ES2959087T3 - PCR avanzado de mancuerna para la detección de isomir - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para la detección de pequeños ARN no codificantes en una muestra utilizando adaptadores estructurados de secuencia específica para la ligación mediante una ARN ligasa de doble hebra con posterior producción y cuantificación de ADNc. La presente invención se refiere además a un kit para llevar a cabo este método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
PCR avanzado de mancuerna para la detección de isomir
La presente invención se refiere a un método para la detección de pequeños ARN no codificantes en una muestra utilizando adaptadores estructurados específicos de secuencia para la ligadura mediante una ARN ligasa de cadena doble con posterior producción y cuantificación de ADNc. La presente invención se refiere además a un kit para llevar a cabo este método.
Antecedentes de la invención
Las regiones del genoma que no codifican proteínas se transcriben ampliamente para producir pequeños ARN no codificantes tales como miARN que desempeñan funciones cruciales en procesos biológicos normales y estados patológicos. Por lo tanto, la diversidad y expresión de estos pequeños ARN no codificantes, como los miARN, pueden utilizarse con fines de diagnóstico.
Los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) son capaces de detectar una inmensa gama de pequeños ARN no codificantes tales como miARN y, por lo tanto, se utilizan principalmente con fines de descubrimiento. Sin embargo, el uso de NGS está relacionado con una mayor variabilidad entre experimentos y entre laboratorios y no puede adaptarse a la mayoría de los laboratorios de diagnóstico debido a sus enormes costes. Sin embargo, n Gs es una herramienta poderosa para crear perfiles de pequeños ARN no codificantes, como los miARN, que pueden usarse para la predicción de enfermedades. Shoza Honda et al. (Nucleic Acids Research, vol. 43, no. 12, 16 de marzo de 2015, páginas 1-12, GB, ISSN: 0305-1048, DOI: 10.1093/nar/gkv218), Zeqi Yu et al. (Talanta, Elsevier, Ámsterdam, NL, vol. 85, n.° 4, 30 de junio de 2011, páginas 1760-1765, ISSN: 0039-9140, D0I:10.1016/J.TALANTA.2011.06.075) y la patente número WO2021/148717 (IPTOMICS OY) divulgan adaptadores de tallo-bucle de 5'.
En vista de lo anterior, existe la necesidad de desarrollar un método ortogonal para la detección y cuantificación de pequeños ARN no codificantes tales como miARN y validar los datos de NGS que puedan usarse en una amplia gama de laboratorios de una manera rentable.
Actualmente se están utilizando dos métodos principales para la detección y cuantificación de miARN. El primer método utiliza una sonda similar a un tallo-bucle que se hibrida con el extremo terminal 3' de los miARN, seguida de una reacción de transcripción inversa (RT) y una detección cuantitativa de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) utilizando un cebador directo, específico de miARN, y un cebador inverso que se hibrida con la sonda (por ejemplo, ensayo clásico de miARN TaqMan). En un segundo método, primero se aplica una reacción de cola poli-A, creando un tramo de adeninas en el extremo terminal 3' de los miARN, seguido de la RT utilizando el cebador oligod(T). Posteriormente, se utiliza un cebador directo específico de miARN junto con un cebador inverso común para la reacción qPCR (por ejemplo, ensayos de LNA de miRCury, etc.).
El problema común de los métodos anteriores es que los cebadores directos específicos de miARN son incapaces de discriminar variaciones de la secuencia en el extremo terminal 5' de los miARN (por ejemplo, adiciones, eliminaciones, mutaciones) y en el extremo terminal 3' de los miARN (por ejemplo, adiciones). Como resultado, los datos finales de secuenciación de ARN procesados no reflejan con precisión la situación biológica subyacente. Por lo tanto, la información específica de isomiR, descubierta por NGS, no puede validarse fielmente mediante los métodos de qPCR actualmente disponibles. Debido a la diversidad de las variantes de miARN en los extremos 3' y 5', un método basado en hibridación tiene, por definición, un bajo potencial para capturar y cuantificar el isomiR exacto de interés.
Por lo tanto, existe una necesidad adicional de desarrollar un método que no sólo permita la detección y cuantificación de los miARN sino también de isomiR de una manera rápida, fiable y precisa. Además, este método debería permitir la detección y cuantificación de los miARN pero también de los isomiR con alta especificidad y sensibilidad y, así, mejorar el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades. Además, existe una necesidad adicional de desarrollar un kit adecuado para el propósito anterior para uso en cualquier hospital/clínica o centro de investigación.
Los presentes inventores han desarrollado un método basado en PCR de mancuerna (PCR DB), que explota la capacidad de una ARN ligasa de cadena doble, particularmente ARN ligasa 2 (Rnl2), para unir específicamente las mellas en una molécula de ARN de cadena doble hibridada. Sólo los adaptadores correctamente hibridados tanto en el extremo terminal 5' como en el 3' de los isomiR permiten la formación del ARN ligado que puede usarse como plantilla para la síntesis de ADNc. Este método es capaz de determinar y cuantificar de manera específica y eficiente la expresión del ARN diana (por ejemplo, miARN), así como de variantes de ARN diana que tienen secuencias terminales específicas (por ejemplo, isomiR). La segunda capa de especificidad la introduce una sonda TaqMan, que puede alinearse con una región de secuencia de ADNc definida por el usuario. El método basado en PCR de mancuerna (PCR DB) desarrollado por los presentes inventores se puede utilizar en cualquier hospital/clínica o centro de investigación y permite el análisis de muestras clínicas de una manera sencilla, rápida, fiable, precisa y rentable. Gracias a este método, se puede mejorar aún más la especificidad y sensibilidad de las pruebas de diagnóstico. También se proporciona un kit adecuado para el propósito anterior.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un adaptador 5' que comprende en el siguiente orden de 5' a 3'
(i) una secuencia de nucleótidos del extremo terminal 5' que comprende de 6 a 15 desoxinucleótidos, en la que dichos 6 a 15 desoxinucleótidos son complementarios inversos de una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, y
(ii) una secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble, en la que al menos 2 nucleótidos en su extremo terminal 3' son ribonucleótidos o ribonucleótidos modificados y en la que la secuencia de nucleótidos está potenciada con nucleótidos bloqueados (LNA).
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un adaptador 3' que comprende en el siguiente orden de 5' a 3'
(i) una secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble, en la que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado y en la que la secuencia de nucleótidos está potenciada con nucleótidos bloqueados (LNA), y
(ii) una secuencia de nucleótidos del extremo terminal 3' que comprende de 6 a 15 desoxinucleótidos, en la que dichos 6 a 15 desoxinucleótidos son complementarios inversos de una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana y en la que el desoxinucleótido del extremo terminal 3' es un desoxinucleótido invertido.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una combinación que comprende
el adaptador 5' de acuerdo con el primer aspecto, y
el adaptador 3' de acuerdo con el segundo aspecto.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método para ligar dos adaptadores a un ARN diana en una muestra que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una composición que comprende un ARN diana desnaturalizado en una muestra, el adaptador 5' renaturalizado de acuerdo con el primer aspecto y el adaptador 3' renaturalizado de acuerdo con el segundo aspecto, en el que el adaptador 5' y el adaptador 3' están hibridados con el ARN diana, y
(ii) ligar el adaptador 5' y el adaptador 3' al ARN diana usando/con una ARN ligasa de cadena doble, produciendo de este modo un producto de ligadura.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método para determinar y/o cuantificar un ARN diana en una muestra que comprende las etapas de:
(i) llevar a cabo el método de acuerdo con el cuarto aspecto,
(ii) transcribir inversamente el producto de ligadura, obteniendo así un producto de ADNc a partir del ARN diana, y (iii) amplificar el ADNc, determinando y/o cuantificando así el ARN diana.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad o afección en un paciente que comprende las etapas de:
(ia) llevar a cabo los métodos de acuerdo con el tercer y/o cuarto aspecto, determinando así la presencia del ARN diana, y
(iia) diagnosticar si el paciente padece la enfermedad o afección basándose en la presencia del ARN diana, o (ib) llevar a cabo los métodos de acuerdo con el tercer y/o cuarto aspecto, cuantificando así el ARN diana,
(iib) comparar el ARN diana cuantificado con una referencia, y
(iiib) diagnosticar si el paciente padece la enfermedad o afección basándose en la comparación.
En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende
el adaptador 5' de acuerdo con el primer aspecto, y
el adaptador 3' de acuerdo con el segundo aspecto, o
la combinación de acuerdo con el tercer aspecto.
Este sumario de la invención no describe necesariamente todas las características de la presente invención. Otras realizaciones resultarán evidentes a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Antes de que la presente invención se describa en detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la técnica.
Preferiblemente, los términos utilizados en el presente documento se definen como se describe en "A multilingual glosary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza). Nada de lo contenido en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a ser anterior a dicha divulgación en virtud de una invención anterior. En caso de conflicto entre las definiciones o enseñanzas de las referencias citadas en el presente documento y las definiciones o enseñanzas citadas en la presente memoria descriptiva, el texto de la presente memoria descriptiva tiene prioridad.
El término "comprende" o variaciones tales como "que comprende" de acuerdo con la presente invención significa la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicado pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros. El término "que consiste esencialmente en" de acuerdo con la presente invención significa la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicados, excluyendo modificaciones u otros números enteros que afectarían o alterarían materialmente el número entero indicado. El término "que consiste esencialmente en" o variaciones tales como "consiste en" de acuerdo con la presente invención significa la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicado y la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.
Los términos "un" y "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique claramente lo contrario en el presente documento o claramente sea contradicho por el contexto.
El término "nucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula orgánica que consiste en un nucleósido y un fosfato. En particular, un nucleótido se compone de tres subunidades de moléculas: una nucleobase, un azúcar de cinco carbonos (ribosa o desoxirribosa) y un grupo fosfato que consta de uno a tres fosfatos. Las cuatro nucleobases del ADN son guanina, adenina, citosina y timina; en el ARN, se utiliza uracilo en lugar de timina. El nucleótido sirve como unidad monomérica de polímeros de ácidos nucleicos, como el ácido desoxirribonucleótido (ADN) o el ácido ribonucleótido (ARN). Por lo tanto, el nucleótido es un bloque de construcción molecular del ADN y el ARN.
El término "nucleósido", como se usa en el presente documento, se refiere a una glicosilamina que puede considerarse como un nucleótido sin un grupo fosfato. Un nucleósido consta simplemente de una nucleobase (también denominada base nitrogenada) y un azúcar de cinco carbonos (ribosa o 2'-desoxirribosa), mientras que un nucleótido está compuesto de una nucleobase, un azúcar de cinco carbonos y uno o más grupos fosfato. En un nucleósido, el carbono anomérico está unido mediante un enlace glicosídico al N9 de una purina o al N1 de una pirimidina.
Los términos "secuencia de nucleótidos" o "polinucleótido" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a polímeros de cadena sencilla y de cadena doble de monómeros de nucleótidos, incluidos, entre otros, 2'-desoxirribonucleótidos (ADN) y ribonucleótidos (ARN) unidos por uniones de enlace fosfodiéster internucleótidos, o análogos de internucleótidos, y contraiones asociados, por ejemplo, H+, NH4+, trialquilamonio, Mg2+, Na+ y similares. Una secuencia de nucleótidos o polinucleótido puede estar compuesta enteramente de desoxirribonucleótidos, enteramente de ribonucleótidos o mezclas quiméricas de los mismos y puede incluir análogos de nucleótidos. Las unidades de monómero de nucleótidos pueden comprender cualquiera de los nucleótidos descritos en el presente documento, incluidos, entre otros, nucleótidos y/o análogos de nucleótidos.
El término "análogo", como se usa en el presente documento, incluye análogos sintéticos que tienen fracciones base modificadas, fracciones de azúcar modificadas y/o fracciones de éster de fosfato modificadas. Los análogos de fosfato generalmente comprenden análogos de fosfato en los que el átomo de fósforo está en el estado de oxidación 5 y uno o más de los átomos de oxígeno se reemplazan con una fracción sin oxígeno, por ejemplo, azufre. Los ejemplos de análogos de fosfato incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, boronofosfatos, incluidos contraiones asociados, por ejemplo, H+, NH4+, Na+. Los ejemplos de análogos de bases incluyen: 2,6-diaminopurina, hipoxantina, pseudouridina, C-5-propino, isocitosina, isoguanina, 2-tiopirimidina. Los ejemplos de análogos de azúcar incluyen: modificaciones 2' o 3' donde la posición 2' o 3' es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, por ejemplo, metoxi, etoxi, aliloxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi y fenoxi, azido, amino o alquilamino, flúor, cloro y bromo.
En una realización, los ribonucleótidos modificados están presentes en/parte de los adaptadores descritos en el presente documento. En una realización preferida, los ribonucleótidos modificados son 2'-o-metil ribonucleótidos.
El término "ARN diana", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ribonucleótidos que se busca detectar. El ARN diana puede obtenerse de cualquier fuente y puede comprender cualquier número de componentes de composición diferentes. Por ejemplo, el ARN diana se aísla de organismos, tejidos, células o fluidos corporales como la sangre. Por ejemplo, el ARN diana abarca ARN no codificante y/o ARN codificante. En particular, el ARN diana es un microARN (miARN) o una isoforma de miARN (una isomiR), un ARN de transferencia (ARNt), un ARN de interferencia pequeño (ARNip) u otro ARN pequeño maduro, y puede comprender variantes, análogos e imitaciones.
Además, se apreciará que el término "ARN diana" puede referirse a la propia molécula diana así como a sustitutos de la misma, por ejemplo, productos de amplificación (por ejemplo, ADNc derivado de la misma) y secuencias nativas. En ciertas realizaciones, el ARN diana es una molécula de miARN o isoforma de miARN (una isomiR). En determinadas realizaciones, el ARN diana carece de una cola poli-A. En determinadas realizaciones, el ARN diana es una molécula de ARN pequeña madura, en particular una molécula de ARN pequeña no codificante (es decir, que tiene una longitud de < 200 ribonucleótidos, por ejemplo, entre 10 y < 200 ribonucleótidos). El ARN diana descrito en el presente documento puede derivarse de cualquier número de fuentes, incluidos, entre otros, humanos y animales. Estas fuentes pueden incluir, entre otras, sangre entera, biopsia de tejido, linfa, médula ósea, líquido amniótico, cabello, piel, semen, agentes de guerra biológica, secreciones anales, secreciones vaginales, transpiración, saliva o hisopos bucales. Sin embargo, también se pueden usar como muestras diversas muestras ambientales (por ejemplo, agrícolas, de agua y de suelo), muestras de investigación en general, muestras purificadas en general, células cultivadas y células lisadas. Se apreciará que los ARN diana pueden aislarse de muestras usando cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, la Estación de preparación de ácido nucleico ABI Prism® 6100 de Applied Biosystems (Life Technologies, Foster City, CA) y la Estación de trabajo automatizada de ácido nucleico ABI Prism® 6700 (Life Technologies, Foster City, CA), el kit de aislamiento de ARN Ambion® mirVanaMC (Life Technologies, Austin, TX) y similares.
En una realización, el ARN diana es cualquier ARN de cadena sencilla (codificante o no codificante) que tiene una fracción fosfato 5' y una fracción hidroxilo 3'. En una realización preferida, el ARN diana es ARN que tiene una longitud de < 200 ribonucleótidos, por ejemplo, entre 10 y < 200 ribonucleótidos. En una realización más preferida, el ARN diana es ARN que tiene una longitud de entre 10 y 100 ribonucleótidos. En una realización aún más preferida, el ARN diana es ARN que tiene una longitud de entre 10 y 50 ribonucleótidos. Dicho ARN es particularmente un ARN no codificante, concretamente un miARN o una isoforma de miARN (una isomiR).
El término "miARN" (la designación "microARN" también es posible), tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ARN de cadena sencilla. El miARN puede ser una molécula de 10 a 50 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos de longitud, sin incluir opcionalmente etiquetas y/o secuencias alargadas (por ejemplo, tramos de biotina).
Los miARN regulan la expresión génica y están codificados por genes de cuyo ADN se transcriben, pero los miARN no se traducen en proteínas (es decir, los miARN son ARN no codificantes). Los genes que codifican los miARN son más largos que las moléculas de miARN maduras procesadas. El miARN se transcribe inicialmente como una molécula precursora más larga (>1000 nucleótidos de longitud) llamada transcripción de miARN primario (pri-miARN). Los primiARN tienen estructuras en horquilla que son procesadas por la enzima Drosha (como parte del complejo de microprocesador). Después del procesamiento de Drosha, los pri-miARN tienen solo entre 60 y 100 nucleótidos de largo y se denominan miARN precursores (pre-miARN). En este punto, el pre-miARN se exporta al citoplasma, donde se encuentra con la enzima Dicer. Dicer corta el miARN en dos, lo que da como resultado cadenas de miARN dúplex. Tradicionalmente, sólo uno de estos brazos de miARN se consideraba importante en la regulación genética: el brazo que está destinado a cargarse en el complejo silenciador inducido por ARN (RISC), y que se produce en una concentración más alta en la célula. Esto a menudo se denomina la cadena "guía" y se designa como miR. El otro brazo se llama el "miARN menor" o "miARN pasajero" y, a menudo, se denomina miR*. Se pensaba que los miARN pasajeros estaban completamente degradados, pero estudios de secuenciación profundos han descubierto que algunos miARN menores persisten y, de hecho, tienen un papel funcional en la regulación génica. Debido a estos desarrollos, la convención de nomenclatura ha cambiado. En lugar del esquema de nombres miR/miR*, se ha adoptado una nomenclatura miR-5p/miR-3p. Según el nuevo sistema, el brazo 5' del miARN siempre se denomina miR-5p y el brazo 3' es miR-3p. La nomenclatura actual es la siguiente: el prefijo "miR" va seguido de un guión y un número, este último indica a menudo el orden de denominación. Por ejemplo, hsa-miR-16 fue nombrado y probablemente descubierto antes de hsa-miR-342. Un "miR-" en mayúscula se refiere a las formas maduras del miARN (por ejemplo, hsa-miR-16-5p y hsa-miR-16-3p), mientras que el "mir-" sin mayúscula se refiere al pre-miARN y al primiARN (por ejemplo, hsa-mir-16) y "MIR" se refiere al gen que los codifica. Sin embargo, como se trata de un cambio reciente, la literatura a menudo se referirá a los nombres originales de miR/miR*. Después del procesamiento, las cadenas de miARN duplicadas se cargan en una proteína Argonauta (AGO) para formar un precursor del RISC. El complejo hace que el dúplex se desenrolle y la cadena de ARN pasajero se descarte, dejando un RISC maduro que transporta el miARN de cadena sencilla maduro. El miARN sigue siendo parte del RISC ya que silencia la expresión de sus genes diana. Si bien esta es la vía canónica para la biogénesis de miARN, se han descubierto muchas otras. Estas incluyen vías independientes de Drosha (como la vía mirtron, la vía derivada de ARNpn y la vía derivada de ARNph) y vías independientes de Dicer (tal como una que depende de AGO para la escisión y otra que depende de tRNasaZ).
El término "miRBase", como se usa en el presente documento, se refiere a un repositorio bien establecido de miARN validados. La miRBase (www.mirbase.org) es una base de datos con capacidad de búsqueda de secuencias y anotaciones de miARN publicadas. Cada entrada en la base de datos de secuencias miRBase representa una porción de horquilla prevista de una transcripción de miARN (denominada mir en la base de datos), con información sobre la ubicación y secuencia de la secuencia de miARN madura (denominada miR). Tanto las secuencias de horquilla como las maduras están disponibles para buscar y explorar, y las entradas también se pueden recuperar por nombre, palabra clave, referencias y anotaciones. Todos los datos de secuencias y anotaciones también están disponibles para descargar. En octubre de 2018, se lanzó la versión 22.1 de miRbase. Esta es la versión actual.
El término "isomiR" (o "isoforma de miARN"), como se usa en el presente documento, se refiere a un miARN que varía ligeramente en secuencia, que resulta de variaciones en el sitio de escisión durante la biogénesis de miARN o por procesos que afectan al miARN maduro después de que se ha producido la biogénesis, tal como la oligouridilación. En particular, la escisión imprecisa de Drosha y Dicer o el recambio de miARN puede dar como resultado miARN que son heterogéneos en longitud y/o secuencia. Los isomiR (isoformas de miARN) se pueden dividir en tres categorías principales: isomiR 3' (recortados o con adición de uno o más nucleótidos en la posición 3'), isomiR 5' (recortados o con adición de uno o más nucleótidos en la posición 5') , e isomiR polimórficos (algunos nucleótidos dentro de la secuencia son diferentes de la secuencia de miARN maduro de tipo silvestre). Se podría imaginar que el aumento de la expresión de variantes de miARN, o isomiR individuales, conduzca a la pérdida o al debilitamiento de la función del correspondiente miARN maduro de tipo silvestre o dé como resultado la regulación de un transcriptoma diferente. Estudios recientes sugieren que los isomiR probablemente desempeñan funciones vitales en una variedad de cánceres, tejidos y tipos de células. Por lo tanto, la detección de miARN e isomiR es absolutamente necesaria para reflejar con precisión la situación biológica subyacente y tomar las decisiones correctas de diagnóstico y tratamiento.
Como se usa en el presente documento, el término "adaptador" se refiere a un polinucleótido que se puede ligar al extremo terminal 5' de un ARN diana (es decir, "adaptador 5'") o al extremo terminal 3' de un a Rn diana (es decir, " Adaptador 3'"). Los nucleótidos del adaptador 5' y del adaptador 3' pueden ser estándar o naturales (es decir, adenosina, guanosina, citidina, timidina y uridina), así como nucleótidos no estándar. Los ejemplos no limitantes de nucleótidos no estándar incluyen inosina, xantosina, isoguanosina, isocitidina, diaminopirimidina y desoxiuridina. Los adaptadores pueden comprender nucleótidos modificados o derivatizados. Los ejemplos no limitantes de modificaciones en las fracciones de ribosa o base incluyen la adición o eliminación de grupos acetilo, grupos amino, grupos carboxilo, grupos carboximetilo, grupos hidroxilo, grupos metilo, grupos fosforilo y grupos tiol. En particular, se incluyen 2'-O-metilo y nucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Los ejemplos adecuados de nucleótidos derivatizados incluyen aquellos con colorantes unidos covalentemente, tales como colorantes fluorescentes o colorantes de inactivación, u otras moléculas tales como biotina, digoxigenina o partículas o microesferas magnéticas. Los adaptadores también pueden comprender análogos de nucleótidos sintéticos tales como morfolinos o ácidos nucleicos peptídicos (PNA). Los enlaces fosfodiéster o enlaces fosfotioato pueden enlazar los nucleótidos o análogos de nucleótidos de los enlazadores.
La longitud del adaptador 5' y 3' puede variar dependiendo, por ejemplo, de la longitud deseada del producto de ligadura y de las características deseadas del adaptador. En general, el adaptador 5' o el adaptador 3' pueden oscilar entre 15 y 60, por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 nucleótidos de longitud.
El adaptador 5' como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos del extremo terminal 5' que comprende de 6 a 15, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 desoxinucleótidos (aleatorios), en los que dichos 6 a 15 desoxinucleótidos (aleatorios) son complementarios inversos de una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana. Además, el adaptador 3' como se describe en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos del extremo terminal 3' que comprende de 6 a 15, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 desoxinucleótidos (aleatorios), en los que dichos 6 a 15 desoxinucleótidos (aleatorios) son complementarios inversos de una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana. El adaptador 5' y el adaptador 3' pueden estar presentes como polinucleótido lineal, por ejemplo, después de la desnaturalización/cuando se desnaturaliza. De esta forma, el adaptador 5' y el adaptador 3' son de cadena sencilla. Esta estructura primaria puede convertirse en una estructura secundaria. En particular, el adaptador 5' y el adaptador 3' son además capaces de formar una estructura de tallo-bucle. Por lo tanto, el adaptador 5' y el adaptador 3' también pueden tener una estructura de tallo-bucle, por ejemplo, después de la renaturalización/cuando se renaturaliza.
Generalmente, el término "estructura de tallo-bucle" se refiere a un patrón que puede ocurrir en el ARN de cadena sencilla. La estructura también se conoce como "horquilla" o "bucle de horquilla". Ocurre cuando dos regiones de la misma cadena, generalmente complementarias en la secuencia de nucleótidos cuando se leen en direcciones opuestas, se emparejan por bases para formar una doble hélice que termina en un bucle desapareado.
En particular, el adaptador 5' y el adaptador 3' que es capaz de formar una estructura de tallo-bucle comprenden una primera secuencia de tallo posicionada en 5' y una segunda secuencia de tallo posicionada en 3' que son complementarias inversamente entre sí. La primera secuencia de tallo y la segunda secuencia de tallo forman la "región de cadena doble" o "tallo de cadena doble" del adaptador de tallo-bucle.
En una realización, el tallo tiene entre 5 y 20, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos de longitud. En una realización preferida, el tallo tiene entre 5 y 10, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud.
Cabe señalar que una porción de un cebador puede estar codificada en el tallo. Como cuestión general, en aquellas realizaciones en las que una porción de un cebador está codificada en el tallo, el tallo puede ser más largo. En aquellas realizaciones en las que una porción de un cebador no está codificada en el tallo, el tallo puede ser más corto.
Como se utiliza en el presente documento, el término "bucle" se refiere a la región de cadena sencilla de la estructura de tallo-bucle. En particular, el bucle está situado entre la primera secuencia de tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia de tallo posicionada en 3'. En otras palabras, el bucle está situado entre las dos cadenas complementarias inversas del tallo y normalmente el bucle comprende nucleótidos de cadena sencilla, aunque también son posibles otros fracciones tales como moléculas de<a>D<n>o ARN modificadas. En una realización, la secuencia de bucle comprende entre 10 y 40 nucleótidos, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos. En una realización preferida, la secuencia de bucle comprende entre 12 y 20 nucleótidos, por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos. Los nucleótidos de la estructura de bucle son preferiblemente desoxinucleótidos, pero también son posibles ribonucleótidos.
Cabe señalar que una porción de un cebador puede codificarse en el bucle. Como cuestión general, en aquellas realizaciones en las que un cebador está codificado en el bucle, el bucle puede ser más largo. En aquellas realizaciones en las que un cebador no está codificado en el bucle, el bucle puede ser más corto.
Además, cabe señalar que el adaptador 5' como se describe en el presente documento comprende una secuencia del extremo terminal 5' que está configurada de manera que forma una protuberancia 5' de cadena sencilla después de la formación de la estructura de tallo-bucle. Además, cabe señalar que el adaptador 3' como se describe en el presente documento comprende una secuencia del extremo terminal 3' que está configurada de manera que forma una protuberancia 3' de cadena sencilla después de la formación de la estructura de tallo-bucle.
El adaptador, por ejemplo, el adaptador 5' y/o el adaptador 3' pueden comprender uno o más nucleótidos de bloqueo. El término "nucleótido de bloqueo", como se usa en el presente documento, se refiere a un nucleótido que comprende una fracción química que previene o minimiza la adición de nucleótidos por una ADN polimerasa. Por ejemplo, al agregar un grupo bloqueante al 3'-OH terminal, el nucleótido ya no puede participar en la formación del enlace fosfodiéster catalizada por la ADN polimerasa. Algunos ejemplos no limitantes incluyen un grupo alquilo, enlazadores no nucleotídicos, fosforotioato, residuos de alcanodiol, p Na , LNA, análogos de nucleótidos que comprenden un grupo 3'-amino en lugar del grupo 3'-OH, análogos de nucleótidos que comprenden un grupo 5'-Oh en lugar del grupo 5'-fosfato, derivados de nucleótidos que carecen de un grupo 3'-OH o biotina. Estos nucleótidos generalmente no son extensibles en cadena. Otros ejemplos de nucleótidos no extensibles que pueden usarse incluyen nucleótidos que tienen fracciones de ribosa modificados. En determinadas realizaciones, los ribonucleótidos pueden servir como nucleótidos no extensibles porque los oligonucleótidos que terminan en ribonucleótidos no pueden extenderse mediante determinadas ADN polimerasas. La ribosa se puede modificar para incluir derivados 3'-desoxi, incluidos aquellos en los que el 3'-hidroxi se reemplaza por un grupo funcional distinto de hidrógeno, por ejemplo, como un grupo azida. En determinadas realizaciones, un nucleótido no extensible comprende un didesoxinucleótido (ddN), por ejemplo, pero sin limitarse a, una didesoxiadenosina (ddA), una didesoxicitosina (ddC), una didesoxiguanosina (ddG), una didesoxitimidina (ddT) o una didesoxiuridina (ddU).
En particular, el adaptador, por ejemplo, el adaptador 5' y/o el adaptador 3' pueden comprender ácidos nucleicos bloqueados (LNA). El término "ácidos nucleicos bloqueados (LNA)", como se usa en el presente documento, se refiere a nucleótidos modificados, específicamente ribonucleótidos, en los que los átomos 2'-O y 4'-C de la ribosa están unidos a través de un puente de metileno. Este puente adicional limita la flexibilidad normalmente asociada con el anillo, esencialmente bloqueando la estructura en una conformación rígida. Estos análogos de ácidos nucleicos también se denominan en algunos círculos "ribonucleótidos inaccesibles". Los nucleótidos de LNA se pueden mezclar con residuos de ADN o ARN en el polinucleótido, hibridando de hecho con ADN o ARN de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick. La naturaleza inflexible de estas moléculas mejora en gran medida la estabilidad de la hibridación. Además, los polinucleótidos que contienen LNA ofrecen un tremendo poder discriminatorio, lo que permite a estas moléculas distinguir entre secuencias diana complementarias de coincidencia exacta y no coincidentes con muy poca dificultad. En una realización, el adaptador 5' y/o el adaptador 3' comprende o comprenden nucleótidos bloqueados, en particular ribonucleótidos. En una realización preferida, la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' del adaptador 5' está o están potenciadas con LNA. En otra realización preferida, la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' del adaptador 3' está o están potenciadas con LNA.
El adaptador 3' puede comprender un desoxinucleótido invertido en 3'. El término "desoxinucleótido invertido", como se usa en el presente documento, se refiere a un desoxinucleótido que crea un enlace 3'-3' y, por lo tanto, evita la síntesis de nucleótidos no deseada desde el extremo terminal 3' del adaptador, por ejemplo, durante la PCR con transcriptasa inversa (RT). Además, el desoxinucleótido invertido en 3' protege la secuencia de la escisión por la exonucleasa 3'. En una realización, el adaptador 3' comprende un desoxinucleótido invertido en 3'. En una realización preferida, el adaptador 3' comprende un desoxinucleótido invertido en 3', en el que el desoxinucleótido es dT, dA, dC o dG invertido.
El adaptador 5' puede comprender además en el bucle un espaciador que carece de base, específicamente en el extremo terminal 5' del bucle. El término "espaciador que carece de base", como se usa en el presente documento, se refiere a una fracción que permite la terminación de la transcripción inversa en una etapa posterior. En particular, la reacción termina en el nucleótido que precede a el espaciador que carece de base en la región del bucle del adaptador 5', lo que impide que la reacción continúe hasta el final del adaptador 5' y, por lo tanto, genere ADNc altamente estructurados, que pueden alterar etapas posteriores de la PCR. En particular, el espaciador que carece de base es un espaciador de 2'-didesoxirribosa. Más particularmente, el espaciador que carece de base es un espaciador de 1'2'-didesoxirribosa. En una realización, el adaptador 5' comprende en el bucle un espaciador que carece de base, preferiblemente en el extremo terminal 5' del bucle. En una realización preferida, el adaptador 5' comprende en el bucle un espaciador de 2'-didesoxirribosa, preferiblemente en el extremo terminal 5' del bucle.
En una realización más preferida, un adaptador 5', en el que la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' del adaptador 5' está o están potenciados con LNA y un adaptador 3', en el que la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' del adaptador 3' está o están potenciados con LNA, se combinan o forman parte de una combinación.
En una realización aún más preferida, un adaptador 5', en el que la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' del adaptador 5' está o están potenciados con LNA y un adaptador 3', en la que la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' del adaptador 3' está o están potenciados con LNA y en la que el adaptador 3' comprende un desoxinucleótido invertido en 3', por ejemplo, dT, dA, dC o dG invertidos se combinan o forman parte de una combinación.
En el presente documento se divulga además un método para ligar adaptadores al ARN diana en una muestra. Este método requiere que los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', estén hibridados con el ARN diana. Antes de que los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', se hibriden con el ARN diana, se desnaturaliza el ARN diana. Además, los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', se desnaturalizan y a continuación se renaturalizan.
El término "hibridación", como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso de calentamiento y enfriamiento de dos polinucleótidos de cadena sencilla con secuencias complementarias. El calor rompe todos los enlaces de hidrógeno y el enfriamiento permite que se formen nuevos enlaces entre las secuencias. Durante este proceso, los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', se unen al ARN diana y forman su estructura de tallo-bucle característica. En particular, el adaptador 5' se une al extremo terminal 5' del<a>R<n>diana y el adaptador 3' se une al extremo terminal 3' del ARN diana.
A este respecto, cabe señalar que la desnaturalización/renaturalización de los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', tiene lugar por separado y en ausencia de ARN diana en el método de la presente invención.
Los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', se ligan luego al ARN diana usando/con una ARN ligasa de cadena doble, produciendo de este modo un producto de ligadura. Como se usa en el presente documento, el término "producto de ligadura" se refiere a una molécula híbrida (ADN/ARN) que comprende al menos un adaptador y un ARN diana. Por ejemplo, el producto de ligadura puede comprender un adaptador 5' y un ARN diana tal como miARN o isomiR. El producto de ligadura puede comprender un adaptador 3' y un ARN diana tal como miARN o isomiR. Además, la ligadura producida puede comprender un adaptador 5', un adaptador 3' y un ARN diana tal como miARN o isomiR.
En particular, la hibridación del adaptador 5' con el ARN diana genera un híbrido de cadena doble (ADN/ARN) que contiene una muesca de ARN-OH-3'/5'-P-ARN entre el extremo terminal 3' del adaptador y el extremo terminal 5' del ARN diana. Este es un sustrato eficaz para la ligadura mediante una ARN ligasa de doble cadena. Además, la hibridación del adaptador 3' con el ARN diana genera un híbrido de cadena doble (ADN/ARN) que contiene una muesca de ARN-OH-3'/5'-P-ARN entre el extremo terminal 3' del ARN diana y el extremo terminal 5' del adaptador. Este también es un sustrato eficaz para la ligadura mediante una ARN ligasa de doble cadena.
Generalmente, para este fin se puede utilizar cualquier ARN ligasa de cadena doble capaz de ligar muescas de ARN de cadena doble/estructuras de ARN. En una realización preferida, la ARN ligasa de cadena doble es una ARN ligasa 2 (Rnl2) T4 o una Kod1 ligasa. En una realización más preferida, la ARN ligasa de cadena doble es una ARN ligasa 2 (Rnl2)T4.
Las condiciones de la reacción de ligadura normalmente se ajustan de modo que la ligasa funcione cerca de su nivel de actividad óptimo. Se puede usar un agente tampón para ajustar y mantener el pH al nivel deseado. Los ejemplos representativos de tampones adecuados incluyen, entre otros, MOPs , HEPES, TAPS, Bicina, Tricina, TES, PIPES, MES, acetato de sodio y tampón Tris.
Como se usa en el presente documento, el término "reacción de extensión" se refiere a una reacción de elongación en la que el adaptador 3' ligado al extremo terminal 3' del ARN diana se extiende, en particular en dirección 5' a 3', para formar un "producto de reacción de extensión" que comprende una cadena inversa complementaria al ARN diana. Tal como se utiliza en el presente documento, la reacción de extensión también se denomina "transcripción inversa". En algunas realizaciones, el ARN diana es una molécula de miARN y la reacción de extensión es una reacción de transcripción inversa que comprende una transcriptasa inversa, mediante la cual se realiza una copia de ADN (en particular ADNc) del producto de ligadura. En determinadas realizaciones, la reacción de extensión es una reacción de transcripción inversa que comprende una polimerasa, tal como una transcriptasa inversa.
El término "transcriptasa inversa", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enzima que tenga actividad de transcriptasa inversa. En particular, el término "transcriptasa inversa", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una enzima utilizada para generar ADN (ADNc) a partir de una plantilla de ARN en un proceso denominado transcripción inversa. La transcriptasa inversa tiene una actividad de a Dn polimerasa dependiente de ARN. Mediante esta actividad, primero se construye una cadena doble híbrida de ARN y ADN después de la presentación de un ARN de cadena sencilla mediante la unión de bloques de construcción de ADN emparejados complementarios (desoxirribonucleótidos). Posteriormente, su porción de ARN se degrada en gran medida mediante la actividad de RNasa H de una sección especial de la proteína. La cadena sencilla de ADN restante finalmente se completa en la cadena doble de ADN, catalizada por una actividad adicional inherente de la ADN polimerasa dependiente de ADN de la transcriptasa inversa. Para iniciar la transcripción inversa, la transcriptasa inversa requiere un cebador que sirve como punto de partida para que la transcriptasa inversa sintetice una nueva cadena. Este cebador también se denomina secuencia del cebador de RT. El cebador de RT depende de la secuencia del adaptador 3'. El cebador de RT es complementario inverso a dicha secuencia. En una realización preferida, la transcriptasa inversa es Maxima H-RT o Tth polimerasa. En una realización más preferida, la transcriptasa inversa es Maxima H-RT.
En el presente documento se describe además un método para analizar el producto de ligadura de manera que se detecte el ARN diana. En particular, en el presente documento se describe además un método para analizar el producto de ligadura que comprende el ADNc del ARN diana y el adaptador 3' de manera que se detecte el ARN diana.
El ensayo puede ser cuantitativo, de modo que se pueda determinar la cantidad o copias del ARN diana en una muestra. Alternativamente, el ensayo puede ser cualitativo, de modo que se pueda determinar la presencia o ausencia de un ARN diana en la muestra, pero no se pueda medir su nivel. Por lo tanto, el ensayo permite la determinación y cuantificación del ARN diana en una muestra. En el presente documento se describe un método de amplificación para analizar el producto de ligadura. En particular, la amplificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se puede seleccionar del grupo que consiste en PCR en tiempo real (PCR cuantitativa o qPCR), preferiblemente qPCR Taq-man, PCR multiplex, PCR anidada, PR de alta fidelidad, PCR rápida, PCR de inicio en caliente y PCR rica en GC. Para amplificar el producto de ligadura que comprende un ARN diana, el producto de ligadura generalmente se convierte en una copia de ADN.
Los términos "amplicón" y "producto de amplificación", como se usan en el presente documento, generalmente se refieren al producto de una reacción de amplificación. Un amplicón puede ser de cadena doble o de cadena sencilla y puede incluir las cadenas componentes separadas obtenidas desnaturalizando un producto de amplificación de cadena doble. En determinadas realizaciones, el amplicón de un ciclo de amplificación puede servir como plantilla en un ciclo de amplificación posterior.
El término "amplificar", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier medio por el cual se reproduce al menos una parte de un ARN diana, un sustituto de ARN diana, o combinaciones de los mismos, típicamente de una manera dependiente de la plantilla, incluyendo sin limitación , una amplia gama de técnicas para amplificar secuencias de ácidos nucleicos, ya sea lineal o exponencialmente. Puede usarse cualquiera de varios métodos para amplificar el polinucleótido diana. Puede utilizarse cualquier medioin vitropara multiplicar las copias de una secuencia diana de ácido nucleico. Estos incluyen métodos de amplificación lineal, logarítmico u otros. Los ejemplos de métodos incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR), procedimientos isotérmicos (usando una o más ARN polimerasas, desplazamiento de cadenas, destrucción parcial de moléculas cebadoras, reacción en cadena de ligasa (LCR), sistemas de ARN replicasa Q, sistemas basados en la transcripción de ARN (por ejemplo, TAS , 3SR) o amplificación de círculo rodante (RCA).
En el contexto de la presente invención, se amplifica el ADNc del ARN diana.
El término "PCR de mancuernas (PCR DB)", como se usa en el presente documento, se refiere a un método eficiente y conveniente para cuantificar de manera distintiva un ARN pequeño individual específico tal como un miARN así como una variante de ARN pequeño individual específico tal como una isomiR. En PCR DB, los adaptadores de 5' y 3' se hibridan y ligan específicamente a los extremos 5' y 3' de los ARN diana, respectivamente, mediante una ARN ligasa de cadena doble, por ejemplo, ARN ligasa 2 (Rnl2) T4. Los productos de ligadura resultantes con estructuras en forma de mancuerna se cuantifican a continuación, por ejemplo, mediante RT-PCR TaqMan. Los presentes inventores encontraron que el uso de los adaptadores de 5' y 3' patentados como se describen en el presente documento, así como la alta especificidad de la ligadura de Rnl2 y la RT-PCR TaqMan hacia los ARN diana aseguraron secuencias terminales 5' y 3' de los ARN diana con resolución de un solo nucleótido para que PCR DB detectara específicamente los ARN diana pero no sus variantes terminales correspondientes. La p Cr d B descrita en este documento tiene una amplia aplicabilidad para la cuantificación de varios ARN pequeños en diferentes tipos de células. Por lo tanto, la PCR DB proporciona un método simple muy necesario para analizar la heterogeneidad del terminal de ARN.
Se dice que los residuos en dos o más polinucleótidos "corresponden" entre sí los residuos ocupan una posición análoga en las estructuras de polinucleótidos. Es bien conocido en la técnica que pueden determinarse posiciones análogas en dos o más polinucleótidos alineando las secuencias de polinucleótidos basándose en la secuencia de ácidos nucleicos o similitudes estructurales. Dichas herramientas de alineación son bien conocidas por el experto en la técnica y se pueden obtener, por ejemplo, en la World Wide Web, por ejemplo, ClustalW o Align usando configuraciones estándar, preferiblemente para Align EMBOSS::needle, Matriz: Blosum62, apertura espacio 10.0, ampliación de espacio 0.5.
El término "enfermedad", como se usa en el presente documento, se refiere a una condición anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad a menudo se interpreta como una condición médica asociada con síntomas y signos específicos. En los seres humanos, el término "enfermedad" se utiliza a menudo de manera más amplia para referirse a cualquier afección que causa dolor, disfunción, angustia, problemas sociales o muerte al individuo afectado, o problemas similares para quienes están en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, a veces incluye lesiones, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, conductas desviadas y variaciones atípicas de estructura y función, mientras que en otros contextos y para otros fines pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades suelen afectar a las personas no sólo físicamente, sino también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de la vida y la personalidad. La enfermedad puede ser una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad neurodegenerativa, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa y cáncer.
El término "tratamiento terapéutico/terapia", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier tratamiento/terapia que mejora el estado de salud y/o prolonga (aumenta) la esperanza de vida de un paciente. Dicho tratamiento/terapia puede eliminar la enfermedad en un paciente, detener, inhibir o retardar el desarrollo de una enfermedad en un paciente, disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas en un paciente y/o disminuir la recurrencia en un paciente que actualmente tiene o que previamente haya padecido alguna enfermedad.
El término "muestra", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra que comprenda ARN diana, particularmente ARN diana codificantes y/o no codificantes, más particularmente ARN diana pequeños no codificantes. Dicha muestra se deriva específicamente del cuerpo de un paciente/sujeto. Dicha muestra comprende específicamente ARN diana, en particular ARN diana pequeño no codificante, aislado de organismos, tejidos, células o fluidos corporales tales como sangre. Por lo tanto, la muestra es particularmente una muestra biológica.
El término "muestra biológica", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra que tenga un origen biológico y/o comprenda material biológico. La muestra biológica puede ser una muestra de fluido corporal, por ejemplo, una muestra de sangre o una muestra de orina, o una muestra de tejido, por ejemplo, una muestra de biopsia de tejido. Las muestras biológicas pueden mezclarse o combinarse, por ejemplo, una muestra puede ser una mezcla de una muestra de sangre y una muestra de orina.
El término "muestra de fluido corporal", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra líquida que comprenda ARN diana. Dicha muestra se deriva específicamente del cuerpo de un paciente/sujeto. Dicha muestra de fluido corporal puede ser una muestra de orina, muestra de sangre, muestra de esputo, muestra de leche materna, muestra de fluido cefalorraquídeo (LCR), muestra de cerumen (cera de los oídos), muestra de jugo gástrico, muestra de moco, muestra de linfa, muestra de fluido de endolinfa, muestra de fluido de perilinfa, muestra de fluido peritoneal, muestra de fluido pleural, muestra de saliva, muestra de sebo (aceite de la piel), muestra de semen, muestra de sudor, muestra de lágrimas, hisopo de mejilla, muestra de secreción vaginal, biopsia líquida o muestra de vómito, incluidos componentes o fracciones de los mismos. El término "muestra de fluido corporal" también abarca fracciones de fluido corporal, por ejemplo, fracciones de sangre, fracciones de orina o fracciones de esputo. Las muestras de fluidos corporales pueden mezclarse o combinarse. Por lo tanto, una muestra de fluido corporal puede ser una mezcla de una muestra de sangre y orina o una mezcla de una muestra de sangre y fluido cefalorraquídeo.
El término "muestra de sangre", como se usa en el presente documento, abarca sangre entera o una fracción de sangre. Preferiblemente, la fracción sanguínea se selecciona del grupo que consiste en una fracción de células sanguíneas, plasma y suero. En particular, la fracción sanguínea se selecciona del grupo que consiste en una fracción de células sanguíneas y plasma o suero. Por ejemplo, la fracción de células sanguíneas abarca eritrocitos, leucocitos y/o trombocitos.
La muestra de sangre entera se puede recoger por medio de un tubo de recolección de sangre. Se recoge, por ejemplo, en un tubo de ARN sanguíneo PAXgene, en un tubo de ARN sanguíneo Tempus, en un tubo de EDTA, en un tubo de citrato de Na, en un tubo de heparina o en un tubo de ACD (citrato ácido dextrosa).
La muestra de sangre entera también se puede recoger mediante una técnica de gota de sangre, por ejemplo, utilizando un dispositivo de micromuestreo Mitra. Esta técnica requiere volúmenes de muestra más pequeños, normalmente entre 45 y 60 μl para humanos o menos. Por ejemplo, se puede extraer la sangre entera del paciente mediante un pinchazo en el dedo con una aguja o lanceta. Por lo tanto, la muestra de sangre entera puede tener la forma de una gota de sangre. Luego se coloca dicha gota de sangre sobre una sonda absorbente, por ejemplo, un material polimérico hidrófilo como la celulosa, que es capaz de absorber la sangre entera. Una vez que se completa el muestreo, la gota de sangre se seca al aire antes de transferirla o enviarla por correo a los laboratorios para su procesamiento. Debido a que la sangre está seca, no se considera peligrosa. Por lo tanto, no es necesario tomar precauciones especiales en el manejo o envío. Una vez en el lugar de análisis, los componentes deseados, por ejemplo, los miARN se extraen de las manchas de sangre seca en un sobrenadante que luego se analiza más a fondo.
El término "nivel", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad (medida, por ejemplo, en gramos, moles o recuentos de iones) o concentración (por ejemplo, concentración absoluta o relativa, por ejemplo, lecturas por millón (RPM) o recuentos de NGS) de un a Rn diana. El término "nivel", como se usa en el presente documento, también comprende cantidades o valores escalados, normalizados o escalados y normalizados. En particular, el nivel del ARN diana se determina mediante secuenciación, preferiblemente secuenciación de próxima generación (por ejemplo, ABI SOLID, Illumina Genome Analyzer, Roche 454 GS FL, BGISEQ), hibridación de ácidos nucleicos (por ejemplo, microarreglos o perlas), amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR, RT-PCR, qRT-PCR o RT-PCR de alto rendimiento), extensión con polimerasa, espectrometría de masas, citometría de flujo (por ejemplo, LUMINEX) o cualquier combinación de las mismas. Específicamente, el nivel del ARN diana es el nivel de expresión de dicho ARN diana.
El término "paciente", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier individuo del que se desea saber si padece una enfermedad o afección. En particular, el término "paciente", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un individuo que se sospecha que está afectado por una enfermedad o afección. Se puede diagnosticar que el paciente está afectado por una enfermedad o afección o se le puede diagnosticar que no está afectado por una enfermedad o afección, es decir, sano. El término "paciente", tal como se utiliza en el presente documento, también se refiere a un individuo que está afectado por una enfermedad o afección. Al paciente se le puede volver a realizar la prueba para detectar la enfermedad o afección y se le puede diagnosticar que todavía está afectado por la enfermedad o afección, o que ya no está afectado por la enfermedad o afección, es decir, que está sano, por ejemplo después de una intervención terapéutica. El paciente puede ser un ser humano o un animal. Se prefieren particularmente los individuos humanos.
El término "sujeto de (control)", como se usa en el presente documento, se refiere a un sujeto que se sabe que está afectado por una enfermedad o afección o que se sabe que no está afectado por una enfermedad o afección, es decir, sano. El sujeto (de control) puede ser un ser humano o un animal. Se prefieren particularmente los individuos humanos.
En el contexto de la presente invención, se entiende por "kit de piezas (en resumen: kit)" cualquier combinación de al menos algunos de los componentes aquí identificados, que se combinan, coexistiendo espacialmente, para formar una unidad funcional y que puede contener otros componentes.
Realizaciones de la invención
A continuación se describirá con mayor detalle la presente invención. En los siguientes pasajes, se definen con más detalle diferentes aspectos de la invención. Cada aspecto así definido podrá combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa podrá combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas, a menos que se indique claramente lo contrario.
Los presentes inventores han desarrollado un método basado en PCR de mancuerna (PCR DB), que explota la capacidad de una ARN ligasa de cadena doble, particularmente ARN ligasa 2 (Rnl2), para unir específicamente las mellas en una molécula de ARN de cadena doble hibridada. Sólo los adaptadores correctamente hibridados tanto en el extremo terminal 5' como en el 3' de los isomiR permiten la formación del ARN ligado que puede usarse como plantilla para la síntesis de ADNc. Este método es capaz de determinar y cuantificar de manera específica y eficiente la expresión del ARN diana (por ejemplo, miARN), así como de variantes de ARN diana que tienen secuencias terminales específicas (por ejemplo, isomiR). La segunda capa de especificidad la introduce una sonda TaqMan, que puede alinearse con una región de secuencia de ADNc definida por el usuario. El método basado en PCR de mancuerna (PCR DB) desarrollado por los presentes inventores se puede utilizar en cualquier hospital/clínica o centro de investigación y permite el análisis de muestras clínicas de una manera sencilla, rápida, fiable, precisa y rentable. Gracias a este método, se puede mejorar aún más la especificidad y sensibilidad de las pruebas de diagnóstico. También se proporciona un kit adecuado para el propósito anterior.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un adaptador 5' que comprende en el siguiente orden de 5' a 3'
(i) una secuencia de nucleótidos del extremo terminal 5' que comprende de 6 a 15, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 desoxinucleótidos, en los que dichos 6 a 15 desoxinucleótidos son complementarios inversos de una secuencia del extremo terminal 5' de un a Rn diana, y
(ii) una secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble, en la que al menos 2, por ejemplo, 2, 3 o 4 nucleótidos en su extremo terminal 3' son ribonucleótidos o ribonucleótidos modificados y en los que la secuencia de nucleótidos está (preferiblemente) potenciada con nucleótidos bloqueados (LNA).
Preferiblemente, la secuencia potenciada con LNA comprende entre 2 y 10, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente 3, nucleótidos bloqueados, específicamente ribonucleótidos.
En particular, la secuencia de nucleótidos del adaptador 5' comprende desoxinucleótidos y ribonucleótidos.
El adaptador 5' puede variar de 15 a 60, por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 nucleótidos de longitud.
El adaptador 5' puede estar presente como polinucleótido lineal, particularmente en forma de cadena sencilla, por ejemplo, después de la desnaturalización/cuando se desnaturaliza. El adaptador 5' es un polinucleótido que se puede unir/ligar al extremo terminal 5' de un ARN diana. Cuando se une/liga al extremo terminal 5' de un ARN diana, el adaptador 5' tiene una estructura de tallo-bucle. La unión/ligadura es posible ya que el adaptador 5' comprende entre 6 y 15, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 desoxinucleótidos que son complementarios inversos de una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana. El ARN diana es preferiblemente un miARN o isomiR comprendido en/parte de miRbase versión 22.1.
En una realización, la secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle comprende una primera secuencia de tallo posicionada en 5' y una segunda secuencia de tallo posicionada en 3' que son complementarias inversamente entre sí. Por lo tanto, la primera secuencia de tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia de tallo posicionada en 3' pueden formar el tallo de cadena doble.
El tallo de cadena doble puede tener una longitud de entre 5 y 20, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos.
Preferiblemente, cada una de la primera secuencia de tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia de tallo posicionada en 3' tiene una longitud de entre 5 y 10, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos. En particular, la primera secuencia de tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia de tallo posicionada en 3' tienen la misma longitud, por ejemplo, una longitud de 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos.
Más preferiblemente, la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' está o están potenciadas con LNA. En particular, la secuencia potenciada con LNA comprende entre 2 y 5, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5, más particularmente 3, nucleótidos bloqueados, específicamente ribonucleótidos. Ejemplos de ribonucleótidos bloqueados son LNA-guanina, LNA-adenosina o LNA-citosina. Incluso más preferiblemente, la primera secuencia del tallo situada en 5' está potenciada con LNA. En particular, la secuencia potenciada con LNA comprende entre 2 y 5, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5, más particularmente 3, nucleótidos bloqueados, específicamente ribonucleótidos. Ejemplos de ribonucleótidos bloqueados son LNA-guanina, LNA-adenosina o LNA-citosina. Específicamente, cada nucleótido, cada segundo nucleótido o cada tercer nucleótido se puede potenciar con LNA en la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o en la segunda secuencia del tallo posicionada en 3'.
Por lo tanto, la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' pueden comprender (una mezcla de) desoxinucleótidos y ribonucleótidos (por ejemplo, potenciados con LNA) o la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada 3' puede comprender ribonucleótidos. Dichos ribonucleótidos incluyen ribonucleótidos que están potenciados con LNA.
En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle comprende una secuencia de bucle que está ubicada entre la primera secuencia de tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia de tallo posicionada en 3'. La secuencia del bucle puede comprender entre 10 y 40, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos. Preferiblemente, la secuencia del bucle comprende entre 12 y 20, por ejemplo, ej. 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos, por ejemplo, desoxinucleótidos y/o ribonucleótidos. Más preferiblemente, la secuencia del bucle comprende entre 12 y 20, por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 desoxinucleótidos.
En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble comprende desoxinucleótidos con la excepción de al menos dos nucleótidos en su extremo terminal 3' que son ribonucleótidos o ribonucleótidos modificados, preferiblemente ribonucleótidos 2'-ometilo, y los ribonucleótidos bloqueados.
En otra realización, la secuencia del extremo terminal 5' está configurada de manera que forma una protuberancia 5' de cadena sencilla después de la formación de la estructura de tallo-bucle.
En una realización preferida, los 6 a 15, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16, los desoxinucleótidos que son complementarios inversos de la secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana abarcan G y C pero no más de 4, por ejemplo 1, 2, 3 o 4 seguidos.
En una realización más preferida, el adaptador 5' tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGGCGTGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 1), en la que "r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, y en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, o son una variante de esta secuencia.
Por ejemplo, cada nucleótido, cada segundo nucleótido o cada tercer nucleótido puede estar potenciado con LNA en la porción subrayada y/o en la porción doblemente subrayada especificada anteriormente.
En una realización aún más preferida, el adaptador 5' tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGGCGTGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 1), en la que "r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, y en la que uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de los nucleótidos en negrita están potenciados con LNA, o es una variante de esta secuencia.
Específicamente, los nucleótidos potenciados con LNA son ribonucleótidos.
La variante del adaptador 5' como se describió anteriormente tiene una secuencia que tiene al menos el 80 %, preferiblemente el 85 %, más preferiblemente el 90 %, incluso más preferiblemente el 95 %, y aún más preferiblemente el 99 %, por ejemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 1. Tal variante de adaptador 5' todavía comprende al menos 2 nucleótidos en su extremo terminal 3' que son ribonucleótidos o ribonucleótidos modificados. Además, esta variante de adaptador 5' sigue estando potenciada con LNA. Además, dicha variante de adaptador 5' todavía es capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble. El experto puede evaluar fácilmente si una variante de adaptador 5' todavía es capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble. Por ejemplo, la sección experimental proporciona suficiente información a este respecto.
En una realización particular, el adaptador 5' descrito anteriormente comprende un espaciador que carece de base (por ejemplo, un espaciador de 1',2'-didesoxirribosa que carece de base) en la región del bucle. Un adaptador 5' que tiene un espaciador que carece de base en la región del bucle tiene preferiblemente la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGGCG/idSp/TGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 29), en la que"r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, en la que "idSp" significa espaciador que carece de base, y en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, o es una variante de esta secuencia.
Específicamente, los nucleótidos potenciados con LNA son ribonucleótidos.
En una realización más particular, el adaptador 5' que comprende un espaciador que carece de base (por ejemplo, un espaciador de 1',2'-didesoxirribosa que carece de base) en la región del bucle tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGGCG/idSp/TGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 29), en la que"r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, en la que "idSp" significa espaciador que carece de base, y en la que uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de los nucleótidos en negrita están potenciados con LNA, o
es una variante de esta secuencia.
La variante del adaptador 5' como se describió anteriormente tiene una secuencia que tiene al menos el 80 %, preferiblemente el 85 %, más preferiblemente el 90 %, incluso más preferiblemente el 95 %, y aún más preferiblemente el 99 %, por ejemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 29. Tal variante de adaptador 5' todavía comprende al menos 2 nucleótidos en su extremo terminal 3' que son ribonucleótidos o ribonucleótidos modificados. Además, dicha variante del adaptador 5' todavía está potenciada con LNA. Además, dicho adaptador 5' todavía comprende un espaciador que carece de base. Además, dicha variante de adaptador 5' todavía es capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble. El experto puede evaluar fácilmente si una variante de adaptador 5' todavía es capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble. Por ejemplo, la sección experimental proporciona suficiente información a este respecto.
En otra realización particular, el adaptador 5' como se describió anteriormente no comprende un espaciador que carece de base (por ejemplo, un espaciador de 1',2'-didesoxirribosa que carece de base) en la región del bucle.
El adaptador 5' como se describió anteriormente puede unirse a cualquier diana de ARN (específicamente al extremo terminal 5' de cualquier diana de ARN) simplemente intercambiando las protuberancias variables. En particular, del 6 al 15, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 desoxinucleótidos en la secuencia de nucleótidos del extremo terminal 5' del adaptador 5' sólo deben seleccionarse de manera que sean complementarios inversos a el ARN diana (específicamente al extremo terminal 5' del ARN diana) que se va a detectar. El adaptador 5' se utiliza especialmente junto con el adaptador 3'.
El adaptador 5' descrito anteriormente puede estar presente en forma desnaturalizada o renaturalizada.
En otra realización, el ARN diana es cualquier ARN de cadena sencilla que tiene una fracción fosfato 5' y una fracción hidroxilo 3'. En particular, el ARN diana es ARN que tiene una longitud de < 200 ribonucleótidos, por ejemplo, entre 10 y < 200 ribonucleótidos. Más particularmente, el ARN diana es un ARN que tiene una longitud de entre 10 y 100 ribonucleótidos. Aún más particularmente, el ARN diana es un ARN que tiene una longitud comprendida entre 10 y 50 ribonucleótidos. Dicho ARN es específicamente un miARN o una isoterma de miARN (una isomiR).
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un adaptador 3' que comprende en el siguiente orden de 5' a 3'
(i) una secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble, en la que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado y en la que la secuencia de nucleótidos está (preferiblemente) potenciada con nucleótidos bloqueados (LNA), y
(ii) una secuencia de nucleótidos del extremo terminal 3' que comprende de 6 a 15, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 desoxinucleótidos, en los que dichos 6 a 15 desoxinucleótidos son complementarios inversos de una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana y en los que el desoxinucleótido del extremo terminal 3' es un desoxinucleótido invertido.
Preferiblemente, la secuencia potenciada con LNA comprende entre 2 a 10, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente 3, nucleótidos bloqueados, específicamente ribonucleótidos.
En particular, la secuencia de nucleótidos del adaptador 3' comprende desoxinucleótidos y ribonucleótidos.
El adaptador 3' puede oscilar entre aproximadamente 15 y aproximadamente 60, por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 nucleótidos de longitud.
El adaptador 3' puede estar presente como polinucleótido lineal, particularmente en forma de cadena sencilla, por ejemplo, después de la desnaturalización/cuando se desnaturaliza. El adaptador 3' es un polinucleótido que se puede unir/ligar al extremo terminal 3' de un ARN diana. Cuando se une/liga al extremo terminal 3' de un ARN diana, el adaptador 3' tiene una estructura de tallo-bucle. La unión/ligadura es posible ya que el adaptador 3' comprende entre 6 y 15, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 desoxinucleótidos que son complementarios inversos de una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana. El ARN diana es preferiblemente un miARN o isomiR comprendido en miRbase versión 22.1.
En una realización, la secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle comprende una primera secuencia de tallo posicionada en 5' y una segunda secuencia de tallo posicionada en 3' que son complementarias inversamente entre sí. Por lo tanto, la primera secuencia de tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia de tallo posicionada en 3' pueden formar el tallo de cadena doble.
El tallo de cadena doble puede tener una longitud de entre 5 y 20, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos.
Preferiblemente, cada una de la primera secuencia de tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia de tallo posicionada en 3' tiene una longitud de entre 5 y 10, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos. En particular, la primera secuencia de tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia de tallo posicionada en 3' tienen la misma longitud, por ejemplo, una longitud de 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos.
Más preferiblemente, la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' es o están potenciadas con LNA. En particular, la secuencia potenciada con LNA comprende entre 2 y 5, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5, más particularmente 3, nucleótidos bloqueados, específicamente ribonucleótidos. Ejemplos de ribonucleótidos bloqueados son LNA-guanina, LNA-adenosina o LNA-citosina. Incluso más preferiblemente, la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' está potenciada con LNA. En particular, la secuencia potenciada con LNA comprende entre 2 y 5, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5, más particularmente 3, nucleótidos bloqueados, específicamente ribonucleótidos. Ejemplos de ribonucleótidos bloqueados son LNA-guanina, LNA-adenosina o LNA-citosina. Específicamente, cada nucleótido, cada segundo nucleótido o cada tercer nucleótido se puede potenciar con LNA en la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o en la segunda secuencia del tallo posicionada en 3'.
Por lo tanto, la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' pueden comprender (una mezcla de) desoxinucleótidos y ribonucleótidos (por ejemplo, potenciados con LNA) o la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' puede comprender ribonucleótidos. Dichos ribonucleótidos incluyen ribonucleótidos que están potenciados con LNA.
En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle comprende una secuencia de bucle que está ubicada entre la primera secuencia de tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia de tallo posicionada en 3'. La secuencia del bucle puede comprender entre 10 y 40, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos. Preferiblemente, la secuencia del bucle comprende entre 12 y 20, p.ej. 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos, por ejemplo, desoxinucleótidos y/o ribonucleótidos. Más preferiblemente, la secuencia del bucle comprende entre 12 y 20, por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 desoxinucleótidos.
En otra realización, la secuencia del extremo terminal 3' está configurada de manera que forma una protuberancia 3' de cadena sencilla después de la formación de la estructura de tallo-bucle.
En una realización preferida, los 6 a 15, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16, los desoxinucleótidos que son complementarios inversos de la secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana abarcan G y C pero no más de 4, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 seguidos.
En otra realización preferida, el desoxinucleótido invertido es dT, dA, dC o dG invertido. A este respecto, cabe señalar que el desoxinucleótido invertido en 3' crea un enlace 3'-3' y, por lo tanto, evita la síntesis de nucleótidos no deseada desde el extremo terminal 3' del adaptador, por ejemplo, durante la RT-PCR. Además, el desoxinucleótido invertido en 3' protege la secuencia de la escisión de la exonucleasa 3'.
En una realización más preferida,
el adaptador 3'
tiene la siguiente secuencia de 5' a 3': /5Phos/CTCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGAG (6-15x)N/31nvdT/ (SEQ ID NO: 2), en la que "/5Phosr indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana, y en la que "/3InvdT/" representa desoxinucleótido invertido en 3', o
es una variante de esta secuencia.
Por ejemplo, cada nucleótido, cada segundo nucleótido o cada tercer nucleótido se puede potenciar con LNA en la porción subrayada y/o en la porción doblemente subrayada especificada anteriormente.
En una realización aún más preferida, el adaptador 3'
tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
/5Phos/CTCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGAG(6-15x)N/3InvdT/ (SEQ ID NO: 2), en la que "/5Phos/" indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de los nucleótidos en negrita están potenciados con LNA, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana, y en la que "/3InvdTr representa desoxinucleótido invertido en 3', o
es una variante de esta secuencia.
Específicamente, los nucleótidos potenciados con LNA son ribonucleótidos.
La variante del adaptador 3' como se describió anteriormente tiene una secuencia que tiene al menos el 80 %, preferiblemente el 85 %, más preferiblemente el 90 %, incluso más preferiblemente el 95 %, aún más preferiblemente el 99 %, por ejemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 2. Esta variante de adaptador 3' todavía está potenciada con LNA. Además, el nucleótido del extremo terminal 5' todavía está fosforilado en dicha variante de adaptador 3'. Además, el desoxinucleótido del extremo terminal 3' sigue siendo un desoxinucleótido invertido en dicha variante de adaptador 3'. Además, dicha variante de adaptador 3' todavía es capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble. El experto puede evaluar fácilmente si una variante de adaptador 3' todavía es capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble. Por ejemplo, la sección experimental proporciona suficiente información a este respecto.
El adaptador 3' como se describió anteriormente puede unirse a cualquier diana de ARN (específicamente al extremo terminal 3' de cualquier diana de ARN) simplemente intercambiando las protuberancias variables. En particular, los 6 al 15, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 desoxinucleótidos en la secuencia de nucleótidos del extremo terminal 3' del adaptador 3' sólo deben seleccionarse de manera que sean complementarios inversos al ARN diana (específicamente al extremo terminal 3' del ARN diana) que se va a detectar. El adaptador 3' se utiliza especialmente junto con el adaptador 5'.
El adaptador 3' descrito anteriormente puede estar presente en forma desnaturalizada o renaturalizada.
En otra realización, el ARN diana es cualquier ARN de cadena sencilla que tiene una fracción fosfato 5' y una fracción hidroxilo 3'. En particular, el ARN diana es ARN que tiene una longitud de < 200 ribonucleótidos, por ejemplo, entre 10 y < 200 ribonucleótidos. Más particularmente, el ARN diana es un ARN que tiene una longitud de entre 10 y 100 ribonucleótidos. Aún más particularmente, el ARN diana es un ARN que tiene una longitud comprendida entre 10 y 50 ribonucleótidos. Dicho ARN es específicamente un miARN o una isoforma de miARN (una isomiR).
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una combinación que comprende
el adaptador 5' de acuerdo con el primer aspecto, y
el adaptador 3' de acuerdo con el segundo aspecto.
El adaptador 5' de acuerdo con el primer aspecto y el adaptador 3' de acuerdo con el segundo aspecto pueden estar presentes en la combinación individualmente o juntos. Por ejemplo, el adaptador 5' de acuerdo con el primer aspecto puede estar comprendido en una (primera) composición y el adaptador 3' de acuerdo con el segundo aspecto puede estar comprendido en otra/(segunda) composición diferente. Alternativamente, el adaptador 5' de acuerdo con el primer aspecto y el adaptador 3' de acuerdo con el segundo aspecto pueden estar comprendidos en una única composición. La composición puede ser una solución acuosa tal como agua o una solución tampón.
En una realización preferida, la longitud total de la secuencia de nucleótidos del extremo terminal 5' que comprende de 6 a 15 desoxinucleótidos, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, y la secuencia de nucleótidos del extremo terminal 3' que comprende de 6 a 15 desoxinucleótidos, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, es más corta en al menos 2, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos que la longitud del ARN diana.
En una realización preferida,
el adaptador 5'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGGCGTGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 1), en la que "r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, y en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, o una variante de esta secuencia, y
el adaptador 3'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3': /5Phos/CTCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGAG(6-15x)N/3InvdT/ (SEQ ID NO: 2), en la que "/5Phos/" indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana, y en la que "/3InvdTr representa desoxinucleótido invertido en 3', o una variante de esta secuencia
están combinados/parte de la combinación.
Específicamente, los nucleótidos potenciados con LNA son ribonucleótidos.
En una realización más preferida,
el adaptador 5'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGGCGTGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 1), en la que "r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, y en la que uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de los nucleótidos en negrita están potenciados con LNA, o una variante de esta secuencia, y
el adaptador 3'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
/5Phos/CTCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGAG(6-15x)N/3InvdT/ (SEQ ID NO: 2), en la que "/5Phos/" indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3 ) de los nucleótidos en negrita están potenciados con LNA, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana, y en la que "/3InvdTr representa desoxinucleótido invertido en 3', o una variante de esta secuencia
están combinados/parte de la combinación.
Específicamente, los nucleótidos potenciados con LNA son ribonucleótidos.
En una realización particular,
el adaptador 5'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGGCG/idSp/TGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 29), en la que"r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, en la que "idSp" significa espaciador que carece de base, y en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, o una variante de esta secuencia, y
el adaptador 3'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
/5Phos/CTCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGAG (6-15x)N/31nvdT/ (SEQ ID NO: 2), en la que "/5Phos/" indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana, y en la que "/3InvdTr representa desoxinucleótido invertido en 3', o una variante de esta secuencia
están combinados/parte de la combinación.
[En una realización más particular,
el adaptador 5'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGGCG/idSp/TGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 29), en la que"r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, en la que "idSp" significa espaciador que carece de base, y en la que uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de los nucleótidos en negrita están potenciados con LNA, o una variante de esta secuencia, y
el adaptador 3'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
/5Phos/CTCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGAG(6-15x)N/3InvdT/ (SEQ ID NO: 2), en la que "/5Phos/" indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3 ) de los nucleótidos en negrita están potenciados con LNA, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana, y en la que "/3InvdTr representa desoxinucleótido invertido en 3', o una variante de esta secuencia
están combinados/parte de la combinación.
Específicamente, los nucleótidos potenciados con LNA son ribonucleótidos.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método para ligar dos adaptadores a un ARN diana en una muestra que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una composición que comprende un ARN diana desnaturalizado en una muestra, el adaptador 5' renaturalizado de acuerdo con el primer aspecto y el adaptador 3' renaturalizado de acuerdo con el segundo aspecto, en la que el adaptador 5' y el adaptador 3' están hibridados con ARN diana, y
(ii) ligar el adaptador 5' y el adaptador 3' al ARN diana usando/con una ARN ligasa de cadena doble, produciendo de este modo un producto de ligadura.
La hibridación de los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', con el ARN diana requiere que el ARN diana esté presente en forma desnaturalizada. En una realización, el ARN diana desnaturalizado se produce calentando el ARN diana entre 65 °C y 75 °C, por ejemplo, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 o 75 °C, preferiblemente a 70 °C, durante entre 1 y 3 minutos, por ejemplo, 1,2 o 3 minutos, preferiblemente durante 2 minutos.
Por ejemplo, el ARN diana desnaturalizado se produce calentando el ARN diana a 70 °C durante 2 minutos.
Se prefiere que el ARN diana se coloque inmediatamente en hielo después de la desnaturalización.
Para la etapa de desnaturalización, el ARN diana se administra preferiblemente a una solución acuosa, por ejemplo, agua o a una solución tampón.
En cuanto a los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', se requiere una etapa de desnaturalización y una de renaturalización para que puedan partir de una estructura de tallo-bucle que permita la hibridación con el ARN diana. La hibridación es un proceso de calentamiento y enfriamiento de adaptadores con secuencias complementarias. El calor rompe todos los enlaces de hidrógeno y el enfriamiento permite que se formen nuevos enlaces entre las secuencias. Durante este proceso, los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', se unen al ARN diana desnaturalizado y forman su estructura de tallo-bucle característica. En particular, el adaptador 5' se une al extremo terminal 5' del ARN diana y el adaptador 3' se une al extremo terminal 3' del ARN diana. Se prefiere que los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', se desnaturalicen y renaturalicen juntos, es decir, en un recipiente de reacción común. Se prefiere además que la desnaturalización/renaturalización de los adaptadores, en particular de los adaptadores de 5' y 3', tenga lugar por separado y en ausencia de ARN diana.
En una realización, el adaptador 5' renaturalizado se produce mediante
la desnaturalización del adaptador 5' entre 75 °C y 85 °C, por ejemplo, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 u 85 °C, preferiblemente a 82 °C, durante entre 1 y 3 minutos, por ejemplo, 1, 2 o 3 minutos, preferiblemente durante 2 minutos, y
renaturalizar el adaptador 5' enfriándolo a 4 °C, preferiblemente a una velocidad de 0.1 °C/s.
Por ejemplo, el adaptador 5' renaturalizado se produce desnaturalizando el adaptador 5' a 82 °C durante 2 minutos y renaturalizando el adaptador 5' enfriándolo a 4 °C, preferiblemente a una velocidad de 0.1 °C/ s.
En una realización adicional o alternativa, el adaptador 3' renaturalizado se produce mediante
la desnaturalización del adaptador 3' entre 75 °C y 85 °C, por ejemplo, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 u 85 °C, preferiblemente a 82 °C, durante entre 1 y 3 minutos, por ejemplo, 1,2 o 3 minutos, preferiblemente durante 2 minutos, y
renaturalizar el adaptador 3' enfriándolo a 4 °C, preferiblemente a una velocidad de 0.1 °C/s.
Por ejemplo, el adaptador 3' renaturalizado se produce desnaturalizando el adaptador 3' a 82 °C durante 2 minutos, y renaturalizando el adaptador 3' enfriándolo a 4 °C, preferiblemente a una velocidad de 0.1 °C/s. Para la etapa de desnaturalización y renaturalización, los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', se colocan preferiblemente en un tampón acuoso que comprende TRIS HCl 10 mM, pH 7.5, NaCl 50 mM y EDTA 0.1 mM. En otras palabras, la desnaturalización y renaturalización de los adaptadores, en particular de los adaptadores de 5' y 3', se lleva a cabo preferiblemente en un tampón acuoso que comprende TRIS HCl 10 mM pH 7.5, NaCl 50 mM y EDTA 0.1 mM.
La composición proporcionada en la etapa (i) del método anterior se produce específicamente mezclando el ARN diana desnaturalizado, el adaptador 5' renaturalizado de acuerdo con el primer aspecto y el adaptador 3' renaturalizado de acuerdo con el segundo aspecto entre sí, hibridando así el adaptador 5' y el adaptador 3' con el ARN diana. De este modo, los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', se hibridan/ligan al ARN diana al mismo tiempo. Además, el ARN diana desnaturalizado sólo se mezcla con los adaptadores, en particular con los adaptadores de 5' y 3', antes de la reacción de hibridación/ligadura. En otras palabras, los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', sólo se mezclan con el ARN diana antes de la reacción de hibridación/ligadura. Esto tiene la ventaja de que se forma una estructura adaptadora estable en ausencia de ARN que podría interferir con este proceso a través de abundantes ARN, como los ARN ribosómicos.
La hibridación del adaptador 5' con el ARN diana genera particularmente un híbrido de cadena doble (ADN/ARN) que contiene una muesca de ARN-OH-3'/5'-P-ARN entre el extremo terminal 3' del adaptador y el extremo terminal 5' del ARN diana. Este es un sustrato eficaz para la ligadura mediante una ARN ligasa de doble cadena.
Además, la hibridación del adaptador 3' con el ARN diana genera particularmente un híbrido de cadena doble (ADN/ARN) que contiene una muesca de ARN-OH-3'/5'-P-ARN entre el extremo terminal 3' del ARN diana y el extremo terminal 5' del adaptador. Este es un sustrato para la ligadura mediante una ARN ligasa de doble cadena.
La ligadura se lleva a cabo habitualmente en un tampón de ligadura. En la sección experimental de la presente solicitud de patente se describe un tampón de ligadura a modo de ejemplo. En una realización preferida, el tampón de ligadura comprende polietilenglicol (PEG), por ejemplo, PEG 8000 (5%) y/o trifosfato de adenosina (ATP), por ejemplo, ATP 1 mM. Los presentes inventores han observado que el PEG tuvo el efecto sobre la reacción de ligadura de manera que funciona como agente de apiñamiento molecular y/o el ATP tuvo el efecto sobre la reacción de ligadura de manera que concentraciones aumentadas facilitan las reacciones de ligadura.
En una realización, la ligadura se lleva a cabo
entre 36 °C y 38 °C, por ejemplo, 36, 37 o 38 °C, preferiblemente a 37 °C, durante entre 30 minutos y 1.5 horas, por ejemplo, 30, 35, 40, 45, 50, 55 minutos, 1, 1.25 o 1.5 horas, preferiblemente durante 1 hora, o
entre 15 °C y 20 °C, por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 °C, preferiblemente a 16 °C, durante entre 30 minutos y 2 horas, por ejemplo, 30, 35, 40, 45, 50, 55 minutos, 1, 1.25, 1.5, 1.75 o 2 horas, preferiblemente durante 1 o 2 horas y luego durante la noche a 12 °C. Durante la noche puede significar un período de tiempo entre 8 y 12 horas, por ejemplo, 8, 9, 10, 11 o 12 horas.
Por ejemplo, la ligadura se lleva a cabo
a 37 °C durante 1 hora, o
a 16 °C durante 1 o 2 horas y luego durante la noche a 12 °C. Durante la noche puede significar un período de tiempo entre 8 y 12 horas, por ejemplo, 8, 9, 10, 11 o 12 horas.
La ARN ligasa de cadena doble puede ser cualquier ligasa capaz de ligar muescas de ARN de cadena doble/estructuras de ARN. Preferiblemente, la ARN ligasa de cadena doble es una ARN ligasa 2 (Rnl2) T4 o una Kod1 ligasa.
A este respecto, cabe señalar que sólo una molécula perfectamente hibridada proporciona un sustrato para la ARN ligasa de cadena doble, en particular Rnl2. Además, en caso de protrusión de cualquiera de las cadenas o de un espacio de 2 nucleótidos o más, el Rnl2 ligará la molécula con una eficacia mucho menor. Los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', descritos en el presente documento proporcionan un contexto de ARNbc con una protuberancia de 6 a 15 nucleótidos que se hibrida con el ARN diana. Finalmente, también se requiere una fracción fosfato 5' en la molécula de ARN diana para una ligadura eficaz por parte de Rnl2.
Ligando los adaptadores, en particular los adaptadores de 5' y 3', al ARN diana usando/con una ARN ligasa de cadena doble, se produce un producto de ligadura. El producto de ligadura puede describirse como una molécula híbrida (ADN/ARN) que comprende al menos un adaptador y un ARN diana. Por ejemplo, el producto de ligadura puede comprender un adaptador 5' y un ARN diana tal como miARN o isomiR. El producto de ligadura puede comprender un adaptador 3' y un ARN diana tal como miARN o isomiR. Además, la ligadura producida puede comprender un adaptador 5', un adaptador 3' y un ARN diana tal como miARN o isomiR.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método para determinar y/o cuantificar un ARN diana en una muestra que comprende las etapas de:
(i) llevar a cabo el método de acuerdo con el cuarto aspecto,
(ii) transcribir inversamente el producto de ligadura, obteniendo así un producto de ADNc a partir del ARN diana, y (iii) amplificar el ADNc, determinando y/o cuantificando así el ARN diana. En una realización, la transcripción inversa del producto de ligadura se lleva a cabo mediante
(iia) hibridación de un cebador para la transcripción inversa (cebador para RT) con el producto de ligadura, y (iib) transcripción inversa del producto de ligadura utilizando una transcriptasa inversa (RT).
En una realización preferida, dicha hibridación de un cebador para la transcripción inversa (cebador de RT) con el producto de ligadura en la etapa (iia) se lleva a cabo
entre 60 °C y 80 °C, por ejemplo, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 °C, preferiblemente a 65 °C o 75 °C, durante entre 2 y 7 minutos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 minutos, preferiblemente 3 o 5 minutos.
Por ejemplo, dicha hibridación se lleva a cabo a 65 °C durante entre 2 y 7 minutos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 minutos, preferiblemente 5 minutos. Alternativamente, dicha hibridación se lleva a cabo a 75 °C durante entre 2 y 7 minutos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 minutos, preferiblemente 3 minutos.
En una realización preferida (adicional o alternativa), dicha transcripción inversa del producto de ligadura mediante el uso de una transcriptasa inversa (RT) en la etapa (iib) se lleva a cabo.
entre 40 °C y 65 °C, por ejemplo, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, o 65 °C, preferiblemente a 50 °C, 55 °C, 58 °C o 62 °C, durante entre 10 y 40 minutos, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 minutos, preferiblemente 15 o 30 minutos, y
posteriormente entre 75 °C y 90 °C, por ejemplo, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 o 90 °C, preferiblemente a 85 °C, durante entre 2 y 4 minutos, por ejemplo, 2, 3 o 4 minutos, preferiblemente 3 minutos, o entre 60 °C y 75 °C, por ejemplo, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 o 75 °C, preferiblemente a 68 °C, durante entre 10 y 30 minutos, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 minutos, preferiblemente 15 minutos.
En particular, la transcriptasa inversa (RT) es Maxima H-RT o Tth polimerasa.
Por ejemplo, en el caso de que la transcriptasa inversa (RT) sea Maxima H-RT, dicha transcripción inversa se lleva a cabo a 55 °C durante 30 minutos y posteriormente a 85 °C durante 3 minutos.
Alternativamente, dicha transcripción inversa se realiza a 50 °C, 58 °C o 62 °C durante 15 minutos y posteriormente a 85 °C durante 3 minutos.
Por ejemplo, en el caso de que la transcriptasa inversa (RT) sea la Tth polimerasa, dicha transcripción inversa se lleva a cabo a 68 °C durante 15 minutos.
En la reacción de transcripción inversa, el adaptador 3' ligado al extremo terminal 3' del ARN diana se extiende, en particular en dirección 5' a 3', para formar una cadena inversa complementaria al ARN diana. En particular, en la reacción de transcripción inversa se produce una copia de ADNc del producto de ligadura. Para este proceso, la transcriptasa inversa (RT) requiere un cebador de RT. El cebador de r T es particularmente complementario inverso de la secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble del adaptador 3'. Por lo tanto, la secuencia del cebador de RT depende de la secuencia del adaptador 3'.
En una realización particular, el cebador de RT tiene la siguiente secuencia de 5' a 3': CTCAGTGCGAATACCTCGGACCCT (SEQ ID NO: 3) o es una variante de esta secuencia. El cebador de RT es, por lo tanto, complementario inverso de al menos una parte de la secuencia del adaptador 3' como se describió anteriormente. En particular, el cebador de RT es complementario inverso de los nucleótidos en la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' y en la secuencia bucle. Como se mencionó anteriormente, la secuencia del adaptador 3' es preferiblemente la siguiente de 5' a 3': /5Phos/CTCAGTGCAGGTCCGAGGTATTCGCACTGAG(6- 15x)N/3InvdT/ (SEQ ID NO: 2), en la que "/5Phosr indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, en la que (6-15x)N designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana, y en la que "/3InvdT/" representa desoxinucleótido invertido en 3'. Específicamente, los nucleótidos potenciados con LNA son ribonucleótidos.
La variante del cebador de RT tiene una secuencia que tiene al menos el 80 %, preferiblemente el 85 %, más preferiblemente el 90 %, incluso más preferiblemente el 95 %, aún más preferiblemente el 99 %, por ejemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 3. Tal variante de cebador de RT todavía es capaz de unirse a la secuencia del adaptador 3' y permitir la transcripción inversa que se realiza mediante una transcriptasa inversa (RT), por ejemplo, Maxima H-RT o Tth polimerasa. El experto puede evaluar fácilmente si una variante del cebador de R<t>todavía es capaz de unirse a la secuencia del adaptador 3' y permitir la transcripción inversa. Por ejemplo, la sección experimental proporciona suficiente información a este respecto.
Para analizar el ARN diana, su ADNc debe amplificarse (véase la etapa (iii) del método anterior). El ensayo puede ser cuantitativo, de modo que se pueda determinar la cantidad o copias del ARN diana en una muestra. Alternativamente, el ensayo puede ser cualitativo, de modo que se pueda determinar la presencia de un ARN diana en la muestra, pero no se pueda medir su nivel. Por lo tanto, el ensayo permite la determinación y cuantificación del ARN diana en una muestra.
En una realización preferida adicional (adicional o alternativa), el método comprende además entre las etapas (ii) y (iii) una etapa de preamplificación de ADNc. La reacción de preamplificación es una reacción de PCR "simple" y normalmente se realiza en una máquina de PCR "simple", donde, por ejemplo, no se detectan señales fluorescentes y no se utiliza una sonda TaqMan. Normalmente se utiliza un número de ciclo bajo.
La preamplificación requiere una ADN polimerasa, por ejemplo, una Taq polimerasa. La etapa de preamplificación del ADNc sirve para aumentar la sensibilidad de los ensayos. En una realización particular, dicha preamplificación de ADNc se realiza con un cebador directo que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3': TGGAGTGTGTGCTTTGCCACG (SEQ ID NO: 4) o con una variante de esta secuencia y un cebador inverso que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3': GTGCGAATACCTCGGACC (SEQ ID NO: 5) o con una variante de esta secuencia. Mientras que el cebador directo se deriva del adaptador 5', el cebador inverso se deriva del adaptador 3'. Estos diseños de cebadores hacen que la preamplificación dependa completamente de la ligadura de los adaptadores de 5' y 3' para preamplificar exclusivamente el producto de ligadura.
A este respecto, cabe señalar que el cebador inverso que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3': GTGCGAATACCTCGGACC (SEQ ID NO: 5) es complementario inverso de al menos una parte de la secuencia del adaptador 3' como se describió anteriormente. En particular, el cebador inverso es complementario inverso de los nucleótidos en la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' y en la secuencia del bucle. Como se mencionó anteriormente, la secuencia del adaptador 3' es preferiblemente la siguiente de 5' a 3': /5Phos/CTCAGTGC AGGTCCGAGGTATTCGCACTGAG(6-15x)N/31nvdT/ (SEQ ID NO: 2), en la que "/5Phos/" indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, en la que (6-15x)N designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana, y en la que "/3InvdTr representa desoxinucleótido invertido en 3'. Específicamente, los nucleótidos potenciados con LNA son ribonucleótidos.
Además, cabe señalar que el cebador directo que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3': TGGAGTGTGTGCTTTGCCACG (SEQ ID NO: 4) es en cambio complementario inverso al producto de ADN producido a partir del adaptador 5' en la reacción de transcripción inversa. Como se mencionó anteriormente, la secuencia del adaptador 5' es preferiblemente la siguiente de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGCGTGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 1), en la que "r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, y en el que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA.
Específicamente, los nucleótidos potenciados con LNA son ribonucleótidos. Alternativamente, la secuencia del adaptador 5' es la siguiente de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGCG/idSp/TGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 29), en la que "r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, en la que "idSp" significa espaciador que carece de base, y en la que
uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA.
Se puede utilizar cualquier método de preamplificación. En una realización preferida, la preamplificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La preamplificación mediante<p>C<r>se puede realizar de la siguiente manera: 95 °C durante 3 minutos, seguido de 12 ciclos a 95 °C durante 15 segundos y a 58 °C durante 4 minutos. Posteriormente la muestra de preamplificación se mantiene a 4 °C.
Después de la preamplificación o en lugar de la preamplificación, se lleva a cabo una reacción de amplificación. La amplificación requiere una ADN polimerasa, por ejemplo, una Taq polimerasa.
En una realización particular, la reacción de amplificación, se lleva a cabo con un cebador directo que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3': TGGAGTGTGTGCTTTGCCACG (SEQ ID NO: 4) o con una variante de esta secuencia y un cebador inverso que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3': GTGCGAATACCTCGGACC (SEQ ID NO: 5) o con una variante de esta secuencia (véase arriba). Se puede utilizar cualquier método de amplificación.
Específicamente, la amplificación se lleva a cabo usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Más específicamente, la PCR se selecciona del grupo que consiste en PCR en tiempo real (PCR cuantitativa o qPCR), preferiblemente qPCR Taq-man, PCR multiplex, PCR anidada, PR de alta fidelidad, PCR rápida, PCR de inicio en caliente y PCR rica en GC.
Aún más específicamente, la qPCR TaqMan se lleva a cabo con un cebador directo que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3': TGGAGTGTGTGCTTTGCCACG (SEQ ID NO: 4) o con una variante de esta secuencia y un cebador inverso que tiene lo siguiente secuencia de 5' a 3': GTGCGAATACCTCGGACC (SEQ ID NO: 5) o con una variante de esta secuencia. Mientras que el cebador directo se deriva del adaptador 5', el cebador inverso se deriva del adaptador 3'. Estos diseños de cebadores hacen que la amplificación dependa completamente de la ligadura de los adaptadores de 5' y 3' para amplificar exclusivamente el producto de ligadura. La amplificación utilizando una qPCR Taq-man se puede realizar de la siguiente manera: 95 °C durante 20 segundos, seguido de 40 ciclos a 95 °C durante 1 segundo y 60 °C durante 20 segundos. Posteriormente la muestra de amplificación se mantiene a 4 °C.
Aún más específicamente, la qPCR TaqMan se lleva a cabo en presencia de una sonda TaqMan. La secuencia de la sonda TaqMan depende de la secuencia del ARN diana. La sonda TaqMan es una sonda de hidrólisis diseñada para aumentar la especificidad de la PCR cuantitativa. En general, el principio de la sonda TaqMan se basa en la actividad exonucleasa 5'-3' de la Taq polimerasa para escindir una sonda con doble etiqueta durante la hibridación con la secuencia diana complementaria y la detección basada en fluoróforos. Como en otros métodos de PCR cuantitativa, la señal de fluorescencia resultante permite mediciones cuantitativas de la acumulación del producto durante las etapas exponenciales de la PCR. Sin embargo, la sonda TaqMan aumenta significativamente la especificidad de la detección.
La variante del cebador directo como se describió anteriormente tiene una secuencia que tiene al menos el 80 %, preferiblemente el 85 %, más preferiblemente el 90 %, incluso más preferiblemente el 95 %, aún más preferiblemente el 99 %, por ejemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 4. Tal variante de cebador directo todavía es capaz de unirse al producto de ADN producido a partir del adaptador 5' en la reacción de transcripción inversa. En otras palabras, la variante de cebador directo debe tener al menos en parte, por ejemplo, en una longitud de al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos, la misma secuencia que el adaptador 5'. En particular, las secuencias son idénticas, por ejemplo, en una longitud de al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos, en la región del bucle y en la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' del adaptador 5'. El experto puede evaluar fácilmente si una variante de cebador directo todavía es capaz de unirse al producto de ADN producido a partir del adaptador 5' en la reacción de transcripción inversa. Por ejemplo, la sección experimental proporciona suficiente información a este respecto.
Además, la variante del cebador inverso como se describió anteriormente tiene una secuencia que tiene al menos el 80 %, preferiblemente el 85 %, más preferiblemente el 90 %, incluso más preferiblemente el 95 %, aún más preferiblemente el 99 %, por ejemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 5. Dicha variante de cebador inverso todavía es capaz de unirse a la secuencia del adaptador 3' y permitir la preamplificación/amplificación del ADNc. El experto puede evaluar fácilmente si una variante de cebador inverso todavía es capaz de unirse a la secuencia del adaptador 3' y permitir la preamplificación/amplificación del ADNc. Por ejemplo, la sección experimental proporciona suficiente información a este respecto.
En los métodos de acuerdo con el cuarto y/o quinto aspecto de la presente invención, la muestra es preferiblemente una muestra biológica. La muestra biológica puede ser cualquier muestra que tenga un origen biológico. Por ejemplo, la muestra biológica puede ser una muestra de fluido corporal, por ejemplo, una muestra de sangre o una muestra de orina, o una muestra de tejido, por ejemplo, una muestra de biopsia de tejido. Las muestras biológicas pueden mezclarse o combinarse, por ejemplo, una muestra puede ser una mezcla de una muestra de sangre y una muestra de orina.
La muestra de fluido corporal puede ser una muestra de orina, muestra de sangre, muestra de esputo, muestra de leche materna, muestra de fluido cefalorraquídeo (LCR), muestra de cerumen (cera de los oídos), muestra de jugo gástrico, muestra de moco, muestra de linfa, muestra de fluido de endolinfa, muestra de fluido de perilinfa, muestra de fluido peritoneal, muestra de fluido pleural, muestra de saliva, muestra de sebo (aceite de la piel), muestra de semen, muestra de sudor, muestra de lágrimas, hisopo de mejilla, muestra de secreción vaginal, biopsia líquida o muestra de vómito, incluidos componentes o fracciones de los mismos. El término "muestra de fluido corporal" también abarca fracciones de fluido corporal, por ejemplo, fracciones de sangre, fracciones de orina o fracciones de esputo. Las muestras de fluidos corporales pueden mezclarse o combinarse. Por lo tanto, una muestra de fluido corporal puede ser una mezcla de una muestra de sangre y orina o una mezcla de una muestra de sangre y fluido cefalorraquídeo.
Más preferiblemente, la muestra biológica es una muestra de sangre. Aún más preferiblemente, la muestra de sangre es sangre entera o una fracción de sangre, preferiblemente células sanguíneas (por ejemplo, eritrocitos, leucocitos y/o trombocitos), suero o plasma. Por ejemplo, la fracción de células sanguíneas abarca eritrocitos, leucocitos y/o trombocitos. La muestra de sangre entera se puede recolectar mediante un tubo de extracción de sangre. Se recoge, por ejemplo, en un tubo de ARN sanguíneo PAXgene, en un tubo de ARN sanguíneo Tempus, en un tubo de EDTA, en un tubo de citrato de Na, en un tubo de heparina o en un tubo de ACD (citrato ácido dextrosa). La muestra de sangre entera también puede recogerse mediante una técnica de gota de sangre, por ejemplo, utilizando un dispositivo de micromuestreo Mitra. Esta técnica requiere volúmenes de muestra más pequeños, normalmente entre 45 y 60 μl para seres humanos o menos. Por ejemplo, se puede extraer sangre entera del paciente mediante un pinchazo en el dedo con una aguja o lanceta. Por lo tanto, la muestra de sangre entera puede tener la forma de una gota de sangre. Luego se coloca dicha gota de sangre sobre una sonda absorbente, por ejemplo, un material polimérico hidrófilo tal como la celulosa, que es capaz de absorber la sangre entera. Una vez que se completa el muestreo, la gota de sangre se seca al aire antes de transferirla o enviarla por correo a los laboratorios para su procesamiento. Debido a que la sangre está seca, no se considera peligrosa. Por lo tanto, no es necesario tomar precauciones especiales en el manejo o envío. Una vez en el lugar de análisis, los componentes deseados, por ejemplo, los miARN se extraen de las manchas de sangre seca en un sobrenadante que luego se analiza más a fondo.
En los métodos de acuerdo con el cuarto y/o quinto aspecto de la presente invención, la muestra también puede ser una muestra que contiene ARN total. En particular, el ARN total incluye ARN que tiene una longitud de <200 nucleótidos, tal como un miARN o una isoforma de miARN (una isomiR). Específicamente, la muestra utilizada en los métodos de acuerdo con el cuarto y/o quinto aspecto de la presente invención contiene ARN celular total. En particular, el ARN celular total incluye ARN que tiene una longitud de <200 nucleótidos, tal como un miARN o una isoforma de miARN (una isomiR). El ARN celular total puede obtenerse de células sanguíneas, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos y/o trombocitos.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad o afección en un paciente que comprende las etapas de:
(ia) llevar a cabo los métodos de acuerdo con el cuarto y/o quinto aspecto, determinando así la presencia o ausencia del ARN diana, y
(iia) diagnosticar si el paciente padece la enfermedad o afección en función de la presencia o ausencia del ARN diana, o
(ib) llevar a cabo los métodos de acuerdo con el cuarto y/o quinto aspecto, cuantificando así el ARN diana,
(iib) comparar el ARN diana cuantificado con una referencia, y
(iiib) diagnosticar si el paciente padece la enfermedad o afección basándose en la comparación.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad o afección en un paciente que comprende las etapas de:
(i) llevar a cabo los métodos de acuerdo con el cuarto y/o quinto aspecto, determinando así la presencia o ausencia del ARN diana, y
(ii) diagnosticar si el paciente padece la enfermedad o afección basándose en la presencia o ausencia del ARN diana.
Por consiguiente, la presencia o ausencia del ARN diana es indicativa de la enfermedad o afección. Por ejemplo, se diagnostica que el paciente padece la enfermedad o afección, si el ARN diana está presente o ausente. Alternativamente, se diagnostica que el paciente no padece la enfermedad o afección, si el ARN diana está presente o ausente.
Alternativamente, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad o afección en un paciente que comprende las etapas de:
(i) llevar a cabo los métodos de acuerdo con el cuarto y/o quinto aspecto, cuantificando así el ARN diana,
(ii) comparar el ARN diana cuantificado con una referencia, y
(iii) diagnosticar si el paciente padece la enfermedad o afección basándose en la comparación.
En particular, la referencia es un ARN diana de referencia. Más particularmente, la referencia es una referencia obtenida de uno o más sujetos sanos (control). Aún más particularmente, la referencia es el ARN diana de referencia cuantificado determinado en uno o más sujetos sanos (control). Si se han analizado dos o más sujetos sanos (control), la cantidad del ARN diana de referencia puede indicarse como valor medio. Por ejemplo, se diagnostica que el paciente padece la enfermedad o afección si el ARN diana cuantificado está por encima o por debajo del ARN diana de referencia cuantificado, por ejemplo, obtenido de uno o más sujetos sanos (control). Alternativamente, se diagnostica que el paciente no padece la enfermedad o afección, si el ARN diana cuantificado está por encima o por debajo del ARN diana de referencia cuantificado, por ejemplo, obtenido de uno o más sujetos sanos (control). La referencia también puede ser una referencia obtenida de uno o más sujetos (control) que padecen una enfermedad o afección.
En una realización preferida, el ARN diana cuantificado es un miARN o una isoforma de miARN (una isomiR). En otra realización preferida, el ARN diana de referencia cuantificado es un miARN o una isoforma de miARN (una isomiR).
Específicamente, el ARN diana y el ARN diana de referencia son idénticos, es decir, del mismo tipo de ARN, por ejemplo, ambos ARN son miARN.
En una realización preferida (adicional o alternativa), la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad neurodegenerativa, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa y cáncer. En una realización más preferida,
(i) la enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer (EA) y otras demencias, enfermedad de Parkinson (EP) y enfermedades relacionadas con la EP, enfermedad priónica, enfermedades de las neuronas motoras (ENM), enfermedad de Huntington (EH), ataxia espinocerebelosa (AEC), atrofia muscular espinal (AME), complejo de demencia del SIDA y aterosclerosis,
(ii) la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en diabetes, artritis reumatoide (AR), esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (lupus), enfermedad de Graves, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, vasculitis anemia perniciosa y enfermedad celíaca,
(iii) la enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en infección viral, preferiblemente infección viral crónica o persistente, infección bacteriana, infección parasitaria, o
(iv) el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de piel, cáncer nasofaríngeo, cáncer neuroendocrino, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer urotelial, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de riñón , cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de mama, cáncer renal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer linfático, cáncer de sangre, cáncer de células escamosas, cáncer de laringe, cáncer de retina, cáncer de próstata, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer testicular, cáncer de hueso, linfoma y leucemia.
En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un kit que comprende
el adaptador 5' de acuerdo con el primer aspecto, y
el adaptador 3' de acuerdo con el segundo aspecto, o
la combinación de acuerdo con el tercer aspecto.
En una realización preferida, el kit comprende además una ARN ligasa de cadena doble, preferiblemente una ARN ligasa 2 (Rnl2) T4 o una Kod1 ligasa. En este caso, el kit preferiblemente comprende además instrucciones sobre cómo llevar a cabo el método de acuerdo con el cuarto aspecto. El kit con esta composición preferiblemente permite además llevar a cabo el método de acuerdo con el cuarto aspecto.
En una realización preferida (adicional o alternativa), el kit comprende además
una transcriptasa inversa (RT), preferiblemente una Maxima H-RT o una Tth polimerasa, y un cebador de RT que permite la transcripción inversa del ARN diana para obtener un producto de ADNc a partir del ARN diana, y/o
una ADN polimerasa, preferiblemente una Taq polimerasa, y un cebador directo y/o un cebador inverso que permite la preamplificación y/o amplificación del ADNc.
En este caso, el kit preferiblemente comprende además instrucciones sobre cómo llevar a cabo el método de acuerdo con el quinto aspecto. El kit con esta composición preferiblemente permite además llevar a cabo el método de acuerdo con el quinto aspecto.
Opcionalmente, el kit comprende además una sonda TaqMan.
En cuanto a los cebadores RT, directos y/o inversos específicos, se hace referencia al quinto aspecto de la presente invención.
En una realización preferida adicional (adicional o alternativa), el kit comprende además una referencia. En este caso, el kit preferiblemente comprende además instrucciones sobre cómo llevar a cabo el método de acuerdo con el sexto aspecto. El kit con esta composición preferiblemente permite además llevar a cabo el método de acuerdo con el sexto aspecto.
En cuanto a la referencia, se hace referencia al sexto aspecto de la presente invención.
En vista de lo anterior, el kit comprende en una realización más preferida los siguientes componentes:
(i) el adaptador 5' de acuerdo con el primer aspecto y el adaptador 3' de acuerdo con el segundo aspecto o la combinación de acuerdo con el tercer aspecto,
(ii) una transcriptasa inversa (RT), preferiblemente una Maxima H-RT o una Tth polimerasa, y un cebador de RT que permite la transcripción inversa del ARN diana para obtener un producto de ADNc a partir del ARN diana, y/o
(iii) una ADN polimerasa, preferiblemente una Taq polimerasa, y un cebador directo y/o un cebador inverso que permite la preamplificación y/o amplificación del ADNc.
Opcionalmente, el kit comprende además una sonda TaqMan.
El kit comprende en una realización aún más preferida los siguientes componentes:
(i) el adaptador 5'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGCGTGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 1), en la que "r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, y en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, o una variante de esta secuencia, y
el adaptador 3'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3': /5Phos/CTCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGAG(6-15x)N/3InvdT/ (SEQ ID NO: 2), en la que "/5Phos/" indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana , y en la que "/3InvdT/" representa desoxinucleótido invertido en 3', o una variante de esta secuencia,
(ii) una transcriptasa inversa (RT), preferiblemente una Maxima H-RT o una Tth polimerasa, y un cebador de RT que tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 o una variante de esta secuencia, y/o
(iii) una ADN polimerasa, preferiblemente una Taq polimerasa, y un cebador directo que tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 o una variante de esta secuencia y/o un cebador inverso que tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 o un variante de esta secuencia.
Opcionalmente, el kit comprende además una sonda TaqMan.
Alternativamente, el adaptador 5' mencionado anteriormente se reemplaza por un adaptador 5' que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGCG/idSp/TGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 29), en la que "r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, en la que "idSp" significa espaciador que carece de base, y en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, o una variante de esta secuencia.
El kit comprende en una realización aún más preferida los siguientes componentes:
(i) el adaptador 5'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGGCGTGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 1), en la que "r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, y en la que uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de los nucleótidos en negrita están potenciados con LNA, o una variante de esta secuencia, y
el adaptador 3'
que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
/5Phos/CTCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGAG(6-15x)N/3InvdT/ (SEQ ID NO: 2), en la que "/5Phos/" indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3 ) de los nucleótidos en negrita están potenciados con LNA, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana, y en la que "/3InvdTr representa desoxinucleótido invertido en 3',
o una variante de esta secuencia,
(ii) una transcriptasa inversa (RT), preferiblemente una Maxima H-RT o una Tth polimerasa, y un cebador de RT que tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 o una variante de esta secuencia, y/o
(iii) una ADN polimerasa, preferiblemente una Taq polimerasa, y un cebador directo que tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 o una variante de esta secuencia y/o un cebador inverso que tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 o un variante de esta secuencia.
Opcionalmente, el kit comprende además una sonda TaqMan.
Alternativamente, el adaptador 5' mencionado anteriormente se reemplaza por un adaptador 5' que tiene la siguiente secuencia de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGGCG/idSp/TGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 29), en la que"r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, en la que "idSp" significa espaciador que carece de base, y en la que uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de los nucleótidos en negrita están potenciados con LNA, o una variante de esta secuencia.
En cuanto a las variantes específicas descritas anteriormente, se hace referencia al primer, segundo, cuarto y quinto aspecto de la presente invención.
El kit puede comprender además
(i) uno o más contenedores para los diferentes componentes del kit, y/o
(ii) un soporte de datos.
Dicho soporte de datos puede ser un soporte de datos no electrónico, por ejemplo, un soporte de datos gráficos tal como un folleto informativo, una hoja informativa, un código de barras o un código de acceso, o un soporte de datos electrónicos tal como un disquete, un disco compacto (CD), un disco versátil digital (DVD), un microchip u otro soporte de datos electrónico basado en semiconductores. El código de acceso puede permitir el acceso a una base de datos, por ejemplo, una base de datos de Internet, una base de datos centralizada o una descentralizada. El código de acceso también puede permitir el acceso a una aplicación de software que hace que un ordenador realice tareas para los usuarios de ordenadores o una aplicación móvil que es un software diseñado para ejecutarse en teléfonos inteligentes y otros dispositivos móviles.
Dicho soporte de datos puede comprender además una referencia como se describe en el contexto del sexto aspecto. En caso de que el soporte de datos comprenda un código de acceso que permita el acceso a una base de datos, dicha referencia se deposita en esta base de datos.
Además, el soporte de datos puede comprender información o instrucciones sobre cómo llevar a cabo los métodos del cuarto al sexto aspecto de la presente invención.
Dicho kit también puede comprender materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario que incluyen un tampón o tampones, un reactivo o reactivos y/o un diluyente o diluyentes que podrían ser posibles para llevar a cabo los métodos del cuarto al sexto aspecto de la presente invención. En particular, el kit también puede comprender tampones y componentes para llevar a cabo la hibridación y ligadura de los dos adaptadores a un ARN diana, tampones y componentes para llevar a cabo la transcripción inversa del ARN diana, y/o tampones y componentes para llevar a cabo la preamplificación y /o amplificación del ARN diana.
Diversas modificaciones y variaciones de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance de la invención. Aunque la invención se ha descrito en relación con realizaciones preferidas específicas, debe entenderse que la invención tal como se reivindica no debe limitarse indebidamente a tales realizaciones específicas. De hecho, se pretende que la presente invención cubra diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para los expertos en la técnica en los campos relevantes.
Breve descripción de las figuras
Las siguientes figuras son meramente ilustrativas de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención como lo indican las reivindicaciones adjuntas de ninguna manera.
Figura 1: Muestra una estructura híbrida a modo de ejemplo de adaptador 5', adaptador 3' y miARN diana. En esta estructura, el adaptador 5' tiene la siguiente secuencia: 5'ATCTACGGTTCGTGGCGTGGAGTGTGTGCTTT GCCArCrG 3' (SEQ ID NO: 6), en la que "r" significa ribonucleótido, en la que la secuencia en negrita designa la secuencia complementaria inversa a la secuencia extremo terminal 5' del ARN diana miR-100-5p, y en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA. En esta estructura, el adaptador 3' tiene la siguiente secuencia: 5' /5Phos/CTCAGTGC AGGTCCGAGGTATTCGCACTGAGCACAAGT/3InvdT/ 3' (SEQ ID NO: 7), en la que "/5Phos/" indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, en la que la secuencia en negrita designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' del ARN diana miR-100-5p, y en la que "/3InvdT/" representa desoxinucleótido invertido en 3'. El ARN diana miR-100-5p tiene la siguiente secuencia: 5'AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG3' (SEQ ID NO: 8). Las secuencias complementarias inversas a los adaptadores 5'/3' se indican en negrita.
Figura 2: Resultados de ensayos comerciales y ensayos de PCR DB en el banco de pruebas de 8 variantes de miR-100-5p. En las columnas se enumeran las plantillas de ARN que se utilizaron, en las filas los ensayos respectivos. Los números representados son valores de Ct proporcionados por el instrumento de qPCR ABI Flex6. Cuanto menor es el número de Ct, más ARN se detecta en la muestra. Lo resaltado en verde indica dónde solo se espera la señal. A. Se probaron ensayos comerciales de cebadores basados en LNA en 60 amol de la plantilla de ARN. B. El ensayo comercial basado en el cebador de tallo-bucle se probó en 60 amol de la plantilla de ARN. C. Se probó un ensayo comercial basado en un híbrido cebador-sonda en 2 pmol de la plantilla de ARN. D. El ensayo PCR DB sin etapa de preamplificación se probó en 10 fmol de la plantilla de ARN.
Figura 3: Resultados del experimento del ensayo PCR DB realizado de manera similar a como se muestra en la Figura 2, pero con 60 amol de la plantilla de ARN y 7 ciclos de preamplificación.
Figura 4: Secuencia de<a>R<n>diana miR-100-5p y de variantes de ARN diana miR-100-5p utilizadas para los análisis mostrados en las Figuras 1 y 2.
Figura 5: Detección del miR-100-5p silvestre endógeno (A.) y la eliminación de 3' (B.) en la muestra de ARN de PAXgene. Se indica la cantidad de muestra de ARN añadida a la reacción, así como los valores de Ct resultantes de PCR DB con 7 ciclos de preamplificación.
Figura 6: Descripción general de los adaptadores de 5' y 3', los cebadores de transcripción inversa (RT), los cebadores directos e inversos y las sondas TaqMan utilizadas para los diferentes miARN en la configuración experimental. Figura 7: Combinaciones específicas de variante de miARN, adaptador 5', adaptador 3' y sonda TaqMan.
Ejemplos
Los ejemplos que se dan a continuación tienen fines ilustrativos únicamente y no limitan la invención descrita anteriormente de ninguna manera.
1. Materiales y métodos
En primer lugar, los adaptadores se desnaturalizan y renaturalizan de manera que formen las estructuras requeridas en forma de tallo-bucle. El ARN se desnaturaliza por separado, se mezcla con adaptadores y se utiliza para la ligadura mediante Rnl2. Posteriormente, se utiliza el cebador de RT que se alinea con el adaptador 3' para la producción de ADNc. El ADNc se preamplifica (por ejemplo, usando una mezcla de pre amplificación de Biorad) y luego se usa para la qPCR con un cebador inverso que se alinea con el extremo terminal 5' del ADNc de la primera cadena y un cebador directo complementario al extremo terminal 3' de la primera cadena de ADNc. Finalmente, se utiliza una sonda TaqMan para la detección de la señal específica en qPCR.
En la Figura 1 se muestran un ejemplo de adaptador 5' (SEQ ID NO: 6) y un ejemplo de adaptador 3' (SEQ ID NO: 7). Estos adaptadores se dirigen al miR-100-5p (Se Q ID NO: 8) .
Detalles del protocolo:
Se diseñaron adaptadores, cebadores y sondas de manera que puedan reconocer y ser específicos para el miR-100-5p y sus variantes (enumeradas en la Figura 3). Los miR sintéticos se ordenaron en forma 5'fosforilada. La lista completa de adaptadores, sondas y cebadores se muestra en la Figura 6. Todos los oligos se ordenaron en forma seca.
Todos los oligos se diluyeron en agua libre de nucleasas hasta una concentración de 100 μM y se almacenaron a -20 °C en la oscuridad. Luego se prepararon los adaptadores de la siguiente manera:
A continuación, se preparó ARN mediante desnaturalización. Indique la cantidad de ARN total de PAXgene que se usó o la cantidad indicada de miR-100-5p tipo silvestre sintético y se usaron variantes en un conjunto equimolar. El ARN se desnaturalizó durante 2 min a 70 °C y se colocó inmediatamente en hielo.
A continuación, se preparó la reacción de ligadura con los siguientes componentes. Después de que la reacción se mezclara bien, se incubó durante 1 hora a 37 °C.
A continuación, se usó ARN ligado para la reacción de transcripción inversa usando el cebador de RT, como se indica en el siguiente protocolo.
Después de la transcripción inversa, el ADNc se usó para una reacción de preamplificación usando una mezcla madre de preamplificación comercial (BioRad). Posteriormente, el ADNc previamente amplificado se diluyó y se almacenó a -20 °C.
Finalmente, se usaron ensayos de qPCR usando ADNc diluido, incluidas sondas Taqman. La reacción se realizó en una máquina ABI Flex 6 en formato de 384 pocillos.
2. Resultados
El protocolo de PCR DB original se mejoró en los aspectos de ligadura. Luego se utilizó para comparar con los principales ensayos comerciales disponibles, como se muestra en la Figura 2. Se pudo demostrar claramente que el protocolo "PCR mejorada con mancuernas (DB)" tenía una especificidad superior en comparación con los otros ensayos. El protocolo se optimizó aún más con una etapa de preamplificación para crear una "PCR DB avanzada". De esta forma se podría alcanzar una alta sensibilidad sin perder especificidad (Figura 3).
Es importante señalar que el ensayo se puede utilizar en fuentes biológicas de ARN tales como muestras clínicas, por ejemplo, muestra de a Rn de sangre entera PAXgene. El protocolo PCR DB original no puede detectar miR-100-5p en una muestra de ARN de PAXgene humano (datos no mostrados). El protocolo avanzado de PCR DB puede detectar miR-100-5p en una muestra de ARN de PAXgene (Figura 5), y en su forma de tipo silvestre o canónica, así como la variante de eliminación de 3'.
Las secuencias de los adaptadores específicos y las sondas Taqman utilizadas para la detección se muestran en la Figura 6. Las combinaciones de los adaptadores y sondas utilizadas para los ensayos de discriminación se muestran en la Figura 7.
3. Secuencias de los adaptadores y cebadores (en orientación 5' -> 3')
Adaptador de 5' de 5' a 3':
(6-15x)NCGTGCGTGGAGTGTGTGCTTTGCCArCrG (SEQ ID NO: 1), en la que "r" representa ribonucleótido, en la que "(6-15x)N" designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, y en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y/o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA. Un ejemplo de adaptador 5' dirigido a miR-100-5p tiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 6.
Adaptador de 3' de 5' a 3' :
/5Phos/CTCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGAG(6-15x)N/3InvdT/(SEQ ID NO: 2), en la que"/5Phos/" indica que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado, en la que uno o más nucleótidos en la porción subrayada y /o uno o más nucleótidos en la porción doblemente subrayada están potenciados con LNA, en la que (6-15x)N designa la secuencia complementaria inversa a una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana, y en la que "/3InvdT/" representa un desoxinucleótido invertido en 3'. Un ejemplo de adaptador 3' dirigido a miR-100-5p tiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 7.
Cebador RT de 5' a 3': CTCAGTGCGAATACCTCGGACCCT (SEQ ID NO: 3)
Cebador directo de 5' a 3': TGGAGTGTGTGCTTTGCCACG (SEQ ID NO: 4)
Cebador inverso de 5' a 3': GTGCGAATACCTCGGACC (SEQ ID NO: 5).
Claims (15)
1. Un adaptador 5' que comprende en el siguiente orden de 5' a 3'
(i) una secuencia de nucleótidos del extremo terminal 5' que comprende de 6 a 15 desoxinucleótidos, en la que dichos 6 a 15 desoxinucleótidos son complementarios inversos de una secuencia del extremo terminal 5' de un ARN diana, y
(ii) una secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de cadena doble, en la que al menos 2 nucleótidos en su extremo terminal 3' son ribonucleótidos o ribonucleótidos modificados y en la que la secuencia de nucleótidos está potenciada con nucleótidos bloqueados (LNA).
2. El adaptador 5' de la reivindicación 1,
en el que la secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle comprende una primera secuencia de tallo posicionada en 5' y una segunda secuencia de tallo posicionada en 3' que son complementarias inversamente entre sí,
en el que preferiblemente cada una de la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' tiene una longitud de entre 5 y 10 nucleótidos, y
en la que más preferiblemente la primera secuencia de tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia de tallo posicionada en 3' tienen la misma longitud.
3. El adaptador 5' de la reivindicación 2,
en el que la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' está o están potenciados con LNA, y
en el que preferiblemente la secuencia potenciada con LNA comprende entre 2 y 5 nucleótidos bloqueados.
4. Un adaptador 3' que comprende en el siguiente orden de 5' a 3'
(i) una secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle que contiene un bucle y un tallo de doble cadena, en la que el nucleótido del extremo terminal 5' está fosforilado y en la que la secuencia de nucleótidos está potenciada con nucleótido bloqueado (LNA), y
(ii) una secuencia de nucleótidos del extremo terminal 3' que comprende de 6 a 15 desoxinucleótidos, en la que dichos 6 a 15 desoxinucleótidos son complementarios inversos de una secuencia del extremo terminal 3' de un ARN diana y en la que el desoxinucleótido del extremo terminal 3' es un desoxinucleótido invertido.
5. El adaptador 3' de la reivindicación 4,
en el que la secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura de tallo-bucle comprende una primera secuencia de tallo posicionada en 5' y una segunda secuencia de tallo posicionada en 3' que son complementarias inversamente entre sí,
en el que preferiblemente cada una de la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' tiene una longitud de entre 5 y 10 nucleótidos,
en el que más preferiblemente la primera secuencia de tallo posicionada en 5' y la segunda secuencia de tallo posicionada en 3' tienen la misma longitud.
6. El adaptador 3' de la reivindicación 5,
en el que la primera secuencia del tallo posicionada en 5' y/o la segunda secuencia del tallo posicionada en 3' está o están potenciados con LNA, y
en el que preferiblemente la secuencia potenciada con LNA comprende entre 2 y 5 nucleótidos bloqueados.
7. Una combinación que comprende
el adaptador 5' de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y
el adaptador 3' de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8. Un método para ligar dos adaptadores a un ARN diana en una muestra que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una composición que comprende un ARN diana desnaturalizado en una muestra, el adaptador 5' renaturalizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y el adaptador 3' renaturalizado de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el adaptador 5' y el adaptador 3' se hibrida con el ARN diana, y
(ii) ligar el adaptador 5' y el adaptador 3' al ARN diana usando/con una ARN ligasa de cadena doble, produciendo de este modo un producto de ligadura.
9. El método de la reivindicación 8, en el que
(i) el ARN diana desnaturalizado se produce calentando el ARN diana entre 65 °C y 75 °C, preferiblemente a 70 °C, durante entre 1 a 3 minutos, preferiblemente durante 2 minutos,
(ii) el adaptador 5' renaturalizado se produce desnaturalizando el adaptador 5' entre 75 °C y 85 °C, preferiblemente a 82 °C, durante entre 1 a 3 minutos, preferiblemente durante 2 minutos, y
renaturalizar el adaptador 5' enfriándolo a 4 °C, preferiblemente a una velocidad de 0.1 °C/s, y/o
(iii) el adaptador 3' renaturalizado se produce desnaturalizando el adaptador 3' entre 75 °C y 85 °C, preferiblemente a 82 °C, durante entre 1 a 3 minutos, preferiblemente durante 2 minutos, y
renaturalizar el adaptador 3' enfriándolo a 4 °C, preferiblemente a una velocidad de 0.1 °C/s.
10. El método de las reivindicaciones 8 o 9, en el que los adaptadores de 5' y 3' renaturalizados se producen por separado y en ausencia de ARN diana.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la composición se produce mezclando el ARN diana desnaturalizado, el adaptador 5' renaturalizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y el adaptador 3' renaturalizado de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 entre sí, hibridando así el adaptador 5' y el adaptador 3' con el ARN diana.
12. Un método para determinar y/o cuantificar un ARN diana en una muestra que comprende las etapas de:
(i) llevar a cabo el método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11,
(ii) transcribir inversamente el producto de ligadura, obteniendo así un producto de ADNc a partir del ARN diana, y (iii) amplificar el ADNc, determinando y/o cuantificando así el ARN diana.
13. El método de la reivindicación 12, en el que la transcripción inversa del producto de ligadura se lleva a cabo mediante
(iia) hibridar un cebador para la transcripción inversa (cebador de RT) con el producto de ligadura, y
(iib) transcripción inversa del producto de ligadura utilizando una transcriptasa inversa (RT).
14. Un método para diagnosticar una enfermedad o afección en un paciente que comprende las etapas de:
(ia) llevar a cabo los métodos de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, determinando así la presencia del ARN diana, y
(iia) diagnosticar si el paciente padece la enfermedad o afección basándose en la presencia del ARN diana, o (ib) llevar a cabo los métodos de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, cuantificando así el ARN diana, (iib) comparar el ARN diana cuantificado con una referencia, y
(iiib) diagnosticar si el paciente padece la enfermedad o afección basándose en la comparación.
15. Un kit que comprende
el adaptador 5' de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y
el adaptador 3' de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, o
la combinación de la reivindicación 7.
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