JP2008188022A

JP2008188022A - クローン化されたヌクレオチド配列からの感染性ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ）の生産

Info

Publication number: JP2008188022A
Application number: JP2008107219A
Authority: JP
Inventors: Peter L Collins; エル．コリンズ，ピーター
Original assignee: National Institutes of Health NIH; US Government
Current assignee: National Institutes of Health NIH; US Government
Priority date: 1995-09-27
Filing date: 2008-04-16
Publication date: 2008-08-21
Also published as: CA2230033C; US6264957B1; AU727923B2; KR19990063811A; KR100905760B1; US6790449B2; WO1997012032A1; AU7119296A; JPH11512609A; US20020182228A1; JP2007097600A; CA2230033A1

Abstract

【課題】単離ヌクレオチド分子であって、ヒト、ウシ又はネズミRSV 又はRSV 様ウイルス、及びそれらのキメラのものを含むRSV ゲノム及びアンチゲノムの提供。
【解決手段】組換えゲノム又はアンチゲノムは、ヌクレオキャプシド（Ｎ）プロテイン、ヌクレオキャプシド・ホスホプロテイン（Ｐ）、大きな（Ｌ）ポリメラーゼ・タンパク質、及びRNA ポリメラーゼ延長因子と共に発現されて、単離感染性RSV 粒子を作り出すことができる。組換えRSV ゲノム又はアンチゲノムは、所望の表現型の変更、例えば、ワクチン用途のための減弱ウイルスを作り出すように修飾されることができる。
【選択図】なし

Description

本発明の背景
ヒトRSウイルス（respiratory syncytial virus (RSV））は、世界で最も重要な小児科学の呼吸器病原体である。この遍在する高感染剤は、流行感染において毎年現れる。ほとんど誰もが、少なくとも１回、生後２年間に感染される。RSV 疾患は、特に乳幼児においてかなりの罹患率及び死亡率の原因であり；米国においては、毎年、推定91,000人の入院、及び4500人の死亡が引き起こされ、そしてその衝撃は、より貧しい国々においては、より大きなものである。また、RSV は、免疫無防備状態の成人及び高齢者の疾患の重要な剤として認められるようになった。

自然感染により引き起こされたRSV 再感染に対する耐性は、不完全であるが、反復された暴露により漸進的に増加する。従って、RSV は、幼児期と生涯の間に多数回感染することができるが、重篤な疾患は、通常、生涯の最初の及びときどき２番目の感染に限定される。RSV 予防の最小の目標は、最初の感染に関係する重篤な疾患を防ぐために十分な耐性を生じさせることである。

多数の減弱RSV 株が1960年代〜1970年代の間にワクチンとして開発され、そして評価されたが、それらは、過剰に減弱されたか又は不十分に減弱されたかのいずれかであることが判明し、そして一本鎖RNA ウイルスにとって一般的であるが、ある場合には、遺伝的な不安定性を示した。RSV ワクチン開発のための調査における最近の戦略は、主に、精製されたウイルス抗原の非経口投与であるか又は経鼻投与のための生減弱RSV の開発である。
経鼻は、局所免疫の直接的な刺激を提供する。それはまた、 RSV−特異的母系血清抗体の免疫抑制効果を部分的に排除し、これは、乳幼児に典型的にみられる。実験動物における失活RSV 又は精製RSV 抗原の非経口投与は、1960年代に評価されたホルマリン失活ワクチンに関係する強化RSV疾患と同様に、その後のウイルス感染に対する強化された免疫病理学的に関係しているようである。しかしながら、この効果は、呼吸管のRSV 感染と伴に観察されておらず、このことは、生減弱ウイルスが安全性において重要な利点を有することを示唆している。しかしながら、今日まで、RSV のための認可されたワクチン又は高く有効な抗ウイルス治療法はない。

好適なRSV ワクチンを製造するための研究努力は、組織培養における貧弱なウイルス増殖、長い複製サイクル、ビリオン不安定性、ネガティブ−センスRNA ゲノム、及び複雑なゲノムの組織化及び遺伝子産物により妨害されている。RSV は、パラミクソウイルス・ファミリーのニューモウイルス（pneumo virus) のメンバーであり、そして15,222ヌクレオチドをもつ一本鎖ネガティブ−センスRNA のそのゲノムは、野生型株Ａ２ウイルスについて及びその減弱誘導体について完全に配列決定されている。

RSV によるRNA 合成のいくつかの側面は、非セグメント化ネガティブ・ストランド・ウイルスの一般的なパターンに従うようである。このゲノムの鋳型は、大きなヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質により密に包まれており、そしてホスホプロテイン（Ｐ）と大きな（Ｌ）ポリメラーゼ・サブユニット・タンパク質と会合している。転写は、３’遺伝子外リーダー領域に始まり、そしてそれら遺伝子に隣接する短い鋳型シグナルにより案内される逐次的なストップ−スタート機構によりその全体長に沿って進行する。これは、少なくとも10の大きなタンパク質をコードする少なくとも10の大きな種のmRNAをもたらす。RNA 複製は、完全長ポジティブ−センス“アンチゲノム（antigenome) ”の合成へのスイッチにより生じ、これはまた、密にキャプシドに包まれており、そして子孫ゲノムの合成のための鋳型として働く。

ネガティブ鎖ウイルスのウイルス・ゲノムRNA は、フリーのRNAのように単独で感染しない。ビリオン又は細胞内では、ウイルスRNA は、常に、リボ核タンパク質コア内に密に包まれている。このヌクレオキャプシドは、転写及び複製のために必要なウイルス・タンパク質を含み、そして長く、伝染性の最小単位としてみられてきた（Brown et al., J. Virol. 1 : 368-373 (1967)）。従って、cDNAからの生物学的に活性な合成ウイルスRNA の生成は、機能的ヌクレオキャプシドのアセンブリーを導く、ウイルス・タンパク質による相補を必要とするであろうと認められている（Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 9663-9667 (1991)、及びCollins et al., Virology 195 : 252-256 (1993））。cDNAから生RSV を作る能力は、特に重要である。なぜなら、それは、安全かつ有効なRSV ワクチンを製造する努力において感染性ウイルスのゲノム内への、減弱突然変異を含む、特定の遺伝子操作された変更の導入を許容するであろう。

ゲノム又はアンチゲノムRNA の短い、内部欠失アナログ（“ミニゲノム（mini genomes) ”）は、適切なウイルス・タンパク質の存在下、細胞内で合成されるとき、転写及び複製に参加することが示されている。２つのラブドウイルス(rhabdoviruses) 、狂犬病（rabies) 及び水疱性口内炎（resicular stomatitis) ウイルスについては、感染性ウイルスは、Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質の存在下、完全cDNA−コード・アンチゲノムRNA の同時発現により作られる（Schnell et al., EMBO J. 13 : 4195-4203 (1994) 及びLawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 4477-4481 (1995) ）。

RSV は、パラミクソウイルス（Paramyxo virus) 属のよく特徴付けられたパラミクソウイルス、ルブラウイルス（Rubula virus) 及びモルビリウイルス（Morbilli virus) 属から、それを、そしてニューモウイルス（Pneumo virus) 属の他のメンバーを区別する多くの特性をもつ。これらの差異は、より多数のmRNA、そのゲノムの３’末端における異常な遺伝子の順番、糖タンパク及びＭ２遺伝子の順番における種間変動、遺伝子内領域におけるより大きな多様性、ムチン様特性を示す接着タンパク質、広い株間配列多様性、及び他の非セグメント化ネガティブ鎖DNA ウイルスのいずれか又はほとんどにおいて見られないいくつかのタンパク質を含む。

RSV は、幼児及び小児における重篤なウイルス性下呼吸管疾患の最も一般的な原因として残る。従って、しばしば入院を要求する上記集団における重篤な疾患を防止することができる安全かつ有効なワクチンを設計するための能力についての緊急な必要性がある。極めて驚くべきことに、本発明は、感染性RSV に規定の、かつ、所定の変更を導入するための方法を提供することにより、上記及び他の関連する必要性を達成する。

本発明の要約
本発明は、組換えRSV ゲノム又はアンチゲノム、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシド・ホスホプロテイン（Ｐ）、大きな（Ｌ）ポリメラーゼ・タンパク質、及びRNA ポリメラーゼ延長因子を含む単離感染性RSV 粒子を提供する。RNA ポリメラーゼ延長因子は、RSV のＭ２（ORF1）であることができる。この単離された感染性RSV 粒子は、ウイルス又はサブウイルス粒子であることができる。この単離された感染性RSV ウイルスは、ヒトRSV 、ウシ又はネズミRSV であることができ、又は上記ゲノム又はアンチゲノムは、例えば、ヒト及びウシRSV からのヌクレオチド・セグメントをもつ２以上の異なるRSV ゲノムのキメラであることができる。

他の態様においては、本発明は、RSV をコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子から感染性RSV 粒子を製造する方法を提供する。RSV ゲノム又はアンチゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター、及びＮ，Ｐ，Ｌ及びRNA ポリメラーゼ延長因子タンパク質をコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターが、細胞又は無細胞溶解物内で同時発現され、それにより感染性RSV 粒子を作り出す。RSV ゲノム又はアンチゲノム及びＮ，Ｐ，Ｌ及びRNA ポリメラーゼ延長因子タンパク質は、同一の又は異なる発現ベクターにより発現されることができる。ある場合には、このＮ，Ｐ，Ｌ及びRNA ポリメラーゼ延長因子タンパク質は、各々、異なる発現ベクター上にコードされる。RSV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子は、ヒト、ウシ又はネズミRSV 配列由来であり、そしてヒトRSV 株配列と少なくとも１の非ヒトRSV 配列のキメラであることができ、又は野生型RSV 株のゲノム又はアンチゲノムをコードすることができる。このRSV ゲノム又はアンチゲノムは、表現型変更、例えば、RSV の減弱、感温性、冷−順応（cold-adaptation)、小さなプラーク・サイズ、宿主レンジ制限、又はRSV の免疫原性エピトープにおける変化をもたらすもの、をコードするように、ヌクレオチド挿入、再編成、欠失又は置換により野生型RSV 株から修飾されることができる。上記ポリヌクレオチドは、非ヒトRSV ウイルスのゲノム又はアンチゲノムをコードすることができ、又は非ヒトRSV と少なくとも１の他のRSV 又はヒト又は非ヒト起源とのキメラであることができる。このゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子は、サイトカイン、Ｔ−ヘルパー・エピトープ、異なるRSV サブグループのＧプロテイン、制限部位マーカー、又は意図された宿主内での保護免疫性応答を顕出することができる微生物病原体（例えば、ウイルス、バクテリア又は真菌）のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むように修飾されることもできる。

他の態様においては、本発明は、RSV ゲノム又はアンチゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター、及びRSV のＮ，Ｐ，Ｌ及びRNA ポリメラーゼ延長因子タンパク質をコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを含む、細胞又は無細胞溶解物を提供する。発現の間、上記ゲノム又はアンチゲノムとＮ，Ｐ，Ｌ、及びRNA ポリメラーゼ延長因子タンパク質は併合して、感染性RSV 粒子、例えばウイルス又はサブウイルス粒子を作り出す。

他の態様においては、本発明は、作用可能な状態で連結された転写プロモーター、RSV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列、及び転写ターミネーターを含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。このRSV ゲノム又はアンチゲノムは、配列番号：１に例示するようなヒトRSV 配列及びその修飾バージョンであることができる（これは、５’〜３’ポジティブ−センス配列を示し、一方、そのゲノムは、ネガティブ−センスである。）。ポリヌクレオチドは、非ヒトRSV ウイルスのゲノム又はアンチゲノムをコードし、又は非ヒトRSV とヒト又は非ヒト起源の少なくとも１の他のRSV のキメラをコードすることができる。

特定の態様の説明
本発明は、cDNAからの感染性RSV の製造を提供する。感染性RSVは、転写性、複製性ヌクレオキャプシドを生成するために必要なウイルス性タンパク質、好ましくは、大きなヌクレオキャプシド（Ｎ又はNP）タンパク質、ヌクレオキャプシド・ホスホプロテイン（Ｐ）、大きな（Ｌ）ポリメラーゼ・タンパク質、及びＭ２（ORF1）プロテインをコードする１以上の配列と共に、RSV ゲノム又はアンチゲノムRNA をコードするcDNAの細胞内同時発現により製造される。感染性RSV 粒子は、上記の組換え体系により製造される。この組換え体製造系は、感染性RSV 内への規定の変更の導入を許容し、これらの変化は、多種多様な適用、例えば：所定、規定の減弱突然変異を担持する生減弱ワクチン株の開発；例えば、RSV タンパク質の機能又は発現を変更するための規定の突然変異を使用したRSV 分子生物学及び病理学の分析；培養における成長の改善；サイレントな偶発的な突然変異対表現型の差異の原因となるものとの間を区別することによる現存又は将来のワクチン株における減弱突然変異の同定；抗原ドリフトに適合させるための修飾ワクチン・ウイルスの製造；ワクチン免疫原性の強化；不所望の免疫病理学に関係するエピトープの除去（ablation) ；RSV と保護抗原がそれから得られるところのウイルス又は剤に対する免疫性を誘発することができるRSV 株を生成するための、保護抗原を、全体的に又は部分的に、コードする外来遺伝子の挿入；上記ワクチン・ウイルスの免疫原性を強化するための、免疫系のモジュレーター、例えば、サイトカイン又はＴ細胞エピトープを、全体的に又は部分的に、コードする外来遺伝子の挿入；等において有用である。

本発明によれば、RSV ゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAが、感染性RSV を形成するための、必要なウイルス・タンパク質との細胞内又はインビットに同時発現のために構築される。“RSV アンチゲノム”とは、子孫RSV ゲノムの合成のための鋳型として働く単離ポジティブ−センス・ポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくは、転写性、複製性ヌクレオキャプシドを生成するために必要なタンパク質をコードする相補性配列、すなわち、Ｎ，Ｐ，Ｌ及びＭ２（ORF1）タンパク質をコードする配列のポジティブ（＋）、センス転写物とハイブリダイズする可能性を最小化するために、複製性中間体RNA に対応するRSV ゲノム、又はアンチゲノムのポジティブ−センス・バージョンであるcDNAが構築される。RSV ミニゲノム系においては、ゲノム及びアンチゲノムは、RSV 又はプラスミドにより相補されるか否かに拘らず、レスキュー（rescue) において等しく活性であり、このことは、ゲノム又はアンチゲノムのいずれかが使用されることができ、そしてそれ故、この選択は、方法論又は他の理由に基づき行われることができることを示す。

生来のRSV ゲノムは、典型的には、相補的ウイルスmRNAを通じて、引用により本明細書中に取り込むMink et al., Virology 185 :615-624 (1991), Stec et al., Virology 183 : 273-287 (1991)、及びConnors et al., Virol. : 208 : 478-484 (1995) 中に実質的に記載されるような、11の種のウイルス・タンパク質、すなわち、非構成種NS１及びNS２，Ｎ，Ｐ、マトリックス（Ｍ）、小さな疎水性物（SH）、糖タンパク質（Ｇ）、融合物（Ｆ）、Ｍ２（ORF1）、Ｍ２（ORF2）、及びＬをコードするネガティブ（−）−センス・ポリヌクレオチド分子を含む。本発明の目的のためには、本発明の組換えRSV のゲノム又はアンチゲノムは、それによりコードされたウイルス又はサブウイルス粒子に感染性を与えるために必要な遺伝子又はそれらの部分だけを含むことが必要である。さらに、上記遺伝子又はそれらの部分は、１以上のポリヌクレオチド分子により提供されることができ、すなわち、遺伝子は、別個のヌクレオチド分子から、相補物その他により提供されることができる。

組換え体RSV とは、組換え発現系から直接的に又は間接的に得られた、又はそれから作られたウイルス又はサブウイルス粒子から増幅されたRSV 又はRSV 様ウイルス又はサブウイルス粒子を意味する。この組換え体発現系は、RSV 遺伝子発現において調節的役割をもつ少なくとも１の遺伝子要素又は複数の遺伝子要素、例えば、プロモーター、構成的又はコーディング配列であってRSV RNA に転写されるもののアセンブリーを含む作用可能な状態で連結された転写単位、並びに適切な転写開始及び終結配列を含む、組換え発現ベクターを使用するであろう。

cDNA発現ゲノム又はアンチゲノムから感染性RSV を製造するために、上記ゲノム又はアンチゲノムは、（ｉ）RNA 複製をすることができるヌクレオキャプシドを製造するために、そして（ii）RNA 複製と転写の両方についての能力を子孫ヌクレオキャプシドに付与するために、必要なRSV タンパク質と同時発現される。上記ゲノム・ヌクレオキャプシドによる転写は、他のRSV タンパク質を提供し、そして多産的感染（productive infection) を開始させる。あるいは、多産的感染のために必要な追加のRSV タンパク質は、同時感染により供給されることができる。

RSV アンチゲノムは、例えば、クローン化されたcDNAセグメントをアセンブルすることにより、その完全なアンチゲノムを組合せにおいて提示することにより、RSV mRNA又はゲノムRNA の逆転写されたコピーのポリメラーゼ連鎖反応（RCR ; 例えば、米国特許第 4,683,195号及び第 4,683,202号、及びRCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego (1990) 中に記載されたもの、これを引用により本明細書中に取り込む。）により、本発明において構築されることができる。例えば、適切なプロモーター（例えば、Ｔ７ RNAポリメラーゼ・プロモーター）から広がる、アンチゲノムの左側及びSH遺伝子に相補するリーダー領域を含むcDNAを、適切な発現ベクター、例えばプラスミド（例えば、pBR322) 又は様々な入手可能なエスミド、ファージ、又はDNA ウイルス・ベクター内にアセンブルされる。このベクターは、アセンブリーを容易にするようにデザインされたユニークな制限部位を含む合成ポリリンカーの突然変異誘発及び／又はは挿入により修飾されることができる。例えば、本明細書中に記載するプラスミド・ベクターは、便利な制限酵素部位を含む合成DNAでその PstＩ−EcoRＩ断片を置換することにより、pBR322から得られた。pBR322は、RSV 配列のヌクレオチド3716-3732 を安定化し、これはまた、ヌクレオチド欠失又は挿入を維持し、そしてそのプラスミドの増殖は、nt 4449 の近傍でも生じた人工物重複及び挿入を回避するためにバクテリア株DH101B内にあった。

調製を容易にするために、Ｇ、Ｆ及びＭ２遺伝子を、Ｌ及びトレーラー(trailer) 配列のように、別個のベクター内でアセンブルすることができる。アンチゲノム・プラスミドの右側端（例えば、Ｌ及びトレーラー配列）は、所望により追加の配列、例えばフランキング・リボザイム及びタンデムＴ７転写ターミネーターを含むことができる。このリボザイムは、ハンマーヘッド型であることができ（例えば、Grosfeld et al., J. Virol. 69 : 5677-5686 (1995)）、これは、単一の非ウイルス・ヌクレオチドを含む３’末端を作り出すであろうし、又は非−RSV ヌクレオチドを含まない３’末端を作り出すであろう。他の好適なリボザイム：例えば肝炎デルタ・ウイルス（Perrotta et al., Nature 350 : 434-436 (1991)）のリボザイムの中のいずれかであることができる。中央セグメント（例えば、Ｇ−to−Ｍ２片）は、リーダー−to−SHプラスミドの適切な制限部位に挿入され、これは次に、完全なアンチゲノムを作り出す。Ｌ−トレーラー−リボザイム−ターミネーター片のための受容体となる。図１Ａに示す例においては、このリーダー端は、最適な活性のための３つの転写されたＧ残基を含んだＴ７ RNAポリメラーゼのためのプロモーターと境を接するように構築され；転写は、これらの３つの非ウイルス性Ｇを、上記アンチゲノムの５’末端に寄贈する。これらの３つの非ウイルス性Ｇ残基は、非ウイルス性ヌクレオチドを含まない５’末端を作り出すために省かれることができる。ほぼ正確な３’末端を生成するために、上記トレーラー端を、ハンマーヘッド・リボザイムに隣接するように構築した。これは、解裂の間に、コードされたRNA の３’末端に、単一の３’−リン酸化Ｕ残基を寄贈するであろう。

様々なヌクレオチド挿入及び欠失を、RSV ゲノム又はアンチゲノム内で行うことができる。野生型ヒトRSV のゲノムのヌクレオチド長（15,222ヌクレオチド）は、６の倍数であり、そしてパラミクソウイルス（Paramyxo virus) 及びモルビリウイルス（Morbilli virus) 属のメンバーは、典型的には“６の法則（rule of six)”に従う。すなわち、ゲノム（又はミニゲノム）は、それらのヌクレオチド長が、（キャプシドを包むNPタンパク質に対してヌクレオチド残基の正確な配置のための要求であると考えられる）６の倍数であるときだけ、効率的に複製する。

１の残基の増加によるRSV ゲノムの長さの変更は、複製の効率に対して全く効果をもっておらず、そして継代後のいくつかの異なるミニゲノム突然変異体の配列分析は、長さの相違が、相補的変化を伴わずに維持されることを示した。従って、RSV は、ゲノムの長さが６の倍数であるという厳格な要求を欠き、そしてヌクレオチド挿入及び欠失は、本発明に係る組換え体RSV の複製を無効にすることなく、RSV ゲノム又はアンチゲノム内で行われることができる。

ゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAを構築するための代替手段は、１又は２片程少なくなるまでサブユニットcDNA成分の数を減少させるために、改良PCR 条件（例えば、Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 5695-5699 (1994)、これを引用により本明細書中に取り込む。）を用いて、逆転写−PCR を含む。他の態様においては、異なるプロモーター（例えば、Ｔ３，SP６）又は異なるリボザイム（例えば、肝炎デルタ・ウイルスのもの）を、使用することができる。異なるDNA ベクター（例えば、コスミド）は、より大きなサイズのゲノム又はアンチゲノムによく適合するように増幅のために使用されることができる。

本発明によって、感染性組換え体RSV 内への取り込みのために、RSV ゲノム又はアンチゲノム内で、様々な変更を行うことができる。例えば、外来遺伝子を挿入し、遺伝子の順番を変更し、遺伝子の重複を除去し、RSV ゲノムのプロモーターを、そのアンチゲノムのプロモーターで置換し、遺伝子の部分を除去し（例えば、糖タンパク遺伝子の細胞質尾）、そして遺伝子全体さえ欠失することができる。配列における修飾、例えば、様々な遺伝子内領域内のユニーク制限部位（例えば、Ｇ遺伝子とＦ遺伝子の間のユニークStul部位）その他の挿入を、操作を容易にするために、行うことができる。非翻訳遺伝子配列を、外来配列を挿入するための能力を増加させるために、除去することができる。

cDNA発現ゲノム又はアンチゲノムから製造された感染性RSV は、RSV 又はRSV 様株、例えばヒト、ウシ、ネズミ等の中のいずれか、又はいずれかのニューモウイルス、例えば、マウス又は七面鳥の鼻腔気管炎ウイルスの中のいずれかであることができる。保護免疫応答を発生させるために、RSV 株、例えばヒトを免疫化させるために使用されるヒトRSV は、免疫感作された被験体に内因的なものであることができる。上記ゲノム又はアンチゲノムは、しかしながら、異なるタイプからのRSV 遺伝子を発現させるために修飾されることができる。従って、ヒトへの投与を意図された感染性RSV は、例えば減弱の目的のためにウシ又はネズミRSV タイプからの遺伝子を含むように修飾されているヒトRSV であることができ、又はウシRSVは、ヒトRSV 感染に対する保護を顕出させるためのエピトープ又はタンパク質をコードする遺伝子を含むように修飾されることができ、例えば、ヒトRSV 糖タンパク遺伝子は、ヒト宿主内で複製する制限された能力をもつウシRSV がヒトRSV 株に対しするヒトにおける保護免疫応答を顕出することができるような、ウシ糖タンパク遺伝子に置き替えられることができる。

RNA 複製に必要なＮ，Ｐ及びＬタンパク質は、RNA ポリメラーゼ延長因子、例えばプロセッシブ転写（processive transcription)のためのＭ２（ORF1）タンパク質を要求する。従って、Ｍ２（ORF1）又はネガティブ鎖RNA ウイルスのための実質的に均等な転写延長因子が、感染性RSV の製造のために要求され、そして多産的感染の間の機能的ヌクレオキャプシドの必要成分である。Ｍ２（ORF1）タンパク質のための必要性は、転写延長因子としてのその役割を矛盾しない。ネガティブ鎖RNA ウイルスのためのRNA ポリメラーゼ延長因子タンパク質の発現のための必要性が、本発明の特徴である。Ｍ２（ORF1）は、完全Ｍ２−遺伝子の発現により供給されることができる。但し、この形態において、第２のORF2が発現されることもでき、そしてRNA 複製に対する阻害的効果をもつことができる。それ故、完全Ｍ２遺伝子を使用した感染性ウイルスの製造のために、上記２つのORF の活性は、転写延長活性を提供するのに十分なＭ（ORF1）の発現を許容するが、RNA 複製を阻害する程多くのＭ（ORF2）の発現を許容しないようにバランスされなければならない。あるいは、このORF1タンパク質は、ORF2を欠くように操作されているか、又は欠陥ORF2をコードするcDNAから提供される。ウイルス製造の効率は、追加のウイルス・タンパク質遺伝子、例えば、エンベロープ構成成分（すなわち、SH, Ｍ，Ｇ，Ｆタンパク質）をコードするものの同時発現により改良されることもできる。

ゲノム又はアンチゲノム及び、別々に、Ｎ，Ｐ，Ｌ及びＭ２（ORF1）タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド（例えば、cDNA）は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入、形質導入その他により、多産的RSV 感染をサポートすることができる細胞、例えばHEp-2, FRhL-DBS2, MRC 、及びVero細胞内に挿入される。単離ポリヌクレオチド配列のトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション（Wigler et al., Cell 14 : 725 (1978) ; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 : 603 (1981) ; Graham and Van der Eb, Virology 52 : 456 (1973) 、エレクトロポレーション（Neumann et al., EMBO J. 1 : 841-845 (1982)）、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション（Ausubel et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY (1987)、これらを引用により本明細書中に取り込む。）、カチオン脂質仲介トランスフェクション（Hawley-Nelson et al., Focus 15 : 73-79 (1993））又は商業的に入手可能なトランスフェクション試薬、例えば、Lipofect ACEＲ（Life Technologies)により培養細胞内に導入されることができる。Ｎ，Ｐ，Ｌ及びＭ２（ORF1）タンパク質は、上記ゲノム又はアンチゲノムをコードするベクターと同一又は別個であることができる１以上の発現ベクター、及びそれらの様々な組合せ物によりコードされる。それ自身のベクター上に又はＮ，Ｐ，Ｌ又はＭ２（ORF1）タンパク質点をコードするベクター又は完全なゲノム又はアンチゲノム上にコードされた追加のタンパク質が、所望により含まれることができる。トランスフェクトされたプラスミドからの上記ゲノム又はアンチゲノム及びタンパク質の発現は、例えば、Ｔ７ RNAポリメラーゼのためのプロモーターの制御下にある各cDNAにより達成されることができ、これは次に、Ｔ７ RNAポリメラーゼのための発現系、例えば、Ｔ７ RNAポリメラーゼを発現するワクシニア・ウイルスMVA 株組換え体を用いた感染、トランスフェクション又は形質導入により供給される（Wyatt et al., Virology, 210: 202-205 (1995)、これを引用により本明細書中に取り込む。）

ウイルス・タンパク質、及び／又はＴ７ RNAポリメラーゼは、形質転換された哺乳類細胞から、又は事前に形成されたmRNA又はタンパク質のトランスフェクションによって、提供されることもできる。

あるいは、アンチゲノム又はゲノムの合成は、上述のウイルス・タンパク質と共に、併合転写−翻訳反応においてインビトロ（無細胞）においてその後の細胞内へのトランスフェクションにおいて行われることができる。又はアンチゲノム又はゲノムRNA は、インビトロにおいて合成され、そして細胞内にトランスフェクトされてRSV タンパク質が発現されることができる。

本発明に係る感染性クローンを有することは、規定の突然変異を導入することによりRSV ゲノム（又はアンチゲノム）の変更を許容する。“感染性クローン”とは、感染性ウイルス又はサブウイルス粒子のゲノムを製造するための鋳型として役立つことができるゲノム又はアンチゲノムRNA 内に転写されることができる、合成又はそれ以外の、cDNA又はその産物を意味する。規定の突然変異は、上記ゲノム又はアンチゲノムのcDNAコピー内に、慣用技術（例えば、部位指定突然変異誘発）により導入されることができる。本明細書中に記載するような完全アンチゲノムcDNAをアセンブルするための、アンチゲノムcDNAサブ断片の使用は、各領域が別々に操作されることができ（より小さなcDNAは大きなものよりも容易に操作される。）、そして次に完全cDNA内に容易にアセンブルされることができるという利点をもつ。従って、完全なアンチゲノム又はゲノムcDNA、又はそのいずれかのサブ断片は、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発のための鋳型として使用されることができる。これは、１本鎖ファージミド形態の中間体を通じたものであり、例えば、Bio-RadのMuta-genキットを使用したもの、又は鋳型として直接的に２本鎖プラスミドを使用する方法。StratageneのChameleon 突然変異誘発キット、又はオリゴヌクレオチド・プライマー又は着目の突然変異を含む鋳型のいずれかを使用するポリメラーゼ連鎖反応によるものであることができる。次に、突然変異されたサブ断片は、完全アンチゲノム又はゲノムcDNAにアセンブルされることができる。様々な他の突然変異誘発技術が知られており、RSV アンチゲノム又はゲノムcDNA内での着目の突然変異の作成における使用のために利用されることができる。突然変異は、単一のヌクレオチド変更から、１以上の遺伝子又はゲノム領域を含む大きなcDNA片の置換まで、変化することができる。

従って、１の例示的態様においては、突然変異は、Bio-Rad Laboratories, Richmond, CAから入手可能なMuta-gene ファージミド・インビトロ突然変異誘発キットを使用することにより導入される。簡単に言えば、RSV ゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAが、プラスミドpTZ18U内にクローン化され、そしてDH５αＦ’細胞（Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) を形質転換されるために使用される。ファージミド調製物は、上記製造者により推奨されるように調製される。オリゴヌクレオチドを、ゲノム又はアンチゲノムの所望の位置における変更されたヌクレオチドの導入による突然変異誘発のために、デザインする。次に遺伝子変更されたゲノム又はアンチゲノムを含むプラスミドを増幅する。

感染性RSV に所望の突然変異を導入する能力は、RSV 分子生物学及び病因論の分析を含む、多くの適用分野を有する。例えば、NS１，NS２，SH，Ｍ２（ORF1）及びＭ２（ORF2）タンパク質を含む、RSV タンパク質の機能は、それらの発現レベルを除去し又は減少させ、又は突然変異体タンパク質を作り出す突然変異を導入することにより、調査されることができる。

他の実施例として、Ｆプロテインの解裂部位における配列、又はＧプロテインの推定付着ドメインが、組織培養における増殖並びに実験動物における感染及び病因論に対する効果を評価するために修飾されることができる。

様々なゲノムRNA 構造的特徴、例えばプロモーター、遺伝子内領域、遺伝子重複、及び転写シグナルの役割は、本発明に係る方法及び組成物を使用して評価されることができる。完全アンチゲノムcDNAを使用したトランス作用性タンパク質及びシス作用性RNA 配列の評価は、RSV ミニゲノムを使用して並行して行われることができ（例えば、Grosfeld et al., J. Virol. 69 : 5677-5686 (1995)、これを引用により本明細書中に取り込む。）、そのヘルパー依存状態は、複製−依存感染性ウイルスにおいて回収されるにはあまりに阻害的であるような突然変異体の特徴付けにおいて有用である。

鼻内投与のための候補ワクチンとしての多様の減弱RSV 株が、冷−継代（cold-passage) の間に既に減弱されているウイルス内に多様の突然変異を導入するための、多ラウンドの化学的突然変異誘発を使用して開発されてきた（例えば、Connors et al., Virology 208 : 478-484 (1995) ; Crowe et al., Vaccine 12 : 691-699 (1994) ; 及びCrowe et al., Vaccine 12 : 783-790 (1994) 、これらを引用により本明細書中に取り込む。）。

げっ歯類、チンパンジー、成長体及び小児体における評価は、上記候補ワクチン株の中の特定のものが、遺伝子として比較的安定であり、高い免疫原性をもち、そして満足な結果をもって減弱されることができることを示している。これらの減弱ウイルスの中のいくつかのヌクレオチド配列分析は、増加された減弱の各レベルが、２以上の新たなヌクレオチド及びアミノ酸置換に関係することを示している（Connors et al., 前掲）。本発明は、上記突然変異体を、別々に及び様々な組合せにおいて、感染性野生型RSV のゲノム又はアンチゲノム内に、導入することにより、サイレントな偶発的な突然変異対表現型の差異の原因となる突然変異の間を区別するその能力を提供する。この手順は、表現型、例えば減弱、感温性、冷適応 (cold-adaptation)、小さなプラーク・サイズ、宿主レンジ制限、等の如き、表現型の原因となる突然変異を同定する。このメニューからの突然変異は、次に、所望により、ワクチン・ウイルスを、適切なレベルの減弱に換算するために、様々な組合せにおいて導入されることができる。その上、本発明は、１の株に、異なる株のウイルスからの突然変異を併合する能力を提供する。

本発明は、新たな減弱方法をも提供する。例えば、ヒトRSV の個々の内部遺伝子を、それらのウシ、ネズミ又は他のRSV 遺伝子で置き替えることができる。これは、１以上のNS１，NS２，Ｎ，Ｐ，Ｍ，SH，Ｍ２（ORF1），Ｍ２（ORF2）及びＬ遺伝子、の中の一部又は全部、あるいはＧ及びＦ遺伝子の非免疫原性部分を含むことができる。相互に、ヒト減弱遺伝子をウシRSV ゲノム又はアンチゲノム・バックグラウンドに挿入することにより生減弱ウシRSV を生成するための手段が提供される。ヒトRSV 担持ウシRSV 糖タンパクは、ヒト・ワクチン調製のために好ましい宿主レンジ制限を提供する。本発明において使用されることができるウシRSV 配列は、例えば、Pastey et al., J. Gen. Viol. 76 : 193-197 (1993) ; Pastey et al., Virus Res. 29 : 195-202 (1993) ; Zamora et al., J. Gen. Virol. 73 : 737-741 (1992) ; Mallipeddi et al., J. J. Gen. Virol. 74 : 2001-2004 (1993) ; Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 73 : 2441-2444 (1992) ; 及びZamora et al., Virus Res. 24 : 115-121 (1992) （これらの各々を、引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されている。

本発明は、減弱突然変異の他のタイプを分析し、そしてワクチン又は他の用途のためにそれらを感染性RSV を取り込む能力をも提供する。例えば、マウスの肺炎ウイルスの組織培養・適用非病原性株(RSVのネズミ株）は、Ｇプロテインの細胞質尾を欠く（Rand hawa et al., Virology 207 : 240-245（1995））。類推により、RSV 糖タンパク、Ｆ，Ｇ及びSHの各々の細胞質及びトラスメンブラン・ドメインが、減弱を達成するために欠失又は修飾されることができる。

本発明に係る感染性RSV における使用のための他の突然変異は、RSV ミニゲノムの突然変異の分析の間に同定されたシス作用性のシグナルにおける突然変異を含む。例えば、上記リーダー及びトレーラー及びフランキング配列の挿入及び欠失分析は、ウイルス・プロモーター及び転写シグナルを同定し、そしてRNA 複製又は転写の減少の程度の変化に関係する一連の突然変異を提供した。これらのシス作用性シグナルの飽和突然変異誘発（これにより、各位置は順番に、そのヌクレオチド代替物のそれぞれに修飾される。）は、RNA複製又は転写を減少させた（又はある場合には増加させた）多くの突然変異をも同定した。これらの突然変異のいずれも、本明細書中に記載するように完全アンチゲノム又はゲノム内に挿入されることができる。他の突然変異は、RNA 複製及び転写における変化に関係する、アンチゲノムからの３’末端と、ゲノムの３’末端を置換することを含む。さらに、遺伝子内領域（Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 4594-4598 (1986)、これを引用により本明細書中に取り込む。）を、配列量において短かくされ又は長くされ又は変化されることができ、そして天然遺伝子重複（Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 5134-5138 (1987)、これを引用により本明細書中に取り込む。）は、除去されるか又は、本明細書中に記載する方法により異なる遺伝子内領域に変えられることができる。

他の態様においては、ワクチン配合物中で有用なRSV は、便利には、循環ウイルスにおける抗原ドリフトに適合するように修飾されることができる。典型的には、この修飾は、Ｇ及び／又はＦプロテイン内にあるであろう。Ｇ又はＦ遺伝子全体、又はそれらの特定の免疫原性領域をコードするセグメントは、いくつかの抗原性形態が提示されるような遺伝子の１以上のコピーを添加することにより又はその感染性クローン内の対応領域の置換によりRSV ゲノム又はアンチゲノムcDNA内に取り込まれる。

上記修飾RSV cDNAから製造された子孫ウイルスは、次に、その出現株に対する種痘手順において使用される。さらに、RSV サブグループＢのＧプロテイン遺伝子を含むことは、ヒト集団中に存在する比較的多様なサブグループＡとＢ株のより広いスペクトルをカバーすることに対する応答を広げるであろう。

本発明の感染性RSV クローンは、その免疫原性を高めるように、そして自然感染により提供されるものよりも大きな保護レベルを誘発するように操作されることもでき、又は、それとは反対に、不所望の免疫病理学的反応に関係するエピトープを同定し、かつ、除去するように操作されることもできる。本発明により製造されるワクチンの高められた免疫原性は、RSV を制御することに対する最大の障害の中の１つ、すなわち、自然感染により誘発される免疫の不完全な性質に向けられている。追加の遺伝子は、転写シグナルの独立セットの制御下にあるRSV ゲノム又はアンチゲノム内に挿入され、又はそれの近くにあることができる。着目の遺伝子は、サイトカイン（例えば、IL−２〜IL−15、特にIL−３，IL−６及びIL−７等）、ガンマ−インターフェロン、及びＴヘルパー細胞エピトープに富むタンパク質をコードするものを含む。追加のタンパク質は、RSVタンパク質の中の１、例えばSHの第２のコピーとは別個のタンパク質又は遺伝子操作されたキメラのいずれかとして発現されることができる。これは、定量的かつ定性的にRSV に対する免疫応答を修飾し、かつ、改良する能力を提供する。

ワクチン用途のために、本発明に従って製造されたウイルスは、ワクチン配合物中で直接使用されるか又は、所望により、当業者によく知られた凍結乾燥プロトコールを使用して、凍結乾燥されることができる。凍結乾燥されたウイルスは、典型的には、約４℃で維持されるであろう。使用直前に、この凍結乾燥されたウイルスは、以下にさらに説明するような、安定性溶液、例えば生理食塩水又はSPG ，Mg⁺⁺を含むもの又はHEPES 中で、アジュバントと共に又は伴わずに、再構築される。

従って、本発明のRSV ワクチンは、活性成分として、本明細書中に記載するように製造されたRSV の免疫遺伝学的に有効な量を含む。修飾されたウイルスは、生理学的に許容される担体及び／又はアジュバントと共に、宿主内に導入されることができる。有用な担体は、本分野においてよく知られており、そして、例えば、水緩衝液化水、 0.4％生理食塩水、 0.3％グリシン、ヒアルロン酸その他を含む。得られた水溶液は、そのまま使用のために包装されるか、又は上述のように、投与前に滅菌溶液と併合されて凍結乾燥されることができる。上記組成物は、生理学的条件を真似るために必要な医薬として許容される補助物質、例えばpH調節及び緩衝液化剤、浸透圧調節剤、水和剤その他、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタン・モノラウレート、トリエタノールアミン・オレエートその他を含むことができる。許容されるアジュバントは、不完全フロイント・アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、又はミョウバンであって、本分野においてよく知られた材料であるものを含む。

エアロゾル、小滴、経口、表在局所的又は他の経路を介して、本明細書に記載するようなRSV 組成物で免疫感作する間、宿主の免疫系は、RSV ウイルス・タンパク質、例えばＦ及びＧグリコプロテインに特異的な抗体を製造することにより、上記ワクチンに応答する。この種痘の結果として、この宿主は、RSV 感染に対し少なくとも部分的に又は完全に免疫性となり、又は特に下呼吸管の中程度又は重度のRSV 感染の進展に対して抵抗性となる。

上記ワクチンが投与される宿主は、RSV 又は近い関係のウイルスによる感染を受け易いいずれかの哺乳類であることができ、その宿主は、種痘株の抗原に対する保護免疫応答を作り出すことができる。従って、好適な宿主は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ゲッ歯類その他を含む。従って、本発明は、様々なヒト及び獣医用途をもつワクチンを作成するための方法を提供する。

本発明のRSV を含むワクチン製剤は、その宿主自身の免疫応答能力を高めるために、RSV 感染を受け易い宿主又はその他その危険にある宿主に投与される。このような量は、“免疫遺伝学的有効量”と定量される。この用途においては、その正確な量は、再び、その宿主の健康状態及び体重、投与モード、その製剤の性質に依存するが、一般的には、約 10³〜約10⁶ プラーク形成単位（plaque forming units (PFU)）以上のウイルス／宿主、より一般的には、約 10⁴〜10⁵ PFU ウイルス／宿主の範囲内にある。いずれの事件においても、ワクチン配合物は、重篤な又は致死的なRSV 感染に対して、その宿主の患者を有効に保護するために十分な品質の、本発明の修飾RSV を提供すべきである。

本発明に従って製造されたRSV は、多数のRSV サブグループ又は株に対する保護を達成するために他のサブグループ又は株のウイルスと併合されることができ、又はこれらの株の保護性エピトープは、本明細書中に記載するように１のウイルス内に遺伝子操作されることができる。典型的には、異なるウイルスが、混合され、そして同時に投与されるであろうが、別々に投与されることもできる。例えば、上記２つのRSV サブグループのＦグリコプロテインは、アミノ酸配列において約11％程相異し、この類似性は、RSV 又はＦ抗原で免疫感作され、そして異種株で接種された動物において観察されるような交差保護性免疫応答のための基確である。従って、１の株による免疫感作は、同一の又は異なるサブグループの異なる株に対する保護を作り出すことができる。

いくつかの場合においては、本発明に係るRSV ワクチンと、他の剤、特に他の小児期ウイルスに対する保護応答を誘発するワクチンを、併合することが望ましい。例えば、本発明に係るRSV ワクチンは、例えば、Clements et al., J. Clin. Microbiol. 29 : 1175-1182 (1991)（これを引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されたような、パラインフルエンザ・ウイルス・ワクチンと同時に投与されることができる。本発明の他の側面においては、上記RSVは、本明細書中に記載するような感染性RSV を製造するために使用されるRSV ゲノム又はアンチゲノム内に上記保護性抗原をコードする配列を取り込むことにより、他の呼吸管病原体、例えばパラインフルエンザの保護抗原のためのベクターとして使用されることができる。

本発明に係るワクチン製剤の単一回又は多数回投与を行うことができる。新生児及び乳幼児においては、多数回投与が、十分なレベルの免疫を顕出するために、要求されることができる。投与は、生後１ヶ月以内に、そして小児期の全体にわたり一定間隔で、例えば、２ヶ月目、６ヶ月目、１年目、及び２年目に、生来の（野生型の）RSV 感染に対する十分なレベルの保護を維持することが必要なときに、開始されるべきである。同様に、繰り返しの又は重度のRSV感染を特に受け易い成人、例えばヘルス・ケア従事者、デイ・ケア従事者、若い子供をもつ家族のメンバー、免疫無防備状態の機能をもつ、より年輩の個体は、保護免疫応答を確立し、そして／又は維持するために多数回の免疫感作を要求することができる。減少された免疫のレベルは、分泌及び血清抗体を中和する量を計測することによりモニターされることができ、所望のレベルの保護を維持するために必要な場合、投与量が調整され又は種痘が繰り返される。さらに、異なるワクチン・ウイルスは、異なる受容体群にとって有利であることができる。例えば、Ｔ細胞エピトープにおいて豊富な追加のタンパク質を発現する遺伝子操作されたRSV 株は、乳幼児にとってよりも成人にとって、特に有利であることができる。

本発明のさらに他の側面においては、上記RSV は、呼吸管の過渡的遺伝子治療のためのベクターとして使用される。この態様に従って、組換えRSV ゲノム又はアンチゲノムは、着目の遺伝子産物をコードすることができる配列を取り込む。着目の遺伝子産物は、RSV発現を制御するプロモーターと同一の又はそれと異なるプロモーターの制御下にある。

Ｎ，Ｐ，Ｌ及びＭ２（ORF1）タンパク質と共に組換えRSV ゲノム又はアンチゲノムを同時発現させることにより製造され、そして着目の遺伝子産物をコードする配列を含む感染性RSV を、患者に投与する。投与は、典型的には、エアロゾル、噴霧器、又は治療されている患者の呼吸管への他の表在局所的適用による。組換えRSV は、所望の遺伝子産物の治療的又は予備的レベルの発現をもたらすために十分な量で投与される。この方法において投与される代表的な遺伝子産物の例は、例えば、過渡的発現のために特に好適なもの、例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−４、ガンマ−インターフェロン、GM−CSF 、Ｇ−CSF 、エリスロポイエチン、及び他のサイトカイン、グルコセレブロシダーゼ、フェニルアラニン、ヒドロキシラーゼ、嚢胞性繊維症トランスメンブラン・コンダクタンス・レギュレーター（Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)）、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ、サイトトキシン、腫瘍サプレッサー遺伝子、アンチセンスRNAs、及びワクチン抗原をコードするものを含む。
以下の例を、限定のためではなく、説明のために提供する。

実施例Ｉ
RSV アンチゲノムをコードするcDNAの構築
RSV 株Ａ２のアンチゲノムをコードするcDNAクローンを、図１Ａ中に示すように構築した。このcDNAを、プライマーとして合成オリゴヌクレオチド及び鋳型として精製されたビリオンから単離された細胞内RSV mRNA又はゲノムRNA を使用して、逆転写（reverse transcription (RT)）及びポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction (PCR））によりセグメントにおいて合成された。この最終cDNAは、Ｔ７ RNAポリメラーゼのためのプロモーターによりそのリーダー末端上に隣接され、これは、最適活性のための３つの転写されたＧ残基を含み；転写は、そのアンチゲノムの５’末端に上記３つの非ウイルスＧを与えることをもたらすであろう。ほぼ正確な３’末端を作り出すために、そのcDNAトレーラー端を、先に記載したハンマーヘッド・リボザイムに隣接するように構築し、これは、解裂の間に、コードされたRNA の３’末端に単一の３’−リン酸化Ｕ残基を与えるであろう（Grosfeld et al., J. Virol. 69 : 5677-5686 、これを引用により本明細書中に取り込む。）。このリボザイム配列の後に、Ｔ７ RNAポリメラーゼのターミネーターのタンデム対が続いた。（クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ(CAT）リポーター遺伝子を含むcDNAコードRSV ミニゲノムへの３つの５’Ｇ残基及び１つの３’Ｕ残基の追加は、RSV により相補されるときCAT の発現に対する効果を全くもっていなかった。）

図１Ａは、cDNAとコードされたアンチゲノムRNA の構造を示す（一定の比率ではない）。（上部にある）アンチゲノムのダイアグラムは、以下の特徴を示す：Ｔ７プロモーターにより与えられる５’−末端非ウイルスＧトリプレット、（その長さに１ntを追加する）1099位、1139，5611、及び7559位における４つの配列マーカー、リボザイム及びタンデムＴ７ターミネーター、及びリボザイム解裂によりその３’末端に与えられた単一の非ウイルス３’−リン酸化Ｕ残基（この解裂部位を矢印で示す。）（13）。

完全なアンチゲノムを組合せにおいて提示するクローン化されたcDNAセグメント（図１Ａ、中央）を、RSV mRNA又はゲノムRNA のRT−PCR により構築した。Ｔ７プロモーターから広がる上記アンチゲノムの左手端並びにSH遺伝子に相補的なリーダー領域を含むcDNAsを、pBR322の改変物内でアセンブルした（図１Ａ、下）、ここで、天然BamHＩ部位は、アセンブリーを容易にするようにデザインされた（BstBＩ，BstXＩ， PacＩ，BamHＩ， MluＩを含む）ユニークな制限部位を含む合成ポリリンカーで置換された PstＩ−EcoRＩ断片及び突然変異誘発により除去されていた。図１Ａ中のボックスは、BamHＩ部位の除去を示す。天然BamHＩ− SalＩ断片（BamHＩ部位をポジティブ・センス内の上部線内に、下線を付して示す。）を、PCR −生成 BglII− SalＩ断片で置き替えた（この BglII部位を、下部線内に、下線を付して示す；その４−nt付着末端〔イタリック体〕は、BamHＩのものと互換性である。）。これは、そのアミノ酸レベルにおいてサイレントである単一ntの変化（中央線、下線を付す）をもたらした。上記ベクターに対する上記修飾は、アンチゲノムcDNA内にユニークなBamHＩ部位を付与することによりcDNAの構築を容易にした。

Ｇ，Ｆ及びＭ２遺伝子を、別個のプラスミド内で、Ｌ、トレーラー及びフランキング・リボザイム並びにタンデムＴ７転写ターミネーターのように、アセンブルした。次にＧ−to−Ｍ２片を、リーダー−to−SHプラスミドの PacＩ−BamHＩ窓内に挿入した。これは、今度、BamHＩ〜 MluＩ内に挿入されたＬ−トレラー−リボザイム−ターミネーターのための受容体となり、完全なアンチゲノムをもたらす。４つの制限部位マーカー（図１Ｂ）を、RT−PCR において使用されるオリゴヌクレオチド・プライマー内に変化を取り込むことによりアンチゲノムcDNA内に導入した。これは、アセンブリーを容易にするために行われ、組換えウイルスを同定するための手段を提供し、そして感染性RSV 内に変化を導入するその能力を説明する。上記３つの部位は、遺伝子内領域内にあり、そして第４のものは、非翻訳遺伝子領域内にあり、そしてそれらは、合計５つのnt置換及び１のnt挿入を含んでいた。これは、野生型のものから全部で15,223ntまで、１nt程コードされたアンチゲノムの長さを増加させた（配列番号：１は、５’〜３’ポジティブ配列を示し、一方、そのゲノムは、ネガティブ・センスである。）。

これらの配列マーカーは、図１Ｂに示すようにcDNAコード・アンチゲノムRNA 内に挿入された。配列は、ポジティブ・センスであり、そのリーダー領域相補物の第１ntを１と番号付け；それぞれサブグループＡとＢを代表する株Ａ２と18537 の間の同一性（Johnson and Collins, J. Gen. Virol, 69 : 2901-2906 (1988) 、これを引用により本明細書中に取り込む。）を、ドットで示し；cDNA内の制限部位を表す配列に、下線を付し；遺伝子−開始（GS）と遺伝子−終結（GE）転写シグナルをボックスで囲み；1141位におけるＮ翻訳オープン・リーディング・フレームの開始コドンをイタリック体で表し、そしてそれら配列マーカーを各配列の下に示す。上の配列においては、単一のＣ残基が、NSII−Ｎ遺伝子内領域内に AflII部位を作り出すために1099位に挿入され、そしてＮ翻訳オープン・リーディング・フレームの直上流の1139と1140位におけるAGは、新たな NcoＩ部位を作り出すためにCCで置き替えられた。中央の配列におて、それぞれ、5612と5616位におけるＧとＵの置換は、Ｇ−Ｆ遺伝子内領域内に新たな StuＩ部位を作り出した。そして、図１Ｂの下の配列においては、7561位におけるＣ置換は、Ｆ−Ｍ２遺伝子内領域内に新たな SphＩ部位を作り出した。

全てのcDNAを、アセンブリー前に、ほとんどの場合、いくつかの独立したcDNAから、それらの全体について配列決定した。個々のRSV タンパク質をコードするプラスミドは、Gros feld et al., J. Virol. 69 : 5677-5686 (1995) 及びCollins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 、（これらの各々を引用により本明細書中に引用する。）中に記載されている。

実施例II
組換えRSV のトランスフェクション及び回収
関係するcDNA発現アンチゲノムから感染性RSV を製造するための戦略は、（ｉ）RNA 複製が可能であるアンチゲノム・ヌクレオキャプシドを作り出し；そしてRNA 複製と転写の両方についての能力をその子孫ゲノム・ヌクレオキャプシドに与える、ために十分であるようなRSV タンパク質とのその同時発現を含むものであった。

アンチゲノムをコードするプラスミド担持cDNAは、タンパク質Ｎ，Ｐ，Ｌ及びＭ２（ORF1）をコードするプラスミドと共に、Ｔ７ RNAポリメラーゼを発現する最近記載されたワクシニア・ウイルスMVA 株組換え体で感染されていた HEp−２細胞内にトランスフェクトされた（Wyatt et al., Virol. 210 : 202-205 (1995) 、これを引用により本明細書中に取り込む。）このMVA 株は、トリ細胞内では寛容に増殖する宿主レンジ突然変異体であり、一方、哺乳類細胞内では、感染性ウイルスの製造をかなり減少させるビリオン成熟における後期段階における遮断が存在する。 HEp−２細胞においては、MVA 組換え体は、Ｔ７ポリメラーゼの発現及び細胞病原性のレベルに関しては、より一般的に使用されるWR−ベースの組換え体に類似していたが（Fuerst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 8122-8126 (1986））、作り出された子孫のレベルは、上清が、最小の細胞病原性をもって新鮮な細胞に継代培養されることができる程十分に低いものであった。これは、トランスフェクトされたワクシニア・ウイルス感染細胞内で製造されることができるであろういずれかの組換え体RSV の回収を容易にするはずである。

組換え体RSV のトランスフェクションと回収を、以下のように行った。 HEp−２細胞の単層培養物は、６−ウェル皿の中の１ウェル当り、 0.1mlのOpti−MEM (Life Technologies）培地の最終容量中５つのプラスミドを混合することにより調製された感染−トランスフェクション培地１ml、すなわち、各 0.4μｇのアンチゲノム、Ｎ及びＰプラスミド、並びに各 0.1μｇのＬ及びＭ２（ORF1）プラスミドを受容した。これは、12μｌ Lipofect ACE (Life Technologies）を含む 0.1mlのOpti−MEM と併合された。室温において15分間のインキュベーションの後、これを、２％熱失活胎児ウシ血清及び 1.5×10⁶ pfu の、Ｔ７ RNAポリメラーゼをコードする株MVA ワクシニア・ウイルス（Wyatt et al., 前掲）を含む 0.8mlと併合した。これを、上記細胞に添加し、そして２％血清を含むOpti−MEM により１日後に置き替えた。培養物を、32℃においてインキュベートし、そして３日目に収穫した。32℃におけるインキュベーションを使用した。なぜなら、MVA ウイルスは僅かに感温性であり、そして上記の低い温度においてより効率的であることが発見されたからである。

トランスフェクション３日後に、清澄化された培養上清を新鮮な HEp−２細胞上に継代し、そして（その後の抗体染色のために）メチル・セルロース又は（プラーク単離のために）アガロース上に継代培養した。メチル・セルロース下で５日間インキュベートした後、上記細胞を、Murphy et al., Vaccine 8 : 497-502 (1990) の一般手順に従って、RSV Ｆプロテインに対する３つのネズミ・モノクローナル抗体の混合物、その後の西洋ワサビ・ペルオキシダーゼに結合された抗−マウス抗体を使用して、間接的西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ法により固定し、そして染色した。

多数の RSV−様プラークが、恐らく低レベルの MVA−Ｔ７組換え体ウイルスに因る細胞病原性のバックグラウンドに対して検出された。これらのプラークは、茶色−黒色発色により示されるような、多量のRSV Ｆタンパク質を含んでおり、そしてRSV に特徴的な細胞病理学的効果、顕著には、シンシチウム(syncytium）形成を示した。

RSV 様プラークは、並行して調製されていたがアガロース下でインキュベートされ、そしてニュートラル・レッドで染色されていたプレートから拾い上げた。それらを、増殖させ、そしてプラーク・アッセイ及び抗体染色によりRSV 株Ａ２の実験室株と比較した。トランスフェクトされた培養物から得られたプラークを、実験室株のものに極めて似ていた。１の差異は、トランスフェクトされた培養物から得られたプラークが、上記実験室株からのものよりも僅かに小さいようであり、その中心は、十分に清澄ではなかった、ということであった。上記組換えウイルスは、上記の特定の野生型単離物と表現型として相異することができ、たぶん、細胞〜細胞の広がりにおいて僅かにより制限されており、そして減少された細胞殺生速度を示す。放出されたウイルスの増殖に関しては、 HEp−２細胞における組換えウイルス対実験室ウイルスの収率は、32℃又は37℃において本質的に同じであった。予備試験において、組換えウイルスと実験室ウイルスは、細胞内mRNAs とタンパク質の蓄積に関して区別することができなかった。

プラーク精製、３代継代培養組換えRSV を、４つの挿入されたマーカーに隣接する３つのプライマー対を使用してRT−PCR により実験室ウイルスと並行して分析した。３つの独立したプラーク精製組換えRSV 単離物を、非感染対照培養物と並行して増殖させた。清澄化培地上清を、ポリエチレン・グリコールと高塩で処理して（Zoller and Smith, DNA 3 : 479-488 (1984)ウイルスを沈殿させ、そしてRNA を、Trizol TM (Life Technologies) を用いて上記ペレットから抽出した。これらのRNAsを、RNA の添加されていない追加の対照又は株Ａ２の実験室単離物からのRNA 0.1μｇと並行して、DNAse で処理し、再精製し、各々50ngのランダム・ヘキサマーとアニールさせ、そして逆転写酵素と共に又はそれを伴わずに標準的なRT条件（40μｌ反応）の下でインキュベートした（Connors et al., Virol. 208 : 478-484 (1995) ）。各反応のアリコートを、３つの異なる対の合成デオキシオリゴヌクレオチド・プライマーを使用してPCR (94℃45秒間、37℃30秒間、72℃１分間の35サイクル）に供した。プライマー対（Ａ）：ポジティブ−センス、 925−942 位及びネガティブ−センス、1421−1440位、それぞれ、NS２遺伝子とＮ遺伝子の接点において、及びＮ遺伝子内に挿入された AflII及び NcoＩ部位を含む 516bp（組換えウイルスの場合には 517bpの予想される産物を作り出す。プライマー対（Ｂ）：ポジティブ−センス、5412−5429位及びネガティブ−センス、5930−5949、Ｇ遺伝子とＦ遺伝子の間の接点に挿入された StuＩ部位にわたる 538bpの予想産物を作り出す。プライマー対（Ｃ）：ポジティブ−センス、7280−7297及びネガティブ−センス、7690−7707、Ｆ遺伝子とＭ２遺伝子の間の接点に挿入された SphＩ部位にわたる 428bp断片を作り出す。PCR 産物を、 HaeIII 消化×174 DNA 分子長マーカーと並行して１％アガロース及び２％低融点アガロースを含む中性ゲル上での電気泳動により分析し、そして臭化エチジウムでの染色により可視化した。上記の予想サイズのPCR 産物を製造した。各々の製造は、上記PT段階に依存した。このことは、各々が、汚染性cDNAよりもむしろRNA から得られていたことを示す。

PCR 産物を、制限酵素による消化により分析した。 AflII又は NcoＩによるプライマー対Ａの産物の消化は、予想された 177及び340bp (AflII）又は217 及び 300bp(NcoＩ）に一致する断片を作り出した。 StuＩによるプライマー対Ｂの産物の消化は、予想された201 及び 337bpに匹敵する断片を作り出した。 SphＩによるプライマー対Ｃを用いた反応からの産物の消化は、予想された147 及び 281bpに一致する産物を作り出した。これらの消化物を、上記のようなゲル電気泳動により分析した。 AflIIによる残存未消化PCR 産物の存在は、再消化により確認されたような、不完全消化に因るものであった。従って、上記制限酵素消化は、組換えを提示する上記PCR産物が、上記予想制限部位マーカーを示し、一方、実験室株を提示するものは、そうしなかったことを示した。クローン化されたPCR産物のヌクレオチド配列分析は、上記制限部位マーカーにわたる配列を確認した。

表１に示すように、Ｎ，Ｐ，Ｌ及びＭ２（ORF1）により相補されるときRSV 生産の効率は、比較的高く、３つの実験において、 0.4μｇの仕込みアンチゲノムcDNA及び 1.5×10⁶ 細胞当り、平均 9.9〜94.8プラークの範囲にあった。これらのプラークは、継代培養により誘導されたので、元のトランスフェクションの各ウェル内に存在する感染細胞の数は、知られていなかった。ほとんど全てのトランスフェクトされたウェル（表１中、56中54）がウイルスを製造した。感染された細胞当りの放出されたRSV の収率は、典型的には、理想的な条件下でさえひじょうに低い（〜10pfu)であるので、そして多くのウェルが上記量の多数倍（表１中、169 プラークまで）をもたらすので、いくつかのRSV 産生細胞が、トランスフェクトされた細胞のウェルの多くの内に存在したようである。

RSV は、（例えば、表１中に示すように）上記プラスミドの中のいずれかが省かれた場合には、回収されなかった。Ｍ２（ORF1）のための要求も、上記完全遺伝子を用いて満足されることができた。但し、その仕込み(input）cDNAのレベルは低かった(1.5×10⁶ 細胞当り 0.016μｇ〔表１〕）。より高いレベルにおいては、ウイルスの製造は、かなり減少された。これは、Ｍ２（ORF2）に関連するミニゲノムRNA 合成の阻害は、保護感染の間に上記完全ゲノム上でも働くことを示唆している。

これらの結果は、感染性RSV の製造が、Ｎ，Ｐ及びＬに加えてＭ２（ORF1）タンパク質の発現に高く依存することを示した。さらに、それは、Ｍ２（ORF1）の最適な発現方法は、ORF2が欠失されていた遺伝子操作されたcDNAからであったが、両ORF₂を含む完全cDNAもRSV の製造をサポートしたことを示した。

従って、本発明の一部として、RSV による転写は、本明細書中Ｍ２（ORF1）といい、そして従来22Ｋ又はＭ２といわれた（Collins et al., J. Virol. 54 : 65-71 (1985））第４のタンパク質を要求する点で、先に記載された非セグメント化ネガティブ・ストランドRNA ウイルスとは相異していた。Ｍ２（ORF1）タンパク質は、プロセッシブで逐次的転写のために必須なRNA ポリメラーゼ延長因子であることが判明した。この要求は、本発明の一部として、感染性RSV 内への特定の、所定の変更を導入するための能力を提供する。

実施例III
所望の表現型を与えるための、所定の突然変異をもつ感染性RSV の構築
本実施例は、上記方法を使用した感染性組換えRSV 内への特定の所定の突然変異の導入について説明する。操作を容易にするために、アンチゲノムcDNAを、２つの別個の片として、別々のプラスミド内にクローン化した：１片（左端）は、ヌクレオチド１〜8501ヌクレオチドにあるBamHＩ部位と共にＴ７プロモーターを含み（cDNA Ｄ50）、そして他（右端）は、上記リボザイムとＴ７転写ターミネーターと共に、上記BamHＩ部位〜ヌクレオチド15223 を含む（cDNA Ｄ39）。Ｄ39は、さらに２片内に分割され、そして各々が、別個のファージミド・プラスミド内に置かれていた：１片（左手半分、cDNA Ｌ１）は、BamHＩ部位〜ヌクレオチド12255 における PmlＩ部位であり、そして他（右手半分、cDNA Ｌ２）は、上記 PmlＩ部位〜Ｔ７ターミネーターの端である。制限部位の位置に指定された配列部分は、記述的案内として意図され、関連するヌクレオチドの全てを単独で正確に定めるものではない。

Kunkel et al., Meth. Enzymol. 54 : 367-382 (1987) の一般的手順（これを引用により本明細書中に取り込む。）に従って、上記プラスミドを、Ｅ．coli株 CJ236のdut ung 株内で増殖させ、そして１本鎖DNA を、ヘルパー・ファージ、M13KO7を用いた感染により調製した。１以上の着目のヌクレオチド変化を各々が含むリン酸化合成オリゴヌクレオチドを調製し、１回又は１度に１回以上、１本鎖鋳型にアニールし、そしてＴ４ DNAポリメラーゼによるDNA 合成に向けるために使用した。これら生成物をライゲートし、そしてＥ．coli, DH５α又はDH10B の非−dut ung 株内に形質転換した。突然変異プラスミドを含むコロニーを、制限酵素消化により又は配列分析にあり同定した。他の突然変異誘発方法を容易に使用することができる。

上記Ｌ１とＬ２を、アンチゲノム・プラスミド内に現れず又はまれないくつかの異なる制限酵素のための認識部位のいくつかの組合せを含むように修飾し；これらの部位を、コードされたＬプロテインのアミノ酸配列を変えなかったヌクレオチド置換を使用して導入した。さらに、Ｌ１は、ts表現型を与えると信じられた突然変異を含むように修飾された。Ｌ１の２つの改変物を作った。１のバージョンにおいては、Ｌ１を、新たなBsu 36Ｉ（ヌクレオチド9399）及びSnaBＩ(11848）部位を含むように単一サイクルの突然変異誘発において修飾し、そしてその突然変異を530 と命名し、cDNA 530ＬＩ部位を得た。この530 突然変異は、生物学的に得られたウイルスcpts 530−RSV の配列分析により同定されており、そしてＬプロテイン内のアミノ酸521 にアミノ酸変更(phe→Leu)をもたらす10060 位における１のヌクレオチド変更を含んでいる。第２のバージョンにおいては、Ｌ１は、Bsu 36ＩとSnaBＩ部位を含むように単一サイクルにおいて修飾され、これは、cDNA Ｌ１部位をもたらす。Ｌ２は、新たな部位 PmeＩ(13342）、RsrIＩ(14083）及びSnaBＩ(14477）を含むような１サイクルの突然変異誘発において修飾された。第２のサイクルにおいては、BstEII部位(14318）が添加され、そしてSnaBＩ（6956）のための天然認識部位が除去された。これは、Ｌ２部位をもたらした。

３つの完全アンチゲノムcDNAを、選ばれたＬ１及びＬ２突然変異体cDNA又はそれらの断片をＤ39内に導入し、そしてこれをＤ50と併合することにより、作った。アンチゲノムcDNA“Ｄ53部位”は、Ｌ１部位とＬ２部位を含む。cDNA“530 Ｄ53”は、（Bsu 36Ｉ及び530 突然変異を含む）530 Ｌ１部位のBamHＩ− SpeＩ(10149）断片を含む。cDNA“530 Ｄ53”は、530 Ｌ１部位とＬ２部位を含んでいた（表II）。組換えウイルスを、本発明の方法論を使用して３つの完全突然変異体アンチゲノムcDNAのそれぞれから回収し、そして直接的にか又はプラーク精製及び増幅の後に分析した。突然変異体の存在を、ウイルスRNA のRT−PCR その後の、制限酵素消化又はヌクレオチド配列決定、又は両方による分析により、確認した。

遺伝子操作されたウイルスを、２つの非組換え生物学的誘導ウイルス、HEK 、野生型株Ａ２ウイルス、及びcpts 530 RSV、それから530 突然変異が配列分析により同定されたところのウイルス（表II）と並行して、32℃，39℃及び40℃において HEp−２細胞内でプラークを形成するためのそれらの能力について評価した。この比較は、３つの遺伝子操作されたウイルスの全てが32℃においてプラークを形成したことを示し、そしてさまざまなウイルス調製物のタイターが、互いに２log₁₀ 単位内にあったことを示した。これは、RSVの独立調製物の中に典型的に見られる実験的バラツキの範囲内にある。530 突然変異を含む組換えウイルスは、cpts 530 RSVに匹敵する、39℃又は40℃においてプラークを形成する能力の点でかなり弱められた。530 Ｄ53部位対530 Ｄ53内の追加の制限部位の存在は、ts表現型に対する区別することができる効果を全くもっていなかった。サイレント制限部位マーカーを含むが、530 突然変異を欠いているＤ53部位ウイルスは、野生型に比較して、より高い温度においてプラークを形成するその能力を保持していた。これは、530 突然変異がcpts 530 RSVの表現型には含まれないポジティブな同定を提供するだけではなく、点突然変異が、本発明に従って組換えRSV 内に計画的に導入されることができることを示した。これらの場合においては、得られた遺伝子操作されたウイルスの表現型は、その親株と完全に矛盾せず、そして減弱突然変異の直接的な確認及び再構成を提供した。

実施例IV
追加の外来遺伝子を発現する感染性RSV ウイルスの回収
上記方法を、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ(CAT）をコードする追加の遺伝子を含む組換えRSV を構築するために使用した。CAT コーディング配列は、 RSV−特異的遺伝子−開始及び遺伝子−終結モチーフ、ウイルスRNA 依存性RNA ポリメラーゼのための転写シグナルにより、隣接された。 RSV／CAT キメラ転写カセットを、完全cDNAコード・ポジティブ−センスRSV アンチゲノムのＧ遺伝子とＦ遺伝子の間の遺伝子内領域内に挿入し、そして感染性CAT 発現性組換えRSV を回収した。CAT mRNAは、効率的に発現され、そしてＧとＦmRNAのレベルは、野生型組換えRSV により発現されたものに匹敵した。CAT 含有及び野生型ウイルスは、主要ウイルス・タンパク質の合成レベルに関して同様のものであった。

プラスミドＤ46を、CAT 遺伝子を含むRSV アンチゲノムRNA をコードするcDNAの構築のために使用した。（プラスミドＤ46とＤ50（後者を実施例III において言及した）は、同一のアンチゲノムcDNAの異なる調製物である。）完全な、15,223ヌクレオチドのRSV アンチゲノムをコードするＤ46（野生型RSV よりも１ヌクレオチド長い）を、上記の組換え感染性RSV を製造するために使用した。その構築の間に、アンチゲノムcDNAは、マーカーとして４つの新たな制限部位を含むように修飾されていた。これらの中の１，Ｇ遺伝子とＦ遺伝子の間の遺伝子内領域内に置かれた StuＩ部位（野生型ゲノムの３’−５’配列内の5611−5616位）を、外来CAT 遺伝子のための挿入部位として選んだ。RSV GSシグナルによりその上流端上に、そしてRS GE シグナルによりその下流端上に隣接されたCAT ORF のコピーを、先に記載した RSV−CAT ミニゲノムから得た（Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 9663-9667 (1991)及びKuo et al., J. Virol. 70 : 6892-6901 (1996) 、これらを引用により本明細書中に取り込む。）。Ｄ46／1024 CAT cDNA を作り出した、この RSV／CAT 転写カセットの StuＩ部位内への挿入は、コードされたアンチゲノムの長さを全部で15,984ヌクレオチドに増加させた。そして、野生型RSV は、10の大きなサブゲノムmRNAをコードするけれども、Ｄ46／1024 CATアンチゲノムから予測される組換えウイルスは、11番目のmRNAとしてCAT 遺伝子をコードするであろう。この構築の戦略を図２に示す。

上記のような、cDNAコード・アンチゲノムRNA からの感染性RSVの製造は、ウイルスRNA 複製及び転写に必要かつ十分である。アンチゲノムRNA 又はＮ，Ｐ，Ｌ又はＭ２（ORF1）プロテインを別々にコードする５つのcDNAの HEp−２細胞内での同時発現を含んでいた。cDNA発現は、MVA 株に基づくワクシニア−Ｔ７組換えウイルスにより供給されるＴ７ RNAポリメラーゼにより駆動された。 MVA−Ｔ７組換えウイルスは、継代培養の間に広範な細胞病原性を引き起こすために十分な感染性子孫を作り出し、そしてそれ故、シトシン・アラビノシド（cytosine arabinoside）、ワクシニア・ウイルス複製のインヒビターは、トランスフェクションの24時間後に添加され、そして最初の６の継代の間、維持された。

２つのアンチゲノムcDNA：Ｄ46 cDNA 及びＤ46／1024 CAT cDNAを、RSV の回収についてテストした。各々が、感染性組換えRSV を作り出した。Ｄ46／1024 CAT組換えウイルスにより感染された細胞は、豊富なレベルのCAT 酵素を発現した。各ウイルスについて、トランスフェクション上清を、新鮮細胞に継代し、そして全部で８つの逐次的継代を、５〜６日間間隔で、そして 0.1PFU 未満／細胞の感染多重度において行った。

Ｄ46／1024 CATゲノム内のCAT 配列を、RSV GSとGEシグナルにより隣接させ、そしてこれ故、追加の、別個の、ポリアデニル化mRNAとして発現されるはずである。この予想mRNAの存在は、第８継代におけるＤ46／1024 CATウイルス又はＤ46ウイルスにより感染された細胞からのRNA のノーガン・ブロット・ハイブリダイゼーションによりテストされた。ネガティブ−センス CAT−特異的リボプローブ（ribo probe）とのハイブリダイゼーションは、ポリ（Ａ）を含まない735 ヌクレオチドを含むであろう。予想CAT mRNAであるための適切なサイズを有する大きなバンドを検出した。この種は、オリゴ（dT）ラテックス粒子により完全に保持されたものであり、これは、それがポリアデニル化されていたことを示していた。いくつかの場合においては、僅かに大きな CAT−特異的種であって、Ｇ−CATリードスルー（resd through）mRNAであるための適切なサイズを有するものが、検出された。Ｄ46／1024 CATウイルスは、細胞内RNAの調製のために使用された感染前の低感染多重度における８の継代に供されていた。CAT 遺伝子が欠失に供された場合に生じたかもしれないような、CAT mRNAのより短い形状の証拠は、全く存在しなかった。

複製ブロットを、CAT, sH,Ｇ又はＦ遺伝子に特異的なネガティブ−センス・リボプローブとハイブリダイズさせた。後者の２つの遺伝子は、挿入されたCAT 遺伝子に隣接している。これらのブロットは、サブゲノムSH, Ｇ及びＦ mRNA の発現は、２つのウイルスについて類似していることを示した。ホスホイマジェリー（Phospho imagery)を、Ｄ46／1024 CATとＤ46について３つのRSV mRNAバンドのそれぞれにおけるハイブリダイズした放射能の量を比較するために使用した。Ｄ46／1024 CATとＤ46の間の放射能の比は、各mRNAについて測定された：SH, 0.77；Ｇ，0.87；及びＦ，0.78。１からの逸脱は、たぶん、僅かに少ないRNA がＤ46／1024 CAT対Ｄ46についてロードされることを示している。但し、mRNA蓄積の全体レベルがＤ46／1024 CAT RSVについて僅かに小さい可能性もある。上記３つの比が同様であることの立証は、上記mRNAのそれぞれの発現レベルが、Ｄ46／1024 CAT対Ｄ46についてほぼ同一であることを確信させる。このこと、Ｇ遺伝子とＦ遺伝子の間のCAT 遺伝子の挿入は、いずれの遺伝子の転写レベルにも激烈に影響を及ぼさなかった。

ウイルス性タンパク質合成を特徴付けるために、感染した HEp−２細胞を、〔³⁵Ｓ〕×チオニンで標識付けし、そして細胞溶解物を、標識された抗原の回収が本質的に完全である条件下で、直接的又は免疫沈降後のいずれかにおいてPAGEにより分析した。精製RSV に対して生じたウサギ抗血清を用いた沈殿は、Ｄ46／1024 CATとＤ46ウイルスの両方が、同様量の主要ウイルス性タンパク質Ｆ₁,Ｎ，Ｐ，Ｍ及びＭ２を発現したことを示した。同様レベルのＭ２タンパク質が各ウイルスについて回収されたことは、注目に値する。なぜなら、その遺伝子は、挿入されたCAT 遺伝子の下流にあるからである。上記挿入の直下流に位置する遺伝子によりコードされる、Ｆプロテインの蓄積をも、３つの抗−Ｆモノクローナル抗体の混合物による免疫沈降により調べた。類似のレベルのＦ₁ サブユニットが各ウイルスについて回収された。上述の主要ウイルス性タンパク質のPhosphrimagery分析を、いくつかの独立した実験について行い、そしていくつかのサンプル〜サンプル変動があるが全体として、上記２つのウイルスが、回収されたタンパク質のレベルに基づいて区別されることができなかったことを示した。抗−CAT 抗体を用いた沈殿は、Ｄ46ウイルスについてではなくＤ46／1024 CATについての単一種を回収した。全ての標識されたタンパク質の分析は、Ｎ，Ｐ及びＭタンパク質が免疫沈降によらず検出されることができたこと（但し、後者の検出は、細胞種とのその同時移動により複雑なものにされた）を示し、そして上記２つのウイルスが同様のパターンをもたらすことを確信させた。CAT タンパク質の位置に対応する位置は、独立実験のphosphorimagery により確認されたとき、Ｄ46の放射能に比較して、Ｄ46／1024 CATパターン内により多くの放射能を含んでいた。これは、CAT タンパク質が沈降によらず全ての標識されたタンパク質の中から検出されることができたことを示唆していた。但し、この立証は、非感染及びＤ46感染パターン内の同時移動性バックグラウンドの存在により複雑にされた。

RT−PCR を、組換えRSV のゲノムの予想された位置におけるCAT遺伝子の存在を確認するために使用した。全細胞内RNA を、Ｄ46／1024 CATとＤ46 RSVの両方の継代８の細胞ペレットから単離した。２つのプライマーであって、上記挿入部位、RSV 5611−5616位における StuＩ制限エンドヌクレアーゼ部位、に隣接するものを選んだ：上流ポジティブ−センス・プライマーは5412−5429位に対応し、そして下流ネガティブ−センス・プライマーは、5730−5711位に対応した。上記ポジティブ−センス・プライマーを、上記PT行程のために使用し、そして両プライマーを、上記PCR に含ませた。

Ｄ46ウイルスのRT−PCR は、追加の外来配列を伴わずにＧ／Ｆ遺伝子接点を提示する。
318 ヌクレオチドの予想断片に対応した単一の産物を作り出した。Ｄ46／1024 CATウイルスRNA の分析は、挿入されたCAT 転写カセットを含むＧ／Ｆ遺伝子接点を提示する、予想1079ヌクレオチド断片とその電気泳動易動度がよく一致する単一の産物を作り出した。後者のPCR は、単一の大きなバンドを作り出し；検出可能なより小さな産物の非存在は、組換えゲノムの集団が、この領域内に欠失をもつ多数の分子を含んでいなかったことを示した。PCR 分析が、PT行程を伴わずに、Ｄ46／1024 CATウイルスRNA上で行われたとき、バンドは全く見られず、その分析はRNA に特異的であったことを確認させた。従って、RT−PCR 分析は、Ｄ46／1024 CAT組換えウイルスのゲノムRNA 内での予想位置における予想された長さをもつ挿入物の存在を確信させた。

酵素発現を、CAT 遺伝子の安定性を計測するために使用した。
第３から始まる全ての継代からの細胞ペレットをCAT 発現についてテストした。ウイルスＤ46／1024 CATについては、上記アッセイの全てが、〔¹⁴Ｃ〕標識クロラムフェニコールのアセチル化型への変換を示した。発現安定性を調べるために、それぞれ、３又は８継代からの20又は25の個々のプラークからのウイルスを、CAT 発現について分析した。全てのサンプルが陽性であり、そしてCAT の発現レベルは、等アリコートの細胞溶解物のアッセイにより判定されるように、８継代からの25単離物のそれぞれについて、同様であった。これは、各単離物によりコードされたCAT タンパク質の活性が、突然変異により減じられずに残っていたことを示した。

プラーク形態学及びサイズを決定するために、第２継代から始まり、各継代段階から収穫した培地上清の１／８（すなわち 0.5ml）を、５〜７日間メチルセルロース重層下でインキュベートされた６−ウェル・プレート内で新鮮 HEp−２細胞を感染させるために使用した。次に、これらの細胞を固定し、そしてRSV Ｆプロテインに対するモノクローナル抗体、その後の西洋ワサビ・ペルオキシダーゼに結合された第２抗体とのインキュベーションにより染色した。初期には、cDNA Ｄ46から作られた組換えRSV は、インビトロにおける温度範囲にわたるプラーク形成の効率の点で、並びに事前に非感染となっているチンパンジーの呼吸管内に接種されるとき複製し、かつ、疾患を引き起こす能力の点で、天然の野生型RSV 単離物とは区別することができなかった。従って、Ｄ46組換えRSV は、有害な野生型株であると考えられた。Ｄ46及びＤ46／1024 CAT組換えウイルスにより作られたプラークを、抗体染色により比較した。プラーク形態学は、上記２つのウイルスについて酷似していた。但し、CAT 含有組換えプラークの平均直径は、各ウイルスについての30のランダムに選ばれたプラークの計測に基づいて、Ｄ46ウイルスの直径の90％であった。

Ｄ46及びＤ46／1024 CATウイルスの組織培養における複製の効率を、１段階の成長サイクルにおいて比較した。３連の細胞単層を、いずれかのウイルスで感染させ、そしてサンプルを、12時間の間隔において採取し、そしてプラーク・アッセイにより定量した。上記結果は、Ｄ46に対するＤ46／1024 CATウイルスの製造が、遅延され、そして20倍低い最大タイターが達成されたことを示した。

上記結果は、外来遺伝子、この場合、CAT 遺伝子を発現する組換えヘルパー非依存性RSV を構築することができることを示す。組換えRSV は、CAT タンパク質をコードする予想ポリアデニル化サブゲノムmRNAの発現を指令し、このタンパク質は、酵素アッセイにより、並びにラジオイムノ沈殿により検出される。他の例は、同一CAT部位に挿入されたルシフェラーゼ遺伝子をもつ、又はSH遺伝子とＧ遺伝子の間に挿入されたCAT 又はルシフェラーゼ遺伝子をもつRSV組換え体を作り出した。これらのウイルスも減じられた成長を示す。一方、回収された多数の野生型組換えウイルスは、減ぜられることのない成長を示す。
これは、この減ぜられた成長が、事実、そのゲノム内のどこかの偶然の突然変異によるよりもむしろ挿入された遺伝子と関係することを示している。組換えRSV 内への外来遺伝子の挿入は、その複製レベルを減少させ、そしてインビトロにおける継代の間に安定であったという事実は、ワクチン用途のために減弱を行うさらに他の手段を提供することを示唆する。そして、これらの結果は、本明細書中に記載する方法論が、成長において制限されるウイルスを回収することができることを示している。

これらの結果は、非セグメント化ネガティブ−ストランド・ウイルスの遺伝子発現の戦略の利点、すなわち、外来コーディング配列が、別個のmRNAとして発現される別個の転写カセットとして導入されることができることをも例示する。これらの結果は、RSV がCAT遺伝子の場合において、762 ヌクレオチドのゲノム長の、全部で15,984ヌクレオチド（野生型RSV の長さの1.05倍）への増加に耐えることができることをも示す。首尾よく回収されたルシフェラーゼ遺伝子は、ほとんど３倍の長さである。

ウイルス性RNA 依存性RNA ポリメラーゼは、校正及び修復メカニズムの非存在のために誤りを生じ易い性質をもつことが知られている。RNA ウイルス・ゲノムにおいては、突然変異の頻度は、平均10^-4〜10^-5／部位程の高さであると推定される（Holland et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 176 : 1-20 (1992)及びその中の参考文献）。ここで製造された組換えＤ46／1024 CAT RSVの場合においては、外来遺伝子の正しい発現は、ウイルス複製に無関係であろうし、そして突然変異を自由に蓄積するであろう。本明細書中に記載する継代は、0.1PFU／細胞未満の感染多重度を含み、そして各継代レベルの経過時間は、多ラウンドの感染が含まれていたことを示した。RSV 感染組織培養細胞からの感染性ウイルスの収率は低いけれども、細胞内巨大分子合成は、強く、そして感染性ウイルスの乏しい収率は、低いレベルのRNA 複製よりもパッケージングにおいて効率的でない段階を提示するようである。従って、８つの逐次的継代を通じてのCAT の維持は、多ラウンドのRNA 複製を含んでいた。必須でないCAT 遺伝子が無傷で残り、そして第８継代においてテストされた25の単離物のそれぞれにおいて完全に機能的なタンパク質をコードすることができるように残ったことは、驚ろくべきことであった。また、８継代から単離されたRNA のRT−PCR 分析は、CAT遺伝子内の欠失を検出しなかった。

２つのRSV 抗原サブグループ間の抗原性の差異がＧグリコプロテイン内に在ることを主な原因として、組換えRSV は、追加の遺伝子として異種サブグループのＧプロテインを発現するように構築されて、２価のワクチンをもたらす。いくつかの他の呼吸器ウイルスのエンベロープ・タンパク質遺伝子、例えば、ヒト・パラインフルエンザ３ウイルスも、組換えRSV による発現のために挿入されることができる。他の用途は、感染性RSV の免疫原性を高めるための、免疫モジュレーター、例えば、インターロイキン６の同時発現を含む。他の使用、例えば、遺伝子治療のためのベクターとしての本明細書中に記載するような修飾RSV の使用も、提供される。

これまで、本発明を、理解を容易にするために説明及び完治例によっていくぶん詳細に説明してきたけれども、添付の請求の範囲内で特定の変更及び修正を行うことができることは自明であろう。

図１Ａと１Ｂは、RSV アンチゲノムRNA をコードするcDNAの構築を示し、ここで、図１Ａは、（一定の比率ではなく）上記cDNAとエードされたアンチゲノムRNA の構造を示す。このアンチゲノムのダイアグラムは、以下の特徴：Ｔ７プロモーターにより与えられる５’末端非ウイルスＧトリプレット、（その長さに１ヌクレオチドを加える）1099位、1139位、5611位、及び7559位（新たな制限部位の第１塩基を参照する番号付け）における４つの配列マーカー、リポゾーム及びタンデムＴ７ターミネーター、及びリポゾーム解裂によるその３’末端に帰される単一の非ウイルス３’−リン酸化Ｕ残基（解裂部位を矢印で示す。）を含む。組合されて完全なアンチゲノムを提示するクローン化されたcDNAセグメントも示される。ボックスは、BamHＩ部位の除去を示し、アセンブリーを容易にした修飾：天然のBamHＩ− SacＩ断片（BamHＩ部位は、下線を引かれたポジティブ・センス内の上の線内に示される。）は、 PCR−生成 BglII− SacＩ断片(BglII部位は、下線を引かれた下の線内に示され；その４−ヌクレオチド付着末端〔イタリック体で示す〕はBamHＩのものと互換性である。）で置き替えられた。これは、アミノ酸レベルにおいてはサイレントである単一ヌクレオチド（下線を引かれた中央の線）をもたらした。図１Ｂは、cDNAコード・アンチゲノムRNA 内に含まれる配列マーカーを示し、ここで、配列は、ポジティブ・センスであり、そしてそのリーダー領域補足物の第１ヌクレオチドに対して１として番号付けられ；それぞれ、サブグループＡとＢを代表する株Ａ２と18537 の間の同一性は、点で示され；そのcDNA内の制限部位を表す配列は、下線を引かれ；遺伝子開始（gene-start (GS））と遺伝子終結（gene-end (GE））転写シグナルをボックスで囲み；1141位のＮ翻訳オープン・リーディング・フレームの開始コドンをイタリック体にし、そしてそれらの配列マーカーを各配列の下に示す。一番上の配列においては、単一のＣ残基は、NSII−Ｎ遺伝子内領域内に AflII部位を創り出すために1099位に挿入され、そしてＮ翻訳オープン・リーディング・フレームの直上流の1139位と1140位にあるAGは、新たな NcoＩ部位を創り出すためにCCで置き替えられた。中央の配列においては、それぞれ、5612位と5616位におけるＧとＵの置換は、Ｇ−Ｆ遺伝子内領域内に新たな StuＩ部位を創り出した。一番下の配列においては、7560位におけるＣ置換は、Ｆ−Ｍ２遺伝子内領域内に新たな SphＩ部位を創り出した。図２は、RSV 転写シグナルに隣接されるCAT ORF を含むRSV アンチゲノムをコードするＤ46／1024 CAT cDNA の構築を示す（一定比率によらず、RSV 特異的セグメントが塗りつぶされたボックスとして、そしてCAT 配列が白抜きボックスとして示される）。CAT 遺伝子転写カセットの源は、 RSV−CAT ミニゲノムcDNA6196であった（上のダイアグラム）。この RSV−CAT ミニゲノムは、リーダー領域、遺伝子−開始（GS）及び遺伝子−終結（GE）シグナル、非コーディング（NC）RSV 遺伝子配列、及びCAT ORF を含み、 XmaＩ制限エンドヌクレアーゼ部位は、GSシグナルに先行し、そしてGEシグナルの後にある。これらの要素のヌクレオチド長を示し、そして上記 XmaＩ部位の周りの配列（ポジティブ−センス）を、上記ダイアグラムの上に示す。８−ヌクレオチド XmaＩリンカーを、その親プラスミドＤ46の StuＩ部位内に挿入してプラスミドＤ46／1024を構築した。プラスミド6196の XmaＩ− XmaＩ断片を、このプラスミドＤ46／1024内に挿入してプラスミドＤ46／1024 CATを構築した。Ｄ46 cDNA によりコードされたRNA を一番下に示す、これは、Ｔ７プロモーターにより与えられた３つの５’末端非ウイルス性Ｇ残基及びハンマーヘッド・リボゾームの解裂により与えられる３’−末端リン酸化Ｕ残基を含み；そのヌクレオチド長は、上記非ウイルス性ヌクレオチドを含まない。上記Ｌ遺伝子は、遺伝子重複を示すためにオフセットされている。

Claims

ヌクレオキャプシド（Ｎ）プロテインをコードするポリヌクレオチド、ヌクレオキャプシド・ホスホプロテイン（Ｐ）をコードするポリヌクレオチド、大きなポリメラーゼ・タンパク質（Ｌ）をコードするポリヌクレオチド、及びＭ２（ORF1）RNA ポリメラーゼ延長因子をコードするポリヌクレオチドを含む組換えRSV ゲノム又はアンチゲノム；ヌクレオキャプシド（Ｎ）プロテイン；ヌクレオキャプシド・ホスホプロテイン（Ｐ）；大きな（Ｌ）ポリメラーゼ・タンパク質；並びにRNA ポリメラーゼ延長因子を含む感染自己複製性RSV 粒子であって、当該組換えRSV ゲノム又はアンチゲノムは、上記Ｌタンパク質内の521位にフェニルアラニンからロイシンへのアミノ酸の変更をコードする突然変異を含む前記RSV 粒子。
感染性自己複製性RSV をコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子から当該感染性自己複製性RSV 粒子を製造する方法であって：
細胞内又は無細胞溶解物中で、ヌクレオキャプシド（Ｎ）プロテインをコードするポリヌクレオチド、ヌクレオキャプシド・ホスホプロテイン（Ｐ）をコードするポリヌクレオチド、大きなポリメラーゼ・タンパク質（Ｌ）をコードし、かつ、上記Ｌタンパク質内の521位にフェニルアラニンからロイシンへのアミノ酸の変更をコードする突然変異を含むポリヌクレオチド、及びＭ２（ORF1）RNA ポリメラーゼ延長因子をコードするポリヌクレオチドを含むRSV ゲノム又はアンチゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター、並びにＮ，Ｐ，Ｌ及びRNA ポリメラーゼ延長因子タンパク質をコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子を含む１以上の発現ベクターを同時発現させ、それにより感染性自己複製性RSV 粒子を製造する、
ことを含む前記方法。
ヌクレオキャプシド（Ｎ）プロテインをコードするポリヌクレオチド、ヌクレオキャプシド・ホスホプロテイン（Ｐ）をコードするポリヌクレオチド、大きなポリメラーゼ・タンパク質（Ｌ）をコードし、かつ、上記Ｌタンパク質内の521位にフェニルアラニンからロイシンへのアミノ酸の変更をコードする突然変異を含むポリヌクレオチド、及びＭ２（ORF1）RNA ポリメラーゼ延長因子をコードするポリヌクレオチドを含むRSV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター、並びにRSV のＮ，Ｐ，Ｌ及びRNA ポリメラーゼ延長因子タンパク質をコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子を含む１以上の発現ベクターを含み、それにより発現の間に、上記RSV ゲノム又はアンチゲノム並びにＮ，Ｐ，Ｌ及びポリメラーゼ延長因子タンパク質が併合されて感染性自己複製性RSV 粒子が作り出される、細胞又は無細胞溶解物。
哺乳動物細胞内又はインビトロにおいて作用しうる作用可能な状態で連結された転写プロモーター；ヌクレオキャプシド（Ｎ）プロテインをコードするポリヌクレオチド、ヌクレオキャプシド・ホスホプロテイン（Ｐ）をコードし、かつ、上記Ｌタンパク質内の521位にフェニルアラニンからロイシンへのアミノ酸の変更をコードする突然変異を含むポリヌクレオチド、大きなポリメラーゼ・タンパク質（Ｌ）をコードするポリヌクレオチド、及びＭ２（ORF1）RNA ポリメラーゼ延長因子をコードするポリヌクレオチドを含むRSV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列；並びに転写ターミネーターを含む単離ポリヌクレオチド分子。
RSV ヌクレオキャプシド（Ｎ）プロテイン、ヌクレオキャプシド・ホスホプロテイン（Ｐ）、大きなポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質をコードし、かつ、当該Ｌタンパク質内の521位にフェニルアラニンからロイシンへのアミノ酸の変更をコードし、かつ、RNA ポリメラーゼ延長因子（Ｍ２（ORF1））タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド分子。
cDNA分子である、請求項５に記載の単離ポリヌクレオチド。
哺乳動物細胞内でのポリヌクレオチドの複製、及び複製性ウイルス・ヌクレオキャプシド粒子内への当該ポリヌクレオチドのパッケージングのためのRSV の３’リーダー及び５’トレイラー・シス作用性シグナルを提供するポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５又は６に記載の単離ポリヌクレオチド。