JP2007536906A - Gag結合蛋白質 - Google Patents
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Abstract
Description
ケモカインは、化学誘引物質サイトカインを起源とし、実際は50より多いメンバーを含み、そして小さくて誘導可能な、そして分泌される、低分子量の蛋白質(それらのモノマー形態において6−12kDa)のファミリーを表し、免疫監視機構及び炎症のプロセスの間に決定的な役割を担う。免疫及び炎症におけるそれらの機能に依存して、それらは、2つのクラスに区別することができる。多くの異なる組織細胞により、並びに細菌の毒素及び炎症性サイトカイン、例えばIL−1,TNF及びインターフェロンに応答して白血球を移入する(immigrating)ことにより、炎症性ケモカインは生産される。それらの主な機能は、宿主の防御のため及び炎症のプロセスにおいて白血球を補充することである。ホーミングケモカインは、他方、リンパ組織の規定されたエリアにおいて構成的に発現される。それらは、免疫系において白血球及び星状細胞の往来及びホーミングを指示する。これらのケモカインは、BCA−1,SDF−1又はSLCにより例示されたとおり、成熟、分化、活性化のコンテクストにおいて白血球の再配置及び再循環を制御し、そして二次リンパ器官内でそれらの正確なホーミングを確保する(ensure)。
―構造保持に必須でない蛋白質中の領域を同定すること
―塩基性アミノ酸を上記部位中に導入するか、及び/又は、少なくとも一つの巨大な及び/又は酸性のアミノ酸を上記部位において欠失させること
を含み、GAG結合部位はKd≦10μM、好ましくは≦1μM、さらに好ましくは≦0.1μMのGAG結合親和性を有する。塩基性アミノ酸を上記部位中に導入するか、及び/又は、少なくとも一つの巨大な及び/又は酸性のアミノ酸を上記部位において欠失させることにより、新規で改良された「人工の」GAG結合部位が上記蛋白質に導入される。これは、上記修飾の前にはGAG結合活性を示さなかった蛋白質へのGAG結合部位の新規で完璧な導入を含む。これは、既にGAG結合活性を示す蛋白質へのGAG結合部位の導入も含む。新規なGAG結合部位は、GAG結合親和性を示さない蛋白質の領域並びにGAG結合親和性を示す蛋白質の領域へ導入することができる。しかしながら、本発明のもっとも好ましい態様によれば、与えられたGAG結合蛋白質のGAG結合親和性の修飾が提供され、上記修飾された蛋白質のGAG結合能力が野生型蛋白質に比べて増加する。本発明は、GAG結合部位を蛋白質に導入する方法、修飾されたGAG結合蛋白質、並びに単離されたDNA分子、ベクター、組換え細胞、薬学組成物、及び上記修飾された蛋白質の使用法に関する。
蛋白質の領域が構造の保持に必須であるか否かは、例えば、当業者には知られている特定のプログラムとともにコンピュータの方法により試験することができる。蛋白質の修飾の後に、コンフォメーションの安定性をインシリコにて試験することが好ましい。
・全体の構造保持に必須ではなくかつGAG結合に適しているかもしれない蛋白質の領域を同定する
・何れかの位置において塩基性Arg,Lys,His,Asn及び/又はGln残基を導入すること(置換又は挿入)により新規のGAG結合部位をデザインする
・インシリコにおいて結果の変異蛋白質のコンフォメーションの安定性をチェックする
・野生型蛋白質のcDNAをクローン化する(あるいは:cDNAを購入する)
・これをPCR−補助変異導入法のための鋳型として使用することによりアミノ酸配列に上記の変化を導入する
・変異体遺伝子を適当な発現系にサブクローン化する(生物学上必要とされる翻訳後修飾に依存して原核生物又は真核生物)
・インビトロにおいて変異体蛋白質の発現、精製及び特性決定
・導入されたGAG結合親和性Kd GAG(変異体)<10μMの基準。
上記の修飾の蛋白質のGAG結合親和性が各野生型蛋白質のGAG結合親和性に比較して増加しているか否かは、上記のとおり、例えば、解離定数を測定する蛍光滴定実験の助けを借りて測定することができる。改良されたGAG結合親和性に関する基準は、Kd(変異体)<Kd(野生型)であり、好ましくは少なくとも100%である。特別に改良されて修飾のされた蛋白質は、野生型のKdに比較して、最小5、好ましくは最小10、さらに好ましくは最小100のファクターだけ高いGAG結合親和性を有する。増加したGAG結合親和性は、よって、好ましくは10μM以下、好ましくは10μM以下、さらに好ましくは0.1μM以下のKdを示す。
好ましくは、Arg,Lys,及びHisからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が上記GAG結合領域に挿入される。これらのアミノ酸は、GAG結合領域に容易に挿入されるが、用語「挿入される」は、挿入それ自体並びにあらゆる非塩基性アミノ酸をアルギニン、リジン又はヒスチジンで置換することに関する。もちろん、一つより覆い塩基性アミノ酸を挿入することが可能であり、それにより同じ塩基性アミノ酸が挿入されるか又は上記アミノ酸2つ又は3つの組み合わせでもよい。
実施例
実施例1:組換えIL−8遺伝子の生成及び変異体のクローン化
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)技術を用いることにより、センス及びアンチセンス変異導入プライマーを用いて変異を導入して変異体に関しての所望のcDNAsを生成した。wtIL−8に関するcDNAを含む合成プラスミドを鋳型として用い、Clontech Advantage(登録商標)2ポリメラーゼミックスをDNAポリメラーゼとして適用し、そしてPCR反応をエッペンドルフマスターグラディエントサイクラーを用いて実施した。用いられた変異導入プライマーは以下の表に要約され、フォワードプライマーから始める(5’から3’):
・CACC ATG TGT CAG TGT ATA AAG ACA TAC TCC(変異Δ6のためのプライマー)
・CACC ATG TGT CAG TGT ATA AAG ACA TAC TCC AAA CCT AGG CAC CCC AAA AGG ATA(変異Δ6 F17R F21Rのためのプライマー)
リバースプライマーは(5’から3’):
・TTA TGA ATT CCT AGC CCT CTT(変異E70Rのためのプライマー)
・TTA TGA ATT CTT AGC CCT CTT(変異E70Kのためのプライマー)
・TTA TGA CTT CTC AGC CCT CTT(変異N71Kのためのプライマー)
・TTA TGA CTT CTT AGC CCT CTT(変異E70K N71Kのためのプライマー)
・TTA TGA CTT CCT AGC CCT CTT(変異E70R N71Kのためのプライマー)
・TTA TGA CCT CTT AGC CCT CTT(変異E70K N71Rのためのプライマー)
・TTA TGA CCT CCT AGC CCT CTT(変異E70R N71Rのためのプライマー)。
実施例2:組換え蛋白質の発現及び精製
配列が確認されたら、発現のために、構築物によりカルシウム−コンピテントBL21(DE3)エシェリヒアコリを形質転換した。細胞を撹拌しながら、100μg/mlアンピシリンを含む1lのLennox Broth(シグマ)中で37℃においてOD600が0.8に到達するまで生育させた。蛋白質発現の誘導は、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度1mMまで加えることにより達成した。4時間後に、細胞を6000gにおいて20分間遠心分離することにより回収した。細胞沈殿物を次に、20mM TRIS/HCl,50mM NaCl,pH8を含むバッファーに懸濁し、100ワットにて5x20秒音波処理し、そして最後に再び10,000gにて20分間遠心分離した。組換えIL−8蛋白質の主要フラクションが封入体(inclusion body)中に見いだされたので、さらなる精製のために変性条件を選択した。そうして、細胞沈殿物を6M Gua/HcL及び50mM MES,pH6.5を含むバッファーに懸濁した。懸濁液を次に4℃において4時間撹拌して、次に、50mM MES,pH6.5に対する透析工程に続いた。結果の懸濁液を次に遠心分離し、そして濾過して強カチオン交換カラム(ファルマシアバイオテックのSP Sepharose(登録商標))に負荷した。50mM MESバッファー,pH6.5中の0M−1M NaClからの直線勾配により、60分かけて溶出を達成した。所望の蛋白質を含むフラクションの凍結乾燥後に、第2の精製工程をC18カラムを用いた逆相HPLCにより実施した。この場合、10%−90%アセトニトリルの非直線勾配を選択することにより、所望の蛋白質を溶出した。上記と同じ条件下で同じカチオン交換カラムにより、変性蛋白質のリフォールディングを最後に達成した。
実施例3:変異体の生物物理特性決定
3.1円偏光二色性測定及び分析
硫酸ヘパラン(HS)の存在及び不在下で上記変異体蛋白質の二次構造変化を調査するために、CD分光法を実施した。測定値は、Jasco J−710旋光分散計(spectropolarimeter)上で195−250nmの範囲にわたり記録し、そして0.1cmの経路(path)の長さのセルを用いた。5μMの濃度による蛋白質溶液のスペクトルを1秒のレスポンス時間、0.2nmの工程解析、50nm/分の速度、1nmのバンド幅及び20mdegの感度にて記録した。3つのスキャンを平均化してスムーズなスペクトルを生じさせた。蛋白質のスペクトルを、次に、バッファー自体又はバッファー/BSの何れかのCD−シグナルに関してバックグラウンド補正した。プログラムSELCONを用いて、HS存在及び不在下での蛋白質の二次構造分析を最後に実施した。
導入された変異に依存して異なる構造が得られた。何の構造も示さなかった一つの発現変異体(変異Δ6 F17R F21R E70K N71R)を除いて、全ての変異体が測定可能なα−ヘリックス、β−シート及びループを呈した。IL−8wtに比較して、一つの変異体のみ(変異Δ6 E70R)がほぼ類似の構造を示したが、その他は主にそれらのα−ヘリックスに差異があり、全体の構造の17.2%から45.2%の範囲であった。にも拘らず、この事実は、IL−8wtの全体の構造が蛋白質配列内での多くの変化にも拘わらず保持されたことを示唆する。これは、以前には予測され得なかった。硫酸ヘパランオリゴサッカライドのみがIL−8wt二次構造に影響し得てヘパリンは不可能であったという既に見いだされた事実から、未分画の硫酸ヘパランにより誘導された効果に注意が引き付けられた。試験された変異体全てがHS結合に際して構造変化を示し、複合体形成の証拠として観察され得る。
3.2蛍光測定
濃度及びリガンド依存性の第4の構造変化を研究するため、蛍光分光法を実施した。その高い感度のために、ナノグラム量の蛋白質しか必要とせず、蛍光技術は所望の調査を実施するための選択の方法であった。測定は、Perkin−Elmer(ビーカンズフィールド、英国)LS50B分光計を用いて企てられた。
3.3蛍光異方性(Anisotropy)
外来発色団bisANSによりもたらされるケモカインの濃度依存性の蛍光異方性を記録することにより、上記変異体のダイマー化定数を発見することを目指した。測定はPBS中で実施し、高濃度で開始し(4μMまでの蛋白質)、徐々に希釈した。各データ点に関して、507nmにおいて記録された異方性シグナル(r)を60秒間かけて平均化した。
3.4恒温蛍光滴定(IFT)実験
解離定数(Kd値)はリガンドの蛋白質に対する結合親和性に関する測定値であり、よって、リガンド結合に際して蛋白質の蛍光放射特性の濃度依存性変化(蛍光クエンチング)がKdの測定に用いられた。これらの変異体は、提案された(proposed)GAG結合部位においてか又はその近くに位置する固有のトリプトファン発色団を含むためにリガンド結合に際して構造的な変化に感受性であるべきだから、IFT実験はこの種の調査に適しているようであった。蛍光強度滴定をPBS中で700nMの蛋白質濃度を用いて実施した。各GAGリガンドのアリコートの付加及び60秒の平衡期間の後に、282nMにおける励起に際しての蛋白質溶液の放射を300−400nmの範囲にわたり記録した。
3.5アンフォールド実験
蛋白質の安定性及びこの安定性がGAGリガンド結合に際して変化するのか否かについての情報を得るため、アンフォールド実験を企画した。上記のとおり、蛍光技術は第4の構造変化を観察するのに極めて感度がよく、よって蛋白質の熱構造変化を調査するためのえり抜きの方法である。測定はIFTに関して記載されたとおりに企画し、リガンド濃度は変化させずに温度を変化させた。蛋白質の構造は0.7μMの濃度において15−85℃の温度において10倍過剰の硫酸ヘパラン及びヘパリンの不在下及び存在下において観察された。
実施例4:優性−陰性IL−8変異体の受容体『陰性』機能の細胞に基づくアッセイ
好中球誘引に関してのIL−8変異体の損なわれた受容体機能を特性決定するために、IL−8変異体に応答した好中球のトランスフィルターに基づく走化性を、5μmのPVP−無しのポリカーボネート膜を備えたマイクロ走化性チェンバー内でアッセイした。
細胞調製:
簡単に言えば、好中球フラクションを新たに回収されたヒト血液から調製した。これは、6%デキストラン溶液のヘパリン処理された血液への添加(2:1)により行い、次に、45分間沈降のために放置した。上清の透明な溶液を回収し、そしてHBSS w/o Ca及びMgにより2回洗浄した。細胞を数え、そして最後にHBSSにより2Mio/ml細胞懸濁液にて希釈して、数えられた細胞の60%のみが好中球であることを考慮した。
走化性アッセイ:
IL−8変異体を10μg/ml、1μg/ml及び0.1μg/mlの濃度に希釈し、そしてチェンバーの底部区画へ同じものを3通りにして置いた(ウエルあたり26μl)。新たに調製された好中球を上部チェンバー内に接種し(ウエルあたり50μl)、そして30分間、37℃において5%のCO2加湿インキュベーター中でインキュベートした。インキュベーション後に、チェンバーを解体し、フィルターの上部側を洗浄し、そしてふき取り(wiped off)、そして底部側に付着した細胞をメタノールで固定してHemacolor溶液(メルク)により染色した。細胞を、次に、400xの倍率にて、ウエルあたり4つのランダムに選択された顕微鏡の視野の中で数えた。最後に、3つの個別の実験の平均をケモカイン濃度に対してプロットした。図7において、様々なIL−8変異体の走化性指数を示す。予測されたとおり、全ての変異体が顕著に低下した受容体結合活性を示した。
実施例5:組換えRANTES遺伝子の生成、発現、変異体の生物物理特性決定及び活性の特性決定
優性な陰性「GAG−マスキング」ケモカイン変異体のコンセプトを、移植拒絶のようなタイプIVの高感受性反応、アトピー性皮膚炎並びに関節炎、進行性糸球体腎炎及び炎症性肺疾患のような他の炎症性傷害に関与するケモカインであるRANTESにも用いた。
野生型Rantes 456.2±8.5
Met-Rantes V49R/E66S 345.5±21.7
Rantes 15LSLA18 V49R/E66S 297.3±14.1
Rantes N46R 367.7±11.7
Rantes N46K 257.4±10.2
Rantes H23K 202.5±12.8
Rantes Q48K 383.4±39.6
Rantes T43K 139.2±30.1
Rantes A22K 202.1± 9.8
Rantes A22K/N46R 164.0±16.6
RANTES走化性アッセイ
RANTES変異体により指示された細胞移動を、5μmのPVP−コートされたポリカーボネート膜を備えた48ウエルBoydenチェンバーシステムを用いて調査した。RANTES及びRANTES変異体の20mM HEPES pH7.3及び1mg/mlのBSAを含むRPMI 1640の希釈液を3通りにしてチェンバーの底部ウエル内に置いた。同じ培地中の2x106/ml細胞の50μlのTHP−1細胞懸濁液(セルカルチャーのヨーロッパコレクションからの前単球細胞系)を上部ウエル中に置いた。37℃における5%CO2加湿の2時間のインキュベーションの後に、フィルターの上部表面をHBSS溶液で洗浄した。移動した細胞をメタノールにより固定して、Hemacolor溶液(メルク)により染色した。400xの倍率にて、ウエルあたり5つを数え、3つの個別の実験の平均を図8においてケモカイン濃度に対してプロットした。エラーバーは3つの実験の平均の標準誤差を表す。再び、IL−8変異体の場合のように、全てのRANTES変異体が顕著に低下した受容体結合活性を示した。
実施例6:GAG結合領域を有する蛋白質
バイオインフォマティックス及びプロテオームにより、GAG結合蛋白質をそれらのGAG結合領域と共に特性決定した。以下の表2及び3において、ケモカインとそれらのGAG結合領域(表2)を示し、そして他の蛋白質の例もそれらのGAG結合領域と共に提供する(表3)。
Claims (22)
- GAG結合部位を、特性決定された蛋白質に導入する方法であって、工程:
・構造保持に必須でない蛋白質中の領域を同定すること
・塩基性アミノ酸を上記部位中に導入するか、及び/又は、少なくとも一つの巨大な及び/又は酸性のアミノ酸を上記部位において欠失させること
を含み、
GAG結合部位はKd≦10μM、好ましくは≦1μM、さらに好ましくは≦0.1μMのGAG結合親和性を有する、
方法。 - 請求項1記載の方法により得ることができる蛋白質。
- 修飾されたGAG結合蛋白質であって、当該蛋白質内のGAG結合領域が少なくとも一つのアミノ酸の置換、挿入、及び/又は欠失により修飾されることにより、上記GAG結合領域中の塩基性アミノ酸の相対量を増加させるか、及び/又は上記GAG結合量中、好ましくは溶剤露出位置において巨大か及び/又は酸性のアミノ酸を減少させることを特徴とし、そして当該蛋白質のGAG結合親和性が各野生型蛋白質のGAG結合親和性に比較して増加していることを特徴とする、修飾されたGAG結合蛋白質。
- Arg,Lys,及びHisからなる群から選択される少なくとも一つの塩基性アミノ酸がGAG結合領域に挿入されていることを特徴とする、請求項2又は3記載の蛋白質。
- 蛋白質がケモカイン、好ましくはIL−8,RANTES又はMCP−1であることを特徴とする、請求項2乃至4の何れか1項記載の蛋白質。
- GAG結合領域がC末端αヘリックスであることを特徴とする、請求項5記載の蛋白質。
- IL−8の17、21、70、及び/又は71位がArg,Lys,His,Asn及び/又はGlnにより置換されていることを特徴とする、請求項6記載の蛋白質。
- 増加したGAG結合親和性が硫酸ヘパラン及び/又はヘパリンに対する増加した結合親和性であることを特徴とする、請求項2乃至7の何れか1項記載の蛋白質。
- さらなる生物学上活性な領域が修飾されることにより上記蛋白質のさらなる生物学上の活性を阻害するか及び/又はダウン制御することを特徴とする、請求項2乃至8の何れか1項記載の蛋白質。
- さらなる生物学上活性な領域が、欠失、挿入、及び/又は置換により、好ましくはアラニン、立体構造上及び/又は静電上類似の残基により修飾されていることを特徴とする、請求項9記載の蛋白質。
- 蛋白質がケモカインであり、そしてさらなる生物学上の活性が白血球活性化であることを特徴とする、請求項9又は10記載の蛋白質。
- 蛋白質がIL−8であり、そしてさらなる生物学上活性な領域が最初の10個のN末端アミノ酸の中に位置することを特徴とする、請求項11記載の蛋白質。
- 蛋白質がIL−8であり、そして最初の6個のN末端アミノ酸が欠失していることを特徴とする、請求項12記載の蛋白質。
- 蛋白質が、del6F17RE70KN71R,del6F17RE70RN71K及びdel6E70KN71Kからなる群から選択されるIL−8であることを特徴とする、請求項12記載の蛋白質。
- 請求項2乃至14の何れか1項に記載された蛋白質をコードすることを特徴とする、単離されたポリ核酸分子。
- ストリンジェントな条件下で請求項15記載のDNA分子にハイブリダイズすることを特徴とする、単離されたポリ核酸分子。
- 請求項15又は16記載の単離されたDNA分子を含むことを特徴とする、ベクター。
- 請求項17記載のベクターにより安定にトランスフェクトされていることを特徴とする、組換え細胞。
- 請求項2乃至14の何れか1項記載の蛋白質、請求項15又は16記載のポリ核酸又は請求項17記載のベクター及び薬学上受容可能な担体を含むことを特徴とする、薬学組成物。
- 請求項2乃至14の何れか1項記載の蛋白質、請求項15又は16記載のポリ核酸又は請求項17記載のベクターの、各野生型蛋白質の生物活性を阻害するか又は抑圧するための方法における、使用。
- 請求項2乃至14の何れか1項記載の蛋白質、請求項15又は16記載のポリ核酸又は請求項17記載のベクターの、炎症性の症状の治療のための医薬を製造するための方法における、使用。
- 炎症性症状が、慢性関節リウマチ、乾癬、骨関節症、喘息、アルツハイマー疾患、及び多発性硬化症からなる群から選択されることを特徴とする、請求項21記載の使用。
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