ES2369139T3

ES2369139T3 - Proteinas de unión a gag.

Info

Publication number: ES2369139T3
Application number: ES04801190T
Authority: ES
Inventors: Andreas J. Kungl
Original assignee: Protaffin Biotechnologie AG
Current assignee: Protaffin Biotechnologie AG
Priority date: 2003-12-04
Filing date: 2004-12-02
Publication date: 2011-11-25
Anticipated expiration: 2024-12-02
Also published as: KR20070001917A; CY1109480T1; US20110144305A1; ATE439376T1; PL1689775T3; DE602004022595D1; WO2005054285A1; US7807413B2; CN1890264A; US20100331237A1; ATA19522003A; BRPI0416544A; ES2330362T3; AU2004295104B2; NZ547612A; US7585937B2; JP2012139226A; DK1689775T3; EP2363411A1; EP1752470B1

Abstract

Método para modificar una región de unión a GAG (glucosaminoglicano) que es una hélice α C-terminal de una quimoquina, caracterizado porque comprende las etapas de introducir por lo menos un aminoácido básico en dicha hélice α C-terminal y/o delecionar por lo menos un aminoácido voluminoso y/o ácido en dicha hélice α C-terminal, de manera que dicha quimoquina presenta una afinidad de unión a GAG de Kd <=10 mM, preferentemente <=1 mM, todavía más preferentemente <=0,1 mM, y en el que la afinidad de unión a GAG de dicha quimoquina se encuentra incrementada en comparación con la afinidad de unión a GAG de la quimoquina de tipo salvaje respectiva.

Description

Proteínas de unión a GAG

La presente invención se refiere a métodos y herramientas para la inhibición de la interacción de las quimoquinas y sus receptores de alta afinidad sobre los leucocitos, y a métodos para el tratamiento terapéutico de las enfermedades inflamatorias.

Las quimoquinas, derivadas originalmente de las citoquinas quimioatrayentes, actualmente comprenden más de 50 miembros y representan una familia de proteínas pequeñas, inducibles y secretadas de bajo peso molecular (6 a 12 kDa en su forma monomérica) que desempeñan un papel decisivo durante la inmunovigilancia y los procesos inflamatorios. Dependiendo de su función en la inmunidad y la inflamación, pueden agruparse en dos clases. Las quimoquinas inflamatorias son producidas por células de muchos tejidos diferentes, así como por leucocitos inmigrantes en respuesta a toxinas bacterianas y citoquinas inflamatorias como IL-1, TNF e interferones. Su función principal es reclutar leucocitos para la defensa del huésped, y en el proceso de la inflamación. Las quimoquinas de alojamiento, por otra parte, se expresan constitutivamente en áreas definidas de los tejidos linfoides. Dirigen el tráfico y alojamiento de linfocitos y células dendríticas dentro del sistema inmunológico. Estas quimoquinas, tal como se ilustra mediante BCA-1, SDF-1 ó SLC, controlan la relocalización y recirculación de los linfocitos en el contexto de la maduración, diferenciación y activación, y garantizan su alojamiento correcto dentro de los órganos linfoides secundarios. A pesar del gran número de representantes, las quimoquinas muestran pliegues estructurales notablemente similares, aunque la homología de secuencia varía entre el 20 y el 70 por ciento. Las quimoquinas consisten de aproximadamente 70 a 130 aminoácidos con cuatro residuos conservados de cisteína. Las cisteínas forman dos enlaces disulfuro (Cys 1→Cys 3, Cys 2→Cys 4) que son responsables de su estructura tridimensional característica. Las citquinas quimiotácticas consisten de un dominio aminoterminal corto (3 a 10 aminoácidos) que precede al primer residuo de cisteína, un núcleo formado de cadenas β y bucles conectores presentes entre el segundo y cuarto residuos de cisteína, así como una hélice α carboxi-terminal de 20 a 60 aminoácidos. El núcleo de proteína presenta una estructura bien ordenada, mientras que las partes N-terminal y C-terminal se encuentran desordenadas. Al igual que las proteínas secretorias, se sintetizan con una secuencia líder de 20 a 25 aminoácidos que se escinde antes de la liberación. Las quimoquinas se han subdividido en cuatro familias basándose en la posición relativa de sus residuos cisteína en la proteína madura. En la subfamilia de las quimoquinas α, las primeras dos de las cuatro cisteínas se encuentran separadas por un único aminoácido (CXC), mientras que en las quimoquinas β, los residuos cisteína correspondientes son contiguos (CC). Las quimoquinas α pueden clasificarse adicionalmente en aquéllas que contienen la secuencia ELR en el extremo N-terminal, siendo de esta manera quimiotácticas para los neutrófilos (IL-8, por ejemplo), y aquéllas que carecen del motivo ELR y que actúan sobre los linfocitos (I-TAC, por ejemplo) Estructuralmente, las quimoquinas β pueden subdividirse en dos familias: la familia de la proteína quimioatrayente de monocitos eotaxina, que contiene las cinco proteínas quimioatrayentes de monocitos (MCP) y la eotaxina, que son aproximadamente 65 por ciento idénticas entre sí, y las quimoquinas β restantes. Al igual que la familia de CXC, los aminoácidos N-terminales que preceden a los residuos CC son componentes críticas para la actividad biológica y la selectividad de leucocitos de las quimoquinas. Las quimoquinas β, en general, no actúan sobre los neutrófilos pero atraen a los monocitos, eosinófilos, basófilos y linfocitos con selectividad variable. Sólo unas cuantas quimoquinas encajan en la familia de CC o de CXC. La linfotactina es hasta el momento la única quimoquina que muestra sólo dos, en lugar de las cuatro, cisteínas características, en su estructura primaria, y de esta manera se clasifica como quimoquina Y o como quimoquina C. Por otra parte, concluyendo esta clasificación, debe mencionarse la fractalquina como único representante de la subfamilia de δ o CXXXC, con tres aminoácidos que separan las dos primeras cisteínas. Las dos, la linfotaxina y la fractalquina, inducen la quimiotaxis de las células T y de las células asesinas naturales.

Las quimoquinas inducen la migración y activación celulares al unirse a una superficie celular específica, siente receptores transmembranales (7TM) acoplados a proteína G sobre las células diana. Hasta el momento se han clonado dieciocho receptores de quimoquina, entre ellos seis receptores CXC, diez CC, un CX3C y un XC. Los receptores de quimoquina se expresan sobre diferentes tipos de leucocitos, algunos de ellos restringidos a determinadas células (por ejemplo CXCR1 se restringe a los neutrófilos), mientras que otros se expresan más ampliamente (por ejemplo CCR2 se expresa sobre monocitos, células T, células asesinas naturales y basófilos). De manera similar a las quimoquinas, los receptores pueden expresarse constitutivamente sobre determinadas células, mientras que algunas son inducibles. Algunas de ellas incluso pueden regularse negativamente, provocando que las células no responden a una quimoquina determinada pero sigan siendo sensibles a otra. La mayoría de receptores reconoce más de una quimoquina y viceversa, aunque el reconocimiento se restringe a quimoquinas de la subfamilia correspondiente (ver la Tabla 1).

Tabla 1

Enfermedades inflamatorias

Las quimoquinas presentan dos sitios principales de interacción con sus receptores, uno en el dominio aminoterminal y el otro dentro de un bucle expuesto del esqueleto que se extiende entre el segundo y el tercer 5 residuo de cisteína. Ambos sitios son mantenidos en estrecha proximidad por los enlaces disulfuro. El receptor reconoce el primer sitio de unión dentro de la región de bucle que aparentemente funciona como un dominio de anclaje. Esta interacción restringe la movilidad de la quimoquina, facilitando de esta manera la orientación correcta del dominio aminoterminal. Se han llevado a cabo estudios con quimoquinas mutantes que todavía se unían con efectividad a sus receptores pero que no señalizaban. Se obtuvieron estos mutantes mediante deleción o

10 modificación de aminoácidos dentro de los extremos N-terminales de, por ejemplo, IL-8, RANTES y MCP-1.

Las múltiples rutas intracelulares de señalización se producen tras la activación de receptores como resultado de la unión de quimoquinas. Las quimoquinas también interactúan con dos tipos de moléculas no señalizadoras. Una es el receptor DARC, que se expresa en eritrocitos y sobre células endoteliales y que se une a CC, así como a

15 quimoquinas CXC, impidiendo su circulación. El segundo tipo son los glucosaminoglucanos heparán sulfato (GAGs), que son parte de los proteoglicanos y que sirven como correceptores de las quimoquinas. Capturan y presentan las quimoquinas sobre la superficie del tejido de alojamiento (por ejemplo las células endoteliales) con el fin de establecer un gradiente local de concentraciones. En una respuesta inflamatoria, tal como en la artritis reumatoide, los leucocitos que ruedan sobre el endotelio en un proceso mediado por selectina se ponen en contacto con las

20 quimoquinas presentadas por los proteoglicanos sobre la superficie celular. De esta manera, las integrinas de los leucocitos resultan activadas, lo que conduce a adhesión firme y extravasación. Los leucocitos reclutados resultan activados por las citoquinas inflamatorias locales y pueden quedar desensibilizadas frente a la señalización posterior de quimoquinas debido a la elevada concentración local de las mismas. Para mantener un gradiente de quimoquinas en el flujo sanguíneo del tejido, el receptor DARC funciona como sumidero del exceso de quimoquinas.

25 Los proteoglicanos heparán sulfato (HS), que consisten de una proteína nuclear con cadenas laterales de glucosaminoglicano (GAGs) unidas covalentemente, se encuentran en la mayoría de las células y tejidos de mamífero. Aunque la parte proteína determina la localización del proteoglicano en la membrana celular o en la matriz extracelular, el componente glucosaminoglicano media en interacciones con una diversidad de ligandos extracelulares, tales como factores de crecimiento, quimoquinas y moléculas de adhesión. La biosíntesis de los proteoglicanos ha sido revisada extensamente con anterioridad. Son grupos importantes de los proteoglicanos de superficie celular, la familia sindecán de proteínas transmembranales (cuatro miembros en los mamíferos) y la familia glipicán de proteínas unidas a la membrana celular por una cola glucosilfosfatidilinositol (GPI) (seis miembros en los mamíferos). Aunque los glipicanes se expresan ampliamente en el sistema nervioso, en el riñón y, en menor grado, en el músculo esquelético y liso, el sindecán-1 es el HSPG principal en las células epiteliales, el sindecán-2 predomina en los fibroblastos y en las células endoteliales, y el sindecán-3 es abundante en las células neuronales, mientras que el sindecán-4 se expresa ampliamente. La mayoría de las cadenas de GAG añadidas a las proteínas nucleares de sindecán a través de una región de enlace tetrasacárido en serinas particulares son cadenas de HS. Aunque las secuencias de aminoácidos de los dominios extracelulares de los tipos específicos de sindecán no se encuentran conservadas en diferentes especies, al contrario que los dominios transmembranales y citoplasmáticos, el número y las posiciones de las cadenas de GAG se encuentran altamente conservadas. Sin embargo, la estructura de las GAGs es específica de especie y, además, es dependiente de la naturaleza del tejido que expresa HSPG.

El heparán sulfato (HS) es el miembro más abundante de la familia de los glucosaminoglicanos (GAG) de polisacáridos lineales, que también incluye la heparina, el condroitín sulfato, el dermatán sulfato y el queratán sulfato. El HS natural se caracteriza por una cadena lineal de 20 a 100 unidades de disacárido compuestas de Nacetil-D-glucosamina (GlcNAc) y ácido D-glucurónico (GlcA) que pueden modificarse para que incluyan la Nsulfatación y la O-sulfatación (sulfatación 6-O y 3-O de la glucosamina y la sulfatación 2-O del ácido urónico), así como la epimerización del ácido β-D-glucurónico en ácido α-L-idurónico (IdoA).

Las agrupaciones de residuos de azúcar N-sulfatados y O-sulfatos, separadas por regiones de baja sulfatación, se presume que son responsables principalmente de las numerosas propiedades de unión de proteínas y de regulación del HS. Además de las interacciones electrostáticas de los grupos sulfato del HS con aminoácidos básicos, se cree que las interacciones de van der Waals e hidrofóbicas se encuentran implicadas en la unión de proteínas. Además, la presencia de residuos iduronato conformacionalmente flexibles aparentemente favorecen la unión de GAG a proteínas. Otros factores tales como el espaciado entre los sitios de unión de proteínas también desempeñan un papel crucial en las interacciones de unión de proteína-GAG: por ejemplo la dimerización del interferón γ inducida por HS requiere cadenas de GAG con dos secuencias de unión de proteínas separadas por una región de 7 kDa con un bajo grado de sulfatación. En ocasiones resultan necesarias secuencias adicionales para la actividad biológica completa de algunos ligandos: para proporcionar soporte a la transducción de señales de FGF-2, HS debe presentar tanto la secuencia de unión mínima como residuos adicionales que se presume interactúan con el receptor de FGF.

Las proteínas de unión a heparina con frecuencia contienen secuencias de consenso que consisten de agrupaciones de residuos de aminoácidos básicos. La lisina, arginina, asparagina, histidina y glutamina se encuentran implicadas con frecuencia en contactos electrostáticos con los grupos sulfato y carboxilo en el GAG. El espaciado de los aminoácidos básicos, en ocasiones determinado por la estructura 3-D de las proteínas, se cree que controla la especificidad y afinidad de unión de GAG. La actividad biológica del ligando también puede resultar afectada por la cinética de la interacción de HS-proteína. La reducción de la magnitud de la difusión del factor de crecimiento es una de las funciones sugeridas para HSPG, para el que el carácter de repetición larga de las cadenas de GAG, así como sus tasas relativamente rápidas de activación y desactivación de unión de proteína resultan idóneas. En algunos casos, la cinética, no la termodinámica, controla la función fisiológica de la unión de la proteína HS. La mayoría de ligandos de HS requieren secuencias de GAG de longitud y estructura bien definidas. La heparina, producida por los mastocitos, es estructuralmente muy similar al heparán sulfato pero se caracteriza por niveles más altos de modificaciones posteriores a la polimerización que resultan en un grado uniformemente alto de sulfatación con un grado relativamente reducido de diversidad estructural. De esta manera, los bloques altamente modificados en el heparán sulfato en ocasiones se denominan "de tipo heparina". Por ello, la heparina puede utilizarse como análogo perfecto del HS en los estudios biofísicos de proteínas, debido a que, además, se encuentra disponible en cantidades más elevadas y, por lo tanto, resulta menos caro que el HS. Se ha demostrado que diferentes tipos celulares sintetizan proteoglicanos de diferente estructura de glucosaminoglicano que cambia durante la patogénesis, durante el desarrollo o en respuesta a señales extracelulares tales como factores de crecimiento. Esta diversidad estructural de los HSPGs conduce a una elevada versatilidad de unión que subraya la gran importancia que presentan los proteoglicanos.

Desde la demostración de que los proteoglicanos heparán sulfato resultan críticos para la señalización de FGF, se han llevado varias investigaciones que demuestran la importancia de la unión de quimoquina-GAG para la estimulación de la actividad de las quimoquinas. En primer lugar, prácticamente todas las quimoquinas estudiadas hasta el momento aparentemente se unen a HS in vitro, sugiriendo que esto representa una propiedad fundamental de estas proteínas. En segundo lugar, el descubrimiento de que los linfocitos T secretan in vivo quimoquinas-CC en forma de un complejo con glucosaminoglicanos indica que esta forma de interacción es fisiológicamente relevante. Además, es conocido que la asociación de las quimoquinas con el HS ayuda a estabilizar los gradientes de concentración a través de la superficie endotelial, proporcionando de esta manera información direccional para los leucocitos migrantes. También se cree que el HS protege a las quimoquinas de la degradación proteolítica e induce su oligomerización, estimulando de esta manera concentraciones localmente elevadas en la vecindad de los receptores de señalización acoplados a proteína G. Sin embargo, la relevancia funcional de la oligomerización sigue siendo controvertida, aunque todas las quimoquinas presentan una base estructural clara para la multimerización. Se observa la dimerización a través de la asociación de las hojas β en todas las quimoquinas de la familia de CXC (por ejemplo IL-8), al contrario que la mayoría de miembros de la familia de quimoquinas-CC (por ejemplo RANTES), que se dimeriza a través de sus cadenas N-terminales.

Se han acumulado muchos datos sobre la inhibición por parte de compuestos de bajo peso molecular de la interacción entre quimoquinas y sus receptores de alta afinidad presentes sobre los leucocitos. Sin embargo, no se han producido avances sustanciales en el tratamiento terapéutico de las enfermedades inflamatorias mediante este enfoque.

La interleuquina-8 (IL-8) es una molécula clave implicada en la atracción de los neutrófilos durante la inflamación crónica y aguda. Hasta hoy se han seguido varios enfoques para bloquear la acción de IL-8, desde la inhibición de la producción de IL-8 mediante, por ejemplo, glucocorticoides, vitamina D3, ciclosporina A, el factor de crecimiento transformante 15, los interferones, etc., todos ellos inhibidores de la actividad de IL-8 al nivel de la producción de ARNm de IL-8. Un enfoque adicional utilizado anteriormente para inhibir la unión de IL-8 a sus receptores mediante la utilización de anticuerpos específicos contra el receptor presente sobre los leucocitos o contra la IL-8 misma, con el fin de actuar como antagonistas específicos y por lo tanto para inhibir la actividad de IL-8.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar una estrategia alternativa para la inhibición o alteración de la interacción de quimoquinas/receptores sobre leucocitos. Específicamente, la diana de dicha estrategia debe ser la acción de IL-8, RANTES o MCP-1.

La presente invención se refiere a un método para modificar una región de unión a GAG que es una hélice α Cterminal de una quimoquina, a quimoquinas modificadas, a un ácido polinucleico aislado, a un vector, a una célula recombinante, a una preparación farmacéutica y a una utilización según las reivindicaciones.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para producir nuevas proteínas de unión a GAG, así como proteínas de unión a GAG alternativas que muestran una afinidad (más) alta a un correceptor de GAG (que el tipo salvaje). Dichas proteínas de unión a GAG modificadas pueden actuar como competidores con las proteínas de unión a GAG de tipo salvaje y son capaces de inhibir o regular negativamente la actividad de la proteína de unión a GAG de tipo salvaje, sin embargo sin los efectos secundarios que se producen con las proteínas recombinantes conocidas utilizadas en el estado de la técnica. Las moléculas según la presente invención no muestran las desventajas anteriormente indicadas. Las presentes quimoquinas de unión a GAG modificadas pueden utilizarse en fármacos para diversos usos terapéuticos, en particular para el tratamiento de enfermedades inflamatorias sin las desventajas conocidas que se producen en las quimoquinas recombinantes conocidas del estado de la técnica. La modificación del sitio de unión a GAG según la presente invención resulta ser una estrategia ampliamente aplicable para quimoquinas con un sitio de GAG. Las moléculas preferentes según la presente invención con una afinidad de unión a GAG más elevada demostraron ser específicamente ventajosas con respecto a sus efectos biológicos, especialmente con respecto a su actividad antiinflamatoria, debido a su competición con moléculas de tipo salvaje para el sitio de GAG.

Método para introducir un sitio de unión a GAG en una proteína, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

-: identificar una región en una proteína que no resulte esencial para el mantenimiento de la estructura,-introducir por lo menos un aminoácido básico en dicho sitio y/o delecionar por lo menos un aminoácido voluminoso y/o ácido en dicho sitio, de manera que dicho sitio de unión a GAG presente una afinidad de unión a GAG de Kd≤10 mM, preferentemente ≤1 mM, todavía más preferentemente ≤0,1 mM. Mediante la introducción de por lo menos un aminoácido básico y/o la deleción de por lo menos un aminoácido voluminoso y/o ácido en dicha región, se introduce un nuevo sitio "artificial" mejorado de unión a GAG en dicha proteína. Ello comprende la introducción completa nueva de un sitio de unión a GAG en una proteína que no mostraba una actividad de unión a GAG antes de dicha modificación. Ello también comprende la introducción de un sitio de unión a GAG en una proteína que ya mostraba actividad de unión a GAG. El nuevo sitio de unión a GAG puede introducirse en una región de la proteína que no mostraba afinidad de unión a GAG, así como en una región que sí mostraba afinidad de unión a GAG. Con la realización de la presente invención, se proporciona una modificación de la afinidad de unión a GAG de una quimoquina de unión a GAG dada, incrementando la capacidad de unión a GAG de la proteína modificada en comparación con la proteína de tipo salvaje. La presente invención se refiere a un método para modificar un sitio de unión a GAG que es una hélice C-terminal de una quimoquina, a una proteína de unión a GAG modificada, así como a una molécula aislada de ADN, un vector, una célula recombinante, una composición farmacéutica y la utilización de dicha proteína modificada.

La expresión "introducir por lo menos un aminoácido básico" se refiere a la introducción de aminoácidos adicionales, así como la sustitución de aminoácidos. El propósito principal es incrementar la cantidad relativa de aminoácidos básicos, preferentemente Arg, Lys, His, Asn y/o Gln, en comparación con la cantidad total de aminoácidos en dicho sitio, de manera que el sitio de unión a GAG resultante preferentemente comprenda por lo menos 3 aminoácidos básicos, más preferentemente 4, y todavía más preferentemente 5 aminoácidos.

El sitio de unión a GAG preferentemente se encuentra en una posición expuesta a solvente, por ejemplo en un bucle. Esto garantizará una modificación efectiva.

Puede someterse a ensayo que una región de una proteína resulte esencial o no para el mantenimiento de la estructura, por ejemplo mediante métodos computacionales con programas específicos conocidos por el experto en la materia. Tras la modificación de la proteína, la estabilidad conformacional preferentemente se somete a ensayo in silico.

La expresión "aminoácido voluminoso" se refiere a aminoácidos con cadenas laterales largas o estéricamente inferfirientes; en particular son Trp, Ile, Leu, Phe y Tyr. Los aminoácidos ácidos en particular son Glu y Asp. Preferentemente, el sitio de unión a GAG resultante no presenta aminoácidos voluminosos y ácidos, implicando que todos los aminoácidos voluminosos y ácidos han sido eliminados.

La afinidad de unión a GAG se determina (para el alcance de protección de la presente solicitud) con la constante de disociación Kd. Una posibilidad es determinar los valores de la constante de disociación (Kd) de cualquier proteína dada a partir del cambio estructural producido con la unión de ligando. Son conocidas por el experto en la materia diversas técnicas, por ejemplo titulaciones isotérmicas de fluorescencia, calorimetría de titulación isotérmica, resonancia de plasmón superficial, ensayo de movilidad en gel e, indirectamente, experimentos de competición con ligandos de GAG marcados radioactivamente. Una posibilidad adicional es predecir las regiones de unión a partir del cálculo utilizando métodos computacionales también conocidos por el experto en la materia, en los que pueden utilizarse varios programas.

Un protocolo para introducir un sitio de unión a GAG en una proteína es, por ejemplo, el siguiente:

-: identificar una región de la proteína que no resulte esencial para el mantenimiento estructural global y que pueda resultar adecuado para la unión de GAG,

-: diseñar un nuevo sitio de unión a GAG mediante la introducción (sustitución o inserción) de residuos básicos de Arg, Lys, His, Asp y Gln en cualquier posición, o mediante la deleción de aminoácidos que interfieren con la unión de GAG, -comprobar la estabilidad conformacional de la proteína mutante resultante in silico,

-: clonar el ADNc de la proteína de tipo salvaje (alternativamente: adquirir el ADNc)

-: utilizar lo anterior como molde para la mutagénesis asistida por PCR para introducir los cambios anteriormente indicados en la secuencia de aminoácidos, -subclonar el gen mutante en un sistema de expresión adecuado (procariótico o eucariótico, dependiendo de las modificaciones post-traduccionales requeridas biológicamente),

-: expresión, purificación y caracterización de la proteína mutante in vitro, -criterio para una afinidad de unión a GAG

GAG

introducida: Kd (mutante) < 10 mM.

Son ejemplos de dichos proteínas manipuladas con nuevos sitios de unión a GAG, por ejemplo, la parte Fc de IgG, así como los factores del complemento C3 y C4 modificados del modo siguiente:

Fc: (439) KSLSLS (444)-> KSKKLS C3: (1297) KSLSLS (1302)-> KSKKLS C4: (1)MLDAERLK (8)-> MKKAKRLK

Por lo tanto, la proteína inventiva comprende un nuevo (en comparación con la proteína de tipo salvaje) sitio de unión a GAG tal como se ha definido anteriormente y por lo tanto actuará como competidor con las proteínas de unión a GAG naturales, en particular debido a que la afinidad de unión a GAG de la proteína inventiva es muy alta, por ejemplo Kd≤10 mM.

Un aspecto adicional de la presente invención es una quimoquina modificada de unión a GAG, de manera que se modifica una región de unión a GAG que es una hélice α C-terminal de dicha proteína, mediante sustitución, inserción y/o deleción de por lo menos un aminoácido con el fin de incrementar la cantidad relativa de aminoácidos básicos en dicha región de unión a GAG y/o se reduce la cantidad de aminoácidos voluminosos y/o ácidos en dicha región de unión a GAG, preferentemente en una posición expuesta a solventes, y en la que la afinidad de unión a GAG de dicha proteína se incrementa en comparación con la afinidad de unión a GAG de una proteína de tipo salvaje respectiva.

Inesperadamente se ha encontrado que, mediante el incremento de la cantidad relativa de aminoácidos básicos, en particular de Arg, Lys, His, Asn y Gln, en la región de unión a GAG, la proteína de unión a GAG modificada muestra una afinidad de unión a GAG incrementada en comparación con las proteínas de tipo salvaje, en particular en el caso de que la cantidad relativa de aminoácidos básicos se encuentre incrementada en una posición expuesta a solventes, debido a que se ha demostrado que un área con carga positiva sobre la superficie de la proteína incrementa la afinidad de unión. Preferentemente se encuentran presentes por lo menos 3, más preferentemente 4 y todavía más preferentemente 5, aminoácidos básicos en la región de unión a GAG.

La expresión "proteína de unión a GAG" se refiere a cualquier proteína que se una a un correceptor de GAG. Puede someterse a ensayo si una proteína se une a un correceptor de GAG o no, con ayuda de protocolos conocidos tales como los indicados anteriormente. Hileman et al. (BioEssays 20:156-167, 1998) dan a conocer sitios de consenso en proteínas de unión a glucosaminoglucano. La información dada a conocer en dicho artículo también resulta útil como información inicial para la presente invención. El término "proteína" aclara que las moléculas proporcionadas por la presente invención presenta una longitud de por lo menos 80 aminoácidos. Esto resulta necesario para que sean candidatos adecuados para la presente estrategia antiinflamatoria. No se conocen moléculas de menor tamaño que interactúen con un sitio de unión a GAG y que sean fisiológica o patológicamente relevantes debido a dicha interacción, y por lo tanto no son relevantes para la presente invención. Preferentemente, las moléculas según la presente invención están compuestas de por lo menos 90, por lo menos 100, por lo menos 120, por lo menos 150, por lo menos 200, por lo menos 300, por lo menos 400 ó por lo menos 500 residuos aminoácidos.

Dentro del alcance de la presente solicitud, la expresión "region de unión a GAG" se define como una región que se une a GAG con una constante de disociación (valor de Kd) inferior a 100 mM, preferentemente inferior a 50 mM, todavía más preferentemente inferior a 20 mM, determinada mediante titulación isotérmica de fluorescencia (ver los ejemplos, posteriormente).

Cualquier modificación indicada en la presente solicitud puede llevarse a cabo mediante métodos bioquímicos conocidos, por ejemplo la mutagénesis sitio-dirigida. También debe indicarse que la clonación molecular de los sitios de unión a GAG es, evidentemente, de la tecnica anterior (ver, por ejemplo, las patentes WO nº 96/34965 A, nº 92/07935, Jayaraman et al. (FEBS Letters 482:154-158, 2000), patente WO nº 02/20715 A, Yang et al. (J. Cell. Biochem. 56:455-468, 1994), en el que se describe la reorganización molecular o la síntesis de novo de regiones de GAG; Butcher et al. (FEBS Letters 4009:183-187, 1997) (se refiere a péptidos artificiales, no a proteínas); JinnoOUe et al., J. Virol. 75:12439-12445, 2001; síntesis de novo.

La región de unión a GAG puede modificarse mediante sustitución, inserción y/o deleción. Ello implica que puede sustituirse un aminoácido no básico por un aminoácido básico, puede insertarse un aminoácido básico en la región de unión a GAG o puede delecionarse un aminoácido no básico. Además, se deleciona un aminoácido que interfiere con la unión de GAG, preferentemente con la unión de todos los aminoácidos interfirientes. Dichos aminoácidos son, en particular, aminoácidos voluminosos, tal como se ha indicado anteriormente, así como aminoácidos ácidos, por ejemplo Glu y Asp. Puede examinarse si un aminoácido interfiere con la unión a GAG o no utilizando, por ejemplo, métodos matemáticos o computacionales. El resultado de cualquiera de dichas modificaciones es que se incrementa la cantidad relativa de aminoácidos básicos en dicha región de unión a GAG, en donde "relativa" se refiere a la cantidad de aminoácidos básicos en dicha región de unión a GAG en comparación con el número total de aminoácidos en dicha región de unión a GAG. Además, se delecionan los aminoácidos que interfieren estérica o electrostáticamente con la unión a GAG.

Puede determinarse la presencia o ausencia de un aminoácido en una posición expuesta a solventes, por ejemplo con ayuda de la estructura tridimensional conocida de la proteína o con ayuda de métodos computacionales tal como se ha indicado anteriormente.

Puede determinarse si la afinidad de unión a GAG de dicha proteína modificada se encuentra incrementada o no en comparación con la afinidad de unión a GAG de la proteína de tipo salvaje respectiva, tal como se ha indicado anteriormente con ayuda de, por ejemplo, experimentos de titulación fluorescente que determinan las constantes de disociación. El criterio de afinidad de unión a GAG mejorada será Kd (mutante) < Kd (tipo salvaje), preferentemente en por lo menos el 100%. Las proteínas modificadas específicamente mejoradas presentan (en comparación con la Kd de tipo salvaje), una afinidad de unión a GAG que es superior en un factor de, como mínimo, 5, preferentemente de como mínimo 10, todavía más preferentemente de como mínimo 100. Por lo tanto, la afinidad de unión a GAG incrementada preferentemente muestra una Kd inferior a 10 mM, preferentemente inferior a 1 mM, todavía más preferentemente inferior a 0,1 mM.

Mediante el incremento de la afinidad de unión a GAG, la proteína modificada actúa como antagonista específica y compite para la unión a GAG con la proteína de unión a GAG de tipo salvaje.

Preferentemente, se inserta por lo menos un aminoácido básico seleccionado de entre el grupo que consiste de Arg, Lys e His en dicha región de unión a GAG. Estos aminoácidos se insertan fácilmente en dicha región de unión a GAG, de manera que el término "insertado" se refiere a una inserción como tal, así como a la sustitución de cualquier aminoácido no básico por arginina, lisina o histidina. Evidentemente resulta posible insertar más de un aminoácido básico, de manera que puede insertarse el aminoácido básico o también una combinación de dos o tres de los aminoácidos anteriormente indicados.

La proteína es una quimoquina, preferentemente IL-8, RANTES o MCP-1. Es conocido que las quimoquinas presentan un sitio de interacción con el correceptor GAG, de manera que la unión de esta quimoquina con frecuencia es una condición para la activación adicional del receptor, tal como se ha indicado anteriormente. Debido a que las quimoquinas con frecuencia se encuentran en las enfermedades inflamatorias, resulta de gran interés bloquear la activación del receptor de quimoquina. Dichas quimoquinas preferentemente son IL-8, RANTES o MCP1, que son moléculas bien caracterizadas y de las que son bien conocidas las regiones de unión a GAG (ver, por ejemplo, Lortat-Jacob et al., PNAS 99(3):1229-1234, 2002). Mediante el incremento de la cantidad de aminoácidos básicos en la región de unión a GAG de estas quimoquinas, se incrementa su afinidad de unión y por lo tanto las quimoquinas de tipo salvaje se unirán menos frecuentemente o nada en absoluto, dependiendo de la concentración de la proteína modificada con respecto a la concentración de la proteína de tipo salvaje.

Dicha región de unión a GAG es una hélice α C-terminal. Un monómero químico típico se organiza en torno a un esqueleto de tres cadenas antiparalelas (3 hojas superpuestas por una hélice α C-terminal). Se ha demostrado que dicha hélice α C-terminal en las quimoquinas se encuentra implicada mayoritariamente en la unión a GAG, de manera que la modificación de esta hélice α C-terminal para incrementar la cantidad de aminoácidos básicos resulta en una quimoquina modificada con una afinidad de unión a GAG incrementada.

Preferentemente, la afinidad de unión incrementada es una afinidad de unión incrementada a heparán sulfato y/o a heparina. El heparán sulfato es el miembro más abundante de la familia GAG de polisacáridos lineales, que también incluye la heparina. La heparina es estructuralmente muy similar al heparán sulfato, caracterizada por niveles más altos de modificaciones posteriores a la polimerización que resultan en un grado uniformemente alto de sulfatación con un grado relativamente reducido de diversidad estructural. Por lo tanto, los bloques altamente modificados en el heparán sulfato en ocasiones se denominan "de tipo heparina", y la heparina puede utilizarse como análogo del heparán sulfato para estudios biofísicos de proteínas. En cualquier caso, ambos, el heparán sulfato y la heparina, resultan particularmente adecuados.

Todavía más preferentemente, se modifica una región biológicamente activa adicional, inhibiendo o regulando negativamente de esta manera una actividad biológica adicional de dicha proteína. Esta actividad biológica adicional es conocida para la mayoría de proteínas de unión a GAG, por ejemplo para las quimoquinas. Ésta es la región de unión a un receptor, por ejemplo al receptor 7TM.

El término "adicional" define una región biológicamente activa que no es la región de unión a GAG que, sin embargo, se une a otras moléculas, células o receptores y/o los activa. Mediante la modificación de esta región biológicamente activa adicional, la actividad biológica adicional de dicha proteína resulta inhibida o regulada negativamente, se proporciona de esta manera una proteína modificada que es una antagonista fuerte de la proteína de tipo salvaje. Esto significa que, por una parte, la afinidad de unión a GAG es más alta que la proteína de unión a GAG de tipo salvaje, de manera que la proteína modificada se une mayoritariamente a GAG en lugar de a la proteína de tipo salvaje. Por otra parte, la actividad adicional de la proteína de tipo salvaje que se produce principalmente en el caso de que la proteína se encuentre unida a GAG, resulta inhibida o regulada negativamente, ya que la proteína modificada no lleva a cabo dicha actividad específica o la lleva a cabo en un grado menor. Con esta proteína modificada se proporciona un antagonista efectivo de las proteínas de unión a GAG de tipo salvaje, que no muestra los efectos secundarios conocidos de otras proteínas recombinantes, tal como se describe en el estado de la técnica. Esta región biológicamente activa adicional puede determinarse, por ejemplo, in vitro mediante ensayo de competición de receptores (utilizando quimoquinas de tipo salvaje marcadas fluorescentemente, flujo de entrada de calcio y la migración celular (por leucocitos nativos o líneas celulares establemente transfectadas con 7TM). Son ejemplos de dichas regiones biológicamente activas adicionales, además de sitios de unión a receptor adicionales (tal como en la familia del factor de crecimiento), sitios enzimáticos (tal como de hidrolasas, liasas, sulfotransferasas, N-desacetilasas y copolimerasas), sitios de interacción con proteínas (tal como la antitrombina III) y dominios de unión a membrana (tales como la proteína gD del virus del herpes simplex). Con esta realización preferente de proteínas doblemente modificadas, por lo tanto, se proporcionan mutantes dominantes (respecto a la unión a GAG) negativos (respecto al receptor), que son específicamente ventajosos con respecto a los objetivos fijados por la presente invención. Todavía preferentemente, dicha región biológicamente activa adicional se modifica mediante deleción, inserción y/o sustitución preferentemente con alanina, un residuo estérica y/o electrostáticamente similar. Evidentemente resulta posible delecionar o insertar o sustituir por lo menos un aminoácido en dicha región biológicamente activa adicional. Sin embargo, también resulta posible proporcionar una combinación de por lo menos dos de dichas modificaciones o de la totalidad de las tres. Mediante la sustitución de un aminoácido dado por alanina o un residuo estéricamente/electrónicamente similar ("similar" se refiere al aminoácido que se sustituye), la proteína modificada

se encuentra modificada estéricamente/electrostáticamente en grado reducido o no modificada. Ello resulta particularmente ventajoso, ya que otras actividades de la proteína modificada, en particular la afinidad con la región de unión a GAG, no resultan modificadas.

Dicha proteína es una quimoquina y dicha actividad biológica adicional es ventajosamente la activación de leucocitos. Tal como se ha indicado anteriormente, las quimoquinas se encuentran implicadas en la atracción de los leucocitos durante la inflamación crónica y aguda. Por lo tanto, mediante la inhibición o regulación negativa de la activación de los leucocitos, se reduce o se inhibe la inflamación, lo que convierte a esta proteína modificada particular en una importante herramienta para estudiar, diagnosticar y tratar las enfermedades inflamatorias.

Según un aspecto ventajoso, dicha proteína es IL-8 y dicha región biológicamente activa adicional se encuentra localizada dentro de los primeros 10 aminoácidos N-terminales. Los primeros aminoácidos N-terminales se encuentran implicados en la activación leucocitaria, en la que se identificó en particular que Glu-4, Leu-5 y Arg6 resultaban esenciales para la unión y activación del receptor. Por lo tanto, estos tres, o incluso la totalidad de los 10 primeros aminoácidos N-terminales, pueden sustituirse o delecionarse con el fin de inhibir o regular negativamente la unión y activación del receptor. Una proteína ventajosa adicional es un mutante de IL-8 con deleción de los primeros 6 aminoácidos N-terminales. Tal como se ha indicado anteriormente, este mutante no se unirá, o se unirá en menor grado, y activará, los leucocitos, de manera que resulta particularmente adecuado para estudiar, diagnosticar y tratar las enfermedades inflamatorias.

Un aspecto adicional de la presente invención es una molécula aislada de ácido polinucleico que codifica la proteína inventiva tal como se ha indicado anteriormente. El ácido polinucleico puede ser ADN o ARN. De esta manera, las modificaciones que conducen a la proteína modificada inventiva se llevan a cabo a nivel del ADN o ARN. Esta molécula aislada inventiva de ácido polinucleico resulta adecuada para métodos diagnósticos, así como para la terapia génica y la producción de proteínas modificadas inventivas a gran escala.

Todavía preferentemente, la molécula aislada de ácido polinucleico se hibrida con la molécula de ácido polinucleico inventiva anteriormente definida bajo condiciones astringentes. Dependiendo de las condiciones de hibridación, se forman dúplex complementarios entre las dos moléculas de ADN o ARN, en el caso de ser perfectamente correspondientes o también en el caso de que comprendan bases desapareadas (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Las sondas de longitud superior a aproximadamente 50 nucleótidos pueden incluir hasta 25 a 30% de bases desapareadas. Las sondas de menor tamaño incluirán menos desapareamientos. La tendencia de una diana y una sonda a formar un dúplex que contiene pares de bases desapareados está controlada por la astringencia de las condiciones de hibridación, las cuales son una función de factores tales como la concentración salina o de formamida en el tampón de hibridación, la temperatura de la hibridación y las condiciones de lavado posterior a la hibridación. Mediante la aplicación de principios bien conocidos que se producen durante la formación de dúplex híbridos, el experto en la materia puede conseguir condiciones que presentan la astringencia deseada, mediante la selección de entre una diversidad de tampones de hibridación, temperaturas y condiciones de lavado. De esta manera, pueden seleccionarse condiciones que permitan la detección de dúplex híbridos perfectamente apareados o parcialmente desapareados. La temperatura de fusión (Tm) de un dúplex resulta útil para seleccionar las condiciones de hibridación apropiadas. Las condiciones astringentes de hibridación para moléculas polinucleótidas de longitud superior a 200 nucleótidos típicamente implican la hibridación a una temperatura entre 15ºC y 25ºC inferior a la temperatura de fusión del dúplex esperado. Para sondas oligonucleótidas de más de 30 nucleótidos, que forman dúplex menos estables que las sondas más largas, la hibridación astringente habitualmente se consigue mediante la hibridación a una temperatura 5ºC a 10ºC inferior a la Tm. La Tm de un dúplex de ácidos nucleicos puede calcularse utilizando una fórmula basada en el porcentaje de G+C contenido en los ácidos nucleicos y que considere la longitud de las cadenas, tal como la fórmula Tm=81,5-16,6(log[Na+])+0,41 (% de G+C) -(600/N), en la que N=longitud de la cadena.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un vector que comprende una molécula aislada de ADN según la presente invención tal como se ha definido anteriormente. El vector comprende todos los elementos reguladores necesarios para la transfección eficiente, así como para la expresión eficiente de las proteínas. Dichos vectores son bien conocidos de la técnica y puede seleccionarse cualquier vector adecuado con este fin.

Un aspecto adicional de la presente solicitud se refiere a una célula recombinante que resulta establemente transfectada con un vector inventivo tal como se ha indicado anteriormente. Dicha célula recombinante, así como cualquier célula descendiente de la misma, comprende el vector. De esta manera, se proporciona una línea celular que expresa la proteína modificada continuamente o tras la activación, dependiendo del vector.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína, un ácido polinucleico o un vector según la presente invención tal como se ha definido anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. Evidentemente la composición farmacéutica puede comprender además sustancias adicionales que se encuentran habitualmente presentes en composiciones farmacéuticas, tales como sales, tampones, emulgentes, agentes colorantes, etc.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a la utilización de la proteína modificada, de un ácido polinucleótido o de un vector según la presente invención tal como se ha definido anteriormente, en un método para inhibir o suprimir la actividad biológica de la proteína de tipo salvaje respectiva. Tal como se ha indicado anteriormente, la proteína modificada actuará como antagonista, de manera que los efectos secundarios que se producen con las proteínas recombinantes conocidas no se producirán con la proteína modificada inventiva. En el caso de las quimoquinas, lo anterior será en particular la actividad biológica implicada en las reacciones inflamatorias.

Por lo tanto, una utilización adicional de la proteína modificada, ácido polinucleico o vector según la presente invención es en un método para producir un medicamento destinado al tratamiento de una condición inflamatoria. En particular, en el caso de que la proteína modificada sea una quimoquina, actuará como antagonista sin efectos secundarios y resultará particularmente adecuada para el tratamiento de una condición inflamatoria. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente solicitud también es un método para el tratamiento de una condición inflamatoria, en el que una proteína modificada según la presente invención, la molécula aislada de ácido polinucleico o un vector según la presente invención o una composición farmacéutica según la presente invención, se administra en un paciente. Preferentemente, la condición inflamatoria se selecciona de entre un grupo que comprende artritis reumatoide, soriasis, osteoartritis, asma, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple. Debido a que la activación mediante quimoquinas puede resultar inhibida con una proteína modificada según la presente invención, las reacciones inflamatorias pueden inhibirse o regularse negativamente, de manera que pueden prevenirse o tratarse las condiciones inflamatorias anteriormente indicadas.

La presente invención se describe en mayor detalle con ayuda de los ejemplos y figuras siguientes, a los cuales, sin embargo, la invención no se encuentra limitada, en los que la fig. 1 es un espectro de CD; la fig. 2 muestra el contenido de estructura secundaria de diversos mutantes; las figs. 3 y 4 muestran gráficos de resultados de los ensayos de anisotropía de fluorescencia de diversos mutantes; la fig. 5 muestra el gráfico de los resultados de titulaciones isotérmicas de fluorescencia; la fig. 6 muestra los resultados de experimentos de desplegamiento de diversos mutantes; la fig. 7 muestra el índice de quimiotaxis de mutantes de IL-8, y la fig. 8 muestra los resultados del ensayo de quimiotaxis de RANTES.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de genes de IL-8 recombinantes y clonación de los mutantes

Se utilizó la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar los ADNc deseados para los mutantes mediante la introducción de las mutaciones utilizando cebadores de mutagénesis de sentido y antisentido. Se utilizó un plásmido sintético que contenía el ADNc para wtIL-8 como molde, la mezcla de polimerasas Clontech Advantage® 2 como ADN polimerasa, y la reacción de PCR se llevó a cabo utilizando un ciclador Mastergradiente de Eppendorf. Los cebadores de mutagénesis utilizados se resumen en

la tabla a continuación, empezando con las secuencias directas (5' a 3'):

•: CACC ATG TGT CAG TGT ATA AAG ACA TAC TCC (cebador para la mutación 16)

•: CACC ATG TGT CAG TGT ATA AAG ACA TAC TCC AAA CCT AGG CAC CCC AAA AGG ATA (cebador para la mutación 16 F17R F21R)

Las secuencias inversas (5' a 3') eran:

•: TTA TGA ATT CCT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70R)

•: TTA TGA ATT CTT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70K)

•: TTA TGA CTT CTC AGC CCT CTT (cebador para la mutación N71K)

•: TTA TGA CTT CTT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70K N71K)

•: TTA TGA CTT CCT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70R N71K)

•: TTA TGA CCT CTT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70K N71R)

•: TTA TGA CCT CCT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70R N71R)

Se purificaron los productos de PCR, se clonaron en el vector pCR ®T7/NT-TOPO ®TA (Invitrogen) y se transformaron en E. coli competentes TOP10F (Invitrogen). Como etapa siguiente, se llevó a cabo una confirmación de la

secuencia mediante secuenciación de ADN de doble cadena utilizando un secuenciador ABI PRISM CE1.

Ejemplo 2: Expresión y purificación de las proteínas recombinantes

Tras confirmar las secuencias, se transformaron los constructos en E. coli BL21(DE3) de competencia preparada con calcio, para la expresión. Se cultivaron las células bajo agitación en 1 litro de caldo Lennox (Sigma) que contenía 100 mg/l de ampicilina a 37ºC hasta alcanzar una DO600 de aproximadamente 0,8. Se llevó a cabo la inducción de la expresión de proteínas mediante la adición de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM. Cuatro horas después, se recolectaron las células mediante centrifugación a 6.000g durante 20 minutos. A continuación, se resuspendió el pellet celular en un tampón que contenía Tris/HCl 20 mM, NaCl 50 mM, pH 8, se sonicó a 100 vatios durante 5x20 s y finalmente se centrifugó nuevamente durante 20 minutos a 10.000g. Debido a que la fracción principal de las proteínas IL-8 recombinantes se encontró en cuerpos de inclusión, se seleccionaron condiciones desnaturalizantes para la purificación adicional. De esta manera, se resuspendió el pellet celular en un tampón de Gua/HCl 6 M y MES 50 mM, pH 6,5. A continuación, se agitó la suspensión a 4ºC durante 4 horas, seguido de una etapa de diálisis frente a MES 50 mM, pH 6,5. Seguidamente, la suspensión resultante se centrifugó y se filtró para cargarse en una columna de intercambio catiónico fuerte (SP Sepharose® de Pharmacia Biotech). Se consiguió la elución mediante un gradiente lineal de 0 a 1 M de NaCl en un tampón MES 50 mM, pH 6,5 durante 60 minutos. Tras la liofilización de las fracciones que contenían la proteína deseada, se llevó a cabo una segunda etapa de purificación mediante HPLC de fase inversa utilizando una columna C18. En el caso, se seleccionó un gradiente no lineal de 10% a 90% de acetonitrilo para eluir la proteína deseada. El replegamiento de la proteína desnaturalizada se consiguió finalmente con la misma columna de intercambio catiónico bajo las mismas condiciones que las indicadas anteriormente.

A continuación, se comprobó la pureza e identidad de la proteína mediante análisis de tinción con plata en el primer caso y análisis de transferencia western con un anticuerpo monoclonal específico contra wtIL-8, en el segundo. También se confirmó el replegamiento de las proteínas mediante mediciones del dicroismo circular (CD).

Ejemplo 3: Caracterización biofísica de los mutantes

3.1 Mediciones del dicroísmo circular y análisis

Con el fin de investigar los cambios de estructura secundaria de la proteína mutante en presencia y en ausencia de heparán sulfato (HS), se llevó a cabo la espectroscopía de CD. Se registraron las mediciones en un espectropolarímetro Jasco J-710 en un intervalo de 195 a 250 nm, y se utilizó una célula de 0,1 cm de longitud de camino óptico. Se registraron los espectros de las soluciones de proteínas con una concentración de 5 mM con un tiempo de respuesta de 1 s, resolución de paso de 0,2 nm, velocidad de 50 nm/minuto, anchura de banda de 1 nm y una sensibilidad de 20 mdeg. Se calculó el promedio de tres escaneos para obtener espectros suavizados. A continuación, se corrigieron los espectros de proteína para el fondo de la señal de CD, debido al tampón mismo o al tampón/HS. El análisis de estructura secundaria de la proteína en presencia y en ausencia de HS se llevó a cabo finalmente utilizando el programa SELCON.

Debido a la modificación de un gran número de aminoácidos en algunas de las nuevas combinaciones, se intentó encontrar la dimensión de los cambios de estructura secundaria resultantes mediante métodos de dicroísmo circular.

Se obtuvieron diferentes estructuras dependiendo de las mutaciones introducidas. Excepto por un mutante expresado (16 F17R F21R E70K N71R) que no mostró ninguna estructura, todos los mutantes mostraron hélices α, hojas β y bucles medibles. En comparación con IL-8wt, únicamente un mutante (16 E70R) mostró una estructura prácticamente similar, mientras que otros diferían principalmente en su hélice α, que comprendía entre 17,2% y 45,2% de la estructura total. Sin embargo, este hecho sugiere que la estructura global de IL-8wt se había mantenido a pesar de las numerosas modificaciones producidas dentro de la secuencia de las proteínas. Esto no podía haberse previsto anteriormente. Tras encontrar que sólo los oligosacáridos de heparán sulfato, y no la heparina, eran capaces de afectar a la estructura secundaria de IL-8wt, la atención se centró en los efectos inducidos por el heparán sulfato no fraccionado. Todos los mutantes examinados mostraron cambios estructurales tras la unión de HS, lo que puede considerarse evidencia de la formación de complejos.

Para demostrar los cambios estructurales tras la introducción de mutaciones y la adición de heparán sulfato, se resumen algunos de los datos obtenidos en los gráficos proporcionados anteriormente y posteriormente.

3.2 Mediciones de fluorescencia

Para estudiar los cambios de estructura cuaternaria dependiente de la concentración y de ligando, se utilizó la espectroscopía de fluorescencia. Debido a su elevada sensibilidad, que requiere cantidades de tan solo nanogramos de proteína, la técnica de fluorescencia fue el método de elección para llevar a cabo las investigaciones deseadas. Se llevaron a cabo mediciones utilizando un fluorímetro LS50B de Perkin-Elmer (Beaconsfield, Inglaterra).

3.3 Anisotropía de fluorescencia

Mediante el registro de la anisotropía de fluorescencia dependiente de la concentración de la quimoquina resultante del cromóforo extrínseco bisANS se intentó encontrar la constante de dimerización de los mutantes. Las mediciones se llevaron a cabo en PBS partiendo de concentraciones altas (hasta 4 mM de proteína), seguido de la dilución por etapas. Para cada punto de datos, se calculó el promedio de las señales de anisotropía (r) registradas a 507 nm durante 60 segundos. Se ha informado de que la oligomerización de IL-8 influye relevantemente sobre las propiedades de unión a GAG. A concentración monomérica, el tamaño de la IL-8 unida definió que los oligosacáridos se unían con 1.000 veces más fuerza que a concentración dimérica. Por lo tanto, se investigaron las propiedades de oligomerización de los mutantes de IL-8 a partir de la anisotropía de fluorescencia. Debido a que el fluoróforo intrínseco de IL-8 (Trp57) no era suficientemente sensible para todos los mutantes, se utilizó el fluoróforo extrínseco bis-ANS para estas mediciones. Nuevamente, tal como ya se había advertido para la estructura secundaria, el mutante 16 E70R mostró una elevada similitud también en la constante de oligomerización (koligo=350 nM) respecto a IL-8wt (koligo=379 nM). El mutante con la koligo más alta (koligo=460 nM), que por lo tanto era el que dimerizaba peor, era 16 F17RF21R E70RN71K. Algunos estudios anteriores identificaron que las hojas β se encontraban implicadas principalmente en el proceso de dimerización, un hecho que se correlaciona con los resultados para la estructura secundaria de este mutante, que mostraba una contribución muy baja de hoja β, de tan sólo 11,4%. Se encontró que el mutante con la koligo más baja (koligo=147 nM) era 16 F17RF21R E70RN71K, que nuevamente mostró la contribución más alta de estructura de hoja β (29,8%) de entre todos los mutantes investigados. También se investigó el impacto de la adición de heparán sulfato. Al igual que para IL-8wt, con el que el heparán sulfato provocó un desplazamiento de la constante de oligomerización a niveles mucho más altos (koligo=1,075 mM), esto también se observó para los mutantes de IL-8 investigados. 16 F17RF21R E70K se desplazó de 0,147 mM a 1,162 mM, y el mutante 16 E70R, de 0,350 mM a 1,505 mM, en presencia de heparán sulfato. Algunos de los resultados obtenidos se muestran en las figs. 3 y 4, en donde la fig. 3 muestra la dependencia de la anisotropía de fluorescencia de los mutantes de IL-8 en PBS sobre la concentración de quimoquina y la fig. 4 muestra la dependencia de la anisotropía de fluorescencia de 16 F17RF21R E70K en PBS sobre la concentración de quimoquina en presencia (exceso de diez veces) y en ausencia de HS (concentración de proteína pc=10 xy exceso). 3.4 Experimentos de titulación isotérmica de fluorescencia (IFT)

Las constantes de disociación (valores de Kd) son una medida de la afinidad de unión de un ligando a un proteína y por lo tanto para la determinación de Kd se utilizó el cambio dependiente de la concentración de las propiedades de emisión de fluorescencia de la proteína (inhibición de fluorescencia) tras la unión de ligando. Debido a que estos mutantes contienen un cromóforo intrínseco de triptófano que se encuentra situado en el sitio de unión a GAG propuesto o próximo al mismo y por lo tanto deberían ser sensible a cambios estructurales tras la unión de ligando, los experimentos de IFT aparentemente resultaban adecuados para este tipo de investigación. Se llevó a cabo la titulación de la intensidad de fluorescencia en PBS utilizando una concentración de proteína de 700 nM. Se registró la emisión de la solución de proteína tras la excitación a 282 nm en un intervalo de 300 a 400 nm tras la adición de una alícuota del ligando respectivo de GAG y un periodo de equilibrado de 60 segundos.

Se investigó la unión a heparina no fraccionada y a heparán sulfato. Se fijaron los mutantes a concentración dimérica parar garantizar una sensibilidad suficiente. Se registró una inhibición de la intensidad de fluorescencia de Trp57 tras la unión a GAG de entre 25% y 35%. Se observó una mejora significativa de la unión a ligando, especialmente para la unión de la heparina. 16 F17RN71R E70K (Kd=14 nM) y 16 F17RF21R N71K (Kd=14,6 nM) mostraron una unión

2.600: veces mejor, mientras que 16 E70K N71K (Kd=74 nM) mostró una unión 1.760 veces mejor en comparación con IL-8wt (Kd=37 mM). También se obtuvieron buenos resultados para la unión del heparán sulfato. Para 16 F17RN71R E70K se encontró una Kd de 107 nM; para 16 F17RF21R N71K la Kd era de 95 nM y el mutante 16 E70K N71K mostró una Kd de 34 nM. Debido a que IL-8wt se une a una Kd de 4,2 mM, las Kd encontradas para los mutantes representan una mejora extraordinaria de la unión; ver la fig. 5.

3.5: Experimentos de desplegamiento

Con el fin de obtener información sobre la estabilidad de las proteínas y si la estabilidad resultaba modificada por la unión del ligando de GAG, se llevaron a cabo experimentos de desplegamiento. Tal como se ha indicado anteriormente, las técnicas de fluorescencia son muy sensibles para observar los cambios de la estructura cuaternaria y por lo tanto también son un método de elección para investigar los cambios de estructura térmica de la proteína. Se realizaron mediciones tal como se ha descrito para la IFT en la que no se modificó la concentración de ligando sino la temperatura. Se observó la estructura de la proteína a una concentración de 0,7 mM entre las temperaturas de 15ºC y 85ºC en ausencia y en presencia de un exceso de 10 veces de heparán sulfato o de heparina.

El máximo de emisión de las proteínas se encontraba comprendido entre 340 nm y 357 nm, valores que son típicos para un residuo triptófano expuesto a solvente. Partiendo de experimentos de desplegamiento a 15ºC, el máximo de emisión de los mutantes variaba entre 340 y 351 nm. En comparación con IL-8wt, cuyo máximo de emisión se observó a 340 nm, lo anterior implica valores ligeramente más altos. Tras incrementarse la temperatura, se redujo la intensidad máxima de emisión, acompañado de un desplazamiento del máximo a una longitud de onda más alta o más baja. El máximo de emisión de 16 E70R y de 16 E70K N71K se desplazó de 352,5 a 357 nm y de 343 a 345 nm, lo que es típico de una exposición adicional del residuo Trp57 al solvente debido al incremento de temperatura, pero resulta interesante que los mutantes 16 F17RN71R E70K y 16 F17RF21R E70R N71K mostraron un desplazamiento al azul, de 350 a 343 nm y, menos pronunciado, de 350 a 348 nm (ver la fig. 6). Mediante la reducción lenta de la temperatura el proceso de desplegamiento resultó parcialmente reversible, tanto respecto al desplazamiento de longitud de onda como a los cambios de intensidad. La adición de un exceso de 5 veces de heparán sulfato condujo a un incremento de la estabilidad de las proteínas, probablemente a través de la formación de complejo. Esto pudo observarse por una parte en un desplazamiento del punto de fusión a una temperatura más alta, y por otra parte en un desplazamiento significativamente menos pronunciado del máximo de emisión al incrementarse la temperatura.

Ejemplo 4: Ensayo basado en células de la función "negativa para receptor" de los mutantes de IL-8 dominantes-negativos

Con el fin de caracterizar la función alterada de receptor de los mutantes de IL-8 con respecto a la atracción de los neutrófilos, se sometió a ensayo la quimiotaxis basada en transfiltro de los neutrófilos en respuesta a los mutantes de IL-8 en una cámara de microquimiotaxis dotada de una membrana de policarbonato sin PVP de 5 mm.

Preparación de las células:

Brevemente, se preparó una fracción de neutrófilos a partir de sangre humana recién recolectada. Lo anterior se llevó a cabo mediante la adición de una solución de dextrano al 6% a sangre tratada con heparina (1:2) que seguidamente se dejó que sedimentase durante 45 minutos. La solución celular transparente en la parte superior se recogió y se lavó dos veces con HBSS sin Ca ni Mg. Se realizó un recuento de las células y finalmente se diluyeron con HBSS a razón de 2 millones/ml de células en suspensión, considerando que únicamente 60% de las células contadas eran neutrófilos.

Ensayo de quimiotaxis:

Se diluyeron mutantes de IL-8 a concentraciones de 10 mg/ml, 1 mg/ml y 0,1 mg/ml y se introdujeron por triplicado en el compartimiento inferior de la cámara (26 ml por pocillo). Los neutrófilos recién preparados se sembraron en la cámara superior (50 ml por pocillo) y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC en un incubador humidificado con 5% de CO2. Tras la incubación, se desmontó la cámara, se lavó la parte superior del filtro y las células enganchadas a la parte inferior se fijaron con metanol y se tiñeron con soluciones de Hemacolor (Merck). A continuación se contaron las células a una magnificación de 400x en 4 campos de microscopía seleccionados aleatoriamente de cada pocillo. Finalmente, se realizó un gráfico de la media de tres experimentos independientes frente a la concentración de quimoquina. En la figura 7, se muestra el índice de quimiotaxis para diversos mutantes de IL-8. Tal como se esperaba, todos los mutantes mostraban una actividad de unión de receptor significativamente reducida.

Ejemplo 5: Generación de genes RANTES recombinantes, expresión, biofísica y caracterización de la actividad de los mutantes

El concepto de mutantes dominantes-negativos de quimoquina "enmascaradores de GAG" también se utilizó con RANTES, una quimoquina implicada en reacciones de hipersensibilidad de tipo IV como el rechazo del trasplante, la dermatitis atópica, así como en otros trastornos inflamatorios como la artritis, la glomerulonefritis progresiva y la enfermedad pulmonar inflamatoria.

Se alteró la capacidad de unión a receptor mediante la introducción en la proteína wt de un residuo de metionina iniciador. La expresión de RANTES wt en E. coli condujo a la retención de este residuo de metionina, que convierte RANTES wt en un potente inhibidor de la migración de los monocitos, el denominado Met-RANTES. Se introdujeron diferentes mutantes que potenciaban la afinidad de unión a GAG mediante métodos de mutagénesis sitio-dirigida basados en la PCR.

Por estos medios se han clonado, expresado y purificado 9 mutantes de RANTES hasta el momento: Met-RANTES A22K, Met-RANTES H23K, Met-RANTES T43K, Met-RANTES N46R, Met-RANTES N46K, Met-RANTES Q48K, Met-RANTES A22K/N46R, Met-RANTES V49R/E66S y Met-RANTES 15LSALA18 V49R/E66S.

Se llevaron a cabo experimentos de titulación isotérmica de fluorescencia para medir las constantes de afinidad relativa (valores de Kd) de los mutantes de RANTES para heparina de tamaño definido. Tal como puede observarse en la tabla, todas las proteínas mutantes RANTES mostraban afinidades más altas para esta heparina, mostrando los resultados más prometedores Met-RANTES A22K, Met-RANTES H23K, Met-RANTES T43K y Met RANTES A22K/N46R.

Kd en nM

-

164,0 ± 16,6

5 Ensayo de quimiotaxis de RANTES

Se investigó la migración celular dirigida por un mutante de RANTE utilizando el sistema de cámara Boyden de 48 pocillos dotado de membranas de policarbonato recubiertas de PVP de 5 mm. Se introdujeron diluciones de RANTES y de mutante de RANTES, en RPMI 1640 que contenía HEPES 20 mM, pH 7,3 y 1 mg/ml de BSA, en los 10 pocillos inferiores de la cámara. Se introdujeron 50 ml de suspensiones de células THP-1 (línea celular promonocítica de la colección europea de cultivos celulares) en el mismo medio a razón de 2x106 células/ml en los pocillos superiores. Tras un periodo de incubación de 2 horas a 37ºC en 5% de CO2, se lavó la superficie superior del filtro en solución de HBSS. Las células que habían migrado se fijaron en metanol y se tiñeron con solución Hemacolor (Merck). Se contaron cinco magnificaciones 400x por pocillo y se realizó un gráfico de la media de tres

15 experimentos realizados independientemente, frente a la concentración de quimoquina, en la figura 8. Las barras de error representan el error estándar de la media de los tres experimentos. Nuevamente, tal como en el caso de los mutantes de IL-8, todos los mutantes de RANTES mostraban una actividad de unión a receptor significativamente reducida.

20 Ejemplo 6: Proteínas con regiones de unión a GAG

Por medios bioinformáticos y proteómicos, se caracterizaron las proteínas de unión a GAG conjuntamente con sus regiones de unión a GAG. En las tablas 2 y 3 a continuación, se muestran quimoquinas con sus regiones de unión a GAG (Tabla 2), y se proporcionan ejemplos de otras proteínas con sus regiones de unión a GAG (Tabla 3).

25 Tabla 2:

Quimoquinas y sus dominios de unión a GAG

Quimoquinas-CXC

18 20 60 68

IL-8: HPK , (R47) RVVEKFLKR

19 21 45 48 60 66

MGSA/GRoα: HPK , KNGR , KKIIEK

19 21 60 68

MIP-2α/GROβ: HLK , K45, KKIIEKMLK

15 18 42 45 57 62

NAP-2: HPK , KDGR , KKIVQK

20 23 46 49 61 66

PF-4: RPRH , KNGR , KKIIKK

24 27 41 43

SDF-1α:K1, KHLK , RLK

quimoquinas-CC

17 23 44 47

RANTES: ( RPLPRAH ) RKNR

18 24 46 49

MCP-2: RKIPIQR , KRGK QPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQN

22 24 47 50 66 11

LKP MCP-3: KQR , KLDK , KHLDKK

44 47

MIP-1α: R17, KRSR

45 48

MIP-1β:R18, KRSK APMGSDPPTACCFSYTARKLPRNFVVDYYETSSLCSQPAVVFQTKRSKQVCADPSESWVQEYVYDLEL

45 48

N MPIF-1: R18, KKGR

40 43

MIP-5 / HCC-2: KKGR

1263 PKRRKN 1268

-

-

-

291 ARKQKA 296 395 KKKIKE 400 291 ARKQKA 296 395 KKKIKE 400 -

-

-

477 EKKPRR 482 477 EKKPRR 482

-

98 KRKIRD 103 98 KRKI RD 103 -

-

372 LKKKEERL 379 384 EKKQRR 389 400 AKKMRP 405 384 EKKQRR 389 400 AKKMRP 405

-

-

102 DRRERE 107 102 DRRERE 107

-

228 LKRKLIRL 235 391 RKKRRARL 398 358 ARRLRE 363 390 ERKKRR 395 629 CKKSRK 634 358 ARRLRE 363 390 ERKKRR 395 -

-

-

21 RKRKSVRG 28 -20 ERKRKS 25

20 ERKRKS 25 -

-

-

11 TRRSRA 16 11 TRRSRA 16

-

-

-

-

-

180 KRRRNQKL 187 179 EKRRRN 184 179 EKRRRN 184 -

-

-

79 VRKFRT 84 102 GKKLKK 107 125 EKRAKY 130 147 SKKYKE 152 156 KKKMKY 161 240 KKRLKW 245 451 KKKAKY 456 523 EKKEKL 528 558 SKKMKF 563 79 VRKFRT 84 102 GKKLKK 107 125 EKRAKY 130 147 SKKYKE 152 156 KKKMKY 161 240 KKRLKW 245 451 KKKAKY 456 523 EKKEKL 528 558 SKKMKF 563 -

-

340 WKKKYEKE 347 605 VKRCKQ 610 864 EKRLRA 869 605 VKRCKQ 610 864 EKRLRA 869 -

215 KRRKHLKR 222 214 WKRRKH 219 220 LKRSRD 225 1340 GRKLRL 1345 -

-

3 ARRQRD 8 430 PKKPKT 435 557 NRRSRN 562 641 EKRDKE 646 3 ARRQRD 8 430 PKKPKT 435 557 NRRSRN 562 641 EKRDKE 646 -

-

-

1285 MRRLRS 1290 1285 MRRLRS 1290

-

-

-

-

86 EKKARS 91 332 GRRRRT 337 344 ERRQRF 349 -86 EKKARS 91 332 GRRRRT 337 344 ERRQRF 349 165 EKKKVSKA 172 124 IKRKKF 129 188 TKRVKK 193 381 DRRQKR 386 124 IKRKKF 129 188 TKRVKK 193 381 DRRQKR 386 --

-

112 DKKKRM 117 158 KRKEKA 163 167 YRKKKQ 172 112 DKKKRM 117 158 KRKEKA 163 261 RRRGKT 266 261 RRRGKT 266

33 -

-

560 NRRRQERF 567

100 TRRERA 105 494 HRKLKV 499 100 TRRERA 105 494 HRKLKV 499 6 PKKPKG 11 84 GKKKKD 89 6 PKKPKG 11 84 GKKKKD 89

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Método para modificar una región de unión a GAG (glucosaminoglicano) que es una hélice α C-terminal de una quimoquina, caracterizado porque comprende las etapas de introducir por lo menos un aminoácido básico en dicha hélice α C-terminal y/o delecionar por lo menos un aminoácido voluminoso y/o ácido en dicha hélice α C-terminal, de manera que dicha quimoquina presenta una afinidad de unión a GAG de Kd ≤10 mM, preferentemente ≤1 mM, todavía más preferentemente ≤0,1 mM, y en el que la afinidad de unión a GAG de dicha quimoquina se encuentra incrementada en comparación con la afinidad de unión a GAG de la quimoquina de tipo salvaje respectiva.
2.

Quimoquina modificada, caracterizada porque una región de unión a GAG que es una hélice α C-terminal en dicha quimoquina se modifica mediante sustitución, la inserción de por lo menos un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste de Arg, Lys e His, y/o la deleción de por lo menos un aminoácido con el fin de incrementar la cantidad relativa de aminoácidos básicos en dicha hélice α Cterminal, y/o reducir la cantidad de aminoácidos voluminosos y/o ácidos en dicha hélice α C-terminal, de manera que se incrementa la afinidad de unión a GAG de dicha quimoquina en comparación con la afinidad de unión a GAG de la quimoquina de tipo salvaje respectiva.
3.

Quimoquina modificada según la reivindicación 2, caracterizada porque la quimoquina es IL-8, RANTES o MCP-1.
4.

Quimoquina modificada según la reivindicación 2, caracterizada porque la quimoquina es SDF-1α, MGSA/GROα, MIP2α/ GROβ, NAP-2, PF-4, MCP-2, MCP-3, MIP-1α, MIP-1β, MPIF-1 ó MIP-5/HCC-1.
5.

Quimoquina modificada según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracteizada porque la afinidad de unión a GAG incrementada es una afinidad de unión incrementada a heparán sulfato y/o a heparina.
6.

Quimoquina modificada según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque una región biológicamente activa adicional se modifica, inhibiendo o regulando negativamente de esta manera una actividad biológica adicional de dicha proteína.
7.

Quimoquina modificada según la reivindicación 6, caracterizada porque dicha región biológicamente activa adicional se modifica mediante deleción, inserción y/o sustitución preferentemente con alanina, un residuo estérica y/o electrostáticamente similar.
8.

Quimoquina modificada según la reivindicación 6 ó 7, caracterizada porque dicha actividad biológica adicional es la activación de los leucocitos.
9.

Molécula aislada de ácido polinucleico, caracterizada porque codifica una quimoquina según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.
10.

Vector, caracterizado porque comprende una molécula aislada de ADN según la reivindicación 9.
11.

Célula recombinante que comprende un ácido polinucleico según la reivindicación 9, en la que la célula recombinante no es de origen humano.
12.

Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una quimoquina según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, un ácido polinucleico según la reivindicación 9 ó un vector según la reivindicación 10, y un portador farmacéuticamente aceptable.
13.

Quimoquina según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, un ácido polinucleico según la reivindicación 9 ó un vector según la reivindicación 10, destinada al tratamiento de una condición inflamatoria, en la que la quimoquina se selecciona de entre el grupo que consiste de IL-8, MGSA/GROα, MIP2alpha, GROβ, NAP-2, PF-4, SDF-1α, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP-1α, MIP-1β, MPIF-1 y MIP-5.
14.

Quimoquina según la reivindicación 13, caracterizada porque la condición inflamatoria se selecciona de entre un grupo que comprende artritis reumatoide, soriasis, osteoartritis, asma, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple.