JP2008209278A

JP2008209278A - センサチップ

Info

Publication number: JP2008209278A
Application number: JP2007046977A
Authority: JP
Inventors: Jun Fujiwara; 純藤原; Akira Suzuki; 晃鈴木
Original assignee: Aisin Seiki Co Ltd
Current assignee: Aisin Corp
Priority date: 2007-02-27
Filing date: 2007-02-27
Publication date: 2008-09-11

Abstract

【課題】簡便な構造のセンサチップを提供する。
【解決手段】測定試料或いは測定試料を検出する検出物質を設置する設置部を一方の面に備えた金属薄膜部１１と、金属薄膜部１１に対して設置部の側に配置され、設置部に流体を供給する流体供給路２１および設置部を通過した流体を排出する流体排出路２２を有する流路チップ２０と、金属薄膜部１１に対して設置部とは反対側に配置され、金属薄膜部１１の裏側から設置部に向けて光を照射するためのプリズム３０とを備えており、金属薄膜部１１を、プリズム３０の表面に直に形成してある表面プラズモン共鳴を利用した測定に用いるセンサチップＸ。
【選択図】図３

Description

本発明は、金属薄膜上におけるエバネッセント波と表面プラズモンとの共鳴現象を利用して、測定物質を検出するための表面プラズモン共鳴装置に使用するセンサチップに関する。

金属薄膜に照射光を照射したとき、金属薄膜の表面上に微弱なエネルギー波（エバネッセント波）と粗密波（表面プラズモン）とが生じる。このとき、両者の波数が一致すると、共鳴して反射光が減衰する現象を表面プラズモン共鳴現象という。金属薄膜の表面で引き起こされる物質間の相互作用は、誘電率に差異を生じるため表面プラズモンに影響し、共鳴の変化として捉えることができる。

このような表面プラズモン共鳴現象を利用して、金属薄膜の表面上で引き起こされる物質の状態に関する知見、例えば特異的結合反応、を検出することができる表面プラズモン共鳴装置（以下、ＳＰＲ装置と称する）が知られている。

ＳＰＲ装置には、検出対象物である測定試料をその内部に導入可能なセンサチップをセッティングする。
例えば、特許文献１に記載してあるセンサチップには、測定試料（抗体）を検出するための検出物質（抗原複合体）を固定可能な設置部を備えた金属薄膜部と、金属薄膜部の側に配置され、抗体を含む流体を供給する流体供給路、および、抗原複合体が固定された設置部に当該流体が通過できる流路を形成してある。
流体供給部に流体を供給し、流路の下流に設けた吸引口から吸引ノズルにより流路内を減圧することにより、当該流体を設置部に導くことができる。抗体を含む流体が設置部に到達すると、抗原抗体反応により、測定試料である抗体を金属薄膜部に捕捉することができる。

ＳＰＲ装置には、発光素子・プリズム・受光素子が設けてある。これらは、発光素子から照射させた照射光がプリズムに入射して金属薄膜で反射した後、この反射光が受光素子により受光できるように構成してある。
抗原抗体反応の進行中に、発光素子から照射光を金属薄膜に照射すれば、抗体が抗原複合体に吸着されるに従い、受光素子の受光量は減少する。このように、ＳＰＲ装置では、表面プラズモン共鳴現象を利用して、金属薄膜の表面上の抗体（測定試料）の量を測定することができる。

特開２００４−５３３７２号公報

特許文献１に記載のセンサチップでは、当該流体を設置部に導くために、ＳＰＲ装置に吸引ノズル等の構成を設ける必要がある。しかし、吸引ノズルなどの装置を設けると、ＳＰＲ装置全体が大掛かりとなる。
さらに、オンサイトでの測定を実現するため、ＳＰＲ装置を簡便化し、それに合せてセンサチップを構成する部品数を少なくするなど、センサチップにおいて、できるだけ簡便な構成とすることが望まれている。

また、金属薄膜部は、ガラス基板の上面全体に蒸着してある。抗原などの物質を固定する設置部は、通常、ガラス基板の中央部分に設けるため、このとき、例えばガラス基板の縁部に金属薄膜部を設ける必要はない。

従って、本発明の目的は、簡便な構造のセンサチップを提供することにある。

上記目的を達成するための本発明に係る表面プラズモン共鳴を利用した測定に用いるセンサチップの第一特徴構成は、測定試料或いは測定試料を検出する検出物質を設置する設置部を一方の面に備えた金属薄膜部と、前記金属薄膜部に対して前記設置部の側に配置され、前記設置部に流体を供給する流体供給路および前記設置部を通過した流体を排出する流体排出路を有する流路チップと、前記金属薄膜部に対して前記設置部とは反対側に配置され、前記金属薄膜の裏側から前記設置部に向けて光を照射するためのプリズムとを備えており、前記金属薄膜部を前記プリズムの表面に直に形成した点にある。

本構成であれば、金属薄膜を蒸着させる部材として例えば透明板を別部材として準備する必要がなく、センサチップをより簡便に構成することができる。
例えば、流路チップとプリズムとの間には流体を流通させるため、両者の間には密封状態を形成する必要がある。しかし、このように単純な構成であれば、密封状態を形成する部位の加工工数が少なくなる等、効率的なセンサチップを得ることができる。

本発明に係るセンサチップの第二特徴構成は、測定試料或いは測定試料を検出する検出物質を設置する設置部を一方の面に備えた金属薄膜部と、前記金属薄膜部に対して前記設置部の側に配置され、前記設置部に流体を供給する流体供給路および前記設置部を通過した流体を排出する流体排出路を有する流路チップと、前記金属薄膜部に対して前記設置部とは反対側に配置され、前記金属薄膜部の裏側から前記設置部に向けて光を照射するためのプリズムとを備えており、前記金属薄膜部を一方の面に設けた透明板と、当該透明板と略同厚であり且つ当該透明板を取り囲む枠部材とを、前記流路チップと前記プリズムとの間に設けた点にある。

本構成によれば、金属薄膜部を形成した透明板を流路チップ及びプリズムの間に設ける構成とすることで、透明板のみを交換して用いることが可能となる。この結果、ランニングコストの安いセンサチップを得ることができる。
また、金属薄膜部を設けた透明板は枠部材の内部に挿入される。よって、金属薄膜を形成する領域を必要最小限の大きさに構成することができ、やはり合理的なセンサチップを得ることができる。
このように、本構成であれば、簡便な構造のセンサチップとなる。

本発明に係るセンサチップの第三特徴構成は、前記流路チップに、前記流体排出路を通過した流体を貯留する廃液貯留部を備えた点にある。

本構成のように廃液貯留部を備えておけば、別途、廃液を回収する手段を要しない。その結果、例えば屋外の観測現場のように十分な測定設備が存在しない場所での測定作業が容易になる。本構成のセンサチップであれば、より可搬性に優れたセンサチップを得ることができる。

さらに、本構成であれば、流体排出路からオーバーフローした流体を廃液貯留部に貯留することができる。そのため、流体供給路からの流体の供給を、流体排出路からオーバーフローする程度の量とすれば、吸引ノズル等を使用して流体を流通させる必要がない。そのため、本構成のセンサチップでは、ＳＰＲ装置を簡便化することができる。

本発明に係るセンサチップの第四特徴構成は、当該流路チップと前記プリズムとの間に介装され、前記流路チップと前記プリズムとの間に反応空間を形成するシールリングが、前記流路チップの下面に形成した溝部に装着した点にある。

本構成のように、シールリングを溝部に装着する構成であれば、シールリングの保持が確実となる。よって、例えば、密封に際する流路チップとプリズムとの締結程度が変動しても、シールリングが所期の位置からずれる虞が殆どない。よって、シール効果が向上する。
また、例えばシール効果を高めるべく厚みの大きなシールリングを用いた場合でも、流路チップとプリズムとの間隔は小さく設定することができる。よって、何らかの外力が作用しても流路チップとプリズムとの相対位置がずれ難く、シール部の密封状態が損なわれる可能性も小さくなる。

以下、本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
本発明のセンサチップは、共鳴現象を利用して、測定物質を検出するための表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲ装置）に使用するセンサチップである。
図１〜３に示したように、センサチップＸは、測定試料或いは測定試料を検出する検出物質を設置する設置部１２を一方の面に備えた金属薄膜部１１と、金属薄膜部１１に対して設置部１２の側に配置され、設置部１２に流体を供給する流体供給路２１および設置部１２を通過した流体を排出する流体排出路２２を有する流路チップ２０と、金属薄膜部１１に対して設置部１２とは反対側に配置され、金属薄膜部１１の裏側から設置部１２に向けて光を照射するためのプリズム３０とを備えている。
そして、金属薄膜部１１をプリズム３０の表面に直に蒸着して形成してある。このとき、金属薄膜部１１は、流路チップ２０に対向するプリズム３０の表面に蒸着する。

（金属薄膜部）
金属薄膜部１１は、プリズム３０の上面に蒸着して形成する。蒸着は、公知の手法により行うことができ、例えば膜厚が３０〜５５ｎｍとなるように金属薄膜部１１を形成する。金属薄膜としては、例えば金・銀・白金等の貴金属の他、鉄・アルミニウム・銅等が適用できるが、これに限られるものではない。本実施形態では金を適用した場合について説明する。

設置部１２は、金属薄膜の表面上に形成される。この設置部１２には、測定試料或いは測定試料を検出する検出物質を直接設置する。或いは、例えば抗原９１である測定試料を、金属薄膜の表面に固定された抗体９２と結合させることにより測定試料を間接的に設置部１２に設置する。

設置部１２に測定試料を間接的に設置する場合、抗原抗体反応のような特異的結合反応を利用するものであれば、限定されるものではない。特異的結合反応は、例えば、測定物質と、測定試料を選択的に検出し得る分子認識能を有する検出物質との結合反応であり、上述した抗原抗体反応の他に、核酸間でのハイブリダイゼーション反応等が例示される。

尚、測定試料とは、抗原・抗体の他に、化学物質・タンパク質等の高分子・ＤＮＡ断片・微生物又はウィルスおよびその断片・ホルモン等、あらゆる物質が対象となりうる。

（流路チップ）
流路チップ２０には、設置部１２に流体を供給する流体供給路２１と、設置部１２を通過した流体を排出する流体排出路２２とを備えている。さらに、流路チップ２０は、流体排出路２１を通過した流体を貯留する廃液貯留部２４を備える。

本実施形態では、流体供給路２１より供給された流体（以下、液体サンプル）は、流体が流通可能な空間である流路を流下して設置部１２に到達し、設置部１２を通過した液体サンプルは、流体排出路２２に到達する。当該流路は、例えば、流路チップの下面に形成し、流体供給路２１と流体排出路２２とを連通させる空間（後述の反応空間２３）とする。
本実施形態の流路チップ２０では、液体サンプルの流通経路は、断面がＵ字形状となっている（図１（ロ））。

流体供給路２１の開口端部は大径に形成してある。例えばシリンジによって液体サンプルを流体供給路２１に供給する場合、当該開口端部を大径に形成すれば、シリンジの先端を流体供給路２１に挿入し易くなり、液体サンプルの供給を容易に行うことができる。

設置部１２を複数箇所設けた場合は、それぞれの設置部に連通する流体供給路２１および流体排出路２２を、１つずつ或いはそれぞれ設置部１２と同じ数だけ設ける。
ただし、流体排出路２２を複数個設けた場合であっても、図１〜３に示したように廃液貯留部２４を１つだけ設ける構成とすると、流路チップ２０の構成を単純化できる。

流体排出路２２から排出された液体サンプルは、オーバーフロー部２８を経由してオーバーフローにより廃液貯留部２４に貯留される。液体サンプルを廃液貯留部２４に貯留することにより、センサチップの外部に廃液貯留部を設ける必要がない。さらに、流体排出路２２から液体サンプルを吸引するポンプ等も必要ない。そのため、ＳＰＲ装置が簡便な構成となり、例えば屋外の観測現場のように十分な測定設備が存在しないオンサイトでの使用に適している。

流路チップ２０は、例えばポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等の透明樹脂や、ＡＢＳ等の樹脂或いはガラス等によって形成されるが、これに限られるものではない。流路チップ２０の成形は公知の成形方法であれば、何れの手法を適用してもよい。

流路チップ２０の下面には溝部２５が形成してある。そして、流路チップ２０とプリズム３０との間に介装され、流路チップ２０とプリズム３０との間に反応空間２３を形成するシールリング５０を、当該溝部２５に装着してある。溝部２５は、１つ、或いは、設置部１２の個数に応じた数だけ形成できる。
シールリング５０は、流路チップ２０とプリズム３０とを組み付けたときに密封して反応空間２３を形成できるように、例えばゴム等の弾性部材で構成されるＯリングが適用できる。当該反応空間２３は流路となって流体供給路２１および流体排出路２２のそれぞれと連通しており、流体供給路２１から供給された液体サンプルは、反応空間２３の内部に充填される。

設置部１２を複数箇所設けた場合は、設置部１２の個数に対応する数のシールリング５０を溝部２５に装着して、設置部１２の個数に対応する数の反応空間２３を形成することができる。

一方、例えば１つのシールリング５０を装着して１つの反応空間２３を形成した場合であっても、当該１つの反応空間２３の内部に複数の設置部１２を設けることができる。このような構成は、複数の設置部において異なる測定物質をそれぞれ固定し、これら測定物質を同じ液体サンプルで処理できる場合に適用できる。

本構成のように、シールリング５０を溝部２５に装着する構成であれば、シールリング５０の保持が確実となる。よって、例えば、密封に際する流路チップ２０とプリズム３０との締結程度が変動しても、シールリング５０が所期の位置からずれる虞が殆どない。よって、シール効果が向上する。
また、例えばシール効果を高めるべく厚みの大きなシールリング５０を用いた場合でも、流路チップ２０とプリズム３０との間隔は小さく設定することができる。よって、何らかの外力が作用しても流路チップ２０とプリズム３０との相対位置がずれ難く、シール部の密封状態が損なわれる可能性も小さくなる。

（プリズム）
プリズム３０は、アクリル・プラスチック等の透明樹脂材料や、高屈折率のガラス材料により形成されるが、これらに限られるものではない。当該ガラス材料としては、例えばＢＫ７・ＳＦＬ６などの光学ガラスが例示される。
プリズム３０には、その表面に金属薄膜部１１を形成してある。本構成であれば、金属薄膜を蒸着させる部材として、例えば透明板を別部材として準備する必要がなく、センサチップＸをより簡便に構成することができる。

上述した流路チップ２０・シールリング５０・金属薄膜部１１を蒸着したプリズム３０の各部材をこの順に組み付け、流路チップ２０とプリズム３０とに亘りネジ穴２６を介してネジ７０によって固定することで、センサチップＸを形成する。また、これら各部材は、嵌合或いは接着により固定してもよい。

（ＳＰＲ装置）
ＳＰＲ装置には、照射光を照射する発光ダイオード（ＬＥＤ）や半導体レーザー素子（ＬＤ）の１個又は複数個の発光素子８１と、フォトトランジスタ・フォトダイオード（ＰＤ）・ＣＣＤ等の１個又は複数個の受光素子８２が設けてある。発光素子８１は、波長が６００〜８００ｎｍの光を発光するものが望ましい。
尚、Ｓ偏向をカットするため、偏向板８３を、入射側・反射側にそれぞれ設けてある。

ＳＰＲ装置には、センサチップＸを収容するチップ設置部を備える。本実施形態ではチップ設置部として、例えばセンサチップＸのプリズム３０を収容可能なプリズム取付位置６１を設けたプリズムガイド６０を設けてある。
プリズムガイドの外周部において、一対の対向する側面にはガイド溝６２を設けて、ＳＰＲ装置への組み込みを容易にしてある。
また、プリズムガイド６０には、発光素子８１からの照射光をプリズム３０に照射できるように、或いは、センサチップＸによって反射された反射光を受光素子が受光できるように、一対の窓部６３，６４が設けてある。

＜抗原抗体反応検出実験＞
本発明のセンサチップＸを用い、抗原抗体反応が検出できることを検証する実験を行った。プリズムはアクリル製とした。

実験手順
（１）金薄膜（金属薄膜部１１）を表面に成膜したプリズム３０を、オゾンクリーナー（フィルジェン社製ＵＶ１４４）によって３０分間洗浄した。
（２）（１）で作製したプリズム３０を、１ｍＭ１６-ＭＨＤＡ
（１６mercaptohexadecanoic acid）中に浸漬し、室温で３時間振盪して金薄膜上にＳＡＭ膜（自己組織化単分子膜）を形成させた。
（３）（２）で作製したプリズム３０を、エタノールで３回、続いて純水で３回リンスした。
（４）凍結保存していた０．１Ｍ n-hydroxysuccinimide、および、
０．４Ｍ N-（３-dimethylaminopropyl）-N'-ethylcarbodiimide hydrochlorideを解凍して当量混合して作製した活性化試薬を、（３）の処理を行ったプリズム３０の金薄膜１１に滴下して１０分間静置し、ＳＡＭ膜のカルボン酸の活性化を行った。
（５）活性化終了後、金薄膜１１をＰＢＳ（Phosphate buffered saline）で１回リンスした。
（６）プリズム３０と流路チップ２０とはネジで組み付けてセンサチップＸを構築した（図１，３）。流路チップ２０には、２チャンネル（ターゲット用、リファレンス用）の反応空間２３ａ，２３ｂが形成してあり、各チャンネルはＰＢＳで満たした。
（７）ターゲット用チャンネル２３ａには抗ヒトＩｇＡ抗体溶液を、リファレンス用チャンネル２３ｂには抗マウスＩｇＧ抗体溶液をシリンジで注入し、室温にて１時間静置してそれぞれの抗体を金薄膜１１の上に固定した。尚、抗体溶液の濃度は何れも２０μｇ/ｍＬとし、溶媒にはＰＢＳを用いた。
（８）それぞれのチャンネル内をＰＢＳ with Tween 20（以下、ＰＢＳ−Ｔと略称する）で１回リンスし、続いてＰＢＳで２回リンスした後、各チャンネルの内部をＰＢＳで満たした。
（９）センサチップＸをＳＰＲ装置にセットし、ヒトＩｇＡ溶液（５，１０，２０μｇ/ｍＬ、溶媒はＰＢＳ）を各チャンネルに注入して光量の変化を測定した。尚、センサチップＸは１測定につき１個使用した。

結果
抗ヒトＩｇＡ抗体溶液を固定したターゲット用チャンネル２３ａの方で光量の減少を確認することができた。図４には、各濃度のＩｇＡ溶液において、光量の減少分の変化割合（％）を示した。これにより、金薄膜１１を表面に成膜したプリズム３０（アクリル製）とした本実施形態のセンサチップＸ内で引き起こした抗原抗体反応を、ＳＰＲ装置で検出することが確認できた。

＜長期保存実験＞
本実施形態のセンサチップＸにおいて、金薄膜１１の上に固定した抗体を、長期間に亘って保存できることを検証する実験を行った。本実験においても、金薄膜１１を直に形成したプリズム３０（アクリル製）を使用した。

実験手順
（１）８個のアクリル製プリズム３０の表面に直に金薄膜１１を形成し、当該金薄膜１１の上にＳＡＭ膜を形成させた。
（２）エタノールで３回、続いて純水で３回リンスした後、上述した手法によりＳＡＭ膜のカルボン酸の活性化を行った。
（３）活性化後に金薄膜１１をＰＢＳで１回リンスし、抗体固定用ガイド（図外）をプリズム３０に組み付けた。
（４）ターゲット用チャンネル２３ａには抗ヒトＩｇＡ抗体溶液を、リファレンス用チャンネル２３ｂには抗マウスＩｇＧ抗体溶液を、それぞれ抗体固定用ガイドを利用してマイクロピペットで注入した。室温にて１時間静置してそれぞれの抗体を金薄膜１１の上に固定した。尚、抗体溶液の濃度は何れも２０μｇ/ｍＬとし、溶媒にはＰＢＳを用いた。
（５）チャンネル内をＰＢＳ−Ｔで１回リンスし、続いてＰＢＳで２回リンスした後、抗体固定用ガイドを外し、流路チップ２０を載置してセンサチップＸを８個構築した。流路チップ２０には１チャンネルの反応空間２３を形成してある（図５）。
（６）流路内をＰＢＳで満たし、センサチップＸを４個ずつ、２グループ（グループＡ，Ｂ）に分けた。
（７）グループＡのセンサチップＸは直ちにＳＰＲ装置にセットし、ヒトＩｇＡ溶液（５μｇ/ｍＬ、溶媒はＰＢＳ）を反応空間２３に注入して光量の変化を測定した。
（８）グループＢのセンサチップＸには、反応空間２３内を、アジ化ナトリウム（終濃度０．１％）を含むＰＢＳに置換し、センサチップＸの流体供給路２１・流体排出路２２を密封し、４℃で１ケ月間保存した。１ケ月経過後、反応空間２３内をＰＢＳに置換してＳＰＲ装置にセットし、ヒトＩｇＡ溶液（５μｇ/ｍＬ、溶媒はＰＢＳ）を反応空間２３に注入して光量の変化を測定した。

結果
グループＡ，Ｂの何れのセンサチップＸにおいても光量の減少を確認することができた（結果は示さない）。図７には、ヒトＩｇＡ溶液を注入して６００秒経過した後のリファレンスデータとターゲットデータとの光量の差分を示した。グラフ中の保存期間０週はグループＡ、保存期間４週はグループＢを示し、それぞれのグラフのデータは４個のセンサチップＸの平均値を示した。

グループＡとグループＢとの結果において、殆ど同様の光量変化となっている。即ち、本実施形態のセンサチップでは、金薄膜１１の上に固定した抗体を、長期間に亘って保存できることを確認できた。従って、本実施形態のセンサチップＸを用いれば、予め金膜に抗体を固定しておけば、ＳＰＲ装置で検出する前に抗体を固定することなく、迅速に試料の検出を行うことができる。

〔別実施の形態１〕
上述した実施形態では、金属薄膜部１１はプリズム３０の表面に直に蒸着して形成した。しかし、これに限られるものではなく、透明板１０の上面に蒸着して形成してもよい。本実施形態では、図６に示したように、金属薄膜部１１を一方の面に設けた透明板１０と、当該透明板１０と略同厚であり且つ当該透明板１０を取り囲む枠部材４０とを、流路チップ２０とプリズム３０との間に設けてある。

（透明板）
透明板１０は、ＰＭＭＡ等の透明樹脂やガラス等によって形成されるが、これに限られるものではない。本実施形態では、上述したプリズム３０と同じ屈折率を有する光学ガラスを使用した場合を例示する。

本発明のセンサチップＸでは、金属薄膜部１１を形成した透明板１０を流路チップ２０及びプリズム３０の間に設ける構成とすることで、透明板１０のみを交換して用いることが可能となる。この結果、ランニングコストの安いセンサチップＸを得ることができる。

（枠部材）
枠部材４０は、透明板１０の周縁部を取り囲んで収容できる枠体状に形成してある。枠部材４０は、樹脂等の材料によって形成可能である。
枠部材４０の内周に形成した開口である透明板取付位置４１に、透明板１０を嵌め込み、この状態で、流路チップ２０およびプリズム３０の間に配置する。
このように金属薄膜部１１を設けた透明板１０は枠部材４０の内部に挿入することによって、金属薄膜を形成する領域を必要最小限の大きさに構成することができる。

本実施形態のセンサチップＸを用い、抗原抗体反応が検出できることを検証する実験を行った。プリズム３０はガラス製とした。

実験手順
（１）金薄膜（金属薄膜部１１）を成膜したガラス金基板１００（モリテックス社製）を、オゾンクリーナー（フィルジェン社製ＵＶ１４４）によって３０分間洗浄した。
（２）ガラス金基板１００を、１ｍＭ１６-ＭＨＤＡ
（１６mercaptohexadecanoic acid）中に浸漬し、室温で１０分振盪した後、一晩静置して金薄膜上にＳＡＭ膜（自己組織化単分子膜）を形成させた。
（３）（２）で作製したガラス金基板１００を、エタノールで３回、続いて純水で３回リンスした。
（４）凍結保存していた０．１Ｍ n-hydroxysuccinimide、および、
０．４Ｍ N-（３-dimethylaminopropyl）-N'-ethylcarbodiimide hydrochlorideを解凍して当量混合して作製した活性化試薬を、（３）の処理を行ったガラス金基板１００の金薄膜１１に滴下して１０分間静置し、ＳＡＭ膜のカルボン酸の活性化を行った。
（５）活性化終了後、金薄膜１１をＰＢＳ（Phosphate buffered saline）で１回リンスした。
（６）適当量のマッチングオイルを塗布したガラス製のプリズム３０（ＢＫ７）の上に、枠部材４０に嵌め込んだガラス金基板１００を載置して密着させ、その上に、流路チップ２０を載置してセンサチップＸを構築した（図６）。流路チップ２０には、２チャンネル（ターゲット用、リファレンス用）の反応空間が形成してあり、各チャンネルはＰＢＳで満たした。
（７）ターゲット用チャンネルには抗ヒトＩｇＡ抗体溶液を、リファレンス用チャンネルには抗マウスＩｇＧ抗体溶液をシリンジで注入し、室温にて１時間静置してそれぞれの抗体を金薄膜１１の上に固定した。尚、抗体溶液の濃度は何れも２０μｇ/ｍＬとし、溶媒にはＰＢＳを用いた。
（８）それぞれのチャンネル内をＰＢＳ−Ｔで１回リンスし、続いてＰＢＳで２回リンスした後、各チャンネルの内部をＰＢＳで満たした。
（９）センサチップＸをＳＰＲ装置にセットし、ヒトＩｇＡ溶液（５μｇ/ｍＬ、溶媒はＰＢＳ）を各チャンネルに注入して光量の変化を測定した。

結果
抗ヒトＩｇＡ抗体溶液を固定したターゲット用チャンネルの方で光量の減少を確認することができた（結果は示さない）。
これにより、プリズム３０をガラス製とした本発明のセンサチップＸ内で引き起こした抗原抗体反応をＳＰＲ装置で検出することが確認できた。

〔別実施の形態２〕
上述した実施形態では、抗体を金薄膜上に固定して測定物質である抗原を金薄膜１１の上に捉えることにより、測定を行った。しかし、本発明のセンサチップＸはこのような態様に限られるものではない。即ち、金薄膜１１の上に固定した抗体により測定物質を捉えるのではなく、本実施形態では、単に、金薄膜１１の上に測定物質を沈殿させる。これにより、測定物質が金薄膜１１の上に沈殿することにより生じる屈折率の変化を検出することで、当該測定物質の測定を行うことが可能である。

このとき、金薄膜１１の上に抗体等の検出物質を固定する必要がないため、簡便に測定を行うことができる。そして、抗体などの検出物質が取得されていない物質でも測定を行うことができる。例えば複数の細菌が混在した液体サンプルにおいても、液体サンプル内の総菌体数を推定することができる。

また、検出物質を使用しないため、その分、安価に検出を行うことができる。
さらに、測定物質を単に沈殿させるだけであるため、当該測定物質を加熱あるいは破壊する等の前処理工程が不要となるため、簡便に測定を行うことができる。

本実施形態では、測定物質を沈殿させるだけであるため、液体サンプルをポンプで送液し続ける必要がない。そのため、ＳＰＲ装置を簡便化することができる。
以下の実験では、当該プリズム３０の表面に直に金薄膜１１を形成したプリズム３０（アクリル製）を使用した。

＜測定物質の検出＞
以下に、センサチップＸの金膜上に測定物質が沈殿することで生じる屈折率の変化により、定量的に測定物質が検出できることを検証した。測定物質としては大腸菌を用いた。

実験手順
（１）１００ｍＬのＬＢ液体培地に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００株）を接種し、３７℃で一晩振盪培養した。
（２）培養液を遠心し（５０００ｒｐｍ５分４℃）、大腸菌を沈殿させて液体培地を捨てた。
（３）１００ｍＬのＰＢＳに沈殿した大腸菌を懸濁させ、遠心（５０００ｒｐｍ５分４℃）した後、上清を捨てた。
（４）上記（１）で培養した大腸菌濃度に対して、１０倍希釈〜１５０倍濃縮となるように、ＰＢＳで懸濁した。
（５）検体中の大腸菌濃度を把握するため、上記（１）の培養液の一部を取得し、ＰＢＳで１０^-6倍に希釈してＬＢ寒天培地３枚に１００μＬずつ接種し、３７℃で一晩静置培養した。培養後、得られたコロニーの数を計測し、液体サンプルの大腸菌濃度を推定した。
（６）このセンサチップＸをＳＰＲ装置にセットし、上記（４）で調製した大腸菌懸濁液をセンサチップＸに注入し、大腸菌を沈殿させて光量の変化を１０分間計測した。

結果
光量の変化の結果を図８に示した（図８の４本のグラフにある大腸菌の個数は、上記（５）で推定した）。
さらに、サンプルに含まれる大腸菌数と計測開始６００秒後の光量の変化を図９に示した。図９より、サンプル中の大腸菌濃度と光量変化との間には、以下の数１に示す相関関係が認められた。

〔数１〕
ｙ＝４．９４Ｌｎ（ｘ）−８６．９９（相関係数Ｒ²＝０．９８）

＜検出物質が取得されていない細菌の検出＞
以下に、本実施形態のセンサチップＸを使用して、抗体等の検出物質が取得されていない細菌を検出できることを検証した。
測定物質として口内細菌を用いた。口内細菌を選択した理由は、
・容易に採取できること、
・口内細菌は数百種類の細菌が混在しているが、虫歯菌など、一部の細菌しか抗体が取得されていないこと、
が挙げられる。

実験手順
（１）５０ｍＬのサンプルチューブ（ポリプロピレン製）に５ｍＬの唾液を採取した。
（２）採取した唾液のうち１ｍＬを１．５ｍＬサンプルチューブに分取し、遠心（５０００ｒｐｍ５分４℃）した後、上清を捨てた。
（３）口内細菌のペレットを１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、遠心（５０００ｒｐｍ５分４℃）した後、上清を捨てた。
（４）口内細菌のペレットを１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、ＳＰＲ装置にセットしたセンサチップに注入して光量変化を１０分間計測した。

結果
光量の変化の結果を図１０に示した。これによると、本実施形態のセンサチップＸを使用することにより、ＳＰＲ装置によって光量変化が検出された。具体的には、計測開始６００秒後にベースラインに対して２８．２％の光量変化が認められた。

この光量変化を数１の式に代入すると、口内細菌の推定濃度は、１．３×１０¹⁰個/ｍＬと算出された。
また、予め検量線を作成しておけば、計測したサンプル中の細菌濃度をその場で即座に推定できることが判明した。

本発明は、金属薄膜上におけるエバネッセント波と表面プラズモンとの共鳴現象を利用して、測定物質を検出するための表面プラズモン共鳴装置に使用するセンサチップに利用できる。

本発明のセンサチップの断面視概略図センサチップの上面視概略図本発明のセンサチップを分解した場合の斜視概略図ターゲット用チャンネルにおける液体サンプルの光量の減少分の変化割合を示したグラフ長期保存実験で使用したセンサチップの上面視概略図別実施形態１のセンサチップを分解した場合の斜視概略図リファレンスデータとターゲットデータとの光量の差分を示したグラフ沈殿させた大腸菌を測定した場合における光量の変化の結果を示したグラフサンプルに含まれる大腸菌数と計測開始６００秒後の光量の変化を示したグラフ口内細菌を測定した場合における光量の変化の結果を示したグラフ

符号の説明

Ｘセンサチップ
１０透明板
１１金属薄膜部
１２設置部
２０流路チップ
２１流体供給路
２２流体排出路
２３反応空間
２４廃液貯留部
２５溝部
３０プリズム
４０枠部材
５０シールリング

Claims

測定試料或いは測定試料を検出する検出物質を設置する設置部を一方の面に備えた金属薄膜部と、
前記金属薄膜部に対して前記設置部の側に配置され、前記設置部に流体を供給する流体供給路および前記設置部を通過した流体を排出する流体排出路を有する流路チップと、
前記金属薄膜部に対して前記設置部とは反対側に配置され、前記金属薄膜の裏側から前記設置部に向けて光を照射するためのプリズムとを備えており、
前記金属薄膜部を、前記プリズムの表面に直に形成してある表面プラズモン共鳴を利用した測定に用いるセンサチップ。
測定試料或いは測定試料を検出する検出物質を設置する設置部を一方の面に備えた金属薄膜部と、
前記金属薄膜部に対して前記設置部の側に配置され、前記設置部に流体を供給する流体供給路および前記設置部を通過した流体を排出する流体排出路を有する流路チップと、
前記金属薄膜部に対して前記設置部とは反対側に配置され、前記金属薄膜部の裏側から前記設置部に向けて光を照射するためのプリズムとを備えており、
前記金属薄膜部を一方の面に設けた透明板と、当該透明板と略同厚であり且つ当該透明板を取り囲む枠部材とを、前記流路チップと前記プリズムとの間に設けてある表面プラズモン共鳴を利用した測定に用いるセンサチップ。
前記流路チップに、前記流体排出路を通過した流体を貯留する廃液貯留部を備えている請求項１又は２に記載のセンサチップ。
当該流路チップと前記プリズムとの間に介装され、前記流路チップと前記プリズムとの間に反応空間を形成するシールリングが、前記流路チップの下面に形成した溝部に装着してある請求項１〜３の何れか一項に記載のセンサチップ。