケル、硝酸ニッケル及び酢酸ニッケル等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。

血液凝固測定用試薬のニッケルイオンの濃度としては、血液凝固測定用試薬による血液凝固能の測定結果が、診断に影響を及ぼさない程度であれば、特に限定されないが、０．０１〜１．０ｍＭが好ましく、特に０．０５〜０．５ｍＭが好ましい。

本実施形態において組織因子としては、哺乳動物の脳や胎盤に由来する天然由来の組織因子、及び遺伝子組換技術により調製された遺伝子組換組織因子が挙げられ、例えば、ヒト、ウシ、サル、ウサギ及び／又はサル由来の組織因子、及びカイコ蛹から調製された遺伝子組換えウシ組織因子が好ましい。

尚、本実施形態における組織因子は、広く血液凝固第ＩＩＩ因子、即ち、アポタンパク質である組織因子及びリン脂質と複合体を形成した組織因子であるトロンボプラスチンをも含むものである。

ここで、カイコ蛹から遺伝子組換えウシ組織因子は、例えば以下の方法で調製することができる。
（１）ウシ組織因子をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスを感染させたカイコ蛹を、ホモジナイザーにより緩衝液中で破砕し破砕液を得る
（２）破砕液を滅菌したガーゼで濾過した後、再度ホモジナイザーで破砕液を破砕する。
（３）得られた破砕液を遠心分離し、上清を回収することで固形成分除去液を得る。
（４）固形成分除去液に非イオン性界面活性剤を加え、インキュベートすることでバキュロウィルスを不活性化し、遺伝子組換えウシ組織因子を可溶化させた溶液を得る。

また、精製された天然由来の組織因子や遺伝子組換組織因子等は、リン脂質と複合体を形成していないので、血液凝固測定用試薬に用いる場合、リン脂質と複合体を形成させる必要がある。組織因子とリン脂質との複合体を形成させる方法としては、公知の方法を用いればよく、特に制限されるものではないが、例えば、デオキシコール酸塩等の界面活性剤を用いてリン脂質の溶解した脂質溶液を調製し、この脂質溶液に遺伝子組換組織因子を添加した後、界面活性剤を透析等で除去する方法等が挙げられる。

本実施形態における血液凝固測定用試薬としては、外因性因子及び共通因子系の血液凝固検査に用いられるものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、プロトロンビン時間測定試薬及び複合因子測定用試薬等が挙げられ、特に血液凝固第ＩＩ、第ＶＩＩ及び／又は第Ｘ因子を測定するものが好ましい。尚、本実施形態における血液凝固測定用試薬には、複数の試薬から構成される試薬キットも含まれる。

ここで、外因性因子の血液凝固因子としては第ＶＩＩ因子が挙げられ、共通因子系の血液凝固因子としては第Ｘ、Ｖ、ＩＩ、Ｉ因子が挙げられる。

また、血液凝固測定用試薬には、必要に応じて緩衝剤を添加してもよい。緩衝剤の種類及び濃度は、血液凝固測定用試薬の目的等に応じ適宜選択すればよく、特に制限されるものではないが、緩衝液の種類の具体例としては、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＰＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＢＩＳＴＲＩＳ及びＧｌｙｃｉｎｅ等が挙げられる。また、緩衝剤の濃度としては、１０〜１００ｍＭが好ましい。

血液凝固測定用試薬のｐＨとしては、血液凝固の測定能に影響を与えないものであれば、特に制限されず、適宜調整することが可能であるが、例えばｐＨ５〜９が好ましく、特に６〜８が好ましい。

本実施形態におけるプロトロンビン時間測定試薬としては、非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン、組織因子とカルシウムイオンを有し、且つ、組織因子が非イオン性界面活性剤及びニッケルイオンと共存するものであれば、特に制限されるものではない。

また、組織因子、非イオン性界面活性剤及びニッケルイオンを含む第１試薬と、カルシウムイオンを含む第２試薬のプロトロンビン時間測定の試薬キットとして構成することもできる。

本実施形態における複合因子測定用試薬としては、非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン、組織因子、血液凝固第Ｖ因子、フィブリノゲン及びカルシウムイオンを有し、且つ、組織因子が非イオン性界面活性剤及びニッケルイオンと共存するものであれば、特に制限されるものではない。

また、組織因子、非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン、血液凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンを含有する第１試薬と、カルシウムイオンを含有する第２試薬とからなる複合因子測定の試薬キットとして構成することもできる。

ここで、血液凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンとしては、硫酸バリウム吸着血漿を用いることができる。硫酸バリウム吸着血漿の調製方法は、公知の方法を用いればよく、特に限定されるものではないが、例えば、Owrenらの方法により調製できる（One-stage Prothrombin Time techniques (Thrombosis and Bleeding Disorders Theory and Method, 1971, p92-97)）。より具体的には、ウシ血漿に約１０〜３０（Ｗ／Ｖ）％の硫酸バリウムを加えて室温で約２０分間混和した後、硫酸バリウムを除去することにより調製することができる。この吸着血漿は実質的に少なくとも凝固第ＩＩ、ＶＩＩ及びＸ因子を含まず、目的とする第Ｖ因子及びフィブリノゲンを含有する。尚、血液凝固第Ｖ因子及びフィブリノゲンの精製品を試薬に添加することもできる。

尚、血液凝固測定用試薬の調製において、上述の硫酸バリウム吸着血漿、カルシウムイオン源となるカルシウム塩及び緩衝剤等の添加順序は、特に制限されるものではない。また、これらは、例えば組織因子とリン脂質の複合体を形成させる前に添加しても良いし、複合体形成後に添加してもよい。

更に、本実施形態における血液凝固測定用試薬は凍結乾燥試薬とすることもできる。該凍結乾燥試薬としては、使用時に精製水又は緩衝液で溶解した際に、組織因子が非イオン性界面活性剤及びニッケルイオンと共存するものであれば、特に制限されるものではない。例えば、精製水又は緩衝液に非イオン性界面活性剤及びニッケルイオンが添加されても良いため、凍結乾燥状態の組織因子が、必ずしも非イオン性界面活性剤及びニッケル塩と共存する必要はない。

本実施形態における組織因子を安定化させる方法としては、非イオン性界面活性剤及びニッケルイオンと組織因子が共存していれば、特に制限されるものではない。即ち、非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン及び組織因子が溶液中で共に存在する状態であれば、組織因子を安定化することができる。

尚、該方法で用いられる、非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン及び組織因子としては、上述の非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン及び組織因子と同様のものを用いることができる。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（非イオン性界面活性剤及び重金属イオンの種類による組織因子の安定性への影響）
＜遺伝子組換えウシ組織因子の調整＞
ウシ組織因子をコードするｃＤＮＡをバキュロウィルスへ組み込んだ組換えバキュロウィルスを感染させたカイコ蛹１匹あたりに、緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭベンザミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＤＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．５）１０ｍＬを加えて、氷冷下、ポリトロンホモジナイザー（回転数１２０００ｒｐｍ、５分間）を用いてカイコ蛹を破砕し、破砕物を含む溶液を得た。この溶液を滅菌したガーゼで濾過することにより、固形成分を除去した後、さらに、テフロンホモジナイザー（アズワン、回転数５０００ｒｐｍで１０ストローク）を用いて破砕することで破砕液を得た。

破砕液を遠心分離（３０００×ｇ、８℃、１０分）し、上清を回収し、この上清を固形成分除去液とした。固形成分除去液８容量に対して、１０％の非イオン性界面活性剤を２容量加えて、３０℃で３時間インキュベートして、バキュロウィルスを不活性化するとともに、遺伝子組換えウシ組織因子を可溶化させることで、遺伝子組換えウシ組織因子の溶液を得た。

バキュロウィルスの不活性化の確認は、非イオン性界面活性剤で処理された固形成分除去液のウィルス力価を、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ，Ｈ．：Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｙｇ．，２７，４９３（１９３８））に基づいて、顕微鏡で目視により９６穴のウィルス感染の有無を観察することにより行なった。

＜組織因子の生物活性の測定方法＞
組織因子の生物活性は、ＡｓｓａｙＰｒｏ社製のＡｓｓａｙＳｅｎｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＦ）Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ キット（ＡｓｓａｙＰｒｏキット）に基づいて、以下の手順で組織因子量の吸光度を力価として測定した。尚、測定回数は３回の繰り返しで測定を行い、吸光度の平均値として計算した。

（１）ＡｓｓａｙＰｒｏ社組織因子合成基質測定キット（以下、ＴＦアッセイキット）の構成試薬ｒｈＴＦ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用法用量に準じて調製する。
（２）ＴＦ標準溶液（1000pM）を希釈液で順次希釈して、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１６希釈系列およびブランク（希釈液）を作成する。
（３）被検試料（組織因子溶液）を専用希釈液で１００倍希釈する。
（４）マイクロプレートのウェル（ヌンク製）に希釈液（５０μＬ）を正確にピペットで分注する。
（５）ＦＶＩＩ溶液（２５μＬ）を正確にピペットで分注する。
（６）次に、予め作成したTF標準溶液および予め希釈した被検試料をそれぞれ２０μＬ分注し、マイクロプレートを１０秒間撹拌する。
（７）上記マイクロプレートに保護フィルムをかぶせて、３７℃下、３０分間、プレートリーダー（ＶＥＲＳＡ Ｍａｘ ｒｅａｄｅｒ、モレキュラーデバイス社）内でインキュベートする。
（８）保護フィルムを剥がし、それぞれのウェルに合成基質試薬（２５μＬ）を正確に分注する。
（９）プレートリーダー（ＶＥＲＳＡ Ｍａｘ ｒｅａｄｅｒ、モレキュラーデバイス社）を用いて、３７℃下、６０分間反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定する。
（１０）被検試料の４０５ｎｍにおける吸光度をブランク（希釈液）の吸光度より差し引き、補正した被検試料の吸光度を算出する。

＜非イオン性界面活性剤の種類の異なる試料溶液の調製＞
カイコ蛹を宿主として発現させた遺伝子組換えウシ組織因子の溶液として、
（１）非イオン性界面活性化剤を含有しない緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭベンザミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＤＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．５）で抽出した溶液、
（２）２％ＮＰ−４０を含有した緩衝液で抽出した溶液、
（３）２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有した緩衝液で抽出した溶液、及び
（４）２％Ｔｗｅｅｎ８０を含有した緩衝液で抽出した溶液
をそれぞれの試料溶液を調製し、８℃で保存した。

＜重金属イオンの種類の異なる試料溶液の調製＞
重金属イオンの種類としては、２価金属イオンとして硫酸Ｎｉ、塩化Ｍｇ、塩化Ｃａ、硫酸Ｃｕ、塩化Ｚｎ、塩化Ｆｅ及び塩化Ｍｎを、３価金属イオンとして塩化Ａｌを、それぞれ０．５ｍＭ濃度になるように、サンプルカップに採取した２％ＮＰ−４０を含有した緩衝液で抽出した遺伝子組換えウシ組織因子の溶液（５ｍＬ）に添加し試料溶液とし、８℃で保存した。

＜組織因子の生物活性の測定＞
それぞれの経時変化毎の試料溶液をサンプルとして、上述のＡｓｓａｙＰｒｏキットにより組織因子としての生物活性を４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度の測定結果に基づき、０日目の生物活性を１００％とした際の相対残存活性の結果を表１及び図１に示す。

表１及び図１から明らかなように、緩衝液だけで抽出した遺伝子組換えウシ組織因子溶液は経時変化とともに比活性が低下し、３週間目で８５％まで、６週間目で４５％まで低下した。２％非イオン性界面活性剤（ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｗｅｅｍ８０）を含有した緩衝液で抽出した遺伝子組換えウシ組織因子は、３週間目で約９０％まで、６週間目で約６０〜７０％まで低下した。その他の重金属イオンにいては、３週間目で約９０〜１００％、６週間目で７０〜９８％までの比活性の保持が認められた。一方、２％ＮＰ−４０及びニッケルイオンを含有した場合には溶液状態で、３週間目で１００％、６週間目で９８％の比活性を維持した。

このように、非イオン性界面活性剤であるＮＰ−４０及びニッケルイオンを含有した試料溶液は、他の試料溶液に比して、組織因子の生物活性を長期間維持できることが明らかとなった。

（ニッケルイオン濃度の組織因子の安定性への影響 ）
２％ＮＰ−４０を含有した緩衝液で抽出された遺伝子組換えウシ組織因子溶液（５ｍＬ）に、硫酸ニッケルを無添加（０ｍＭ）、０．０２５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ及び０．５ｍＭ濃度になるようにサンプルカップに採取し、栓をして８℃保冷庫に６週間保存した。また、コントロールとして、緩衝液のみで抽出された遺伝子組換えウシ組織因子溶液（５ｍＬ）を用いた。

それぞれの濃度において、上述のAssayProキットにより、実施例１と同様に組織因子としての生物活性を測定した。その相対残存活性の結果を表２及び図２に示す。

表２及び図２から明らかなように、緩衝液だけで抽出した遺伝子組換えウシ組織因子溶液は経時変化とともに比活性が低下し、３週間目で８５％まで、６週間目で４５％まで低下した。一方、０．０２５ｍＭ濃度のニッケルを含有すると、３週間目で９７％まで、６週間目で９１％まで比活性が維持した。更に０．１ｍＭ以上の濃度においては、３週間目で１００％、６週間目で１００％の比活性が認められた。

このように、非イオン性界面活性剤であるＮＰ−４０のみを含有した試料溶液に比して、少なくとも０．２５ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上のニッケルイオン含有した試料溶液は組織因子の生物活性を長期間維持できることが明らかとなった。

（凍結保存下における組織因子の安定性への影響）
遺伝子組換えウシ組織因子を緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭベンザミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＤＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．５）で抽出した溶液、２％ＮＰ−４０を含有した緩衝液で抽出した溶液、及び２％ＮＰ−４０を含有した緩衝液で抽出した溶液に０．１ｍＭ硫酸ニッケルを混合させた溶液を、それぞれサンプルカップ５ｍＬ採取し、栓をして冷蔵（８℃）、冷凍庫（−２０℃、−３５℃、−８０℃）に保存した。それぞれの条件において、上述の実施例１と同様にＡｓｓａｙＰｒｏキットにより組織因子としての生物活性を測定した。その結果を表３及び図３に示す。

表３及び図３から明らかなように、凍結保存においても、ＮＰ−４０とニッケルイオンを含有させた場合には、いずれの保存期間において安定した生物活性の保持が確認された。更に、ＮＰ−４０とニッケルイオンを含有させた場合の８℃での冷蔵保存の安定性が、ＮＰ−４０のみの−３５℃での冷凍保存の安定性を上回る結果となった。

（複合凝固因子測定用の試薬における組織因子の安定性）
＜組換えウシ組織因子リン脂質複合体の作製＞
０．２５％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣＮａ）（２０ｍＬ）にベイシス大豆レシチン０．４ｇ（日清製油（株））を溶解する。ローテータで室温下、完全に溶解させ、これに１，２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）０．１ｇ及び１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）０．３ｇ（いずれもＡｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ、Ｉｎｃ．）を懸濁させてリン脂質溶液を調製した。

このリン脂質溶液３７．５ｍＬに、０．５Ｍ塩化ニッケル溶液を５ｍＬ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）５．０ｍＬ、上記の遺伝子組換えウシ組織因子含有溶液（２．５ｍＬ）を添加し、ボルテックスで３０秒間攪拌した。撹拌後、ＢＲＡＮＳＯＮ＃２２１０型超音波装置で、３７℃、１５分間反応させ、３７℃、１時間放置した。溶液を透析膜（透析用セルロースチューブ、三光純薬（株））に移して、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（０．１５Ｍ 塩化ナトリウム含有）ｐＨ７．３で透析を３回行ない、透析後の透析チューブ内の溶液を得て、これをウシ組織因子リン脂質複合体含有液（ウシ組織因子リン脂質複合体含有液）として得た。

＜複合因子試薬：ＩＩ、ＶＩＩ、Ｘ因子検査用試薬の調製＞
（１）硫酸バリウム吸着血漿の調製
クエン酸を添加したウシ血漿に、ウシ血漿の３０ｗ／ｖ％量の硫酸バリウム、及びウシ血漿の２０ｖ／ｖ％量の生理食塩水を、添加し、６０分間ローテータで攪拌した。

この混合液を、４℃、５０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した後、上清を回収した。この上清に、当該上清の３０ｗ／ｖ％の硫酸バリウムを、少しずつ添加して、硫酸バリウムに血漿中のＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子吸着させた。その後遠心分離して上清を回収した。回収した上清を、透析チューブ（透析用セルロースチューブ、三光純薬（株））にいれ、生理食塩水を外液として、２〜８℃で透析を行なった。透析後の透析チューブ内の溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過した濾液を、硫酸バリウム吸着血漿とした。

（２）複合因子試薬：ＩＩ、ＶＩＩ、Ｘ因子検査用試薬の調製
上記で調製したウシ組織因子リン脂質複合体含有液と硫酸バリウム吸着血漿と４０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、４ｍＭの乳酸カルシウムを含む）とを、１：２：１の比率で混合して撹拌し、複合因子試薬（ＩＩ、ＶＩＩ、Ｘ因子測定用試薬）を調製した。

＜長期保存における複合因子試薬の試薬感度の評価＞
ＮＰ−４０を２％、及び硫酸ニッケルを０．１ｍＭの濃度になるように粗抽出遺伝子組換えウシ組織因子含有液に添加し調整した複合因子試薬（ＩＩ、ＶＩＩ、Ｘ因子測定用試薬）を用い、冷蔵保存（８℃）及び凍結保存（−２０℃、−３５℃、−８０℃）した際の、血液凝固検査としての試薬感度の試験を行った。また、コントロールとして硫酸ニッケルが無添加の複合因子試薬を調製した。

感度および再現性試験は、全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所（株））を用い、標準血漿の凝固時間（秒）を測定し次いで生理食塩水で8倍希釈した試料の凝固時間（秒）をそれぞれ３回の繰り返しで測定した。尚、標準血漿には、コアグトロールＮ（シスメックス）を用いた。ＩＳＩ値の算出には、AKキャリブラント（シスメックス）を試料として用いて、各条件における試薬のＩＳＩ値を算出した。試験結果を表４に示す。

表４から明らかなように、ＮＰ−４０と硫酸ニッケルを添加した複合因子試薬は、４週間の冷蔵保存及び６ヶ月凍結保存を行っても、標準血漿を用いた試薬感度は、正常域範囲の凝固時間である３２〜３５秒の範囲にあった。またＩＳＩ値も０．９〜１．０の範囲にあり、臨床検査試薬として十分な試薬感度が示された。

一方、硫酸ニッケルが無添加のコントロールでは、４週間の冷蔵保存で、標準血漿を用いた試薬感度の正常域範囲が４０秒以上となり、１：８希釈血漿においては１００秒以上を超え、もはや臨床検査試薬としては実用的でない性能となっていた。

＜長期保存における複合因子試薬の測定精度の評価＞
上述の試薬感度の評価で調整した複合因子試薬及びコントロールを用い、冷蔵保存（８℃）及び凍結保存（−２０℃、−３５℃、−８０℃）した際の、血液凝固検査としての測定精度試験を行った。

測定精度試験は、正常域管理血漿であるコアグトロールＩ（シスメックス）、及び異常域管理血漿であるコアグトロールＩＩＸ（シスメックス）を用い、５回の繰り返しで測定を行った。コアグトロールＩを用いて得られた凝固時間（秒）の結果を表５に、コアグトロールＩＩＸを用いて得られた凝固時間（秒）の結果を表６に示す。

表５及び表６から明らかなように、硫酸ニッケルが無添加のコントロールでは、３週間の冷蔵保存で、再現性のＣＶ値が大きく、試薬感度と同様に実用的な試薬性能を満足しなかった。一方、ＮＰ−４０および硫酸ニッケルの両者を添加して調製した複合因子試薬においては、３週間の冷蔵保存及び６ヶ月凍結保存を行っても、いずれもＣＶ値として１％未満を示す同時再現性としての測定精度が認められた。

以上の結果から、非イオン性界面活性剤及びニッケルイオンの存在によって、溶液中の組織因子の安定性が向上することが明らかとなった。このことから、従来技術に比べ、組織因子を含有する血液凝固測定用試薬等の長期保存が可能となる。

非イオン性界面活性剤及び重金属イオンの種類による、組織因子の安定性への影響を、相対残存活性で示した図である。 ニッケルイオン濃度の組織因子の安定性への影響を、相対残存活性で示した図である。 非イオン性界面活性剤及びニッケルイオンの、凍結保存下における組織因子の安定性への影響を、相対残存活性で示した図である。

Claims (8)

1. 非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン、及び組織因子を含有する血液凝固測定用試薬。
2. 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル及び／又はポリオキシエチレンソルビタンエステルである請求項１に記載の血液凝固測定用試薬。
3. 非イオン性界面活性剤の濃度が、０．５〜５（Ｖ／Ｖ）％である、請求項１又は２に記載の血液凝固測定用試薬。
4. ニッケルイオンが、硫酸ニッケル、塩化ニッケル、硝酸ニッケル及び／又は酢酸ニッケル由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の血液凝固測定用試薬。
5. ニッケルイオンの濃度が０．０２５〜０．５ｍＭである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の血液凝固測定用試薬。
6. 組織因子が、ヒト、ウシ、サル、ウサギ及び／又はサル由来の組織因子、又はカイコ蛹から調製された遺伝子組換えウシ組織因子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の血液凝固測定用試薬。
7. 血液凝固測定用試薬が、血液凝固第ＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩ因子及び／又は血液凝固第Ｘ因子を測定する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の血液凝固測定用試薬。
8. 非イオン性界面活性剤、ニッケルイオン及び組織因子を共存させることにより、組織因子を安定化させる方法。

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