JP2008086296A - 新規蛍光標識核酸 - Google Patents
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Abstract
低分子の核酸を、PCR法にみられるような酵素を利用することなく検出可能であって、しかも、しかも、例えばマイクロRNAとその前駆体等にみられる極めて類似する核酸分子であっても識別でき、目的核酸分子を選択的に検出することを可能にするための手段を提供する。
【課題解決手段】
検出対象核酸分子と塩基対を形成する塩基配列を有するループ領域と、ステム領域を有する核酸分子であって、ステム領域がループ領域の両側にあって、互いに相補の塩基配列を有し、かつ、一方のステム領域の分子末端塩基が核酸塩基の近接によって消光する蛍光残基を有するステム・ループ構造を形成する蛍光標識核酸分子を蛍光プローブとして使用する。
【選択図】なし
Description
最も広く利用されているRNA検出法はRT-PCR法であり、鋳型となるRNAに相補的な配列を有するDNAをプライマーとして逆転写反応を行った後にPCR反応を行い、cDNAを特異的に増幅する。この手法のメリットは、少ないRNA試料から増幅過程を経て、特異的に核酸分子を検出することができる点である。
このようなin situ ハイブリダイゼーション法に用いる核酸分子検出技術としてはMolecular Beacon法が知られており(非特許文献1参照)、該技術は1996年にTyagiらによって開発されたものである。
マイクロRNAの検出法に関しては、まだ研究がスタートしたばかりであり、確立されている技術も少ない。迅速、簡便にマイクロRNAの検出を行う技術が確立されば、マイクロRNAの機能解析だけではなく、診断薬の分野でも利用される可能性が高い。
Nature Biotechnology 1996Mar;14(3);303-308
そこで、本発明者は鋭意研究の結果、Molecular Beacon法を改良し、塩基対形成に基づいて蛍光色素が消光する現象を利用し、前駆体マイクロRNAとは塩基対を形成して消光するが、成熟マイクロRNAとは塩基対を形成しないことにより蛍光を生じる核酸分子を設計した。そして、これを蛍光プローブとして用いることにより、成熟マイクロRNAとその前駆体とを有効に識別でき、成熟マイクロRNAのみを検出できることを見いだした。また、さらに、この手段が単に成熟マイクロRNAのみでなく、広く標的核酸分子の選択的検出に適用可能であることを確信し、本発明を完成させるに至ったものである。すなわち、本発明は以下のとおりである。
(2)蛍光残基を有するステム領域の末端塩基が、相補の塩基配列の末端から2塩基以内に配置されたものであることを特徴とする、上記(1)に記載の蛍光標識核酸分子。
(3)蛍光残基を有する上記末端塩基が、検出対象核酸分子の塩基配列を含む核酸分子における、当該塩基配列以外の塩基配列中の塩基と塩基対を形成することを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の蛍光標識核酸分子。
(4)検出対象核酸分子が成熟体であり、該検出対象核酸分子の塩基配列を含む核酸分子がその前駆体であることを特徴とする、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の蛍光標識核酸分子。
(5)上記成熟体が,マイクロRNA、siRNA、tRNA、snRNA、mRNA、又はノンコーディングRNAであることを特徴とする、上記(4)に記載の蛍光標識核酸分子。
(6)蛍光標識核酸分子が、DNA、RNA、PNA、BNA、LNA、HNA又はモルホリノ化オリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか記載の蛍光標識核酸分子。
(7)蛍光標識核酸分子が、DNAおよびRNAの構成ヌクレオチド以外の,検出対象核酸分子中のヌクレオチドと塩基対を形成し得るヌクレオチド類似体により置換されていることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の蛍光標識核酸分子。
(8)上記類似体中の対応塩基部分が、イノシン、2−アミノプリン、フェノキサジン、G−Clamp、又はGuanido G−Clampであることを特徴とする、上記(7)に記載の蛍光標識核酸分子。
(9)上記(1)〜(8)のいずれかに記載の蛍光標識核酸分子からなる、蛍光プローブ。
(10)ステム領域において互いに相補の塩基配列が分子内塩基対を形成することにより消光している状態の上記(1)〜(9)いずれかに記載の蛍光標識核酸分子を核酸含有試料と接触させ、該蛍光標識核酸分子が検出対象核酸分子と塩基対を形成する際、蛍光残基を有する末端塩基が検出対象核酸分子と塩基対を形成しないことにより発生する蛍光を検出することを特徴とする、試料中の核酸分子の検出方法。
(11)検出対象核酸分子と塩基対を形成する塩基配列を有するループ領域と、ステム領域を有する核酸分子であって、ステム領域がループ領域の両側にあって、互いに相補の塩基配列を有し、かつ、一方のステム領域の分子末端塩基が核酸塩基の近接によって消光する蛍光残基を有することを特徴とし、該蛍光標識核酸分子が検出対象核酸分子と塩基対を形成する際、蛍光残基を有する末端塩基が検出対象核酸分子と塩基対を形成しないことにより発生する蛍光を検出することを特徴とする、蛍光標識核酸分子。
本発明の蛍光標識核酸分子における上記ループ領域は、検出対象核酸分子と塩基対を形成するように、検出対象核酸分子の塩基配列の少なくとも一部と相補の塩基配列になるように設計する。この相補の塩基配列の塩基数は10〜40塩基が好ましい。
また、上記2つのステム領域は、互いに相補の塩基配列部分を有し、これにより分子内で塩基対を形成し、蛍光標識核酸分子がステム−ループ構造を形成可能なように設計する。
また、蛍光残基を有する塩基は、上記相補の塩基配列の末端あるいは少なくともこの末端塩基から2塩基以内に配置されることが好ましい。2塩基以内であれば、本発明の蛍光標識核酸分子がステム−ループ構造形成のためステム領域が塩基対を形成することにより、標識された蛍光色素が塩基と近接して、消光ないしは減光している状態にすることが可能である。
使用する蛍光色素としては、BODIPY-FL、ピレン、フルオレセイン誘導体、テトラメチルローダミン誘導体、クマリン誘導体、オキサジン誘導体、2−アミノプリン等が挙げられる。
ステム領域における、この標識する塩基を含む類似核酸分子と相補の塩基配列の塩基数は、3〜10塩基が好ましい。また、上記蛍光標識する塩基からループ領域終端までの塩基配列は、類似核酸分子の塩基配列と連続した塩基対を形成するように設計することが好ましい。
Molecular Beacon法(図1A)は、ステム−ループ構造を形成する蛍光標識核酸分子を用いるものであるが、該蛍光標識核酸分子がステム−スープ構造を形成する場合、ステム領域末端に標識した蛍光色素(FL)は、他方のステム領域末端の消光分子(Q)により消光状態にある。試料中の前駆体RNAからプロッセッシングされた成熟RNAを検出する場合、成熟RNAと相補の塩基配列を有するループ領域と成熟RNAとがハイブリダイズすることにより、蛍光色素(FL)と、これを消光するための消光分子(Q)が離間して蛍光を発生することで、成熟RNAを検出することができる。しかし、前駆体RNAが同時に存在する場合、前駆体RNAは成熟RNAの塩基配列を有するため、上記蛍光標識核酸分子は、前駆体RNAともハイブリダイズし、蛍光を発生してしまう。
これに対して、Molecular Spotter法(図1B)によれば、本発明の蛍光標識核酸分子がステム−スープ構造を形成する場合、ステム領域末端に標識した蛍光色素(FL)は、一方のステム領域の蛍光標識した塩基と他方のステム領域の塩基とが塩基対を形成し、ステム領域末端に標識した蛍光色素(FL)は、他方のステム領域における蛍光標識を消光する塩基(G)と近接することにより、消光している。一方、試料中に成熟RNAを検出する場合においては、成熟RNAと相補の塩基配列を有するループ領域と成熟RNAとがハイブリダイズすることにより、蛍光色素(FL)と、これを消光するための塩基(G)が離間して蛍光を発生する。他方、試料中に成熟RNAとその前駆体RNAが共存していても、本発明の蛍光標識核酸分子は、前駆体RNAにおける成熟RNAの塩基配列以外の塩基配列と相補塩基配列を有し、蛍光標識された塩基は前駆体RNAの塩基(G)と塩基対を形成することにより、蛍光標識は塩基(G)と近接し、蛍光の発生は抑制される。したがって、本発明の蛍光標識核酸分子を用いることにより、成熟RNAとその前駆体RNAを識別し、成熟RNAのみを検出することが可能となる。
慢性骨髄性白血病では、染色体転座によって生じたBCR遺伝子とABL遺伝子のキメラ遺伝子BCR-ABLが原因となって発症することが知られている。キメラ遺伝子には大別してb2a2タイプとb3a2タイプがあり、後者の方が頻度が高い。また、b2a2タイプの患者とb3a2タイプの患者では血小板数が異なるなどの症状に違いがある。キメラ遺伝子を簡便に区別して検出できれば白血病の診断に役立つ。しかし、正常型ABL遺伝子であるa1a2型、白血病b2a2型および白血病b3a2型は、配列が非常に類似しているため、選択的に検出することは困難であったものである。
一方、本発明の蛍光標識核酸分子を構成する核酸の形態としてはDNA、RNAが挙げられるが、さらに、塩基配列特異性が高く、また酵素的安定性が向上した修飾核酸の形態であってもよい。これらの例としてはPNA、BNA、LNA、HNA又はモルホリノ化オリゴヌクレオチド等を挙げることができる。
また、本発明の蛍光標識核酸分子は、DNA、RNAの構成ヌクレオチド以外の、検出対象核酸分子中のヌクレオチドと塩基対を形成し得るヌクレオチド類似体により置換されていてもよい。
このうち、前者については、糖の環構造が、フラノース環、ピラノース環、またはリボース環を含む複環式であって、これらの糖骨格上の水酸基が、3’−オキシ、2’−メトキシ、2’−フルオロ、2’−Oアルキル、又はモルホリノ基等に変換されたものが挙げられる。
これらのヌクレオチド類似体により置換された、蛍光標識核酸分子は、塩基配列特異性が向上し、安定した塩基対を形成する。
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例により限定されるものではない。
配列番号1
配列名:miR133(d)(miR133等価体)
配列:5'- TTGGTCCCCTTCAACCAGCTGT -3'
配列番号2
配列名:Pre-miR133(d)(Pre-miR133等価体)
配列:5'- GGATTTGGTCCCCTTCAACCAGCTGTAGCT -3'
配列番号3
配列名:miR21(d) (miR21等価体)
配列:5'- TAGCTTATCAGACTGATGTTGA -3'
配列番号4
配列名:Pre-miR21(d)
配列:5'- GGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGACTGT -3'
(以上の合成DNAは北海道システムサイエンスより購入した。)
配列番号5
配列名:MSPrb_miR133S4
配列:5'- GGATACAGCATGGTTGAAGGGGACCAAATCCX -3'
ここで、XはBODIPY-FL
配列番号6
配列名:MSPrb_miR133S6
配列:5'- GGATTTACAGCATGGTTGAAGGGGACCAAATCCX -3'
ここで、XはBODIPY-FL
配列番号7
配列名:MSPrb_miR133S8
配列:5'- GGATTTGGACAGCATGGTTGAAGGGGACCAAATCCX -3'
ここで、XはBODIPY-FL
配列番号8
配列名:MSPrb_miR21S4
配列:5'- GGGTCAACATCAGTCTGAATAAGCTACCCX -3'
ここで、XはBODIPY-FL
(以上の合成DNAは、株式会社日本バイオサービスより購入した。)
c)10Xハイブリ溶液の組成;
100 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 M NaCl, 100 mM MgCl2(最終濃度;10 mM Tris-HCl (pH 7.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2)
microRNA-133(d)の検出
100μM濃度の配列番号5に示す蛍光プローブDNA(MSPrb_miR133S4)溶液1 μl、100μM濃度の配列番号1に示す成熟miR133等価体(miR133(d))溶液1μl、以下の組成の10Xハイブリ溶液10μlおよび純水(88μl)を4°Cにて混合し、UVトランスイルミネーター(ULTRA-LUM社)にてUV光を照射しつつ、デジタルカメラにて撮影した。
一方、上記配列番号1に示す標的の成熟miR133等価体(miR133(d))溶液1μlに代えて、同濃度の配列番号2に示す、miR133前駆体等価体(Pre-miR133(d))溶液1μlを用いて同様の実験を行った。また、さらに蛍光プローブDNAのみ使用し、成熟miR133等価体(miR133(d))およびその前駆体等価体(Pre-miR133(d))溶液を加えない場合の実験も行った。
結果を図3に示す。
蛍光プローブと標的核酸分子とのハイブリダイズに基く蛍光の検出
100 μM濃度の配列番号5に示す蛍光プローブDNA(MSPrb_miR133S4)溶液1 μl、100
μM濃度の配列番号1に示す標的の成熟miR133等価体(miR133(d))溶液1μl、10Xハイブリ溶液1μl、純水7μlおよび、10Xローディング緩衝液を4°Cにて混合し、12% アクリルアミドゲル(非変成条件)で泳動した。泳動緩衝液は、1XTBEを用い、4°Cで電気泳動を行った。蛍光イメージアナライザー(Molecular Dynamics社)を用い、電気泳動後のイメージを取り込んだ。イメージ取り込み後のアクリルアミドゲルをMupid-Blue染色試薬(Advance-Bio社)を用いて染色した。
結果を図4に示す。
慢性骨髄性白血病遺伝子の検出
本実施例に係る実験例は、本発明の蛍光プローブを用いて、慢性白血病遺伝子であるB2A2型及びB3A2型のキメラ遺伝子を検出することを目的とする。本実験に使用した標的サンプル及び蛍光プローブの塩基配列を以下に示す。
配列番号9
配列名:A1A2(d)(A1A2遺伝子等価体)
配列:5'- TGTTATCTGGAAGaagcccttcagcggcc -3'
配列番号10
配列名:B2A2(d)(B2A2遺伝子等価体)
配列:5'- ATCAATAAGGAAGaagcccttcagcggcc -3'
配列番号11
配列名:B3A2(d)(B3A2遺伝子等価体)
配列:5'- AAGCAGAGTTCAAaagcccttcagcggcc -3'
配列番号12
配列名:B3A2(d)(B3A2遺伝子等価体)
配列:5'- AAGCAGAGTTCAAaagcccttcagcggcc -3'
以上の合成DNAは北海道システムサイエンスより購入した。
配列番号13
配列名:MSPrb_B3A2
配列:5'- GTTATCTGCTGAAGGGCTTCTTCCAGATAACX -3'
ここで、XはBODIPY-FL
以上の合成DNAは、株式会社日本バイオサービスより購入した。
100 μM濃度の配列番号12に示す蛍光プローブDNA溶液1 μl、100 μM濃度の配列番号9,10,11に示す各標的サンプルDNA溶液1μl、10Xハイブリ溶液(1μl)および純水(7μl)を4°Cにて混合し、UVトランスイルミネーター(ULTRA-LUM社)にてUV光を照射しつつ、デジタルカメラにて撮影した。結果を図5に示す。
図5に示されるように、 正常型遺伝子であるA1A2遺伝子等価体DNAと蛍光プローブを混合した場合には、蛍光がほとんど見られなかった。異常型B2A2遺伝子等価体DNAと蛍光プローブを混合した場合には、弱い蛍光が見られた。異常型B3A2遺伝子等価体DNAと蛍光プローブを混合した場合には、蛍光が得られた。すなわち、正常型遺伝子であるA1A2遺伝子等価体DNAを検出せずに、異常型遺伝子である、B2A2およびB3A2遺伝子等価体DNAを検出することに成功した。
Claims (11)
- 検出対象核酸分子と塩基対を形成する塩基配列を有するループ領域と、ステム領域を有する核酸分子であって、ステム領域がループ領域の両側にあって、互いに相補の塩基配列を有し、かつ、一方のステム領域の分子末端塩基が核酸塩基の近接によって消光する蛍光残基を有することを特徴とする、ステム・ループ構造を形成する蛍光標識核酸分子。
- 蛍光残基を有するステム領域の末端塩基が、相補の塩基配列の末端から2塩基以内に配置されたものであることを特徴とする、請求項1に記載の蛍光標識核酸分子。
- 蛍光残基を有する上記末端塩基が、検出対象核酸分子の塩基配列を含む核酸分子における、当該塩基配列以外の塩基配列中の塩基と塩基対を形成することを特徴とする、請求項1又は2に記載の蛍光標識核酸分子。
- 検出対象核酸分子が成熟体であり、該検出対象核酸分子の塩基配列を含む核酸分子がその前駆体であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の蛍光標識核酸分子。
- 上記成熟体が,マイクロRNA、siRNA、tRNA、snRNA、mRNA、又はノンコーディングRNAであることを特徴とする、請求項4に記載の蛍光標識核酸分子。
- 蛍光標識核酸分子が、DNA、RNA、PNA、BNA、LNA、HNA又はモルホリノ化オリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか記載の蛍光標識核酸分子。
- 蛍光標識核酸分子が、検出対象核酸分子中のヌクレオチドと塩基対を形成するヌクレオチド類似体により置換されていることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の蛍光標識核酸分子。
- 上記ヌクレオチド類似体中の塩基部分が、イノシン、2−アミノプリン、フェノキサジン、G−Clamp、又はGuanido G−Clampであることを特徴とする、請求項7に記載の蛍光標識核酸分子。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の蛍光標識核酸分子からなる、蛍光プローブ。
- ステム領域において互いに相補の塩基配列が分子内塩基対を形成することにより消光している状態の請求項1〜9のいずれかに記載の蛍光標識核酸分子を核酸含有試料と接触させ、該蛍光標識核酸分子が検出対象核酸分子と塩基対を形成する際、蛍光残基を有する末端塩基が検出対象核酸分子と塩基対を形成しないことにより発生する蛍光を検出することを特徴とする、試料中の核酸分子の検出方法。
- 検出対象核酸分子と塩基対を形成する塩基配列を有するループ領域と、ステム領域を有する核酸分子であって、ステム領域がループ領域の両側にあって、互いに相補の塩基配列を有し、かつ、一方のステム領域の分子末端塩基が核酸塩基の近接によって消光する蛍光残基を有することを特徴とし、該蛍光標識核酸分子が検出対象核酸分子と塩基対を形成する際、蛍光残基を有する末端塩基が検出対象核酸分子と塩基対を形成しないことにより発生する蛍光を検出することを特徴とする、蛍光標識核酸分子。
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