ES2330362T3 - Proteinas de union a gag. - Google Patents
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Abstract
Una proteína interleuquina-8 (IL-8) modificada que se caracteriza por que al menos un residuo aminoacídico en la posición 70 y/o 71 de IL-8 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la tabla 2 está sustituido por Arg, Lys y/o His, y por que los 6 aminoácidos N-terminales de dicha proteína están delecionados.
Description
Proteínas de unión a GAG.
La presente invención está relacionada con los
métodos y herramientas utilizados para la inhibición de la
interacción de quimioquinas y sus receptores de elevada afinidad
sobre los leucocitos, y con los métodos para el tratamiento
terapéutico de las enfermedades inflamatorias.
Las quimioquinas, originalmente denominadas
citoquinas quimioatrayentes, realmente comprenden más de 50 miembros
y representan una familia de proteínas pequeñas, inducibles, de
bajo peso molecular (6-12 kDa en su forma
monomérica) y secretadas que juegan un papel decisivo durante los
procesos inmunovigilancia e inflamatorios. Dependiendo de su
función en la inmunidad y la inflamación, pueden distinguirse dos
clases. Las quimioquinas inflamatorias son producidas por muchas
células de tejidos diferentes así como por los leucocitos que migran
en respuesta a las toxinas bacterianas y las citoquinas
inflamatorias como IL-1, TNF y los interferones. Su
función principal es la de reclutar leucocitos para la defensa del
huésped y en el proceso de la inflamación. Las quimioquinas
localizadoras, por otro lado, se expresan constitutivamente en áreas
definidas de los tejidos linfoides. Estas dirigen el tráfico y
localización de los linfocitos y las células dendríticas dentro del
sistema inmune. Estas quimioquinas, como se ilustra mediante
BCA-1, SDF-1 o SLC, controlan la
relocalización y recirculación de los linfocitos en el contexto de
su maduración, diferenciación, activación y aseguran su correcta
localización dentro de los órganos secundarios linfoides.
A pesar del gran número de representantes, las
quimioquinas muestran un plegamiento estructural notablemente
similar aunque la homología de secuencia varía entre un 20 y un 70
por ciento. Las quimioquinas consisten aproximadamente en
70-130 aminoácidos con cuatro residuos cisteína
conservados. Las cisteínas forman dos puentes disulfuro (Cys
1-Cys 3, Cys 2-Cys 4) que son
responsables de su estructura tridimensional característica. Las
citoquinas quimiotácticas constan de un pequeño dominio
amino-terminal (3-10 aminoácidos)
que precede al primer residuo cisteína, un núcleo compuesto de
láminas \beta y bucles de conexión que se encuentran entre el
segundo y el cuarto residuo de cisteína, así como una hélice
\alpha carboxi-terminal de 20-60
aminoácidos. El núcleo de la proteína posee una estructura bien
ordenada mientras que las partes N- y C-terminal
están desordenadas. Como proteínas de secreción se sintetizan con
una secuencia líder de 20-25 aminoácidos que se
escinde antes de su liberación.
Las quimioquinas se han subdividido en cuatro
familias en base a la posición relativa de sus residuos cisteína en
la proteína madura. En la subfamilia de
\alpha-quimioquinas, los dos primeros de las
cuatro cisteínas están separadas por un único aminoácido (CXC),
mientras en las \beta-quimioquinas los residuos de
cisteína correspondientes se encuentran adyacentes entre ellos
(CC). Las \alpha-quimioquinas pueden además
clasificarse según si contienen la secuencia ELR en
N-terminal, lo que las hace quimiotácticas para los
neutrófilos (por ejemplo IL-8), y las que carecen
del motivo ELR y actúan sobre los linfocitos (por ejemplo
I-TAC). Estructuralmente las
\beta-quimioquinas pueden subdividirse en dos
familias: la familia de la proteína quimioatrayente de los
monocitos eotaxina, que se compone de las cinco proteínas
quimioatrayentes de los monocitos (o MCP) y de la eotaxina que son
idénticas entre ellas aproximadamente en un 65 por ciento, y el
resto de \beta-quimioquinas. Como en la familia
CXC, los aminoácidos N-terminales que preceden los
residuos CC son componentes críticos para la actividad biológica y
la selectividad por los leucocitos de las quimioquinas. Las
\beta-quimioquinas, en general, no actúan sobre
los neutrófilos pero atraen los monocitos, eosinófilos, basófilos y
linfocitos con selectividad variable.
Sólo algunas quimioquinas no encajan en la
familia CC o CXC. La linfotactina es de hecho la única quimioquina
que muestra sólo dos en lugar de las cuatro cisteínas
características en su estructura primaria, y por lo tanto se
clasifican como quimioquinas \gamma o C. Por otro lado,
concluyendo con esta clasificación, debe mencionarse la
fractalquina como el único representante de la subfamilia \delta o
CXXXC con tres aminoácidos separando las primeras dos cisteínas.
Tanto la linfotaxina como la fractalquina, inducen la quimiotaxis de
las células T y las células asesinas naturales.
Las quimioquinas inducen la migración y la
activación celular mediante su unión a receptores específicos de la
superficie celular, con siete dominios transmembranales (7TM)
acoplados a proteína G sobre las células diana. Hasta el momento se
han clonado dieciocho receptores quimioquina, lo que incluye seis
receptores de CXC, diez de CC, uno de CX3C y uno de XC. Los
receptores de quimioquinas se expresan sobre diferentes tipos de
leucocitos, algunos de ellos están restringidos a ciertas células
(por ejemplo CXCR1 se restringe a los neutrófilos) mientras otros
se expresan de forma más amplia (por ejemplo CCR2 se expresa en
monocitos, células T, células asesinas naturales y basófilos). De
forma similar a las quimioquinas, los receptores puede expresarse
constitutivamente en ciertas células, mientras otros son inducibles.
Algunos de ellos incluso pueden regularse negativamente haciendo
que las células no respondan a una determinada quimioquina pero
mantienen la respuesta a otras. La mayoría de receptores reconocen
más de una quimioquina y viceversa, pero el reconocimiento se
restringe a las quimioquinas de la correspondiente subfamilia (véase
la Tabla 1).
Las quimioquinas poseen dos puntos principales
de interacción con sus receptores, uno en el dominio
amino-terminal y el otro con un bucle expuesto del
armazón que se extiende entre el segundo y tercer residuo de
cisteína. Ambos puntos se mantienen en gran proximidad mediante
puentes disulfuro. El receptor reconoce primero el lugar de unión
de la región del bucle que parece funcionar como dominio de anclaje.
Esta interacción restringe la movilidad de la quimioquina
facilitando así la correcta orientación del dominio aminoterminal.
Se han realizado estudios con quimioquinas mutantes que aún se unen
de forma efectiva a sus receptores pero no resultan en una
señalización. Estos mutantes se obtuvieron mediante la deleción o
modificación de aminoácidos del extremo N-terminal
de, por ejemplo, IL-8, RANTES y
MCP-1.
Tras la activación del receptor se da lugar a
múltiples vías de señalización intracelular como resultado de la
unión de la quimioquina. Las quimioquinas también interaccionan con
dos tipos de moléculas no señalizadoras. Una es el receptor DARC
que se expresa en los eritrocitos y en las células endoteliales y
que se une a CC, así como a las quimioquinas CXC, y evitan su
circulación. El segundo tipo son los glucosaminoglucanos (GAG) de
heparán sulfato que forman parte de los proteoglucanos y que sirven
como coreceptores de las quimioquinas. Estos capturan y presentan
las quimioquinas sobre la superficie del tejido diana (por ejemplo
las células endoteliales) para establecer un gradiente de
concentración local. En una respuesta inflamatoria, como en la
artritis reumatoide, los leucocitos ruedan en el endotelio en un
proceso mediado por selectinas y se ponen en contacto con las
quimioquinas presentadas por los proteoglucanos de la superficie
celular. Así, las integrinas de los leucocitos se activan y se da
lugar a una adherencia firme y extravasación. Los leucocitos
reclutados se activan a través de citoquinas inflamatorias locales
y pueden desensibilizarse a otras señalizaciones de quimioquinas a
causa de la elevada concentración local de quimioquinas. Para
mantener un gradiente de quimioquinas del torrente sanguíneo al
tejido, el receptor DARC funciona como un sumidero de quimioquinas
extra.
Los proteoglucanos de heparán sulfato (HS), que
consisten en una proteína núcleo con cadenas laterales de
glucosaminoglucanos (GAG) unidas covalentemente, se encuentran en la
mayoría de células y tejidos de mamíferos. Mientras la parte
proteica determina la localización del proteoglucano en la membrana
celular o en la matriz extracelular, el componente
glucosaminoglucano media las interacciones con una serie de ligandos
extracelulares, como los factores de crecimiento, quimioquinas y
moléculas de adhesión. La biosíntesis de proteoglucanos se ha
revisado extensivamente con anterioridad. Los grupos principales de
proteoglucanos de la superficie celular son de la familia sindecán
de proteínas transmembranales (cuatro miembros en mamíferos) y de la
familia glupicán de proteínas unidas a la membrana celular mediante
una cola de glucosilfosfatidilinositol (GPI) (seis miembros en
mamíferos). Mientras los glipicanos se expresan ampliamente en el
sistema nervioso, riñones y en menor medida en músculo esquelético
y liso, el sindecán-1 es el principal HSPG en las
células epiteliales, el sindecán-2 predomina en los
fibroblastos y células endoteliales, el sindecán-3
abunda en las células neuronales y el sindecán-4 se
expresa ampliamente. La mayoría de las cadenas de GAG añadidas al
núcleo de proteínas sindecán a través de una región de unión
tetrasacárido en serinas concretas son cadenas HS. Aunque las
secuencias aminoacídicas de los dominios extracelulares de los
tipos sindecán específicos no están conservadas entre especies
diferentes, al contrario que los dominios transmembranales y
citoplasmáticos, el número y las posiciones de las cadenas de GAG
están altamente conservadas. La estructura de los GAG, sin embargo,
es específico de especie y además depende de la naturaleza del
tejido que expresa el HSPG.
El heparán sulfato (HS) es el miembro más
abundante de la familia de los glucosaminoglucanos (GAG) de
polisacáridos lineales, que también incluye la heparina, condroitín
sulfato, dermatán sulfato y queratán sulfato. El HS que aparece de
forma natural se caracteriza por una cadena lineal de
20-100 unidades disacárido compuestas por
N-acetil-D-glucosamina
(GlcNAc) y ácido D-glucurónico (GlcA) que pueden
modificarse para que incluyan N- y O-sulfatación
(6-O y 3-O sulfatación de la
glucosamina y 2-O sulfatación del ácido urónico) así
como epimerización del ácido
\beta-D-glurónico a ácido
\alpha-L-idurónico (IdoA).
Los grupos de residuos azúcar N- y
O-sulfatados, separados por regiones de baja
sulfatación, se asumen como los principales responsables de la
importante unión de proteínas y las propiedades regulatorias del HS.
Además de las interacciones electrostáticas de los grupos sulfato
del HS con los aminoácidos básicos, también se cree que están
involucradas en la unión de proteínas las fuerzas de van der Waals y
las interacciones hidrofóbicas. Además, la presencia de residuos
iduronato conformacionalmente flexibles parece favorecer la unión de
GAG a las proteínas. Otros factores como el espaciado entre los
puntos de unión de proteínas también juegan un papel crítico en las
interacciones de unión proteína-GAG: por ejemplo la
dimerización del interferón \gamma inducida por HS requiere de
cadenas GAG con dos secuencias de unión de proteínas separadas por
una región de 7 kDa con baja sulfatación. En ocasiones son
necesarias secuencias adicionales para una actividad biológica
completa de algunos ligandos: para permitir la transducción de
señales de FGF-2, HS debe poseer tanto la secuencia
de unión mínima como residuos adicionales que se supone
interaccionan con el receptor FGF.
Las proteínas de unión a heparina a menudo
contienen secuencias consenso que consisten en grupos de residuos
aminoacídicos básicos. La lisina, arginina, asparagina, histidina y
glutamina están frecuentemente involucradas en los contactos
electrostáticos con los grupos sulfato y carboxilo del GAG. Se cree
que el espaciado de los aminoácidos básicos, en ocasiones
determinado por la estructura 3D de las proteínas, controla la
especificidad de unión y afinidad de los GAG. La actividad
biológica del ligando también puede verse afectada por la cinética
de la interacción HS-proteína. Reducir la dimensión
de la difusión de los factores de crecimiento es una de las
funciones sugeridas del HSPG, para la cual es ideal el carácter
fuertemente repetitivo de las cadenas de GAG así como sus tasas de
unión y disociación de proteínas relativamente rápida. En algunos
casos, la cinética en lugar de la termodinámica dirige la función
fisiológica de la unión HS-proteína. La mayoría de
ligandos de HS requieren secuencias GAG de longitud y estructura
bien definidas. La heparina, que se produce por mastocitos, es
estructuralmente muy similar al heparán sulfato pero se caracteriza
por niveles mayores de modificaciones
post-polimerización que resulta en un alto grado
uniforme de sulfatación con un grado relativamente pequeño de
diversidad estructural. Así, los bloques altamente modificados en
heparán sulfato se refieren algunas veces como "similares a
heparina". Por esa razón, la heparina puede utilizarse como un
análogo perfecto de HS para los estudios fisiológicos de proteína
como, además, está disponible en mayores cantidades y por lo tanto
más barato que el HS. Los diferentes tipos de células han mostrado
sintetizar proteoglucanos con diferentes estructuras de
glucosaminoglucanos que cambia durante la patogénesis, durante el
desarrollo o en respuesta a señales extracelulares como factores de
crecimiento. Esta diversidad estructural de HSPG conduce a una alta
versatilidad de unión que enfatiza la gran importancia de los
proteoglucanos.
Desde la demostración de que los proteoglucanos
de heparán sulfato son críticos para la señalización de FGF, se
realizaron varias investigaciones que muestran la importancia de la
unión quimioquina-GAG para promover la actividad de
quimioquina. Primero, casi todas las quimioquinas estudiadas hasta
la fecha parece que se unen a HS in vitro, lo que sugiere
que esto representa una propiedad fundamental de estas proteínas.
Segundo, el hallazgo que los linfocitos T in vivo secretan
CC-quimioquinas como complejos con
glucosaminoglucanos indica que esta forma de interacción es
fisiológicamente relevante. Además, se sabe que la asociación de
quimioquinas con HS ayuda a estabilizar los gradientes de
concentración a lo largo de la superficie endotelial, proporcionando
así información direccional para los leucocitos migradores. También
se piensa que el HS protege a las quimioquinas de la degradación
proteolítica y que induce su oligomerización promoviendo así altas
concentraciones locales en la proximidad de los receptores de
señalización acoplados a G. La relevancia funcional de la
oligomerización, no obstante, es controvertida aunque todas las
quimioquinas presentan una clara base estructural para la
multimerización. La dimerización a través de la asociación de las
láminas \beta se observa para todas las quimioquinas de la
familia de CXC (por ejemplo IL-8), contrariamente,
la mayoría de
miembros de la familia CC-quimioquina (por ejemplo RANTES), dimerizan a través de sus cadenas N-terminales.
miembros de la familia CC-quimioquina (por ejemplo RANTES), dimerizan a través de sus cadenas N-terminales.
Se han acumulado muchos datos sobre la
inhibición de la interacción de quimioquinas y su alta afinidad de
receptores en los leucocitos mediante compuestos de bajo peso
molecular. No obstante, no ha habido un avance en el tratamiento
terapéutico de las enfermedades inflamatorias mediante esta
aproximación.
La interleuquina-8
(IL-8) es una molécula clave involucrada en la
atracción de neutrófilos durante la inflamación aguda y crónica. Se
han llevado a cabo muchas aproximaciones para bloquear la acción de
IL-8, empezando con la inhibición de la producción
de IL-8 mediante por ejemplo glucocorticoides,
Vitamina D3, ciclosporina A, factor de crecimiento transformante
\beta, interferones etc., todos ellos inhiben la actividad de
IL-8 a nivel de producción de mRNA de
IL-8. Otra aproximación utilizada previamente es
inhibir la unión de IL-8 a sus receptores
utilizando anticuerpos específicos tanto contra el receptor en el
leucocito o frente a IL-8 en sí, para actuar como
antagonistas específicos inhibiendo así la actividad
IL-8.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar así una estrategia alternativa para la inhibición o
entorpecimiento de la interacción de quimioquinas/receptores en los
leucocitos. Específicamente la acción de IL-8 será
el objetivo de dicha estrategia.
La presente invención está relacionada con una
proteína interleuquina-8 (IL-8)
modificada, un ácido polinucleico aislado, un vector, una célula
recombinante, una preparación farmacéutica y un uso como se define
en las reivindicaciones.
Se describe aquí un método para producir nuevas
proteínas de unión a GAG así como proteínas de unión a GAG
alternativas que muestran una mayor afinidad al coreceptor de GAG
(más que el tipo salvaje). Dichas proteínas de unión a GAG
modificadas pueden actuar como competidoras con las proteínas de
unión a GAG y son capaces de inhibir o regular negativamente la
actividad de la proteína de unión a GAG salvaje, no obstante sin los
efectos secundarios que aparecen en las proteínas recombinantes
conocidas que se usan en la actualidad. Las moléculas
IL-8 de acuerdo con la presente invención no
muestran las desventajas mencionadas anteriormente. Las proteínas
de unión a GAG modificadas pueden utilizarse en fármacos para varios
usos terapéuticos, en particular -en el caso de las quimioquinas-
para el tratamiento de enfermedades inflamatorias sin las
desventajas conocidas que aparecen en las quimioquinas
recombinantes conocidas en la actualidad. La modificación del sitio
de unión a GAG de acuerdo con dicho método pasó a ser una
estrategia ampliamente aplicable para todas las proteínas cuya
actividad se basa en el evento de unión a este sitio, especialmente
quimioquinas con sitios GAG. Las moléculas IL-8 de
acuerdo con la presente invención con una mayor afinidad de unión a
GAG son específicamente ventajosas con respecto
a sus efectos biológicos, especialmente con respecto a su actividad antiinflamatoria mediante su competición con las moléculas de tipo salvaje para el sitio GAG.
a sus efectos biológicos, especialmente con respecto a su actividad antiinflamatoria mediante su competición con las moléculas de tipo salvaje para el sitio GAG.
\vskip1.000000\baselineskip
Un método para introducir un sitio de unión a
GAG en una proteína que se caracteriza porque comprende los pasos
de:
- identificar una región en una proteína que no
es esencial para el mantenimiento de la estructura
- introducir al menos un aminoácido básico en
dicho sitio y/o delecionar al menos un aminoácido de relleno y/o
acídico en dicho sitio, en la que dicho sitio de unión a GAG posee
una afinidad de unión a GAG de Kd \leq 10 \muM, preferiblemente
\leq 1 \muM, más preferiblemente \leq 0,1 \muM.
Introduciendo al menos un aminoácido básico y/o delecionando al
menos un aminoácido de relleno y/o acídico en dicha región, se
introduce en dicha proteína un nuevo sitio de unión a GAG
"artificial" mejorado. Esto comprende la nueva introducción
completa de un sitio de unión a GAG en una proteína que no muestra
una actividad de unión a GAG antes de esta modificación. Esto
también comprende la introducción de un sitio de unión a GAG en una
proteína que ya muestra actividad de unión a GAG. El nuevo sitio de
unión a GAG puede introducirse en una región de la proteína que no
muestra afinidad de unión a GAG así como una región que muestra
afinidad de unión a GAG. No obstante, se proporciona una
modificación de la afinidad de unión a GAG de una proteína de unión
a GAG determinada, dicha capacidad de unión a GAG de la proteína
modificada aumenta en comparación con la proteína salvaje. La
presente invención está relacionada con un IL-8
modificado así como a una molécula de DNA aislada, un vector, una
célula recombinante, una composición farmacéutica y el uso de dicha
proteína modificada.
El término "introducir al menos un aminoácido
básico" se refiere a la introducción de aminoácidos adicionales
así como a la sustitución de aminoácidos. El propósito principal es
aumentar la cantidad relativa de los aminoácidos básicos,
preferiblemente Arg, Lys, His, Asn y/o Gln, en comparación con la
cantidad total de aminoácidos en dicho sitio, mientras que el sitio
de unión a GAG resultante preferiblemente comprenderá al menos 3
aminoácidos básicos, aún preferiblemente 4, más preferiblemente 5
aminoácidos.
El sitio de unión a GAG está preferiblemente en
una posición expuesta al solvente, por ejemplo en un bucle. Esto
asegurará una modificación efectiva.
Puede analizarse si una región de una proteína
es esencial o no para el mantenimiento de la estructura, por
ejemplo mediante métodos computacionales con programas específicos
conocidos por los expertos en la materia. Tras la modificación de
la proteína, la estabilidad conformacional se analiza
preferiblemente in silico.
El término "aminoácido de relleno" se
refiere a aminoácidos con cadenas laterales largas o estéricamente
interferentes; estos son en particular Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr. Los
aminoácidos acídicos son en particular Glu y Asp. Preferiblemente,
el sitio de unión a GAG resultante está libre de aminoácidos
acídicos y de relleno, indicando que se han eliminado todos los
aminoácidos acídicos y de relleno.
La afinidad de unión a GAG se determina -para el
alcance de la protección de la presente solicitud- sobre la
constante de disociación K_{d}. Una posibilidad es determinar los
valores de la constante de disociación (K_{d}) de cualquier
proteína dada por el cambio estructural en la unión de ligandos.
Varias técnicas son conocidas por los expertos en la materia, por
ejemplo las titulaciones de la fluorescencia isotérmicas,
calorimetría de titulaciones isotérmicas, resonancia de plasmón en
superficie, ensayo de movilidad en gel, e indirectamente mediante
experimentos de competición con ligandos de GAG radiactivamente
marcados. Otra posibilidad es predecir las regiones de unión
mediante el cálculo con
métodos computacionales también conocidos por los expertos en la materia, en el que se pueden usar varios programas.
métodos computacionales también conocidos por los expertos en la materia, en el que se pueden usar varios programas.
Un protocolo para introducir un sitio de unión a
GAG en una proteína es por ejemplo el siguiente:
- Identificar una región de la proteína que no
es esencial para el mantenimiento estructural general y que puede
ser adecuado para la unión a GAG.
- Diseñar un nuevo sitio de unión a GAG mediante
la introducción (sustitución o inserción) de un residuo básico Arg,
Lys, His, Asp y Gln en cualquier posición o eliminando aminoácidos
que interfieren en la unión a GAG.
- Comprobar la estabilidad conformacional de la
proteína mutante resultante in silico.
- Clonar el cDNA de la proteína de tipo salvaje
(alternativamente: comprar el cDNA).
- Utilizarlo como molde para la mutagénesis
asistida por PCR para introducir los cambios mencionados
anteriormente en la secuencia de aminoácidos.
- Subclonar el gen mutante en un sistema de
expresión adecuado (procariota o eucariota dependiendo de las
modificaciones post-traduccionales biológicamente
requeridas).
- Expresión, purificación y caracterización de
las proteínas mutantes in vitro.
- Criterios para introducir una afinidad de
unión a GAG: K_{d} ^{GAG}(mutante) < 10 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de dichas proteínas diseñadas con un
nuevo sitio de unión a GAG son por ejemplo la parte Fc de la IgG
así como los factores del complemento C3 y C4 modificados como
sigue:
Fc: (439) KSLSLS (444) -> KSKKLS
C3: (1297)WIASHT(1302)->
WKAKHK
C4: (1)MLDAERLK(8)->
MKKAKRLK
La proteína de la invención IL-8
comprende un nuevo sitio de unión a GAG -en comparación con la
proteína salvaje- como se ha definido antes y actuará por lo tanto
como competidor con proteínas de unión a GAG naturales, en
particular ya que la afinidad de unión a GAG de la proteína de la
invención IL-8 es muy alta, por ejemplo K_{d}
\leq 10 \muM.
La región de unión a GAG en una proteína unión a
GAG modificada se modifica mediante sustitución, inserción, y/o
deleción de al menos un aminoácido para aumentar la cantidad
relativa de aminoácidos básicos en dicha región de unión a GAG, y/o
reducir la cantidad de aminoácidos de relleno y/o acídicos en dicha
región de unión a GAG, preferiblemente en una posición expuesta al
solvente, y en la que la afinidad de unión a GAG de dicha proteína
está aumentada en comparación con la afinidad de unión a GAG de la
correspondiente proteína salvaje.
Se ha visto sorprendentemente que aumentando la
cantidad relativa de aminoácidos básicos, en particular Arg, Lys y
His, en la región de unión a GAG, la proteína de unión a GAG
modificada muestra un aumento de la afinidad de unión a GAG en
comparación con las proteínas salvajes, en particular cuando la
cantidad relativa de aminoácidos básicos aumenta en una posición
expuesta al solvente, ya que un área cargada positivamente en la
superficie de la proteína ha demostrado aumentar la afinidad de
unión. Preferiblemente, al menos 3, preferiblemente 4, más
preferiblemente 5 aminoácidos básicos están presentes en la región
de unión a GAG.
El término "proteína de unión a GAG" se
refiere a cualquier proteína que se une a un coreceptor de GAG.
Tanto si una proteína se une o no a un coreceptor de GAG, puede
analizarse con la ayuda de protocolos conocidos tal como se ha
mencionado antes. Hileman et al. (BioEssays 20 (1998),
156-167) describe sitios consenso en las proteínas
de unión a glucosaminoglucano. La información descrita en este
artículo es también útil como información de partida para la
presente invención.
En el alcance de la presente solicitud, el
término "región de unión a GAG" se define como una región que
se une a GAG con una constante de disociación (valor K_{d})
inferior a 100 \muM, preferiblemente inferior a 50 \muM, más
preferiblemente inferior a 20 \muM, como se ha determinado
mediante titulación de la fluorescencia isotérmica (véanse los
ejemplos más adelante).
Cualquier modificación mencionada en la presente
solicitud puede llevarse a cabo con métodos bioquímicos conocidos,
por ejemplo mutagénesis dirigida al sitio. Deberá también notarse
que el clonaje molecular del sitio de unión a GAG es, por lo tanto,
una técnica previa (véase por ejemplo WO96/34965 A, WO 92/07935 A,
Jayaraman et al. (FEBS Letters 482 (2000),
154-158), WO02/20715 A, Yang et al. (J. Cell.
Biochem. 56 (1994), 455-468), en las que el
barajado molecular o la síntesis de novo de las regiones GAG se
describen en; Butcher et al., (FEBS Letters 4009 (1997),
183-187) (se refiere a péptidos artificiales, no
proteínas); Jinno- Oue et al, (J. Virol. 75 (2001),
12439-12445) síntesis de novo)).
La región de unión a GAG puede modificarse
mediante sustitución, inserción y/o deleción. Esto quiere decir que
un aminoácido no básico puede sustituirse mediante un aminoácido
básico, un aminoácido básico puede insertarse en la región de unión
a GAG o un aminoácido no básico puede delecionarse. Además, se
deleciona un aminoácido que interfiere con la unión a GAG,
preferiblemente todos los aminoácidos que interfieren la unión se
delecionan. Dichos aminoácidos son en particular aminoácidos de
relleno como se han descrito antes así como aminoácidos acídicos,
por ejemplo Glu y Asp. Tanto si un aminoácido interfiere o no con la
unión a GAG puede examinarse con métodos por ejemplo matemáticos o
computacionales. El resultado de cualquiera de estas modificaciones
es que aumenta la cantidad relativa de aminoácidos básicos en dicha
región de unión a GAG, en la que "relativa" se refiere a la
cantidad de aminoácidos básicos en dicha región de unión a GAG en
comparación con el número total de aminoácidos en dicha región de
unión a GAG. Además, los aminoácidos que interfieren de forma
estérica o electroestáticamente con la unión a GAG se eliminan.
Tanto si un aminoácido está presente o no en una
posición expuesta al solvente, puede determinarse por ejemplo con
la ayuda de la estructura tridimensional conocida de la proteína o
con la ayuda de métodos computacionales como se ha mencionado
antes.
Tanto si la afinidad de unión a GAG de dicha
proteína modificada aumenta o no en comparación con la afinidad de
unión a GAG de las correspondientes proteínas salvajes, se puede
determinar como se ha mencionado antes con la ayuda de, por
ejemplo, experimentos de titulación por fluorescencia que determinan
las constantes de disociación. Los criterios para la mejora de la
afinidad de unión a GAG será K_{d} (mutante) < K_{d}
(salvaje), preferiblemente en al menos 100%. Específicamente las
proteínas modificadas mejoradas poseen una afinidad de unión a GAG
-en comparación con la K_{d} salvaje- mayor en un factor como
mínimo de 5, preferiblemente como mínimo de 10, más preferiblemente
como mínimo de 100. El aumento de la afinidad de unión a GAG
mostrará por lo tanto preferiblemente una K_{d} inferior a 10
\muM, preferiblemente inferior a 1 \muM, más preferiblemente
inferior a 0,1 \muM.
Al aumentar la afinidad de unión a GAG, la
proteína modificada actuará como un antagonista específico y
competirá con la proteína de unión a GAG salvaje por la unión a
GAG.
Se inserta al menos un aminoácido básico
seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys, y His en dicha
región de unión a GAG. Estos aminoácidos se insertan fácilmente en
dicha región de unión a GAG, en la que el término "insertado"
se refiere a una inserción, así como una sustitución de cualquier
aminoácido no básico por arginina, lisina o histidina. Por
supuesto, es posible insertar más de un aminoácido básico en el que
el mismo aminoácido básico puede insertarse o también una
combinación de dos o tres de los aminoácidos anteriormente
mencionados.
La proteína es la quimioquina
IL-8. Se sabe que las quimioquinas tienen un sitio
de interacción con el co-receptor GAG mientras que
esta unión de quimioquina es a menudo una condición para la
posterior activación del receptor como se ha mencionado antes. Ya
que las quimioquinas se encuentran a menudo en enfermedades
inflamatorias, es de gran interés bloquear la activación del
receptor de quimioquina. Dichas quimioquinas son
IL-8, RANTES o MCP-1, que son
moléculas bien caracterizadas y cuya región de unión a GAG es bien
conocida (véase, por ejemplo, Lortat-Jacob et
al., PNAS 99 (3) (2002), 1229-1234). Al aumentar
la cantidad de aminoácidos básicos en la región de unión a GAG de
IL-8, su afinidad de unión aumenta y por lo tanto
las quimioquinas salvajes se unirán menos frecuentemente o no se
unirán, dependiendo de la concentración de la proteína modificada
respecto a la concentración de la proteína salvaje.
De acuerdo con un aspecto ventajoso, dicha
región de unión a GAG es una hélice \alpha en C terminal. Un
monómero químico típico se organiza alrededor de una lámina \beta
de triple cadena antiparalela cubierta por una hélice \alpha de
C-terminal. Se ha visto que en las quimioquinas,
esta hélice \alpha de C-terminal está involucrada
principalmente en la unión a GAG, por lo que la modificación de esta
hélice \alpha de C-terminal, para poder aumentar
la cantidad de aminoácidos básicos resulta en una quimioquina
modificada con una afinidad de unión a GAG aumentada.
De forma ventajosa, las posiciones 17, 21, 70,
y/o 71 en la IL-8 está sustituidas por Arg, Lys y/o
His. Aquí es posible que sólo uno de estos sitios esté modificado.
No obstante, también más de uno de estos sitios puede estar
modificado así como todos, mientras que todas las modificaciones
pueden ser Arg o Lys o His o una mezcla de estas. En
IL-8 se ha visto que estas posiciones aumentan
fuertemente la afinidad de unión a GAG de IL-8 y
por lo tanto estas posiciones son particularmente adecuadas para las
modificaciones.
Preferiblemente el aumento de la afinidad de
unión es un aumento de la afinidad de unión a heparán sulfato y/o
heparina. El heparán sulfato es el miembro más abundante de la
familia GAG de polisacáridos lineales que también incluye la
heparina. La heparina es estructuralmente muy similar al heparán
sulfato que se caracteriza por niveles superiores de modificaciones
post polimerización que resulta en un alto grado de sulfatación
uniforme con un grado relativamente pequeño de diversidad
estructural. Por lo tanto, los bloques altamente modificados en el
heparán sulfato se refieren algunas veces como similares a heparina
y puede utilizarse la heparina como un análogo de heparán sulfato
para los estudios biofísicos de proteína. En cualquier caso, ambos,
el heparán sulfato y la heparina, son particularmente
adecuados.
Aún preferiblemente, se modifica otra región
biológicamente activa inhibiendo así o regulando negativamente otra
actividad biológica de dicha proteína. Esta otra actividad biológica
se conoce para la mayoría de proteínas de unión a GAG, por ejemplo
para las quimioquinas. Esta puede ser la región de unión a un
receptor, por ejemplo al receptor 7TM. El término "otra"
define una región biológicamente activa que no es la región de unión
a GAG que, no obstante, se une a otras moléculas, células o
receptores y/o las activa. Al modificar esta otra región
biológicamente activa la otra actividad biológica de esta proteína
se inhibe o regula negativamente y por lo tanto se proporciona una
proteína modificada que es un antagonista fuerte de la proteína
salvaje. Esto indica que por otro lado, la afinidad de unión a GAG
es mayor que la unión a GAG de la proteína salvaje, por lo que la
proteína modificada se unirá en mayor medida a GAG en lugar que a la
proteína salvaje. Por otro lado, la otra actividad de la proteína
salvaje que principalmente ocurre cuando la proteína se une a GAG,
está inhibida o regulada negativamente, ya que la proteína
modificada no llevará esta actividad específica o llevará esta
actividad en un menor grado. Con esta proteína modificada se
proporciona un antagonista efectivo para las proteínas de unión a
GAG salvajes que no muestran los efectos secundarios conocidos de
las otras proteínas recombinantes como se describe en el estado de
la técnica. Esta otra región biológicamente activa puede por
ejemplo determinarse in vitro mediante ensayos de competición
de receptor (utilizando quimioquinas salvajes marcadas con
fluorescencia, influjo de calcio, y migración celular (realizado en
leucocitos nativos o en líneas celulares transfectadas de forma
estable con 7TM). Ejemplos de dichas otras regiones biológicamente
activas son, además de otros sitios de unión a receptor (como en la
familia de factores de crecimiento), sitios enzimáticos (como en
las hidrolasas, liasas, sulfotransferasas,
N-deacetilasas, y copolimerasas), sitios de
interacción de proteínas (como en la antitrombina III), y dominios
de unión a membrana (como en la proteína gD del virus herpes
simplex). Con esta realización preferible de proteínas
IL-8 doblemente modificadas, se proporcionan por lo
tanto mutantes dominantes (refiriéndose a la unión a GAG) negativos
(en referencia al receptor) que son específicamente ventajosos
respecto a los objetivos establecidos para la presente
invención.
Aún preferiblemente, dicha otra región
biológicamente activa se modifica mediante deleción, inserción, y/o
sustitución, preferiblemente con alanina, un residuo estéricamente
y/o electrostáticamente similar. Es posible, por supuesto,
delecionar o insertar o sustituir al menos un aminoácido en dicha
otra región biológicamente activa. No obstante, es también posible
proporcionar una combinación de al menos dos de estas modificaciones
o las tres. Sustituyendo un aminoácido determinado con alanina o un
residuo estéricamente y/o electrostáticamente similar
-"similar" significa similar al aminoácido que se sustituye- la
proteína modificada no se modificará o lo hará sólo
estéricamente/electrostáticamente en menor medida. Esto es
particularmente ventajoso, ya que otras actividades de la proteína
modificada, en particular la afinidad a la región de unión a GAG, no
cambian.
De forma ventajosa, dicha proteína es
IL-8 y dicha otra actividad biológica es la
activación de leucocitos. Como se ha mencionado antes, las
quimioquinas están involucradas en la atracción de leucocitos
durante la inflamación crónica y aguda. Por lo tanto, al inhibir o
regular negativamente la activación de leucocitos, disminuye o se
inhibe la inflamación que hace de esta proteína modificada
particular, una herramienta importante para estudiar, diagnosticar
y tratar enfermedades inflamatorias.
De acuerdo con un aspecto ventajoso, dicha
proteína es IL-8 y dicha otra región biológicamente
activa está localizada dentro de los primeros 10 aminoácidos de
N-terminal. Los primeros aminoácidos en
N-terminal están involucrados en la activación de
leucocitos, mientras que en particular Glu-4,
Leu-5 y Arg-6 se identifican como
esenciales para la unión y activación del receptor. Por lo tanto,
estos tres o incluso todos los primeros 10 aminoácidos de
N-terminal pueden sustituirse o delecionarse para
inhibir o regular negativamente la unión y activación del
receptor.
Otra proteína ventajosa es un mutante de
IL-8 con los primeros 6 aminoácidos de
N-terminal del mutante de IL-8 de
la presente invención delecionados. Como se ha dicho antes, este
mutante no se unirá ni activará o lo hará en menor medida a
leucocitos, por lo que es particularmente adecuado para estudiar,
diagnosticar y tratar enfermedades inflamatorias.
Preferiblemente, dicha proteína es un mutante de
IL-8 seleccionado de entre el grupo que consiste
en
del6F17RE70KN71R, del6F17RE70RN71K y del6E70KN71K. Estos mutantes han demostrado ser particularmente ventajosos, ya que la deleción de los primeros 6 aminoácidos de N-terminal inhibe o regula negativamente la unión y activación del receptor. Además, se sabe que las dos fenilalaninas en la posición 17 y 21 hacen el primer contacto con el receptor en su dominio N-terminal extracelular para facilitar la posterior activación del receptor. Para poder prevenir cualquier contacto con neutrófilos, estos dos aminoácidos 17 y 21 se intercambian, por lo que se intercambian por aminoácidos básicos, ya que están muy cercanos al motivo de unión a GAG de la hélice \alpha de C-terminal como puede verse en el modelo tridimensional de la proteína. Al intercambiar la posición 17 y/o 21 con una arginina o lisina, la afinidad de unión a GAG aumenta.
del6F17RE70KN71R, del6F17RE70RN71K y del6E70KN71K. Estos mutantes han demostrado ser particularmente ventajosos, ya que la deleción de los primeros 6 aminoácidos de N-terminal inhibe o regula negativamente la unión y activación del receptor. Además, se sabe que las dos fenilalaninas en la posición 17 y 21 hacen el primer contacto con el receptor en su dominio N-terminal extracelular para facilitar la posterior activación del receptor. Para poder prevenir cualquier contacto con neutrófilos, estos dos aminoácidos 17 y 21 se intercambian, por lo que se intercambian por aminoácidos básicos, ya que están muy cercanos al motivo de unión a GAG de la hélice \alpha de C-terminal como puede verse en el modelo tridimensional de la proteína. Al intercambiar la posición 17 y/o 21 con una arginina o lisina, la afinidad de unión a GAG aumenta.
Otro aspecto de la presente invención es una
molécula de ácido polinucleico aislada que codifica la proteína de
la invención como se ha descrito antes. El ácido polinucleico puede
ser DNA o RNA. Por lo tanto las modificaciones que conducen a la
proteína modificada de la invención, se llevan a cabo a nivel de DNA
o RNA. Esta molécula de ácido polinucleico aislada de la invención
es adecuada para los métodos de diagnóstico así como para la
terapia génica y la producción de proteína modificada de la
invención a gran escala.
Dependiendo de las condiciones de hibridación,
se forman dúplex complementarios entre las dos moléculas de DNA o
RNA, tanto por emparejamiento perfecto o también mediante bases
desemparejadas (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A
laboratory manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). Las
sondas mayores de 50 nucleótidos de longitud, pueden acumular hasta
un 25 o 30% de bases desemparejadas. Las sondas más pequeñas
acumulan menos desemparejamientos. La tendencia de una diana y una
sonda para formar dúplex que contienen pares de base desemparejadas
está controlada por la astringencia de las condiciones de
hibridación que en sí es una función de factores, como la
concentración de sal o formamida en el tampón de hibridación, la
temperatura de hibridación y las condiciones de lavado tras la
hibridación. Al aplicar los principios bien conocidos que suceden en
la formación de dúplex híbridos, pueden lograrse, por un experto en
la materia, las condiciones de astringencia deseada, al seleccionar
entre una serie de tampones de hibridación, temperaturas y
condiciones de lavado. Así, las condiciones pueden seleccionarse de
forma que permitan la detección de dúplex híbridos perfectamente
emparejados o parcialmente desemparejados. La temperatura de fusión
(Tm) de un dúplex es útil para seleccionar condiciones de
hibridación apropiadas. Las condiciones de hibridación astringentes
para las moléculas de polinucleótidos superiores a 200 nucleótidos
de longitud normalmente implica hibridar a una temperatura
15-25ºC por debajo de la temperatura de fusión del
dúplex esperado. Para las sondas de oligonucleótido de más de 30
nucleótidos que forman dúplex menos estables que las sondas más
largas, se logra una hibridación astringente al hibridar entre 5 y
10ºC por debajo de la Tm. La Tm de un dúplex de ácido nucleico puede
calcularse utilizando una fórmula basada en el porcentaje de G+C
contenido en los ácidos nucleicos y que tiene en cuenta las
longitudes de las cadenas, como la fórmula Tm =
81,5-16,6 (log [Na^{+})]) + 0,41 (% G+C) -(600/N),
en la que N = longitud de cadena.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un vector que comprende una molécula de DNA aislada de acuerdo
con la presente invención como se ha definido anteriormente. El
vector comprende todos los elementos regulatorios necesarios para
la transfección eficiente así como la expresión eficiente de
proteínas. Dichos vectores son bien conocidos en la técnica y
cualquier vector adecuado puede seleccionarse con este
propósito.
Otro aspecto de la presente solicitud se refiere
a una célula recombinante que está transfectada de forma estable
con un vector de la invención como se ha descrito anteriormente.
Dicha célula recombinante así como cualquier célula que descienda
de ella comprende el vector. Así, se proporciona una línea celular
que expresa la proteína modificada de forma continua o tras la
activación dependiendo del vector.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una composición farmacéutica que comprende una proteína, un ácido
polinucleico o un vector de acuerdo con la presente invención como
se ha definido antes y un transportador farmacéuticamente
aceptable. Por supuesto, la composición farmacéutica puede
comprender sustancias adicionales que están normalmente presentes
en las composiciones farmacéuticas, como sales, tampones,
emulsificantes, colorantes, etc.
\newpage
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de la proteína modificada, un ácido polinucleico o un vector
de acuerdo con la presente invención como se ha definido antes en un
método para inhibir o suprimir la actividad biológica de la
correspondiente proteína salvaje. Como se ha mencionado antes, la
proteína modificada actuará como un antagonista en el que los
efectos secundarios que aparecen con las proteínas recombinantes
conocidas no aparecerán con la proteína modificada de la invención.
En el caso de las quimioquinas esta será en particular la actividad
biológica involucrada en las reacciones inflamatorias.
Por lo tanto, otro uso de la proteína
modificada, ácido polinucleico o vector de acuerdo con la presente
invención es un método para producir un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad inflamatoria. En particular, si la
proteína modificada es una quimioquina, actuará como antagonista sin
efectos secundarios y será particularmente adecuada para el
tratamiento de una enfermedad inflamatoria. Por lo tanto, otro
aspecto de la presente solicitud es también un método para el
tratamiento de una enfermedad inflamatoria, en la que una proteína
modificada de acuerdo con la presente invención, la molécula de
ácido polinucleico aislada o vector de acuerdo con la presente
invención o una farmacéutica composición de acuerdo con la presente
invención se administra a un paciente.
Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria se
selecciona de un grupo que comprende artritis reumatoide, psoriasis,
osteoartritis, asma, enfermedad de Alzheimer, y esclerosis
múltiple. Ya que la activación a través de quimioquinas puede
inhibirse con una proteína modificada de acuerdo con la presente
invención, las reacciones inflamatorias pueden inhibirse o
regularse negativamente por lo que las condiciones inflamatorias
anteriormente mencionadas pueden prevenirse o tratarse.
La presente invención se describe en más detalle
con la ayuda de los siguientes ejemplos y figuras a los que, no
obstante, no se limita la invención, en la que la Fig. 1 es un
espectro del DC; la Fig. 2 muestra el contenido de la estructura
secundaria de varios mutantes; las Fig. 3 y 4 muestran las gráficas
de resultados de los ensayos de anisotropía de fluorescencia de
varios mutantes; la Fig. 5 muestra la gráfica de los resultados de
las titulaciones de la fluorescencia isotérmica; la Fig. 6 muestra
la gráfica de los resultados de los experimentos de desplegamiento
de varios mutantes, la Fig. 7 muestra el índice de quimiotaxis de
los mutantes de IL-8, y la Fig. 8 muestra los
resultados del ensayo de quimiotaxis de RANTES.
Se utilizó la técnica de la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) para generar los cDNA deseados para los
mutantes introduciendo las mutaciones utilizando cebadores sentido y
antisentido para mutagénesis. Un plásmido sintético que contiene el
cDNA de la IL-8 salvaje se utilizó como molde, se
añadió mezcla con polimerasa de DNA Clontech Advantage®2 Polymerase
Mix y se realizó la reacción de PCR utilizando un Mastergradient
Cycler de Eppendorf. Los cebadores de mutagénesis utilizados se
resumen en la tabla a continuación, que se inicia con las
secuencias directas (de 5' a 3'):
\bullet CACC ATG TGT CAG TGT ATA AAG ACA TAC
TCC (cebador para la mutación \Delta6)
\bullet CACC ATG TGT CAG TGT ATA AAG ACA TAC
TCC AAA CCT AGG CAC CCC AAA AGG ATA (cebador
{}\hskip0.7cm para la mutación \Delta6 F17R F21R)
{}\hskip0.7cm para la mutación \Delta6 F17R F21R)
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias reversas son (de 5' a 3'):
\bullet TTA TGA ATT CCT AGC CCT CTT (cebador
para la mutación E70R)
\bullet TTA TGA ATT CTT AGC CCT CTT (cebador
para la mutación E70K)
\bullet TTA TGA CTT CTC AGC CCT CTT (cebador
para la mutación N71K)
\bullet TTA TGA CTT CTT AGC CCT CTT (cebador
para la mutación E70K N71K)
\bullet TTA TGA CTT CCT AGC CCT CTT (cebador
para la mutación E70R N71K)
\bullet TTA TGA CCT CTT AGC CCT CTT (cebador
para la mutación E70K N71R)
\bullet TTA TGA CCT CCT AGC CCT CTT (cebador
para la mutación E70R N71R)
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de PCR se purificaron, se clonaron
en el vector pCR.T7/NT-TOPO.TA (Invitrogen) y se
transformaron en competentes de E. coli TOP10F (Invitrogen).
En el siguiente paso se llevó a cabo una confirmación de la
secuencia mediante la secuenciación del DNA de doble cadena
utilizando un secuenciador ABI PRISM CE1.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez confirmadas las secuencias, las
construcciones se transformaron en competentes por calcio de E.
coli BL21(DE3) para su expresión. Las células se
cultivaron en agitación en 1 L de medio Lennox Broth (Sigma) que
contiene 100 mg/ml de ampicilina a 37ºC hasta que se alcanzó una
DO600 de alrededor de 0,8. La inducción de expresión proteica se
consiguió mediante la adición de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) hasta una concentración final de 1 mM. Cuatro horas después,
las células se recogieron mediante centrifugación a 6000 g durante
20 minutos. El botón celular se resuspendió entonces en un tampón
que contenía TRIS/HCl 20 mM, NaCl 50 mM, pH 8, se sonicó a 100
vatios durante 5 x 20 s y finalmente se centrifugó de nuevo durante
20 min a 10.000 g. Ya que la fracción principal de proteínas
IL-8 recombinantes se encontró en cuerpos de
inclusión, se eligieron condiciones desnaturalizantes para la
posterior purificación. El botón celular se resuspendió en un
tampón de Gua/HCl 6 M y MES 50 mM, pH 6,5. La suspensión se agitó
entonces a 4ºC durante 4 horas, seguido de un paso de diálisis
contra MES 50 mM, pH 6,5. La suspensión resultante se centrifugó
entonces y se filtró para cargarse en una columna de intercambio de
cationes fuertes (SP Sepharose® de Pharmacia Biotech). La elución
se consiguió mediante un gradiente lineal de NaCl de 0 M a 1 M en un
tampón MES 50 mM, pH 6,5 a lo largo de 60 minutos. Tras la
liofilización de las fracciones que contienen la proteína deseada,
se realizó un segundo paso de purificación mediante HPLC de fase
reversa utilizando una columna C18. En este caso se escogió un
gradiente no lineal de acetonitrilo del 10% al 90% para eluir la
proteína deseada. El plegamiento de la proteína desnaturalizada se
consiguió finalmente mediante la misma columna de intercambio de
cationes y bajo las mismas condiciones descritas anteriormente.
Entonces se comprobó la pureza e identidad de la
proteína mediante un análisis de tinción de plata en el primer caso
y análisis de Western Blot, utilizando un anticuerpo monoclonal
específico contra la IL-8 salvaje, en el segundo.
El plegamiento de las proteínas también se confirmó mediante medidas
de dicroismo circular (DC).
\vskip1.000000\baselineskip
Para investigar los cambios de estructura
secundaria de la proteína mutante en presencia y ausencia de heparán
sulfato (HS), se realizó una espectroscopía de DC. Las medidas se
registraron en un espectropolarímetro Jasco J-710 a
lo largo del rango de 195 a 250 nm, y se utilizó una célula de 0,1
cm de longitud de paso. El espectro de las soluciones de proteína
con una concentración de 5 mM se registraron con un tiempo de
respuesta de 1 s, resolución de paso de 0,2 nm, velocidad de 50
nm/min, ancho de banda de 1 nm y una sensibilidad de 20 mdeg. Se
promediaron tres escaneos para conseguir un espectro más uniforme.
Se corrigió el ruido de fondo de los espectros de las proteínas
relacionado con la señal de DC del propio tampón o del tampón/HS. El
análisis de la estructura secundaria de la proteína en presencia y
ausencia de HS se realizó finalmente utilizando el programa
SELCON.
Como se cambiaron una gran número de aminoácidos
en una serie de nuevas combinaciones, se intento averiguar la
dimensión de los cambios en las estructura secundaria resultante
mediante métodos de dicroismo circular.
Se obtuvieron diferentes estructuras dependiendo
de las mutaciones introducidas. Excepto por un mutante expresado
(\Delta6 F17R F21R E70K N71R) que no mostró ninguna estructura,
todos los mutantes mostraron hélices \alpha, láminas \beta y
bucles medibles. Comparado con la IL-8 salvaje sólo
un mutante (\Delta6 E70R) mostró una estructura bastante similar
mientras el resto diferían principalmente en su hélice \alpha que
oscila entre el 17,2% al 45,2% del total de la estructura. Sin
embargo, este hecho sugiere que la estructura global de la
IL-8 salvaje se mantenía a pesar de los muchos
cambios de la secuencia proteica. Esto no podría haberse previsto
con anterioridad. Al conocer ya que sólo los oligosacáridos de
heparán sulfato, y no de heparina, son capaces de afectar la
estructura secundaria de la IL-8 salvaje, se centró
la atención en los efectos inducidos mediante el heparán sulfato no
fraccionado. Todos los mutantes examinados mostraron cambios
estructurales tras la unión de HS que pueden interpretarse como una
evidencia de formación de comple-
jos.
jos.
Para demostrar los cambios estructurales tras
las mutaciones introducidas y la adición de heparán sulfato, se
resumen algunos de los datos obtenidos en las gráficas anteriores y
a continuación.
Para estudiar la concentración y los cambios en
la estructura cuaternaria dependiente de ligando se realizó una
espectroscopía de fluorescencia. Debido a su elevada sensibilidad,
que requiere sólo cantidades en nanógramos de proteína, la técnica
fluorescente fue el método elegido para realizar las investigaciones
deseadas. Las medidas se llevaron a cabo utilizando un fluorímetro
LS50B de Perkin-Elmer (Beaconsfield, England).
Registrando la anisotropía de fluorescencia
dependiente de concentración de la quimioquina resultante del
cromóforo extrínseco bisANS se pretende encontrar la constante de
dimerización de los mutantes. Las medidas se realizaron en PBS,
empezando con concentraciones elevadas (de hasta 4 mM de proteína)
seguido de una dilución paso a paso. Para cada punto de lectura, se
registró la señal de anisotropía (r) a 507 nm promediada a lo largo
de 60 s.
Se ha descrito que la oligomerización de
IL-8 tiene una influencia relevante sobre las
propiedades de unión de las proteínas a GAG. A una concentración
monomérica, IL-8 se une a oligosacáridos de un
tamaño definido 1000 veces más fuerte que a una concentración
dimérica. Por lo tanto, las propiedades de oligomerización de los
mutantes de IL-8 se investigaron mediante
anisotropía de fluorescencia. Como el fluoróforo intrínseco de
IL-8 (Trp57) no era suficientemente sensible para
todos los mutantes, se utilizó el fluoróforo extrínseco
bis-ANS para estas medidas. De nuevo, como ya se
había detectado para la estructura secundaria, el mutante \Delta6
E70R también mostró un gran parecido de la constante de
oligomerización (k_{oligo} = 350 nM) con la de la
IL-8 salvaje (k_{oligo} = 379 nM). El mutante con
la mayor k_{oligo} (k_{oligo} = 460 nM), que por lo tanto es el
que peor dimeriza fue \Delta6 F17R F21R E70R N71K. Estudios
previos identificaron que las láminas \beta están principalmente
involucradas en el proceso de dimerización, un hecho que se
correlaciona con los resultados de estructura secundaria de estos
mutantes, que mostró un parecido muy bajo en las láminas \beta de
sólo un 11,4%. El mutante con la menor k_{oligo} (k_{oligo} =
147 nM), se detctó que es \Delta6 F17R F21R E70K, que de nuevo
mostró el mayor parecido en la estructura de láminas \beta (29,8%)
de todos los mutantes investigados. También se observó el impacto
de la adición del heparán sulfato. Como en el caso de la
IL-8 salvaje, en la que el heparán sulfato causó un
cambio en la constante de oligomerización a niveles mucho más
elevados (k_{oligo} = 1.075 mM), se detectó también en los
mutantes de IL-8 investigados, donde \Delta6 F17R
F21R E70K cambió de 0,147 mM a 1.162 mM, y el mutante \Delta6 E70R
de 0,350 mM a 1.505 mM en presencia de heparán sulfato. Algunos de
los resultados obtenidos se muestran en las Fig. 3 y 4, en las que
la Fig. 3 muestra la dependencia de la anisotropía de fluorescencia
de los mutantes de IL-8 en PBS de la concentración
de quimioquina y la Fig. 4 muestra la dependencia de la anisotropía
de fluorescencia de \Delta6 F17R F21R E70K en PBS de la
concentración de quimioquina en presencia (exceso de diez veces) y
ausencia de HS (concentración de proteína (Cp = exceso 10 xy).
\vskip1.000000\baselineskip
Las constantes de disociación (valores de Kd)
son una medida de la afinidad de unión de un ligando a una proteína
y por lo tanto el cambio dependiente de la concentración en las
propiedades de emisión de fluorescencia de la proteína (bloqueo de
la fluorescencia) tras la unión del ligando se utilizó para la
determinación de la Kd. Como estos mutantes contienen un cromóforo
de triptófano intrínseco que está situado cercano o en el sitio de
unión a GAG propuesto y por lo tanto podría ser sensible a cambios
estructurales tras la unión del ligando, los experimentos de TFI
parecen adecuados para este tipo de investigación. La titulación de
la intensidad de fluorescencia se realizó en PBS utilizando una
concentración de proteína de 700 nM. La emisión de la solución de
proteína tras una excitación a 282 nm se registró a lo largo de un
rango de 300-400 nm tras la adición de una alícuota
del respectivo ligando GAG y un periodo de equilibrado de 60 s.
Se investigó la unión a heparina no fraccionada
y a heparán sulfato. Los mutantes se situaron a una concentración
dimérica para asegurar una sensibilidad suficiente. Un bloqueo de la
intensidad de fluorescencia del Trp57 tras la unión de GAG se
registró en un rango del 25-35%. Se observó una
mejora significativa de la unión del ligando, especialmente para la
unión de heparina. \Delta6 F17R N71R E70K (Kd = 14 nM) y \Delta6
F17R F21R N71K (Kd = 14,6 nM) mostraron una unión 2600 veces mayor,
y \Delta6 E70K N71K (Kd = 74 nM) una unión 1760 veces mayor
comparado con la IL-8 salvaje (Kd = 37 mM). También
se obtuvieron buenos resultados de unión de heparán sulfato. Para
\Delta6 F17R N71R E70K se encontró una Kd de 107 nM, para
\Delta6 F17RF 21R N71K la Kd fue de 95 nM y el mutante \Delta6
E70K N71K mostró una Kd de 34 nM. Como la IL-8
salvaje se une con una Kd de 4,2 mM, las Kd encontradas en los
mutantes representan una extraordinaria mejora de la unión, véase la
Fig.5.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener información de la estabilidad de
las proteínas y si esta estabilidad podría cambiarse tras la unión
del ligando GAG, se realizaron experimentos de desplegamiento. Como
se ha mencionado anteriormente las técnicas de fluorescencia son
muy sensibles para observar cambios en la estructura cuaternaria y
por lo tanto también son el método de elección para investigar los
cambios estructurales térmicos de la proteína. Las medidas se
realizaron como se describe para la TFI, pero en lugar de cambiar la
concentración de ligando, se cambia la temperatura. La estructura
de la proteína se observó a una concentración de 0,7 mM a
temperaturas de entre 15 y 85ºC en ausencia y presencia de un
exceso de 10 veces de heparán sulfato o heparina.
El máximo de emisión de las proteínas osciló
entre 340 nm y 357 nm, los valores típicos de un residuo de
triptófano expuesto a solvente. Empezando con los experimentos de
desplegamiento a 15ºC, el máximo de emisión de los mutantes varió
entre 340 nm y 351 nm. Comparado con la IL-8
salvaje, cuyo máximo de emisión se observó a 340 nm, es decir
valores ligeramente mayores. Tras el aumento de la temperatura, la
intensidad del máximo de emisión disminuyó, acompañada de una
modificación en el máximo a una longitud de onda mayor o menor. El
máximo de emisión de \Delta6 E70R y \Delta6 E70K N71K cambió de
352,5 nm a 357 nm y de 343 nm a 345 nm, que es típico de una mayor
exposición del residuo Trp57 al solvente a medida que la temperatura
aumenta, pero de forma interesante los mutantes \Delta6 F17R N71R
E70K y \Delta6 F17R F21R E70R N71K mostraron un viraje azul,
oscilando de 350 nm a 343 nm y, de forma menos pronunciada, de 350
nm a 348 nm (véase la Fig.6). Al reducir lentamente la temperatura,
el proceso de desplegamiento es parcialmente reversible en relación
al cambio de longitud de onda y a los cambios en la intensidad. La
adición de un exceso de 5 veces de heparán sulfato dio lugar a un
aumento de la estabilidad de las proteínas, probablemente a través
de la formación de complejos. Esto podría observarse por un lado
mediante un cambio de la temperatura de fusión a una temperatura
mayor, y por otro lado mediante un cambio del máximo de emisión
significativamente menos pronunciado tras el aumento de la
temperatura.
\vskip1.000000\baselineskip
Para caracterizar la función anómala del
receptor de los mutantes de IL-8 con respecto a la
atracción de neutrófilos, se analizó la quimiotaxis a través de un
filtro d los neutrófilos en respuesta a los mutantes de
IL-8 en una cámara de microquimiotaxis equipada con
una membrana de policarbonato sin PVP de 5 mm.
Brevemente, se obtuvo una fracción de
neutrófilos a partir de sangre humana recién recogida. Esto se
consiguió añadiendo una solución de dextrano al 6% a sangre tratada
con heparina (1:2) que luego se dejó sedimentar durante 45 min. Se
recogió la solución clara superior que contiene las células y se
lavó dos veces con HBSS sin Ca y Mg. Las células se contaron y
finalmente se diluyeron con HBSS a 2 Mio/ml de suspensión celular,
teniendo en cuenta que sólo el 60% de las células contadas son
neutrófilos.
Los mutantes de IL-8 se
diluyeron a concentraciones de 10 mg/ml, 1 mg/ml y 0,1 mg/ml y se
situaron en triplicados en el compartimento inferior de la cámara
(26 ml por pocillo). Los neutrófilos recién preparados se sembraron
en la cámara superior (50 ml por pocillo) y se incubaron durante 30
minutos a 37ºC en un incubador humidificado con CO_{2} al 5%.
Tras la incubación, la cámara se desensambló, el lado superior del
filtró se lavó y rascó y las células unidas a la cara inferior se
fijaron con metanol y se tiñeron con soluciones Hemacolor (Merck).
Las células se contaron entonces a 400 aumentos en 4 campos
microscópicos seleccionados al azar por pocillo. Finalmente, se
representó la media de los tres experimentos independientes frente a
la concentración de quimioquina. En la Figura 7, se muestra el
índice de quimiotaxis de varios mutantes de IL-8.
Como era esperable, todos los mutantes mostraron una actividad de
unión al receptor significativamente reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
El concepto de mutantes de quimioquina "que
enmascaran los GAG" dominante negativo también se utilizó con
RANTES, una quimioquina involucrada en las reacciones de
hipersensibilidad de tipo IV como el rechazo de transplantes,
dermatitis atópica así como otros trastornos inflamatorios como la
artritis, la glomerulonefritis progresiva y la enfermedad
inflamatoria pulmonar.
La capacidad de unión al receptor se vio
afectada al introducir en la proteína salvaje un residuo de
iniciación metionina. La expresión del RANTES salvaje en E.
Coli dio lugar a la retención de este residuo de metionina, lo
que convierte el RANTES salvaje en un potente inhibidor de la
migración de monocitos, el denominado Met-RANTES.
Se introdujeron diferentes mutaciones que potencian la afinidad de
unión de GAG mediante métodos de mutagénesis dirigida por basados
en PCR.
Mediante estos métodos se han clonado, expresado
y purificado 9 mutantes RANTES hasta el momento,
Met-RANTES A22K, Met-RANTES H23K,
Met-RANTES T43K, Met-RANTES N46R,
Met-RANTES N46K, Met-RANTES Q48K,
Met-RANTES A22K/N46R, Met-RANTES
V49R/E66S y Met-RANTES 15LSLA18 V49R/E66S.
Se realizaron experimentos de titulación de la
fluorescencia isotérmica para medir las constantes de afinidad
relativas (valores de K_{d}) de los mutantes RANTES para una
heparina de tamaño definido. Como puede observarse en la tabla,
todas las proteínas mutantes RANTES mostraron una mayor afinidad por
esta heparina, mostrando Met-RANTES A22K,
Met-RANTES H23K, Met-RANTES T43K y
Met-RANTES A22K/N46R los resultados más
prometedores.
\newpage
- \quad
- Kd en nM
- Rantes salvaje
- 456,2 \pm 8,5
- Met-Rantes V49R/E66S
- 345,5 \pm 21,7
- Rantes 15LSLA18 V49R/66S
- 297,3 \pm 14,1
- Rantes N46R
- 367,7 \pm 11,7
- Rantes N46K
- 257,4 \pm 10,2
- Rantes H23K
- 202,5 \pm 12,8
- Rantes Q48K
- 383,4 \pm 39,6
- Rantes T43K
- 139,2 \pm 30,1
- Rantes A22K
- 202,1 \pm 9,8
- Rantes A22K/N46R
- 164,0 \pm 16,6
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la migración celular dirigida por
RANTES mutante utilizando el sistema de cámara Boyden de 48 pocillos
equipado con membranas de policarbonato recubierto de PVP de 5
\mum. Se colocaron en los pocillos inferiores de la cámara por
triplicado las diluciones de RANTES y mutante de RANTES en RPMI 1640
que contenía HEPES 20 mM pH 7,3 y BSA 1 mg/ml. Se colocaron en los
pocillos superiores 50 \mul de suspensiones celulares de
THP-1 (línea celular promonocítica de los cultivos
celulares de la colección Europea) en el mismo medio a 2 x 10^{6}
células/ ml. Tras un periodo de incubación de 2 h a 37ºC en CO_{2}
al 5% se lavó la superficie superior del filtro en solución de
HBSS. Las células migradas se fijaron en metanol y se tiñeron con
solución de Hemacolor (Merck). Se contaron cinco magnificaciones a
400 x por pocillo y la media de tres experimentos independientes se
representó frente a la concentración de quimioquina en la Figura 8.
Las barras de error representa el error estándar de la media de los
tres experimentos. De nuevo, como en el caso de los mutantes de
IL-8, todos los mutantes de RANTES mostraron una
actividad de unión al receptor significativamente reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
Se caracterizaron las proteínas de unión a GAG
por medios bioinformáticos y proteómicos junto con su región de
unión a GAG. En las siguientes tablas 2 y 3, se muestran las
quimioquinas con su región de unión a GAG (tabla 2) y ejemplos de
otras proteínas se dan también con su región de unión a GAG (tabla
3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Factor de biogénesis del peroxisoma 1
- 181 TRRAKE 186
- 367 QKKIRS 372
- 1263 PKRRKN 1268
- 181 TRRAKE 186
- 367 QKKIRS 372
- 1263 PKRRKN 1268
MLTK-beta
- 415 SKRRGKKV 422
- 312 ERRLKM 317
- 416 KRRGKK 421
- 312 ERRLKM 317
- 416 KRRGKK 421
Factor BHLH Hes4
- 43 EKRRRARI 50
- 43 EKRRRA 48
- 43 EKRRRA 48
Protocadherina 11
- 867 MKKKKKKK 874
- 867 MKKKKK 872
- 867 MKKKKK 872
- 899 MKKKKKKK 906
- 899 MKKKKK 904
- 899 MKKKKK 904
catenina (proteína asociada a cadherina), delta
1
- 315 RRRLRS 320
- 404 VRKLKG 409
- 460 LRKARD 465
- 545 RRKLRE 550
- 621 AKKGKG 626
- 787 AKKLRE 792
- 315 RRRLRS 320
- 404 VRKLKG 409
- 460 LRKARD 465
- 545 RRKLRE 550
- 621 AKKGKG 626
- 787 AKKLRE 792
Receptor muscarínica de acetilcolina M5
- 221 EKRTKD 226
- 427 TKRKRV 432
- 514 WKKKKV 519
- 221 EKRTKD 226
- 427 TKRKRV 432
- 514 WKKKKV 519
Receptor adrenérgico alfa-2A
- 147 PRRIKA 152
- 224 KRRTRV 229
- 147 PRRIKA 152
- 224 KRRTRV 229
proteína de unión a la región REII del promotor
de IL-5
- 440 TKKKTRRR 447
- 569 GKRRRRRG 576
- 38 ARKGKR 43
- 437 GKKTKK 442
- 444 TRRRRA 449
- 569 GKRRRR 574
- 38 ARKGKR 43
- 437 GKKTKK 442
- 444 TRRRRA 449
- 569 GKRRRR 574
Mitofusina 1
- 291 ARKQKA 296
- 395 KKKIKE 400
- 291 ARKQKA 296
- 395 KKKIKE 400
Proteína N-cym
- 71 VRRCKI 76
- 71 VRRCKI 76
Factor regulador de la ubiqüitinación Smad 1
- 672 ERRARL 677
- 672 ERRARL 677
Factor similar a CUG-BP y
ETR-3 5
- 468 MKRLKV 473
- 475 LKRPKD 480
- 468 MKRLKV 473
- 475 LKRPKD 480
EWS-Fli1 del sarcoma de
Ewings
- 347 QRKSKP 352
- 347 QRKSKP 352
NUF2R
- 455 LKRKMFKM 462
- 331 LKKLKT 336
- 347 VKKEKL 352
- 331 LKKLKT 336
- 347 VKKEKL 352
proteína en dedos de zinc similar a Kruppel
GLIS2
- 22 EKRERT 27
- 22 EKRERT 27
FKSG32
- 15 LKRVRE 20
- 431 VRRGRI 436
- 15 LKRVRE 20
- 431 VRRGRI 436
Proteína similar a BARH 1
- 175 LKKPRK 180
- 228 NRRTKW 233
- 175 LKKPRK 180
- 228 NRRTKW 233
Proteína de unión a GTP nucleolar 1
- 393 SRKKRERD 400
- 624 GKRKAGKK 631
- 48 MRKVKF 53
- 141 IKRQKQ 146
- 383 ARRKRM 388
- 393 SRKKRE 398
- 490 KKKLKI 495
- 543 ARRSRS 548
- 550 TRKRKR 555
- 586 VKKAKT 591
- 629 GKKDRR 634
- 48 MRKVKF 53
- 141 IKRQKQ 146
- 383 ARRKRM 388
- 393 SRKKRE 398
- 490 KKKLKI 495
- 543 ARRSRS 548
- 550 TRKRKR 555
- 586 VKKAKT 591
- 629 GKKDRR 634
\newpage
EVG1
- 17 RRRPKT 22
- 138 ERKRKA 143
- 17 RRRPKT 22
- 138 ERKRKA 143
ASPL
- 282 PKKSKS 287
- 282 PKKSKS 287
Transportador de Zinc 1
- 477 EKKPRR 482
- 477 EKKPRR 482
Autoantígeno uveal
- 603 EKKGRK 608
- 995 ERKFKA 1000
- 1023 VKKNKQ 1028
- 603 EKKGRK 608
- 995 ERKFKA 1000
- 1023 VKKNKQ 1028
RAB39
- 7 VRRDRV 12
- 7 VRRDRV 12
Molécula de adhesión celular del síndrome de
Down
- 320 PRKVKS 325
- 387 VRKDKL 392
- 320 PRKVKS 325
- 387 VRKDKL 392
Fosfatasa de
proteínas-tirosinas, no receptor tipo 12
- 139 GRKKCERY 146
- 59 VKKNRY 64
- 59 VKKNRY 64
Proteína con repetición WD 11
- 752 VRKIRF 757
- 752 VRKIRF 757
Proteína relacionada con el cáncer gástrico
VRG107
- 20 SRKRQTRR 27
- 25 TRRRRN 30
- 25 TRRRRN 30
Proteína de respuesta a crecimiento temprano
4
- 356 ARRKGRRG 363
- 452 EKKRHSKV 459
- 357 RRKGRR 362
- 357 RRKGRR 362
Proteína relacionada con el transporte de
vesículas
- 309 PKRKNKKS 316
- 226 DKKLRE 231
- 310 KRKNKK 315
- 355 VKRLKS 360
- 226 DKKLRE 231
- 310 KRKNKK 315
- 355 VKRLKS 360
UPF3X
- 140 AKKKTKKR 147
- 141 KKKTKK 146
- 217 ERRRRE 222
- 225 RKRQRE 230
- 233 RRKWKE 238
- 240 EKRKRK 245
- 296 DKREKA 301
- 373 RRRQKE 378
- 393 MKKEKD 398
- 426 VKRDRI 431
- 140 AKKKTKKRD 148
- 141 KKKTKK 146
- 217 ERRRRE 222
- 225 RKRQRE 230
- 233 RRKWKE 238
- 240 EKRKRK 245
- 296 DKREKA 301
- 373 RRRQKE 378
- 393 MKKEKD 398
- 426 VKRDRI 431
Proteína CGI-201, tipo IV
- 49 ARRTRS 54
- 49 ARRTRS 54
Proteína en dedo RING 23
- 98 KRKIRD 103
- 98 KRKIRD 103
FKSG17
- 72 EKKARK 77
- 95 IRKSKN 100
- 72 EKKARK 77
- 95 IRKSKN 100
P83
- 681 ARKERE 686
- 681 ARKERE 686
Proteína relacionada con el cáncer de ovario
1
- 62 LKRDRF 67
- 62 LKRDRF 67
Transactivator del MHC de clase II CIITA
- 407 HRRPRE 412
- 741 PRKKRP 746
- 783 DRKQKV 788
- 407 HRRPRE 412
- 741 PRKKRP 746
- 783 DRKQKV 788
Glucoproteína de las plaquetas
VI-2
- 275 SRRKRLRH 282
- 275 SRRKRL 280
- 275 SRRKRL 280
\global\parskip0.960000\baselineskip
Proteína similar a ubiqüitina 5
- 11 GKKVRV 16
- 11 GKKVRV 16
Quinasa de proteínas D2
- 191 ARKRRL 196
- 191 ARKRRL 196
Proteína de la Homeobox
GSH-2
- 202 GKRMRT 207
- 252 NRRVKH 257
- 202 GKRMRT 207
- 252 NRRVKH 257
Proteína ULBP3
- 166 ARRMKE 171
- 201 HRKKRL 206
- 166 ARRMKE 171
- 201 HRKKRL 206
deyodinasa de yodotironinas tipo II
- 87 SKKEKV 92
- 87 SKKEKV 92
- 299 SKRCKK 304
- 299 SKRCKK 304
Antígeno espermático
- 160 LKKYKE 165
- 478 IKRLKE 483
- 160 LKKYKEKRT 168
- 160 LKKYKE 165
- 478 IKRLKE 483
UDP-GaINAc:
N-acetilgalactosaminiltransferasa de
polipéptidos
- 4 ARKIRT 9
- 44 DRRVRS 49
- 138 PRKCRQ 143
- 4 ARKIRT 9
- 44 DRRVRS 49
- 138 PRKCRQ 143
\global\parskip1.000000\baselineskip
NCBE
- 62 HRRHRH 67
- 73 RKRDRE 78
- 1012 SKKKKL 1017
- 62 HRRHRH 67
- 73 RKRDRE 78
- 1012 SKKKKL 1017
Proteína con repeticiones WD
- 372 LKKKEERL 379
- 384 EKKQRR 389
- 400 AKKMRP 405
- 384 EKKQRR 389
- 400 AKKMRP 405
Fosfodiesterasa 11A
- 27 MRKGKQ 32
- 27 MRKGKQ 32
ATPase probable transportadora de cationes 2
- 891 ERRRRPRD 898
- 306 SRKWRP 311
- 891 ERRRRP 896
- 306 SRKWRP 311
- 891 ERRRRP 896
Factor de transcripción de la
HMG-box TCF-3
- 420 GKKKKRKR 427
- 399 ARKERQ 404
- 420 GKKKKR 425
- 420 GKKKKRKRE 428
- 399 ARKERQ 404
- 420 GKKKKR 425
HVPS11
- 793 VRRYRE 798
- 793 VRRYRE 798
\newpage
PIST
- 165 NKKEKM 170
- 165 NKKEKM 170
Proteína de unión a FYN
- 473 KKREKE 478
- 501 KKKFKL 506
- 682 LKKLKK 687
- 696 RKKFKY 701
- 473 KKREKE 478
- 501 KKKFKL 506
- 682 LKKLKK 687
- 696 RKKFKY 701
C1orf25
- 620 GKKQKT 625
- 620 GKKQKT 625
C1orf14
- 441 LRRRKGKR 448
- 70 LRRWRR 75
- 441 LRRRKG 446
- 70 LRRWRR 75
- 441 LRRRKG 446
Factor de transcripción T-box
TBX3
- 144 DKKAKY 149
- 309 GRREKR 314
- 144 DKKAKY 149
- 309 GRREKR 314
Proteína ribosomal mitocondrial 39S L47
- 121 AKRQRL 126
- 216 EKRARI 221
- 230 RKKAKI 235
- 121 AKRQRL 126
- 216 EKRARI 221
- 230 RKKAKI 235
\newpage
CGI-203
- 33 VRRIRD 38
- 33 VRRIRD 38
Jagged1
- 1093 LRKRRK 1098
- 1093 LRKRRK 1098
Proteína de la membrana asociada a transportador
secretor 1
- 102 DRRERE 107
- 102 DRRERE 107
Componente del complejo de proteínas que
interacciona con el receptor de la vitamina D DRIP205
- 673 KKKKSSRL 680
- 672 TKKKKS 677
- 954 QKRVKE 959
- 978 GKRSRT 983
- 995 PKRKKA 1000
- 1338 GKREKS 1343
- 1482 HKKHKK 1487
- 1489 KKKVKD 1494
- 672 TKKKKS 677
- 954 QKRVKE 959
- 978 GKRSRT 983
- 995 PKRKKA 1000
- 1338 GKREKS 1343
- 1482 HKKHKK 1487
- 1489 KKKVKD 1494
Proteína de la membrana asociada a trasportador
secretor 2
- 100 ERKERE 105
- 100 ERKERE 105
Receptor Nogo
- 420 SRKNRT 425
- 420 SRKNRT 425
\newpage
FLAMINGO 1
- 169 GRRKRN 174
- 2231 ARRQRR 2236
- 169 GRRKRN 174
- 2231 ARRQRR 2236
Receptor de quimioquina CC
- 58 CKRLKS 63
- 58 CKRLKS 63
Proteína de unión al elemento regulador de la
prolactina
- 271 HKRLRQ 276
- 271 HKRLRQ 276
Proteínas de unión a las secuencias señal de
recombinación Kappa B y V(D)J
- 17 PRKRLTKG 24
- 713 RKRRKEKS 720
- 903 PKKKRLRL 910
- 180 HKKERK 185
- 629 TKKTKK 634
- 712 LRKRRK 717
- 903 PKKKRL 908
- 1447 QKRVKE 1452
- 1680 SRKPRM 1685
- 180 HKKERK 185
- 629 TKKTKK 634
- 712 LRKRRK 717
- 903 PKKKRL 908
- 1447 QKRVKE 1452
- 1680 SRKPRM 1685
Supresor de la metástasis de cáncer de mama
1
- 200 SKRKKA 205
- 229 IKKARA 234
- 200 SKRKKA 205
- 229 IKKARA 234
Proteína Forkhead box P3
- 414 RKKRSQRP 421
- 413 FRKKRS 418
- 413 FRKKRS 418
Proteína de unión a FAS
- 228 LKRKLIRL 235
- 391 RKKRRARL 398
- 358 ARRLRE 363
- 390 ERKKRR 395
- 629 CKKSRK 634
- 358 ARRLRE 363
- 390 ERKKRR 395
- 629 CKKSRK 634
Hidrolasa carboxiterminal de la ubiqüitina
12
- 228 HKRMKV 233
- 244 LKRFKY 249
- 228 HKRMKV 233
- 244 LKRFKY 249
Proteína KIAA0472
- 110 HRKPKL 115
- 110 HRKPKL 115
PNAS-101
- 68 LKRSRP 73
- 106 PRKSRR 111
- 68 LKRSRP 73
- 106 PRKSRR 111
PNAS-26
- 118 DRRTRL 123
- 118 DRRTRL 123
Factor de transcripción de la mielina 2
- 176 GRRKSERQ 183
Cadena gamma de la ATPasa de transporte de
sodio/potasio
- 47 SRRFRC 52
- 55 NKKRRQ 60
- 47 SRRFRC 52
- 55 NKKRRQ 60
Proteína Mdm4
- 441 EKRPRD 446
- 464 ARRLKK 469
- 441 EKRPRD 446
- 464 ARRLKK 469
Proteína de la familia del antígeno G D 2
- 87 QKKIRI 92
- 87 QKKIRI 92
Proteína NipSnap2
- 153 FRKARS 158
- 153 FRKARS 158
Stannina
- 73 ERKAKL 78
- 73 ERKAKL 78
Cotransportador de bicarbonato sódico
- 973 EKKKKKKK 980
- 165 LRKHRH 170
- 666 LKKFKT 671
- 966 DKKKKE 971
- 973 EKKKKK 978
- 165 LRKHRH 170
- 666 LKKFKT 671
- 966 DKKKKE 971
- 973 EKKKKK 978
Miosina X
- 683 YKRYKV 688
- 828 EKKKRE 833
- 1653 LKRIRE 1658
- 1676 LKKTKC 1681
- 683 YKRYKV 688
- 828 EKKKRE 833
- 1653 LKRIRE 1658
- 1676 LKKTKC 1681
PNAS-20
- 21 RKRKSVRG 28
- 20 ERKRKS 25
- 20 ERKRKS 25
Pellino
- 36 RRKSRF 41
- 44 FKRPKA 49
- 36 RRKSRF 41
- 44 FKRPKA 49
Receptor de movilidad mediado por
hialuronano
- 66 ARKVKS 71
- 66 ARKVKS 71
canal potencial del receptor corto transitorio
7
- 753 FKKTRY 758
- 753 FKKTRY 758
Liprina alfa2
- 825 PKKKGIKS 832
- 575 IRRPRR 580
- 748 LRKHRR 753
- 839 GKKEKA 844
- 875 DRRLKK 880
- 575 IRRPRR 580
- 748 LRKHRR 753
- 839 GKKEKA 844
- 875 DRRLKK 880
Factor intermediario de la transcripción 1
alfa
- 904 DKRKCERL 911
- 1035 PRKKRLKS 1042
- 321 NKKGKA 326
- 1035 PRKKRL 1040
- 321 NKKGKA 326
- 1035 PRKKRL 1040
Proteína de la capa intermedia del cartílago
- 719 QRRNKR 724
- 719 QRRNKR 724
UBX dominio-que contiene
proteína 1
- 194 YRKIKL 199
- 194 YRKIKL 199
Lipoxigenasa de araquidonato 12, tipo 12R
- 166 VRRHRN 171
- 233 WKRLKD 238
- 166 VRRHRN 171
- 233 WKRLKD 238
Proteína de interacción con PBX
hematopoyético
- 159 LRRRRGRE 166
- 698 LKKRSGKK 705
- 159 LRRRRG 164
- 703 GKKDKH 708
- 159 LRRRRG 164
- 703 GKKDKH 708
NAG18
- 28 LKKKKK 33
- 28 LKKKKK 33
Proteína del dominio POU 5
- 222 ARKRKR 227
- 222 ARKRKR 227
Proteína NRCAM
- 2 PKKKRL 7
- 887 SKRNRR 892
- 1185 IRRNKG 1190
- 1273 GKKEKE 1278
- 2 PKKKRL 7
- 887 SKRNRR 892
- 1185 IRRNKG 1190
- 1273 GKKEKE 1278
Grupo gamma de protocadherina
- 11 TRRSRA 16
- 11 TRRSRA 16
Proteína SKD1
- 288 IRRRFEKR 295
- 251 ARRIKT 256
- 362 FKKVRG 367
- 251 ARRIKT 256
- 362 FKKVRG 367
Proteína anti-muerte
- 58 HRKRSRRV 65
- 59 RKRSRR 64
- 59 RKRSRR 64
Centrina 3
- 14 TKRKKRRE 21
- 14 TKRKKR 19
- 14 TKRKKR 19
Difosfohidrolasa de ectonucleósidos trifosfato
3
- 512 TRRKRH 517
- 512 TRRKRH 517
Proteína de la homeobox profeta de
PIT-1
- 12 PKKGRV 17
- 69 RRRHRT 74
- 119 NRRAKQ 124
- 12 PKKGRV 17
- 69 RRRHRT 74
- 119 NRRAKQ 124
Receptor EP3 de prostaglandinas
- 77 YRRRESKR 84
- 389 MRKRRLRE 396
- 82 SKRKKS 87
- 389 MRKRRL 394
- 82 SKRKKS 87
- 389 MRKRRL 394
Homeobox pituitaria 3
- 58 LKKKQRRQ 65
- 59 KKKQRR 64
- 112 NRRAKW 117
- 118 RKRERS 123
- 59 KKKQRR 64
- 112 NRRAKW 117
- 118 RKRERS 123
HPRL-3
- 136 KRRGRI 141
- 136 KRRGRI 141
Advilina
- 812 MKKEKG 817
- 812 MKKEKG 817
Factor de interacción con el interactor nuclear
LIM 1
- 32 GRRARP 37
- 109 LKKQRS 114
- 32 GRRARP 37
- 109 LKKQRS 114
Nucleo de histona
macro-H2A,1
- 5 GKKKSTKT 12
- 114 AKKRGSKG 121
- 70 NKKGRV 75
- 132 AKKAKS 137
- 154 ARKSKK 159
- 302 DKKLKS 307
- 70 NKKGRV 75
- 132 AKKAKS 137
- 154 ARKSKK 159
- 302 DKKLKS 307
\global\parskip0.960000\baselineskip
Proteína similar a vilina
- 180 KRRRNQKL 187
- 179 EKRRRN 184
- 179 EKRRRN 184
Beta-filamina
- 254 PKKARA 259
- 2002 ARRAKV 2007
- 254 PKKARA 259
- 2002 ARRAKV 2007
Proteína con motivo tripartito TRIM31 alfa
- 290 LKKFKD 295
- 290 LKKFKD 295
co-represor del receptor nuclear
1
- 106 SKRPRL 111
- 299 ARKQRE 304
- 330 RRKAKE 335
- 349 IRKQRE 354
- 412 QRRVKF 417
- 497 KRRGRN 502
- 580 RRKGRI 585
- 687 SRKPRE 692
- 2332 SRKSKS 2337
- 106 SKRPRL 111
- 299 ARKQRE 304
- 330 RRKAKE 335
- 349 IRKQRE 354
- 412 QRRVKF 417
- 497 KRRGRN 502
- 580 RRKGRI 585
- 687 SRKPRE 692
- 2332 SRKSKS 2337
Proteína en dedos RING expresada en cerebro
- 432 KRRVKS 437
- 432 KRRVKS 437
\global\parskip1.000000\baselineskip
PB39
- 231 TKKIKL 236
- 231 TKKIKL 236
Proteína acrosomal espermática
- 48 FRKRMEKE 55
- 24 RRKARE 29
- 135 KRKLKE 140
- 213 KKRLRQ 218
- 24 RRKARE 29
- 135 KRKLKE 140
- 213 KKRLRQ 218
Proteína del tráfico de vesículas SEC22B
- 177 SKKYRQ 182
- 177 SKKYRQ 182
Factor de transcripción nucleolar 1
- 79 VRKFRT 84
- 102 GKKLKK 107
- 125 EKRAKY 130
- 147 SKKYKE 152
- 156 KKKMKY 161
- 240 KKRLKW 245
- 451 KKKAKY 456
- 523 EKKEKL 528
- 558 SKKMKF 563
- 79 VRKFRT 84
- 102 GKKLKK 107
- 125 EKRAKY 130
- 147 SKKYKE 152
- 156 KKKMKY 161
- 240 KKRLKW 245
- 451 KKKAKY 456
- 523 EKKEKL 528
- 558 SKKMKF 563
Plexina-B3
- 248 FRRRGARA 255
Junctofilina tipo 3
- 626 QKRRYSKG 633
Proteína quinasa de linaje mixto plausible
- 773 YRKKPHRP 780
- 312 ERRLKM 317
- 312 ERRLKM 317
Proteína de unión a ácidos grasos 4,
adipocitos
- 78 DRKVKS 83
- 105 IKRKRE 110
- 78 DRKVKS 83
- 105 IKRKRE 110
exostosis (múltiple) 1
- 78 SKKGRK 83
- 78 SKKGRK 83
Proteína rica en cisteínas que coniene el
dominio DHHC
- 64 HRRPRG 69
- 64 HRRPRG 69
Proteína del proto-oncogén
Myb
- 2 ARRPRH 7
- 292 EKRIKE 297
- 523 LKKIKQ 528
- 2 ARRPRH 7
- 292 EKRIKE 297
- 523 LKKIKQ 528
Ligasa de ácidos grasos de cadena
larga-CoA 2
- 259 RRKPKP 264
- 259 RRKPKP 264
sintaxina 1 B2
- 260 ARRKKI 265
- 260 ARRKKI 265
\global\parskip0.960000\baselineskip
Dachshund 2
- 162 ARRKRQ 167
- 516 QKRLKK 521
- 522 EKKTKR 527
- 162 ARRKRQ 167
- 516 QKRLKK 521
- 522 EKKTKR 527
Helicasa DEAD/DEXH DDX31
- 344 EKRKSEKA 351
- 760 TRKKRK 765
- 760 TRKKRK 765
Receptor de andrógenos
- 628 ARKLKK 633
- 628 ARKLKK 633
Receptor del ácido retinoico alfa
- 364 RKRRPSRP 371
- 163 NKKKKE 168
- 363 VRKRRP 368
- 163 NKKKKE 168
- 363 VRKRRP 368
Cadena pesada de la quinesina
- 340 WKKKYEKE 347
- 605 VKRCKQ 610
- 864 EKRLRA 869
- 605 VKRCKQ 610
- 864 EKRLRA 869
Diubiqüitina
- 30 VKKIKE 35
- 30 VKKIKE 35
Proteína BING1
- 519 NKKFKM 524
- 564 ERRHRL 569
- 519 NKKFKM 524
- 564 ERRHRL 569
Quinasa de adhesión focal 1
- 664 SRRPRF 669
- 664 SRRPRF 669
Proteína EBN2
- 20 TKRKKPRR 27
- 13 PKKDKL 18
- 20 TKRKKP 25
- 47 NKKNRE 52
- 64 LKKSRI 69
- 76 PKKPRE 81
- 493 SRKQRQ 498
- 566 VKRKRK 571
- 13 PKKDKL 18
- 20 TKRKKP 25
- 47 NKKNRE 52
- 64 LKKSRI 69
- 76 PKKPRE 81
- 493 SRKQRQ 498
- 566 VKRKRK 571
Proteína CO16
- 33 ARRLRR 38
- 115 PRRCKW 120
- 33 ARRLRR 38
- 115 PRRCKW 120
Monooxigenasa de la quinurenina 3
- 178 MKKPRF 183
- 178 MKKPRF 183
Proteína MLN 51
- 4 RRRQRA 9
- 255 PRRIRK 260
- 407 ARRTRT 412
- 4 RRRQRA 9
- 255 PRRIRK 260
- 407 ARRTRT 412
\global\parskip1.000000\baselineskip
Antígeno del MHC clase II
- 99 QKRGRV 104
Antígeno del MHC class II
- 99 QKRGRV 104
Proteína que contiene una hélice superenrrollada
acídica transformante 1
- 225 SRRSKL 230
- 455 PKKAKS 460
- 225 SRRSKL 230
- 455 PKKAKS 460
Proteína específica neuroendocrina VGF
- 479 EKRNRK 484
- 479 EKRNRK 484
Transportador de cationes orgánicos
- 230 GRRYRR 235
- 535 PRKNKE 540
- 230 GRRYRR 235
- 535 PRKNKE 540
Polimerasa de DNA theta
- 215 KRRKHLKR 222
- 214 WKRRKH 219
- 220 LKRSRD 225
- 1340 GRKLRL 1345
- 1689 SRKRKL 1694
- 214 WKRRKH 219
- 220 LKRSRD 225
- 1340 GRKLRL 1345
- 1689 SRKRKL 1694
Proteína relacionada con CDC45
- 169 MRRRQRRE 176
- 155 EKRTRL 160
- 170 RRRQRR 175
- 483 NRRCKL 488
- 155 EKRTRL 160
\global\parskip0.960000\baselineskip
- 170 RRRQRR 175
- 483 NRRCKL 488
Proteína del canal intracelular de cloruro 2
- 197 AKKYRD 202
- 197 AKKYRD 202
Proteína de unión a
metil-CpG
- 85 KRKKPSRP 92
- 83 SKKRKK 88
- 318 QKRQKC 323
- 354 YRRRKR 359
- 83 SKKRKK 88
- 318 QKRQKC 323
- 354 YRRRKR 359
Quinasa de proteínas C, tipo eta
- 155 RKRQRA 160
- 155 RKRQRA 160
Ribonucleoproteína nuclear heterogénea H
- 71 LKKDRE 76
- 169 LKKHKE 174
- 71 LKKDRE 76
- 169 LKKH KE 174
ORF2
- 11 SRRTRW 16
- 155 ERRRKF 160
- 185 LRRCRA 190
- 530 SRRSRS 535
- 537 GRRRKS 542
- 742 ERRAKQ 747
- 11 SRRTRW 16
- 155 ERRRKF 160
- 185 LRRCRA 190
- 530 SRRSRS 535
- 537 GRRRKS 542
- 742 ERRAKQ 747
\global\parskip1.000000\baselineskip
Proteína única de la F-box
24
- 9 LRRRRVKR 16
- 9 LRRRRV 14
- 29 EKRGKG 34
- 9 LRRRRV14
- 29 EKRGKG 34
Proteína neuronal rica en leucinas
- 51 NRRLKH 56
- 51 NRRLKH 56
Proteína RER1
- 181 KRRYRG 186
- 181 KRRYRG 186
Nefrocistina
- 3 ARRQRD 8
- 430 PKKPKT 435
- 557 NRRSRN 562
- 641 EKRDKE 646
- 3 ARRQRD 8
- 430 PKKPKT 435
- 557 NRRSRN 562
- 641 EKRDKE 646
Isoenzima de la quinasa de adenilato 2,
mitocondrial
- 60 GKKLKA 65
- 116 KRKEKL 121
- 60 GKKLKA 65
- 116 KRKEKL 121
Reductasa de clordecona
- 245 AKKHKR 250
- 245 AKKHKR 250
Metaxina 2
- 166 KRKMKA 171
- 166 KRKMKA 171
Proteína de la homeobox de mesodermo emparejada
1
- 89 KKKRKQRR 96
- 88 EKKKRK 93
- 94 QRRNRT 99
- 144 NRRAKF 149
- 88 EKKKRK 93
- 94 QRRNRT 99
- 144 NRRAKF 149
Proteína con dedos Ring
- 174 LKRKWIRC 181
- 8 TRKIKL 13
- 95 MRKQRE 100
- 8 TRKIKL 13
- 95 MRKQRE 100
Ataxina 7
- 55 PRRTRP 60
- 377 GRRKRF 382
- 704 GKKRKN 709
- 834 GKKRKC 839
- 55 PRRTRP 60
- 377 GRRKRF 382
- 704 GKKRKN 709
- 834 GKKRKC 839
Proteína específica de parada del crecimiento
1
- 169 ARRRCDRD 176
Proteína SKAP55
- 115 EKKSKD 120
- 115 EKKSKD 120
Palmitoiltransferasa de serinas 1
- 232 PRKARV 237
- 232 PRKARV 237
Palmitoiltransferasa de serinas 2
- 334 KKKYKA 339
- 450 RRRLKE 455
- 334 KKKYKA 339
- 450 RRRLKE 455
Sinaptopodina
- 405 KRRQRD 410
- 405 KRRQRD 410
Alfa-tectorina
- 1446 TRRCRC 1451
- 2080 IRRKRL 2085
- 1446 TRRCRC 1451
- 2080 IRRKRL 2085
Factor de transcripción C-MAF
forma larga
- 291 QKRRTLKN 298
Proteína tipo IIa del síndrome de Usher
- 1285 MRRLRS 1290
- 1285 MRRLRS 1290
polipéptido p30 asociado a MSin3A
- 95 QKKVKI 100
- 124 NRRKRK 129
- 158 LRRYKR 163
- 95 QKKVKI 100
- 124 NRRKRK 129
- 158 LRRYKR 163
Región C de la cadena delta de las Ig
- 142 KKKEKE 147
- 142 KKKEKE 147
Componente TRAP100 del complejo proteico
asociado al receptor de la hormona tiroidea
- 383 AKRKADRE 390
- 833 KKRHRE 838
- 833 KKRHRE 838
catanina P60
- 369 LRRRLEKR 376
- 326 SRRVKA 331
\vskip1.000000\baselineskip
- 326 SRRVKA 331
Factor de transcripción
jun-D
- 286 RKRKLERI 293
- 273 RKRLRN 278
- 285 CRKRKL 290
- 273 RKRLRN 278
- 285 CRKRKL 290
Deshidrogenasa de esterol/retinol
- 152 VRKARG 157
- 152 VRKARG 157
Sintasa de glucógeno [almidón], hígado
- 554 DRRFRS 559
- 578 SRRQRI 583
- 554 DRRFRS 559
- 578 SRRQRI 583
Receptor relacionado con el estrógeno gamma
- 173 TKRRRK 178
- 353 VKKYKS 358
- 173 TKRRRK 178
- 353 VKKYKS 358
Proteína con cremallera de leucina específica de
retina neural
- 162 QRRRTLKN 169
Fosfolipasa citosólica
A2-gamma
- 514 NKKKILRE 521
- 31 LKKLRI 36
- 218 FKKGRL 223
- 428 CRRHKI 433
- 31 LKKLRI 36
Fosfolipasa citosólica
A2-gamma
- 218 FKKGRL 223
- 428 CRRHKI 433
\newpage
GLE1
- 415 AKKIKM 420
- 415 AKKIKM 420
Proteína de exostosis múltiple tipo II
EXT2.I
- 296 VRKRCHKH 303
- 659 RKKFKC 664
- 659 RKKFKC 664
Factor de transcripción dependiente de AMP
cíclic ATF-7
- 86 EKKARS 91
- 332 GRRRRT 337
- 344 ERRQRF 349
- 86 EKKARS 91
- 332 GRRRRT 337
- 344 ERRQRF 349
Quinasa de proteínas/endoribonucleasa
- 886 LRKFRT 891
- 886 LRKFRT 891
Factor de transcripción E2F6
- 23 RRRCRD 28
- 59 VKRPRF 64
- 98 VRKRRV 103
- 117 EKKSKN 122
- 23 RRRCRD 28
- 59 VKRPRF 64
- 98 VRKRRV 103
- 117 EKKSKN 122
Proteína con un dominio muerte activadora de MAP
quinasa
- 1333 IRKKVRRL 1340
- 160 KRRAKA 165
- 943 MKKVRR 948
- 1034 DKRKRS 1039
- 1334 RKKVRR 1339
- 1453 TKKCRE 1458
- 160 KRRAKA 165
- 943 MKKVRR 948
- 1034 DKRKRS 1039
- 1334 RKKVRR 1339
- 1453 TKKCRE 1458
Receptor nuclear huérfano PXR
- 126 KRKKSERT 133
- 87 TRKTRR 92
- 125 IKRKKS 130
- 87 TRKTRR 92
- 125 IKRKKS 130
Factor de crecimiento derivado del epitelio de
la lente
- 149 RKRKAEKQ 156
- 286 KKRKGGRN 293
- 145 ARRGRK 150
- 178 PKRGRP 183
- 285 EKKRKG 290
- 313 DRKRKQ 318
- 400 LKKIRR 405
- 337 VKKVEKKRE 345
- 145 ARRGRK 150
- 178 PKRGRP 183
- 285 EKKRKG 290
- 313 DRKRKQ 318
- 400 LKKIRR 405
Cofactor de la proteína homeobox LIM
- 255 TKRRKRKN 262
- 255 TKRRKR 260
- 255 TKRRKR 260
Receptor que se extiende en múltiples membranas
TRC8
- 229 WKRIRF 234
- 229 WKRIRF 234
Factor de transcripción SUPT3H
- 172 DKKKLRRL 179
- 169 MRKDKK 174
- 213 NKRQKI 218
- 169 MRKDKK 174
- 213 NKRQKI 218
Geminina
- 50 KRKHRN 55
- 104 EKRRKA 109
- 50 KRKHRN 55
- 104 EKRRKA 109
Factor regulado por el ciclo celular p78
- 165 EKKKVSKA 172
- 124 IKRKKF 129
- 188 TKRVKK 193
- 381 DRRQKR 386
- 124 IKRKKF 129
- 188 TKRVKK 193
- 381 DRRQKR 386
Complejo del antígeno 6 de linfocitos, locus
D
- 61 QRKGRK 66
- 85 ARRLRA 90
- 61 QRKGRK 66
- 85 ARRLRA 90
Sintetasa de
1-pirrolin-5-carboxilato
Delta
- 455 LRRTRI 460
- 455 LRRTRI 460
Proteína enlazante de células B BLNK
- 36 IKKLKV 41
- 36 IKKLKV 41
Proteína enlazante de células B
BLNK-S
- 36 IKKLKV 41
- 36 IKKLKV 41
Antígeno del Alzheimer fetal
- 5 ARRRRKRR 12
- 16 PRRRRRRT 23
- 93 WKKKTSRP 100
- 5 ARRRRK 10
- 16 PRRRRR 21
- 26 PRRPRI 31
- 35 TRRMRW 40
- 5 ARRRRK 10
- 16 PRRRRR 21
- 26 PRRPRI 31
- 35 TRRMRW 40
Variante de corte y empalme del canal de
potencial del receptor transitorio 4 zeta
- 505 CKKKMRRK 512
- 506 KKKMRR 511
- 676 HRRSKQ 681
- 506 KKKMRR 511
- 676 HRRSKQ 681
Regulador de a miofibrilogénesis
MR-2
- 65 RKRGKN 70
- 65 RKRGKN 70
Proteína de anclaje a fosfatasa que contiene un
dominio SH2 2c de la superfamilia inmunoglobulina, miembro 3
- 269 IKKRSLRS 276
- 394 SKRPKN 399
- 394 SKRPKN 399
Homólogo de Meis (mouse) 3
- 112 PRRSRR 117
- 120 WRRTRG 125
- 112 PRRSRR 117
- 120 WRRTRG 125
Delecionada en la azoospermia 2
- 105 GKKLKL 110
- 114 IRKQKL 119
- 105 GKKLKL 110
- 114 IRKQKL 119
Centaurina gamma3
- 543 NRKKHRRK 550
- 544 RKKHRR 549
- 544 RKKHRR 549
Factor de transcripción de la leucemia de
pre-células B 1
- 233 ARRKRR 238
- 286 NKRIRY 291
- 233 ARRKRR 238
- 286 NKRIRY 291
Proteína ribosomal 60S L13a
- 112 DKKKRM 117
- 158 KRKEKA 163
- 167 YRKKKQ 172
- 112 DKKKRM 117
- 158 KRKEKA 163
- 167 YRKKKQ 172
Proteína que contiene el dominio WD40 y FYVE
3
- 388 IKRLKI 393
- 388 IKRLKI 393
Proteína LENG1
- 34 RKRRGLRS 41
- 84 SRKKTRRM 91
- 1 MRRSRA 6
- 33 ERKRRG 38
- 85 RKKTRR 90
- 1 MRRSRA 6
- 33 ERKRRG 38
- 85 RKKTRR 90
MRIP2
- 375 NKKKHLKK 382
Receptor acoplado a proteína G
- 430 EKKKLKRH 437
- 290 WKKKRA 295
- 395 RKKAKF 400
- 431 KKKLKR 436
- 290 WKKKRA 295
- 395 RKKAKF 400
- 431 KKKLKR 436
- 143 LKKFRQ 148
- 228 LRKIRT 233
- 143 LKKFRQ 148
- 228 LRKIRT 233
- 232 QKRRRHRA 239
- 232 QKRRRH 237
- 232 QKRRRH 237
Canal de iones espermático
- 402 QKRKTGRL 409
Proteína de anclaje a la quinasa A
- 2232 KRKKLVRD 2239
- 2601 EKRRRERE 2608
- 2788 EKKKKNKT 2795
- 370 RKKNKG 375
- 1763 SKKSKE 1768
- 2200 EKKVRL 2205
- 2231 LKRKKL 2236
- 2601 EKRRRE 2606
- 2785 EKKEKK 2790
- 1992 QKKDWKRQ 2000
- 370 RKKNKG 375
- 1763 SKKSKE 1768
- 2200 EKKVRL 2205
- 2231 LKRKKL 2236
- 2601 EKRRRE 2606
- 2785 EKKEKK 2790
Proteína específica de linfocitos LSP1
- 315 GKRYKF 320
- 315 GKRYKF 320
Similar a la molécula de activación de la
señalización linfocítica (H. sapiens)
- 261 RRRGKT 266
- 261 RRRGKT 266
Dermatan-4-sulfotransferasa-1
- 242 VRRYRA 247
- 242 VRRYRA 247
Moesina
- 291 MRRRKP 296
- 325 EKKKRE 330
- 291 MRRRKP 296
- 325 EKKKRE 330
Quinasa de
serina/treonina-proteínas
proto-oncogén A-Raf
- 288 KKKVKN 293
- 358 LRKTRH 363
- 288 KKKVKN 293
- 358 LRKTRH 363
Citocromo P450 2C18
- 117 GKRWKE 122
- 117 GKRWKE 122
- 117 GKRWKE 122
- 156 LRKTKA 161
- 117 GKRWKE 122
- 156 LRKTKA 161
Fosfatasa de tirosina proteínas, no receptor
tipo 3
- 594 IRRRAVRS 601
- 263 FKRKKF 268
- 388 IRKPRH 393
- 874 VRKMRD 879
- 263 FKRKKF 268
- 388 IRKPRH 393
- 874 VRKMRD 879
similar a la calicreína 7 (quimiotríptica,
estrato corneo)
- 15 VKKVRL 20
- 15 VKKVRL 20
Lipasa sensible a las hormonas
- 703 ARRLRN 708
- 703 ARRLRN 708
Proteína ribosomal 40S S30
- 25 KKKKTGRA 32
- 23 EKKKKK 28
- 23 EKKKKK 28
Proteína con dedos de Zinc 91
- 617 LRRHKR 622
- 617 LRRHKR 622
Proteína NNP-1
- 320 NRKRLYKV 327
- 387 ERKRSRRR 394
- 432 QRRRTPRP 439
- 454 EKKKKRRE 461
- 29 VRKLRK 34
- 355 GRRQKK 360
- 361 TKKQKR 366
- 388 RKRSRR 393
- 454 EKKKKR 459
- 29 VRKLRK 34
- 355 GRRQKK 360
- 361 TKKQKR 366
- 388 RKRSRR 393
- 454 EKKKKR 459
Sintetasa de metionil-tRNA
- 725 WKRIKG 730
- 725 WKRIKG 730
ELMO2
- 560 NRRRQERF 567
Antígeno expresado en meningioma 6/11
- 432 RKRAKD 437
- 432 RKRAKD 437
Fosfatasa de Inositol polifosfato 4 tipo
1-beta
- 375 LRKKLHKF 382
- 829 ARKNKN 834
- 829 ARKNKN 834
- 815 SKKRKN 820
- 815 SKKRKN 820
C7ORF1
- 40 SRRYRG 45
- 338 HRKNKP 343
- 40 SRRYRG 45
- 338 HRKNKP 343
Factor de intercambio de nucleótidos guanina
Rap
- 138 SRRRFRKI 145
- 1071 QRKKRWRS 1078
- 1099 HKKRARRS 1106
- 139 RRRFRK 144
- 661 SKKVKA 666
- 930 LKRMKI 935
- 1071 QRKKRW 1076
- 1100 KKRARR 1105
- 1121 ARKVKQ 1126
- 139 RRRFRK 144
- 661 SKKVKA 666
- 930 LKRMKI 935
- 1071 QRKKRW 1076
- 1100 KKRARR 1105
- 1121 ARKVKQ 1126
Adaptina sigma 1 C
- 27 ERKKITRE 34
Alsina
- 883 GRKRKE 888
- 883 GRKRKE 888
NOPAR2
- 14 LKRPRL 19
- 720 VKREKP 725
- 14 LKRPRL 19
- 720 VKREKP 725
Factor de transcripción de unión a AT 1
- 294 SKRPKT 299
- 961 EKKNKL 966
- 1231 NKRPRT 1236
- 1727 DKRLRT 1732
- 2032 QKRFRT 2037
- 2087 EKKSKL 2092
- 2317 QRKDKD 2322
- 2343 PKKEKG 2348
- 294 SKRPKT 299
- 961 EKKNKL 966
- 1231 NKRPRT 1236
- 1727 DKRLRT 1732
- 2032 QKRFRT 2037
- 2087 EKKSKL 2092
- 2317 QRKDKD 2322
- 2343 PKKEKG 2348
Supresina
- 232 YKRRKK 237
- 232 YKRRKK 237
Proteína de la línea media 1
- 100 TRRERA 105
- 494 HRKLKV 499
- 100 TRRERA 105
- 494 HRKLKV 499
Proteína del grupo de elevada movilidad 2a
- 6 PKKPKG 11
- 84 GKKKKD 89
- 6 PKKPKG 11
- 84 GKKKKD 89
Claims (16)
1. Una proteína interleuquina-8
(IL-8) modificada que se caracteriza por que
al menos un residuo aminoacídico en la posición 70 y/o 71 de
IL-8 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con
la tabla 2 está sustituido por Arg, Lys y/o His, y por que los 6
aminoácidos N-terminales de dicha proteína están
delecionados.
2. Una proteína IL-8 modificada
de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por
que al menos un residuo aminoacídico adicional en la posición 17
y/o 21 de IL-8 está sustituido por Arg, Lys y/o
His.
3. Una proteína IL-8 modificada,
que se caracteriza por que todos los residuos aminoacídicos
en las posiciones 17, 21, 70 y 71 de IL-8 están
sustituidos por Arg, Lys y/o His.
4. Una proteína IL-8 modificada
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, que se
caracteriza por que la afinidad de unión a GAG aumenta en un
factor de al menos 5, preferiblemente en un mínimo de 10, más
preferiblemente en un mínimo de 100, comparado con la
IL-8 salvaje.
5. Una proteína IL-8 modificada
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, que se
caracteriza por que la afinidad de unión a GAG aumentada es
un aumento de la afinidad de unión a heparán sulfato y/o
heparina.
6. Una proteína IL-8 modificada
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, que se
caracteriza por que una región biológicamente activa
adicional de la proteína IL-8 está modificada
inhibienso así o regulando negativamente otra actividad biológica
de dicha proteína.
7. Una proteína IL-8 modificada
de acuerdo con la reivindicación 6, que se caracteriza por
que la unión al receptor está inhibida o regulada
negativamente.
8. Una proteína IL-8 modificada
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 7, que se
caracteriza por que dicha proteína es una
IL-8 mutada con los primeros 6 aminoácidos
N-terminales delecionados.
9. Una proteína IL-8 modificada
de acuerdo con la reivindicación 6, que se caracteriza por
que dicha región biológicamente activa adicional está localizada en
los primeros 10 aminoácidos N-terminales.
10. Una proteína IL-8 modificada
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9, que se
caracteriza por que dicha proteína es una
IL-8 mutante seleccionada de entre el grupo que
consiste en del6F17RE70KN71R, de16F17RE70RN71K y de16E70KN71K.
11. Una molécula de ácido polinucleico aislado
que codifica para una proteína de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10.
12. Un vector que comprende una molécula de DNA
aislada de acuerdo con la reivindicación 11.
13. Una célula recombinante que comprende un
vector de acuerdo con la reivindicación 12, cuya célula recombinante
no está comprendida en el organismo humano.
14. Una composición farmacéutica, que se
caracteriza por que comprende una proteína de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, un ácido polinucleico
de acuerdo con la reivindicación 11 o un vector de acuerdo con la
reivindicación 12 y un transportador farmacéuticamente
aceptable.
15. La utilización de la proteína de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, un ácido polinucleico
de acuerdo con la reivindicación 11 o un vector de acuerdo con la
reivindicación 12 en un método para producir un medicamento para el
tratamiento de un estado inflamatorio.
16. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 15, que se caracteriza por que el estado
inflamatorio se selecciona de entre un grupo que comprende la
artritis reumatoide, psoriasis, osteoartritis, asma, enfermedad de
Alzheimer y esclerosis múltiple.
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